CN111034736B - 一种杀虫组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种杀虫组合物及其应用，包括杀虫基因序列和辣根素，所述的基因序列如SEQ ID NO：1所示，或至少包含SEQ ID NO：1所示序列90％的同一性的基因序列；所述的基因序列如SEQ ID NO：1所示，或至少包含SEQ ID NO：1所示序列90％的同一性的基因序列；所述的基因序列如SEQ ID NO：1所示，或至少包含SEQ ID NO：1所示序列90％的同一性的基因序列。通过微量注射的方法导入试虫体内后24h后，再进行辣根素LC20熏蒸处理，72h死亡率分别达到85.56％，67.78％，58.89％，均显著高于辣根素LC20单独熏蒸处理，致死作用显著。以饲喂法分别饲喂dsRNACOXⅠ或dsRNACOXⅡ或dsRNACOXⅢ与辣根素LC20熏蒸联合处理提高玉米象的防效显著，AITC用药量减少。

Description

一种杀虫组合物及其应用
技术领域
发明涉及生物技术领域，具体涉及一种杀虫组合物及其应用。
背景技术
玉米象(Sitophilus zeamais)属鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae)，是一种重要 的仓储物初期性害虫，被列为头号毁灭性贮粮害虫。在仓储害虫防治应用最为广泛的是 溴甲烷和磷化铝，而溴甲烷在发展中国家已被禁用，磷化铝产品由于其高毒、高风险， 在防除粮食仓储害虫时易发生中毒伤亡事故。
辣根(Armoracia rusticana)是十字花科辣根属植物，其主要挥发性成分为烯丙基 异硫氰酸酯(辣根素AITC)作为一种生物源熏蒸剂，具有低毒、易降解等特点，对储 粮害虫有较好的防效。吴华等(2007)采用锥形瓶法测定了AITC对玉米象、赤拟谷盗、 谷蠹和干鱼书虱等4种仓储害虫的生物活性，结果表明，AITC精油对四种仓储害虫都具 有较高的生物活性。
RNA干扰(RNAi)技术利用双链RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻 断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。目前RNAi已经成为了杀虫剂的靶标识 别与鉴定的有效工具，即通过RNAi降低预测靶标基因转录水平之后，测定虫体对于杀 虫剂的敏感性变化从而确定杀虫剂的靶标位点，同时也可以减少用药量，在生产实践中 提高害虫的致死作用。
细胞色素C氧化酶(COX)是真核生物线粒体内膜和需氧菌细胞膜电子传递链上的终端金属膜蛋白酶，负责细胞色素C到氧分子的电子传递功能，是线粒体氧化能力的关 键调节部位。由三个核心亚基(COXⅠ、Ⅱ、Ⅲ)以及十个小亚基组成。
发明内容
本发明的目的在于提供根据玉米象细胞色素C氧化酶(COX)三个核心亚基(COX Ⅰ、COXⅡ和COXⅢ)设计基因片段合成dsRNA与辣根素熏蒸(AITC)联合在害虫 防治中的作用。
一种杀虫组合物，包括杀虫基因序列和辣根素，所述的基因序列如SEQ ID NO：1所示，或至少包含SEQ ID NO：1所示序列90％的同一性的基因序列。
可选的，合成所述杀虫基因序列的引物包括SEQ ID NO：2所示的上游引物和SEQID NO：3所示的下游引物。
可选的，所述的杀虫基因序列根据NCBI数据库中玉米象细胞色素C氧化酶核心亚基Ⅰ基因(NCBI参考序列：NC_030764.1:1323-2864)设计的基因片段。
一种杀虫杀虫组合物，包括杀虫基因序列和辣根素，所述的基因序列如SEQ IDNO： 4所示，或至少包含SEQ ID NO：4所示序列90％的同一性的基因序列。
可选的，合成所述杀虫基因序列的引物包括SEQ ID NO：5所示的上游引物和SEQID NO：6所示的下游引物。
可选的，所述的杀虫基因序列根据NCBI数据库中玉米象细胞色素C氧化酶核心亚基Ⅱ基因(GENBANK登录号：KX783028)设计的基因片段。
一种杀虫杀虫组合物，包括杀虫基因序列和辣根素，所述的基因序列如SEQ IDNO： 7所示，或或至少包含SEQ ID NO：7所示序列90％的同一性的基因序列。
