ES2410230A1 - Pharmaceutical composition for the treatment of cerebrovascular diseases - Google Patents

Abstract

The invention relates to a pharmaceutical composition comprising citicoline or a pharmaceutically acceptable salt thereof and a SIRT1 activator for use as a drug for the treatment and/or prevention of a cerebrovascular disease.

Description

Composición farmacéutica para el tratamiento de las enfermedades cerebrovasculares Pharmaceutical composition for the treatment of cerebrovascular diseases

CAMPO DE LA INVENCIÓN FIELD OF THE INVENTION

La presente invención se relaciona con composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades cerebrovasculares, en particular para el tratamiento de la isquemia cerebral. The present invention relates to pharmaceutical compositions for the treatment of cerebrovascular diseases, in particular for the treatment of cerebral ischemia.

ESTADO DE LA TÉCNICA STATE OF THE TECHNIQUE

Las enfermedades cerebrovasculares (ECV) comprenden un conjunto de trastornos de la vasculatura cerebral que conllevan a una disminución del flujo sanguíneo en el cerebro con la consecuente afectación, de forma transitoria o permanente, de la función de una región generalizada del cerebro o de una zona pequeña o focal. Las ECV son la tercera causa de muerte en el mundo desarrollado, y la 2a en hombres y la 1a en mujeres en España; se consideran la primera causa de discapacidad y de demencia vascular y afectan a un 50% de la población mayor de 60 años, por lo que constituyen en la actualidad un problema de salud y una urgencia médica. Atendiendo al tipo de episodio vascular pueden ser hemorrágicas o isquémicas. Cerebrovascular diseases (CVD) comprise a set of disorders of the cerebral vasculature that lead to a decrease in blood flow in the brain with the consequent transient or permanent involvement of the function of a generalized region of the brain or an area Small or focal. CVD is the third leading cause of death in the developed world, and the 2nd in men and the 1st in women in Spain; They are considered the leading cause of disability and vascular dementia and affect 50% of the population over 60 years old, so they are currently a health problem and a medical emergency. According to the type of vascular episode they can be hemorrhagic or ischemic.

La estrategia del tratamiento de la isquemia cerebral en su fase aguda tiene dos objetivos principales: la restauración del flujo sanguíneo cerebral (reperfusión) y la limitación del daño neuronal (neuroprotección). La orientación terapéutica más importante en estos pacientes con infarto cerebral consiste en mejorar el flujo sanguíneo cerebral y reducir o bloquear las consecuencias metabólicas a nivel celular y subcelular. The strategy of treating cerebral ischemia in its acute phase has two main objectives: the restoration of cerebral blood flow (reperfusion) and the limitation of neuronal damage (neuroprotection). The most important therapeutic orientation in these patients with cerebral infarction is to improve cerebral blood flow and reduce or block metabolic consequences at the cellular and subcellular levels.

Uno de los objetivos principales de las investigaciones en el tratamiento de la isquemia cerebral es desarrollar fármacos que intervengan en la cascada isquémica y reduzcan la cantidad de tejido dañado. De este modo se podrá obtener un mejor resultado clínico, traducido no sólo en supervivencia, sino también en la mejora de la calidad de vida de los pacientes que sufren eventos vasculares agudos. One of the main objectives of research in the treatment of cerebral ischemia is to develop drugs that intervene in the ischemic cascade and reduce the amount of damaged tissue. In this way, a better clinical result can be obtained, translated not only in survival, but also in the improvement of the quality of life of patients suffering from acute vascular events.

Los modelos de isquemia cerebral en animales han contribuido al desarrollo del conocimiento de este problema. Se han ensayado muchos agentes
The models of cerebral ischemia in animals have contributed to the development of knowledge of this problem. Many agents have been tested

neuroprotectores en estos modelos y muy pocos rebasan los criterios de neuroprotectors in these models and very few exceed the criteria of

eficacia y seguridad en ensayos clínicos. efficacy and safety in clinical trials.

La CDP-Colina (Citidina Difosfato Colina), también llamada Citicolina, es un CDP-Choline (Citidine Diphosphate Choline), also called Citicoline, is a

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precursor esencial para la síntesis de fosfatidilcolina, componente de la essential precursor for the synthesis of phosphatidylcholine, component of the

membrana celular. La administración exógena de CDP-Colina reduce la cellular membrane. Exogenous administration of CDP-Choline reduces the

destrucción de la membrana celular en modelos experimentales, provocando destruction of the cell membrane in experimental models, causing

un aumento de la síntesis de la fosfatidilcolina y una reducción de los niveles an increase in the synthesis of phosphatidylcholine and a reduction in levels

de ácidos grasos libres. Se ha demostrado que la citicolina posee efectos of free fatty acids. Citicoline has been shown to have effects

1O 1O

neuroprotectores en varios modelos animales de lesión del sistema nervioso neuroprotectors in various animal models of nervous system injury

central (SNC) incluyendo la isquemia cerebral, aunque el mecanismo central (CNS) including cerebral ischemia, although the mechanism

neuroprotector de la CDP-Colina no se conoce en toda su extensión. CDP-Hill neuroprotector is not known to its full extent.

Actualmente, se relaciona este efecto con una reducción de ácidos grasos Currently, this effect is related to a reduction in fatty acids

libres, una menor producción de radicales libres, estabilización de la free, lower production of free radicals, stabilization of the

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membrana neuronal, decremento de la toxicidad provocada por el glutamato y neuronal membrane, decreased toxicity caused by glutamate and

un aumento de la supervivencia neuronal. Además, la CDP-colina ha an increase in neuronal survival. In addition, the CDP-hill has

mostrado propiedades beneficiosas en diferentes escenarios, que incluyen shown beneficial properties in different scenarios, which include

traumatismos craneales, trastornos cognitivos, enfermedad de Parkinson, head injuries, cognitive disorders, Parkinson's disease,

drogadicción, ambliopia, glaucoma, lesión de médula espinal, lesión axonal, drug addiction, amblyopia, glaucoma, spinal cord injury, axonal injury,

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lesión de nervio periférico y nocicepción. De modo apreciable, las peripheral nerve injury and nociception. Appreciably, the

propiedades de la CDP-colina parecen extenderse incluso a otros escenarios, CDP-choline properties seem to extend even to other scenarios,

tales como la regulación de la liberación de insulina, lo que sugiere la such as the regulation of insulin release, which suggests the

implicación de efectos pleiotrópicos desconocidos de esta sustancia. implication of unknown pleiotropic effects of this substance.

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Las sirtuinas, las cuales pertenecen a una familia de desacetilasas Sirtuins, which belong to a family of deacetylases

dependientes de NAO+, han aparecido recientemente como proteínas NAO + dependent, have recently appeared as proteins

implicadas en el metabolismo, envejecimiento, resistencia al estrés oxidativo involved in metabolism, aging, resistance to oxidative stress

y mantenimiento del genoma. Las sirtuinas modulan la expresión génica de and genome maintenance. Sirtuins modulate the gene expression of

acuerdo con el estado energético de la célula, actuando como sensores de according to the energy state of the cell, acting as sensors of

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energía de los niveles NAD+ mediante la desacetilación de histonas, factores energy of NAD + levels by histone deacetylation, factors

de transcripción y ce-reguladores. SIRT1 (primer miembro de esta familia) es of transcription and ce-regulators. SIRT1 (first member of this family) is

una nueva diana terapéutica emergente que está implicada en la regulación a new emerging therapeutic target that is involved in regulation

del metabolismo, senescencia y cáncer, y que desempeña un papel crucial en of metabolism, senescence and cancer, and that plays a crucial role in

las rutas de señalización sensibles al estrés. Diversos planteamientos stress-sensitive signaling pathways. Various approaches

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experimentales han implicado sus acciones beneficiosas en muchas experimental have implicated their beneficial actions in many

enfermedades, incluyendo las enfermedades metabólicas (diabetes tipo 2, diseases, including metabolic diseases (type 2 diabetes,

miopatías mitocondriales), cardiovasculares e inflamatorias, cáncer, neurodegenerativas (enfermedad de Alzheimer, entre otras) e ictus. mitochondrial myopathies), cardiovascular and inflammatory, cancer, neurodegenerative (Alzheimer's disease, among others) and stroke.

De acuerdo con lo expuesto, se ha demostrado que la sobreexpresión y/o activación de SIRT1 ralentizan la muerte neuronal in vitro así como la neurodegeneración in vivo. En este contexto, se han descrito varias moléculas que actúan, directamente o indirectamente, aumentando la actividad enzimática desacetilasa de SIRT1. Este es el caso del polifenol natural, resveratrol, conocido desde hace tiempo por promover los efectos protectores sobre las enfermedades cardiovasculares, y del cual también se ha demostrado que es capaz de penetrar la barrera hematoencefálica y ejercer un marcado efecto neuroprotector en varios escenarios patológicos del SNC. Concretamente, en el contexto de la isquemia cerebral, el resveratrol ha demostrado efectos neuroprotectores en modelos animales, los cuales parecen estar mediados por la activación de SIRT1. Además, se han identificado compuestos activadores de SIRT1 de bajo peso molecular con características in vivo e in vitro semejantes a las del resveratrol, los cuales actúan probablemente sobre las mismas rutas y son 1000 veces más potentes. In accordance with the above, it has been shown that overexpression and / or activation of SIRT1 slow neuronal death in vitro as well as neurodegeneration in vivo. In this context, several molecules have been described that act, directly or indirectly, by increasing the enzymatic deacetylase activity of SIRT1. This is the case of natural polyphenol, resveratrol, known for a long time to promote the protective effects on cardiovascular diseases, and which has also been shown to be able to penetrate the blood brain barrier and exert a marked neuroprotective effect in several pathological scenarios of the SNC Specifically, in the context of cerebral ischemia, resveratrol has demonstrated neuroprotective effects in animal models, which appear to be mediated by the activation of SIRT1. In addition, low molecular weight SIRT1 activating compounds have been identified with in vivo and in vitro characteristics similar to those of resveratrol, which probably act on the same routes and are 1000 times more potent.

