ES2384466T3 - Composiciones y procedimientos de tratamiento de una infección viral - Google Patents

Abstract

Un compuesto que bloquea un receptor inhibidor de una célula asesina natural para su uso en el tratamiento deuna enfermedad viral causada por VIH en un sujeto humano que lo necesita, en el que el sujeto humano ha sidotratado con terapia antirretroviral altamente activa y en el que el compuesto es un anticuerpo que se une al Receptorsimilar a Ig de Células Asesinas 2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3 y que bloquea la inhibición mediada por KIR2DL1,KIR2DL2 y KIR2DL3 de citotoxicidad de células NK..

Description

Composiciones y procedimientos de tratamiento de una infeccion viral

Campo de la invención

La presente invencion se refiere a procedimientos y composiciones para el tratamiento de infecciones virales tales

5 como VIH (Virus de Inmunodeficiencia Humana) y VHC (Virus de Hepatitis C). Mas particularmente, la invencion se refiere al uso de un anticuerpo monoclonal (mAb) especifico para uno o mas receptores similares a Ig de celulas Asesinas humanas (KIR) para tratamiento de estas y otras enfermedades virales. En una realizacion particular, la invencion se refiere al uso de tales mAb en el tratamiento de pacientes de VIH que se han sometido a Terapia Antirretroviral Altamente Activa (HAART ). En otra realizacion particular, la i nvencion se refi ere al uso de un anticuerpo terapeutico especifico para un a molecula de superficie expresada en celulas infectadas con virus en combinacion con un mAb (u otro compuesto) que se une a y bloquea a los receptores KIR inhibidores de celulas asesinas naturales y permite una p otenciacion de la c itotoxicidad de celulas as esinas naturales en sujetos mamiferos con el fin de p otenciar la eficacia del tratamiento en sujetos humanos, particularmente a traves de u n aumento del mecanismo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) que conduce a la erradicacion

15 de celulas infectadas viralmente.

Antecedentes de la invención

Diversas estrategias terapeuticas en seres humanos se basan en el uso de anticuerpos terapeuticos. Esto incluye, por ejemplo, el uso de antic uerpos terapeuticos desarrollados para agotar celulas diana, particularmente celulas enfermas tales como celulas infectadas viralmente, celulas tumorales u otras celulas patogenas. Tales anticuerpos son tipicamente anticuerpos monoclonales, de especies de gamma inmunoglobulina (IgG), tipicamente con la parte Fc de IgG1 o IgG3. Estos anticuerpos pueden ser anticuerpos nativos o recombinantes, anticuerpos de raton humanizados (es decir, que comprenden dominios funcionales de diversas especies, tipicamente parte Fc de origen humano o de primate no humano y region variable o region determinante de complementariedad (CDR) de origen de raton). Como alternativa, el anticuerpo monoclonal puede ser completamente humano a traves de inmunizacion en

25 ratones transgenicos de locus de Ig humana u obtenido a traves de bibliotecas de ADNc obtenidas a partir de celulas humanas. Un ejemplo particular de tales anticuerpos terapeuticos es rituximab (Mabthera®, Rituxan®), que es un anticuerpo monoclonal anti-CD20 quimerico preparado con las regiones constantes y1 y K humanas (por lo tanto con parte Fc de IgG1 humana) enlazadas a dominios variables murinos que confieren especificidad de CD20. En los ultimos anos, rituximab ha modificado considerablemente la estrat egia terapeutica frente a malig nidades linfoproliferativas de, partic ularmente, linfomas no Ho dgkin (NHL). 0tros ejempl os de anticu erpos de IgG1 humanizados incluyen alemtuzumab (Campath-1H®), que se usa en el tratamiento de malignidades de celulas B o trastuzumab (Herceptin®), que se usa en el tratamiento de cancer mamario. En la tecnica se divulgan ejemplos adicionales de anticuerpos terapeuticos en desarrollo.

El mecanismo de accion de los anticuerpos terapeuticos se desarrollo para el agotamiento de celulas que portan el

35 antigeno reconocido especificamente por el anticuerpo. Este agotamiento se puede mediar a traves de al menos cuatro mecanismos: ADCC, lisis dependiente de complemento, fagocitosis y efectos antitumorales directos, por ejemplo inhibicion de crecimiento tumoral mediante bloqueo mediado por mA b de senalizacion de receptor de crecimiento.

Aunque estos anticuerpos representan un enfoque novedoso frente a terapia humana, particularmente en el tratamiento de neoplasias, los mismos no siempre muestran una eficacia marcada. Por ejemplo, aunque rituximab, en solitario o en combinacion con quimioterapia ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de NHL de grado bajo, intermedio y elevado, del 30% al 50% d e los pacientes con NHL de grado bajo no tienen respuesta clinica a rituximab. Se ha sugerido que el nivel de expresion de CD20 en celulas de linfoma, la presencia de carga tumoral elevada en el momento del tratamiento o las concentraciones de rituximab en suero bajas pueden explicar la

45 carencia de eficacia de rituximab en algunos pacientes. Sin embargo, las causas reales del fracaso del tratamiento permanecen en su mayoria desconocidas. Se ha descubierto previamente que la eficacia para la destruccion de celulas tumorales de rituximab se puede potenciar reforzando ADCC mediante celulas asesinas naturales (NK). Un mecanismo mediante el cual las celulas NK pueden destruir celulas diana es mediante ADCC, cuando un mAb se une con la parte especifica de antigeno a un antigeno en una celula diana y al mismo tiempo la parte Fc del mAb se une a un receptor de Fc (denominado CD16) en celulas NK. Esto conduce la activacion de CD16 en la celula NK, lo cual desencadena la activacion de la maquinaria citolitica de celulas NK. Sin embargo, las celulas NK tambien expresan receptores inhibidores, tales como KIR, que envian senales negativas a las celulas NK, equilibrando de este modo las senales positivas, por ejemplo, transducidas a traves de CD16. Se ha observado que mediante el bloqueo de los receptores KIR inhibidores, usando mAb que se une a KIR y evita su funcion, se puede potenciar la

55 senalizacion estimuladora a traves de CD16, conduciendo a una destruccion por NK aumentada de celulas diana tumorales, en presencia de mAb que se pueden unir simultaneamente a un antigeno en la diana y a CD16 en celulas NK.

Los documentos W02005003168 y W02005003172 describen el uso de anticuerpos anti-KIR de reaccion cruzada para tratar, por ejemplo, cancer, una enfermedad infecciosa o un trastorno inmune. El documento W02005009465

describe elusode un anticuerpo que bloquea un receptor inhibidor de celulas NK y un anticuerpo terapeutico que puede estar unido por CD16 para tratar cancer, una enfermedad infecciosa o un trastorno inmune.

Ahmad y Ahmad (Current HIV research, 2007; 1:295-307) divulga la evasion de VIH de respuesta de celulas NK del huesped.

La memoria descriptiva divulga un procedimiento para potenciar la respuesta de ADCC mediada por NK hacia celulas infectadas por virus en presencia de mAb terapeuticos especificos para antigenos expresados en celulas infectadas viralmente, como un tratamiento de infecciones virales, por ejemplo infecciones por VIH.

Sumario de la invención

La memoria descriptiva divulga enfoques novedosos para tratar VIH y para pote nciar la eficacia de anticuerpos terapeuticos para el tratamiento de infecciones virales.Estos enfoques se basan en un subgrupo especifico de pacientes con VIH que son adecuados para tratamiento con compuestos que se dirigen a receptores inhibidores de celulas NK yen un aumento del mecanismo de ADCC in vivo, cuando se inyectan anticuerpos terapeuticos. De hecho, la presente invencion actualmente proporciona composiciones novedosas y procedimientos que superan la dificultad actual relacionada con la eficacia baja de anticuerpos terapeuticos en el tratamiento de infecciones virales. Se demuestra en la presente invencion que las celulas NK de un individuo tienen mala ADCC mediada por mAb (anticuerpos monoclonales) terapeutica debido a que esta inhibida por receptores inhibidores en las celulas NK. Preferentemente, un aumento en el mecanismo de ADCC se consigue mediante la administracion de compuestos que bloquean el receptor inhibidor de celulas asesinas naturales y permite una potenciacion de citotoxicidad de celulas asesinas naturales en sujetos mamiferos. Preferentemente el compuesto es un anticuerpo o un fragmento del mismo. Los anticuerpos reaccionan con un receptor inhibidor de celulas NK, es decir moleculas de receptor inhibidor d e c elulas Ases inas (KIR o CD 941NKG2A1C) en ce lulas NK y ne utralizan sus senales inhibidoras, aumentando de ese modo su actividad de ADCC.

Por consiguiente, en un aspecto, la memoria descriptiva divulga un procedimiento de tratamiento de una enfermedad viral causada por VIH en un sujeto humano que lo necesita, que comprende administrar al sujeto humano un primer compuesto que bloquea un receptor inhibidor de una celula NK, en el que el sujeto humano se ha tratado con terapia antirretroviral altamente activa (HAART), en el que el compuesto es un anticuerpo que se une a KIR2DL1, KIR2DL2, y KIR2DL3 y que bloquea la inhibicion mediada por KIR2DL1-, KIR2DL2-, y KIR2DL3- de citotoxicidad de celulas NK. En otro aspecto, el anticuerpo compite con anticuerpo monoclonal DF200 en la union a al menos uno de KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3 o con anticuerpo monoclonal 1-7F9en la union a al menos uno de KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3. En un aspecto particular, el anticuerpo es anticuerpo monoclonal 1-7F9. En otro aspecto, el sujeto humano se puede haber tratado con HAART durante un periodo de tiempo suficiente para conseguir un nivel en plasma de VIH por debajo de un nivel predeterminado antes de al administracion del primer compuesto. En otro aspecto, el procedimiento comprende ademas administrar al sujeto un segundo compuesto que es un anticuerpo terapeutico o proteina de fusion que se une a un antigeno expresado en una celula infectada por VIH. En un aspecto particular, el segundo compuesto es un anticuerpo terapeutico.

En otro aspecto, la memoria descriptiva divulga un procedimiento de tratamiento de una enfermedad viral en un sujeto humano que l o necesita, que com prende (a) a dministrar al s ujeto un pr imer compuesto que bloquea un receptor i nhibidor de una celul a NK y (b ) admin istrar al suj eto un s egundo comp uesto q ue es un antic uerpo terapeutico o proteina de fusion que se une a un antigeno expresado en una celula infectada por virus. En un aspecto, la enfermedad vir al esta c ausada por VIH (Vir us d e Inmu nodeficiencia H umana), VS R ( virus si ncitial Respiratorio), CMV (Citomegalovirus), virus de Ebola, virus de Hepatitis A, virus de Hepatitis B, virus de Hepatitis C, virus de Epstein-Barr, virus de varicela zoster (VVZ), virus de Hantaan, virus de influenza, virus de Herpes simple (VHS), virus de herpes Humano 6 (VHH-6), virus de herpes humano 8 (VHH-8), virus de papiloma Humano o Parvovirus. En aspectos particulares separados, la enfermedad viral esta causada por VIH o por virus de Hepatitis C.

En un aspecto, el segundo compuesto es un anticuerpo terapeutico. En otro aspecto, el segundo compuesto es un anticuerpo o proteina de fusion que comprende una parte Fc de un anticuerpo de IgG1 o IgG3 humano. En u n aspecto, el primer compuesto es un anticuerpo o un fragmento del mismo. En un aspecto particular, al menos uno del primero y segundo compuestos es un anticuerpo monoclonal. En otro aspecto particular, al menos uno del primer y segundo compuestos es un anticuerpo humano, humanizado o quimerico.

El primer compuesto se puede unir, por ejemplo, a al menos uno de un receptor humano CD94, NKG2A1C, KIR2DL y KIR3DL y reducir la inhibicion de citotoxicidad de celulas NK mediada por el receptor humano al cual se une. En una realizacion, el primer compuesto se une a un determinante comun de al menos dos receptores humanos de KIR2DL y reduce la inhibicion de citotoxicidad de celulas NK mediada por los receptores humanos de KIR2DL a los cuales se une. Por ejemplo, el primer compuesto se puede unir a un determinante comun de receptores humanos de KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3 y evitar la inhibicion mediada por KIR2DL1-, KIR2DL2-, KIR2DL3- de citotoxicidad de celulas NK. El primer compuesto, por ejemplo, puede ser un anticuerpo que compite con el anticuerpo monoclonal DF200 o el anticuerpo monoclonal 1-7F9 en la union a al menos uno de KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3.

En un aspecto, el primer ysegundo compuestos se administran simultaneamente al sujeto. En otro aspecto, el segundo compuesto se admi nistra al suj eto dentro d e cuatro semanas despues de l a administracion del primer compuesto.

El antigeno se puede seleccionar entre, por ejemplo, el grupo que consiste en CD3, CD28, CD4, CCR5, gp120 y gp41.