可选的，合成所述杀虫基因序列的引物包括SEQ ID NO：8所示的上游引物和SEQID NO：9所示的下游引物。
所述的杀虫基因序列根据NCBI数据库中玉米象细胞色素C氧化酶核心亚基Ⅲ基因(NCBI参考序列：NC_030764.1:4574-5365)设计的基因片段。
本发明所述的杀虫组合物用于制备防治玉米象农药的应用；优选的，所述的杀虫基 因序列通过注射法或饲喂法使用；辣根素通过熏蒸方式使用，熏蒸浓度为3.997μL/L。
经试验证明，注射虫体再经过辣根素(AITC)熏蒸处理后，玉米象18天虫龄幼虫 死亡率分别为85.56％，67.78％，58.89％，均显著高于辣根素LC20单独熏蒸处理，致死 作用显著，并出现头部发黑并死亡的表型变化
附图说明
图1：琼脂糖凝胶检测SEQ ID NO：1序列长度；
图2：SEQ ID NO：1对应的dsRNA注射玉米象18天虫龄幼虫24h、36h和48h后 对细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因(COXⅠ)的转录影响，对照组为注射dsGFP；
图3：SEQ ID NO：1对应的dsRNA注射玉米象18天虫龄幼虫24h、36h和48h后 死亡率的变化；
图4：SEQ ID NO：1对应的dsRNA注射玉米象18天虫龄幼虫生长发育的影响， 对照组为注射0.75％NaCl。A、B和C是实验组玉米象18天虫龄幼虫注射dsRNA后出 现幼虫从头部开始变黑到整个虫体变黑，D、E和F是实验组玉米象18天虫龄幼虫注射 dsRNA后幼虫成功化蛹，之后蛹从头部开始变黑到整个虫体变黑，G、H和I是实验组 玉米象18天虫龄幼虫注射dsRNA后蛹成功羽化，之后羽化成功的成虫虫体从乳白色变 为黄色，头部的口器、触角变黑；J、K和L是对照组玉米象18天虫龄幼虫注射0.75％NaCl 后幼虫成功化蛹、蛹成功羽化；
图5：琼脂糖凝胶检测SEQ ID NO：4序列长度；
图6：SEQ ID NO：4对应的dsRNA注射玉米象18天虫龄幼虫24h、36h和48h后 对细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因(COXⅡ)的转录影响，对照组为注射dsGFP；
图7：SEQ ID NO：4对应的dsRNA注射玉米象18天虫龄幼虫24h、36h和48h后 死亡率的变化；
图8：SEQ ID NO：4对应的dsRNA注射玉米象18天虫龄幼虫生长发育的影响， 对照组为注射0.75％NaCl；A、B和C是实验组玉米象18天虫龄幼虫注射dsRNA后出 现幼虫从头部开始变黑到整个虫体变黑，D、E和F是实验组玉米象18天虫龄幼虫注射 dsRNA后幼虫成功化蛹，之后蛹从头部开始变黑到整个虫体变黑，G、H和I是实验组 玉米象18天虫龄幼虫注射dsRNA后蛹成功羽化，之后羽化成功的成虫虫体从乳白色变 为黄色，头部的口器、触角和翅变黑；J、K和L是对照组玉米象18天虫龄幼虫注射 0.75％NaCl后幼虫成功化蛹、蛹成功羽化；
图9：琼脂糖凝胶检测SEQ ID NO：7序列长度；
图10：SEQ ID NO：7对应的dsRNA注射玉米象18天虫龄幼虫24h、36h和48h 后对细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ基因(COXⅢ)的转录影响，对照组为注射dsGFP；
图11：SEQ ID NO：7对应的dsRNA注射玉米象18天虫龄幼虫24h、36h和48h 后死亡率的变化；
图12：SEQ ID NO：7对应的dsRNA注射玉米象18天虫龄幼虫生长发育的影响， 对照组为注射0.75％NaCl；A、B和C是实验组玉米象18天虫龄幼虫注射dsRNA后出 现幼虫从头部开始变黑到整个虫体变黑，D、E和F是实验组玉米象18天虫龄幼虫注射 dsRNA后幼虫成功化蛹，之后蛹体变黄后从头部开始变黑，G、H和I是实验组玉米象 18天虫龄幼虫注射dsRNA后蛹成功羽化，之后羽化成功的成虫虫体从乳白色变为黄色， 头部的口器、触角和翅变黑；J、K和L是对照组玉米象18天虫龄幼虫注射0.75％NaCl 后幼虫成功化蛹、蛹成功羽化；
