ES2410230B1 - PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF CEREBROVASCULAR DISEASES. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende citicolina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y un activador de SIRT1 para su uso como medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad cerebrovascular.The present invention relates to a pharmaceutical composition comprising citicoline or a pharmaceutically acceptable salt thereof and a SIRT1 activator for use as a medicament for the treatment and / or prevention of cerebrovascular disease.

Description

Composición farmacéutica para el tratamiento de las enfermedades Pharmaceutical composition for the treatment of diseases

cerebrovasculares cerebrovascular

CAMPO DE LA INVENCiÓN FIELD OF THE INVENTION

La presente invención se relaciona con composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfenmedades cerebrovasculares, en particular para el tratamiento de la isquemia cerebral. The present invention relates to pharmaceutical compositions for the treatment of cerebrovascular diseases, in particular for the treatment of cerebral ischemia.

ESTADO DE LA TÉCNICA STATE OF THE TECHNIQUE

Las enfenmedades cerebrovasculares (ECV) comprenden un conjunto de trastornos de la vasculatura cerebral que conllevan a una disminución del flujo sanguineo en el cerebro con la consecuente afectación, de fonma transitoria o permanente, de la función de una región generalizada del cerebro o de una zona pequeña o focal. Las ECV son la tercera causa de muerte en el mundo Cerebrovascular diseases (CVD) comprise a set of disorders of the cerebral vasculature that lead to a decrease in blood flow in the brain with the consequent involvement, of transient or permanent phonma, of the function of a generalized region of the brain or an area Small or focal. CVDs are the third leading cause of death in the world

desarrollado, y la 2a en hombres y la 1a en mujeres en España; se consideran developed, and the 2nd in men and the 1st in women in Spain; they are considered

la primera causa de discapacidad y de demencia vascular y afectan a un 50% de la población mayor de 60 años, por lo que constituyen en la actualidad un problema de salud y una urgencia médica. Atendiendo al tipo de episodio vascular pueden ser hemorrágicas o isquémicas. the first cause of disability and vascular dementia and affect 50% of the population over 60 years, so they are currently a health problem and a medical emergency. According to the type of vascular episode they can be hemorrhagic or ischemic.

La estrategia del tratamiento de la isquemia cerebral en su fase aguda tiene dos objetivos principales: la restauración del flujo sanguineo cerebral (reperfusión) y la limitación del daño neuronal (neuroprotección). La The strategy of treating cerebral ischemia in its acute phase has two main objectives: the restoration of cerebral blood flow (reperfusion) and the limitation of neuronal damage (neuroprotection). The

orientación terapéutica más importante en estos pacientes con infarto cerebral consiste en mejorar el flujo sanguíneo cerebral y reducir o bloquear las consecuencias metabólicas a nivel celular y subcelular. Most important therapeutic guidance in these patients with cerebral infarction is to improve cerebral blood flow and reduce or block metabolic consequences at the cellular and subcellular levels.

Uno de los objetivos principales de las investigaciones en el tratamiento de la isquemia cerebral es desarrollar fármacos que intervengan en la cascada isquémica y reduzcan la cantidad de tejido dañado. De este modo se podrá One of the main objectives of research in the treatment of cerebral ischemia is to develop drugs that intervene in the ischemic cascade and reduce the amount of damaged tissue. This way you can

obtener un mejor resultado clínico, traducido no sólo en supervivencia, sino obtain a better clinical result, translated not only in survival, but

también en la mejora de la calidad de vida de los pacientes que sufren eventos vasculares agudos. also in improving the quality of life of patients suffering from acute vascular events.

Los modelos de isquemia cerebral en animales han contribuido al desarrollo del conocimiento de este problema. Se han ensayado muchos agentes The models of cerebral ischemia in animals have contributed to the development of knowledge of this problem. Many agents have been tested

neuroprotectores en estos modelos y muy pocos rebasan los criterios de neuroprotectors in these models and very few exceed the criteria of

eficacia y seguridad en ensayos clinicos. efficacy and safety in clinical trials.

La CDP-Colina (Citidina Difosfato Colina), también llamada Citicolina, es un precursor esencial para la síntesis de fosfatidilcolina, componente de la membrana celular. La administración exógena de CDP-Colina reduce la destrucción de la membrana celular en modelos experimentales, provocando un aumento de la síntesis de la fosfatidilcolina y una reducción de los niveles de ácidos grasos libres. Se ha demostrado que la citicolina posee efectos neuroprotectores en varios modelos animales de lesión del sistema nervioso central (SNC) incluyendo la isquemia cerebral, aunque el mecanismo neuroprotector de la CDP-Colina no se conoce en toda su extensión. Actualmente, se relaciona este efecto con una reducción de ácidos grasos libres, una menor producción de radicales libres, estabilización de la membrana neuronal, decremento de la toxicidad provocada por el glutamato y CDP-Choline (Citidine Diphosphate Choline), also called Citicoline, is an essential precursor for the synthesis of phosphatidylcholine, a component of the cell membrane. Exogenous administration of CDP-Choline reduces cell membrane destruction in experimental models, causing an increase in phosphatidylcholine synthesis and a reduction in free fatty acid levels. Citicoline has been shown to have neuroprotective effects in several animal models of central nervous system injury (CNS) including cerebral ischemia, although the neuroprotective mechanism of CDP-Choline is not known to its full extent. Currently, this effect is related to a reduction in free fatty acids, a lower production of free radicals, stabilization of the neuronal membrane, a decrease in the toxicity caused by glutamate and

un aumento de la supervivencia neuronal. Además, la COP-colina ha an increase in neuronal survival. In addition, COP-hill has

mostrado propiedades beneficiosas en diferentes escenarios, que incluyen shown beneficial properties in different scenarios, which include

traumatismos craneales, trastornos cognitivos, enfermedad de Parkinson, head injuries, cognitive disorders, Parkinson's disease,

drogadicción, ambliopia, glaucoma, lesión de médula espinal, lesión axonal, lesión de nervio periférico y nocicepción. De modo apreciable, las propiedades de la CDP-colina parecen extenderse incluso a otros escenarios, tales como la regulación de la liberación de insulina, lo que sugiere la implicación de efectos pleiotrópicos desconocidos de esta sustancia. drug addiction, amblyopia, glaucoma, spinal cord injury, axonal injury, peripheral nerve injury and nociception. Notably, the properties of CDP-choline appear to extend even to other scenarios, such as the regulation of insulin release, suggesting the implication of unknown pleiotropic effects of this substance.

Las sirtuinas, las cuales pertenecen a una familia de desacetilasas Sirtuins, which belong to a family of deacetylases

dependientes de NAD+, han aparecido recientemente como proteínas NAD + dependent, have recently appeared as proteins

implicadas en el metabolismo, envejecimiento, resistencia al estrés oxidativo involved in metabolism, aging, resistance to oxidative stress

y mantenimiento del genoma. Las sirtuinas modulan la expresión génica de acuerdo con el estado energético de la célula, actuando como sensores de energía de los niveles NAD+ mediante la desacetilación de histonas, factores de transcripción y co-reguladores. SIRTl (primer miembro de esta familia) es una nueva diana terapéutica emergente que está implicada en la regulación del metabolismo, senescencia y cáncer, y que desempeña un papel crucial en las rutas de señalización sensibles al estrés. Diversos planteamientos and genome maintenance. Sirtuins modulate gene expression according to the energy status of the cell, acting as energy sensors of NAD + levels by deacetylation of histones, transcription factors and co-regulators. SIRTl (first member of this family) is a new emerging therapeutic target that is involved in the regulation of metabolism, senescence and cancer, and that plays a crucial role in stress-sensitive signaling pathways. Various approaches

experimentales han implicado sus acciones beneficiosas en muchas experimental have implicated their beneficial actions in many

enfermedades, incluyendo las enfermedades metabólicas (diabetes tipo 2, diseases, including metabolic diseases (type 2 diabetes,

miopatías mitocondriales), cardiovasculares e inflamatorias, cáncer, mitochondrial myopathies), cardiovascular and inflammatory, cancer,

neurodegenerativas (enfermedad de Alzheimer, entre otras) e ictus. neurodegenerative (Alzheimer's disease, among others) and stroke.

De acuerdo con lo expuesto, se ha demostrado que la sobreexpresión y/o In accordance with the above, it has been shown that overexpression and / or

5 activación de SIRT1 ralentizan la muerte neuronal in vitro así como la neurodegeneración in vivo. En este contexto, se han descrito varias moléculas que actúan, directamente o indirectamente, aumentando la actividad enzimática desacetilasa de SIRT1. Este es el caso del polifenol 5 activation of SIRT1 slows neuronal death in vitro as well as neurodegeneration in vivo. In this context, several molecules have been described that act, directly or indirectly, by increasing the enzymatic deacetylase activity of SIRT1. This is the case of polyphenol.

natural, resveratrol, conocido desde hace tiempo por promover los efectos natural, resveratrol, known for a long time to promote the effects

10 protectores sobre las enfermedades cardiovasculares, y del cual también se ha demostrado que es capaz de penetrar la barrera hematoencefálica y 10 protectors on cardiovascular diseases, and which has also been shown to be able to penetrate the blood brain barrier and

ejercer un marcado efecto neuroprotector en varios escenarios patológicos exert a marked neuroprotective effect in several pathological scenarios

del SNC. Concretamente, en el contexto de la isquemia cerebral, el resveratrol ha demostrado efectos neuroprotectores en modelos animales, los 15 cuales parecen estar mediados por la activación de SIRT1 . Además, se han identificado compuestos activadores de SIRT1 de bajo peso molecular con of the SNC. Specifically, in the context of cerebral ischemia, resveratrol has demonstrated neuroprotective effects in animal models, all of which appear to be mediated by the activation of SIRT1. In addition, low molecular weight SIRT1 activating compounds have been identified with

caracteristicas in vivo e in vitro semejantes a las del resveratrol, Jos cuales characteristics in vivo and in vitro similar to those of resveratrol, which

actúan probablemente sobre las mismas rutas y son 1000 veces más potentes. they probably act on the same routes and are 1000 times more powerful.