En otro aspect o, la memori a descriptiva tambien describe un proc edimiento para tratamiento de u na enfermedad viral en un sujeto humano que lo necesita, que comprende administrar al sujeto un compuesto que bloquea un receptor inhibidor de una celula NK.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. (A) Las celulas NK se definieron como todas las celulas CD56+CD3- en la ventana de linfocitos. Los cuadros muestran celulas oscuras CD56 (cuadro inferior) asi como celulas brillantes CD56 (cuadro superior). (B) La pr oporcion de c elulas NK de to dos los linfoc itos p ara contro les s anos y pacientes infectados con VIH-1 tratados con HAART se muestra, con una linea indicando la mediana. No se observo diferencia significativa. Figura 2. Porcentaje de celulas NK que expresan KIR en controles sanos (cuadros blancos) y pacientes infectados con VIH-1 (cuadros grises), P>0,05 para todos los KIR. Los anticuerpos frente a KIR2DL1, K1R2DL2 y KIR3DL1 reconocen diferentes receptores de KIR y el anticuerpo de KIR Pan 1-7F9 reconoce KIR2DUS1, KIR2DUS2 y KIR2DL3. Figura 3. Expresion del marcador de desgranulacion CD107a en celulas NK CD56+CD3- seleccionadas sin estimulacion (A) y despues de la estimulacion con la linea de celulas K562 sensibles a NK (B). (C) El porcentaje de expresi on de CD10 7a d espues de l a estimulacion c on celu las K 562 se muestra para controles sanos asi como para pacientes infectados con VIH-1. No hubo diferencia significativa entre los grupos. Se muestra la mediana de cada grupo. Figura 4.(A) Se muestra el porcentaje de expresion aumentada de CD107a en celulas NK despues de estimulacion con celulas 721.221 transfectadas con alelos HLA-C diferentes y bloqueo de todos los KIR con el mAb anti-KIR 1-7F9. El mAb anti-KIR indujo CD107 hasta un alcance similar en (1) celulas NK que expresan KIR2DL2 y estimuladas con celulas transfectadas con HLA-Cw3 como en (2) celulas NK que expresan KIR2DL1 y expuestas a celulas diana transfectadas con HLA-Cw4 o HLA-C w6, que se unen ambas a KIR2DL1. Tampoco se pudo observar diferencia significativa entre individuos sanos (circulos) y pacientes infectados con VIH (triangulos). Se muestra la mediana de cada grupo. (B) Bloqueo de todos los KIR en celulas NK estimuladas con la lin ea de celulas CEM no infectadas (barras blancas) o el 70% de celulas CEM infectadascon VIH-1 (barras grises) aumenta expresion de CD107a. No se pudo observar diferencia entre celulas no infectadas y celulas infectadas con VIH-1 en este experimento realizado una vez con PBMC de control sanas. (C) Celulas CD4+ autologas, expandidas yactivadas con IL-2 y PHA, se usaron como dianas yel bloqueo de KIR sobre celulas NK con mAb anti-KIR (1-7 F9) conduce a una expresion de CD107a aumentada en el 10% en dos experimentos independientes con sangre a partir de individuos sanos.

Descripción detallada de la invención

La presente invencion se basa, en parte, en el descubrimiento de que pacientes con VIH tratados con HAART pueden ser mas adecuados para tratamiento con anticuerpos anti-KIR que los pacientes con enfermedad muy activa (vease Ejemplo 5). La invencion tambiense basa, en parte, en el descubrimiento de que anticuerpos frente a receptores inhibidores de celulas NK pueden mejorar la eficacia deanticuerpos terapeuticos frente a antigenos virales, particularmente anticuerpos terapeuticos que se pueden unir por CD16, potenciando la respuesta de ADCC frente a tales anticuerpos terapeuticos.

En base a los datos en el Ejemplo 5, se pueden extraer dos conclusiones importantes:

1) Existe un grupo de pacientes infectados con VIH, concretamente pacientes tratados con HAART, que portan celulas NK funcionales y que se pueden activar que expresan KIR inhibidor funcional, que regula la actividad de destruccion de dichas celulas NK y estos KIR se pueden bloquear mediante mAb anti-KIR, induciendo de ese modo lisis por esas celulas NK hacia dianas que expresan HLA-C. Por el contrario, una caracteristica informada previamente d e celulas infectadas con VIH es que l as mismas r egulan negativamente (o anulan) la expresion de HLA-A y -Bpara evitar la destruccion mediante celulas T, mientras que conservan la expresion de HLA-C, evitando de ese modo la destruccion mediante celulas NK. 2) La infecc ion de cel ulas diana med iante VIH no cau sa la red uccion de la e xpresion d e lig andos activadores que son necesarios para desencadenar los receptores activadores en las celulas NK.

En conjunto estos nuevos hallazgos sugieren que celulas NK endogenas en al menos pacientes de HAART pueden destruir celulas infectadas por VIH cua ndo se bl oquea KIR u otro rec eptor inhibidor de celulas NK usando, por ejemplo, un anticuerpo capaz de reducir el bloqueo mediado por KIR de la citotoxicidad de celulas NK.

En un aspecto, se preve, por ejemplo, que los pacientes se traten tan pronto como sea posible con HAART hasta que la carga viral este por debajo de un nivel predeterminado o por debajo del nivel de deteccion durante un periodo de tiempo predeterminado, por ejemplo, al menos 1, 2, 4, 8 o 20 semanas. El nivel predeterminado podria ser, por ejemplo, una carga viral por debajo del nivel de deteccion, una carga viral por debajo de aproximadamente 50 copias de ARN1ml, una carga viral por debajo de aproximadamente 100 copias de ARN1ml o una carga viral por debajo de aproximadamente 200 c opias de ARN1ml. Una vez qu e la carga vir al ha lle gado a estar por de bajo del n ivel predeterminado o una vez que la carga viral ha estado por debajo del nivel predeterminado durante el periodo de tiempo predeterminado, se inicia el tratamiento con un compuesto capaz de reducir la actividad inhibidora de celulas NK de un receptor inhibidor de celulas NK. Tales compuestos se describen en el presente documento.

La pres ente memoria descriptiva tamb ien divu lga un medio p ara aumentar la eficacia de l os anticuer pos terapeuticos. L a memoria d escriptiva div ulga mas espec ificamente que el uso de u n compu esto, tal como un anticuerpo o un fragme nto del mism o, qu e blo quea e l re ceptor i nhibidor de una celul a NK, pu ede a umentar significativamente la eficacia de anticuerpos terapeuticos. De hecho, los inventores demuestran que la destruccion mediada por NK de celulas infectadas por virus puede potenciarse enormemente enpresencia de un anticuerpo dirigido frente a receptor inhibidor de celulas NK.

Por lo tanto, la memoria descriptiva divulga un procedimiento o un tratamiento de una enfermedad en un sujeto que lo necesita que comprende:

a) administrar al sujeto un compuesto, tal como un anticuerpo o un fragmento del mismo, que bloquea uno

o mas receptores inhibidores de una celula NK; y b) administrar al sujeto un anticuerpo terapeutico, especifico para un antigeno expresado sobre las celulas infectadas por virus.

El anticuerpo terapeutico se puede unir a CD16 en celulas NK, preferentemente a traves de su region Fc.

Preferentemente, el anticuerpo ter apeutico tien e u na p arte Fc de IgG1 o IgG3 humana, pa rticularmente un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo, mas preferentem ente un anticuerpo humanizado, humano o quimerico o un fragmento del mismo.

El compuesto, preferentemente un anticuerpo o un fragme nto del mismo, que bloquea el receptor inhibidor de una celula NK se puede administrar al s ujeto antes de, simultaneamente con o des pues de la administracion d el anticuerpo terapeutico. El modo de administracion de los diferentes anticuerpos depende de su biodisponibilidad y farmacocinetica. En un aspecto de la divulgacion, el anticuerpo terapeutico se administra dentro de 0 a cuatro semanas de la admi nistracion d el com puesto, prefer entemente un a nticuerpo o u n fragmento del mismo, qu e bloquea el receptor inhibidor de una celula NK, en otro aspecto dentro de dos semanas o dentro de una semana y en un aspecto adicional dentro de 5 o 2 di as. En un aspecto, el anticuerpo terapeutico se administra antes de o simultaneamente con el com puesto, tal como un anticuerpo o un frag mento del mismo, que bloquea el receptor inhibidor de una celula NK.

En un aspecto adicional, la memoria descriptiva divulga un procedimiento para aumentar ADCC en un sujeto que recibe un trata miento de anticuerpo terapeutico, comprendiendo el procedimiento administrar al su jeto antes de, simultaneamente con o despues de la administracion del anticuerpoterapeutico, una cantidad de un compuesto suficiente para aumentar ADCC, tal como un anticuerpo o un fragmento del mismo, que bloquea el receptor inhibidor de una celula NK. El anticuerpo terapeutico se puede unir por CD16 en celulas NK, preferentemente a traves de su region Fc. Preferentemente, el anticuerpo terapeutico tiene una parte Fc de IgG1 o IgG3 humana, particularmente un anticuerpo m onoclonal o fra gmento del m ismo, mas pr eferentemente un anticuerpo huma no, h umanizado o quimerico o un fragmento del mismo.

En un as pecto adic ional, la memoria d escriptiva d ivulga un pr ocedimiento p ara a umentar l a efi cacia d e un tratamiento de anticuerpo terapeutico en un sujeto, comprendiendo el procedimiento administrar al sujeto antes de, simultaneamente o despues de la administracion del anticuerpo terapeutico, una cantidad eficaz de un compuesto, tal com o u n anticuerpo o un fra gmento de l mism o, que bloquea el r eceptor i nhibidor d e u na ce lula NK suficientemente para aumentar la eficacia del anticuerpo terapeutico. El anticuerpo terapeutico puede estar unido por CD16, preferentemente a traves de su region Fc. Preferentemente, el anticuerpo terapeutico tiene una parte Fc de IgG1 o IgG3 huma na, particularmente un anticuerpo monoclonal, mas preferentemente un anticuerpo humano, humanizado o quimerico.

Dentro del contexto de la presente invencion, un sujeto o paciente incluye cualquier sujeto o paciente mamifero, mas preferentemente un sujeto o paciente humano.

Mas especificamente, la memoria descriptiva divulga procedimientos de tratamiento de un sujeto en los cuales un compuesto, tal como un anticuerpo o un fragmento del mismo, que bloquea el receptor inhibidor de una celula NK se coadministra con el anticuerpo terapeutico al sujeto. La memoria descriptiva divulga la coadministracion con los anticuerpos terapeuticos dirigidos especificamente frente a infeccion viral.

La m emoria d escriptiva d ivulga una com posicion farm aceutica qu e c omprende un a nticuerpo ter apeutico y un compuesto, tal como un anticuerpo o un fragmento del mismo, que bloquea al receptor inhibidor de una celula NK. La memoria descriptiva tambien divulga un kit que comprende un anticuerpo terapeutico frente a celulas infectadas por virus yun compuesto, tal como un antic uerpo o un fragmento del mismo, que bloquea el receptor inhibidor de una celula NK.

La memoria descriptiva divulga el uso de un compuesto, tal como un anticuerpo o un fragmento del mismo, que bloquea el receptor inhibidor de una celula NK para aumentar la eficacia de un tratamiento con un anticuerpo terapeutico dirigido frente a celulas infectadas por v irus o p ara aumentar ADCC e n un s ujeto som etido a un tratamiento con un anticuerpo terapeutico.

La memoria descriptiva tambien divulga el uso de un compuesto, tal como un anticuerpo o un fragmento del mismo, que bloquea el receptor inhibidor de una celula NK y de un anticuerpo terapeutico para la preparacion de un farmaco para tratar una enfermedad. Mas particularmente, el tratamiento de una enfermedad requiere el agotamiento de las celulas a las que se dirige y la enfermedad es infeccion viral.

En un aspecto particular, la memoria descriptiva divulga un procedimiento de tratamiento de un sujeto que lo necesita que comprende:

a) administrar al sujeto un compuesto, tal como un anticuerpo o un fragmento del mismo, que bloquea al receptor inhibidor de una celula NK; y b) administrar al sujeto un anticuerpo terapeutico que es especifico para infeccion por VIH.

El anticuerpo terapeutico es capaz de formar un complejo inmune. Preferentemente, el anticuerpo terapeutico se puede unir por el receptor CD16 presente en celulas NK, preferentemente a traves de su region Fc. En un aspecto preferido, el a nticuerpo tera peutico tien e una p arte F c de IgG1 o IgG3 huma na o de primat e no huma no. Preferentemente, el anticuerpo terapeutico es un anticuerpo monoclonal o un fragmento o un derivado del mismo, mas preferentemente un anticuerpo humanizado, humano o quimerico o un fragmento del mismo.

Las celulasNK conservan CD16, el receptor de afinidad baja de IgG. La union simultanea de IgG a un antigeno en una celula diana y de CD16 en celula NK, da como resultado la activacion de las celulas NK yla destruccion de la diana unida por el anticuerpo. La coadministracion de mAb anti-KIR junto con mAb especificos para receptores diana infectados por VIH, tales c omo un mAb anti-CD4, potenciara la ADCC mediada por NK. Los mAb anti-CD4 ilustrativos p ara su uso en la pr esente i nvencion incluyen, p ero s in limitacion, trx I (T olerRx) y HuMax CD4 (Genmab). 0tros mAb d e CD4 se pueden producir de acuerdo con procedimientos conocidos en la tecnica u obtenerse a partir de fuentes comerciales.

En un aspecto de la divulgacion, los mAb terapeuticos preferidos especificos para antigenos en celulas infectadas por VIH incluyen mAb especificos para moleculas de superficie en celulas T o especificos para ligandos que estan codificados por el virus de VIH yexpresados selectivamente en celulas infectadas. Tales mAb terapeuticos pueden ser especificos para moleculas de superficie tales como: CD3, CD28, CD4, CCR5, gp120, gp41. Los mAb anti-CD3, CD28, CD4, CCR5, gp120 y gp41 ilustrativos para su uso en la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, trx4 (TolerRx), anticuerpo anti-HIV-1 gp120 descrito en Science, 1994, vol 266, pags. 1024-1027; y anticuerpo anti HIV-1 gp 41 descrito en AIDS Res Hum Retroviruses 1994, vol 10, pags. 1651-1658. 0tros anticuerpos adecuados se pueden producir de acuerdo con procedimientos conocidos en la tecnica u obtenerse a partir de fuentes comerciales.

En otro aspecto de la divulgacion los anticuerpos terapeuticos preferidos no incluyen aquellos que son especificos para antigenos codific ados por otros v irus. Estos vir us inc luyen VSR (Virus s incitial R espiratorio), CM V (Citomegalovirus), virus de Ebola, virus de Hepatitis A, virus de Hepatitis B, virus de Hepatitis C, virus de Epstein-Barr, virus de varicela zoster (VVZ), virus Hantaan, virus de influenza, virus de Herpes simple (VHS), virus de herpes Humano 6 (VHH-6), virus de herpes humano 8 (VHH-8), virus de papiloma Humano y Parvovirus.

En otro aspecto de la divulgacion los anticuerpos terapeuticos preferidos incluyen aquellos que son especificos para antigenos celulares expresados por celulas infectadas por virus. Para VHC estos incluyen anticuerpos que son especificos para antigenos celulares expresados por celulas hepaticas infectadas. La proteina FyG de VSR, la proteinaE1 y E2 deVHC, los antigenos gp1 y gp2 devirus Ebola, la proteina L1 de virus de papiloma humano (VPH).

