ES2385451T3 - Rock2 y Rock3, dos nuevas variantes de ganancia de función de los receptores de citoquinina AHK2 y AHK3 - Google Patents

Abstract

Un ácido nucleico aislado, que comprende una secuencia de ácido nucleico codificando una varianteconstitutivamente activa del receptor de citoquinina AHK2 con:i) una secuencia de aminoácido con la SEQ ID No.1 o un ortólogo de la misma;ii) una secuencia de aminoácido que tiene al menos un 48%, preferiblemente al menos un 50%, máspreferiblemente al menos un 55% de identidad sobre la longitud de la secuencia completa de la SEQ ID No.1; oiii) una secuencia de aminoácido que tiene al menos un 50%, preferiblemente al menos un 53%, máspreferiblemente un 55% de identidad sobre un segmento de secuencia de aminoácido 50 de SEQ ID No. 1teniendo la SEQ ID No. 5;en donde la secuencia de aminoácido tiene la fenilalanina del aminoácido (F) en una posición correspondiente a laposición 552 de la SEQ ID No.1.

Description

Rock2 y Rock3, dos nuevas variantes de ganancia de funcion de los receptores de citoquinina AHK2 y AHK3

[0001] Para ser capaz de suministrar a una población que crece continuamente con comida y otros productos derivados de plantas, la gente siempre ha estado interesada en mejorar la productividad en la agricultura.

[0002] La productividad de una planta puede ser influenciada de varias maneras diferentes, por ejemplo, mejorando las características de crecimiento de la planta o retrasando la senescencia de la hoja. Hay varios mecanismos y rutas conocidas que están implicadas en el crecimiento y desarrollo de las plantas.

[0003] La citoquinina es una hormona vegetal que juega papeles regulatorios positivos y negativos en muchos aspectos del crecimiento y desarrollo vegetal. Estimula la formación y activación de meristemos de brotes, es capar de establecer tejidos sumideros, retarda la senescencia de la hoja, inhibe el crecimiento y ramificación de la raíz, y juega un papel en la germinación de las semillas y las respuestas al estrés. El análisis de plantas deficientes en citoquinina ha mostrado que la citoquinina juega papeles opuestos en los meristemos de brotes y de raíz, y sugiere que la hormona tiene una función esencial en el control cuantitativo del crecimiento orgánico (Mok, D. W. S. & Mok,

M. C. (2001) Ann. Rev. Plant Physiol. Mol. Bio. 52, 89-1 18). Para la planta modelo Arabidopsis thaliana se ha mostrado que la señal de citoquinina se pervive por tres miembros de la familia receptora de citoquinina, que son quinasas de histidina sensores (Inoue, T. y otros (2001) Nature 409, 1060-3; Suzuki, T y otros (2001) Plant Cell Physiol. 42, 107-13; Yamada, H. y otros (2001) Plant Cell Physiol. 42, 1017-23.). Estos tres receptores de citoquinina, AHK2, AHK3 y CRE1/AHK4, muestran un alto grado de identidad de secuencias, pero cada uno tiene características distintivas.

[0004] Recientemente se ha divulgado una variante de ganancia de la función del receptor de citoquinina AHK3 y se le ha llamado ore 12 (ver WO 2007/108931 A1). Se ha mostrado que la expresión ore12 en la Arabidopsis thaliana produce plantas con senescencia de las hojas retardada, mientras que la apariencia general de la planta completa no mostró diferencias significativas en comparación con las plantas del tipo salvaje. A pesar de que la expresión del ore12 puede llevar a plantas con senescencia de las hojas retardad y de este modo a plantas con productividad mejorada, la expresión ore12 no tuvo un efecto significativo en otras características del crecimiento vegetal. En consecuencia, permanece una necesidad para una mejora adicional de la productividad vegetal.

[0005] Es un objeto de la presente invención proporcionar medios y métodos adecuados para producir plantas transgénicas con características de productividad y/o crecimiento mejoradas.

[0006] Este objetivo se consigue por la presente invención como se establece en detalle a continuación.

[0007] La presente invención proporciona nuevas variantes de ganancia de función de los receptores de citoquinina, concretamente rock2. El polipéptido rock2 con la secuencia de aminoácido SEQ ID No. 1 es una variante activa constitutivamente del receptor de citoquinina AHK2 de la Arabidopsis thaliana y puede ser codificada por un ácido nucleico con la secuencia de la SEQ ID No. 3.

[0008] Se descubrió sorprendentemente que la expresión transgénica de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido con la SEQ ID No. 1 lleva a plantas transgénicas que muestran características de crecimiento mejoradas y senescencia retardada de las hojas. El efecto de la expresión transgénica de una secuencia de aminoácido con la SEQ ID No. 1 en una planta en senescencia de las hojas es más pronunciada que la ya observada para la variante de función de ganancia conocida del AHK3, ore12. Incluso más sorprendentemente, se descubrió por primera vez que la expresión transgénica de la variante de función de ganancia del AHK2 de una secuencia de aminoácido con la SEQ ID No.1 tiene un efecto significativo en el crecimiento de brotes, número de silicuas por tallo principal, grosor del tallo y/o tamaño de las flores de la planta transgénica resultante en comparación con el tipo salvaje, mientras que las plantas que expresan el ore12 carecen de tal efecto. En consecuencia, la expresión transgénica de una secuencia de aminoácido con la SEQ ID No. 1 lleva a plantas que muestran productividad mejorada.

[0009] En un primer aspecto de la presente invención, un ácido nucleico aislado está provisto como se define en las reivindicaciones. El ácido nucleico aislado de la presente invención comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante constitutivamente activa del receptor de citoquinina AHK2 con:

i) Una secuencia de aminoácido con la SEQ ID No.1 o un ortólogo de la misma; ii) una secuencia de aminoácido que tiene al menos un 48%, preferiblemente al menos un 50%, más preferiblemente al menos un 55% de identidad sobre la longitud de la secuencia completa de la SEQ ID No. 1; o iii) una secuencia de aminoácido que tiene al menos un 50%, preferiblemente al menos un 53%, más preferiblemente un 55% de identidad sobre un segmento de secuencia de aminoácido 50 de SEQ ID No. 1 teniendo la SEQ ID No. 5;

en donde la secuencia de aminoácido tiene la fenilalanina del aminoácido (F) en una posición correspondiente a la posición 552 de la SEQ ID No. 1. La SEQ ID No. 5 engloba los residuos de aminoácido 50 de la SEQ ID No. 1 localizada directamente hacia el término-N de la fenilalanina del aminoácido (F) en la posición 552 de la SEQ ID No.1.

[0010] Preferiblemente se proporciona un ácido nucleico aislado, comprendiendo una secuencia de ácido nucleico codificando al menos la secuencia de aminoácido con la SEQ ID No. 1 o un ortólogo de la misma. El término “ortólogo” como se usa en la presente se refiere a una secuencia de ácido nucleico o aminoácido de una especie, preferiblemente diferente de la Arabidopsis thaliana, que muestra similitud más alta, preferiblemente identidad de secuencia más alta, con la secuencia de ácido nucleico o aminoácido de la Arabidopsis thaliana debido a que ambos genes se originaron de un antecesor común. La presente invención también proporciona un polipéptido aislado codificado por un ácido nucleico aislado de la invención, preferiblemente un polipéptido aislado que comprende al menos la secuencia de aminoácido con la SEQ ID No.1.

[0011] En un segundo aspecto la invención proporciona un casete de expresión transgénica para la expresión de ácidos nucleicos, en donde el casete de expresión transgénica de la invención comprende un ácido nucleico aislado de acuerdo a la presente invención. El casete de expresión transgénica de la invención puede ser diseñado de tal forma que media la expresión transgénica de la secuencia de ácido nucleico codificando al menos la secuencia de aminoácido con la SEQ ID No. 1 en un tejido vegetal bajo el control de al menos un promotor en un organismo huésped, preferiblemente una célula vegetal.

[0012] En un tercer aspecto de la invención, se proporciona un vector que comprende un ácido nucleico aislado de acuerdo a la invención o un casete de expresión transgénica de la invención.

[0013] En un cuarto aspecto, la presente invención está dirigida a un organismo transgénico que comprende un ácido nucleico aislado de acuerdo a la invención, un casete de expresión transgénica de la invención o un vector de la presente invención.

[0014] La presente invención proporciona un polipéptido aislado comprendiendo:

i) Una secuencia de aminoácido con la SEQ ID No. 1 o un ortólogo de la misma;

ii) Una secuencia de aminoácido que tiene al menos un 48%, preferiblemente al menos un 50%, más

preferiblemente al menos un 55% de identidad sobre la longitud de la secuencia completa de la SEQ ID No.

1; o

iii) Una secuencia de aminoácido que tiene al menos un 50%, preferiblemente al menos un 53%, más

preferiblemente un 55% de identidad sobre el segmento de la secuencia de aminoácido 50 de la SEQ ID No.

1 que tiene la SEQ ID No. 5;

en donde la secuencia de aminoácido tiene la fenilalanina del aminoácido (F) en una posición correspondiente a la posición 552 de la SEQ ID No. 1.

[0015] En una realización preferida, el polipéptido aislado de la invención comprende y/o consiste de la secuencia de aminoácido con la SEQ ID No. 1.

[0016] La presente invención también se refiere a un ácido nucleico aislado, que comprende una secuencia de aminoácido codificando al menos la secuencia de aminoácido con la SEQ ID No.1.