图13：玉米象18天虫龄幼虫不经任何处理(CK)在24h、48h和72h的表型(A、B 和C)，在注射0.75％NaCl在24h、48h和72h的表型(D、E和F)作为对照组；
图14：SEQ ID NO：1对应的dsRNA注射玉米象18天虫龄幼虫24h、48h和72h后的表型(A、B和C)，注射后24h之后进行辣根素LC20熏蒸24h、48h和72h后的表型(D、E和 F)；
图15：CK、对照组、辣根素LC20熏蒸处理、注射SEQ ID NO：1对应的dsRNA以及 辣根素LC20熏蒸处理+注射SEQ ID NO：1对应的dsRNA在24h、48h和72h的死亡率；
图16：SEQ ID NO：2对应的dsRNA注射玉米象18天虫龄幼虫24h、48h和72h后的表型(A、B和C)，注射后24h之后进行辣根素LC20熏蒸24h、48h和72h后的表型(D、E和 F)；
图17：CK、对照组、辣根素LC20熏蒸处理、注射SEQ ID NO：2对应的dsRNA以及 辣根素LC20熏蒸处理+注射SEQ ID NO：2对应的dsRNA在24h、48h和72h的死亡率；
图18：SEQ ID NO：3对应的dsRNA注射玉米象18天虫龄幼虫24h、48h和72h后的表型(A、B和C)，注射后24h之后进行辣根素LC20熏蒸24h、48h和72h后的表型(D、E和 F)；
图19：CK、对照组、辣根素LC20熏蒸处理、注射SEQ ID NO：3对应的dsRNA以及 辣根素LC20熏蒸处理+注射SEQ ID NO：3对应的dsRNA在24h、48h和72h的死亡率。
具体实施方式
本发明提供一种玉米象细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因(COXⅠ)，在NCBI数据库 中检索其参考序列(NC_030764.1:1323-2864)开放阅读框(ORF)，通过PCR扩增进一 步测序得到其长度为1542bp。根据以上基因序列在E-RNAi网站上设计上游引物SEQ ID NO：2和下游引物SEQ ID NO：3，通过PCR扩增获得SEQ ID NO：1，其含有T7启 动子。进一步利用T7RiboMAXExpress RNAi System试剂盒合成dsRNA。
本发明提供一种玉米象细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因(COXⅡ)，在NCBI数据库 中检索其GENBANK登录号：KX783028，得到其开放阅读框(ORF)，通过RACE-PCR 扩增进一步测序得到其长度为684bp。根据以上基因序列在E-RNAi网站上设计上游引 物SEQ ID NO：5和下游引物SEQ ID NO：6，通过PCR扩增获得SEQ ID NO：4，其 含有T7启动子。进一步利用T7RiboMAX Express RNAi System试剂盒合成dsRNA。
本发明提供一种玉米象细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ基因(COXⅢ)，在NCBI数据库 中检索其参考序列(NC_030764.1:4574-5365)开放阅读框(ORF)，通过RACE-PCR扩 增进一步测序得到其长度为792bp。根据以上基因序列在E-RNAi网站上设计上游引物 SEQ ID NO：8和下游引物SEQ ID NO：9，通过PCR扩增获得SEQ ID NO：7，其含 有T7启动子。进一步利用T7RiboMAX Express RNAi System试剂盒合成dsRNA。
SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3合成的dsRNA与辣根素(AITC) 联合在害虫防治中的应用：利用微量注射器将合成的dsRNA从玉米象18天虫龄幼虫的 侧腹部倒数第四个或五个节间膜处注射到其体腔内，在注射dsRNA24h之后进行辣根素 LC20熏蒸，再经过24h、48h和72h之后统计死亡率，结果表明SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3合成的dsRNA注射虫体再经过辣根素(AITC)熏蒸处理后， 玉米象18天虫龄幼虫死亡率分别为85.56％，67.78％，58.89％，均显著高于辣根素LC20单独熏蒸处理，致死作用显著，并出现头部发黑并死亡的表型变化。