En u n as pecto, la m emoria descri ptiva di vulga u n pr ocedimiento par a tratar VIH ( Virus d e Inm unodeficiencia Humana), VSR (Virus sincitial Respiratorio), CMV (Citomegalovirus), virus de Ebola, virus de Hepatitis A, virus de Hepatitis B, virus de Hepatitis C, virus de Epstein-Barr, virus de varicela zoster (VVZ), virus Hantaan, virus de influenza, virus de Herpes simple (VHS), virus de herpes Humano 6 (VHH-6), virusde herpes humano 8 (VHH-8), virus de papiloma Humano y Parvovirus, que comprendeadministrar a un paciente que lo necesita una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo o un fragmento del mismo, que bloquea el receptor inhibidor de una celula NK.

En un asp ecto, el proce dimiento p ara tratar una e nfermedad viral ca usada p or uno de los virus menci onados anteriormente comprende administrar al mismo paciente una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente antiviral

adicional. Los ejemplos de tales agentes son

Frente a infeccion por Herpes simple, virus de varicela zoster (VVZ): Aciclovir, famciclovir, valaciclovir, penciclovir.

Frente a infeccion por CMV: Ganciclovir, valganciclovir.

Frente a infeccion por retrovirus (por ejemplo VIH-1): Lamivudina, zidovudina, emtricitabina, abacavir, tenofovir, didanosina, es tavudina, efavirenz, n evirapina, am prenavir, indi navir, s aquinavir, rito navir, l opinavir, atazan avir, nelfinavir, enfuvirtida.

Frente a infeccion por virus de influenza: 0seltamivir.

Frente a infeccion por hepatitis B cronica: Adefovir, lamivudina

Frente a infeccion por virus de hepatitis C cronica: Ribavirina, interferon-alfa, interferon alfa pegilado.

En un aspecto, el paciente se ha tratado con HAART antes de la administracion de un anticuerpo que bloquea un receptor inhibidor de una celula NK. La terapia HAART consiste en un coctel de farmacos antivirales. Las clases incluyen, por ejem plo, inhibidores de transcriptasa inve rsa an alogos de los nucleosidos (N RTI), inhibi dores n o nucleosidicos de la transcriptasa inversa (NNRTI) e inhibidores de proteasa (IP). Habitualmente 2 a 4 farmacos de preferentemente mas de una clase se combinan para reducir la carga viral hasta niveles casi no detectables. Las terapias HAART con frecuencia son combinaciones o "cocteles" de dos o mas agentes antirretrovirales. R. M. Gulick, "Current antiretroviral therapy: an overview", Qual. Life Res. 6: 471-474 (1997); K. Henry y col., "Antiretroviral therapy for HIV infection. Heartening Successes mixed with continuing challenges", Postgrad. Med. 102: 100-107 (1997); C.

B. Hicks, "Update on antiretroviral therapy", Radiol. Clin. North Am. 35: 995-1005 (1997); R. H. Goldschmidt, "Antiretroviral drug treatment for HIV1AIDS", Am. Fam. Physician, 54: 574-580 (1996). Los farmacos usados en regimenes HAART inclu yen los a nalogos nucl eosidicos de AZ T, estavudina (d4T ) y 3T C; n evirapina (un inhib idor no nucleosidico de transcriptasa inversa, que se puede abreviar NVP) e inhibidores de proteasa tales como RTV, SQV, IDV y nelfinavir. La HAART que usa estos tratamientos puede reducir las cargas en plasma de virus de VIH activo en pacientes pos itivos a VIH-1 hasta c antidades no d etectables (por de bajo de apr oximadamente 5 0 copi as1ml), aparentemente sin el peligro de desarrollar cepas resistentes de VIH. M. Balter, "HIV Survives Dru g 0nslaught by Hiding 0ut in T Cells," Science 278: 1227 (Nov. 14, 1997). Los productos HAART, los programas de dosificacion y los efectos secundarios comunes tambien se proporcionan en las Tablas I a III adjuntas de la publicacion de solicitud de patente de los Estados 20050191702.

En una realizacion de la invencion la induccion de respuesta de ADCC es mediante proteinas de fusion de Fc receptoras, en las que la parte Fc se une a CD16 y el receptor se une a un ligando en las celulas T. Este ligando podria ser una proteina CD-2-Fc que se une a LFA-3 en celulas T.

Preferentemente, el compuesto, tal como un anticuerpo o un fragmento del mismo, que bloquea el receptor inhibidor de una celula NK se une a al menos uno de los receptores humanos KIR o CD94 o NKG2A1C e inhibe la inhibicion mediada p or KIR2DL, KIR3 DL y1o NKG2 A1C relacio nada de citoto xicidad de cel ulas NK. Preferenteme nte, el receptor humano KIR2DL se selecciona entre el grupo que consiste en receptores humanos KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 y el receptor humano KIR3DL se selecciona entre el grupo que consiste en KIR3DL1 y KIR3DL2. En un aspecto preferido, el compuesto, tal como un anticuerpo o un fragmento del mismo, que bloquea el receptor inhibidor de una celula NK se une a un determinante comun de dos o mas receptores humanos de KIR2DL yevita la inhibicion mediada por KIR2DL de citotoxicidad de celulas NK. Mas preferentemente, el anticuerpo se une a un determinante comun d e rec eptores h umanos KIR2D L1, KI R2DL2, KI R2DL3 y evita la in hibicion media da p or KIR2DL1-, KIR2DL2-, KIR2DL3 de citotoxicidad de celulas NK. En un aspecto particular, el compuesto, tal como un anticuerpo o un fragmento del mismo, que bloquea el receptor inhibidor de una celula NK inhibe la union de una molecula alelica de HLA-C que tiene un resto Lys en la posicion 80 a un receptor de KIR2DL2 humano y la union de una molecula alelica de HLA-C que tiene un resto Asn en la posicion 80 a receptores KIR2DL2 y KIR2DL3 humanos. En otro aspecto particular, el anticuerpo o un fragmento del mismo que bloquea el receptor inhibidor de una celula NK se un e al mismo e pitopo q ue el anticuerpo m onoclonal DF 200 pro ducido por el h ibridoma DF 200. 0pcionalmente, este anticuerpo o un fragmento del mismo, compite con el anticuerpo monoclonal DF200 producido mediante el hibridoma DF200 por la union a un receptor KIR en la superficie de una celula NK humana. En un aspecto preferido, este anticuerpo es anticuerpo monoclonal DF200 producido por el hibridoma DF200. El hibridoma que produce el anticuerpo DF200, N° C NCM I-3224, r egistrado el 10 de junio de 2004, Coleccion Nacional de Cultivos de Microorganismos, Instituto Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15, Francia.

En otro aspecto particular, el anticuerpo o un fragmento del mismo que bloquea el receptor inhibidor de una celula NK se une al mismo epitopo que un anticuerpo monoclonal 1-7F9, un anticuerpo monoclonal humano que se une a KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3 y reduce o bloquea la inhibicion de citotoxicidad de celulas NK mediada por KIR, como se describe, por ejemplo, en el documento W02005003168. Las secuencias VH y VL de 1-7F9 se describen en SEC ID N°: 1 y 2, respectivamente. 0pcionalmente, el anticuerpo o fragmento del mismo compite con 1-7F9 (es decir, un anticuerpo que comprende las secuencias de cadena pesada (H) y ligera (L) de 1-7F9), por la union a un receptor de KIR en la su perficie de una celula NK humana. En un aspecto preferido, este anticuerpo es 1-7F9, es decir, un anticuerpo monoclonal que comprende las secuencias H y L de 1-7F9.

En un aspecto preferido, el anticuerpo o un fragmento del mismo que bloquea el receptor inhibidor de una celula NK es un anticuerpo monoclonal, un fragmento o un derivado del mismo. Mas preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpohumanizado, humano o quimerico o un fragmento del mismo. El fragmento o un derivado del mismo preferentemente se selecciona entre un fragmento Fab, un fragmento Fab'2, una CDR y un ScFv.

Anticuerpo terapéutico

Dentro del contexto de la presente memoria descriptiva, el termino "anticuerpo o anticuerpos terapeuticos" designan mas especificamente cualquier anticuerpo que funciona para agotar celulas diana en un paciente. Los ejemplos especificos de tales celulas diana incluyen celulas tumorales, celulas infectadas por virus, celulas alogenicas, celulas inmunocompetentes patologicas (por ejemplo, linfocitos B, linfocitos T, celulas presentadoras de antigeno, etc.) implicadas e n aler gias, enfermedades au toinmunes, re acciones alogenicas, etc. o incl uso c elulas san as (p or ejemplo, celulas endoteliales en una estrategia terapeutica antiangiogenica). Las celulas diana mas preferidas dentro del co ntexto d e la pres ente divul gacion s on cel ulas tu morales y cel ulas i nfectadas por virus. Los anticu erpos terapeuticos pueden, p or ej emplo, m ediar un efect o cit otoxico o u na lisis ce lular, particu larmente medi ante citotoxicidad mediada por celula dependiente de anticuerpo (ADCC). La ADCC requiere receptores de leucocitos para la parte Fc de IgG (F cyR) cuya funcion es unir los antigenos sensibilizados a IgG a celulas citotoxicas que portan FcyR y desencadenar la maquinaria de activacion celular. Por lo tanto, el anticuerpo terapeutico es capaz de formar un complejo inmune. Por ejemplo, un complejo inmune puede ser una diana tumoral (es decir, celulas) cubierta por l os anticu erpos terapeutic os. Mas particu larmente, el a nticuerpo p uede estar un ido por CD 16, preferentemente a traves de su region Fc. Los anticuerpos terapeuticos pueden ser policlonales o, preferentemente, monoclonales. Los mismos tambien se pueden producir mediante hibridomas o mediante celulas recombinantes sometidas a ingenieria genetica para expresar los dominios variable y constante deseados. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos de cadena unica u otros derivados de anticuerpo que conservan la especificidad de antigeno y la region de bisagra inferior o una variante de los mismos. Estos pueden ser anticuerpos polifuncionales, anticuerpos recombinantes, anticuerpos humanizados, fragmentos o variantes de los mismos. El fragmento o un derivado del mismo preferentemente se selecciona entre un fragmento Fab, un fra gmento Fab'2, una CDR y un ScFv. Los anticuerpos terapeuticos son especificos para antigenos de superficie, por ejemplo, antigenos de membrana. En la presente memoria descriptiva, los a ntigenos de m embrana preferidos son aquellos que se expresan en celulas infectadas por VIH. Estos in cluyen CD4, CD3 y CD28. Los anticuerpos terapeuticospreferentemente tienen una parte Fc de IgG1 o IgG3 humana o de primate no humano, mas preferentemente IgG1 humana.

Anticuerpo que regula células NK

La actividad de celulas NK esta regulada por un mecanismo complejo que implica senales tanto estimulantes como inhibidoras. Por consiguiente, la terapia mediada por celula NK eficaz se puede conseguir tanto mediante una estimulacion de estas celulas como mediante una neutralizacion de senales inhibidoras.

Las c elulas NK estan reg uladas ne gativamente por r eceptores in hibidores es pecificos d el c omplejo ma yor d e histocompatibilidad (CMH) de clase I (Karre y col., 1986; Ohlen y col, 1989). Estos receptores especificos se unen a determinantes polimorficos de moleculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) de clase I o HLA e inhiben la lisis de celulas asesinas naturales (NK). En s eres humanos, una familia de receptores denominados receptores similares a Ig de celulas asesinas (KIR) reconoce grupos de alelos HLA de clase I.

Existen varios grupos de receptores de KIR, incluyendo KIR2DL, KIR2DS, KIR3DL y KIR3DS. Los receptores de KIR que tienen dos dominios de Ig (KIR2D) identifican alotipos HLA-C: KIR2DL2 (denominado anteriormente p58.1) o el producto genico relacionado de forma cercana KIR2DL3 reconoce un epitopo compartido con los alotipos HLA-C de grupo 2 (Cw1, 3, 7 y 8), mientras que KIR2DL1 (p58.2) reconoce un epitopo compartido por los alotipos HLA-C de grupo 1 reciprocos (Cw2, 4, 5 y 6). El reconocimiento por KIR2DL1 esta determinado por la presencia de un resto Lys en la posicion 80 de alelos HLA-C. El reconocimiento de KIR2DL2 y KIR2DL3 esta determinado por la presencia de un resto Asn en la posicion 80. De forma importante, la gran mayoria de los alelos HLA-C tiene un resto Asn o un resto Lys en la posicion 80. Un KIR con tres dominios de Ig, KIR3DL1 (p70), reconoce un epitopo compartido por los alelos HLA-Bw4. Finalmente, un homodimero de moleculas con tres dominios de Ig KIR3DL2 (p140) reconoce HLA-A3 y -A11.

Aunque los KIR y otros receptores inhibidores de clase I (Moretta y col, 1997; Valiante y col, 1997; Lanier, 1998) se pueden coexpresar por celulas NK, en el repertorio de NK de cualquier individuo dado, existen celulas que expresan un KIR unicoy por tanto, las celulas NK correspondientesestan bloqueadas unicamente por celulas que expresan un grupo alelico de clase I especifico.

En la presente divulgacion, la expresion "un compuesto o compuestos, preferentemente anticuerpo o anticuerpos o un fragmento de los mismo s, que bloquea o bloquean el receptor inhibidor de una celula NK" se refiere a u n compuesto, tal como un anticuerpo o un fragmento del mismo, especifico para al menos un receptor inhibidor de celulas NK, es decir KIR o NKG2A1C de celulas NK y senales inhibidoras neutralizantes de KIR o NKG2A1C . Preferentemente, el com puesto, tal como un anticuerpo o un fra gmento de l mi smo, e s ca paz de b loquear la interaccion entre HLA y un receptor inhibidor de un a celula NK. L os antic uerpos pueden ser p oliclonales o, preferentemente, mon oclonales. Los mism os se pu eden producir por hibridomas o por c elulas r ecombinantes

sometidas a ingenieria genetica para expresar los dominios variable y constante deseados. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos de cadena unica u otros derivados de anticuerpo que conservan la especificidad de antigeno y la region de bisagra inferior o una variante de los mismos tal como un fragmento Fab, un fragmento Fab'2, una CDR y un ScFv. Estos pueden ser anticuerpos polifuncionales, anticuerpos recombinantes, anticuerpos humanizados o variantes de los mismos.