El documento W00238141 describe un método para el tratamiento de trastornos cognitivos leves (alteraciones de la memoria relacionadas con la edad) y síntomas relacionados (Aizheimer y otras enfermedades neurodegenerativas) así como la isquemia cerebral, que comprende la administración de un agente serotoninérgico, en particular, resveratrol. Aunque dicho documento menciona que dicho compuesto se puede administrar junto con otros compuestos activadores de la memoria, en la parte experimental sólo se demuestra el uso de resveratrol a distintas dosis para el tratamiento de la demencia asociada a la edad (MCI). Document W00238141 describes a method for the treatment of mild cognitive disorders (age-related memory disorders) and related symptoms (Aizheimer and other neurodegenerative diseases) as well as cerebral ischemia, which comprises the administration of a serotonergic agent, in particular Resveratrol Although said document mentions that said compound can be administered together with other memory activating compounds, in the experimental part only the use of resveratrol at different doses for the treatment of age-associated dementia (MCI) is demonstrated.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN SUMMARY OF THE INVENTION

Los autores de la presente invención han demostrado que la CDP-colina y el activador de SIRT1, resveratrol, poseen sorprendentemente un potente efecto sinérgico que lleva hasta reducciones del 60% del volumen de infarto en un modelo animal de isquemia cerebral, cuando se emplean conjuntamente a dosis individualmente sub-efectivas de dichas sustancias. The authors of the present invention have shown that CDP-choline and the activator of SIRT1, resveratrol, surprisingly possess a potent synergistic effect that leads to 60% reductions in infarct volume in an animal model of cerebral ischemia, when used together at individually sub-effective doses of said substances.

Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención se relaciona con una Therefore, in a first aspect, the present invention relates to a

composición farmacéutica que comprende una combinación de (i) una pharmaceutical composition comprising a combination of (i) a

cantidad terapéuticamente efectiva de citicolina o una sal farmacéuticamente therapeutically effective amount of citicoline or a pharmaceutically salt

aceptable de la misma y (ii) una cantidad terapéuticamente efectiva de un acceptable thereof and (ii) a therapeutically effective amount of a

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activador de SIRT1 junto uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables SIRT1 activator together with one or more pharmaceutically acceptable vehicles

para su uso como medicamento para el tratamiento y/o prevención de una for use as a medicine for the treatment and / or prevention of a

enfermedad cerebrovascular. cerebrovascular disease

En una realización particular, dicho activador de SIRT1 se selecciona del In a particular embodiment, said activator of SIRT1 is selected from the

1o 1st

grupo formado por resveratrol, 3,4,5-trimetoxi-N-(2-(3-(piperazin-1- group consisting of resveratrol, 3,4,5-trimethoxy-N- (2- (3- (piperazin-1-

ilmetil)imidazo[2, 1-b ]tiazol-6-il)fenil)benzamida, N-(2-(3-(piperazin-1-ilmethyl) imidazo [2,1-b] thiazol-6-yl) phenyl) benzamide, N- (2- (3- (piperazin-1-

ilmetil)imidazo[2,1-b ]tiazol-6-il)fenil)quinoxalin-2-carboxamida, (R)-N-(2-(3-( (3-ilmethyl) imidazo [2,1-b] thiazol-6-yl) phenyl) quinoxalin-2-carboxamide, (R) -N- (2- (3- ((3-

hidroxipirrolindin-1-il)metil)imidazo[2, 1-b]tiazol-6-il)fenil)-2-naftamida. hydroxypyrrolindin-1-yl) methyl) imidazo [2,1-b] thiazol-6-yl) phenyl) -2-naphthamide.

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En una realización particular de la invención, dicha enfermedad In a particular embodiment of the invention, said disease

cerebrovascular es la isquemia cerebral. Más particularmente, dicha isquemia Cerebrovascular is cerebral ischemia. More particularly, said ischemia

cerebral es isquemia cerebral aguda o crónica. En una realización preferida, Cerebral is acute or chronic cerebral ischemia. In a preferred embodiment,

dicha isquemia cerebral es ataque isquémico transitorio, traumatismo said cerebral ischemia is transient ischemic attack, trauma

craneoencefálico o ictus cerebral. craniocerebral or cerebral stroke.

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En otra realización particular de la invención, dicha composición se administra In another particular embodiment of the invention, said composition is administered

de forma separada, simultánea o secuencial. separately, simultaneously or sequentially.

En un caso particular, dicho medicamento es para la administración por vía In a particular case, said medication is for administration via

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oral. En otro caso particular, dicho medicamento es para la administración por oral. In another particular case, said medication is for administration by

vía parenteral. parenteral route

En otra realización particular, la dosis de citicolina o sal farmacéuticamente In another particular embodiment, the dose of citicoline or salt pharmaceutically

aceptable es de entre 100 mg y 5000 mg al día. En una realización más Acceptable is between 100 mg and 5000 mg daily. In one more embodiment

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particular, la dosis de citicolina o sal farmacéuticamente aceptable es de entre In particular, the dose of citicoline or pharmaceutically acceptable salt is between

500 mg y 2000 mg al día. En otra realización de la invención, la dosis de 500 mg and 2000 mg daily. In another embodiment of the invention, the dose of

dicho activador de SIRT-1 es de entre 0,1 mg a 500 mg al día. Más said activator of SIRT-1 is between 0.1 mg to 500 mg daily. Plus

particularmente, la cantidad de activador de SIRT-1 es de entre 1 mg a 500 particularly, the amount of activator of SIRT-1 is between 1 mg to 500

mg. mg

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En otro aspecto, la invención se refiere al uso de una composrcron In another aspect, the invention relates to the use of a composrcron

farmacéutica que comprende una combinación de (i) una cantidad pharmaceutical comprising a combination of (i) an amount

5 1 O 5 1 O

terapéuticamente efectiva de citicolina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y (ii) una cantidad terapéuticamente efectiva de un activador de SIRT1 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad cerebrovascular. En una realización particular, dicho activador de SIRT1 se selecciona del grupo formado por resveratrol, 3,4,5-trimetoxi-N-(2-(3-(piperazin-1-ilmetil)imidazo[2, 1-b ]tiazol-6-il)fenil)benzamida, N-(2-(3-(piperazin-1-ilmetil)imidazo[2, 1-b ]tiazol-6-il)fenil)quinoxalin-2-carboxamida, (R)-N-(2-(3-( (3-hidroxipirrolindin-1-il)metil)imidazo[2, 1-b ]tiazol-6-il)fenil)-2-naftamida. therapeutically effective citicoline or a pharmaceutically acceptable salt thereof and (ii) a therapeutically effective amount of a SIRT1 activator for the preparation of a medicament for the treatment and / or prevention of cerebrovascular disease. In a particular embodiment, said SIRT1 activator is selected from the group consisting of resveratrol, 3,4,5-trimethoxy-N- (2- (3- (piperazin-1-ylmethyl) imidazo [2,1-b] thiazole- 6-yl) phenyl) benzamide, N- (2- (3- (piperazin-1-ylmethyl) imidazo [2,1-b] thiazol-6-yl) phenyl) quinoxalin-2-carboxamide, (R) -N - (2- (3- ((3-Hydroxypyrrolindin-1-yl) methyl) imidazo [2,1-b] thiazol-6-yl) phenyl) -2-naphthamide.

En otra realización particular, dicha enfermedad cerebrovascular es isquemia cerebral. In another particular embodiment, said cerebrovascular disease is cerebral ischemia.

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BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

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Figura 1: Efecto de CDP-colina sobre el volumen de infarto después de oclusión de la arteria cerebral media (OACM o MCAO) Se expusieron las ratas a una OACM permanente durante 48 horas y se cuantificaron los volúmenes de infarto (ver Materiales y Métodos) en secciones coronales en serie teñidas con TTC. Los datos son medias±SEM, n=6; *Plt;O.OS). Figure 1: Effect of CDP-choline on the volume of infarction after occlusion of the middle cerebral artery (LMO or MCAO) The rats were exposed to a permanent OACM for 48 hours and the infarct volumes were quantified (see Materials and Methods) in series coronal sections stained with TTC. Data are means ± SEM, n = 6; * Plt; O.OS).

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Figura 2: Efecto de CDP-colina sobre los niveles de SIRT1 en homogenados de cerebro de rata después de OACM. (A) lnmunoblot representativo mostrando la expresión de la proteína SIRT-1 en tejido cortical peri-infarto de animales SHAM y OACM y el efecto del tratamiento con CDP-colina. Se normalizó la carga de proteína determinando ~-actina. (8) Análisis densitométrico de la proteína SIRT-1 de 3 ensayos independientes. Los datos representan media±SEM; *Plt;O.OS vs SHAM; #plt;O.OS vs. SHAM o MCAO (OACM). Figure 2: Effect of CDP-choline on SIRT1 levels in rat brain homogenates after OACM. (A) Representative immunoblot showing the expression of the SIRT-1 protein in peri-infarcted cortical tissue of SHAM and OACM animals and the effect of treatment with CDP-choline. Protein loading was normalized by determining ~ -actin. (8) Densitometric analysis of the SIRT-1 protein from 3 independent assays. Data represent mean ± SEM; * Plt; O.OS vs SHAM; #plt; O.OS vs. SHAM or MCAO (OACM).

35    35

Figura 3: Efecto de CDP-colina sobre los niveles (A,B) y actividad (C) de la proteína SIRT1 en neuronas corticales cultivadas de ratas. (A) lnmunoblot representativo mostrando la expresión de SIRT-1 en extractos citosólicos y nucleares (ver Métodos). Se normalizó la carga de proteína Figure 3: Effect of CDP-choline on the levels (A, B) and activity (C) of the SIRT1 protein in cultured cortical neurons of rats. (A) Representative immunoblot showing the expression of SIRT-1 in cytosolic and nuclear extracts (see Methods). Protein loading was normalized

determinando Sp-1. (B) Análisis densitométrico de la proteína SIRT-1 de 3 ensayos independientes. Los datos son media±SEM, *Plt;0.05 vs Control nuclear. (C) La actividad enzimática de SIRT-1 se determinó en extractos totales, nucleares y citosólicos 24 h después del tratamiento con CDP-colina. Los datos son media±SEM, *Plt;0.05 vs control total y nuclear. determining Sp-1. (B) Densitometric analysis of the SIRT-1 protein from 3 independent assays. Data are mean ± SEM, * Plt; 0.05 vs Nuclear Control. (C) The enzymatic activity of SIRT-1 was determined in total, nuclear and cytosolic extracts 24 h after treatment with CDP-choline. The data are mean ± SEM, * Plt; 0.05 vs total and nuclear control.