El documento W00238141 describe un método para el tratamiento de Document W00238141 describes a method for the treatment of

trastornos cognitivos leves (alteraciones de la memoria relacionadas con la mild cognitive disorders (memory disorders related to

edad) y slntomas relacionados (Alzheimer y otras enfermedades neurodegenerativas) así como la isquemia cerebral, que comprende la age) and related symptoms (Alzheimer's and other neurodegenerative diseases) as well as cerebral ischemia, which includes

25 administración de un agente serotoninérgico, en particular, resveratrol. Administration of a serotonergic agent, in particular, resveratrol.

Aunque dicho documento menciona que dicho compuesto se puede Although said document mentions that said compound can be

administrar junto con otros compuestos activadores de la memoria, en la administer together with other memory activating compounds, in the

parte experimental sólo se demuestra el uso de resveratrol a distintas dosis para el tratamiento de la demencia asociada a la edad (MCI). The experimental part only demonstrates the use of resveratrol at different doses for the treatment of age-related dementia (MCI).

COMPENDIO DE LA INVENCiÓN SUMMARY OF THE INVENTION

Los autores de la presente invención han demostrado que la CDP-colina y el activador de SIRT1, resveratrol, poseen sorprendentemente un potente efecto sinérgico que lleva hasta reducciones del 60% del volumen de infarto en un The authors of the present invention have shown that CDP-choline and the activator of SIRT1, resveratrol, surprisingly possess a potent synergistic effect that leads to 60% reductions in infarct volume in a

35 modelo animal de isquemia cerebral, cuando se emplean conjuntamente a dosis individualmente sub-efectivas de dichas sustancias. 35 animal model of cerebral ischemia, when used together at individually sub-effective doses of said substances.

Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención se relaciona con una Therefore, in a first aspect, the present invention relates to a

composición farmacéutica que comprende una combinación de (i) una cantidad terapéuticamente efectiva de citicolina o una sal farmacéutica mente aceptable de la misma y (ii) una cantidad terapéuticamente efectiva de un Pharmaceutical composition comprising a combination of (i) a therapeutically effective amount of citicoline or a pharmaceutically acceptable salt thereof and (ii) a therapeutically effective amount of a

5 activador de SIRT1 junto uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables para su uso como medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad cerebrovascular. 5 activator of SIRT1 together with one or more pharmaceutically acceptable vehicles for use as a medicine for the treatment and / or prevention of cerebrovascular disease.

En una realización particular, dicho activador de SIRT1 se selecciona del In a particular embodiment, said activator of SIRT1 is selected from the

10 grupo formado por resveratrol, 3,4,5-trimetoxi-N-(2-(3-(piperazin-1ilmetil}imidazo[2, 1-b ]tiazol-6-il}fenil)benzamida, N-(2-(3-(piperazin-1ilmetil}imidazo[2, 1-b ]tiazol-6-il}fenil)quinoxalin-2 -carboxamida, (R}-N-(2-(3-«3hidroxipirrolindin-1-il}metil}imidazo[2, 1-b]tiazol-6-il}fenil}-2-naftamida. 10 group consisting of resveratrol, 3,4,5-trimethoxy-N- (2- (3- (piperazin-1-methylmethyl) imidazo [2,1-b] thiazol-6-yl} phenyl) benzamide, N- (2- (3- (piperazin-1-methylmethyl) imidazo [2,1-b] thiazol-6-yl} phenyl) quinoxalin-2-carboxamide, (R} -N- (2- (3- "3-hydroxypyrrolindin-1-yl} methyl } imidazo [2,1-b] thiazol-6-yl} phenyl} -2-naphthamide.

15 En una realización particular de la invención, dicha enfermedad In a particular embodiment of the invention, said disease

cerebrovascular es la isquemia cerebral. Más particularmente, dicha isquemia Cerebrovascular is cerebral ischemia. More particularly, said ischemia

cerebral es isquemia cerebral aguda o crónica. En una realización preferida, Cerebral is acute or chronic cerebral ischemia. In a preferred embodiment,

dicha isquemia cerebral es ataque isquémico transitorio, traumatismo craneoencefálico o jetus cerebral. said cerebral ischemia is transient ischemic attack, craniocerebral trauma or cerebral jetus.

En otra realización particular de la invención, dicha composición se administra In another particular embodiment of the invention, said composition is administered

de forma separada, simultánea o secuencial. separately, simultaneously or sequentially.

En un caso particular, dicho medicamento es para la administración por vía In a particular case, said medication is for administration via

25 oral. En otro caso particular, dicho medicamento es para la administración por 25 oral. In another particular case, said medication is for administration by

vía parenteral. parenteral route

En otra realización particular, la dosis de citicolina o sal farmacéuticamente aceptable es de entre 100 mg y 5000 mg al dia. En una realización más In another particular embodiment, the dose of citicoline or pharmaceutically acceptable salt is between 100 mg and 5000 mg daily. In one more embodiment

30 particular, la dosis de citicolina o sal farmacéuticamente aceptable es de entre 500 mg y 2000 mg al dia. En otra realización de la invención, la dosis de dicho actívador de SIRT-1 es de entre 0,1 mg a 500 mg al dia. Más particularmente, la cantidad de activador de SIRT-1 es de entre 1 mg a 500 mg. In particular, the dose of citicoline or pharmaceutically acceptable salt is between 500 mg and 2000 mg daily. In another embodiment of the invention, the dose of said SIRT-1 activator is between 0.1 mg to 500 mg daily. More particularly, the amount of activator of SIRT-1 is between 1 mg to 500 mg.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de una composición In another aspect, the invention relates to the use of a composition

farmacéutica que comprende una combinación de (i) una cantidad terapéuticamente efectiva de citicolina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y (ii) una cantidad terapéuticamente efectiva de un activador de pharmaceutical comprising a combination of (i) a therapeutically effective amount of citicoline or a pharmaceutically acceptable salt thereof and (ii) a therapeutically effective amount of an activator of

SIRT1 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad cerebrovascular. SIRT1 for the preparation of a medicine for the treatment and / or prevention of cerebrovascular disease.

En una realización particular, dicho activador de SIRT1 se selecciona del grupo formado por resveratrol, 3,4,5-trimetoxi-N-(2-(3-(piperazin-1ilmetil)imidazo[2 ,1-b ]tiazol-6-il)fenil)benzamida, N-(2-(3-(piperazin-1ilmetil)imidazo[2 ,1-b ]tiazol-6-il)fenil)quinoxalin-2 -carboxamida, (R)-N-(2-(3-«3hidroxipirrolindin-1-il)metil)imidazo[2,1-b ]tiazol-6-il)fenil)-2-naftamida. In a particular embodiment, said SIRT1 activator is selected from the group consisting of resveratrol, 3,4,5-trimethoxy-N- (2- (3- (piperazin-1-methylmethyl) imidazo [2,1-b] thiazole-6- il) phenyl) benzamide, N- (2- (3- (piperazin-1-methylmethyl) imidazo [2,1-b] thiazol-6-yl) phenyl) quinoxalin-2-carboxamide, (R) -N- (2- (3- "3-Hydroxypyrrolindin-1-yl) methyl) imidazo [2,1-b] thiazol-6-yl) phenyl) -2-naphthamide.

En otra realización particular, dicha enfermedad cerebrovascular es isquemia cerebral. In another particular embodiment, said cerebrovascular disease is cerebral ischemia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

Figura 1: Efecto de CDP-colina sobre el volumen de infarto después de oclusión de la arteria cerebral media (OACM o MCAO) Se expusieron las ratas a una OACM permanente durante 48 horas y se cuantificaron los volúmenes de infarto (ver Materiales y Métodos) en Figure 1: Effect of CDP-choline on the volume of infarction after occlusion of the middle cerebral artery (LMO or MCAO) The rats were exposed to a permanent OACM for 48 hours and the infarct volumes were quantified (see Materials and Methods) in

secciones coronales en serie teñidas con TIC . Los datos son medias±SEM, serial coronal sections stained with TIC. The data are means ± SEM,

n=6; ·P<O.05). n = 6; P <O.05).

Figura 2: Efecto de CDP-colina sobre los niveles de SIRT1 en homogenados de cerebro de rata después de OACM. Figure 2: Effect of CDP-choline on SIRT1 levels in rat brain homogenates after OACM.

(A) Inmunoblot representativo mostrando la expresión de la proteina SIRT-1 en tejido cortical peri-infarto de animales SHAM y OACM y el efecto del tratamiento con CDP-colina. Se normalizó la carga de proteína determinando j3-actina. (B) Análisis densitométrico de la proteina SIRT-1 de 3 ensayos independientes. Los datos representan media±SEM; ·P<O.05 vs SHAM; #p<O.05 vs. SHAM o MCAO (OACM). (A) Representative immunoblot showing the expression of the SIRT-1 protein in peri-infarcted cortical tissue of SHAM and OACM animals and the effect of treatment with CDP-choline. Protein loading was normalized by determining j3-actin. (B) Densitometric analysis of the SIRT-1 protein from 3 independent assays. Data represent mean ± SEM; · P <O.05 vs SHAM; #p <O.05 vs. SHAM or MCAO (OACM).

Figura 3: Efecto de COP-colina sobre los niveles (A,B) y actividad (C) de la proteina SIRT1 en neuronas corticales cultivadas de ratas. Figure 3: Effect of COP-choline on the levels (A, B) and activity (C) of the SIRT1 protein in cultured cortical neurons of rats.

(A) Inmunoblot representativo mostrando la expresión de SIRT-1 en extractos citosólicos y nucleares (ver MétodOS). Se normalizó la carga de proteína determinando Sp-1. (B) Análisis densitométrico de la proteína SIRT-1 de 3 ensayos independientes. Los datos son media±SEM, ·P<0.05 vs Control nuclear. (C) La actividad enzimática de SIRT-1 se determinó en extractos totales, nucleares y citosólicos 24 h después del tratamiento con CDP-colina. Los datos son media±SEM, ·P<0.05 vs control total y nuclear. (A) Representative immunoblot showing the expression of SIRT-1 in cytosolic and nuclear extracts (see Methods). Protein loading was normalized by determining Sp-1. (B) Densitometric analysis of the SIRT-1 protein from 3 independent assays. Data are mean ± SEM, · P <0.05 vs Nuclear control. (C) The enzymatic activity of SIRT-1 was determined in total, nuclear and cytosolic extracts 24 h after treatment with CDP-choline. The data are mean ± SEM, · P <0.05 vs total and nuclear control.