Preferentemente, el compuesto, tal como un anticuerpo o un fragmento del mismo, que bloquea el receptor inhibidor de una celula NK es un compuesto, tal como un anticuerpo o un fragmento del mismo, que neutraliza la senal inhibidora de al menos un receptor inhibidor seleccionado entre el grupo que consiste en KIR2DL2, KIR2DL 3, KIR2DL1, KIR3DL1, KIR3DL2, NKG2A y NKG2C. Mas preferentemente, el compuesto, tal como un anticuerpo o un fragmento del mismo, que bloquea el receptor inhibidor de una celula NK es un compuesto, tal como un anticuerpo o un fragmento del mismo, que neutraliza la senal inhibidora de KIR2DL2, KIR2DL3 y1o KIR2DL1.

La divulgacion tambien contempla el uso de una combinacion de varios compuestos, preferentemente anticuerpos o un fragmento de los mismos, que bloquean receptores inhibidores diferentes de celulas NK. Preferentemente, los compuestos, preferentemente anticuerpos o un fragmento de los mismos, que bloquean receptores inhibidores de celulas NK son especificos de un receptor inhibidor seleccionado entre KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1, KIR3DL2, NKG2A y NKG2C y son capaces de inhibir la inhibicion mediada por KIR- o NKG2A1C re lacionada de citotoxicidad de celulas NK. Por ejemplo, los compuestos que bloquean los receptores inhibidores de celulas NK pueden comprender un anticuerpo que tiene especificidad por KIR2DL1 y otro que tiene especificidad por KIR2DL2 y1o KIR2DL3. Mas preferentemente, la combinacion de compuestos que bloquean receptores inhibidores de celulas NK es capaz de inhibir la inhibicion mediada por KIR2DL1-, KIR2DL2- y KIR2DL3 de citotoxicidad de celulas NK.

Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales especificos para KIR2DL1 han demostrado bloquear las interacciones entre KIR2DL1 y alotipos HLA-Cw4, asi como tambien alotipos HLA-C similares que pertenecen al mismo grupo que Cw4 (Moretta y col., J Exp Med. 1993; 178(2): 597-604;). En otro ejem plo, tambien se han descrito anticuerpos monoclonales frente a KIR2DL213 que bloquean las interacciones de KIR2DL213 con alotipos HLACw3 (o similares) (Moretta y c ol., 1993, menc ionado anteriormente). Los anticuerpos anti-NKG2A h an dem ostrado blo quear l a interaccion inhibidora entre NKG2A y HLA-E.

0pcionalmente, el anticu erpo se pu ede seleccionar e ntre el gr upo que co nsiste en GL1 83 ( especifico de KIR2DL2131S2 disponible en Immunotech, Francia and Beckton Dickinson, EE.UU.); EB6 (especifico de KIR2DL11s1, disponible en Immunotech, Francia and Beckton Dickinson, EE.UU.); AZ138 (especifico de KIR3DL1, disponible en Moretta y col, Univ. Gen ova, Italia); Q66 (especifico d e KIR3D L2, d isponible e n Immunotec h, F rancia); Z 270 (especifico de NKG2A, disponible en Immunotech, Francia); P25 (especifico de NKG2A1C, disponible en Moretta y col, Univ. Genova, Italia); y DX9, Z27 (especifico de KIR3DL1, disponible en Immunotech, Francia and Beckton Dickinson, EE.UU.).

En un aspecto preferido, la divulgacion usa anticuerpos monoclonales, asi como tambien fragmentos y derivados de los mismos, en los que el anticuerpo, fragmento o derivado reacciona de forma cruzada con varios receptores de KIR o NKG2A 1C en l a su perficie d e cel ulas NK y neutraliza sus s enales i nhibidoras. Mas prefer entemente, l a divulgacion usa un anticuerpo monoclonal que se une a un determinante comun de receptores KIR2DL humanos e inhibe la ruta inhibidora correspondiente. Mas especificamente, la invencion usa un anticuerpo monoclonal que se une a los receptores KIR2DL1 y KIR2DL213 en la superficie de celulas NK humanas e inhibe la inhibicion mediada por KIR2D L1-y KIR2D L213 de citoto xicidad d e cel ulas NK. El antic uerpo in hibe especificamente la u nion d e moleculas de HLA-C a receptores KIR2DL1 y KIR2DL213. Mas preferentemente, el anticuerpo facilita la actividad de celulas NK in vivo.

Debido a que KIR2DL1 y KIR2DL3 (o KIR2DL2) pueden formar un complejo molecular con la mayoria de los alotipos HLA-C, respectivamente alotipos HLA-C de grupo 1 y alotipos HLA-C de grupo 2, los anticuerpos frente a KIR2DL1 y KIR2DL3 se pueden usar para aumentar la eficacia de un anticuerpo terapeutico en la mayoria de los individuos humanos, tipicamente en aproximadamente el 90% de los individuos humanos o mas.

En un aspecto particular de la presente divulgacion, el anticuerpo que bloquea el receptor inhibidor de una celula NK es un anticuerpo monoclonal, en el que e l anticuerpo se une a un d eterminante comun de receptores humanos KIR2DL e in hibe la in hibicion med iada por KIR2DL de citotoxici dad d e celu las NK. El anticuer po mas especificamente se une al mismo epitopo que el anticuerpo monoclonal DF200 producido por el hibridoma DF200 y1o compite con anticuerpo monoclonal DF200 producido por el hibridoma DF200 por la union a un receptor KIR en la superficie de una celula NK humana.

En un aspecto especifico, el anticuerpo monoclonal es anticuerpo monoclonal DF200 producido por el hibridoma DF200.

Dentro del contexto de l a presente divulgacion un "d eterminante comun" designa un determinante antigenico o epitopo que se comparte por varios miembros del grupo de receptor KIR2DL humano. El determinante o epitopo puede representar un fragmento peptidico o un epitopo conformacional compartido por los miembros. En un aspecto especifico, el determinante comun comprende un epitopo reconocido por el anticuerpo monoclonal DF200.

Dentro del contexto de la presente divulgacion, el termino anticuerpo que se "une" a un determinante comun designa un anticuerpo que se une al determinante con especificidad y1o afinidad, por ejemplo, que basicamente noseune con afinidad o especificidad elevada a otros motivos o determinantes o estructuras no relacionados en la superficie de celulas NK humanas. Mas particularmente, la union de un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente divulgacion al determinante se puede diferenciar de la union del anticuerpo a otro epitopo o determinante.

Estos compue stos, preferen temente anticuerpos, son por tanto co mpuestos "n eutralizantes" o "inhib idores", preferentemente anticu erpos, en el se ntido de q ue los mi smos blo quean, al men os parci almente, la ruta de senalizacion inhibidora mediada por un receptor inhibidor de celulas NK, es decir, receptores KIR o NKG2A1C. Mas importante, esta actividad inhibidora se puede mostrar con respecto a varios tipos de receptores KIR o NKG2A1C, de forma qu e est os comp uestos, preferent emente a nticuerpos, se p ueden usar en diversos su jetos con efic acia elevada. La inhibicion de la inhibicion mediada por KIR o NKG2A1C de citotoxicidad de celulas NK se puede evaluar mediante diversos ensayos o pruebas, tales como ensayos de union o celulares. En un aspecto especifico, la actividad inhibidora se ilustra mediante la capacidad del compuesto, tal como un anticuerpo, de reconstituir la lisis de clones de NK positivos a KIR o NKG2A1C, respectivamente, en dianas positivas a HLA-C o HLA-E. En otro aspecto especifico, se define el compuesto, tal como un anticuerpo, como que inhibe la union de moleculas de HLA-C a receptores KIR2DL1 y KIR2DL3 (o el relacionado de forma cercana KIR2DL2), ademas preferentemente como su capacidad de alterar:

la union de una molecula de HLA-C seleccionada entre Cw1, Cw3, Cw7 y Cw8 (o de una molecula de HLAc que tiene un resto Asn en la posicion 80) a KIR2DL213; y la union de una molecula de HLA-C seleccionada entre Cw2, Cw4, Cw5 y Cw6 (o de una molecula de HLAc que tiene un resto Lys en la posicion 80) a KIR2DL1.

En otro aspecto, la actividad inhibidora de un compuesto de la presente invencion, tal como un anticuerpo, se puede evaluar en un ensayo de citotoxicidad basado en celulas, como se divulga en los ejemplos.

En otro aspecto, la actividad inhibidora de un compuesto de la presente invencion, tal como un anticuerpo, se puede evaluar en un ensayo de liberacion de citoquina.

Los compuestos de la presente invencion, preferentemente anticuerpos, pueden mostrar actividad inhibidora parcial, por ejem plo, reduc en parc ialmente la inhibicion mediada por KIR 2DL de c itotoxicidad de c elulas NK. L os compuestos mas preferidos son capaces de inhibir al menos el 20%, preferentemente al menos el 30%, el 40% o el 50% o mas de la inhibicion mediada por KIR o NKG 2A1C de toxicidad de celulas NK, preferentemente de la inhibicion mediada por KIR2DL de citotoxicidad de celulas NK. Como alternativa, los compuestos preferidos de la presente divulgacion, preferentemente anticuerpos, son capaces de inducir la lisis de poblacion de celulas diana coincidentes o compatibles con HLA o aut ologas, esdecir, poblacioncelular que no se lisaria eficazmente por celulas NK en ausencia del anticuerpo. Por consiguiente, los compuestos de la presente divulgacion tambien se pueden definir como que facilitan la actividad de celulas NK in vivo.

La invencion tambien contempla realizaciones en las cuales los compuestos que bloquean el receptor inhibidor de una celula NK son fragmentos y derivados de un antic uerpo monoclonal de este tipo que tiene sustancialmente la misma especificidad de antigeno, incluyendo, sin limitacion, un fragmento Fab, un fragmento Fab'2, una CDR y un ScFv. Adicionalmente, el anticuerpo monoclonal puede ser humanizado, humano o quimerico (por ejemplo, un anticuerpo biespecifico o funcionalizado).

Los anticuerpos que bloquean el receptor inhibidor de una celula NK de acuerdo con la invencion se pueden producir mediante una diversidad de tecnicas conocidas per se en la tecnica. Tipicamente, los mismos se producen mediante inmunizacion de u n anim al no hum ano con un inmunogeno q ue co mprende p olipeptido KIR o NKG2A1C y recoleccion de celulas del bazo (para producir hibridomas mediante fusion con lineas celulares apropiadas). Los procedimientos para produccion de anticuerpos monoclonales a partir de diversas especies se pueden encontrar en Harlow y co l (Antibo dies: A lab oratory Ma nual, CSH Press, 1988). Mas especifica mente, estos proce dimientos comprenden inmunizar a un animal no humano con el antigeno, seguido por una recuperacion de celulas del bazo que despues se fusionan con celulas inmortalizadas, tales como celulas de mieloma. Los hibridomas resultantes producen los anticuerpos monoclonales yse pueden seleccionar mediante diluciones limitantes para aislar clones individuales. L os a nticuerpos tambie n s e pueden pr oducir med iante s eleccion de bi bliotecas c ombinatorias d e inmunoglobulinas, como se divulga por ejemplo en Ward y col (1989).

Los anticuerpos preferidos que bloquean el receptor inhibidor de una celula NK de acuerdo con la invencion se preparan mediante inmunizacion con un inmunogeno que comprende un polipeptido KIR2DL, mas preferentemente un polipeptido KIR2DL humano. El polipeptido KIR2DL puede comprender la secuencia de longitud completa de un polipeptido KIR2DL humano o un fragmento o un derivado del mismo, tipicamente un fragmento inmunogenico, es decir, una parte del polipeptido que comprende un epitopo, preferentemente un epitopo de celula T o B. Tales fragmentos tipicamente contienen al menos 7 aminoacidos consecutivos de la secuencia de polipeptido maduro, incluso mas p referentemente al menos 1 0 amino acidos c onsecutivos de la mism a. Los mismos se obtien en basicamente a partir del dominio extracelular del receptor.

En un aspecto mas preferido, el inmunogeno comprende un polipeptido KIR2DL humano de tipo silvestre en una membrana lipidica, tipicamente en la superficie de una celula. En un aspecto especifico, el inmunogeno comprende celulas NK intactas, particularmente celulas NK humanas intactas, opcionalmente tratadas o lisadas.

Los anticuerpos que bloquean los receptores KIR2DL decelulas NK se pueden producir por procedimientos que comprenden:

inmunizacion de un mamifero no humano con un inmunogeno que comprende un polipeptido KIR2DL; preparacion d e anticu erpos monocl onales a partir del anim al inm unizado, e n el q ue los anticuerpos monoclonales se unen al polipeptido KIR2DL, seleccion de anticuerpos monoclonales de (b) que reaccionan de forma cruzada con al menos dos serotipos diferentes de polipeptidos KIR2DL, y seleccion de anticuerpos monoclonales de (c) que inhiben la inhibicion mediada por KIR2DL de celulas NK.

El orden de las etapas (c) y (d) se puede cambiar. 0pcionalmente, el procedimiento puede comprender ademas etapas adicionales para preparar fragmentos o derivados del anticuerpo monoclonal, como se divulga mas adelante. En un aspecto preferido, el animal no humano es un mamifero, tal como un roedor (por ejemplo, raton, rata, etc.), bovino, porcino, caballo, conejo, cabra, oveja, etc. Tambien, el mamifero no humano puede modificarse o someterse a ingenieria genetica para producir anticuerpos "humanos".

En otro aspecto, el procedimiento comprende:

seleccion, a partir de una biblioteca o repertorio, de un anticuerpo monoclonal o un fragmento o derivado del mismo que reacciona de forma cruzada con al menos dos serotipos diferentes de polipeptidos KIR2DL, y seleccion de un anticuerpo de (a) que inhibe la inhibicion mediada por KIR2DL de celulas NK.