Figura 4: Efecto de CDP-colina sobre los niveles de la proteína SIRT1 en células mononucleares de ratas. Figure 4: Effect of CDP-choline on SIRT1 protein levels in rat mononuclear cells.

(A) lnmunoblot representativo mostrando la expresión de SIRT-1 en células mononucleares (ver Métodos). Se normalizó la carga de proteína determinando GAPDH. (B) Análisis densitométrico de la proteína SIRT-1 de 3 ensayos independientes. Los datos son media±SEM, *Plt;0.05 vs Control. (A) Representative immunoblot showing the expression of SIRT-1 in mononuclear cells (see Methods). Protein loading was normalized by determining GAPDH. (B) Densitometric analysis of the SIRT-1 protein from 3 independent assays. Data are mean ± SEM, * Plt; 0.05 vs Control.

Figura 5. Efecto sinérgico de CDP-colina y el activador de SIRT1, resveratrol, sobre el volumen de infarto después de OACM en ratas. Figure 5. Synergistic effect of CDP-choline and the activator of SIRT1, resveratrol, on the volume of infarction after OACM in rats.

ANOVAlt;0,0001. #plt;0.01 vs CDP 200mg/kg; Resveratrol 2.5mg/kg. *plt;0.001 vs control; Post-hoc test: Bonferroni ANOVAlt; 0.0001. #plt; 0.01 vs CDP 200mg / kg; Resveratrol 2.5mg / kg * plt; 0.001 vs control; Post-hoc test: Bonferroni

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

La presente invención se refiere a combinaciones terapéuticas para el tratamiento y/o prevención de enfermedades cerebrovasculares (ECV), en particular, para el tratamiento de la isquemia cerebral, que comprenden citicolina y un activador de SIRT1 a dosis fijas que son adaptables a las dosis requeridas por pacientes de forma individual o determinados subgrupos de población. The present invention relates to therapeutic combinations for the treatment and / or prevention of cerebrovascular diseases (CVD), in particular, for the treatment of cerebral ischemia, which comprise citicoline and a fixed dose SIRT1 activator that are dose adaptable required by patients individually or certain population subgroups.

Según se ha mencionado anteriormente, los autores de la presente invención han observado que una composición que comprende la combinación (i) CDP-colina y (ii) un activador de SIRT1, diferente de citicolina, por ejemplo, resveratrol, muestra, sorprendentemente, un potente efecto sinérgico tras su administración conjunta en modelos animales de isquemia cerebral que produce unas reducciones del 60% del volumen de infarto después de la OACM (oclusión de la arteria cerebral media). As mentioned above, the authors of the present invention have observed that a composition comprising the combination (i) CDP-choline and (ii) an activator of SIRT1, other than citicoline, for example, resveratrol, surprisingly shows a potent synergistic effect after joint administration in animal models of cerebral ischemia that produces 60% reductions in the volume of infarction after the OACM (occlusion of the middle cerebral artery).

Por tanto, la presente invención se relaciona en un primer aspecto con una composición farmacéutica, de aquí en adelante denominada quot;composición farmacéutica de la invenciónquot;, que comprende una combinación de (i) una cantidad terapéuticamente efectiva de citicolina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y (ii) una cantidad terapéuticamente efectiva de un activador de SIRT1 junto uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables para su uso como medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad cerebrovascular. En una realización preferida de la invención, dicha enfermedad es la isquemia cerebral.
Therefore, the present invention relates in a first aspect to a pharmaceutical composition, hereinafter referred to as "pharmaceutical composition of the invention", which comprises a combination of (i) a therapeutically effective amount of citicoline or a pharmaceutically acceptable salt thereof and (ii) a therapeutically effective amount of a SIRT1 activator together with one or more pharmaceutically acceptable carriers for use as a medicament for the treatment and / or prevention of cerebrovascular disease. In a preferred embodiment of the invention, said disease is cerebral ischemia.

Por tratamiento profiláctico o preventivo se entiende cuando la composición de la invención se administra antes de la posible aparición de la isquemia. En otra realización particular de la invención, ésta se refiere al uso de la composición de la invención para prevenir la extensión del tejido cerebral dañado. De acuerdo con un aspecto más específico, ésta se refiere al uso de la composición de la invención cuando el tejido cerebral dañado y en particular el infarto cerebral está asociado con la isquemia cerebral. Prophylactic or preventive treatment is understood when the composition of the invention is administered before the possible occurrence of ischemia. In another particular embodiment of the invention, this refers to the use of the composition of the invention to prevent the spread of damaged brain tissue. According to a more specific aspect, this refers to the use of the composition of the invention when damaged brain tissue and in particular cerebral infarction is associated with cerebral ischemia.

Como se ha mencionado anteriormente, el término quot;enfermedad cerebrovascular o ECVquot; tal como aquí se emplea, se refiere a un conjunto de trastornos de la vasculatura cerebral que conllevan a una disminución del flujo sanguíneo en el cerebro con la consecuente afectación, de forma transitoria o permanente, de la función de una región generalizada del cerebro o de una zona pequeña o focal. As mentioned above, the term quot; cerebrovascular disease or ECVquot; as used herein, it refers to a set of disorders of the cerebral vasculature that lead to a decrease in blood flow in the brain with the consequent transient or permanent involvement of the function of a generalized region of the brain or a small or focal area

El término quot;isquemia cerebralquot;, tal como aquí se utiliza, consiste en un episodio isquémico cerebral que puede definirse como una reducción de la aportación de sangre a un tejido. La isquemia cerebral puede ser causada por una disminución o interrupción de la aportación de sangre desde la arteria que irriga el cerebro. La isquemia cerebral puede ser aguda o crónica. Por tanto, en una realización particular de la invención, dicha isquemia cerebral incluye isquemia cerebral aguda e isquemia cerebral crónica. En una realización más particular, es un ataque isquémico transitorio, traumatismo craneoencefálico o ictus cerebral. The term "cerebral ischemia", as used herein, consists of a cerebral ischemic episode that can be defined as a reduction in blood supply to a tissue. Cerebral ischemia can be caused by a decrease or interruption of blood supply from the artery that supplies the brain. Cerebral ischemia can be acute or chronic. Therefore, in a particular embodiment of the invention, said cerebral ischemia includes acute cerebral ischemia and chronic cerebral ischemia. In a more particular embodiment, it is a transient ischemic attack, head trauma or cerebral stroke.

El término quot;ataque isquémico transitorioquot;, tal como aquí se utiliza, se refiere a un episodio cerebrovascular de tipo isquémico que se produce por la falta de aporte sanguíneo a una parte del cerebro, de forma transitoria, desapareciendo los síntomas, por definición, antes de 24 horas, generalmente antes de 1 hora. Durante un ataque isquémico transitorio, la
The term "transient ischemic attack", as used herein, refers to an ischemic stroke that occurs due to a lack of blood supply to a part of the brain, transiently, with symptoms disappearing, by definition, before 24 hours, usually before 1 hour. During a transient ischemic attack, the

interrupción temporal del suministro sanguíneo a un área del cerebro temporary interruption of blood supply to an area of the brain

ocasiona una reducción breve y repentina en la función cerebral. It causes a brief and sudden reduction in brain function.

En la presente invención, los términos quot;CDP-Colinaquot;, quot;citidina difosfato colinaquot; In the present invention, the terms quot; CDP-Colinaquot ;, quot; citidine diphosphate cholinequot;

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o quot;citicolinaquot; se usan indistintamente. Como se ha mencionado anteriormente, or quot; citicolinaquot; They are used interchangeably. As it mentioned above,

la citicolina o CDP-colina, un intermedio en la biosíntesis de la fosfatidilcolina, citicoline or CDP-choline, an intermediate in the biosynthesis of phosphatidylcholine,

ha demostrado poseer efectos neuroprotectores en varios modelos animales has been shown to have neuroprotective effects in several animal models

de lesión del SNC incluyendo la isquemia cerebral. of CNS injury including cerebral ischemia.

1o 1st

Por otra parte, el término quot;SIRT 1quot; tal como aquí se emplea, se refiere a la On the other hand, the term quot; SIRT 1quot; as used herein, refers to the

sirtuina 1. SIRT1 es una sirtuina implicada en la regulación del metabolismo, sirtuine 1. SIRT1 is a sirtuin involved in the regulation of metabolism,

senescencia, cáncer, y que desempeña un papel crucial en las rutas de senescence, cancer, and that plays a crucial role in the routes of

señalización sensibles al estrés. Se ha visto que la sobreexpresión y/o stress-sensitive signaling It has been seen that overexpression and / or

activación de SIRT1 ralentizan la muerte neuronal in vitro así como la SIRT1 activation slows neuronal death in vitro as well as the

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neurodegeneración in vivo. neurodegeneration in vivo.

Así, en una realización particular de la presente invención, la composición de Thus, in a particular embodiment of the present invention, the composition of

la presente invención, que comprende citicolina y un activador de SIRT1, se The present invention, which comprises citicoline and a SIRT1 activator, is

usa como medicamento para el tratamiento de enfermedades use as a medicine to treat diseases

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neurodegenerativas, tal como, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer. En neurodegenerative, such as, for example, Alzheimer's disease. In

otra realización particular de la invención, la composición de la invención se Another particular embodiment of the invention, the composition of the invention is

usa para el tratamiento de trastornos neurológicos, diabetes, enfermedades used for the treatment of neurological disorders, diabetes, diseases

cardiovasculares, cáncer y enfermedades relacionadas con el envejecimiento cardiovascular, cancer and aging-related diseases

o la edad. or age

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El término quot;activador de SIRT1quot; tal como aquí se menciona, se refiere a The term quot; activator of SIRT1quot; as mentioned here, it refers to

cualquier molécula que directa o indirectamente active dicha sirtuina 1, tanto any molecule that directly or indirectly activates said sirtuin 1, both

a nivel transcripcional, postranscripcional, traduccional o postraduccional. Se at the transcriptional, post-transcriptional, translational or post-translational level. Be

han descrito en la literatura varias moléculas que actúan, directa o have described in the literature several molecules that act, directly or

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indirectamente, aumentando la actividad enzimática desacetilasa de SIRT1. indirectly, increasing the enzymatic activity deacetylase of SIRT1.