[0017] Un ácido nucleico “aislado” es aquel que está sustancialmente separado de otras moléculas de ácido nucleico, que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico (por ejemplo, secuencias que codifican otros polipéptidos). Preferiblemente, un ácido nucleico “aislado” está libre de algunas de las secuencias, que flanquean de forma natural el ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5’ y 3’ del ácido nucleico) en su replicón de origen natural. Por ejemplo, un ácido nucleico clonado está considerado aislado. En varias realizaciones, el ácido nucleico aislado de la invención puede contener menos que alrededor de 5 kb, 4 kb, 3kb, 2kb, 1 kb, 0,5kb, ó 0,1kb de las secuencias de nucleótido que flanquean de forma natural la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que se deriva el ácido nucleico. Un ácido nucleico es también considerado aislado si ha sido alterado por la intervención humana, o colocado en un locus o localización que no es su sitio natural, o si es introducido en una célula por ejemplo por agroinfección. Por otra parte, un ácido nucleico “aislado”, como una molécula de ADNc, puede estar libre de alguno del otro material celular que está asociado de forma natural, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetiza químicamente. Están excluidos específicamente de la definición de “ácido nucleico aislado”: los cromosomas de origen natural (como las propagaciones de cromosoma), las librerías genómicas, y las preparaciones de ADN genómico celular completo o ARN celular completo de fuentes de origen natural (incluyendo las preparaciones celulares completas que son cortadas mecánicamente o digeridas enzimáticamente). Los ácidos nucleicos y/o los polipéptidos de la presente invención pueden ser proporcionados en forma aislada, es decir, purificados de su ambiente natural, preferiblemente en una forma sustancialmente pura u homogénea o libre o sustancialmente libre de ácidos nucleicos o genes de la especie de origen que no sea la secuencia deseada.

[0018] El ácido nucleico de acuerdo a la presente invención puede incluir ADN, ARN, mezclas y/o sustituyent6es funcionales de los mismos, particularmente ADNC, ADN y ARN genómico y puede ser completamente o parcialmente sintético. Los ácidos nucleicos de la invención comprenden secuencias de poli-nucleótidos de monocatenarias o totalmente o parcialmente bicatenarias. El término “aislado” engloba todas estas posibilidades. Para el propósito de la presente invención, donde se especifica una cadena de ADN, por ejemplo, con referencia a una SEQ ID No. Particular, a menos que el contexto requiera lo contrario, se engloba el equivalente de ARN, con U sustituido por T donde tiene lugar. El ácido nucleico de la invención puede ser producido por cualquier medio, incluyendo preparaciones genómicas, preparaciones de ADNc, síntesis in vitro, PCR, RT-PCR, y/o transcripción in vitro o in vivo.

[0019] El ácido nucleico aislado de la invención puede comprender al menos una secuencia de ácido nucleico seleccionada de:

i) una de la SEQ ID No. 3 o un complemento contrario a la misma;

ii) una secuencia funcionalmente equivalente o un complemento contrario de la misma con al menos un 70% de homología, preferiblemente al menos un 75% de homología, más preferiblemente al menos un 80% de homología con la secuencia con la SEQ ID No. 3 sobre un segmento de secuencia de codificación de al menos 300 pares de base, preferiblemente sobre un segmento de secuencia de codificación de al menos 500 pares de base, más preferiblemente sobre la longitud de secuencia de codificación completa, y que codifica al menos un polipéptido aislado de la invención, preferiblemente una secuencia de aminoácido con la SEQ ID No. 1; o

iii) secuencias funcionalmente equivalentes o un complemento contrario de las mismas que hibridizan bajo condiciones estándar con la secuencia de ácido nucleico con SEQ ID No. 3 o con secuencias de ácido nucleico complementarias a las mismas, y que codifican al menos un polipéptido aislado de la invención, preferiblemente una secuencia de aminoácido con la SEQ ID No. 1.

[0020] La secuencia de ácido nucleico con la SEQ ID No. 3 codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácido de SEQ ID No. 1, mientras que la secuencia de ácido nucleico con la SEQ ID No. 4 codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácido de SEQ ID No. 2.

[0021] Para el propósito de la presente invención el término “secuencia equivalente funcional” se refiere a cualquier secuencia no idéntica con una de la SEQ ID No. 3 o un complemento contrario de la misma, y que codifica al menos la secuencia de aminoácido con la SEQ ID No. 1. La persona experta es consciente de la degeneración del código genético, permitiendo para un número de secuencias de ácido nucleico diferentes codificar la misma secuencia de aminoácido y no tiene dificultades en determinar si una secuencia de ácido nucleico dada codifica menos la secuencia de aminoácido con la SEQ ID No. 1.

[0022] Los métodos para preparar secuencias equivalentes funcionales o fragmentos de la invención comprenden preferiblemente la introducción de mutaciones en la secuencia de3scrita por la SEQ ID No. 3 o un complemento contrario de la misma. La mutagénesis puede ser aleatoria, en cuyo caso las secuencias mutagenizadas son posteriormente cribadas de sus propiedades por un proceso de prueba y error. Los métodos para la mutagénesis de secuencias de ácidos nucleicos son conocidos por el trabajador experto e incluyen a modo de ejemplo el uso de oligonucleótidos con una o más mutaciones en comparación con la región a ser mutada (por ejemplo, en una mutagénesis de sitio específico). Se emplean típicamente cebadores con aproximadamente de 15 a aproximadamente 75 nucleótidos o más, con preferiblemente de alrededor de 10 a alrededor de 25 o más residuos de nucleótido estando localizados en ambos lados de la secuencia a ser modificada. Los detalles y el proceso para dichos métodos de mutagénesis son familiares para el trabajador experto (Kunkel y otros (1987) Methods Enzymol 154:367-382; Tomic y otros (1990) Nucl Acids Res 12:1656: Upender y otros (1995 Biotechniques 18(1):29-30; Patente U.S. Nº 4.237.224). También se puede conseguir una mutagénesis tratando por ejemplo vectores de expresión transgénicos que comprenden una de las secuencias de ácido nucleico de la invención con agentes mutagenizantes como la hidroxilamina.

[0023] El uso de secuencias equivalentes funcionales puede ser particularmente beneficioso para cumplir con un uso del codón particular de un organismo seleccionado que puede ser usado para transcribir el ácido nucleico de la invención y para expresar el polipéptido codificado que comprende o consiste de al menos la secuencia de aminoácido con la SEQ ID No. 1.

[0024] El ácido nucleico de la invención puede comprender al menos una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las secuencias funcionalmente equivalentes o un complemento contrario de las mismas que tienen al menos un 80% de homología, preferiblemente al menos un 90% de homología, más preferiblemente al menos un 95% de homología con la secuencia de SEQ ID No. 3 sobre un segmento e secuencia codificante de al menos 300 pares de base, preferiblemente sobre un segmento de secuencia de codificación de al menos 500 pares de base, más preferiblemente sobre la longitud de secuencia de codificación completa, y que codifica al menos una secuencia de aminoácido con la SEQ ID No. 1.

[0025] La homología o identidad entre dos secuencias de ácido nucleico se entiende que significa la identidad de las secuencias respectivas sobre una longitud de secuencia dada en cada caso, que es calculada por comparación con la ayuda del algoritmo del programa GAP (Wisconsin Package Version 10.0, Universidad de Wisconsin, Genetic Computer Group (GCG), Madison, USA), estableciendo los siguientes parámetros:

Peso del Hueco: 12 Peso de la Longitud: 4 Coincidencia Media: 2,912 Falta de Coincidencia Media: -2,0003

[0026] Por ejemplo, una secuencia con al menos un 70% de homología o identidad con la secuencia de SEQ ID No: 3 en la base del ácido nucleico se entiende que significa una secuencia que, en comparación con la secuencia SEQ ID No. 3 por el algoritmo del programa anterior con los parámetros anteriormente establecidos, tiene al menos un 70% de homología. La identidad u homología entre dos secuencias de aminoácidos se entiende que significa la identidad de las secuencias respectivas sobre una longitud de secuencia dada en cada caso, que es calculada por comparación con la ayuda del algoritmo ClusatW_Bioedit (Thompson JD y otros (1994) Nucleic Acids Res 22:46734680) usando los ajustes por defecto en el paquete de software Bioedit (disponible en: http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.htmlt).

[0027] Por ejemplo, una secuencia con al menos un 48% de homología o identidad con la secuencia de SEQ ID No. 1 en base al aminoácido se entiende que significa una secuencia que, en comparación con la secuencia SEQ ID No. 1 por el algoritmo del programa anterior con el juego de parámetros anteriores, tiene al menos un 48% de identidad.

[0028] El ácido nucleico aislado de la invención puede comprender al menos una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las secuencias funcionalmente equivalentes o un complemento contrario de las mismas que hibridizan bajo condiciones estándar con la secuencia de ácido nucleico con la SEQ ID No. 3 o con secuencias de ácido nucleico complementarias a las mismas, y que codifican al menos un polipéptido aislado de la invención, preferiblemente una secuencia de aminoácido con la SEQ ID No. 1.

[0029] El término “condiciones de hibridación estándar” se debe entender en términos generales y significa condiciones de hibridación rigurosas y/o menos rigurosas. Dichas condiciones de hibridación se describen entre otros en Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T y otros, en Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, páginas 9.31-9.57 o en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.

[0030] Por ejemplo, las condiciones durante el (los) paso(s) de lavado pueden ser seleccionadas de un intervalo de condiciones limitado por aquellas de rigor bajo (con aproximadamente 2*SSC a 50º C) y de rigor alto (con aproximadamente 0,2*SSC a 50º C, preferiblemente a 65º C) (20*SSC: citrato de sodio, 3 M NaCl, pH 7,0). Además, la temperatura durante el paso de lavado puede ser elevada de condiciones de rigor bajo a temperatura ambiente, aproximadamente 22º C, a condiciones de más rigor a aproximadamente 65º C. Ambos parámetros, la concentración de sal y la temperatura, pueden ser variados simultáneamente, y también es posible que uno de los dos parámetros es mantenido constante y sólo se varíe el otro. Es también posible emplear agentes desnaturalizantes como, por ejemplo, formamida o SDS durante la hibridación.