Figura 4: Efecto de CDP-colina sobre los niveles de la proteina SIRT1 en Figure 4: Effect of CDP-choline on SIRT1 protein levels in

células mononucleares de ratas. mononuclear cells of rats.

(A) Inmunoblot representativo mostrando la expresión de SIRT-1 en células mononucleares (ver Métodos). Se normalizó la carga de proteína determinando GAPDH. (B) Análisis densitométrico de la proteína SIRT-1 de 3 ensayos independientes. Los datos son media±SEM, ·P<0.05 vs Control. (A) Representative immunoblot showing the expression of SIRT-1 in mononuclear cells (see Methods). Protein loading was normalized by determining GAPDH. (B) Densitometric analysis of the SIRT-1 protein from 3 independent assays. The data are mean ± SEM, · P <0.05 vs Control.

Figura 5. Efecto sinérgico de CDP-colina y el activador de SIRT1, resveratrol, sobre el volumen de infarto después de OACM en ratas. ANOVA<O,0001. #p<O.01 vs CDP 200mg/kg; Resveratrol 2.5mglkg. ·p<O.001 vs control; Post-hoc test: Bonferroni Figure 5. Synergistic effect of CDP-choline and the activator of SIRT1, resveratrol, on the volume of infarction after OACM in rats. ANOVA <O, 0001. #p <O.01 vs CDP 200mg / kg; Resveratrol 2.5mglkg · P <O.001 vs control; Post-hoc test: Bonferroni

DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN La presente invención se refiere a combinaciones terapéuticas para el tratamiento y/o prevención de enfermedades cerebrovasculares (ECV), en DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to therapeutic combinations for the treatment and / or prevention of cerebrovascular diseases (CVD), in

particular, para el tratamiento de la isquemia cerebral, que comprenden in particular, for the treatment of cerebral ischemia, which comprise

citicolina y un activador de SIRT1 a dosis fijas que son adaptables a las dosis requeridas por pacientes de forma individual o determinados subgrupos de población. Citicoline and a fixed-dose SIRT1 activator that are adaptable to the doses required by individual patients or certain population subgroups.

Según se ha mencionado anteriormenteI los autores de la presente invención han observado que una composición que comprende la combinación (i) CDPcolina y (ii) un activador de SIRT1, diferente de citicolina, por ejemplo, resveratrol, muestra, sorprendentemente, un potente efecto sinérgico tras su administración conjunta en modelos animales de isquemia cerebral que produce unas reducciones del 60% del volumen de infarto después de la OACM (oclusión de la arteria cerebral media). As mentioned above, the authors of the present invention have observed that a composition comprising the combination (i) CDPcoline and (ii) an activator of SIRT1, other than citicoline, for example, resveratrol, shows, surprisingly, a potent synergistic effect after joint administration in animal models of cerebral ischemia that produces 60% reductions in the volume of infarction after the OACM (occlusion of the middle cerebral artery).

Por tanto, la presente invención se relaciona en un primer aspecto con una composición farmacéutica, de aquí en adelante denominada "composición Therefore, the present invention relates in a first aspect to a pharmaceutical composition, hereinafter referred to as "composition

farmacéutica de la invención", que comprende una combinación de (i) una cantidad terapéutica mente efectiva de citicolina o una sal fanmacéuticamente aceptable de la misma y (ii) una cantidad terapéuticamente efectiva de un Pharmaceutical of the invention ", which comprises a combination of (i) a therapeutically effective amount of citicoline or a pharmaceutically acceptable salt thereof and (ii) a therapeutically effective amount of a

activador de SIRT1 junto uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables para su uso como medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad cerebrovascular. En una realización preferida de la invención, SIRT1 activator together with one or more pharmaceutically acceptable vehicles for use as a medicine for the treatment and / or prevention of cerebrovascular disease. In a preferred embodiment of the invention,

dicha enfenmedad es la isquemia cerebral. This emphaticity is cerebral ischemia.

Por tratamiento profiláctico o preventivo se entiende cuando la composición de la invención se administra antes de la posible aparición de la isquemia. En otra realización particular de la invención, ésta se refiere al uso de la composición de la invención para prevenir la extensión del tejido cerebral dañado. De acuerdo con un aspecto más específico, ésta se refiere al uso de la composición de la invención cuando el tejido cerebral dañado y en particular el infarto cerebral está asociado con la isquemia cerebral. Prophylactic or preventive treatment is understood when the composition of the invention is administered before the possible occurrence of ischemia. In another particular embodiment of the invention, this refers to the use of the composition of the invention to prevent the spread of damaged brain tissue. According to a more specific aspect, this refers to the use of the composition of the invention when damaged brain tissue and in particular cerebral infarction is associated with cerebral ischemia.

Como se ha mencionado anteriormente, el término "enfermedad As mentioned earlier, the term "disease

cerebrovascular o ECV' tal como aquí se emplea, se refiere a un conjunto de trastornos de la vasculatura cerebral que conllevan a una disminución del flujo cerebrovascular or CVD 'as used herein, refers to a set of disorders of the cerebral vasculature that lead to a decrease in flow

sanguíneo en el cerebro con la consecuente afectación, de forma transitoria o permanente, de la función de una región generalizada del cerebro o de una zona pequeña o focal. blood in the brain with the consequent involvement, temporarily or permanently, of the function of a generalized region of the brain or of a small or focal area.

El término "isquemia cerebral", tal como aquf se utiliza, consiste en un episodio isquémico cerebral que puede definirse como una reducción de la aportación de sangre a un tejido. la isquemia cerebral puede ser causada por una disminución o interrupción de la aportación de sangre desde la arteria que irriga el cerebro. la isquemia cerebral puede ser aguda o crónica. Por The term "cerebral ischemia," as used herein, consists of a cerebral ischemic episode that can be defined as a reduction in blood supply to a tissue. cerebral ischemia can be caused by a decrease or interruption of blood supply from the artery that supplies the brain. cerebral ischemia can be acute or chronic. By

tanto, en una realización particular de la invención, dicha isquemia cerebral incluye isquemia cerebral aguda e isquemia cerebral crónica. En una therefore, in a particular embodiment of the invention, said cerebral ischemia includes acute cerebral ischemia and chronic cerebral ischemia. In a

realización más particular, es un ataque isquémico transitorio, traumatismo more particular realization, is a transient ischemic attack, trauma

craneoencefálico o ictus cerebral. craniocerebral or cerebral stroke.

El ténmino "ataque isquémico transitorio", tal como aquí se utiliza, se refiere a un episodio cerebrovascular de tipo isquémico que se produce por la fafta de aporte sanguíneo a una parte del cerebro, de forma transitoria, desapareciendo fas síntomas, por definición, antes de 24 horas, generalmente antes de 1 hora. Durante un ataque isquémico transitorio, la interrupción temporal del suministro sanguíneo a un área del cerebro ocasiona una reducción breve y repentina en la función cerebral. The term "transient ischemic attack", as used herein, refers to an ischemic cerebrovascular episode that occurs due to the blood supply to a part of the brain, transiently, disappearing fas symptoms, by definition, before 24 hours, usually before 1 hour. During a transient ischemic attack, temporary interruption of blood supply to an area of the brain causes a brief and sudden reduction in brain function.

En la presente invención, los términos "CDP-Colina", "citidina difosfato colina" In the present invention, the terms "CDP-Hill", "choline cytidine diphosphate"

o "citicolina" se usan indistintamente. Como se ha mencionado anteriormente, or "citicoline" are used interchangeably. As it mentioned above,

la citicolina o CDP-colina, un intermedio en la bioslntesis de la fosfatidilcolina, ha demostrado poseer efectos neuroprotectores en varios modelos animales de lesión del SNC incluyendo la isquemia cerebral. Citicoline or CDP-choline, an intermediate in the biosynthesis of phosphatidylcholine, has been shown to have neuroprotective effects in several animal models of CNS injury including cerebral ischemia.

Por otra parte, el término "SIRT 1" tal como aquí se emplea, se refiere a la sirtuina 1. SIRTl es una sirtuina implicada en la regulación del metabolismo, senescencia, cáncer, y que desempeña un papel crucial en las rutas de señalización sensibles al estrés. Se ha visto que la sobreexpresión ylo On the other hand, the term "SIRT 1" as used herein refers to sirtuin 1. SIRTl is a sirtuin involved in the regulation of metabolism, senescence, cancer, and which plays a crucial role in sensitive signaling pathways. to stress It has been seen that overexpression and what

activación de SIRT1 ralentizan la muerte neuronal in vitro así como la neurodegeneración in vivo. SIRT1 activation slows neuronal death in vitro as well as neurodegeneration in vivo.