Este es el caso del polifenol natural, resveratrol, conocido desde hace tiempo This is the case of natural polyphenol, resveratrol, long known

por promover los efectos protectores sobre las enfermedades for promoting the protective effects on diseases

cardiovasculares, y del cual también se ha demostrado que es capaz de cardiovascular, and which has also been shown to be capable of

penetrar la barrera hematoencefálica y ejercer un marcado efecto penetrate the blood brain barrier and exert a marked effect

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neuroprotector en varios escenarios patológicos del SNC. Así, a modo neuroprotector in several pathological scenarios of the CNS. So, by way

ilustrativo, el resveratrol se une directamente a SIRT1 promoviendo un illustratively, resveratrol joins directly with SIRT1 promoting a

cambio conformacional en la enzima. Recientemente, se han descrito otras conformational change in the enzyme. Recently, others have been described

pequeñas moléculas como activadores potentes de SIRT1 (Milne et al, 2007. small molecules as potent activators of SIRT1 (Milne et al, 2007.

Small molecule activators of SIRT1 as therapeutics for the treatment of type 2 Small molecule activators of SIRT1 as therapeutics for the treatment of type 2

diabetes. Nature, 450: 712-6). Algunas de dichas moléculas se están diabetes. Nature, 450: 712-6). Some of these molecules are getting

ensayando en clínica para el tratamiento de diabetes y enfermedades clinical trial for the treatment of diabetes and diseases

5 5

oncológicas, enfermedades relacionadas con la edad y la enfermedad de cancer, age-related diseases and disease

Alzheimer (www.sirtrispharma.com/pipeline.html). Alzheimer's (www.sirtrispharma.com/pipeline.html).

Así, en una realización particular de la invención, dicho activador de SIRT1 se Thus, in a particular embodiment of the invention, said activator of SIRT1 is

selecciona del grupo formado por resveratrol, 3,4,5-trimetoxi-N-(2-(3-select from the group consisting of resveratrol, 3,4,5-trimethoxy-N- (2- (3-

1o 1st

(piperazin-1-ilmetil)imidazo[2, 1-b ]tiazol-6-il)fenil)benzamida, N-(2-(3- (piperazin-1-ylmethyl) imidazo [2,1-b] thiazol-6-yl) phenyl) benzamide, N- (2- (3-

(piperazin-1-ilmetil)imidazo[2, 1-b]tiazol-6-il)fenil)quinoxalin-2-carboxamida, (piperazin-1-ylmethyl) imidazo [2,1-b] thiazol-6-yl) phenyl) quinoxalin-2-carboxamide,

(R)-N-(2-(3-( (3-hidroxipirrolindin-1-il)metil)imidazo[2, 1-b]tiazol-6-il)fenil)-2-(R) -N- (2- (3- ((3-hydroxypyrrolindin-1-yl) methyl) imidazo [2,1-b] thiazol-6-yl) phenyl) -2-

naftamida. naphthamide

15 fifteen

Tal como se ha mencionado anteriormente, la composición de la invención As mentioned above, the composition of the invention

comprende como uno de sus componentes citicolina o una sal comprises as one of its components citicoline or a salt

farmacéuticamente aceptable de la misma. Como sales farmacéuticamente pharmaceutically acceptable thereof. How do you leave pharmaceutically

aceptables de la CDP-Colina, se encuentran sus sales de adición básicas, en acceptable from CDP-Choline, its basic addition salts are found, in

particular las sales alcalinas o alcalinotérreas, tales como sus sales de sodio, particularly alkaline or alkaline earth salts, such as their sodium salts,

20 twenty

potasio, calcio y magnesio, o bien sus sales con ácidos minerales u potassium, calcium and magnesium, or its salts with mineral acids or

orgánicos, como el ácido clorhídrico, el ácido bromhídrico, el ácido sulfúrico, organic, such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid,

el ácido acético, el ácido trifluoroacético, el ácido cítrico, el ácido láctico, el acetic acid, trifluoroacetic acid, citric acid, lactic acid,

ácido malónico, el ácido tartárico, el ácido acrílico, el ácido metacrílico, el Malonic acid, tartaric acid, acrylic acid, methacrylic acid,

ácido málico, el ácido maleico, el ácido fumárico, el ácido benzoico, el ácido malic acid, maleic acid, fumaric acid, benzoic acid, acid

25 25

salicílico, el ácido crnamrco, el ácido metansulfónico, el ácido salicylic acid, crnamic acid, methanesulfonic acid, acid

bencenosulfónico, el ácido p-toluensulfónico y el ácido nicotínico. benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid and nicotinic acid.

La composición farmacéutica proporcionada por esta invención comprende, The pharmaceutical composition provided by this invention comprises,

citicolina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y (ii) un citicoline or a pharmaceutically acceptable salt thereof and (ii) a

activador de SJRT1, ambos en una cantidad terapéuticamente eficiente. En el SJRT1 activator, both in a therapeutically efficient amount. At

30 30

sentido utilizado en esta descripción, la expresión quot;cantidad terapéuticamente meaning used in this description, the expression "amount therapeutically

eficientequot; se refiere a la cantidad de citicolina y activador de SIRT1 calculada efficientquot; refers to the amount of citicoline and activator of SIRT1 calculated

para producir el efecto deseado. La dosis de los componentes (i) e (ii) a to produce the desired effect. The dose of components (i) and (ii) a

administrar a un sujeto puede variar dentro de un amplio intervalo administering to a subject may vary within a wide range

dependiendo de numerosos factores, entre los que se incluyen las depending on numerous factors, including

35 35

características de citicolina y activador de SIRT1 utilizada, e.g., su actividad y characteristics of citicoline and activator of SIRT1 used, e.g., its activity and

vida media biológica, la concentración en la composición farmacéutica, la biological half-life, concentration in the pharmaceutical composition, the

situación clínica del sujeto, la severidad de la patología, la forma farmacéutica clinical situation of the subject, the severity of the pathology, the pharmaceutical form

de administración elegida, etc. La composición farmacéutica proporcionada of chosen administration, etc. The pharmaceutical composition provided

por esta invención se puede administrar una o más veces al día con fines by this invention it can be administered one or more times a day for purposes

preventivos o terapéuticos o con otras pautas de administración, no preventive or therapeutic or with other administration guidelines, not

necesariamente diaria sino también de forma puntual, semanal, etc. necessarily daily but also on time, weekly, etc.

5 5

En una realización particular de la invención, los componentes de la In a particular embodiment of the invention, the components of the

composición de la invención se administran de de forma separada, Composition of the invention are administered separately,

simultánea o secuencial. simultaneous or sequential.

En otra realización particular de la invención, dicho medicamento es para la In another particular embodiment of the invention, said medicament is for the

1o 1st

administración por vía oral. Así, la composición de la invención puede oral administration Thus, the composition of the invention can

administrarse para la puesta en práctica de la presente invención por vía oral administered for the implementation of the present invention orally

en forma de comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, sellos, pastillas para in the form of tablets, capsules, powders, granules, seals, pills for

chupar, soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, geles y afines. En suck, solutions, suspensions, emulsions, syrups, gels and related. In

otra realización particular, la composición se administra por vía parenteral en Another particular embodiment, the composition is administered parenterally in

15 fifteen

forma de soluciones, suspensiones, emulsiones o afines para administración form of solutions, suspensions, emulsions or related for administration

intravenosa, subcutánea o intramuscular. También se contemplan fórmulas intravenous, subcutaneous or intramuscular. Formulas are also contemplated

para su inhalación o administración intranasal. for inhalation or intranasal administration.

Las composiciones farmacéuticas pueden contener agentes saborizantes, The pharmaceutical compositions may contain flavoring agents,

20 twenty

edulcorantes, etc., en vehículos o diluyentes sólidos o líquidos adecuados, o sweeteners, etc., in suitable solid or liquid carriers or diluents, or

en medios estériles adecuados para formar suspensiones o soluciones in sterile media suitable to form suspensions or solutions

adecuadas para inyección intravenosa, subcutánea o intramuscular. Dichas suitable for intravenous, subcutaneous or intramuscular injection. These

composiciones contienen normalmente de un 1 a un 40%, preferiblemente de compositions usually contain 1 to 40%, preferably of

un 1 a un 10% en peso del compuesto activo, siendo el resto de la 1 to 10% by weight of the active compound, the remainder of which is

25 25

composición vehículos, diluyentes, disolventes y similares farmacéuticamente Composition vehicles, diluents, solvents and the like pharmaceutically

aceptables. acceptable.

La citicolina se administra preferiblemente de forma oral como una sal Citicoline is preferably administered orally as a salt.

aceptable desde el punto de vista farmacéutico. La sal preferida es la sal Pharmaceutically acceptable. The preferred salt is salt

30 30

monosodio de citicolina, ya que esta forma está normalmente disponible con Citicoline monosodium, since this form is normally available with

una pureza aceptable desde el punto de vista farmacéutico. El monosodio de a purity acceptable from the pharmaceutical point of view. The monosodium of

citicolina es una forma de exógeno de citidina 5\cc, difosfato de colina (CDP-Citicoline is a form of exogenous citidine 5, choline diphosphate (CDP-

colina). El endógeno CDP-colina es un intermediario clave en la biosíntesis de hill). The endogenous CDP-choline is a key intermediary in the biosynthesis of

la fosfatidilcolina, un componente lipídico primario de la membrana phosphatidylcholine, a primary lipid component of the membrane

35    35

involucrado en la regulación dinámica de la integridad celular. involved in the dynamic regulation of cellular integrity.

Las dosis de citicolina se suministran según una base por paciente (oscilando entre aproximadamente 45 kg hasta 100 kg por paciente, o una media de 70 kg por paciente). Generalmente, las dosis diarias de citicolina pueden variar desde aproximadamente 100 mg hasta unos 5000 mg, preferiblemente desde 250 mg hasta 3000 mg, y más preferiblemente desde 500 mg hasta 2000 mg. Las dosis pueden ser administradas una sola vez o hasta cuatro o más veces al día. Una dosis altamente preferida es de 500 mg administrados dos veces al día a cada paciente. Si se requiere una mayor eficacia terapéutica se recomienda una administración de 2000 mg en una sola toma o repartida en dos tomas de 1000 mg. Citicoline doses are given on a per patient basis (ranging from approximately 45 kg to 100 kg per patient, or an average of 70 kg per patient). Generally, daily doses of citicoline may vary from about 100 mg to about 5000 mg, preferably from 250 mg to 3000 mg, and more preferably from 500 mg to 2000 mg. Doses can be administered only once or up to four or more times a day. A highly preferred dose is 500 mg administered twice daily to each patient. If greater therapeutic efficacy is required, an administration of 2000 mg in a single dose or divided into two doses of 1000 mg is recommended.