[0031] La hibridación en presencia de un 50% de formamida es preferiblemente llevada a cabo a 42º C. Se dan a continuación algunas condiciones ejemplares para los pasos de hibridación y lavado:

(1) Condiciones de hibridación con por ejemplo

[0032]

a) 4*SSC a 65º C, o

b) 6*SSC, 0,5% de SDS, 100 !g/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado a 65º C, o

c) 4*SSC, 50% de formamida, a 42º C, o

d) 2* ó 4*SSC a 50º C (condición de rigor bajo), o

e) 2* ó 4*SSC, 30 a 40% de formamida a 42º C, (condición de rigor bajo), o

f) 6*SSC a 45º C, o,

g) 0,05 M de regulador de fosfato de sodio pH 7,0, 2 mM EDTA, 1% BSA y 7% SDS:

(2) Pasos de lavado con por ejemplo

[0033]

a) 0,1*SSC a 65º C, o b) 0,1*SSC, 0,5% SDS a 68º C, o

c) 0,1*SSC, 0,5% SDS, 50% de formamida a 42º C, o

d) 0,2*SSC, 0,1% SDS a 42º C, o

e) 2*SSC a 65º C (condición de rigor bajo), o

f) 40 mM de regulador de fosfato de sodio pH 7,0, 1% SDS, 2mM EDTA.

[0034] El ácido nucleico aislado de la invención puede comprender al menos una secuencia promotora que puede estar localizada hacia arriba en la posición 5’ a la secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido aislado de la invención, preferiblemente una secuencia de aminoácido con la SEQ ID No. 1.

[0035] Una secuencia promotora es una secuencia de ácido nucleico que es capaz de facilitar o mejorar la transcripción de un gen particular. La referencia en la presente a un “promotor” debe ser tomada en su sentido y contexto más amplio e incluye las secuencias reguladoras transcripcionales derivadas de un gen genómico eucariota clásico, incluyendo la caja TATA que es requerida para la iniciación de la transcripción precisa, con o sin una secuencia de caja CCAAT y elementos reguladores o de control adicionales (por ejemplo, secuencias de activación hacia arriba, represores, potenciadores y silenciadores) que alteran la expresión del gen en respuesta al desarrollo y/o estimulo externo, o de una manera específica del tejido.

[0036] El término “promotor” puede también incluir las secuencias reguladoras transcripcionales de un gen procariota clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja -35 y/o secuencias reguladoras transcripcionales de caja -10.

[0037] El término “promotor” también se usa para describir una molécula sintética o de fusión, o un derivado que confiere, activa o potencia la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano. Los promotores pueden contener copias adicionales de uno o más elementos reguladores específicos, para potenciar adicionalmente la expresión y/o alterar la expresión espacial y/o la expresión temporal de una molécula de ácido nucleico a la que está enlazada funcionalmente. Dichos elementos reguladores pueden ser colocados adyacentes a una secuencia promotora heteróloga para manejar la expresión de una molécula de ácido nucleico en respuesta a por ejemplo, cobre, glucocorticoides, dexametasona, tetraciclina, giberelina, CAMP, ácido abscísico, auxina, heridas, etileno, ácido jasmonato o salicílico o para conferir expresión de una molécula de ácido nucleico a células, tejido u órganos específicos como meristemos, hojas, raíces, embriones, flores, semillas o frutos.

[0038] En el contexto de la presente invención, el promotor es preferiblemente una secuencia promotora expresable en plantas. Los promotores que también funcionan o únicamente funcionan en células no vegetales como las bacterias, células de levadura, células de insectos y células animales no son excluidos de la invención. Por “expresable en plantas” se entiende que la secuencia promotora, incluyendo cualquier elemento regulador añadido a la misma o contenido en la misma, es al menos capaz de inducir, conferir, activar o potenciar la expresión en una célula, tejido u órgano vegetal, preferiblemente una célula, tejido u órgano vegetal monocotiledónea o dicotiledónea. Los términos “operativo en plantas” y “operativo en una planta” cuando se usan en la presente, respecto de una secuencia promotora, deben ser tomados como equivalentes a una secuencia promotora expresable en plantas.

[0039] También son conocidos para el experto en la técnica los promotores regulables como parte de un sistema de expresión vegetal viral binario (Yadav 1999 – WO 99/22003; Yadav 2000 – WO 00/17365). En el presente contexto, una “secuencia promotora regulable” es un promotor que es capaz de conferir expresión de un gen un una célula, tejido u órgano particular o grupo de células, tejidos u órganos de una planta, opcionalmente bajo condiciones específicas, sin embargo no confiere generalmente expresión a través de la planta bajo todas las condiciones. Por consiguiente, una secuencia promotora regulable puede ser una secuencia promotora que confiere expresión de un gen al que está enlazada funcionalmente en una localización particular dentro de la planta o alternativamente, a través de la planta bajo un conjunto específico de condiciones, como después de la inducción de la expresión del gen por un compuesto químico u otro elicitor. Preferiblemente, el promotor regulable usado en el funcionamiento de la presente invención confiere expresión en una localización específica dentro de la planta, ya sea constitutivamente

o después de la inducción, sin embargo, no en la planta completa bajo cualquier circunstancia. Incluidos dentro del ámbito de dichos promotores están las secuencias promotoras específicas de células, las secuencias promotoras específicas de tejidos, las secuencias promotoras específicas de órganos, las secuencias promotoras específicas de ciclos celulares, las secuencias promotoras inducibles y las secuencias promotoras constitutivas que han sido modificadas para conferir expresión en una parte particular de la planta en cualquier momento, como por la integración del mencionado promotor constitutivo dentro de un elemente genético transponible ((Ac, Ds, Spm, En, u otro transposón). De manera similar, el término “específico de tejidos” debe ser entendido como que indica que la expresión está predominantemente en un tejido particular o tipo de tejido, preferiblemente de origen vegetal, aunque no necesariamente exclusivamente en el mencionado tejido o tipo de tejido. De manera similar, el término “específico de órganos” debe entenderse como que indica que la expresión está predominantemente en un órgano particular, preferiblemente de origen vegetal, aunque no necesariamente exclusivamente en dicho órgano. De manera similar, el término “específico del ciclo celular” debe entenderse que indica que la expresión es predominantemente cíclica y que tiene lugar en una o más, no necesariamente consecutivas, fases del ciclo celular aunque no necesariamente exclusivamente en las células en reproducción, preferiblemente de origen vegetal. Aquellos expertos en la técnica serán conscientes que un “promotor” inducible” es un promotor en el que la actividad transcripcional del mismo está aumentada o inducida en respuesta a estímulos de de desarrollo, químicos, ambientales, o físicos. De manera similar, el experto en la técnica entenderá que un “promotor constitutivo” es un promotor que está transcripcionalmente active a través de la mayoría, pero no necesariamente todas, las partes de un organismo, preferiblemente una planta, durante la mayoría, pero no necesariamente todas, las fases de su crecimiento y desarrollo. Aquellos expertos en la técnica serán fácilmente capaces de seleccionar secuencias promotoras apropiadas para el uso en la regulación de la expresión apropiada de las variantes de proteínas receptoras de citoquinina de fuentes públicamente disponibles, sin experimentación indebida.

[0040] Colocar una molécula de ácido nucleico bajo el control regulador de una secuencia promotora, o en una conexión o enlace funcional con una secuencia promotora, significa posicionar dicha molécula de ácido nucleico de tal forma que la expresión está al menos controlada en parte por la secuencia promotora. Un promotor está habitualmente, pero no necesariamente, posicionado hacia arriba, o en el extremo 5’, y dentro de 2 kb del sitio de comienzo de la transcripción, de la molécula de ácido nucleico que regula, aunque los potenciadores y los silenciadores, que también están comprendidos por el término “promotor” pueden estar colocados más lejos del sitio de comienzo transcripcional. Se piensa que estos elementos se unen a proteínas capaces de acción de largo alcance debido a la formación de bucles de la secuencia interviniente. En la construcción de las combinaciones de promotor/gen estructural heterólogas se prefiere generalmente posicionar el promotor a una distancia del sitio de comienzo de la transcripción del gen que es aproximadamente la misma que la distancia entre eses promotor y el gen que controla en su ajuste natural (es decir, el gen del que se deriva el promotor). Como es conocido en la técnica, se puede acomodar alguna variación en esta distancia sin pérdida de la función promotora. DE manera similar, el posicionamiento preferido de un elemento de la secuencia reguladora con respecto al gen heterólogo a ser colocado bajo su control se define por el posicionamiento del elemento en su ajuste natural (es decir, el gen del que se deriva). De nuevo, como se conoce en la técnica, puede tener lugar alguna variación en esta distancia.

[0041] De acuerdo a la presente invención cualquier secuencia promotora puede ser usada para producir un ácido nucleico aislado de la invención. Preferiblemente, la secuencia promotora está colocada hacia arriba de la secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido aislado de la invención, preferiblemente una secuencia de aminoácido con la SEQ ID Nos. 1. Preferiblemente se usan las secuencias promotoras que están activas en al menos un tejido o tipo celular de una planta y/o que están activas en un microorganismo. Para servir a este propósito, la al menos una secuencia promotora y la secuencia de ácido nucleico codificando el al menos un polipéptido aislado de la invención, preferiblemente una secuencia de aminoácido con la SEQ ID No. 1; están enlazadas funcionalmente entre sí.