实施例1：辣根素(AITC)对玉米象18天幼虫的熏蒸活性
挑选健康活泼、大小一致的玉米象18天幼虫，将其分为三个生物学重复，每个生物学 重复30头幼虫，设置6个浓度梯度对辣根素对玉米象幼虫的毒力进行测定，最终得到其LC20为3.997μL/L,毒力回归方程为Y＝5.05X-4.425。
实施例2：玉米象第一链cDNA的获得
玉米象幼虫总RNA提取：选取生长健康的玉米象18天幼虫三头一组，使用RNAprepPure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒进行总RNA提取，使用PrimeScriptTM1st Strand cDNASynthesis Kit(Takara)试剂盒进行反转录合成cDNA。
实施例3：基于玉米象细胞色素C氧化酶核心亚基ORF的dsRNA合成
dsRNA引物的设计：基于COXⅠ(NC_030764.1:1323-2864)、COXⅡ(GENBANK登 录号：KX783028)和COXⅢ(NC_030764.1:4574-5365)的ORF序列，在网站E-RNAi设 计dsRNA引物，其上游引物序列分别为：SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3、SEQ ID NO： 5；其下游引物序列分别为：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9。所有引 物均由奥科鼎盛生物科技有限公司合成。
dsRNA合成：分别用上述两对引物合成dsRNA产物，利用通用型DNA纯化回收 试剂盒(天根)纯化后利用T7RiboMAX Express RNAi System试剂盒体外合成dsRNA，dsRNA浓度利用Nanodrop2000(Thermo scientific)核酸浓度测定仪测定浓度，1.0％琼 脂糖凝胶测定单一性和完整性，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3合成 的dsRNA的PCR跑胶图1、图5和图9。
实施例4：细胞色素C氧化酶核心亚基Ⅰ的dsRNACOXⅠ致死玉米象幼虫
细胞色素C氧化酶核心亚基ⅠdsRNACOXⅠ注射：将100ng基于COXⅠ (NC_030764.1:1323-2864)合成的dsRNA使用Drummond微量注射仪注射到玉米象18天 幼虫侧腹部倒数第四个或五个节间膜处，共注射3个生物学重复，每组30头。注射相 同量的dsGFP至对照组体内，将注射后的玉米象幼虫置于28℃恒温生化培养箱中饲养。
注射dsRNA后玉米象幼虫表型观察：玉米象18天幼虫组在注射0.75％NaCl 48h 之后成功化蛹，72h之后成功羽化(图4J、K、L)，而注射dsRNACOXⅠ后出现幼虫、 蛹头部发黑，成虫翅、触角部位变黑死亡(图4C、F和I)，死亡率达到75.6％(图3)。
细胞色素C氧化酶核心亚基Ⅰ基因沉默效率检测：注射dsRNACOXⅠ后的幼虫在 24h、36h和48h取样，3个生物学重复，每个重复3头，在液氮中冻存，使用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取试虫总RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)(Takara)反转录后，使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(TliRNaseH Plus)试剂盒，使用仪器CFX96Touch(BIO-RAD)进行RT-qPCR实 验，测得细胞色素C氧化酶核心亚基Ⅰ基因沉默效率可达到56.6％(图2)。
实施例5：细胞色素C氧化酶核心亚基Ⅱ的dsRNACOXⅡ致死玉米象幼虫