El repertorio puede ser cualquier repertorio (recombinante) de anticuerpos o fragmentos de los mismos, presentado opcionalmente por cualquier estructura adecuada (por ejemplo, fago, bacteria, complejo sintetico, etc.). La seleccion de anticuerpos inhibidores se puede realizar como se ha divulgado anteriormente e ilustrado adicionalmente en los ejemplos.

Procedimientos similares se pueden usar para la preparacion de anticuerpos que bloquean un KIR3DL o un receptor NKG2A1C de celulas NK.

Competición con anticuerpos de reacción cruzada y/o neutralizantes

En otro aspecto, la memoria descriptiva divulga anticuerpos que bloquean el receptor inhibidor de una celula NK caracterizado por la capacidad de competir con anticuerpos de reaccion cruzada y1o neutralizantes que bloquean el receptor inhibidor de una celula NK de acuerdo con la invencion para union a KIR afinesy1o para union a la misma region de determinante antigenico1epitopo que tales anticuerpos conocidos, para su uso en los procedimientos de la invencion. Por ejemplo, en un aspecto, la memoria descriptiva divulga un anticuerpo anti-KIR caracterizado por su capacidad de competir con anticuerpo NKVSF1, 1-7F9 y1o anticuerpo DF200.

La expresion "compite con" cuando se refiere a un anticuerpo monoclonal particular (por ejemplo, DF200, NKVSF1, etc.) significa que el anticuerpo Anti-KIR compite con el anticuerpo al que se hace referencia u otra molecula en un ensayo de union usando cualquier molecula de KIR recombinante o moleculas de KIR expresadas en la superficie. Por ejemplo, si un antic uerpo anti-KIR reduce de forma detectable la union de DF200 a una molecula de KIR normalmente unida por DF200 en un ensayo de union, el anticuerpo anti-KIR se puede decir que "compite" con DF200. U n a nticuerpo a nti-KIR que "c ompite" con DF 200 pue de c ompetir con DF 200 por l a u nion al rec eptor humano KIR2DL1, el receptor humano KIR2DL213 o los receptores humanos tanto KIR2DL1 como KIR2DL213.

Los anticuerpos que compiten con DF200, 1-7F9 y1o NKVSF1 se pueden identificar usando ensayos de exploracion conocidos. Varios de tales ensayos se practican de forma rutinaria yse conocen bien en la tecnica (por ejemplo, vease, la P atente d e Est ados Un idos N° 5.6 60.827). Los protocolos en base a, por eje mplo, ELISA, radioinmunoensayos, transferencia de Western yel uso de analisis BIAC0RE son adecuados para su uso en tales estudios de competicion.

Se puede, por ejemplo, premezclar el anticuerpo de control (por ejemplo, DF200, NKVSF1 o 1-7F9) con cantidades variables d el anticuerpo d e ens ayo (por ej emplo, e n pr oporciones de a proximadamente 1:1, 1:2, 1:10 o aproximadamente 1:100) durante un periodo de tiempo antes de aplicar a una muestra de antigeno de KIR. Como alternativa, el control y cantidades variables de anticuerpo de ensayo se pueden anadir sencillamente por separado y mezclarse durante la exposicion a la muestra de antigeno de KIR. Siempre y cuando se puedan diferenciar los anticuerpos unidos de los libres (por ejemplo, mediante el uso de tecn icas de separacion o lavado para eliminar anticuerpos no unidos) y el anticu erpo de control d el anticuerpo d e en sayo (por ejemplo, med iante el us o de anticuerpos secundarios especificos de especie o especificos de isotipo o marcando especificamente el anticuerpo de control con un marcador detectable) se puede ser capaz de determinar si el anticuerpo de ensayo reduce la union del anticuerpo de control a los antigenos de KIR2DL diferentes, indicando que el anticuerpo de ensayo reconoce

sustancialmente el mismo epitopo que el control. La union del anticuerpo de control (marcado) en presencia de un anticuerpo completamente irrelevante (que no se une a KIR) puede servir como el valor alto de control. El valor bajo de control se puede obtener incubando el anticuerpo de control marcado con el mismo anticuerpo de control pero no marcado, donde la competicion ocurriria yse reduciria la union del anticuerpo marcado. En un ensayo de prueba, una r educcion sign ificativa en re actividad de anticuerpo marcado en prese ncia d el antic uerpo de ens ayo es indicativa de un anticuerpo de ensayo que reconoce sustancialmente el mismo epitopo, es decir, uno que compite con el anticuerpo de c ontrol marcado. Po r ejemp lo, cu alquier a nticuerpo de ensayo que r educe la uni on del anticuerpo de control a uno o ambos de los antigenos de KIR2DL1 y KIR2DL3 en almenos aproximadamente el 50%, tal com o al m enos a proximadamente el 60% o mas prefer entemente al m enos e l 7 0% ( por e jemplo, aproximadamente 65-100%), a cualquier proporcion de anticuerpo de control: de ensayo entre aproximadamente 1:1

o 1:10 y aproximadamente 1:100 se considera que es un anticuerpo que compite con el control.

La competicion tambien se puede evaluar, por ejemplo, mediante citometria de flujo. En un ensayo de este tipo, las celulas que portan un KIR dado se pueden incubar en primer lugar con un anticuerpo de control y despues con el anticuerpo de ensayo marcado con un fluorocromo o biotina. El anticuerpo se dice que compite con el anticuerpo de control si la union obtenida tras la incubacion previa con una cantidadde saturacionde anticuerpo de control es aproximadamente el 8 0%, p referentemente apro ximadamente el 50%, aproximadamente el 4 0% o menos (p or ejemplo, aproximadamente el 30%) de la union (medida por medio de fluorescencia) obtenida mediante el anticuerpo de ensayo sin incubacion previa con anticuerpo de control. Como alternativa, se dice que un anticuerpo compite con el anticuerpo de control si la union obtenida con un anticuerpo control marcado (mediante un fluorocromo o biotina) en celulas incubadas previamente con cantidad de saturacion de anticuerpo de ensayo es aproximadamente el 80%, preferentemente aproximadamente el 50%, aproximadamente el 40% o menos (por ejemplo, aproximadamente el 30%) de la union obtenida sin incubacion previa con el anticuerpo de ensayo.

Un ensayode competicion sencillo en elcual un anticuerpo de ensayo se adsorbe previamentey se aplicaa concentracion de saturacion a una superficie sobre la cual se inmovilizan KIR2DL1 o KIR2DL213, o ambos, tambien se puede emplear de forma provechosa. La superficie en el ensayo de competicion sencilla es preferentemente una microplaca BIAC0RE (u otro medio adecuado para analisis de resonancia de plasmonsuperficial). La union de un anticuerpo de control a la superficie revestida con KIR se mide. Esta union a la superficie que contiene KIR del anticuerpo de control en solitario se compara con la union del anticuerpo de control en presenciadeunanticuerpo de ensayo. Una reduccion significativa en la union a la superficie que contiene KIR2DL1 y KIR2DL213 mediante el anticuerpo de control en pre sencia de un anticu erpo de ensa yo indica que el anticuerpo de ensa yo reconoce sustancialmente el mismo epitopo que el anticuerpo de control de forma que el anticuerpo de ensayo "compite" con el anticuerpo de control. Cualquier anticuerpo de ensayo que reduzca la union del anticuerpo de control a antigenos tanto de KIR2DL1 como KIR2DL213 en al menos aproximadamente el 20% o mas, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 70% o mas, se puede considerar que es un anticuerpo que compite con el anticuerpo de control. Preferentemente, tal anticuerpo de ensayo reducira la union del anticuerpo de control a cada uno de al menos los antigenos de KIR2DL1, 2 y 3 en al menos aproximadamente el 50% (por ejemplo, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70% o mas). Se apreciara que el orden de anticuerpos de control y de ensayo se puede invertir; es decir, el anticuerpo de control se puede unir en primer lugar a lasuperficie y despues el anticuerpo de ensayo se pone en contacto con la superficie a partir entonces en un ens ayo de competici on. Preferentemente, el anticu erpo que tie ne afinidad m as elev ada por antigenos de KIR2DL1 y KIR2DL213 se une a la superficie que contiene KIR2DL1 y KIR2DL213 en primer lugar, de forma que se esperara que la reduccion en la union observada para el segundo anticuerpo (asumiendo que los anticuerpos son competidores) sera de mayor magnitud. Los ejemplos adicionales de tales ensayos se proporcionan en los ejemplos del presente documento y en, por ejemplo, Saunal y Regenmortel, (1995) J. Immunol. Methods. 183: 33-41.

La determinacion de si un anticuerpo u otro agente se une a la misma o sustancialmente a la misma region de epitopo que, por ejemplo, DF200, NKVSF1 o 1-7F9, se puede llevar a cabo usando procedimientos conocidos por los expertos en la materia. En un ejemplo de procedimientos de cartografia1caracterizacion de epitopo, una region de epitopo para un anticuerpo anti-KIR se puede determinar mediante "huellas de epitopo" usando modificacion quimica de las aminas1carboxilos expuestos en la proteina de KIR2DL1 o KIR2DL213. Un ejemplo especifico de tal tecnica de huellaes el uso de HXMS(intercambio de hidrogeno-deuterio detectado mediante espectrometria de masa) en el que un ocurre intercambio de hidrogeno1deuterio de protones amida de proteina de receptor y ligando, union y de nuevo intercambio, en el que los grupos amida de la estructura principal que participan en la union de proteina estan protegidos del intercambio inverso y por lo tanto permaneceran deuterados. Las regiones pertinentes se p ueden identificar e n este p unto m ediante proteolisis pe ptica, se paracion por cr omatografia li quida de alto rendimiento ra pida microb ore y1o es pectrometria de m asas de i onizacion por el ectropulverizacion. Vease, por ejemplo, Ehring H, Analytical Biochemistry, Vol. 267 (2) pags. 252-259 (1999)y1o Engen, J.R. y Smith, D.L. (2001) Anal. Chem. 73, 256A-265A. 0tro ejemplo de una tecnica de identificacion de epitopo adecuada es la cartografia de epitopo de resonancia magnetica nuclear (RMN), donde se comparan tipicamente la posicion de las senales en espectros de RMN de dos dimensiones del antigeno libre yel antigeno en complejo con el peptido de union a antigeno, tal como un a nticuerpo. El antigeno tipicamente se marca isotopicamente selectivamente con 15N de forma que unicamente las senales correspondientes al antigeno y ninguna senal del peptido de union a antigeno se observen en el espectro de RMN. Las senales de antigeno que se originan a partir de aminoacidos implicados en la

interaccion con el peptido de union a antigeno tipicamentecambiaran de posicion en losespectros del complejo en comparacion con los espectros del antigeno libre y los aminoacidos implicados en la union se pueden identificar de esa manera. Veanse, por ejemplo, Ernst Schering Res Found Workshop. 2004; (44): 149-67; Huang y col, Journal of Molecular Biology, Vol. 281 (1) pags. 61-67 (1998); y Saito y Patterson, Methods. 1996 Jun; 9(3): 516-24.

La cartografia1caracterizacion de epitopo tambien se puede realizar usando procedimientos de espectrometria de masas. Veanse, por ejemplo, Downward, J Mass Spectrom. 2000 Apr; 35(4):493-503 y Kiselar y Downard, Anal Chem 1999 May 1; 71(9):1792-801.

Las tecnicas de digestion con proteasa tambien pueden ser utiles en el contexto de cartografia de identificacion de epitopo. Las regi ones1secuencias perti nentes de determinantes a ntigenicos s e p ueden determinar me diante digestion con proteasa, por ejemplo, usando tripsina en una proporcion de aproximadamente 1:50 a KIR2DL1 o KIR2DL213 o1n digestion a 37�C y pH 7-8, seguido por analisis de espectrometria de masas (EM) para identificacion de peptido. Los peptidos protegidos de la escision con tripsina mediante el anticuerpo anti-KIR se pueden identificar posteriormente mediante comparacion de muestras sometidas a digestion con tripsina y muestras incubadas con anticuerpo y despues sometidas a digestion mediante, por ejemplo, tripsina (revelando de ese modo una huella para el a nticuerpo). 0tras enzim as como trips ina, p epsina, etc., tambien o alter nativamente s e p ueden us ar e n procedimientos de caracterizacion de epitopo similares. Ademas, la digestion enzimatica puede proporcionar un procedimiento rapido para analizar si una secuencia de determinante antigenico potencial esta dentro de una region del KIR2DL1 en el contexto de un agente de union a KIR. Si el polipeptido no esta expuesto en superficie, lo mas probable es que no sea pertinente en terminos de un inmunogenicidad1antigenicidad. Vease, por ejemplo, Manca, Ann Ist Super Sanita. 1991; 27(1):15-9 para una discusion de tecnicas similares.

La mutagenesis dirigida es otra tecnica util para elucidacion de un epitopo de union. Por ejemplo, en "mutagenesis mediada por alanina", cada resto dentro de un segmento de proteina se reemplaza con un resto de alanina y se miden las consecuencias para la afinidad de union. Si la mutacion conduce a una r educcion significativa de la afinidad de union, esta mas prob ablemente implicado en la union. Los anticuerpos monoclonales especificos para epitopos estructurales (es decir, anticuerpos que no se unen a la proteina no plegada) se pueden usar para verificar que el reemplazo con alanina no influye sobre el plegamiento global de la proteina. Veanse, por ejemplo, Clackson y Wells, Science 1995; 267:383-386; y Wells, Proc Natl Acad Sci EE.UU. 1996; 93:1-6.

Tambien se puede usar microscopia electronica para "huella" de epitopo. Por ejemplo, Wang ycol, Nature 1992;

355: 275-278 usaron aplicacion coordinada de microscopia crioelectronica, reconstruccion de imagen tridimensional y cristalografia de rayos X para determinar la huella fisica de un fragmento Fab sobre la superficie de capside de virus de mosaico del caupi nativo.