[0042] La presente invención se refiere a un ácido nucleico aislado de la invención, comprendiendo además al menos una secuencia promotora, en donde la al menos una secuencia promotora y la secuencia de ácido nucleico codificando el al menos un polipéptido aislado de la invención, preferiblemente una secuencia de aminoácido con la SEQ ID Nos. 1, están unidas funcionalmente entre sí.

[0043] La presente invención también se refiere a un ácido nucleico aislado de la invención, comprendiendo además al menos una secuencia promotora, en donde la secuencia de ácido nucleico codificando el al menos un polipéptido aislado de la invención, preferiblemente una secuencia de aminoácido con la SEQ ID No. 1, está localizada en la posición 3’ de el al menos un promotor y en donde la al menos una secuencia promotora y la secuencia de ácido nucleico están enlazadas funcionalmente entre sí.

[0044] Como se usa en la presente “enlace funcional” significa, por ejemplo, la disposición secuencial del al menos un promotor, de la secuencia de ácido nucleico codificando el al menos un polipéptido aislado de la invención, preferiblemente una secuencia de aminoácido con la SEQ ID No. 1, y, si es apropiado, de los elementos reguladores adicionales como por ejemplo, un terminador, de tal forma que cada uno de los elementos reguladores es capaz de cumplir su función esperada en la expresión transgénica de la secuencia de ácido nucleico codificando el al menos un polipéptido aislado de la invención, preferiblemente una secuencia de aminoácido con la SEQ ID No. 1. Esto no requiere necesariamente un enlace directo en un sentido químico. Las secuencias de control genético como, por ejemplo, las secuencias potenciadoras, pueden también ejercer su función en la secuencia objetivo desde posiciones que están más alejadas, o de hecho desde otras moléculas de ADN. Preferiblemente en el ácido nucleico aislado de la invención, la secuencia de ácido nucleico codificando el al menos un polipéptido aislado de la invención, preferiblemente una secuencia de aminoácido con la SEQ ID No. 1 está posicionado hacia debajo de la secuencia que actúa como la al menos una secuencia promotora de tal forma que ambas secuencias están acopladas covalentemente entre sí. Preferiblemente, la distancia entre la al menos una secuencia promotora y la secuencia de ácido nucleico codificando el al menos un polipéptido aislado de la invención, preferiblemente una secuencia de aminoácido con la SEQ ID No. 1 es menos que 200 pares de base, especialmente preferiblemente menos que 100 pares de base, más específicamente preferiblemente menos que 50 pares de base. El al menos un promotor y el ácido nucleico codificando al menos un polipéptido aislado de la invención, preferiblemente una secuencia de aminoácido con la SEQ ID No. 1 pueden ser seleccionados y enlazados funcionalmente de tal manera que se permita la expresión transgénica de un polipéptido aislado de la invención, preferiblemente de al menos la secuencia de aminoácido con la SEQ ID No. 1 en un organismo transgénico.

[0045] “Expresión” significa en este contexto la transcripción de la secuencia de ácido nucleico a ser expresada transgénicamente, pero también incluye la traslación del ARN transcrito de la secuencia de ácido nucleico a ser expresada transgénicamente en un polipéptido correspondiente.

[0046] “Transgénico” significa – por ejemplo en referencia a un casete de expresión transgénica , un vector de expresión transgénico, un organismo transgénico o un método para la expresión transgénica de los ácidos nucleicos

– todos ellos constructos que son el resultado de métodos transgénicos, o todos métodos que los utilizan, en los que un ácido nucleico aislado de la invención no está localizado en sus ambientes genéticos naturales o ha sido modificado por métodos transgénicos, donde la modificación puede ser por ejemplo una sustitución, adición, deleción, inversión o inserción de uno o más residuos de nucleótido. Preferiblemente, la al menos una secuencia promotora del ácido nucleico aislado de acuerdo a la invención es heteróloga respecto a la secuencia de ácido nucleico adicional que está enlazada funcionalmente con ella y que se va a expresar transgénicamente. En este contexto, “heteróloga” significa que la secuencia de ácido nucleico adicional no comprende la secuencia codificante que está de forma natural bajo el control de dicho promotor.

[0047] “Ambiente genético natural” significa el locus cromosómico natural en el organismo de origen o la presencia en una librería genómica. En el caso de una librería genómica, el ambiente genético natural de la secuencia de ácido nucleico se mantiene preferiblemente al menos en parte. El ambiente flanquea la secuencia de ácido nucleico al menos en un lado y tiene una longitud de secuencia de al menos 50 bp, preferiblemente al menos 500 bp, especialmente preferentemente al menos 1000 bp, muy especialmente preferiblemente al menos 5000 bp. Un constructo de expresión que tiene lugar de forma natural se vuelve un constructo de expresión transgénica cuando esta combinación se modifica por métodos no naturales, sintéticos (“artificiales”) como, por ejemplo, una mutagénesis in vitro. Dichos métodos han sido descritos (Patente U.S. Nº 5.565.350; WO 00/15815; ver también la presente anteriormente).

[0048] “Transgénico” con respecto a una expresión (“expresión transgénica”) significa preferiblemente todas esas expresiones que han sido llevadas a cabo usando un casete de expresión transgénica, vector de expresión transgénico u organismo transgénico, como se define en la presente anteriormente o más adelante.

[0049] Un enlace funcional entre el al menos un promotor y la secuencia de ácido nucleico a ser expresada se puede producir por medio de recombinación convencional y técnicas de clonación como se describen, por ejemplo, en Maniatis T y otros (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. y en Silhavy T J y otros (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. y en Ausubel F M y otros (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience. Un método que es adecuado para este propósito es, por ejemplo, la tecnología de clonación GATEWAY(TM) (Invitrogen Inc.), que se basa en la recombinación.

[0050] El ácido nucleico aislado de acuerdo a la invención puede comprender secuencias o elementos de control genético adicionales, además de la al menos una secuencia promotora de acuerdo a la invención.

[0051] El concepto de las secuencias o elementos de control genético debe ser entendido ampliamente y significa todas esas secuencias que tienen un efecto en el origen o la función del ácido nucleico aislado o el casete de expresión transgénica de acuerdo a la invención. Las secuencias de control genético modifican, por ejemplo, la transcripción y/o la traslación en organismos procariotas o eucariotas. Preferiblemente, el ácido nucleico aislado o los casetes de expresión transgénica de acuerdo a la invención comprenden al menos una secuencia promotora 5’ hacia arriba de la secuencia de ácido nucleico particular a ser expresada transgénicamente y una secuencia terminadora 3’ hacia abajo como secuencia de control genético, y, si es apropiado, elementos reguladores convencionales adicionales, en cada casa enlazados funcionalmente con la secuencia de ácido nucleico a ser expresada transgénicamente.

[0052] Las secuencias de control genético pueden también comprender promotores adicionales, elementos promotores o promotores mínimos que son capaces de modificar las propiedades de control de la expresión. Es por lo tanto posible, por medio de las secuencias de control genético, que por ejemplo la expresión específica del tejido tenga lugar además en dependencia de factores de estrés determinados.

[0053] Las secuencias de control genético además también comprenden la región no traducida 5’, intrones, la región 3’ no codificante u otras secuencias de genes. Se ha mostrado que las secuencias no trasladadas 5’ son capaces de potenciar la expresión transitoria de los genes heterólogos. Además, pueden promover la especificidad del tejido (Rouster J y otros (1998) Plant J 15:435-44a). A la inversa, la región no traducida 5’ del gen opaco 2 suprime la expresión. La deleción de la región en cuestión resulta en un aumento en la actividad de los genes (Lohmer S y otros (1993) Plant Cell 5:65-73).

[0054] El ácido nucleico aislado puede ventajosamente comprender una o más de las que se conocen como secuencias potenciadoras en enlace funcional con el promotor, lo que hace la expresión transgénica aumentada de la secuencia de acido nucleico posible. También se pueden insertar secuencias ventajosas adicionales en el extremo 3’ de las secuencias de ácido nucleico a ser expresadas transgénicamente, como elementos reguladores o

terminadores adicionales. Las secuencias de ácido nucleico a ser expresadas transgénicamente pueden estar presentes como una o más copias en uno de los casetes de expresión genética de acuerdo a la invención.

[0055] Las secuencias de control se entenderán además que significan aquellas que hacen posible la recombinación o la inserción homóloga en el genoma de un organismo huésped, o que permiten la deleción del genoma. En el caso de la recombinación homóloga, uno de los promotores de acuerdo a la invención puede ser sustituido por el promotor natural de un gen particular, por ejemplo. Dichas secuencias se entenderán como secuencias de control genético. Los métodos como la tecnología cre/lox permiten la deleción específica del tejido, y en algunas circunstancias, inducible del casete de expresión transgénica del genoma del organismo huésped (Sauber B (1998) Methods (Duluth) 14(4):381-92). Aquí, ciertas secuencias flanqueadoras son añadidas al gen objetivo (secuencias lox), que más tarde hacen posible la deleción por medio de la recombinas acre.

[0056] Para seleccionar células que han sido objeto exitosamente de recombinación homóloga, u otra transformación, es, como regla, necesario adicionalmente introducir un marcador seleccionable (ver la presente más adelante). La recombinación homóloga es un hecho relativamente raro en eucariotas más altos, en particular en plantas. Predominan las integraciones aleatorias en el genoma huésped. Una posibilidad de borrar las secuencias integradas aleatoriamente, y por lo tanto aumentar la concentración de clones celulares con una recombinación homóloga correcta, es el uso de un sistema de recombinación específico de la secuencia como se describe en la Patente U.S. Nº 6.110.736.