Así, en una realización particular de la presente invención, la composición de Thus, in a particular embodiment of the present invention, the composition of

la presente invención, que comprende citícolína y un actívador de SIRT1, se The present invention, which comprises citicolin and an SIRT1 activator, is

usa como medicamento para el tratamiento de enfermedades use as a medicine to treat diseases

neurodegenerativas, tal como, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer. En otra realización particular de la invención, la composición de la invención se neurodegenerative, such as, for example, Alzheimer's disease. In another particular embodiment of the invention, the composition of the invention is

usa para el tratamiento de trastornos neurológicos, diabetes, enfermedades used for the treatment of neurological disorders, diabetes, diseases

cardiovasculares, cáncer y enfermedades relacionadas con el envejecimiento cardiovascular, cancer and aging-related diseases

o la edad. or age

El término "activador de SIRT1 " tal como aquí se menciona, se refiere a cualquier molécula que directa o indirectamente active dicha sirtuina 1, tanto a nivel transcripcional, postranscripcional, traduccional o postraduccional. Se han descrito en la literatura varias moléculas que actúan, directa o indirectamente, aumentando la actividad enzimática desacetilasa de SIRT1 . Este es el caso del polifenol natural, resveratrol, conocido desde hace tiempo por promover los efectos protectores sobre las enfermedades cardiovasculares, y del cual también se ha demostrado que es capaz de penetrar la barrera hematoencefálica y ejercer un marcado efecto neuroprotector en varios escenarios patológicos del SNC. Así, a modo ilustrativo, el resveratrol se une directamente a SIRTl promoviendo un cambio conformacional en la enzima. Recientemente, se han descrito otras pequeñas moléculas como activadores potentes de SIRT1 (Milne et al, 2007. Small molecule activators of SIRT1 as therapeutics for the treatment of type 2 diabetes. Nature, 450: 712-6). Algunas de dichas moléculas se están ensayando en clínica para el tratamiento de diabetes y enfermedades The term "activator of SIRT1" as mentioned herein refers to any molecule that directly or indirectly activates said sirtuin 1, both at the transcriptional, post-transcriptional, translational or post-translational level. Several molecules that act, directly or indirectly, increase the enzymatic deacetylase activity of SIRT1 have been described in the literature. This is the case of natural polyphenol, resveratrol, known for a long time to promote the protective effects on cardiovascular diseases, and which has also been shown to be able to penetrate the blood brain barrier and exert a marked neuroprotective effect in several pathological scenarios of the SNC Thus, by way of illustration, resveratrol binds directly to SIRTl promoting a conformational change in the enzyme. Recently, other small molecules have been described as potent activators of SIRT1 (Milne et al, 2007. Small molecule activators of SIRT1 as therapeutics for the treatment of type 2 diabetes. Nature, 450: 712-6). Some of these molecules are being clinically tested for the treatment of diabetes and diseases.

5 oncológicas, enfermedades relacionadas con la edad y la enfermedad de Alzheimer (www.sirtrispharma.com/pipeline.html). 5 cancer, age-related diseases and Alzheimer's disease (www.sirtrispharma.com/pipeline.html).

Asi , en una realización particular de la invención, dicho activador de SIRT1 se selecciona del grupo formado por resveratrol, 3,4,5-trimetoxi-N-(2-(3Thus, in a particular embodiment of the invention, said SIRT1 activator is selected from the group consisting of resveratrol, 3,4,5-trimethoxy-N- (2- (3

10 (piperazin-1-ilmetil)imidazo[2,1-b]tiazol-6-il)fenil)benzamida, N-(2-(3(piperazin-1-ilmetil)imidazo[2, 1-b]tiazol-6-il)fenil)quinoxalin-2 -carboxamida, (R)-N-(2-(3-( (3-h idroxipirrolindin-1-il)metil) imida zo[2, 1-b ]tiazol-6-il)fenil)-2naftamida. 10 (piperazin-1-ylmethyl) imidazo [2,1-b] thiazol-6-yl) phenyl) benzamide, N- (2- (3 (piperazin-1-ylmethyl) imidazo [2,1-b] thiazole- 6-yl) phenyl) quinoxalin-2-carboxamide, (R) -N- (2- (3- ((3-h idroxypyrrolindin-1-yl) methyl) imide zo [2, 1-b] thiazol-6- il) phenyl) -2naphtamide.

15 Tal como se ha mencionado anteriormente, la composición de la invención As mentioned above, the composition of the invention

comprende como uno de sus componentes citicolina o una sal comprises as one of its components citicoline or a salt

farmacéuticamente aceptable de la misma. Como sales farmacéuticamente aceptables de la CDP-Colina, se encuentran sus sales de adición básicas, en pharmaceutically acceptable thereof. As pharmaceutically acceptable salts of CDP-Choline, its basic addition salts are found in

particular las sajes alcalinas o alcalinotérreas, tales como sus sales de sodio, particularly alkaline or alkaline earth salts, such as their sodium salts,

20 potasio, calcio y magnesio, o bien sus sales con ácidos minerales u orgánicos, como el ácido clorhídríco, el ácido bromhídrico, el ácído sulfúrico, el ácido acético, el ácido trffluoroacético, el ácido cítrico, el ácido láctico, el ácido malónico, el ácido tartárico, el ácido acrílico, el ácido metacrílico, el ácido málíco, el ácido maleico, el ácido fumárico, el ácido benzoico, el ácido 20 potassium, calcium and magnesium, or its salts with mineral or organic acids, such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, acetic acid, trffluoroacetic acid, citric acid, lactic acid, malonic acid, tartaric acid, acrylic acid, methacrylic acid, malic acid, maleic acid, fumaric acid, benzoic acid, acid

25 salicílico, el ácido cinámico, el ácido metansulfónico, el ácido bencenosulfónico, el ácido p-toluensulfónico y el ácido nicotínico. La composición farmacéutica proporcionada por esta invención comprende, Salicylic acid, cinnamic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid and nicotinic acid. The pharmaceutical composition provided by this invention comprises,

citicolina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y (ii) un activador de SIRT1 , ambos en una cantidad terapéuticamente eficiente. En el 30 sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéutica mente eficiente" se refiere a la cantidad de citicolina y activador de SIRT1 calculada para producir el efecto deseado. La dosis de los componentes (i) e (ii) a administrar a un sujeto puede variar dentro de un amplio intervalo dependiendo de numerosos factores , entre los que se incluyen las 35 características de c~icolina y activador de SIRT1 utilizada, e.g., su actividad y vida media biológica, la concentración en la composición farmacéutica, la situación clínica del sujeto, la severidad de la patología, la forma farmacéutica citicoline or a pharmaceutically acceptable salt thereof and (ii) an activator of SIRT1, both in a therapeutically efficient amount. In the sense used in this description, the term "therapeutically efficient amount" refers to the amount of citicoline and activator of SIRT1 calculated to produce the desired effect. The dose of the components (i) and (ii) to be administered to a subject may vary within a wide range depending on numerous factors, including the characteristics of the cycoline and activator of SIRT1 used, eg, its biological activity and half-life, concentration in the pharmaceutical composition, the clinical situation of the subject, the severity of the pathology, the pharmaceutical form

de administración elegida, etc. La composición farmacéutica proporcionada of chosen administration, etc. The pharmaceutical composition provided

por esta invención se puede administrar una o más veces al dia con fines preventivos o terapéuticos o con otras pautas de administración, no necesariamente diaria sino también de forma puntual, semanal, etc. by this invention it can be administered one or more times a day for preventive or therapeutic purposes or with other administration guidelines, not necessarily daily but also on a timely, weekly basis, etc.

En una realización particular de la invención, los componentes de la composición de la invención se administran de de forma separada, In a particular embodiment of the invention, the components of the composition of the invention are administered separately,

simultánea o secuencial. simultaneous or sequential. En otra realización particular de la invención, dicho medicamento es para la In another particular embodiment of the invention, said medicament is for the

administración por vía oral. Asl , la composición de la invención puede oral administration Thus, the composition of the invention can

administrarse para la puesta en práctica de la presente invención por vía oral administered for the implementation of the present invention orally

en forma de comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, sellos, pastillas para chupar, soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, geles y afines. En in the form of tablets, capsules, powders, granules, seals, lozenges, solutions, suspensions, emulsions, syrups, gels and the like. In

otra realización particular, la composición se administra por vía parenteral en forma de soluciones, suspensiones, emulsiones o afines para administración intravenosa, subcutánea o intramuscular. También se contemplan fórmulas para su inhalación o administración intranasal. Another particular embodiment, the composition is administered parenterally in the form of solutions, suspensions, emulsions or related for intravenous, subcutaneous or intramuscular administration. Formulas for inhalation or intranasal administration are also contemplated.

Las composiciones farmacéuticas pueden contener agentes saborizantes, edulcorantes, etc., en vehículos o diluyentes sólidos o líquidos adecuados, o The pharmaceutical compositions may contain flavoring agents, sweeteners, etc., in suitable solid or liquid carriers or diluents, or

en medios estériles adecuados para formar suspensiones o soluciones adecuadas para inyección intravenosa, subcutánea o intramuscular. Dichas in sterile media suitable for forming suspensions or solutions suitable for intravenous, subcutaneous or intramuscular injection. These

composiciones contienen normalmente de un 1 a un 40%, preferiblemente de un 1 a un 10% en peso del compuesto activo, siendo el resto de la composición vehículos, diluyentes, disolventes y similares farmacéutica mente aceptables. Compositions usually contain 1 to 40%, preferably 1 to 10% by weight of the active compound, the rest of the composition being pharmaceutically acceptable carriers, diluents, solvents and the like.

La citicolina se administra preferiblemente de forma oral como una sal Citicoline is preferably administered orally as a salt.

aceptable desde el punto de vista farmacéutico. La sal preferida es la sal monosodio de citicolina , ya que esta forma está normalmente disponible con una pureza aceptable desde el punto de vista farmacéutico. El monosodio de citicolina es una forma de exógeno de citidina 5\cc, difosfato de colina (CDPcolina). El endógeno CDP-colina es un intermediario clave en la biosintesis de la fosfatidilcolina, un componente lipídico primario de la membrana Pharmaceutically acceptable. The preferred salt is the monosodium salt of citicoline, since this form is normally available with a pharmaceutically acceptable purity. Citicoline monosodium is an exogenous form of citidine 5, choline diphosphate (CDPcolina). The endogenous CDP-choline is a key intermediate in the biosynthesis of phosphatidylcholine, a primary lipid component of the membrane

35 involucrado en la regulación dinámica de la integridad celular. 35 involved in the dynamic regulation of cellular integrity.

Las dosis de citicolina se suministran según una base por paciente (oscilando Citicoline doses are given on a per patient basis (ranging

entre aproximadamente 45 kg hasta 100 kg por paciente, o una media de 70 between approximately 45 kg to 100 kg per patient, or an average of 70

kg por paciente). Generalmente, las dosis diarias de citicolina pueden variar kg per patient). Generally, daily doses of citicoline may vary.

desde aproximadamente 100 mg hasta unos 5000 mg, preferiblemente desde 250 mg hasta 3000 mg, y más preferiblemente desde 500 mg hasta 2000 mg. Las dosis pueden ser administradas una sola vez o hasta cuatro o más veces al día. Una dosis altamente preferida es de 500 mg administrados dos veces from about 100 mg to about 5000 mg, preferably from 250 mg to 3000 mg, and more preferably from 500 mg to 2000 mg. Doses can be administered only once or up to four or more times a day. A highly preferred dose is 500 mg administered twice.

al día a cada paciente. Si se requiere una mayor eficacia terapéutica se recomienda una administración de 2000 mg en una sola toma o repartida en daily to each patient. If greater therapeutic efficacy is required, an administration of 2000 mg is recommended in a single dose or distributed in

dos tomas de 1000 mg. two doses of 1000 mg.