0tras formas de ensayo "sin marcador" para evaluacion de epitopos incluyen resonancia de plasmon superficial (SPR, BIAC0RE) y espectroscopia de interferencia reflectometrica (RifS). Veanse, por ejemplo, Fagerstam y col, Journal of Molecular Recognition 1990; 3: 208-14; Nice y col., J. Chromatogr. 199 3; 646:159-168; Leipert y col, Angew. Chem. Int. Ed. 1998; 37:3308-3311; Kr�ger y col, Biosensors and Bioelectronics 2002; 17:937-944.

Aunque con frecuencia estan relacionados, la descripcion de una proteina en terminos de la competicion con una proteina de union de referencia frente a la capacidad de la proteina de unirse al mismo epitopo o un epitopo sustancialmente simil ar com o un a pr oteina de r eferencia en algunos casos im plica pro piedades bio logicas y fisicoquimicas significativamente diferentes. La competicion entre proteinas de union implica que el anticuerpo Anti-KIR de ensayo se une a un epitopo que al menos parcialmente se solapa con un epitopo unido por un anticuerpo anti-KIR o esta localizado lo suficientemente cerca de tal epitopo de forma que tal anticuerpo Anti-KIR compite con anticuerpos anti-KIR conoc idos de bido a impedim ento esterico. Un anticuer po A nti-KIR gran de, tal como un anticuerpo anti-KIR que consiste en o que comprende un anticuerpo, puede competir con un anticuerpo anti-KIR de referencia, sin unirse al mismo epitopo o epitopo similar debido al gran tamano de los anticuerpos. Un anticuerpo Anti-KIR de competicion de este tipo puede ser util en in teracciones de bloqueo asociadas con la misma region determinante antigenico que el anticuerpo anti-KIR de r eferencia aunque se une a un determinante antigenico diferente.

Composición y administración

La divulgacion se refiere a una composicion que comprende al menos un compuesto, tal como un anticuerpo o un fragmento del mismo, que bloquea el receptor inhibidor de una celula NK y un anticuerpo terapeutico, el uso de la composicion para aumentar la eficacia del anticuerpo terapeutico, para aumentar ADCC en un sujeto tratado con un anticuerpo terapeutico o para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad, mas particularmente una enfermedad que requiere el agotamiento de las celulas a las que se dirige, preferentemente las celulas enfermas tales como celulas infectadas viralmente, celulas tumorales u otras celulas patogenas. Preferentemente, la enfermedad se selecciona entre e l gr upo qu e co nsiste en un canc er, una enf ermedad a utoinmune, u na enfermedad inflamatoria, un a enfermedad viral. La enfermedad tambien se refiere a rechazo de injerto, mas particularmente de rechazo de aloinjerto y enfermedad de injerto frente a huesped (GVHD).

El anticuerpo terapeutico se puede unir por CD16, preferentemente a traves de su region Fc. Preferentemente, el anticuerpo terapeutico tiene una parte Fc de IgG1 o IgG3 humana, particularmente un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo, mas preferentemente un anticuerpo humano, humanizado o quimerico o un fragmento del mismo.

El compuesto, tal como un anticuerpo o un fragmento del mismo, que bloquea el receptor inhibidor de una celula NK se une al menos uno de receptores humanos KIR o NKG2A1C e inhibe la inhibicion mediada KIR2DL, KIR3DL y1o NKG2A1C relacionada de citotoxicidad mediada por celulas NK. Preferentemente, el receptor humano KIR2DL se selecciona entre el grupo que consiste en receptores humanos KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 y el receptor humano KIR3DL se selecciona entre el grupo que consiste en KIR3DL1 y KIR3DL2.

En un aspecto preferido, el compuesto, tal como un anticuerpo o fragmento del mismo, que bloquea al receptor inhibidor de una celula NK se une a al menos uno de los receptores humanos KIR2DL e inhiben la inhibicion mediada por KIR2DL relacionada de citot oxicidad de celulas NK. Preferentemente, receptor humano KIR2DL se selecciona e ntre el gru po q ue c onsiste e n rece ptores humanos KIR 2DL1, KIR2D L2, KIR2DL3. En u n as pecto preferido, el compuesto, tal como un anticuerpo o un fragmento del mismo, que bloquea el receptor o inhibidor de una celula NK se une a un determinante comun de receptores humanos KIR2DL e inhibe la inhibicion mediada por KIR2DL de citotoxicidad de celulas NK. Mas preferentemente, el compuesto, tal como una anticuerpo se une a determinante comun d e rec eptores h umanos KIR2D L1, KI R2DL2, KIR2DL 3 e in hibe la i nhibicion medi ada por KIR2DL1-, KIR2DL2-, KIR2DL3- de citotoxicidad de celulas NK. En aspecto particu lar, el compuesto, tal como un anticuerpo, inhibe la union de una molecula alelica de HLAC que tiene un resto Lys en la posicion 80 a un receptor KIR2DL1 humano y la union de una molecula alelica de HLAC que tiene un resto a Asn en la posicion 80a receptores KIR2DL2 y KIR2DL3 humanos. En otro aspecto particular, este anticuerpo se une al mismo epitopo que el anticuerpo monoclonal DF200 producido por el hibridoma DF200. 0pcionalmente, este anticuerpo compite con el anticuerpo monoclonal DF200 producido por el hibridoma DF200 por la union a un receptor KIR en la superficie de una celula NK humana. En un aspecto preferido, el anticuerpo es anticuerpo monoclonal DF200 producido por hibridoma DF200.

La composicion de acuerdo con la siguiente divulgacion puede comprender una combinacion de varios compuestos preferentemente anticuerpos o un fragmento de los mismos, que bloquean diferentes receptores e inhibidores de celulas NK. P referentemente, los com puestos, prefere ntemente anticuerpos o fragm entos d e l os m ismos, q ue bloquean receptores inhibidores de celulas NK son especificos de un receptor inhibidor seleccionado entre KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1, KIR3DL2, NKG2A y NKG2C y son capaces de inhibir la inhibicion mediada por KIR- o NKG2A1C- rel acionada de citotoxicidad d e celul as NK. Mas preferen temente, la combinacion de compuest os "neutralizantes" es capaz de inhibir la inhibicion mediada por KIR2DL1-, KIR2DL2- yKIR2DL3- de citotoxicidad de celulas NK.

Las com posiciones de la pres ente divulgacion pueden c omprender cua lquier vehicu lo o e xcipiente farmaceuticamente ac eptable, tipicament e tampon, so luciones is otonicas, susp ension ac uosa, o pcionalmente complementados con a gentes estabilizantes, conservantes, etc. Las formulaci ones tipicas inc luyen una solucion salina y, opcionalmente, una molecula protectora o estabilizante, tal como una proteina de alto peso molecular (por ejemplo, albumina serica humana).

De acuerdo con los procedimientos y composiciones de la presente divulgacion, los compuestos, tales como un anticuerpo o un fragmento del mismo, que bloquean el receptor inhibidor de una celula NK y los anticuerpos terapeuticos se administran en una cantidad eficaz.

La cantidad eficaz de anticuerpos terapeuticos administrados al receptor puede estar entre aproximadamente 0,1 mg1kg y aproximadamente 20 mg1kg. La cantidad eficaz de anticuerpo depende, sin embargo, de la forma del anticuerpo (Ig completa o fragmentos), afinidad del mAb y parametro de farmacocinetica que se tiene que determinar para cada anticuerpo particular.

La cantidad eficaz de compuestos, tales como un anticuerpo o un fragmento del mismo, que bloquean el receptor inhibidor de una celula NK administrada al receptor puede estar entre aproximadamente 0,1 mg1kg y 20 mg1kg. Sin embargo, la cantidad eficaz de anticuerpo depende de la forma del anticuerpo (Ig completa o fragmentos), afinidad del mAb y p arametros d e farmacocin etica que s e tiene n qu e det erminar para cada a nticuerpo partic ular. Tipicamente, un anticuerpo de longitud completa se administrara una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez c ada cuatro sem anas, mientras que un fra gmento d e a nticuerpo se podria admi nistrar tipicamente con mayor frecuencia, por ejemplo, mas de una vez a la semana o una vez a la semana.

La composicion de acuerdo con la presente divulgacion se puede proporcionar en inyeccion directamente a un sujeto, tipic amente me diante via intrav enosa, intrap eritoneal, intra arterial, i ntramuscular o tra nsdermica. Vari os anticuerpos monoclonales han demostrado ser eficaces en situaciones clinicas, tales como Rituxan (Rituximab) o Xolair (0malizumab) y se pueden usar regimenes de administracion similares (es decir, formulaciones y1o dosis y1o protocolos de administracion) con la composicion de la presente divulgacion.

Ademas, las composiciones de la prese nte divu lgacion pue den co mprender ad emas o se pu eden usar en combinacion con otros i ngredientes acti vos o pro gramas terap euticos tales co mo quim ioterapia u otr as inmunoterapias, simultaneamente o secuencialmente.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generación de un anticuerpo KIR2DL pan

Este ejemplo describe la generacion de anticuerpos anti-KIR monoclonales murinos y la identificacion de DF200, un anticuerpo monoclonal novedoso frente a un determinante comun de receptores de NK humanos KIR2DL.

Purificacion de PBL y generacion de lineas de celulas NK policlonales o clonales

Los PBL se obtuvieron a partir de donantes sanos mediante gradientes de Ficoll Hypaque y agotamiento de celulas adherentes a plastico. Para obtener celulas NK enriquecidas, los PBL se incubaron con mAb anti CD3, anti CD4 y anti HLA-DR (30 min a 4°C), seguido por perlas magneticas anti raton de cabra (Dynal) (30 min a 4°C) y seleccion inmuno-magnetica mediante procedimientos conocidos en la tecnica (Pende y col., J Exp Med. 1999; 190(10): 150516). Celulas CD3 menos, CD4 menos DR menos se cultivan en celulas alimentadoras irradiadas y 100 U1ml de Interleuquina 2 (Proleukin, Chiro n Corporation) y 1,5 ng1ml de F itohemaglutinina A (Gibco BRL ) para obte ner poblaciones de NK policlonales. Las celulas NK se clonan mediante dilucion limitante y los clones de celulas NK se caracterizan mediante citometria de flujo para expresion de receptores de superficie celular.

Se usaron los siguientes clones en este estudio:

CP11, CN5 y CN505 son clones positivos de KIR2DL1 y se tinen mediante anticuerpos EB6 o XA-141.

CN12 y CP502 son clones positivos de KIR2DL3 y se tinen mediante anticuerpo GL183.

Analisis de citometria de flujo

Los mAb usados se produjeron en el laboratorio JT3A (IgG2a, anti CD3), EB6 y GL183 (IgG1 anti KIR2DL1 y KIR2DL3 respectivamente), anti KIR2DL1 de IgM de XA-141 (misma especificidad en comparacion con EB6, anti CD4 (HP2.6), anti DR (D1.12, IgG2a). En lugar de JT3A, HP2.6 y DR1.12, los mAb disponibles en el mercado de las mismas especificidades se pueden usar por ejemplo a partir del fabricante Beckman coulter Inc, Fullerton, CA. EB6 y GL183 estan disponibles en el mercado en Beckman Coulter Inc, Fullerton, CA. XA-141 no esta disponible en el Mercado pero se puede usar EB6 para reconstitucion de control de lisis como se ha descrito en Moretta (1993, mencionado anteriormente).

Citometria de flujo

Las celulas se tineron con los anticuerpos adecuados (30 min a 4°C) seguido por anticuerpos anti raton policlonales conjugados a PE o FITC (Southern BiotechnologyAssociates Inc). Las muestras se analizaron mediante analisis citofluorometrico en un aparato FACSAN (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

Experimento de citotoxicidad

La actividad citolitica de clones de NK se evaluo mediante un ensayo de liberacion de 51Cr de 4 h convencional, en el cual las c elulas NK efect oras se ensayaron en li neas celul ares p ositivas a C w3 o C w4 co nocidas p or su sensibilidad a lisis de celulas NK. Todas las dianas se usan a 5.000 celulas por pocillo en placas de microtitulacion y la proporcion de efector a diana es habitualmente 4 efectores por celula diana. El ensayo citolitico se realiza con o sin sobrenadante de anticuerpos monoclonales indicados a una dilucion �. El procedimiento es basicamente el mismo que el descrito en Moretta y col. (1993, mencionado anteriormente).

Generacion de mAb nuevos

Se han generado mAb mediante la inmunizacion de ratones Balb C de 5 semanas de edad con lineas de celulas NK policlonales o monoclonales activadas como se ha descrito en Moretta y col. (J E xp Med. 1990; 171(3): 695-714 y 1990; 172( 6): 158 9-98, l a di vulgacion de cada uno de l os c uales se i ncorpora e n e l prese nte d ocumento por referencia. Despues de diferentes fusiones celulares, los mAb se seleccionaron en primer lugar por su capacidad de reaccionar de forma cruza da co n line as de cel ulas y clones NK EB6 y GL 183 positivas. L os anticu erpos monoclonales positivos se exploraron luego por su capa cidad de reconstituir lisis mediante clones de NK EB 6 positivos o GL183 positivos de dianas Cw4 o Cw3 positivas respectivamente.

Resultados

Se observo que uno de los anticuerpos monoclonales, el mAb DF200 reaccionaba con diversos miembros de la familia KIR incluyendo KIR2DL1, KIR2DL213. Con referencia a la tincion de celulas NK con mAb DF200 celulas tanto KIR2DL1+ como KIR2DL213+ se tineron de forma brillante.

Los clones de NK que expresan uno u otro (o incluso ambos) de estos receptores inhibidores especificos de clase I de HLA se usaron como celulas efectoras frente a celulas diana que expresan uno o mas alelos HLA-C. Como se esperaba, los clones de NK KIR2DL1+ presentaron poca, si acaso alguna, actividad citolitica frente a celulas diana que expresan HLA-Cw4 y KIR2DL213+. Los clones de NK presentaron poca o ninguna actividad sobre dianas positivas de Cw3. Sin embargo, en presencia de DF200mAb (usado para enmascarar sus receptores KIR2DL2), los clones de NK se volvieron incapaces de reconocer sus ligandos de HLA-C y presentaron actividad citolitica marcada sobre dianas positivas a HLA-Cw3 y HLA-Cw4.