[0057] Las señales de poliadenilación que son adecuadas como secuencias de control comprenden señales de poliadenilación vegetales y preferiblemente aquellas que corresponden esencialmente a las señales de poliadenilación del ADN-T de la Agrobacterium tumefaciens. En una realización particularmente preferida, el ácido nucleico aislado o el casete de expresión transgénica comprende una secuencia terminadora que es funcional en plantas. Las secuencias terminadoras que son funcionales en plantas generalmente significan aquellas secuencias que son capaces de producir, en plantas, la terminación de la trascripción de la secuencia de ADN. Ejemplos de secuencias terminadoras adecuadas son el terminador OCS (octopina sintasa) y el terminador NOS (nopalin sintasa). Sin embargo, se prefieren especialmente las secuencias terminadoras vegetales. Las secuencias terminadoras vegetales generalmente se refieren a aquellas secuencias que son parte de un gen vegetal natural. Especialmente preferido en este contexto es el terminador del gen inhibidor D de la catepsina de la patata o el terminador del gen de la proteína de almacenamiento de la alubia de campo VfLE1B3. Estos terminadores son, al menos, equivalentes a los terminadores virales o ADN-T descritos en el estado de la técnica.

[0058] El ácido nucleico aislado o los casetes de expresión transgénica de acuerdo a la invención y los vectores que los comprenden pueden comprender elementos funcionales adicionales. El término elemento funcional debe ser entendido ampliamente y significa todos aquellos elementos que tienen un efecto en la generación, multiplicación o función de los casetes de expresión transgénica de acuerdo a la invención o en los vectores de expresión transgénica o en los organismos derivados de ellos. Lo siguiente puede ser mencionado a modo de ejemplo, pero no por limitación.

1. Marcadores de Selección

[0059] El término “marcador de selección” comprende no sólo marcadores de selección positivos, que confieren una resistencia a un antibiótico, herbicida u otro biocida, sino también marcadores de selección negativos, que confieren una sensibilidad precisamente a los anteriores, y también marcadores que confieren una ventaja de crecimiento a un organismo transformado (por ejemplo por expresión de genes clave de biosíntesis de citoquinina; Ebinuma H y otros (2000) Proc NAtl Acad Sci USA 94:2117-2121). En el caso de la selección positiva, sólo aquellos organismos que expresan el marcador de selección en cuestión prosperan, mientras que precisamente estos organismos mueren en el caso de la selección negativa. El uso de un marcador de selección positivo se prefiere en la generación de plantas transgénicas. Más preferido es el uso de marcadores de selección que confieren ventajas de crecimiento. Los marcadores de selección negativos pueden ser usados ventajosamente cuando la tarea en cuestión consiste en eliminar ciertos genes o segmentos de genoma de un organismo (por ejemplo para el propósito de un proceso de hibridación).

i) Marcadores de Selección Positivos: El marcador seleccionable introducido no el casete de expresión transgénica confiere resistencia a un biocida, por ejemplo un herbicida (como la fosfinotricina, el glifosato o el bromoxinil, un inhibidor metabólico (como la 2-desoxiglucosa-6-fosfato; WO 98/45456) o un antibiótico (como por ejemplo, tetraciclinas, ampicilina, kanamicina, G 418, neomicina, bleomicina o higromicina) a las células transformadas exitosamente. El marcador de selección permite la selección de las células transformadas de células no transformadas (McCormick y otros (1986) Plant Cell Reports 5:81-84). Esencialmente los marcadores de selección preferidos son aquellos que confieren resistencia a herbicidas. ii) Marcadores de Selección Negativos: Los Marcadores de de selección negativos hacen posible por ejemplo la selección de organismos con secuencias borradas exitosamente que comprenden el gen marcador (Koprek T y otros (1999) The Plant Journal 19 (6):719-726). Cuando se lleva a cabo una selección negativa, por ejemplo un compuesto que de otra manera no tiene un efecto desventajoso en la planta es convertido en un compuesto que es desventajoso, por ejemplo debido al marcador de selección negativo introducido en la planta. Los genes que tienen un efecto desventajoso de por sí son aún más adecuados.

2) Genes Reporteros

[0060] Los genes reporteros codifican fácilmente proteínas cuantificables que, que por su color o actividad de los enzimas, permiten una valoración de la eficiencia de transformación, el sitio o tiempo de la expresión (ver también Schenbron E, Groskreutz D. Mol. Biotechnol. 1999; 13(1):29-44). Ejemplos que pueden ser mencionados son: “proteína de flurescencia verde” (GFP) (Chui W L y otros (1996), Curr Biol 6:325-330; Leffel S M y otros (1997) Biotechniques 23(5):9128; Sheen y otros /1995) Plant J 8(5):777-785; Haseloff y otros (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(6):2122-2127; Reichel y otros (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(12):5888-5893; Tian y otros (1997) Plant Cell Rep 16:267-271; WO 97/41228). La cloranfenicol transferasa (Fromm y otros (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82:5824-5828), la Luciferasa (Millar y otros (1992) Plant Mol Biol Rep 10:324-414; Ow y otros (1986) Science 234:856-859); permiten la detección por bioluminiscencia. La �-Galactosidasa, codifica un enzima para el que están disponibles una variedad de sustratos cromogénicos. La �-Glucoronidasa (GUS) (Jefferson y otros (1987) EMBO J. 6:3901-3907) o el gen uidA, que codifica un enzima para una variedad de sustratos cromogénicos. El producto del gen del Locus-R: proteína que regula la producción de pigmentos de antocianina (coloración roja) en el tejido vegetal y por lo tanto hace posible el análisis directo de la actividad promotora sin la adición de sustancias auxiliares adicionales o sustratos cromogénicos (Dellaporta y otros (1988) En: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18º Stadler Genetics Symposium, 11:263-282). Tirosinasa (Katz y otros (1983) J Gen Microbiol 129:2703-2714), un enzima que oxida la tirosina a DOPA y dopaquinona, que posteriormente forman la melanina, que puede ser detectada fácilmente. La aequorina (Prasher y otros (1985) Biochem Biophys Res Commun 126(3):1259-1268), puede ser usada en la detección por bioluminiscencia sensible al calcio.

3) Orígenes de Replicación

[0061] Los orígenes de replicación aseguran la multiplicación de los casetes de expresión transgénica o los vectores de expresión transgénica de acuerdo a la invención en, por ejemplo, el E. coli o las agrobacterias. Ejemplos que pueden ser mencionados son el OR1 (origen de la replicación de ADN), el pBR322 ori o el P15A ori (Sambrook y otros: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). Ejemplos de orígenes de replicación que son funcionales en agrobacterias son pRK2, pRi, PVS1 o pSA.

4) Secuencias limítrofes

[0062] Las “secuencias limítrofes” (como, por ejemplo, el límite derecho o izquierdo del ADN-T) permiten una transferencia mediada por agrobacterias en células vegetales para la transferencia e integración en el genoma vegetal.

5) Sitios de Clonación Múltiples (MCS) permiten y facilitan la inserción de una o más secuencias de ácido nucleico

[0063] La invención también se refiere a vectores que comprenden el anteriormente descrito ácido nucleico de la invención o el casete de expresión transgénica de la invención. Los vectores generalmente significan estructuras que son capaces de replicación y que son preferiblemente específicas del huésped, y que permiten la absorción de secuencias de ácido nucleico y su transferencia en otras células. Ejemplos de vectores pueden ser los plásmidos, los cósmidos, los fagos, los virus u otra agrobacteria. Los vectores que son particularmente adecuados para los propósitos de la biotecnología vegetal están descritos ejemplarmente en la presente más adelante. Los vectores de la presente invención comprenden vectores de expresión transgénicos.

[0064] Otro sujeto de la invención se refiere a organismos transgénicos transformados o transfectados transitoriamente o establemente con al menos un ácido nucleico aislado de la invención o al menos un casete de expresión transgénica de acuerdo a la invención o al menos un vector de acuerdo a la invención o a la progenie de dichos organismos transgénicos. Además la presente invención se refiere a células, cultivos celulares, tejidos, partes

-

como, por ejemplo en el caso de organismos vegetales, hojas, raíces y similares - o material de propagación derivado de dichos organismos, por ejemplo semillas de organismos transgénicos de la invención. Se entiende que para el propósito de la presente invención el término organismo transgénico no solo engloba el organismo donde el ácido nucleico de la invención ha sido transitoriamente o establemente introducido, sino que también se refiere a la progenie de dichos organismos con independencia de la distancia de generación, por ejemplo progenie de primera generación así como progenie de generación Xª, siempre que estos organismos todavía comprendan el ácido nucleico de la invención.

[0065] Preferiblemente el organismo transgénico es una planta o un microorganismo, más preferiblemente el organismo transgénico es una planta seleccionada de la familia Brassicaceae, incluso más preferiblemente de los géneros Brassica o Arabidopsis.

[0066] Organismo, organismos de partida u organismos huésped se entiende que significan organismos procariotas o eucariotas como, por ejemplo, microorganismos u organismos vegetales. Los microorganismos preferidos son las bacterias, las levaduras, las algas o los hongos.

[0067] Las bacterias preferidas son las bacterias del género escherichia, Erwinia, Agrobacterium, Flavobacterium, Alcaligenes o cyanobacteria, por ejemplo del género Synechocystis.