La duración del tratamiento es variable, pero se ha observado que los pacientes toleran bien la citicolina en dosis comprendidas entre los 250 mg y los 2000 mg aproximadamente en periodos prolongados, es decir, desde The duration of treatment is variable, but it has been observed that patients tolerate citicoline well in doses between 250 mg and 2000 mg approximately for prolonged periods, that is, since

varias semanas hasta varios años. Las dosis deben variar a lo largo del tiempo dependiendo de la gravedad de los síntomas, de la tolerancia several weeks to several years. Doses should vary over time depending on the severity of symptoms, tolerance

individual de cada paciente, ruta de administración y respuesta al tratamiento. Éste puede ser continuado de forma indefinida si se tolera bien. individual of each patient, route of administration and response to treatment. This can be continued indefinitely if it is well tolerated.

En otra realización particular de la invención, la cantidad de dicho activador de SIRT-1, en partícular, la dosis de resveratrol a administrar en la composición de la invención es de entre 0,1 mg a 500 mg. Más preferiblemente, la cantidad de activador de SIRT-l a administrar es de entre 1 mg a 500 mg. Además de contener los portadores y/o excipientes fanmacéuticos estándar, In another particular embodiment of the invention, the amount of said SIRT-1 activator, in particular, the dose of resveratrol to be administered in the composition of the invention is between 0.1 mg to 500 mg. More preferably, the amount of SIRT-1 activator to be administered is between 1 mg to 500 mg. In addition to containing the standard fanmaceutical carriers and / or excipients,

en una realización particular de la invención, la composición de la invención también puede contener otras sustancias terapéuticas activas. Así, la composición farmacéutica proporcionada por esta invención, si se desea, In a particular embodiment of the invention, the composition of the invention may also contain other active therapeutic substances. Thus, the pharmaceutical composition provided by this invention, if desired,

puede usarse junto con otros fánmacos, por ejemplo, fánmacos útiles en el tratamiento de las enfermedades cerebrovasculares, en particular, de la it can be used together with other drugs, for example, drugs useful in the treatment of cerebrovascular diseases, in particular of the

isquemia cerebral, con el fin de aumentar la eficiencia de la composición cerebral ischemia, in order to increase the efficiency of the composition

farmacéutica proporcionada por esta invención, generándose de este modo una terapia de combinación. Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de la misma composición fanmacéutica o, alternativamente, pueden Pharmaceutical provided by this invention, thereby generating a combination therapy. Such additional drugs may be part of the same pharmaceutical composition or, alternatively, may

facilitarse como una composición farmacéutica separada para su be provided as a separate pharmaceutical composition for

administración al mismo tiempo (administración simultánea) que la administration at the same time (simultaneous administration) that the

composición farmacéutica proporcionada por esta invención o en momentos pharmaceutical composition provided by this invention or at times

diferentes (administración secuencial) respecto a la administración de la different (sequential administration) with respect to the administration of the

composición farmacéutica proporcionada por esta invención. En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de una composición Pharmaceutical composition provided by this invention. In another aspect, the present invention relates to the use of a composition

farmacéutica que comprende una combinación de (i) una cantidad pharmaceutical comprising a combination of (i) an amount

5 terapéuticamente efectiva de citicolina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y (ii) una cantidad terapéuticamente efectiva de un activador de SIRT1 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o Therapeutically effective citicoline or a pharmaceutically acceptable salt thereof and (ii) a therapeutically effective amount of a SIRT1 activator for the preparation of a medicament for the treatment and / or

prevención de una enfermedad cerebrovascular, en particular, para el prevention of cerebrovascular disease, in particular for

tratamiento de la isquemia cerebral. treatment of cerebral ischemia.

10 En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la prevención y/o tratamiento de las enfermedades cerebrovasculares, en particular, de la isquemia cerebral, que comprende administrar a un sujeto en necesidad de tratamiento una cantidad terapéuticamente eficiente de una composición In another aspect, the invention relates to a method for the prevention and / or treatment of cerebrovascular diseases, in particular, of cerebral ischemia, which comprises administering to a subject in need of treatment a therapeutically efficient amount of a composition.

farmacéutica proporcionada por esta invención que comprende citicolina o Pharmaceutical provided by this invention comprising citicoline or

15 una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y un activador de SIRT1 . 15 a pharmaceutically acceptable salt thereof and an activator of SIRT1.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes, tal como ucomprendiendo", no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Throughout the description and the claims the word "comprises" and its variants, such as "understanding", are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps.

20 Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la 20 For those skilled in the art, other objects, advantages and characteristics of the

invención serán evidentes con el examen de la descripción o se pueden invention will be apparent with the examination of the description or can be

conocer por la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de know by the practice of the invention. The following examples are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of

la presente invención. The present invention.

EJEMPLOS EXAMPLES

MATERIALES Y MÉTODOS Modelo de isquemia cerebral focal permanente en rata MATERIALS AND METHODS Model of permanent focal cerebral ischemia in rat

30 Los ensayos se efectuaron en ratas Fischer macho de peso 250-300g. Las ratas fueron anestesiadas con halotano 1.5% en una mezcla de nitrógeno 70%/oxigeno 30%. Se insertó una cánula en la arteria femoral para la monitorización continua de la presión y la toma de muestras de sangre para el análisis de pH, gases y glucosa. Las temperaturas corporales y cerebrales se 30 The tests were carried out on male Fischer rats weighing 250-300g. The rats were anesthetized with 1.5% halothane in a mixture of 70% nitrogen / 30% oxygen. A cannula was inserted into the femoral artery for continuous pressure monitoring and blood sampling for pH, gas and glucose analysis. Body and brain temperatures are

35 mantuvieron a 36.5±0.5°C durante todo el proceso. Las variables fisiológicas estudiadas no fueron significativamente diferentes entre los grupos de animales antes, durante o después de la oclusión de la arteria cerebral media (OACM o MCAO) (datos no presentados). La isquemia cerebral focal permanente fue inducida por ligadura de la arteria carótida común izquierda (ACC) y oclusión de la arteria cerebral media distal ipsilateral (ACM) tal como se ha descrito anteriormente (Hurtado et al., 2008. Delayed post-ischemic administration of CDP-choline increases EAA T2 association to lipid rafts and affords neuroprotection in experimental stroke. Neurobiol Dis 2008. 29:123131). En resumen, para la ligadura de la ACC, se efectuó una incisión cervical ventral longitudinal y se aisló la ACC ipsilateral ocluyéndola permanentemente con una ligadura de hilo de seda. Después, se realizó una pequeña cranioctomía sobre el tronco de la ACM y encima de la fisura rinal. En algunos ensayos, para la oclusión, la ACM se elevó y se cauterizó (oclusión de la arteria cerebral media; OACM). Por otra parte, en los ensayos dirigidos al estudio de la sinergia entre CDP-colina y resveratrol, la ACM se ligó con una sutura 9-0 justo antes de su bifurcación en las ramas frontal y parietal. A continuación, también se ocluyó la ACC con una ligadura de hilo 35 maintained at 36.5 ± 0.5 ° C throughout the process. The physiological variables studied were not significantly different between groups of animals before, during or after occlusion of the middle cerebral artery (OACM or MCAO) (data not shown). Permanent focal cerebral ischemia was induced by left common carotid artery ligation (ACC) and ipsilateral distal middle cerebral artery occlusion (ACM) as described previously (Hurtado et al., 2008. Delayed post-ischemic administration of CDP-choline increases EAA T2 association to lipid rafts and affords neuroprotection in experimental stroke. Neurobiol Dis 2008. 29: 123131). In summary, for the ACC ligation, a longitudinal ventral cervical incision was made and the ipsilateral ACC was isolated by permanently occluding it with a silk thread ligation. Then, a small cranioctomy was performed on the trunk of the MCA and on top of the rinal fissure. In some trials, for occlusion, the MCA was elevated and cauterized (occlusion of the middle cerebral artery; OACM). On the other hand, in the trials aimed at studying the synergy between CDP-choline and resveratrol, the ACM was ligated with a 9-0 suture just before its bifurcation in the frontal and parietal branches. Next, the ACC was also occluded with a thread ligation

de seda y se confirmó la interrupción completa del flujo sanguíneo en un of silk and the complete interruption of blood flow in a

microscopio quirúrgico. Finalmente, una hora después, se reabrió la ACC contra lateral. surgical microscope Finally, an hour later, the ACC was reopened against the side.

Las ratas en la cuales la ACM estaba expuesta pero no ocluida sirvieron como controles con intervención simulada (SHAM). Después de la Rats in which the MCA was exposed but not occluded served as controls with simulated intervention (SHAM). After the

intervención quirúrgica, los animales fueron devueltos a sus jaulas y tuvieron surgical intervention, the animals were returned to their cages and had

libre acceso a la comida y a la bebida. La temperatura corporal de los Free access to food and drink. The body temperature of

animales se monitorizó durante toda la experimentación y se mantuvo a animals were monitored throughout the experiment and kept at

37.5±0.5°C empleando una manta térmica. Todos los procesos cumplieron con los criterios del Comité del Cuidado de Animales de la Universidad Complutense de Madrid de acuerdo con las Normas UE (86/609/CEE, 2003/65/CE Y RD 1201/2005). El indice de supervivencia de los animales hasta el final de la experimentación fue del 90%. 37.5 ± 0.5 ° C using a thermal blanket. All processes met the criteria of the Animal Care Committee of the Complutense University of Madrid in accordance with EU Standards (86/609 / EEC, 2003/65 / CE and RD 1201/2005). The survival rate of the animals until the end of the experiment was 90%.