La duración del tratamiento es variable, pero se ha observado que los pacientes toleran bien la citicolina en dosis comprendidas entre los 250 mg y los 2000 mg aproximadamente en periodos prolongados, es decir, desde varias semanas hasta varios años. Las dosis deben variar a lo largo del tiempo dependiendo de la gravedad de los síntomas, de la tolerancia individual de cada paciente, ruta de administración y respuesta al tratamiento. Éste puede ser continuado de forma indefinida si se tolera bien. The duration of treatment is variable, but it has been observed that patients tolerate citicoline well in doses ranging from approximately 250 mg to 2000 mg over prolonged periods, that is, from several weeks to several years. The doses should vary over time depending on the severity of the symptoms, the individual tolerance of each patient, route of administration and response to treatment. This can be continued indefinitely if it is well tolerated.

En otra realización particular de la invención, la cantidad de dicho activador de SIRT-1, en particular, la dosis de resveratrol a administrar en la composición de la invención es de entre O, 1 mg a 500 mg. Más preferiblemente, la cantidad de activador de SIRT-1 a administrar es de entre 1 mg a 500 mg. Además de contener los portadores y/o excipientes farmacéuticos estándar, en una realización particular de la invención, la composición de la invención también puede contener otras sustancias terapéuticas activas. Así, la composición farmacéutica proporcionada por esta invención, si se desea, puede usarse junto con otros fármacos, por ejemplo, fármacos útiles en el tratamiento de las enfermedades cerebrovasculares, en particular, de la isquemia cerebral, con el fin de aumentar la eficiencia de la composición farmacéutica proporcionada por esta invención, generándose de este modo una terapia de combinación. Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de la misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden facilitarse como una composición farmacéutica separada para su administración al mismo tiempo (administración simultánea) que la composición farmacéutica proporcionada por esta invención o en momentos
In another particular embodiment of the invention, the amount of said SIRT-1 activator, in particular, the dose of resveratrol to be administered in the composition of the invention is between 0, 1 mg to 500 mg. More preferably, the amount of SIRT-1 activator to be administered is between 1 mg to 500 mg. In addition to containing the standard pharmaceutical carriers and / or excipients, in a particular embodiment of the invention, the composition of the invention may also contain other active therapeutic substances. Thus, the pharmaceutical composition provided by this invention, if desired, can be used together with other drugs, for example, drugs useful in the treatment of cerebrovascular diseases, in particular cerebral ischemia, in order to increase the efficiency of the pharmaceutical composition provided by this invention, thereby generating a combination therapy. Such additional drugs may be part of the same pharmaceutical composition or, alternatively, may be provided as a separate pharmaceutical composition for administration at the same time (simultaneous administration) as the pharmaceutical composition provided by this invention or at times

diferentes (administración secuencial) respecto a la administración de la different (sequential administration) with respect to the administration of the

composición farmacéutica proporcionada por esta invención. Pharmaceutical composition provided by this invention.

En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de una composición In another aspect, the present invention relates to the use of a composition

farmacéutica que comprende una combinación de (i) una cantidad pharmaceutical comprising a combination of (i) an amount

5 5

terapéuticamente efectiva de citicolina o una sal farmacéuticamente aceptable therapeutically effective citicoline or a pharmaceutically acceptable salt

de la misma y (ii) una cantidad terapéuticamente efectiva de un activador de thereof and (ii) a therapeutically effective amount of an activator of

SIRT1 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o SIRT1 for the preparation of a medication for treatment and / or

prevención de una enfermedad cerebrovascular, en particular, para el prevention of cerebrovascular disease, in particular for

tratamiento de la isquemia cerebral. treatment of cerebral ischemia.

1o 1st

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la prevención In another aspect, the invention relates to a method for prevention.

y/o tratamiento de las enfermedades cerebrovasculares, en particular, de la and / or treatment of cerebrovascular diseases, in particular, of the

isquemia cerebral, que comprende administrar a un sujeto en necesidad de cerebral ischemia, which includes administering to a subject in need of

tratamiento una cantidad terapéuticamente eficiente de una composición treatment a therapeutically efficient amount of a composition

farmacéutica proporcionada por esta invención que comprende citicolina o Pharmaceutical provided by this invention comprising citicoline or

15 fifteen

una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y un activador de SIRT1. a pharmaceutically acceptable salt thereof and an activator of SIRT1.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra quot;comprendequot; y Throughout the description and the claims the word quot; comprehequot; Y

sus variantes, tal como quot;comprendiendoquot;, no pretenden excluir otras its variants, such as quot; understandingquot ;, are not intended to exclude other

características técnicas, aditivos, componentes o pasos. technical characteristics, additives, components or steps.

20 twenty

Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la For experts in the field, other objects, advantages and characteristics of the

invención serán evidentes con el examen de la descripción o se pueden invention will be apparent with the examination of the description or can be

conocer por la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se know by the practice of the invention. The following examples are

proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of

la presente invención. The present invention.

25 25

EJEMPLOS EXAMPLES

MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALS AND METHODS

Modelo de isquemia cerebral focal permanente en rata Model of permanent focal cerebral ischemia in rat

30 30

Los ensayos se efectuaron en ratas Fischer macho de peso 250-300g. Las The tests were carried out on male Fischer rats weighing 250-300g. The

ratas fueron anestesiadas con halotano 1.5% en una mezcla de nitrógeno rats were anesthetized with 1.5% halothane in a nitrogen mixture

70%/oxígeno 30%. Se insertó una cánula en la arteria femoral para la 70% / oxygen 30%. A cannula was inserted into the femoral artery for

monitorización continua de la presión y la toma de muestras de sangre para el continuous pressure monitoring and blood sampling for the

análisis de pH, gases y glucosa. Las temperaturas corporales y cerebrales se pH, gas and glucose analysis. Body and brain temperatures are

35 35

mantuvieron a 36.5±0.5°C durante todo el proceso. Las variables fisiológicas kept at 36.5 ± 0.5 ° C throughout the process. Physiological variables

estudiadas no fueron significativamente diferentes entre los grupos de studied were not significantly different between the groups of

animales antes, durante o después de la oclusión de la arteria cerebral media animals before, during or after occlusion of the middle cerebral artery

(OACM o MCAO) (datos no presentados). La isquemia cerebral focal (OACM or MCAO) (data not shown). Focal cerebral ischemia

permanente fue inducida por ligadura de la arteria carótida común izquierda permanent was induced by ligature of the left common carotid artery

(ACC) y oclusión de la arteria cerebral media distal ipsilateral (ACM) tal como (ACC) and ipsilateral distal middle cerebral artery occlusion (ACM) such as

se ha descrito anteriormente (Hurtado et al., 2008. Delayed post-ischemic has been described previously (Hurtado et al., 2008. Delayed post-ischemic

5 5

administration of CDP-choline increases EAA T2 association to lipid rafts and administration of CDP-choline increases EAA T2 association to lipid rafts and

affords neuroprotection in experimental stroke. Neurobiol Dis 2008. 29:123-affords neuroprotection in experimental stroke. Neurobiol Dis 2008. 29: 123-

131). En resumen, para la ligadura de la ACC, se efectuó una incisión cervical 131). In summary, for the ACC ligation, a cervical incision was made

ventral longitudinal y se aisló la ACC ipsilateral ocluyéndola ventral longitudinal and ipsilateral ACC was isolated by occluding it

permanentemente con una ligadura de hilo de seda. Después, se realizó una permanently with a silk thread ligature. Afterwards, a

1O 1O

pequeña cranioctomía sobre el tronco de la ACM y encima de la fisura rinal. small cranioctomy on the trunk of the MCA and on top of the rinal fissure.

En algunos ensayos, para la oclusión, la ACM se elevó y se cauterizó In some trials, for occlusion, the ACM was raised and cauterized

(oclusión de la arteria cerebral media; OACM). Por otra parte, en los ensayos (occlusion of the middle cerebral artery; OACM). On the other hand, in the trials

dirigidos al estudio de la sinergia entre CDP-colina y resveratrol, la ACM se aimed at the study of the synergy between CDP-choline and resveratrol, the ACM is

ligó con una sutura 9-0 justo antes de su bifurcación en las ramas frontal y linked with a 9-0 suture just before its fork in the frontal branches and

15 fifteen

parietal. A continuación, también se ocluyó la ACC con una ligadura de hilo parietal. Next, the ACC was also occluded with a thread ligation

de seda y se confirmó la interrupción completa del flujo sanguíneo en un of silk and the complete interruption of blood flow in a

microscopio quirúrgico. Finalmente, una hora después, se reabrió la ACC surgical microscope Finally, an hour later, the ACC was reopened

contra lateral. against lateral.

20 twenty

Las ratas en la cuales la ACM estaba expuesta pero no ocluida sirvieron Rats in which the MCA was exposed but not occluded served

como controles con intervención simulada (SHAM). Después de la as controls with simulated intervention (SHAM). After the

intervención quirúrgica, los animales fueron devueltos a sus jaulas y tuvieron surgical intervention, the animals were returned to their cages and had

libre acceso a la comida y a la bebida. La temperatura corporal de los Free access to food and drink. The body temperature of

animales se monitorizó durante toda la experimentación y se mantuvo a animals were monitored throughout the experiment and kept at

25 25

37.5±0.5°C empleando una manta térmica. Todos los procesos cumplieron 37.5 ± 0.5 ° C using a thermal blanket. All processes complied

con los criterios del Comité del Cuidado de Animales de la Universidad with the criteria of the University Animal Care Committee

Complutense de Madrid de acuerdo con las Normas UE (86/609/CEE, Complutense de Madrid in accordance with EU Standards (86/609 / EEC,

2003/65/CE y RO 1201/2005). El índice de supervivencia de los animales 2003/65 / CE and RO 1201/2005). The survival rate of animals

hasta el final de la experimentación fue del 90%. until the end of the experimentation it was 90%.