[0068] Especialmente preferidos son los microorganismos que son capaces de infectar plantas y por lo tanto de transferir el ácido nucleico, el casete de expresión transgénica y/o el vector de la invención. Los microorganismos preferidos son aquellos del género Agrobacterium y en particular la especie Agrobacterium tumefaciens.

[0069] Los organismos huésped o de partida que se prefieren como organismos transgénicos son, sobre todo, organismos vegetales. Los organismos vegetales generalmente significan todos aquellos organismos que son capaces de la fotosíntesis. Están incluidos como organismos vegetales dentro del ámbito de la invención todos los géneros y especies de las plantas superiores e inferiores del reino vegetal. También están incluidas las plantas maduras, las semillas, los tubérculos, remolachas/raíces principales engrosadas, frutas, brotes y retoños y también partes, material de propagación y cultivos, por ejemplo cultivos celulares, derivados de los mismos. Plantas maduras significa plantas en cualquier estado de desarrollo más allá del retoño. Retoño significa una planta inmadura joven en un estado de desarrollo temprano. Se prefieren como organismos huésped para preparar las plantas transgénicas las plantas anuales, perennes, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Se da preferencia a las plantas de la siguiente familia vegetal: Brassicaceae en particular a plantas de los géneros Brassica y Arabidopsis.

[0070] La preparación de un organismo transformado o de una célula transformada requiere introducir el ADN apropiado en la célula huésped apropiada. Hay una multiplicidad de métodos disponible para este proceso que es referido como transformación (ver también Keown y otros 1990 Methods in Enzymology 185:527-537). Por lo tanto, a modo de ejemplo, el ADN puede ser introducido directamente por microinyección o por bombardeo con micropartículas recubiertas de ADN. La célula puede ser también permeabilizada químicamente, por ejemplo usando polietilenglicol, de tal forma que el ADN puede entrar en la célula por difusión. El ADN puede también ser realizado por fusión de protoplastos con otras unidades que contienen ADn como minicélulas, células, lisosomas o liposomas. Otro método adecuado para introducir ADN es la electroporación en la que las células son permeabilizadas inversamente por un impulso eléctrico.

[0071] En el caso de las plantas, los métodos descritos para transformar y regenerar plantas de tejidos vegetales o células vegetales se utilizan para la transformación transitoria o estable. Los métodos adecuados son especialmente la transformación de protoplastos por absorción de ADN inducida por polietilenglicol, el método biolístico usando la pistola de genes, el método de “bombardeo de partículas”, la electroporación, la incubación de embriones secos en solución que contiene ADN y la microinyección.

[0072] Aparte de estas técnicas de transformación “directas”, también se puede llevar a cabo una transformación por infección bacteriana por medio de Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes. Estas cepas contienen un plásmido (plásmido Ti o Ri), una parte del cual (que es conocida como ADN-T) es transferida a la planta tras la infección con Agrobacterium e integrada en el genoma de la célula vegetal. La transformación mediada por Agrobacterium está mejor adecuada para células vegetales dicotiledóneas, mientras que las técnicas de transformación directa son adecuadas para cualquier tipo de célula.

[0073] Se puede introducir ventajosamente un casete de expresión transgénica de la invención en las células, preferiblemente en células vegetales, usando vectores, preferiblemente vectores de la invención.

[0074] En una realización ventajosa, el casete de expresión transgénica es introducido por medio de vectores plásmidos. Se da preferencia a aquellos vectores de expresión transgénica que permiten una integración estable del casete de expresión transgénica en el genoma huésped. En este contexto, genoma huésped significa la información hereditaria entera del huésped y comprende por ejemplo no solo el ADN cromosómico del núcleo, sino también el ADN de los plástidos y la mitocondria. Sin embargo, se prefiere la inserción en el ADN cromosómico del núcleo.

[0075] En el cado de inyección o electroporación de ADN en células vegetales, no se hacen exigencias particulares en el plásmido usado. Es posible usar plásmidos simples como aquellos de la serie pUC. Si se van a regenerar plantas completas de las células transformadas, es necesario que esté presente un gen marcador seleccionable adicional en el plásmido.

[0076] Se han descrito las técnicas de transformación para varios organismos vegetales monocotiledóneos y dicotiledóneos. Además están disponibles varios vectores plásmidos posibles que normalmente contienen un origen de la replicación para la propagación en el E. coli y un gen marcador para la selección de bacterias transformadas para introducir genes extraños en plantas. Ejemplos son el pBR322, la serie pCU, la serie M13 mp, el pACYC184, etc.

[0077] El casete de expresión transgénica puede ser introducido en el vector por un sitio de escisión de restricción adecuado. El plásmido resultante es primero introducido en el E. coli. Las células de E. coli correctamente transformadas se seleccionan, se cultivan y el plásmido recombinante es obtenido usando métodos familiares para el trabajador experto. El análisis y la secuenciación de restricción pueden ser usados para comprobar el paso de clonación.

[0078] Las células transformadas, es decir, aquellas que contienen el ADN introducido integrado en el ADN de la célula huésped pueden ser seleccionadas de las células no transformadas, si un marcador seleccionable es parte del ADN introducido. Un marcador puede ser, a modo de ejemplo, cualquier gen que es capaz de impartir una resistencia a antibióticos o herbicidas. Las células transformadas que expresan dicho gen marcador son capaces de sobrevivir en presencia de concentraciones de un antibiótico o herbicida apropiado, que mata una del tipo salvaje no transformada. Ejemplos son el gen bar que imparte resistencia a la fosfinotricina herbicida (Rathore K S y otros, Plant Mol Biol. 1993 Marzo; 21(5):871-884), el gen nptll que imparte resistencia a la kanamicina, el gen hpt que imparte resistencia a la higromicina y el gen EPSP que imparte resistencia al glifosato herbicida.

[0079] Dependiendo del método de introducción de ADN, se pueden requerir genes adicionales en el plásmido del vector. Si se usan agrobacterias, el casete de expresión transgénica ha de ser integrado en los plásmidos específicos, ya sea en un vector intermedio (vector lanzadera) o un vector binario. Si, por ejemplo, el plásmido Ti o Ri se va a usar para la transformación, al menos el extremo derecho, en la mayoría de los casos, sin embargo el borde derecho y el izquierdo, del ADN-T del plásmido Ti o Ri está conectado como región flanqueante con el casete de expresión transgénica a ser introducido. Se da preferencia a usar vectores binarios. Los vectores binarios pueden replican tanto en el E. coli como en la Agobacterium. Normalmente contienen un gen marcador de selección y un conector o policonector flanqueado por las secuencias del borde del ADN-T derecha e izquierda. Pueden ser transformados directamente en Agrobacterium (Jolsters y otros Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). El gen marcador de selección permite la selección de agrobacterias transformadas; un ejemplo es el gen nptll que imparte una resistencia a la kanamicina. La Agrobacterium que en este caso actúa como el organismo huésped debería contener ya un plásmido con la región vir. Esta región se requiere para la transferencia del ADN-T en la célula vegetal. Una Agrobacterium transformada de esta manera puede ser usada para la transformación de células vegetales.

[0080] El uso de ADN-T para la transformación de células vegetales ha sido estudiado y descrito intensamente (B. Jenes y otros Techniques for Gene Transfer, en: TRangenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, editado por Kung S D y Wu R, Academic Press (1993), pp. 128-43 y en Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225; PE 120516; Hoekema, En:The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam, Capítulo V;Fraley y otros, Crit. REv. Plant, Sci., 4:1-46 y An y otros (1985) EMBO J. 4:277-287). Se conocen y están parcialmente disponibles varios vectores binarios, como, por ejemplo, el pBIN19 (Bevan y otros (1984) Nucl Acids Res 12:8711f.; Clontech Laboratories, Inc. USA) e los derivados del PSUN (SunGene GmbH & Co. KGaA; WO 02/00900). El casete de expresión de acuerdo a la invención puede ser insertado en estos vectores binarios e integrado en el genoma vegetal como se describe en la presente anteriormente y/o en la presente más adelante.

[0081] El ADN es transferido en la célula vegetal cocultivando explantes vegetales con Agrobacterium tumefaciens

o Agrobacterium rhizogenes. Empezando de material vegetal infectado (por ejemplo, hoja, raíz, o partes del tallo, pero también protoplastos o suspensiones de células vegetales), es posible regenerar plantas completas usando un medio adecuado que puede contener, por ejemplo, antibióticos o biocidas para la selección de las células transformadas. Las plantas obtenidas pueden entonces ser cribadas para la presencia del ADN introducido, en este caso el casete de expresión transgénica de la invención. Tan pronto como el ADN se ha integrado en el genoma huésped, el genotipo correspondiente es normalmente estable y la inserción correspondiente se encuentra también de nuevo en generaciones posteriores. Normalmente, el casete de expresión transgénica integrado contiene un marcador de selección que imparte a la planta transformada una resistencia a un biocida (por ejemplo un herbicida), a un inhibidor del metabolismo como el 2-DOG o a un antibiótico como la kanamicina, G418, bleomicina, higromicina

o fosfinotricina, etc. El marcador de selección permite la selección de células transformadas de células no transformadas (McCormick y otros (1986) Plant Cell Reports 5:81-84). Las plantas obtenidas pueden ser cultivadas y cruzadas de la manera común. Dos o más generaciones deben ser cultivadas para asegurar que la integración genómica es estable y heredable.

[0082] Tan pronto cono una célula vegetal transformada se ha preparado, es posible obtener una planta completa usando métodos conocidos por el trabajador experto. Con este fin, se usan cultivos de callos como punto de partida, a modo de ejemplo. De estas masas celulares todavía no diferenciadas, es posible inducir la formación de brotes y raíces de la manera conocida. Los brotes obtenidos pueden ser trasplantados y cultivados.