Grupos experimentales en isquemia cerebral focal Experimental groups in focal cerebral ischemia

La CDP-colina fue administrada por inyección intraperitoneal (i.p.). Se establecieron dos series de ensayos: En la primera serie, se utilizaron cuatro grupos de animales para los estudios proteómicos y su confirmación por medio de la prueba Western Blol: 1) animales controles con intervención simulada, sacrificados 24 horas después de la simulación (SHAM; n=l); 2) animales controles con intervención CDP-choline was administered by intraperitoneal injection (i.p.). Two series of trials were established: In the first series, four groups of animals were used for proteomic studies and their confirmation by means of the Western Blol test: 1) control animals with simulated intervention, slaughtered 24 hours after simulation (SHAM ; n = l); 2) control animals with intervention

simulada + CDP-colina 2 g/kg (administrados 4 horas después de la intervención) y sacrificados 24 horas después de la administración (SHAM + CDP-colina; n=4); 3) animales con oclusión permanente de la arteria cerebral media + inyección i.p. de solución salina 4 horas después de la oclusión, 5 sacrificados 24 h después de la administración de la solución salina (OACM; n=4); 4) animales con OACM permanente + inyección i.p. de CDP-colina 2 g/kg 4 horas después de la oclusión, sacrificados 24 horas después de la administración de citicolina (OACM+CDP-colina; n=4). Adicionalmente, para simulated + CDP-choline 2 g / kg (administered 4 hours after the intervention) and sacrificed 24 hours after administration (SHAM + CDP-choline; n = 4); 3) animals with permanent occlusion of the middle cerebral artery + injection i.p. of saline solution 4 hours after occlusion, 5 sacrificed 24 h after administration of the saline solution (OACM; n = 4); 4) animals with permanent OACM + injection i.p. of CDP-choline 2 g / kg 4 hours after occlusion, sacrificed 24 hours after administration of citicoline (OACM + CDP-choline; n = 4). Additionally, for

la determinación del volumen de infarto, Jos animales con el mismo protocolo the determination of the volume of infarction, Jos animals with the same protocol

10 de tratamiento fueron sacrificados 48 horas después de la oclusión (OACM; n=6; OACM+CDP; n=6). En la segunda serie de ensayos dirigidos al estudio del efecto sinérgico entre CDP-colina y los activadores de SIRT1, se utilizaron cuatro grupos de animales para la determinación del volumen de infarto: 1) animales con 10 of treatment were sacrificed 48 hours after occlusion (OACM; n = 6; OACM + CDP; n = 6). In the second series of trials aimed at the study of the synergistic effect between CDP-choline and SIRT1 activators, four groups of animals were used to determine the volume of infarction: 1) animals with

15 OACM + inyección i.p. de solución salina 10 minutos y 3 horas después de la OACM (OACM; n=8); 2) animales con OACM + CDP-colina (O.2g/kg 10 minutos después de la OACM; n=6); 3) animales con OACM + el activa dar de SIRT1 , resveratrol (2.5 mg/kg 3h después de la OACM; n=7); 4) animales con OACM+CDP-colina+resveratrol (0.2 g/kg CDP-colina 10 minutos y 2.5 mg/kg 15 OACM + injection i.p. of saline solution 10 minutes and 3 hours after the OWHC (OWHC; n = 8); 2) animals with OWHC + CDP-choline (O.2g / kg 10 minutes after the OWHC; n = 6); 3) animals with OACM + the active giving of SIRT1, resveratrol (2.5 mg / kg 3h after the OACM; n = 7); 4) animals with OACM + CDP-choline + resveratrol (0.2 g / kg CDP-choline 10 minutes and 2.5 mg / kg

20 de resveratrol 3 horas después de OACM; n=6). 20 of resveratrol 3 hours after OACM; n = 6).

Estudio proteómico Se emplearon tres métodos proteómicos diferentes: proteómica clásica, método DIGE más MALDI-TOF y proteómica de expresión diferencial con Proteomic study Three different proteomic methods were used: classical proteomics, DIGE method plus MALDI-TOF and differential expression proteomics with

25 marcaje iTRAQ más LC/MS/MS, en el Centro de Apoyo a la Investigación en Genómica y Proteómica de la UCM. 25 iTRAQ marking plus LC / MS / MS, at the Center for Research Support in Genomics and Proteomics of the UCM.

Determinación del tamaño del infarto Dos días después de la OACM, se sacrifícaron los animales con una Determination of the size of the infarction Two days after the OWHC, the animals were sacrificed with a

30 sobredosis de pentobarbital sódico para valorar la consecuencia del infarto. Se extrajo el cerebro y se cortaron porciones de 2 mm de espesor para obtener cortes coronales de 1 mm (Brain Matrix, WPI, UK) que se tiñeron con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (1% TIC en tampón fosfato 0.1 M). Se calcularon los volúmenes de infarto tomando muestras de cada lado de las 30 overdoses of sodium pentobarbital to assess the consequence of the infarction. The brain was removed and 2 mm thick portions were cut to obtain 1 mm coronal cuts (Brain Matrix, WPI, UK) that were stained with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (1% TIC in 0.1 M phosphate buffer ). Infarction volumes were calculated by taking samples from each side of the

35 secciones coronales con una cámara digital (Nikon Coolpix 990), y se analizaron las imágenes utilizando ImageJ 1.33u (National Institutes of Health, Bethesda, MD). 35 coronal sections with a digital camera (Nikon Coolpix 990), and the images were analyzed using ImageJ 1.33u (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

La imagen digitalizada se proyectó en un video monitor, habiendo ocultado The scanned image was projected on a video monitor, having hidden

las condiciones experimentales al observador. El perímetro del hemisferio the experimental conditions to the observer. The perimeter of the hemisphere

contralateral se superpuso al hemisferio ipsilateral para excluir edema, y se contralateral overlapped the ipsilateral hemisphere to exclude edema, and

delinearon los márgenes del infarto con un cursor. Se determinó el área de they outlined the margins of the infarction with a cursor. The area of

infarto, que se encontraba sin lenir, por medio del recuento de pixeles heart attack, which was unleashed, by means of pixel count

contenidos en las regiones delineadas, y se expresó en milímetros contained in the delineated regions, and expressed in millimeters

cuadrados. Se integraron los volúmenes de infarto (en mm3 o en % de hemisferio infartado -VHI-) a partir de las áreas de infarto a lo largo de la extensión del infarto calculada como una proyección ortogonal. Todos los animales exhibieron infarto después del proceso de oclusión, el cual incluía la corteza , subcorteza y estriado, dependiendo de la inlensidad de la lesión. squares. Infarction volumes (in mm3 or in% of infarcted hemisphere -VHI-) were integrated from the infarct areas along the length of the infarction calculated as an orthogonal projection. All animals exhibited infarction after the occlusion process, which included the cortex, subcortex and striatum, depending on the inlensity of the lesion.

Cultivo primario de neuronas corticales de ratas los cultivos primarios de neuronas corticales de ratas se han realizado según Primary culture of rat cortical neurons Primary cultures of rat cortical neurons have been performed according to

está descríto (Romera et al., 2004. In vitro ischemic tolerance involves upregulation of glutamate transport partly mediated by the TACE/ADAM17TNF-a pathway, J. Neurosci. 24, 1350-7). Los estudios se efectuaron in vitro a los dias 9-10, tiempo en el cual los cultivos estaban compuestos del 94% de neuronas, tal como se ha determinado por citometria de flujo (Romera et al., 2004, citado supra). It is described (Romera et al., 2004. In vitro ischemic tolerance involves upregulation of glutamate transport partly mediated by the TACE / ADAM17TNF-a pathway, J. Neurosci. 24, 1350-7). The studies were carried out in vitro on days 9-10, at which time the cultures were composed of 94% neurons, as determined by flow cytometry (Romera et al., 2004, cited supra).

Análisis por Western Blot Se recogió tejído cerebral del área peri-infarto de las ratas (n=4 para cada grupo) sacrificadas 24 horas después de la OACM. La concentración de proteínas se determinó por espectrofotometrla (NanoDrop ND1000). Cantidades iguales de proteina total (10 ~g) se resolvieron por SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (HybondTM-P, Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Alemania). La inmunodetección se efectuó por procedimientos estándares. Se bloquearon las membranas con 5% de leche desnatada en TBS-T (0.05% Tween 20 en TBS) y se sondaron con anticuerpos primarios específicos contra SIRTl (Santa Cruz; 1: 1 00 dilución, banda 120 kDa) y se incluyeron anti-(3-actina de ratón (Sigma; 1 :10000) y anti GAPDH de ratón (Sigma; 1:10000) para normalizar la carga de proteína. Las proteinas reconocidas por el anticuerpo se revelaron utilizando el kit ECL según las instrucciones del fabricante (Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Alemania). Western Blot Analysis Brain tissue was collected from the peri-infarcted area of the rats (n = 4 for each group) sacrificed 24 hours after the OACM. The protein concentration was determined by spectrophotometry (NanoDrop ND1000). Equal amounts of total protein (10 g) were resolved by SDS-PAGE and transferred to a polyvinylidene difluoride membrane (PVDF) (HybondTM-P, Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Germany). Immunodetection was performed by standard procedures. The membranes were blocked with 5% skim milk in TBS-T (0.05% Tween 20 in TBS) and probed with specific primary antibodies against SIRT1 (Santa Cruz; 1: 1 00 dilution, 120 kDa band) and anti- (Mouse 3-actin (Sigma; 1: 10000) and mouse anti GAPDH (Sigma; 1: 10000) to normalize protein loading. Proteins recognized by the antibody were revealed using the ECL kit according to the manufacturer's instructions ( Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Germany).