30 30

Grupos experimentales en isquemia cerebral focal Experimental groups in focal cerebral ischemia

La CDP-colina fue administrada por inyección intraperitoneal (i.p.). Se CDP-choline was administered by intraperitoneal injection (i.p.). Be

establecieron dos series de ensayos: They established two series of trials:

En la primera serie, se utilizaron cuatro grupos de animales para los estudios In the first series, four groups of animals were used for the studies

35 35

proteómicos y su confirmación por medio de la prueba Western Blot: 1) proteomics and their confirmation by means of the Western Blot test: 1)

animales controles con intervención simulada, sacrificados 24 horas después control animals with simulated intervention, slaughtered 24 hours later

de la simulación (SHAM; n=4); 2) animales controles con intervención of the simulation (SHAM; n = 4); 2) control animals with intervention

simulada + CDP-colina 2 g/kg (administrados 4 horas después de la simulated + CDP-choline 2 g / kg (administered 4 hours after

intervención) y sacrificados 24 horas después de la administración (SHAM + intervention) and slaughtered 24 hours after administration (SHAM +

CDP-colina; n=4); 3) animales con oclusión permanente de la arteria cerebral CDP-choline; n = 4); 3) animals with permanent occlusion of the cerebral artery

media + inyección i.p. de solución salina 4 horas después de la oclusión, media + injection i.p. of saline solution 4 hours after occlusion,

5 5

sacrificados 24 h después de la administración de la solución salina (OACM; sacrificed 24 h after administration of the saline solution (OACM;

n=4); 4) animales con OACM permanente + inyección i.p. de CDP-colina 2 n = 4); 4) animals with permanent OACM + injection i.p. from CDP-choline 2

g/kg 4 horas después de la oclusión, sacrificados 24 horas después de la g / kg 4 hours after occlusion, sacrificed 24 hours after

administración de citicolina (OACM+CDP-colina; n=4). Adicionalmente, para administration of citicoline (OACM + CDP-choline; n = 4). Additionally, for

la determinación del volumen de infarto, los animales con el mismo protocolo the determination of the volume of infarction, animals with the same protocol

1o 1st

de tratamiento fueron sacrificados 48 horas después de la oclusión (OACM; of treatment were sacrificed 48 hours after occlusion (OACM;

n=6; OACM+CDP; n=6). n = 6; OACM + CDP; n = 6).

En la segunda serie de ensayos dirigidos al estudio del efecto sinérgico entre In the second series of trials aimed at the study of the synergistic effect between

CDP-colina y los activadores de SIRT1, se utilizaron cuatro grupos de CDP-choline and SIRT1 activators, four groups of

animales para la determinación del volumen de infarto: 1) animales con animals for the determination of the volume of infarction: 1) animals with

15 fifteen

OACM +inyección i.p. de solución salina 10 minutos y 3 horas después de la OACM + injection i.p. of saline solution 10 minutes and 3 hours after

OACM (OACM; n=8); 2) animales con OACM + CDP-colina (0.2g/kg 1O OACM (OACM; n = 8); 2) animals with OACM + CDP-choline (0.2g / kg 1O

minutos después de la OACM; n=6); 3) animales con OACM + el activador de minutes after the OWHC; n = 6); 3) animals with OACM + activator

SIRT1, resveratrol (2.5 mg/kg 3h después de la OACM; n=7); 4) animales con SIRT1, resveratrol (2.5 mg / kg 3h after the OACM; n = 7); 4) animals with

OACM+CDP-colina+resveratrol (0.2 g/kg CDP-colina 1 O minutos y 2.5 mg/kg OACM + CDP-choline + resveratrol (0.2 g / kg CDP-choline 1 O minutes and 2.5 mg / kg

20 twenty

de resveratrol 3 horas después de OACM; n=6). of resveratrol 3 hours after OACM; n = 6).

Estudio proteómico Proteomic study

Se emplearon tres métodos proteómicos diferentes: proteómica clásica, Three different proteomic methods were used: classical proteomics,

método DIGE más MAL DI-TOF y proteómica de expresión diferencial con DIGE method plus BAD DI-TOF and differential expression proteomics with

25 25

marcaje iTRAQ más LC/MS/MS, en el Centro de Apoyo a la Investigación en iTRAQ marking plus LC / MS / MS, at the Research Support Center in

Genómica y Proteómica de la UCM. Genomics and Proteomics of the UCM.

Determinación del tamaño del infarto Determination of infarct size

Dos días después de la OACM, se sacrificaron los animales con una Two days after the OWHC, the animals were sacrificed with a

30 30

sobredosis de pentobarbital sódico para valorar la consecuencia del infarto. sodium pentobarbital overdose to assess the consequence of the infarction.

Se extrajo el cerebro y se cortaron porciones de 2 mm de espesor para The brain was removed and 2 mm thick portions were cut to

obtener cortes coronales de 1 mm (Brain Matrix, WPI, UK) que se tiñeron con obtain 1 mm coronal cuts (Brain Matrix, WPI, UK) that were stained with

cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (1% TTC en tampón fosfato 0.1 M). Se 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (1% TTC in 0.1 M phosphate buffer). Be

calcularon los volúmenes de infarto tomando muestras de cada lado de las they calculated the infarct volumes taking samples from each side of the

35 35

secciones coronales con una cámara digital (Nikon Coolpix 990), y se coronal sections with a digital camera (Nikon Coolpix 990), and it

analizaron las imágenes utilizando lmageJ 1.33u (National lnstitutes of analyzed the images using lmageJ 1.33u (National lnstitutes of

Health, Bethesda, MD). Health, Bethesda, MD).

La imagen digitalizada se proyectó en un video monitor, habiendo ocultado las condiciones experimentales al observador. El perímetro del hemisferio contralateral se superpuso al hemisferio ipsilateral para excluir edema, y se delinearon los márgenes del infarto con un cursor. Se determinó el área de infarto, que se encontraba sin teñir, por medio del recuento de pixeles contenidos en las regiones delineadas, y se expresó en milímetros cuadrados. Se integraron los volúmenes de infarto (en mm3 o en % de hemisferio infartado -VHI-) a partir de las áreas de infarto a lo largo de la extensión del infarto calculada como una proyección ortogonal. Todos los animales exhibieron infarto después del proceso de oclusión, el cual incluía la corteza, subcorteza y estriado, dependiendo de la intensidad de la lesión. The digitized image was projected on a video monitor, having hidden the experimental conditions from the observer. The perimeter of the contralateral hemisphere was superimposed on the ipsilateral hemisphere to exclude edema, and the margins of the infarction were delineated with a cursor. The infarct area, which was unstained, was determined by counting pixels contained in the delineated regions, and expressed in square millimeters. Infarction volumes (in mm3 or in% of infarcted hemisphere -VHI-) were integrated from the infarct areas along the length of the infarction calculated as an orthogonal projection. All animals exhibited infarction after the occlusion process, which included the cortex, subcortex and striatum, depending on the intensity of the lesion.

Cultivo primario de neuronas corticales de ratas Los cultivos primarios de neuronas corticales de ratas se han realizado según está descrito (Romera et al., 2004. In vitro ischemic tolerance involves upregulation of glutamate transport partly mediated by the TACE/ADAM17-TNF-a pathway, J. Neurosci. 24, 1350-7). Los estudios se efectuaron in vitro a los días 9-10, tiempo en el cual los cultivos estaban compuestos del 94% de neuronas, tal como se ha determinado por citometría de flujo (Romera et al., 2004, citado supra). Primary culture of rat cortical neurons Primary cultures of rat cortical neurons have been performed as described (Romera et al., 2004. In vitro ischemic tolerance involves upregulation of glutamate transport partly mediated by the TACE / ADAM17-TNF-a pathway , J. Neurosci. 24, 1350-7). The studies were carried out in vitro on days 9-10, at which time the cultures were composed of 94% neurons, as determined by flow cytometry (Romera et al., 2004, cited supra).

Análisis por Western Blot Se recogió tejido cerebral del área peri-infarto de las ratas (n=4 para cada grupo) sacrificadas 24 horas después de la OACM. La concentración de proteínas se determinó por espectrofotometría (NanoDrop ND1 000). Cantidades iguales de proteína total (10 j.Jg) se resolvieron por SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (HybondTM-P, Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Alemania). La inmunodetección se efectuó por procedimientos estándares. Se bloquearon las membranas con 5% de leche desnatada en TBS-T (0.05% Tween 20 en TBS) y se sondaron con anticuerpos primarios específicos contra SIRT1 (Santa Cruz; 1:100 dilución, banda 120 k Da) y se incluyeron anti-~-actina de ratón (Sigma; 1:1 0000) y anti GAPOH de ratón (Sigma; Western Blot Analysis Brain tissue was collected from the peri-infarcted area of the rats (n = 4 for each group) sacrificed 24 hours after the OACM. Protein concentration was determined by spectrophotometry (NanoDrop ND1 000). Equal amounts of total protein (10 j.Jg) were resolved by SDS-PAGE and transferred to a polyvinylidene difluoride membrane (PVDF) (HybondTM-P, Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Germany). Immunodetection was performed by standard procedures. The membranes were blocked with 5% skim milk in TBS-T (0.05% Tween 20 in TBS) and probed with specific primary antibodies against SIRT1 (Santa Cruz; 1: 100 dilution, 120 k Da band) and anti- ~ - mouse actin (Sigma; 1: 1 000) and anti mouse GAPOH (Sigma;

1:1 0000) para normalizar la carga de proteína. Las proteínas reconocidas por el anticuerpo se revelaron utilizando el kit ECL según las instrucciones del fabricante (Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Alemania).
1: 1 0000) to normalize the protein load. The proteins recognized by the antibody were revealed using the ECL kit according to the manufacturer's instructions (Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Germany).