[0083] La integración del ADN-T puede ser determinada, por ejemplo, en base a la eficacia de la expresión de los ácidos nucleicos a ser expresados transgénicamente o del marcador de selección, por ejemplo, en vitro por propagación de los meristemos de brotes usando uno de los métodos de selección anteriormente descritos.

[0084] La invención además se refiere a células, cultivos celulares, partes, como, por ejemplo, raíces, hojas, etc. en el caso de organismos vegetales transgénicos, y material de propagación transgénico como semillas, tubérculos,

remolachas/raíces principales engrosadas o frutos derivados de los organismos transgénicos anteriormente descritos y/o que comprenden un ácido nucleico aislado de la invención, un casete de expresión transgénica de la invención o un vector de la invención.

[0085] Las plantas modificadas genéticamente de la invención, que pueden ser consumidas por humanos y animales, pueden también ser usadas, por ejemplo directamente o después de la preparación conocida por sí misma, como alimentos o piensos.

[0086] La invención además se refiere al uso de los organismos transgénicos anteriormente descritos de la invención y de las células, cultivos celulares, partes, como, por ejemplo, raíces, hojas, etc., en el caso de organismos vegetales transgénicos, y material de propagación transgénico como semillas, tubérculos, remolachas/raíces principales engrosadas o frutos derivados de ellos para la producción de alimentos o piensos, productos farmacéuticos o productos químicos finos.

[0087] La invención también se refiere al uso de un ácido nucleico aislado de la invención, un casete de expresión de acuerdo a la invención o un vector de la invención para la fabricación de una planta transgénica.

[0088] La presente invención además se refiere a un método para la fabricación de una planta transgénica, comprendiendo los pasos de:

a) introducir en una o más células vegetales un ácido nucleico aislado de la invención, un casete de expresión de la invención o un vector de la invención para producir células transgénicas; y b) la selección de células transgénicas que comprende el mencionado ácido nucleico aislado, casete de expresión o vector de la invención integrado en el genoma; y c) la regeneración de plantas intactas de dichas células transgénicas.

[0089] La información de cómo se pueden realizar estos pasos se da en detalle en la presente anteriormente.

[0090] Además, la presente invención se refiere a un método para mejorar el crecimiento de brotes vegetales, comprendiendo:

i) introducir en una planta un ácido nucleico aislado de la invención; y ii) expresar el ácido nucleico introducido de la invención.

[0091] En lo sucesivo se describe adicionalmente la presente invención por medio de ejemplos.

Figuras:

[0092]

FIG. 1 muestra el crecimiento vegetativo de los mutantes rock2, rock3 y ore12 en comparación con el tipo salvaje;(A.) Foto de retoños 19 DAG (días después de la germinación). Las plantas fueron cultivadas bajo condiciones de día largo. (B.) Comparación de las hojas de las plantas mostradas en (A.), sin ore12. (C.) Comparación de peso fresco 18 DAG. n = 10; *,· = p<0,01; **,·· = p<0,005;***,··· = p<0,0001. *= comparado con WT; · = comparado con ore12.

FIG. 2 muestra la senescencia natural de la hoja 6 de las plantas mutantes rock y ore12 bajo condiciones de día largo: (A.) Reducción de la eficiencia fotosintética del fotosistema II de 16 a 378 DAE (días después de la emergencia). (B.) Reducción del contenido de clorofila 16 a 35 DAE. (C.) comparación de las hojas mostradas en (A.) y (B.). n = 10; · = p<0,01; ··p<0,005 en comparación con el ore12.

FIG. 3 muestra el parámetro de los brotes de las plantas mutantes rock2, rock3 y ore12 y las líneas transgénicas que expresan pAHK2:rock2 o pAHK3:rock3. (A.) La altura de la planta del rock2 y las plantas mutantes rock2 y rock3 transgénicas aumenta. (B.) los mutantes rock2 y las líneas rock2 y rock3 transgénicas forman más silicuas en el tallo principal. n = 10; *, = p<0,01; ***, ···= p>0,0001; * = en comparación con el WT; ·= en comparación con el ore12.

FIG. 4 muestra el parámetro de brotes de las plantas mutantes rock2, rock3 y ore12 y las líneas transgénicas que expresan pAHK2:rock2 o pAHK3:rock3: (A., B.) los mutantes rock2 y rock3 y las líneas rock2 y rock3 transgénicas forman (A.) tallos más gordos y (B.) flores más grandes. n = 10; ***,··· = p<0,0001; * = en comparación con WT; · = en comparación con ore12.

FIG. 5 muestra la producción de semillas de dos líneas transgénicas pAHK3:rock3 independientes en comparación con el tipo salvaje. Las líneas transgénicas tienen un incremento de hasta el 47% de producción de semillas en comparación con las plantas del tipo salvaje. n = 10. ** = p<0,005; *** = p<0,0001 en comparación con WT.

Ejemplos:

Material y Métodos

[0093] Los alelos rock2 y rock3 fueron identificados y aislados en base a su capacidad para suprimir las consecuencias fenotípicas de la deficiencia de citoquinina causada por la sobreexpresión de un gen CKX codificando una oxidas/deshidrogenasa de citoquinina.

Material vegetal y condiciones de crecimiento

[0094] El ecotipo Columbia (col-0) de la Arabidopsis thaliana se usó como el tipo salvaje. Las plantas fueron cultivadas en el invernadero en tierra bajo condiciones estériles en fuentes Petri que contenían un medio ATS (Estelle, M.A. y Somerville, C. (1986). Los mutantes resistentes a la auxina de la Arabidopsis thaliana con una morfología alterada. Mol. Gen. Genet. 206, 200-206). Todas las plantas fueron cultivadas a 22º C bajo condiciones de día largo (16 h de luz/8 h de oscuridad).

Mutagenesis

[0095] Aproximadamente 25000 semillas 35S:CKX1 (Werner, T., Motyka, V., Laucou, V., Smets, R., Van Onckelen, H., y Schmülling, T. (2003). Las plantas de Arabidopsis transgénicas deficientes en citoquinina muestran múltiples alteraciones del desarrollo indicando funciones opuestas de citoquininas en la regulación de la actividad meristemática de brotes y raíces. La Célula Vegetal 15,2532-2550) fueron empapadas durante 16 h en 100 ml 0,2% (v/v) de metanosulfonato de etilo a temperatura ambiente. La generación M1 fue cultivada como plantas únicas y la generación M2 fue cribada para plantas con el fenotipo similar al tipo salvaje.

Análisis Genético

[0096] Se generaron mapas de poblaciones para la rock2 y la rock3 cruzando las plantas rock2 35S:CKX1 Y el rock3 35S:CKX1 con el ecotipo de tipo salvaje Landsberg erecta. Las plantas de la progenie F2 se usaron para mapear la rock2 y la rock3.

[0097] Para analizar las consecuencias de las mutaciones rock2 y rock3 en el tipo salvaje, los mutantes supresores rock2 y rock3 en el antecedente 35S:CKX1 fueron cruzadas con el tipo salvaje Columbia. Las plantas de la progenie F1 de este cruce mostraban todavía el fenotipo de reversión sugiriendo que los alelos rock2 y rock3 son dominantes. La generación F2 fue cribada para las plantas rock2 y rock3 en el antecedente del tipo salvaje (llamadas entonces mutantes rock2 y rock3).

Establecimiento de las líneas transgénicas

[0098] Para la construcción del transgén pAHK2:rock2 se amplificó una región promotora de 2124 bp del AHK2 por PCR del ADN genómico de la A. thaliana Col-0 y se clonó con tecnología GatewayTM en el vector de entrada pDONRTMP4-P1R (Invitrogen, Karishure, Alemania). Después de clonar la secuencia de codificación AHK2 con la tecnología GatewayTM en el vector de entrada pDONRTM221 (Invitrogen) la mutación de punto rock2 fue introducida por PCR basada en mutagénesis con el Kit “QuickChange Site-Directed Mutagenesis) (Stratagene, LA Jolla, USA) para obtener el Alelo rock2. Ambos fragmentos fueron combinados con la clonación recombinatoria Multisite GatewayTM en el vector pK7m24GW,3 (Karini y otros, 2005). Para obtener el constructo pAHK3:rock3 se amplificó una región promotora de 2062bp por PCR del ADN genómico de la A. thaliana Col-0 y el fragmento fue insertado en el vector de entrada pDONRTMP4-P1R. El ADNc AHK3 que contenía el marco de lectura abierto del gen fue amplificado por PCR de la A. thaliana Col-0 y clonado en el vector de entrada pDONRTM222 (Invitrogen). Para introducir la mutación de punto rock3 se uso el Kit “QuickChange Site-DIrected Mutagenesis” (Stratagene, La Jolla, USA) para conseguir el alelo rock3. El promotor AHK3 y el ADNc ROCK3 fueron combinados con clonación recombinatoria Multisite GatewayTM en el vector pK7m24GW,3 (Karimi, M., DE Meyer, B., y Hilson, P. (2005). Modular Cloning in plant cells. Trends Plant Sci. 10, 103-105). Ambos constructos fueron introducidos en la cepa de Agrobacterium tumefaciens GV3101 y las plantas A. thaliana Col-0 fueron transformadas usando el método de goteo floral (Clough, S.J., y Bent, A.F. (1998). Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16,735-743). Las líneas transgénicas fueron seleccionadas usando kanamicina y propagandas en la generación T3 o T4.