细胞色素C氧化酶核心亚基ⅡdsRNACOXⅡ注射：将50ng基于COXⅡ(GENBANK 登录号：KX783028)合成的dsRNA使用Drummond微量注射器注射到玉米象18天幼虫 侧腹部倒数第四个或五个节间膜处，3个生物学重复，每组30头。注射相同量的dsGFP 至对照组体内，将注射后的玉米象幼虫置于28℃恒温生化培养箱中饲养。
注射dsRNA后玉米象幼虫表型观察：玉米象18天幼虫组在注射0.75％NaCl 48h 之后成功化蛹，72h之后成功羽化(图8J、K、L)，注射dsRNACOXⅡ后出现幼虫、 蛹头部发黑，成虫翅、触角部位变黑死亡的表型(图8C、F和I)，死亡率达到71.88％ (图7)。
细胞色素C氧化酶核心亚基Ⅱ基因沉默效率检测：注射dsRNACOXⅡ后的幼虫在24h、36h和48h取样，3个生物学重复，每个重复3头，在液氮中冻存，使用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取试虫总RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)(Takara)反转录后，使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(TliRNaseH Plus)试剂盒，使用仪器CFX96Touch(BIO-RAD)进行RT-qPCR实 验，测得细胞色素C氧化酶核心亚基Ⅱ基因沉默效率可达到95.2％(图6)。
实施例6：细胞色素C氧化酶核心亚基Ⅲ的dsRNACOXⅢ致死玉米象幼虫
细胞色素C氧化酶核心亚基ⅢdsRNACOXⅢ注射：将50ng基于COXⅢ (NC_030764.1:4574-5365)合成的dsRNA使用Drummond微量注射器注射到玉米象18天 幼虫侧腹部倒数第四个或五个节间膜处，共注射3个生物学重复，每组30头。注射相 同量的dsGFP至对照组体内，将注射后的玉米象幼虫置于28℃恒温生化培养箱中饲养。
注射dsRNA后玉米象幼虫表型观察：玉米象18天幼虫组在注射0.75％NaCl 48h 之后成功化蛹，72h之后成功羽化(图12J、K、L)，而注射dsRNACOXⅢ后出现幼虫、 蛹头部发黑，成虫翅、触角部位变黑死亡的表型变化(图12C、F和I)，死亡率达到82.2％ (图10)。
细胞色素C氧化酶核心亚基Ⅲ基因沉默效率检测：注射dsRNACOXⅢ后的幼虫在24h、36h和48h取样，3个生物学重复，每个重复3头，在液氮中冻存，使用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取试虫总RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)(Takara)反转录后，使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(TliRNaseH Plus)试剂盒使用仪器CFX96Touch(BIO-RAD)进行RT-qPCR实验， 测得细胞色素C氧化酶核心亚基Ⅲ基因沉默效率可达到84.6％(图11)。
实施例7细胞色素C氧化酶核心亚基的dsRNA饲喂玉米象成虫
在进行饲喂RNAi前，先将试虫饥饿处理24h。玉米象试虫采用麦片饲喂。将麦片 浸入稀释后的dsRNA溶液10s，取出麦片后自然风干。以dsRNA COXⅠ或dsRNA COX Ⅱ或dsRNACOXⅢ处理后麦片为饲喂材料饲养玉米象成虫，隔24h更换一次重新处理 麦片，饲喂4天后将试虫转移，用未处理麦片继续饲养1天，每个处理设3个重复，每 个重复50头试虫和2g麦片。RNase-free water处理组为空白对照组。饲养条件为湿度 75±5％，温度28±1℃，光照周期为L/D：12h/12h。实验结束后，统计成虫的死亡情况 和产卵情况,见表1。
表1
Figure BDA0002316249730000071
Figure BDA0002316249730000081
表1显示了五日龄玉米象成虫饲喂dsRNACOXⅠ或dsRNACOXⅡ或dsRNACOXⅢ及dsRNAGFP 5天后死亡情况和产卵情况。可见，上述基因序列能明显致死玉米象，并显著 降低产卵数和卵孵化数，最高可导致60.67％的死亡率；最低可实现35.56％的孵化率，对 玉米象的防治效果明显。