Por ejemplo, la linea de celulas C1R (linea de celulas CW4+EBV, ATCC N° 1993) no se destruyo por clones de NK KIR2DL1+ (CN51CN505), pero la inhibicion se pudo revertir eficazmente mediante el uso de DF200 o un mAb an ti KIR2DL1 convencional. Por otra parte los clones de NK que expresan el fenotipo KIR2DL213+ KIR2DL1- (CN12) destruyeron ef icazmente C1 R y esta destruccion n o e stuvo afectad a por el DF 200mAb. Se pu eden obte ner resultados similares con clones de NK positivos a KIR2DL2- o KIR2DL3- en dianas positivas a Cw3.

Ejemplo 2: Análisis Biacore de interacciones de mAb DF200/ KIR 2DL1 y mAb DF200/ KIR 2DL3

Este Ejemplo describe una evaluacion de las afinidades respectivas de DF200 en la union a KIR2DL1 y KIR2DL3.

Produccion y purificacion de proteinas recombinantes

Las prot einas recombi nantes KIR 2DL1 y KIR 2DL3 s e produ jeron e n E. coli. AD Nc que c odifica el d ominio extracelular completo de KIR 2DL1 y KIR 2DL3 se amplifico mediante PCR a partir del vector 47.11 del clon pCDM8 (Biassoni ycol, Eur J Immunol. 199 3; 23(5): 1083-7) y el vector 6 del clon de RSVS(gpt)183 (Wagtman y col., Immunity Mayo de 1995; 2(5): 439-49) respectivamente, usando los siguientes cebadores.

Sentido: 5'-GGAATTCCAGGAGGAATTTAAAATGCATGAGGGAGTCCACAG-3' (SEC ID N° 3)

Anti-sentido: 5'-CCCAAGCTTGGGTTATGTGACAGAAACAAGCAGTGG-3' (SEC ID N° 4)

Los mismos se clonaron en el vector de expres ion pML1 en fase con una secuencia que codifica una senal de biotinilacion (Saulquin y col, 2003).

La expresion de proteinas se realizo en la cepa bacteriana BL21(DE3) de E. coli obtenida en Invitrogen. Las bacterias transfectadas se cultivaron a D0600=0,6 a 37°C en medio complementado con ampicilina (100 !g1ml) y se indujeron con IPTG 1 mM.

Las proteinas se recuperaron a partir de los cuerpos de inclusion en condiciones de desnaturalizantes (urea 8 M). El replegamiento de las proteinas recombinantes se realizo en tampon Tris 20 mM, pH 7,0, NaCl 0,50 mM que contiene L-arginina (400 mM, Sigma) y 1-mercaptoetanol (1 mM), a TA, disminuyendo la concentracion de urea en una dialisis de seis etapas (urea 4, 3, 2, 1, 0,5 y 0 M, respectivamente). Glutation reducido y oxidado (5 mM y0,5 mM respectivamente, Sigma) se anadio durante las etapas de dialisis de urea 0,5 y0 M. Finalmente, las proteinas se dializaron exhaustivamente frente a tampon Tris 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM. Las proteinas replegadas solubles se concentrarony despues se purificaron en una columna de exclusion por tamano Superdex 200 (Pharmacia; sistema AKTA).

Analisis Biacore

Se realizaron mediciones de resonancia de plasmon superficial en un aparato Biacore (Biacore).

En todos los experimentos Biacore el tampon HBS complementado con tensioactivo al 0,5% P20 sirvio como un tampon de desarrollo.

Inmovilización de proteína. Las proteinas KIR 2DL1 y KIR 2DL3 se inmovilizaron covalentemente a grupos carboxilo en la capa de dextrano en una Microplaca Sensora CM5 (Biacore). La superficie de la microplaca sensora se activo con ED C1NHS (clorhi drato de N etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida y N-hidroxisuccinimida, Biacor e). Las proteinas, en tampon de acoplamiento (acetato 10 mM pH 4,5) se inyectaron. La desactivacion de los grupos activados restantes se realizo usando etanolamina 100 mM pH 8 (Biacore).

Mediciones de afinidad. Para mediciones cineticas, se aplicaron diversas concentraciones del anticuerpo soluble (107 a 4x10-10 M) a la muestra inmovilizada. Las mediciones se realizaron a un caudal continuo de 20 !l1min. Para cada ciclo, la superficie de la microplaca sensora se regenero mediante inyeccion de 5 !l de Na0H 10 mM pH 11.

El programa BIAlogue Kinetics Evaluation (BIAevaluation 3.1, Biacore) se uso para analisis de datos.

Resultados

Tabla 1

Analisis BIAcore de union de mAb DF200 a KIR 2DL1 y KIR 2DL3 inmovilizados

Antigeno

KD (10-9 M)

KIR 2DL1

10,9 ± -3,8

KIR 2DL3

2,0 ± -1,9

KD: Constante de disociacion

El analito soluble (40 !l a diversas concentraciones) se inyecto a un caudal de 20 !l1min en tampon HBS, en capas de dextrano que contenian 500 o 540 unidades de reflectancia (UR) y 1.000 o 700 UR de KIR 2DL1 y KIR 2DL3 5 respectivamente. Los datos son representativos de 6 experimentos independientes.

Ejemplo 3: Potenciación de ADCC mediante el uso de una combinación de Rituxan y mAb anti-KIR

Este experimento muestra que Rituxan en solitario basicamente no media ADCC mediante un clon de NK positivo a KIR2DL1 en celulas diana positivas a Cw4, mientras que la ADCC d el clon positivo de KIR2DL1 esta potenciada enormemente en presencia de un anticuerpo anti- KIR2DL1.

10 Preparacion de clones de NK humanos

Celulas i nmunonucleares sa nguineas a gotadas d e ce lulas T mediant e selecci on i nmuno-magnetica anti-CD 3 negativa (Miltenyi) se siembran en placas en condiciones de dilucion limitante, se activan con fitohemaglutinina(PHA) (Biochrom KG, Berlin, Alemania) y se cultivan con interleuquina (IL)-2 (Chiron B.V., Amsterdam, Paises Bajos) y celulas irradiadasalimentadoras. Las eficiencias de clonacion son equivalentes en todos los donantes y varian

15 entre 1 en 5 y 1 en 10 celulas NK sembradas. Las celulas NK clonadas se seleccionan para alorreactividad mediante citotoxicidad de liberacion de 51Cr convencional frente a lineas de celulas linfoblastoides B transformadas con virus de Epstein-Barr de tipo de HLA conocido a una proporcion de efector a diana de 10:1. Los clones que muestran ; que 30% de lisis se puntuaron como alorreactivos. Como una regla, los clones muestran lisis < 5% o > 40%.

Potenciacion de ADCC mediada por Rituxan mediante un clon de celula NK positivo a KIR2DL1

20 La actividad citolitica de clon de NK se evaluo mediante un ensayo de liberacion de 51Cr de 4 h convencional, en el cual celulas NK efectoras se ensayaron en lineas de celulas EBV positivas a HLA-Cw3 o HLA-Cw4 (CD20 positivas), conocidas por su sensibilidad a lisis por celulas NK. Todas las dianas se usan a 5.000 celulas por pocillo en placas de microtitu lacion y una pr oporcion d e e fector (clon d e celu la NK) a dian a det erminada. En determin ados experimentos, el rituximab anti CD20 quimerico terapeutico (Rituxan, Idec) se anade a 5 !g1ml a la mezcla de efector

25 diana. En determinados experimentos, el anticuerpo EB6 (anti KIR2DL1) a 10 !g1ml se anade a la mezcla de efector diana.

Este experimento demostro que Rituxan en solitario basicamente no media ADCC mediante el clon de NK positivo a KIR2DL1 en diana positiva a Cw4. La ADCC de clon positivo a KIR2DL1 esta potenciada enormemente en presencia de anticuerpo anti KIR2DL1.

30 Ejemplo 4: Potenciación de destrucción mediada por NK de células infectadas por virus

mAb anti-KIR se ensayan para determinar su capacidad de potenciar destruccion mediada por NK de celulas infectadas por virus mediante ensayos de liberacion de Cromo-51 (51CR) convencionales (ensayos de citotoxicidad).

Los ensayos de 51Cr se conocen bien en la tecnica. En el co ntexto de la presente invencion, los ensayos de liberacion de 51Cr generalmente se realizan en una de dos configuraciones, dependiendo de si el objetivo es ensayar

35 1) si los mAb anti-KIR por si mismos potencian destruccion mediada por NK de celulas infectadas con virus o 2) si los mAb anti-KIR potencian la eficacia de otros mAb terape uticos de inducir destruccion de celulas diana que expresan el ligando de otro mAb terapeutico. La unica diferencia entre estas dos configuraciones generales esta relacionada con la eleccion de la poblacion de celulas NK precisa y la poblacion de celulas diana. A modo de ejemplo, el siguiente procedimiento describe como ensayar si un mAb anti-KIR puede potenciar la eficacia de otros

40 mAb terape uticos usad os e n terapi a anti-viral, en este caso mAb a nti-CD4 q ue s e estan des arrollando par a tratamiento de VIH. Los mAb anti-CD4 se unen a CD4 en celula T, infectadas o no por VIH, y al mismo tiempo se pueden unir a CD16, el receptor Fc activador en celulas NK, estimulando de ese modo a las celulas NK para destruir celulas diana que expresan CD4. Sin embargo, este efecto estimulador se equilibra mediante senalizacion inhibidora a traves de KIR, tras el acoplamiento de HLA-C. Cuando tanto un mAb anti-CD4 como uno anti-KIR se anaden al

ensayo de 51Cr d el m iso ti empo, el nivel de d estruccion es ma yor q ue s i se a nade a nti-CD4 en solit ario. E l experimento se realiza con la linea de celulas NK denominada �TS-2DL1 que no lisa la linea de celulas B 721.221 transfectada con HLA-C y CD4 debido a que HLA-Cw4 proporciona proteccion suministrando senalizacion inhibidora a la celula NK a traves de KIR.

Las celulas diana se marcan con 51Cr durante 1 h a 37°C, se lavan y se siembran en placas a 5.000 celulas1pocillo en placas de 96 pocillos, junto con diversos numeros de celulas NK, para dar proporciones efector:diana de 0,3:1, 1:1, 3:1 y 9:1. Despues se anade un mAb anti-CD4 por si solo, a diferentes concentraciones desde 1-50 !g1ml (concentracion final) o a las mismas concentraciones junto con 1 !g1ml de un mAb anti-KIR. La placa se incuba a 37°C durante 4 h, se centrifuga y el sobrenadante se recoge y se somete a recuento. La cantidad de 51Cr en el sobrenadante es pro porcional a la canti dad d e destruccion de c elulas di ana q ue ha te nido lugar. En este experimento, el mismo nivel de destruccion se obtiene despues de la incubacion con 50 !g1ml de anti-CD4 que con 2 !g1ml de anti-CD4 mas 1 !g1ml de mAb anti-KIR, demostrando que el mAb anti-KIR potencia significativamente la eficacia de los mAb anti-CD4. Una potenciacion similar de la capacidad de mAb anti-CD4 de inducir destruccion similar se espera cuando se usan celulas infectadas con VIH como dianas, ya que el mecanismo es el mismo, pero es debido a l as preocupaciones de seguridad en l os experimentos se realizan preferentemente con celulas no infectadas.

Ejemplo 5: Destrucción promovida por anticuerpo anti-KIR de células diana infectadas con VIH

Las celulas NK son importantes en el control de infecciones virales. En pacientes infectados con VIH con SIDA, las reducciones e n los n umeros y func ion de celu las NK se ha n inform ado. En estudios prev ios, u na e xpresion aumentada de receptores similares a Ig d e celulas asesinas (KIR) s e ha observado en pacientes con VIH co n enfermedad controlada. Los KIR se expresan en celulas NK y celulas T y reconocen moleculas de CMH de clase I en celulas diana. La interaccion entre KIR y sus ligandos en celulas diana puede conducir a inhibicion o activacion de celulas NK, dependiendo del tipo de molecula de KIR. Se ha demostrado previamente que celulas NK con ligando KIR no coincidente pueden destruir dianas tumorales.

En este ejemplo, para ensayar si KIR inhibidor puede controlar la destruccion de NK de celulas infectadas con VIH y si la destruccion se puede aumentar bloqueando KIR usando mAb, la interaccion entre KIR y moleculas de CMH de clase I se bloqueo con un anticuerpo anti-KIR. El efecto de este tratamiento se midio mediante expresion de celulas NK de un m arcador de d esgranulacion denom inado CD107a, cuyo nivel d e e xpresion es pro porcional a la destruccion mediante celulas NK. Una desgranulacion aumentada se observo en celulas NK tanto en individuos sanos como en pacientes infectados con VIH cuando se bloqueo la interaccion de KIR entre celulas NK y lineasde celulas qu e e xpresan HLA-C usan do el anticuerpo a nti-KIR 1-7F 9, demostran do q ue las cel ulas NK de esta poblacion de pacientes son funcionales y activables cuando se bloquea KIR. Estos resultados muestran que la activacion de celu las NK blo queando KIR inh ibidores p odria ser pote ncialmente u n n uevo tratami ento inmunoterapeutico para pacientes infectados con VIH.

Muestras de sangre

La sangre se recibio de 11 individuos sanos asi como de 10 pacientes infectados con VIH-1 a partir de Venhalsan en S�dersjukhuset en Estocolmo. Todos los pacientes eran hombres y de los controles sanos tres eran hombres y siete mujeres. Todos los pacientes estuvieron en tratamiento con terapia antirretroviral altamente activa (HAART) y tenian una viremia controlada, teniendo seis de los pacientes una carga viral de < 50 copias de ARN1ml y el resto tenia una carga viral de entre 77 y 200 copias de ARN1ml. El recuento de CD4+ promedio para los pacientes infectados con VIH-1 fue 582 celulas CD4 +1!l (intervalo 248-1043). Las PBMC se purificaron mediante centrifugacion de densidad.