Aislamiento de los extractos nucleares Isolation of nuclear extracts

Se recogieron las neuronas corticales de ratas cultivadas 24 horas después Cortical neurons were collected from cultured rats 24 hours later

del tratamiento con 1 00 ~M de CDP-colina en solución salina tamponada con fosfato (106 células/mL). El homogeneizado se centrifugó a 4°C, 12.000 x g. Se descartó el sobrenadante y los extractos nucleares se prepararon tal como se describe: se homogeneizaron células neuronales corticales de ratas en 10 mM HEPES, pH 7.9, 1.5 mM MgCI2, 10 mM KCI, y 0.5% Nonidet P-40. Los núcleos se sedimentaron a 12.000 x g durante 1 minuto a 4'C y sometidos a lisis en 20 mM HEPES, pH 7.9,15 mM MgCI2, 420 mM NaCI y 0.2 mM EDTA. Después de centrifugación (12.000 g x durante 5 minutos a 4' C), el pellet se descartó. of treatment with 1 00 ~ M CDP-choline in phosphate buffered saline (106 cells / mL). The homogenate was centrifuged at 4 ° C, 12,000 x g. The supernatant was discarded and the nuclear extracts were prepared as described: rat cortical neuronal cells were homogenized in 10 mM HEPES, pH 7.9, 1.5 mM MgCI2, 10 mM KCI, and 0.5% Nonidet P-40. The nuclei were sedimented at 12,000 x g for 1 minute at 4'C and lysed in 20 mM HEPES, pH 7.9.15 mM MgCl2, 420 mM NaCI and 0.2 mM EDTA. After centrifugation (12,000 g x for 5 minutes at 4 'C), the pellet was discarded.

Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica de ratas 24 horas después de la administración de 2 glkg de CDP-colina en ratas Isolation of peripheral blood mononuclear cells from rats 24 hours after administration of 2 glkg of CDP-choline in rats

Fischer, se recogieron muestras de sangre en un tubo de centrífuga con 2 mi Fischer, blood samples were collected in a centrifuge tube with 2 ml

de sangre tratada con anticoagulante y un volumen igual de solución salina tamponada con fosfato (pH 7.6). Se añadió Ficoll-Paque PREMIUM (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Suecia) al tubo de centrifuga y se colocaron con cuidado en capas las muestras de sangre diluida en Ficoll-Paque Premium. La muestra se centrifugó a 400 x g durante 20 minutos a 20°C y la capa de of blood treated with anticoagulant and an equal volume of phosphate buffered saline (pH 7.6). Ficoll-Paque PREMIUM (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden) was added to the centrifuge tube and blood samples diluted in Ficoll-Paque Premium were carefully layered. The sample was centrifuged at 400 x g for 20 minutes at 20 ° C and the layer of

células mononucleares se transfirió a un tubo de centrífuga estéril. Las Mononuclear cells were transferred to a sterile centrifuge tube. The

células mononucleares se suspendieron en un tampón de homogeneización y mononuclear cells were suspended in a homogenization buffer and

se mezclaron con tampón de muestra de electroforesis para el análisis mixed with electrophoresis sample buffer for analysis

Western Blol. Western Blol

Determinación de la actividad de SIRTl Para determinar la actividad SIRT1, 24 horas después de la administración de 100 ~M de CDP-colina se recogieron neuronas corticales cultivadas, y se analizaron los extractos totales, nucleares y citosólicos. Se recogieron las células después de la administración de CDP-colina, se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (pH 7.4) Y se homogeneizaron en tampón homogeneizador (10 mM HEPES, pH 7.9,1.5 mM MgCI2, 10 mM KCI, y 0.5% Nonidet P-40). Los núcleos se sedimentaron a 12.000 x 9 durante lmin a 4'C y se lisaron en 20 mM HEPES, pH 7.9, 15 mM MgCI2, 420 mM NaCI y 0.2 mM EDTA. Determination of SIRT1 activity To determine the SIRT1 activity, 24 hours after the administration of 100 µM of CDP-choline, cultured cortical neurons were collected, and total, nuclear and cytosolic extracts were analyzed. Cells were collected after administration of CDP-choline, washed in phosphate buffered saline (pH 7.4) and homogenized in homogenizing buffer (10 mM HEPES, pH 7.9.1.5 mM MgCI2, 10 mM KCI, and 0.5% Nonidet P-40). The cores were sedimented at 12,000 x 9 for 1 min at 4'C and lysed in 20 mM HEPES, pH 7.9, 15 mM MgCI2, 420 mM NaCI and 0.2 mM EDTA.

Tras una centrifugación (12,000 x g durante 5 minutos a 4°C), el pellet se After centrifugation (12,000 x g for 5 minutes at 4 ° C), the pellet is

descartó. El sobrenadante obtenido al final de la centrifugación se dializó discarded. The supernatant obtained at the end of the centrifugation was dialyzed

utilizando un aparato Millipore Amicon Ultraconcentrator (YM-10) (Millipore, using a Millipore Amicon Ultraconcentrator (YM-10) (Millipore,

Carrigtwohill, Irlanda). El dializado resultante se conservó a -80·C hasta su Carrigtwohill, Ireland). The resulting dialysate was stored at -80 · C until its

5 5

empleo. Dicho la capa de las células mononucleares se utilizó como fuente job. Said mononuclear cell layer was used as a source

del enzima para el ensayo enzimático de SIRT-1. La actividad enzimática de of the enzyme for the enzymatic assay of SIRT-1. The enzymatic activity of

SIRT-1 se determinó utilizando un ktt de ensayo de actividad por SIRT-1 was determined using an activity test ktt per

fluorescencia de SIRT1 (Biomol International) basado en el péptido sustrato fluorescence of SIRT1 (Biomol International) based on the substrate peptide

Fluor de Lys-SIRT1 . Fluor of Lys-SIRT1.

JO JO

Análisis estadistico Statistic analysis

Los resultados se expresan como media ± SEM del número indicado de The results are expressed as mean ± SEM of the indicated number of

ensayos. Las comparaciones entre los grupos de animales se efectuaron con essays. Comparisons between animal groups were made with

el test-t de Student no pareado o la prueba ANOVA de un factor con la prueba the unpaired Student's t-test or the one-way ANOVA test with the test

15 fifteen

post hoc de Bonferroni para comparaciones múltiples. Los resultados se Bonferroni post hoc for multiple comparisons. The results are

consideraron significativos a p<O.05. considered p <O.05 significant.

RESULTADOS RESULTS

Confirmación del efecto de CDP-colina sobre el volumen de infarto después Confirmation of the effect of CDP-choline on the volume of infarction after

20 twenty

de la OACM of the OACM

El volumen de infarto se determinó 48 horas después de la oclusión en los The volume of infarction was determined 48 hours after occlusion in the

animales tratados con solución salina o con CDP-colina 2 g/kg 4 horas animals treated with saline solution or with CDP-choline 2 g / kg 4 hours

después de la oclusión. El volumen de infarto determinado 48 horas después after occlusion The volume of infarction determined 48 hours later

de la OACM mostró una reducción en el grupo tratado con CDP-colina (Figura of the OWHC showed a reduction in the group treated with CDP-choline (Figure

25 25

1). Estas condiciones de neuroprotección se seleccionaron para el estudio. one). These neuroprotection conditions were selected for the study.

Estudio proteómico en cerebro de ratas control y ratas tratadas con CDPProteomic study in brain of control rats and rats treated with CDP

colina después de la exposición a la OACM permanente choline after permanent exposure to the OWHC

Con las tres técnicas proteómicas empleadas se han identificado varias With the three proteomic techniques used, several have been identified

30 30

proteinas que experimentaron cambios >20%, entre las cuales se seleccionó proteins that underwent changes> 20%, among which was selected

SIRT1, la cual fue aumentada por CDP-colina en el cerebro tanto de ratas SIRT1, which was increased by CDP-choline in the brain of both rats

controles con intervención simulada (SHAM) como de las expuestas a OACM. controls with simulated intervention (SHAM) as those exposed to OACM.

Confirmación por el análisis Western Blot del aumento inducido por CDPConfirmation by Western Blot analysis of the increase induced by CDP

35 35

colina en los niveles de SIRT1 en homogenados de cerebro de rata choline in SIRT1 levels in rat brain homogenates

A fin de confirmar que la CDP-colina es capaz de aumentar los niveles de In order to confirm that CDP-choline is able to increase the levels of

SIRT1, se determinó la presencia de esta proteina por medio de análisis SIRT1, the presence of this protein was determined by analysis

Western Blot en homogenados de cerebro. Tal como muestra la Figura 2, los niveles de protelnas de SIRT1 aumentaron después de la OACM . Más Western blotting in brain homogenates. As Figure 2 shows, the levels of SIRT1 proteins increased after the OACM. Plus

especialmente. la CDP-colina aumentó dichos niveles tanto en las ratas especially. CDP-choline increased these levels in both rats

controles con intervención simulada (SHAM) como de las expuestas a OACM. controls with simulated intervention (SHAM) as those exposed to OACM.

CDP-colina aumentó los niveles de SIRT1 en las fracciones nucleares y CDP-choline increased SIRT1 levels in nuclear fractions and

citosóJicas de neuronas corticales cultivadas de rata Cytosophics of rat cultured cortical neurons

Se ha descrito que la localización subcelular de SIRT1 , aunque referida principalmente como nuclear, podría cambiar en respuesta a diferentes estímulos, lo que podría implicar un mecanísmo regulador de dicha protelna. Se ha estudiado si la CDP-colina afecta la expresión y la localización subcelular de SIRT1 en neuronas corticales de rata tratadas durante 24 horas con CDP-colina. El tratamiento de neuronas corticales cultivadas con CDPcolina (1 00 ~M) aumentó los niveles de SIRT1 en dichas células, localizándose este aumento principalmente en la fracción nuclear de dichas células (Fig. 3A, B). It has been described that the subcellular location of SIRT1, although mainly referred to as nuclear, could change in response to different stimuli, which could imply a regulatory mechanism of said protelna. It has been studied whether CDP-choline affects the expression and subcellular localization of SIRT1 in rat cortical neurons treated for 24 hours with CDP-choline. The treatment of cortical neurons cultured with CDPcolin (1 00 ~ M) increased the levels of SIRT1 in said cells, this increase being located mainly in the nuclear fraction of said cells (Fig. 3A, B).