实施例8：细胞色素C氧化酶核心亚基Ⅰ的dsRNACOXⅠ注射联合辣根素LC20熏蒸对玉米象幼虫的致死作用
细胞色素C氧化酶核心亚基ⅠdsRNACOXⅠ注射：将100ng基于COXⅠ (NC_030764.1:1323-2864)合成的dsRNA使用Drummond微量注射仪注射到玉米象18天幼 虫侧腹部倒数第四个或五个节间膜处，共注射3个生物学重复，每组30头。注射相同量的 0.75％NaCl至对照组体内，将注射后的玉米象幼虫置于28℃恒温生化培养箱中饲养。
结果参见图13-15：
细胞色素C氧化酶核心亚基ⅠdsRNACOXⅠ注射后玉米象幼虫表型观察：玉米象18 天幼虫在注射0.75％NaCl 48h之后成功化蛹，72h之后成功羽化，而注射dsRNACOXⅠ后 出现幼虫、蛹头部发黑，成虫翅、触角部位变黑死亡，72h死亡率达到75.6％。
细胞色素C氧化酶核心亚基ⅠdsRNACOXⅠ注射联合辣根素LC20熏蒸对玉米象幼虫 的致死作用：注射后熏蒸24h、48h之后，联合作用的死亡率达到56.67％、78.89％，显著 高于对照组、CK、单独使用辣根素LC20熏蒸以及单独使用dsRNACOXⅠ注射。
实施例9：细胞色素C氧化酶核心亚基ⅡdsRNACOXⅡ注射联合辣根素LC20熏蒸 对玉米象幼虫的致死作用
细胞色素C氧化酶核心亚基ⅡdsRNACOXⅡ注射：将50ng基于COXⅡ(GENBANK 登录号：KX783028)合成的dsRNA使用Drummond微量注射器注射到玉米象18天幼虫侧 腹部倒数第四个或五个节间膜处，3个生物学重复，每组30头。注射相同量的0.75％NaCl 至对照组体内，将注射后的玉米象幼虫置于28℃恒温生化培养箱中饲养。
结果参见图16-17：
细胞色素C氧化酶核心亚基ⅡdsRNACOXⅡ注射后玉米象幼虫表型观察：玉米象18天幼虫组在注射0.75％NaCl 48h之后成功化蛹，72h之后成功羽化，注射dsRNACOXⅡ后 出现幼虫、蛹头部发黑，成虫翅、触角部位变黑死亡的表型，72h死亡率达到71.88％。
细胞色素C氧化酶核心亚基ⅡdsRNACOXⅡ注射联合辣根素LC20熏蒸对玉米象幼虫的致死作用：注射后熏蒸24h、48h之后，联合作用的死亡率达到42.22％、60％，显著高 于对照组、CK、单独使用辣根素LC20熏蒸以及单独使用dsRNACOXⅡ注射
实施例10：细胞色素C氧化酶核心亚基Ⅲ的dsRNACOXⅢ注射联合辣根素LC20熏蒸对玉米象幼虫的致死作用
细胞色素C氧化酶核心亚基ⅢdsRNACOXⅢ注射：将50ng基于COXⅢ (NC_030764.1:4574-5365)合成的dsRNA使用Drummond微量注射器注射到玉米象18天幼 虫侧腹部倒数第四个或五个节间膜处，3个生物学重复，每组30头。注射相同量的 0.75％NaCl至对照组体内，将注射后的玉米象幼虫置于28℃恒温生化培养箱中饲养。
结果参见图18-19：
细胞色素C氧化酶核心亚基ⅢdsRNACOXⅢ注射后玉米象幼虫表型观察：玉米象18天幼虫组在注射0.75％NaCl 48h之后成功化蛹，72h之后成功羽化，注射dsRNACOXⅢ后 出现幼虫、蛹头部发黑，成虫翅、触角部位变黑死亡的表型，死亡率达到71.88％(图18)。
细胞色素C氧化酶核心亚基ⅢdsRNACOXⅢ注射联合辣根素LC20熏蒸对玉米象幼虫的致死作用：注射后熏蒸48h、72h之后，联合作用的死亡率达到41.11％、58.89％，显著 高于对照组、CK以及单独使用辣根素LC20熏蒸处理组。
实施例11：细胞色素C氧化酶核心亚基的dsRNA饲喂玉米象成虫后联合辣根素LC20熏蒸
在进行饲喂RNAi前，先将试虫饥饿处理24h。玉米象成虫采用麦片饲喂。将麦片 浸入稀释后的dsRNA溶液10s，取出麦片后自然风干。以dsRNA COXⅠ或dsRNA COX Ⅱ或dsRNACOXⅢ处理后麦片为饲喂材料饲养玉米象成虫，隔24h更换一次重新处理 麦片，饲喂4天后将试虫转移，用未处理麦片继续饲养1天，将饲喂dsRNA的玉米象 幼虫置于辣根素LC20熏蒸处理。每个处理设3个重复，每个重复50头试虫和2g麦片。 RNase-free water处理组为空白对照组。饲养条件为湿度75±5％，温度28±1℃，光照周 期为L/D：12h/12h。实验结束后，统计成虫的死亡情况和产卵情况,见表2。