Mediciones morfométricas

[0099] Al de 18 días después de la germinación se tomaron fotografías digitales de las rosetas y se midió el diámetro de la roseta usando el programa Scion Image (Scion Corporation, Frederick, Maryland, USA). Las Flores en el estado 14 fueron fotografiadas y su tamaño también fue medido usando el programa Scion Image.

Determinación del peso fresco, altura de la planta final y parámetros de rendimiento

[0100] Los pesos frescos fueron medidos pesando cualquiera de las rosetas, los brotes sin las rosetas, o la parte aérea completa de las plantas. La altura final de la planta y el número de silicuas fueron determinados tras la finalización de la floración. Para el análisis de la producción de semillas, las plantas fueron puestas en bolsas de papel después de la finalización de la floración. Después de que las plantas fueron mantenidas secas durante tres semanas adicionales, se determinó el peso de las semillas total.

Parámetros fotosintéticos

[0101] La eficiencia máxima de la fotoquímica PSII (proporción Fv/Fm) de las plantas adaptadas a la oscuridad fue medida con FluorCam (Photon Systems Instruments, Brno, República Checa). Los contenidos de clorofila de las hojas individuales fueron medidos usando el Clorophyll Meter SPAD-502 (Konika Minolta, Bremen, Alemania), tomando el valor medio de dos mediciones de la misma hoja.

Resultados

1. Análisis de alelos mutantes en el antecedente 35S:CKX1

[0102] Para comparar las consecuencias de la mutación rock3 con las de la mutación ore12 la última fue introgresada en el antecedente 35S:CKX1 (el rock3 fue identificado en este antecedente). Se pudo demostrar que la mutación ore12 revierte parcialmente las consecuencias fenotípicas de la sobreexpresión CKX1. Sin embargo, en diferentes puntos temporales durante el desarrollo el grado de reversión es menos fuerte que la reversión alcanzada con el alelo rock3. Esta diferencia es más evidente para el tamaño de los retoños y el diámetro de la roseta. Estos dos parámetros son indicadores buenos para un estado de citoquinina cambiado de las plantas CKX1ox.

2. Análisis de los alelos mutantes en antecedentes del tipo salvaje

[0103] A continuación se compararon las consecuencias de los tres alelos mutantes (rock2, rock3 y ore12) en el antecedente del tipo salvaje (Col-0). En la Figura 1 se muestra que sólo los alelos rock2 y rock3 mejoran significativamente el crecimiento vegetativo de las plantas del tipo salvaje, mientras que el alelo ore12 no resulta en una mejora del crecimiento significativa. Este efecto puede ser ya visto poco después de la germinación de la semilla (Figura 1A) y es también evidente de la comparación del tamaño de la hoja en un estado de desarrollo posterior (Figura 1B). Los efectos de los alelos rock2 y rock3 no fueron sólo significativamente más fuertes en comparación con las plantas del tipo salvaje sino también en comparación con el alelo ore12. Tanto el rock2 como el rock3 causaron un aumento de >75% del peso fresco 18 días después de la germinación (DAG) en comparación con el tipo salvaje. Un análisis del aumento del peso fresco de las rosetas y toda la planta sobre el ciclo vital completo de las plantas mostró que el aumento en la diferencia de peso fresco es particularmente evidente en 32-40 DAG y que el efecto es más fuerte con el alelo rock2.

[0104] Se conoce que el estado de citoquinina potenciado causado por el alelo ore12 retrasa la senescencia de la hoja. Se comparó la senescencia de las hojas en plantas del tipo salvaje, en plantas mutantes ore12 y mutantes rock. La Figura 2 muestra claramente un comienzo retardado de la senescencia de las hojas en todas las plantas mutantes en comparación con el tipo salvaje. La eficiencia fotosintética del PS II (FV/Fm) comenzó a declinar en la hoja de la roseta 6’ de las plantas del tipo salvaje alrededor del 17 DAE y alrededor del 21 a 23 DAE en las plantas mutantes (Figura 2A). Entre estas, las plantas rock2 mostraron el comienzo más temprano de la senescencia de las hojas, seguida por el ore12 y el rock3. Está diferencia en el momento de la senescencia de las hojas se mantuvo llevando a un tiempo de vida diez días más largo de las hojas del rock3 en comparación con las hojas del tipo salvaje (Figura 2A). Este resultado fue confirmado midiendo otro parámetro de la senescencia, la disminución de clorofila (Figura 2B), así como con la inspección visual de las hojas (Figura 2C).

3. Análisis de la expresión transgénica de los alelos rock

[0105] En el siguiente paso se analizaron las consecuencias de la expresión transgénica de los alelos rock dominantes. Con este fin transformamos plantas Arabidopsis Col-0 con genes que comprendían ca. 2 kb de las regiones regulatorias hacia arriba 5’ de la AHK2 y la AHK· respectivamente y las secuencias de codificación del rock2 y rock3, respectivamente. Estos genes fueron denominados pAHK2:rock2 y pAHK3:rock3, respectivamente, y están etiquetados pAHK2:rock2 y paHK3:rock3 en la Figura 3 a la Figura 5. De forma general, se descubrió una mejora adicional de los rasgos fenotípicos que fueron alterados en las plantas mutantes rock. Las Figuras 3 y 4 muestran que las plantas transgénicas pAHK2:rock2 y pAHK3:rock3 tienen en comparación con las plantas del tipo salvaje o ore12 un aumento significativo en la altura de los brotes (Figura 3A), un número significativamente aumentado de silicuas en el tallo principal (Figura 3B), tallos más gruesos causado por un número mejorado de células más grandes en la dimensión radial (Figura 4A) y un tamaño significativamente aumentado de las flores (Figura 4B). Como se demuestra en la Figura 5, se pudo demostrar que las plantas transgénicas pAHK3:rock3 tienen una producción de semillas significativamente más alta en comparación con el tipo salvaje.

LISTA DE SECUENCIAS [0106]

<110> FU Berlin Institut fur Biologie Angewandte Genetik

<120> rock2 y rock3, dos nuevas variantes de ganancia de función de los receptores de citoquinina AHK2 y AHK3

<130> P658809EP

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1176

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 1

<210> 2

<211> 1036

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 2

<210> 3

<211> 4595

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 3

<210> 4 <211> 4248

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 4

<210> 5

<211> 50

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 5

<210> 6

<211> 50

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 6

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un ácido nucleico aislado, que comprende una secuencia de ácido nucleico codificando una variante constitutivamente activa del receptor de citoquinina AHK2 con:

   i) una secuencia de aminoácido con la SEQ ID No.1 o un ortólogo de la misma; ii) una secuencia de aminoácido que tiene al menos un 48%, preferiblemente al menos un 50%, más preferiblemente al menos un 55% de identidad sobre la longitud de la secuencia completa de la SEQ ID No. 1; o iii) una secuencia de aminoácido que tiene al menos un 50%, preferiblemente al menos un 53%, más preferiblemente un 55% de identidad sobre un segmento de secuencia de aminoácido 50 de SEQ ID No. 1 teniendo la SEQ ID No. 5;

   en donde la secuencia de aminoácido tiene la fenilalanina del aminoácido (F) en una posición correspondiente a la posición 552 de la SEQ ID No.1.

2. 2.

   Un ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, comprendiendo además al menos una secuencia promotora, en donde la al menos una secuencia promotora y la secuencia del ácido nucleico codificante están enlazadas funcionalmente entre sí.

3. 3.

   Un casete de expresión transgénica para la expresión de los ácidos nucleicos que comprende un ácido nucleico aislado de una de las reivindicaciones 1 a 2.

4. 4.

   Un vector que comprende un ácido nucleico aislado de una de las reivindicaciones 1 a 2 o un casete de expresión transgénica de la reivindicación 3.

5. 5.

   Un organismo transgénico transformado o transfectado transitoriamente o establemente con un ácido nucleico aislado de las reivindicaciones 1 a 2, un casete de expresión de la reivindicación 3 o un vector de la reivindicación 4

   o progenie de dicho organismo transgénico.

6. 6.

   Un organismo transgénico de la reivindicación 5, en donde el organismo es una planta o un microorganismo.

7. 7.

   Un organismo transgénico de la reivindicación 6, en donde el organismo es una planta seleccionada de la familia Brassicaceae, preferiblemente de los géneros Brassica o Arabidopsis.

8. 8.

   Una célula, cultivo celular, parte, órgano, tejido o material de propagación transgénico que comprende un ácido nucleico aislado de las reivindicaciones 1 a 2, un casete de expresión transgénica de la reivindicación 3 o un vector de la reivindicación 4.

9. 9.

   El uso de un ácido nucleico aislado de las reivindicaciones 1 a 2, un casete de expresión transgénica de la reivindicación 3 o un vector de la reivindicación 4 para la fabricación de una planta transgénica.

10. 10.

    El método para la fabricación de una planta transgénica, comprendiendo los siguientes pasos:

    a) introducir en una o más células vegetales un ácido nucleico aislado de las reivindicaciones 1 a 2, un casete de expresión transgénica de la reivindicación 3 o un vector de la reivindicación 4 para producir células transgénicas; b) la selección de células transgénicas que comprende dicho ácido nucleico aislado, casete de expresión o vector integrado establemente en el genoma; y c) la regeneración de las plantas intactas de dichas células transgénicas o células derivadas de las mismas.

11. 11.

    Un polipéptido aislado codificado por un ácido nucleico aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

12. 12.

    Un polipéptido aislado que comprende al menos la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No.1.

13. 13.

    Un método para mejorar el crecimiento de brotes vegetales, que comprende:

    i) introducir en una planta un ácido nucleico aislado de las reivindicaciones 1 a 2; y ii) expresar el ácido nucleico introducido de las reivindicaciones 1 a 2.