Actividad de SIRT1 en las fracciones nucleares y citosólicas de neuronas corticales cultivadas de ratas tratadas con CDP-colina Los resultados aquí mostrados indican que la CDP-colina aumenta la expresión de SIRT1 tanto en homogenados de cerebro como en extractos SIRT1 activity in the nuclear and cytosolic fractions of cultured cortical neurons of rats treated with CDP-choline The results shown here indicate that CDP-choline increases the expression of SIRT1 in both brain homogenates and extracts

nucleares de neuronas corticales de ratas. Posteriormente se determinó si nuclear cortical neurons of rats. Later it was determined if

esta expresión aumentada estaba correlacionada con un aumento en la actividad enzimática de SIRT1, en los extractos totales, nucleares y citosólicos de neuronas corticales de ratas tratadas durante 24 horas con CDP-colina (100 ~M). Los resultados demuestran que, de acuerdo con los niveles de expresión de SIRT1 , la CDP-colina aumentó significativamente la actividad de SIRT1 en los extractos totales y nucleares de dichas células (Fig. 3C). this increased expression was correlated with an increase in the enzymatic activity of SIRT1, in the total, nuclear and cytosolic extracts of cortical neurons of rats treated for 24 hours with CDP-choline (100 ~ M). The results show that, according to the expression levels of SIRT1, CDP-choline significantly increased the activity of SIRT1 in the total and nuclear extracts of said cells (Fig. 3C).

CDP-colina aumentó los niveles de SIRT1 en células mononucleares CDP-choline increased levels of SIRT1 in mononuclear cells

A continuación, se examinó si la CDP-colina podría afectar la expresión Next, it was examined whether CDP-choline could affect expression

proteica de SIRT1 no s610 en el cerebro de ratas y neuronas cultivadas, sino también en otras células, tal como las células mononucleares de sangre periférica. Los resultados muestran que los niveles de expresión proteica de SIRT1 fueron significativamente superiores en las células mononucleares circulantes de ratas tratadas con CDP-colina, cuando se comparó con las ratas control (Fig. 4). SIRT1 protein is not only in the brain of rats and cultured neurons, but also in other cells, such as peripheral blood mononuclear cells. The results show that SIRT1 protein expression levels were significantly higher in circulating mononuclear cells of rats treated with CDP-choline, when compared to control rats (Fig. 4).

Efecto sinérgico entre CDP-colina y el activador de SIRT1 resveratrol 5 Debido a que se ha demostrado que la CDP-colina aumenta la expresión proteica de SIRT1 , se analizó si esta sustancia podría exhibir efectos Synergistic effect between CDP-choline and the activator of SIRT1 resveratrol 5 Because it has been shown that CDP-choline increases the protein expression of SIRT1, it was analyzed whether this substance could exhibit effects

sinérgicos con otros compuestos que actúan como activadores de la actividad synergistic with other compounds that act as activity activators

enzimática de SIRT1 . Por tanto, se estudió el efecto de la asociación de dosis sub-efectivas de CDP-colina (200 mg/kg) y del activador de SIRT1 , 10 resveratrol (2.5 mg/kg). Los datos muestran (Fig. 5) que la asociación de enzymatic of SIRT1. Therefore, the effect of the association of sub-effective doses of CDP-choline (200 mg / kg) and the activator of SIRT1, 10 resveratrol (2.5 mg / kg) was studied. The data show (Fig. 5) that the association of

estas dos sustancias posee un notable efecto sinérgico demostrado en forma These two substances have a remarkable synergistic effect demonstrated in

de una reducción del 60% en el volumen de infarto después de la OACM. of a 60% reduction in the volume of infarction after the OWHC.

DISCUSiÓN Discussion

15 En la presente invención se ha demostrado que la CDP-colina aumenta la In the present invention it has been shown that CDP-choline increases the

expresión de SIRT1 en cerebro de rata in vivo tanto de animales control como SIRT1 expression in rat brain in vivo from both control animals and

expuestos a OACM de forma concomitante a su efecto neuroprotector, e in exposed to OACM concomitantly to its neuroprotective effect, and in

vitro en células mononucleares de sangre circulante, y en neuronas corticales in vitro in circulating blood mononuclear cells, and in cortical neurons

cultivadas de rata. Considerando las acciones beneficiosas de SIRT1 en el cultured rat. Considering the beneficial actions of SIRT1 in the

20 SNC, los resultados sugieren firmemente que esta enzima está implicada en los efectos neuroprotectores inducidos por CDP-colina. Además, los resultados presentes demuestran por primera vez un potente efecto sinérgico con un activador de SrRT1 , resveratrol. 20 CNS, the results strongly suggest that this enzyme is involved in the neuroprotective effects induced by CDP-choline. In addition, the results present demonstrate for the first time a potent synergistic effect with a SrRT1 activator, resveratrol.

Claims (9)

REIVINDICACIONES 1. Una composición farmacéutica que comprende una combinación de (i) una cantidad terapéuticamente efectiva de citicolina o una sal 1. A pharmaceutical composition comprising a combination of (i) a therapeutically effective amount of citicoline or a salt 5 farmacéuticamente aceptable de la misma y (ii) una cantidad terapéuticamente efectiva de un activador de SIRTl junto uno o más vehículos farmacéutica mente aceptables para su uso como medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad cerebrovascular. 5 pharmaceutically acceptable thereof and (ii) a therapeutically effective amount of a SIRTl activator together with one or more pharmaceutically acceptable vehicles for use as a medicament for the treatment and / or prevention of cerebrovascular disease. 10 2. Composición según la reivindicación 1, donde dicho activador de SIRTl se selecciona del grupo formado por resveratrol, 3,4,5-trimetoxi-N-(2(3-(piperazin-l-ilmetil)imidazo[2, 1-b ]tiazol-6-il)fenil)benzamida, N-(2-(3(piperazin-l-ilmetil)imidazo[2, 1-b]tiazol-6-il)fenil)quinoxalin-2 -carboxamida, (R)-N-(2-( 3-( (3-hidroxipirrolindin-l-il)metil)imidazo[2, 1-b]tiazol-6-il)fenil)-2Composition according to claim 1, wherein said SIRTl activator is selected from the group consisting of resveratrol, 3,4,5-trimethoxy-N- (2 (3- (piperazin-l-ylmethyl) imidazo [2, 1- b] thiazol-6-yl) phenyl) benzamide, N- (2- (3 (piperazin-l-ylmethyl) imidazo [2,1-b] thiazol-6-yl) phenyl) quinoxalin-2-carboxamide, (R ) -N- (2- (3- ((3-hydroxypyrrolindin-l-yl) methyl) imidazo [2,1-b] thiazol-6-yl) phenyl) -2 15 naftamida. 15 naphthamide 3. Composición según la reivindicación 1 ó 2, donde dicha enfermedad 3. Composition according to claim 1 or 2, wherein said disease cerebrovascular es la isquemia cerebral. Cerebrovascular is cerebral ischemia. 20 4. Composición según la reivindicación 3, donde dicha isquemia cerebral es isquemia cerebral aguda o crónica. Composition according to claim 3, wherein said cerebral ischemia is acute or chronic cerebral ischemia. 5. Composición según la reivindicación 4, donde dicha isquemia cerebral 5. Composition according to claim 4, wherein said cerebral ischemia es ataque isquémico transitorio, traumatismo craneoencefálico o ictus is transient ischemic attack, head trauma or stroke 25 cerebral. 25 brain 6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde 6. Composition according to any one of claims 1 to 5, wherein dicha composición se administra de forma separada, simultánea o secuencial. said composition is administered separately, simultaneously or sequentially. 30 7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde Composition according to any one of claims 1 to 6, wherein dicho medicamento es para la administración por vía oral. Said medication is for oral administration. 8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicho medicamento es para la administración por vía parenteral. 8. Composition according to any one of claims 1 to 6, wherein said medicament is for parenteral administration. 9. Composición según la reivindicación 1 a 8, donde la dosis de citicolina 9. Composition according to claim 1 to 8, wherein the dose of citicoline o sal farrnacéuticamente aceptable es de entre 100 mg y 5000 mg al día. or pharmaceutically acceptable salt is between 100 mg and 5000 mg per day. 10. Composición según la reivindicación 9, donde la dosis de citicolina o sal farmacéuticamente aceptable es de entre 500 mg y 2000 mg al dia. 10. Composition according to claim 9, wherein the dose of citicoline or pharmaceutically acceptable salt is between 500 mg and 2000 mg daily. 5 11 . Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde la dosis de dicho activador de SIRT-l es de entre 0,1 mg a 500 mg al día. 5 11. Composition according to any one of claims 1 to 10, wherein the dose of said SIRT-1 activator is between 0.1 mg to 500 mg daily. 12. Uso de una composición farmacéutica que comprende una combinación de (i) una cantidad terapéuticamente efectiva de citicolina o una 12. Use of a pharmaceutical composition comprising a combination of (i) a therapeutically effective amount of citicoline or a 10 sal farmacéuticamente aceptable de la misma y (ii) una cantidad terapéulicamente efectiva de un activador de SIRTl para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad cerebrovascular. 10 pharmaceutically acceptable salt thereof and (ii) a therapeutically effective amount of a SIRTl activator for the preparation of a medicament for the treatment and / or prevention of cerebrovascular disease. 15 13. Uso según la reivindicación 12, donde dicho activador de SIRTl se selecciona del grupo formado por resveratrol, 3,4,5-trimetoxi-N-(2-(3(piperazin-l-ilmetil)imidazof2, l-bJtiazol-6-il)fenil)benzamida, N-(2-(3(piperazin-l-ilmetíl)imídazof2, l-b]tiazol-6-il)fenil)quinoxalin-2-carboxamida, (R)-N-(2-(3-( (3-h idroxipirrolindin-l -il )metil )imidazo[2, l-bJtiazol-6-il )fen i 1)-213. Use according to claim 12, wherein said SIRTl activator is selected from the group consisting of resveratrol, 3,4,5-trimethoxy-N- (2- (3 (piperazin-l-ylmethyl) imidazof2, l-bJtiazol- 6-yl) phenyl) benzamide, N- (2- (3 (piperazin-l-ylmethyl) imidazof2, lb] thiazol-6-yl) phenyl) quinoxalin-2-carboxamide, (R) -N- (2- ( 3- ((3-h idroxypyrrolindin-l-yl) methyl) imidazo [2, l-bJthiazol-6-yl) fen i 1) -2 20 naftamida. 20 naphthamide 14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, donde dicha enfermedad cerebrovascular es isquemia cerebral. 14. Use according to any of claims 12 or 13, wherein said cerebrovascular disease is cerebral ischemia.