表2
Figure BDA0002316249730000101
表2显示了五日龄玉米象成虫饲喂dsRNACOXⅠ或dsRNACOXⅡ或dsRNACOXⅢ及 联合辣根素熏蒸5天后死亡情况和产卵情况。可见，上述基因序列能明显致死玉米象，并 显著降低产卵数和卵孵化数，最高可导致84％的死亡率；最低可实现24％的孵化率，对玉 米象的防治效果明显。
虽然，上中已经通过一般性说明、具体实施方案以及活性实验对本发明作了详尽的描 述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易 见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保 护的范围。
核苷酸序列表电子文件
<110>西北农林科技大学
<120>一种杀虫组合物及其应用
<160>9
<210>1
<211>493
<212>dsRNA
<213> 玉米象
<220> 杀虫基因序列
<400>
TCCTGGATCATTAATTGGAAATGATCAAATTTACAATACTATTGTTACAGCTCACGCATTCATTATGATTTTCTTTATGGTGATGCCTATTATGATTGGAGGTTTCGGAAACTGGTTAGTCCCACTAATGCTAGGAGCCCCAGATATGGCATTCCCACGATTAAACAATATGAGTTTCTGGTTACTCCCTCCATCATTAATTCTTTTATTAATGAGTAGTTTCATTGAAAAAGGTGCCGGAACAGGATGGACTGTTTATCCCCCATTATCCTCAAATATTGCACACGAAGGAGCCTCTGTTGATTTAGCAATTTTTAGTCTTCATATGGCAGGTATTTCATCTATTCTTGGAGCTATTAATTTTATTTCTACTACTTATAATATGCGCCCCTCCGGTATGTTATCAGATCGAATGACTTTATTTATTTGGGCAGTTAGTATTACAGCCATTCTTCTTTTACTTAGTTTACCTGTTTTAGCTGGAGCAATCACT
<210>2
<211>43
<212>dsRNA
<213> 玉米象
<220> dsRNA上游引物
<400>
taatacgactcactatagggTCCTGGATCATTAATTGGAAATG
<210>3
<211>43
<212>dsRNA
<213> 玉米象
<220> dsRNA下游引物
<400>
taatacgactcactatagggAGTGATTGCTCCAGCTAAAACAG
<210>4
<211>500
<212>dsRNA
<213> 玉米象
<220> 杀虫基因序列
<400>
CAAGATAGCGCCTCACCTTTAATGGAACATCTTACATTATTTCATGACCATACTATTTTAATCTTAATTTTAATTACAATTTTAGTTAGCCAAATGCTATTAAGCATGTTATTAAATAAACTCTCACACCGATTTTTACTTGAAGGTCAATTAATTGAAACTATTTGGACTATTCTACCTGCTATTATTCTTATTTTAATTGCCTTACCCTCACTTCGATTATTATACATTCTAGACGAAATTAATAACCCTTCTATTACTATTAAAATTATCGGACATCAATGGTATTGGTCATATGAATATTCTGATTATAAAAATATTGAATTTGATTCCTATATGATTCCTACCAAAGAACTTAACTCTTTTAATTTTCGTCTCCTAGAAGTAGATAATCGAACTCCTTTTCCTTATAAAACTCAAATTCGACTCTTAGTTACGTCTGCAGATGTAATTCATTCTTGGACAGTACCAAGTATGGGAATTAAAATTGATAGCACCCC
<210>5
<211>43