Aislamiento de los extractos nucleares Se recogieron las neuronas corticales de ratas cultivadas 24 horas después del tratamiento con 100 f.JM de CDP-colina en solución salina tamponada con fosfato (106 células/mL). El homogeneizado se centrifugó a 4°C, 12.000 x g. Se descartó el sobrenadante y los extractos nucleares se prepararon tal como se describe: se homogeneizaron células neuronales corticales de ratas en 1 O mM HEPES, pH 7.9, 1.5 mM MgCI2, 10 mM KCI, y 0.5% Nonidet P-40. Los núcleos se sedimentaron a 12.000 x g durante 1 minuto a 4°C y sometidos a lisis en 20 mM HEPES, pH 7.9, 15 mM MgCI2, 420 mM NaCI y 0.2 mM EDTA. Después de centrifugación (12.000 g x durante 5 minutos a 4°C), el pellet se descartó. Isolation of nuclear extracts Cortical neurons were collected from cultured rats 24 hours after treatment with 100 f.JM of CDP-choline in phosphate buffered saline (106 cells / mL). The homogenate was centrifuged at 4 ° C, 12,000 x g. The supernatant was discarded and the nuclear extracts were prepared as described: rat cortical neuronal cells were homogenized in 1 O mM HEPES, pH 7.9, 1.5 mM MgCI2, 10 mM KCI, and 0.5% Nonidet P-40. The nuclei were sedimented at 12,000 x g for 1 minute at 4 ° C and lysed in 20 mM HEPES, pH 7.9, 15 mM MgCl2, 420 mM NaCI and 0.2 mM EDTA. After centrifugation (12,000 g x for 5 minutes at 4 ° C), the pellet was discarded.

Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica de ratas 24 horas después de la administración de 2 g/kg de CDP-colina en ratas Fischer, se recogieron muestras de sangre en un tubo de centrífuga con 2 mi de sangre tratada con anticoagulante y un volumen igual de solución salina tamponada con fosfato (pH 7.6). Se añadió Ficoii-Paque PREMIUM (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Suecia) al tubo de centrífuga y se colocaron con cuidado en capas las muestras de sangre diluida en Ficoii-Paque Premium. La muestra se centrifugó a 400 x g durante 20 minutos a 20°C y la capa de células mononucleares se transfirió a un tubo de centrífuga estéril. Las células mononucleares se suspendieron en un tampón de homogeneización y se mezclaron con tampón de muestra de electroforesis para el análisis Western Blot. Isolation of peripheral blood mononuclear cells from rats 24 hours after the administration of 2 g / kg of CDP-choline in Fischer rats, blood samples were collected in a centrifuge tube with 2 ml of blood treated with anticoagulant and an equal volume of phosphate buffered saline (pH 7.6). Ficoii-Paque PREMIUM (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden) was added to the centrifuge tube and blood samples diluted in Ficoii-Paque Premium were carefully layered. The sample was centrifuged at 400 x g for 20 minutes at 20 ° C and the mononuclear cell layer was transferred to a sterile centrifuge tube. The mononuclear cells were suspended in a homogenization buffer and mixed with electrophoresis sample buffer for Western Blot analysis.

Determinación de la actividad de SIRT1 Para determinar la actividad SIRT1, 24 horas después de la administración de 1 00 f.JM de CDP-colina se recogieron neuronas corticales cultivadas, y se analizaron los extractos totales, nucleares y citosólicos. Se recogieron las células después de la administración de CDP-colina, se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (pH 7.4) y se homogeneizaron en tampón homogeneizador (10 mM HEPES, pH 7.9, 1.5 mM MgCI2, 10 mM KCI, y 0.5% Nonidet P-40). Los núcleos se sedimentaron a 12.000 x g durante 1min a 4°C y se lisaron en 20 mM HEPES, pH 7.9, 15 mM MgCI2, 420 mM NaCI y 0.2 mM EDTA.
Determination of SIRT1 activity To determine SIRT1 activity, 24 hours after administration of 1 00 f.JM of CDP-choline, cultured cortical neurons were collected, and total, nuclear and cytosolic extracts were analyzed. Cells were collected after administration of CDP-choline, washed in phosphate buffered saline (pH 7.4) and homogenized in homogenizing buffer (10 mM HEPES, pH 7.9, 1.5 mM MgCI2, 10 mM KCI, and 0.5% Nonidet P-40). The cores were sedimented at 12,000 xg for 1min at 4 ° C and lysed in 20 mM HEPES, pH 7.9, 15 mM MgCI2, 420 mM NaCI and 0.2 mM EDTA.

Tras una centrifugación (12,000 x g durante 5 minutos a 4°C), el pellet se descartó. El sobrenadante obtenido al final de la centrifugación se dializó utilizando un aparato Millipore Amicon Ultraconcentrator (YM-1 O) (Millipore, Carrigtwohill, Irlanda). El dializado resultante se conservó a -80°C hasta su empleo. Dicho la capa de las células mononucleares se utilizó como fuente del enzima para el ensayo enzimático de SIRT-1. La actividad enzimática de SIRT-1 se determinó utilizando un kit de ensayo de actividad por fluorescencia de SIRT1 (Biomol lnternational) basado en el péptido sustrato Fluor de Lys-SIRT1. After centrifugation (12,000 x g for 5 minutes at 4 ° C), the pellet was discarded. The supernatant obtained at the end of the centrifugation was dialyzed using a Millipore Amicon Ultraconcentrator (YM-1 O) apparatus (Millipore, Carrigtwohill, Ireland). The resulting dialysate was stored at -80 ° C until use. Said mononuclear cell layer was used as a source of the enzyme for the SIRT-1 enzyme assay. The enzymatic activity of SIRT-1 was determined using a fluorescence activity assay kit of SIRT1 (Biomol lnternational) based on the Fluor Lys-SIRT1 substrate peptide.

Análisis estadístico Los resultados se expresan como media ± SEM del número indicado de ensayos. Las comparaciones entre los grupos de animales se efectuaron con el test-t de Student no pareado o la prueba ANOVA de un factor con la prueba post hoc de Bonferroni para comparaciones múltiples. Los resultados se consideraron significativos a plt;0.05. Statistical analysis The results are expressed as mean ± SEM of the indicated number of trials. Comparisons between animal groups were made with the unpaired Student's t-test or the one-way ANOVA test with the Bonferroni post hoc test for multiple comparisons. The results were considered significant at plt; 0.05.

RESULTADOS RESULTS

Confirmación del efecto de CDP-colina sobre el volumen de infarto después de la OACM El volumen de infarto se determinó 48 horas después de la oclusión en los animales tratados con solución salina o con CDP-colina 2 g/kg 4 horas después de la oclusión. El volumen de infarto determinado 48 horas después de la OACM mostró una reducción en el grupo tratado con CDP-colina (Figura 1). Estas condiciones de neuroprotección se seleccionaron para el estudio. Confirmation of the effect of CDP-choline on the volume of infarction after the OACM The volume of infarction was determined 48 hours after occlusion in animals treated with saline or with CDP-choline 2 g / kg 4 hours after occlusion . The volume of infarction determined 48 hours after the OACM showed a reduction in the group treated with CDP-choline (Figure 1). These neuroprotection conditions were selected for the study.

Estudio proteómico en cerebro de ratas control y ratas tratadas con CDP-colina después de la exposición a la OACM permanente Con las tres técnicas proteómicas empleadas se han identificado varias proteínas que experimentaron cambios gt;20%, entre las cuales se seleccionó SIRT1, la cual fue aumentada por CDP-colina en el cerebro tanto de ratas controles con intervención simulada (SHAM) como de las expuestas a OACM. Proteomic study in brain of control rats and rats treated with CDP-choline after exposure to permanent LMO With the three proteomic techniques used, several proteins have been identified that underwent changes; 20%, among which SIRT1 was selected, which was increased by CDP-choline in the brain of both control rats with simulated intervention (SHAM) and those exposed to OACM.

Confirmación por el análisis Western Blot del aumento inducido por CDP-colina en los niveles de SIRT1 en homogenados de cerebro de rata A fin de confirmar que la CDP-colina es capaz de aumentar los niveles de SIRT1, se determinó la presencia de esta proteína por medio de análisis Western Blot en homogenados de cerebro. Tal como muestra la Figura 2, los niveles de proteínas de SIRT1 aumentaron después de la OACM. Más especialmente, la CDP-colina aumentó dichos niveles tanto en las ratas controles con intervención simulada (SHAM) como de las expuestas a OACM.
Confirmation by Western Blot analysis of the increase induced by CDP-choline in SIRT1 levels in rat brain homogenates In order to confirm that CDP-choline is capable of increasing SIRT1 levels, the presence of this protein was determined by Western blot analysis medium in brain homogenates. As Figure 2 shows, SIRT1 protein levels increased after the OACM. More especially, CDP-choline increased these levels in both control rats with simulated intervention (SHAM) and those exposed to OACM.

CDP-colina aumentó los niveles de SIRT1 en las fracciones nucleares y citosólicas de neuronas corticales cultivadas de rata Se ha descrito que la localización subcelular de SIRT1, aunque referida principalmente como nuclear, podría cambiar en respuesta a diferentes estímulos, lo que podría implicar un mecanismo regulador de dicha proteína. Se ha estudiado si la CDP-colina afecta la expresión y la localización subcelular de SIRT1 en neuronas corticales de rata tratadas durante 24 horas con CDP-colina. El tratamiento de neuronas corticales cultivadas con CDP-colina (1 00 !JM) aumentó los niveles de SIRT1 en dichas células, localizándose este aumento principalmente en la fracción nuclear de dichas células (Fig. 3A, 8). CDP-choline increased SIRT1 levels in nuclear and cytosolic fractions of rat cultured cortical neurons It has been described that the subcellular location of SIRT1, although referred to primarily as nuclear, could change in response to different stimuli, which could involve a mechanism regulator of said protein. It has been studied whether CDP-choline affects the expression and subcellular localization of SIRT1 in rat cortical neurons treated for 24 hours with CDP-choline. The treatment of cortical neurons cultured with CDP-choline (1 00! JM) increased the levels of SIRT1 in said cells, this increase being located mainly in the nuclear fraction of said cells (Fig. 3A, 8).