<212>dsRNA
<213> 玉米象
<220> dsRNA上游引物
<400>
taatacgactcactatagggCAAGATAGCGCCTCACCTTTAAT
<210>6
<211>44
<212>dsRNA
<213> 玉米象
<220> dsRNA下游引物
<400>
taatacgactcactatagggGGGGTGCTATCAATTTTAATTCCC
<210>7
<211>411
<212>dsRNA
<213> 玉米象
<220> 杀虫基因序列
<400>
TATGTATCAATGGTGGCGAGATATTATTCGAGAGGGAACCTTCCAAGGATTACATACTTTAAAAGTAACTATGGGTCTTCGTTGGGGAATGATTTTATTCATTACATCAGAAGTATTTTTTTTTCTTGGATTTTTTTGGAGTTTCTTTCATGCTAGTTTATCCCCAAGTATTGAAATTGGTTTAGAATGGCCTCCTAAGGGAATTTTTACCTTTAATCCCCTAGAAATTCCACTATTAAATACCTTAATTCTTATTTCATCAGGTTTAACTATTTCATGGTCACACCATGCAATTATGGAAAATAATTATACCCAATCCTTTCAAAGCCTTTTAATTACTGTAATTTTAGGTTTATATTTTTCCTTTCTTCAAAGTTATGAATATTACCAAGCCCCATTCTCTATTAGTGA
<210>8
<211>41
<212>dsRNA
<213> 玉米象
<220> dsRNA上游引物
<400>
taatacgactcactatagggTATGTATCAATGGTGGCGAGA
<210>9
<211>41
<212>dsRNA
<213> 玉米象
<220> dsRNA下游引物
<400>
taatacgactcactatagggCACTAATAGAGAATGGGGCTT

Claims (10)

1.一种杀虫组合物，其特征在于，包括杀虫基因序列和辣根素，所述的基因序列如SEQID NO：1所示，或至少包含SEQ ID NO：1所示序列90％的同一性的基因序列。
2.根据权利要求1所述的杀虫组合物，其特征在于，合成所述杀虫基因序列的引物包括SEQ ID NO：2所示的上游引物和SEQ ID NO：3所示的下游引物。
3.根据权利要求1所述的杀虫组合物，其特征在于，所述的杀虫基因序列根据NCBI数据库中玉米象细胞色素C氧化酶核心亚基Ⅰ基因(NCBI参考序列：NC_030764.1:1323-2864)设计的基因片段。
4.一种杀虫组合物，其特征在于，包括杀虫基因序列和辣根素，所述的基因序列如SEQID NO：4所示，或至少包含SEQ ID NO：4所示序列90％的同一性的基因序列。
5.根据权利要求4所述的杀虫组合物，其特征在于，合成所述杀虫基因序列的引物包括SEQ ID NO：5所示的上游引物和SEQ ID NO：6所示的下游引物。
6.根据权利要求4所述的杀虫组合物，其特征在于，所述的杀虫基因序列根据NCBI数据库中玉米象细胞色素C氧化酶核心亚基Ⅱ基因(GENBANK登录号：KX783028)设计的基因片段。
7.一种杀虫组合物，其特征在于，包括杀虫基因序列和辣根素，所述的基因序列如SEQID NO：7所示，或至少包含SEQ ID NO：7所示序列90％的同一性的基因序列。
8.根据权利要求7所述的杀虫组合物，其特征在于，合成所述杀虫基因序列的引物包括SEQ ID NO：8所示的上游引物和SEQ ID NO：9所示的下游引物。
9.根据权利要求7所述的杀虫组合物，其特征在于，所述的杀虫基因序列根据NCBI数据库中玉米象细胞色素C氧化酶核心亚基Ⅲ基因(NCBI参考序列：NC_030764.1:4574-5365)设计的基因片段。
10.权利要求1-9任一权利要求所述的杀虫组合物用于制备防治玉米象农药的应用；所述的杀虫基因序列通过注射法或饲喂法使用；辣根素通过熏蒸方式使用，熏蒸浓度为3.997μL/L。
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