Actividad de SIRT1 en las fracciones nucleares y citosólicas de neuronas corticales cultivadas de ratas tratadas con CDP-colina Los resultados aquí mostrados indican que la CDP-colina aumenta la expresión de SIRT1 tanto en homogenados de cerebro como en extractos nucleares de neuronas corticales de ratas. Posteriormente se determinó si esta expresión aumentada estaba correlacionada con un aumento en la actividad enzimática de SIRT1, en los extractos totales, nucleares y citosólicos de neuronas corticales de ratas tratadas durante 24 horas con CDP-colina (100 IJM). Los resultados demuestran que, de acuerdo con los niveles de expresión de SIRT1, la CDP-colina aumentó significativamente la actividad de SIRT1 en los extractos totales y nucleares de dichas células (Fig. 3C). SIRT1 activity in the nuclear and cytosolic fractions of cultured cortical neurons of rats treated with CDP-choline The results shown here indicate that CDP-choline increases the expression of SIRT1 in both brain homogenates and in nuclear extracts of rat cortical neurons. Subsequently, it was determined whether this increased expression was correlated with an increase in the enzymatic activity of SIRT1, in the total, nuclear and cytosolic extracts of cortical neurons of rats treated for 24 hours with CDP-choline (100 IJM). The results show that, according to the expression levels of SIRT1, CDP-choline significantly increased the activity of SIRT1 in the total and nuclear extracts of said cells (Fig. 3C).

CDP-colina aumentó los niveles de SIRT1 en células mononucleares A continuación, se examinó si la CDP-colina podría afectar la expresión proteica de SIRT1 no sólo en el cerebro de ratas y neuronas cultivadas, sino también en otras células, tal como las células mononucleares de sangre periférica. Los resultados muestran que los niveles de expresión proteica de SIRT1 fueron significativamente superiores en las células mononucleares circulantes de ratas tratadas con CDP-colina, cuando se comparó con las ratas control (Fig. 4).
CDP-choline increased SIRT1 levels in mononuclear cells Next, it was examined whether CDP-choline could affect the protein expression of SIRT1 not only in the brain of cultured rats and neurons, but also in other cells, such as mononuclear cells of peripheral blood. The results show that SIRT1 protein expression levels were significantly higher in circulating mononuclear cells of rats treated with CDP-choline, when compared to control rats (Fig. 4).

Efecto sinérgico entre CDP-colina y el activador de SIRT1 resveratrol Debido a que se ha demostrado que la CDP-colina aumenta la expresión proteica de SIRT1, se analizó si esta sustancia podría exhibir efectos sinérgicos con otros compuestos que actúan como activadores de la actividad enzimática de SIRT1. Por tanto, se estudió el efecto de la asociación de dosis sub-efectivas de CDP-colina (200 mg/kg) y del activador de SIRT1, resveratrol (2.5 mg/kg). Los datos muestran (Fig. 5) que la asociación de estas dos sustancias posee un notable efecto sinérgico demostrado en forma de una reducción del 60% en el volumen de infarto después de la OACM. Synergistic effect between CDP-choline and the activator of SIRT1 resveratrol Because it has been shown that CDP-choline increases the protein expression of SIRT1, it was analyzed whether this substance could exhibit synergistic effects with other compounds that act as activators of enzymatic activity of SIRT1. Therefore, the effect of the association of sub-effective doses of CDP-choline (200 mg / kg) and the activator of SIRT1, resveratrol (2.5 mg / kg) was studied. The data show (Fig. 5) that the association of these two substances has a remarkable synergistic effect demonstrated in the form of a 60% reduction in the volume of infarction after the LMO.

DISCUSIÓN DISCUSSION

En la presente invención se ha demostrado que la CDP-colina aumenta la expresión de SIRT1 en cerebro de rata in vivo tanto de animales control como expuestos a OACM de forma concomitante a su efecto neuroprotector, e in vitro en células mononucleares de sangre circulante, y en neuronas corticales cultivadas de rata. Considerando las acciones beneficiosas de SIRT1 en el SNC, los resultados sugieren firmemente que esta enzima está implicada en los efectos neuroprotectores inducidos por CDP-colina. Además, los resultados presentes demuestran por primera vez un potente efecto sinérgico con un activador de SIRT1, resveratrol.
In the present invention it has been shown that CDP-choline increases the expression of SIRT1 in rat brain in vivo from both control animals and exposed to OACM concomitantly to its neuroprotective effect, and in vitro in circulating blood mononuclear cells, and in rat cultured cortical neurons. Considering the beneficial actions of SIRT1 in the CNS, the results strongly suggest that this enzyme is involved in the neuroprotective effects induced by CDP-choline. In addition, the results present demonstrate for the first time a potent synergistic effect with an activator of SIRT1, resveratrol.

Claims (8)

REIVINDICACIONES 1. Una composición farmacéutica que comprende una combinación de (i) una cantidad terapéuticamente efectiva de citicolina o una sal 1. A pharmaceutical composition comprising a combination of (i) a therapeutically effective amount of citicoline or a salt 5 farmacéuticamente aceptable de la misma y (ii) una cantidad terapéuticamente efectiva de un activador de SIRT1 junto uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables para su uso como medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad cerebrovascular. 5 pharmaceutically acceptable thereof and (ii) a therapeutically effective amount of a SIRT1 activator together with one or more pharmaceutically acceptable carriers for use as a medicament for the treatment and / or prevention of cerebrovascular disease. 1o 2. Composición según la reivindicación 1, donde dicho activador de SIRT1 se selecciona del grupo formado por resveratrol, 3,4,5-trimetoxi-N-(2-(3-(piperazin-1-ilmetil)imidazo[2, 1-b]tiazol-6-il)fenil)benzamida, N-(2-(3-(piperazin-1-ilmetil)imidazo[2, 1-b]tiazol-6-il)fenil)quinoxalin-2-carboxamida, (R)-N-(2-(3-( (3-hidroxipirrolindin-1-il)metil)imidazo[2, 1-b]tiazol-6-il)fenil)-2-1 2. Composition according to claim 1, wherein said SIRT1 activator is selected from the group consisting of resveratrol, 3,4,5-trimethoxy-N- (2- (3- (piperazin-1-ylmethyl) imidazo [2, 1 -b] thiazol-6-yl) phenyl) benzamide, N- (2- (3- (piperazin-1-ylmethyl) imidazo [2,1-b] thiazol-6-yl) phenyl) quinoxalin-2-carboxamide, (R) -N- (2- (3- ((3-hydroxypyrrolindin-1-yl) methyl) imidazo [2,1-b] thiazol-6-yl) phenyl) -2- 15 naftamida. 15 naphthamide 3. Composición según la reivindicación 1 ó 2, donde dicha enfermedad cerebrovascular es la isquemia cerebral. 3. Composition according to claim 1 or 2, wherein said cerebrovascular disease is cerebral ischemia. 20 4. Composición según la reivindicación 3, donde dicha isquemia cerebral es isquemia cerebral aguda o crónica. Composition according to claim 3, wherein said cerebral ischemia is acute or chronic cerebral ischemia. 5. Composición según la reivindicación 4, donde dicha isquemia cerebral 5. Composition according to claim 4, wherein said cerebral ischemia es ataque isquémico transitorio, traumatismo craneoencefálico o ictus 25 cerebral. it is transient ischemic attack, head trauma or cerebral stroke. 6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicha composición se administra de forma separada, simultánea o secuencial. 6. Composition according to any one of claims 1 to 5, wherein said composition is administered separately, simultaneously or sequentially. 30 7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicho medicamento es para la administración por vía oral. Composition according to any one of claims 1 to 6, wherein said medicament is for oral administration. 8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicho medicamento es para la administración por vía parenteral. 8. Composition according to any one of claims 1 to 6, wherein said medicament is for parenteral administration. 9. Composición según la reivindicación 1 a 8, donde la dosis de citicolina 9. Composition according to claim 1 to 8, wherein the dose of citicoline o sal farmacéuticamente aceptable es de entre 100 mg y 5000 mg al día. or pharmaceutically acceptable salt is between 100 mg and 5000 mg daily. 1O. Composición según la reivindicación 9, donde la dosis de citicolina o sal farmacéuticamente aceptable es de entre 500 mg y 2000 mg al día. 1O. Composition according to claim 9, wherein the dose of citicoline or pharmaceutically acceptable salt is between 500 mg and 2000 mg daily. 5 11. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 O, donde la dosis de dicho activador de SIRT-1 es de entre O, 1 mg a 500 mg al día. Composition according to any one of claims 1 to 1 O, wherein the dose of said SIRT-1 activator is between 0, 1 mg to 500 mg daily. 12. Uso de una composición farmacéutica que comprende una combinación de (i) una cantidad terapéuticamente efectiva de citicolina o una 12. Use of a pharmaceutical composition comprising a combination of (i) a therapeutically effective amount of citicoline or a 1o sal farmacéuticamente aceptable de la misma y (ii) una cantidad terapéuticamente efectiva de un activador de SIRT1 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad cerebrovascular. The pharmaceutically acceptable salt thereof and (ii) a therapeutically effective amount of a SIRT1 activator for the preparation of a medicament for the treatment and / or prevention of cerebrovascular disease. 15 13. Uso según la reivindicación 12, donde dicho activador de SIRT1 se selecciona del grupo formado por resveratrol, 3,4,5-trimetoxi-N-(2-(3-(piperazin-1-ilmetil)imidazo[2, 1-b )tiazol-6-il)fenil)benzamida, N-(2-(3-(piperazin-1-ilmetil)imidazo[2, 1-b]tiazol-6-il)fenil)quinoxalin-2-carboxamida, (R)-N-(2-(3-( (3-hidroxipirrolindin-1-il)metil)imid azo[2, 1-b ]tiazol-6-il)fen il)-2-13. Use according to claim 12, wherein said SIRT1 activator is selected from the group consisting of resveratrol, 3,4,5-trimethoxy-N- (2- (3- (piperazin-1-ylmethyl) imidazo [2, 1 -b) thiazol-6-yl) phenyl) benzamide, N- (2- (3- (piperazin-1-ylmethyl) imidazo [2,1-b] thiazol-6-yl) phenyl) quinoxalin-2-carboxamide, (R) -N- (2- (3- ((3-hydroxypyrrolindin-1-yl) methyl) imid azo [2,1-b] thiazol-6-yl) phenyl) -2- 20 naftamida. 20 naphthamide 14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, donde dicha enfermedad cerebrovascular es isquemia cerebral. 14. Use according to any of claims 12 or 13, wherein said cerebrovascular disease is cerebral ischemia.