Anticuerpos

Los siguientes anticuerpos se adquirieron en BD Biosciences y se usaron para tincion de FACS, FITC anti-CD56 humano (NCAM 16.2) de IgG2b, PerCP anti-CD3 humano (SK7) de IgG1, APC anti-CD56 humano (B159) de IgG1, PE anti-CD56 humano (leu-19), FITC anti-KIR humano (NKB1), FITC anti-CD107a humano (H4A3) de IgG1 de raton purificado y a nti-CD107a h umano (H4A 3) de IgG1 de r aton. Anti-KIR 2DL1 h umano (CD1 58a) y anti-KIR2DL2 humano (CD158b) en Immunotech. El mAb anti-KIR (1-7F9) humano, especifico para KIR2DL1, 2 y 3, asi como KIR2DS1 y 2 se han descrito en los documentos W02005003168 y W02005003172. FITC anti-IgG4 humana de Southern Biotech se uso como anticuerpo secundario para deteccion de 1-7F9.

Tincion de receptor de NK

500.000 PBMC nuevas se tineron durante 30 min a 4�C con anticuerpos no marcados. Las celulas se lavaron en FCS PBS + al 1% y despues se tineron con el Ab secundario durante 10 min a 4�C. Despues del lavado, las celulas se blo quearon con suer o d e raton PBS + al 1%. Des pues l as cel ulas se tiner on durante 10 mi n a 4�C co n anticuerpos conjugados frente a diversos receptores de NK y CD56 CD3. Las celulas s e fijaron en PBS con FCS al 1% y para paraformaldehido al 1% y se almacenaron a 4�C hasta que se analizaron en un Calibur FACS de cuatro colores. Los resultados se analizaron mediante Cell Quest Pro.

El ensayo de CD107a

PBMC nuevas estimuladas durante una noche con 200 U1ml de IL-2 (Peprotech) en medio RPMI complementado con PEST y suero fetal de ternera al 10% (FCS) se anadieron a una placa de 96 pocillos. Las celulas se bloquearon para expresion de fondo de CD107a mediante adicion de 5 !g1ml de mAb de CD 107a purificado no marcado (BD). Despues de incubacion de 15 min a temperatura ambiente, las celulas se lavaron tres veces con medio RPMI completo. En algunos casos, las PBMC se incubaron previamente durante 30 min a TA con 100 !g1ml de anticuerpo anti-KIR. Las celulas diana (K562, 721.221, 721.Cw3, 721.Cw4, 721.Cw6, CEM o celulas CD4 + autologas) se anadieron a una proporcion de efector:diana de 2:1, con 500.000 celulas efectoras y250.000 celulas diana por pocillo. Como un control negativo las PBMC se incubaron con medio completo. A un volumen total de 250 !l, se anadieron 4 !l de mAb marcado con FITC anti-CD107a humano y GolgiStop (BD). Las celulas se centrifugaron rapidamente a 500 rpm durante 1 min para promover el contacto entre celulas efectoras y d iana. Despues de incubacion de 4 h a 37�C las celulas se lavaron en PBS + FCS al 1% y despues se tineron para marcadores de superficie CD56y CD3 durante 10 min a 4�C. Las celulas se lavaron y se fijaron con paraformaldehido al 1% y despues se analizaron en un instrumento Calibur FACS.

Celulas diana

Las celulas diana usadas para el ensayo de CD107a fueron las lineas de celulas sin CMH de clase I K562 y 721.221 como co ntroles positiv os, y las lin eas c elulares q ue expresan CMH de cl ase I 721.Cw3, 7 21.Cw4 y 7 21.Cw6 respecto a las ADN con diferentes alelos HLA-C. La linea de celulas T CEM se uso como una celula diana ya que es sensible a infeccion por VIH-1. Todas las lineas celulares se cultivaron en medio RPMI complementado con PEST y FCS al 10%.

Celulas T CD4 + autologas se purificaron a partir de PBMC nuevas mediante coctel de enriquecimiento de celulas T CD4 + h umano StemS ep® y c oloides magneticos de acu erdo co n la descripcion d el fa bricante (StemCe ll Technologies). Se usaron columnas de separacion LS y un iman MidiMACS de Miltenyi Biotec para la etapa de separacion. Las celulas T CD4 + se estimularon durante 3 dias en medio RPMI complementado con 20 U1ml de IL-2 (Peprotech) y 5 !g1ml de PHA (0xoid, Sollentuna, Suecia), PEST y FCS al 10%. Las celulas se lavaron en medio y despues se estimularon con 10 U1ml de IL-2 durante 12 dias adicionales antes del uso como celulas diana en el ensayo de CD107a.

Infeccion con VIH-1 de celulas diana

Celulas CEM se infectaron con VIH-1 IIIB (LAI) a una 1000xTCDI50 mediante incubacion de celulas y virus durante 4 h a 37�C, agitando lentamente a 100 rpm. Las celulas se suspendieron en medio tibio y se centrifugaron durante8 min a 1000 rpm, el lavado se repitio una vez y despues las celulas se mantuvieron en placas de 24 pocillos a 37�C durante 12 dias. Cada 3-4 dias se anadio medio nuevo a los cultivos. Las celulas se tineron para expresion de p24 intracelular con el fin de determinar si las celulas estaban infectadas. Se lavaron 500 000 celulas en PBS + FCS al 1% y se tineron con APC anti-CD4 humano durante 10 min a 4�C. Despues del lavado las celulas se fijaron mediante incubacion durante 20 min a 4�C con 100 !l de solucion de BD Cytofix1Cytoperm y despues las celulas se lavaron dos veces en solucion BD Perm1Wash. Se anadio el Ab anti-p24 de IgG1 de raton, FITC de KC57 (Beckman Coulter) o control de isotipo, diluido 1120 en solucion BD Perm1lWash. Despues de 45 min de incubacion a 4�C las celulas se lavaron en solucion BD Perm1Wash nuevamente y despues se fijaron en PBS con PFA al 1% y FCS al 1% antes de analizarse en el Calibur FACS.

Estadistica

Los res ultados de los c ontroles s anos y de pacientes infectados co n VIH-1 se co mpararon esta disticamente mediante el ensayo no parametrico de Mann-Whitney U (ensayo de suma de rangos de Wilcoxon).

Resultados

Expresion cambiada de receptores de celulas NK en individuos infectados con VIH-1

Para investigar los efectos de infeccion de VIH-1 sobre la expresion de receptores en celulas NK, PBMC purificadas recientemente se tineron para CD56 y CD3 (Fig. 1 a), asi como para varios receptores NK diferentes. La proporcion de celulas NK CD56+ CD3- no difirio significativamente (P = 0,06) entre pacientes infectados con VIH-1 tratados con HAART y controles sanos, aunque la mediana se redujo en pacientes infectados con VIH-1 (Fig 1b). Las celulas NK se pueden dividir en celulas CD56 brillantes yCD56 oscuras (Fig 1a). En este estu dio se pudo observar una disminucion ligera e n ce lulas osc uras C D56 CD 3- para p acientes infectados c on VIH-1 e n c omparacion co n controles sanos, pero la diferencia no fue significativa.

Se analizo la expresion de un panel de receptores NK diferentes en celulas NK CD56+ CD3-. Aunque no fue significativo, una mediana aumentada en la expresion de receptores KIR se o bservo en pacientes infectados con VIH-1 (Fig 2). Se usaron c uatro mAb diferentes para KIR, de los cuales tres son especificos para KIR unicos (KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR3DL1) y uno, 1-7F9, reacciona de forma cruzada con KIR2DL1S1, KIR2DUS2 y KIR2DL3.

Actividad de celulas NK medida mediante expresion de CD107a

PBMC a partir de pacientes infectados con VIH-1 y controles sanos se estimularon con celulas diana K562 sensibles a NK, lo cual conduce a un aumento en la densidad de la superficie celular del marcador de desgranulacion CD107a (Fig 3 a, b), lo que refleja la destruccion de celulas diana K562 mediante las celulas NK. El porcentaje promedio de celulas CD107a+ CD5 6+ CD 3- fue un icamente ligeramente su perior para c ontroles sanos qu e para p acientes infectados con VIH-1 despues de la estimulacion con celulas K562, (Fig 3c), lo que indica una disminucion ligera de la funcion de celulas NK en paci entes infectad os con VIH-1, aunque la difer encia no fue estadisticame nte significativa.

Bloqueo de KIR aumenta expresion de CD107a

Para investigar si es posible usar el ensayo de CD107 para detectar destruccion mediada por NK aumentada de celulas que expresan HLA-C en respuesta a el bloqueo de receptores KIR inhibidores, se bloquearon los receptores KIR con el anticuerpo 1-7F9 humano (IgG4) que se une a todos los receptores KIR2DL inhibidoresy se midio la regulacion positiva de CD107a en respuesta a lineas de celulas tumorales positivas a HLA-C. El ensayo se realizo con o sin bloqueo de los receptores KIR. Cuando celulas 721-221 transfectadas con diferentes moleculas de HLA de clase I se usaron como celulas diana se pudo observar una expresion aumentada de CD107a cuando los receptores KIR se bloqueaban. La expresion aumentada de CD107a en celulas NK no fue diferente entre pacientes infectados con VIH-1 y controles sanos y vario entre el 0,5-13,6% (Fig 4a).

Debido a que es posible que las celulas infectadas por VIH puedan expresar niveles mas bajos de ligandos para receptores d e NK y s er m enos sens ibles a l a destruccion m ediada por NK q ue las cel ulas n o infecta das, a continuacion se ensayo si era posible obtener un efecto de bloqueo de KIR cuando las celulas diana estaban infectadas con VIH-1. La linea de celulas T denominada CEM, que es susceptible a infeccion por VIH-1, se infecto con la CEPA IIIB de VIH-1. Celulas CEM no infectadas e infectadas al 70% (determinado mediante tincion FACS de p24) se usaron como dianas en el ensayo de CD107a y PBMC a partir de un individuo sano se usaron como celulas efectoras. Como se puede observar en la Figura 4b, el bloqueo de KIR usando el anticuerpo 1-7F9 indujo un aumento similar en expresion de CD107a tanto en celulas no infectadas como en celulas infectadas con VIH. Estos resultados sugieren que las celulas infectadas con VIH conservan expresion de ligandos para activar receptores de NK y que la expresion de HLA-C proporciona proteccion frente a lisis. Se pueden usar mAb anti-KIR para interferir con esta proteccion, volviendo a las celulas infectadas por VIH sensibles a destruccion por NK.

Para descubrir si el bloqueo de KIR de celulas NK tambien puede provocar un efecto frente a contra celulas CD4 + sanas antologas se usaron celulas blasticas CD4 + autologas no infectadas, se expandieron en IL-2 y se activaron con P HA, co mo di anas. El bl oqueo de KIR med iante in cubacion pr evia de cel ulas NK c on 1-7F9 aum ento la expresion d e CD107a e n celul as NK con apro ximadamente el 1 0% en dos e xperimentos in dependientes con linfocitos a partir de individuos sanos (Fig 4c). Este nivel bajo de citotoxicidad frente a celulas diana sanas es consistente con el requerimiento de el acoplamiento de receptores NK activadores mediante ligandos de activacion inducibles por estres sobre celulas diana, que generalmente no estan presentes en dianas sanas. Sin embargo, es posible que el cultivo de blastos CD4 en PHA mas lL-2 condujera a expresion de nivel bajo de algunos ligandos de activacion en algunas celulas diana.

Los r esultados de este estudio muestra n que las ce lulas NK de pacientes c on VIH tratados co n HAART son enormemente comparables a celulas NK de donantes sanos con respecto a fenotipo y actividad. Mas importante, los experimentos descritos en la presente invencion indican que las celulas NK en pacientes tratados con HAART estan bajo regulacion negativa mediante KIR inhibidor y la actividad de tales celulas NK se puede potenciar bloqueando KIR con mAb anti-KIR. Por consiguiente, este grupo de pacientes seria una buena poblacion diana para tratamiento con mAb anti-KIR. Por el contrario, pacientes con enfermedad muy activa han celulas NK deterioradas, las cuales pueden no ser activables incluso si se "elimina el bloqueo de KIR" con, por ejemplo, un anticuerpo anti-KIR.

Los terminos "un1una" y "el1la" y referentes similares como usa en el contexto de la descripcion de la divulgacion se han de interpretar que abarcan tanto el singular como el plural, a menos que se indique de otra manera en el presente documento o que se contradiga claramente por el contexto.

La menc ion de interva los d e valor es en el pres ente d ocumento tien e por ob jeto simplemente s ervir como u n procedimiento abreviado de referencia individualmente a cada valor separado que cae dentro del intervalo, a menos que se indique de otra manera en el presente documento y cada valor separado se incorpora en la memoria descriptiva como si el mismo se estuviera mencionando individualmente en el presente documento. A menos que se indique de otra manera, todos los valores exactos proporcionados en el presente documento son ilustrativos de valores apr oximados c orrespondientes (p or ej emplo, to dos l os val ores ilustrativ os exactos pr oporcionados c on respecto a un factor particular o medicion se pueden considerar que tambien proporciona una medicion aproximada correspondiente, modificada mediante "aproximadamente", cuando sea apropiado).

Todos los procedimientos descritos en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menosquese indique de otra manera en el presente documento o se contradiga claramente de otra manera por el contexto.

El uso de cualquiera y todoslosejemplos o de lenguaje ilustrativo (por ejemplo, "tal como") proporcionado en el presente documento, tiene por objeto simplemente iluminar mejor la invencion. Ningun lenguaje en la m emoria descriptiva se ha de interpretar como que indica que cualquier elemento es basico para la practica de la invencion a menos que se indique de forma explicita.

La mencion de documentos de patente en el presente documento se realiza unicamente por conveniencia y no refleja ninguna vision de la validez, patentabilidad y1o aplicabilidad de tales documentos de patente.

La descripcion en el presente documento de cualquier aspecto o realizacion de la divulgacion que usa terminos tales como "que comprende", "que tiene", "que incluye" o "que contiene" con referencia a un elemento o elementos tiene por o bjeto pr oporcionar apoyo a un aspecto simil ar o r ealizacion de la i nvencion q ue "co nsiste en", "consist e basicamente en" o "comprende sustancialmente" ese elemento o elementos particulares, a menos que se indique de otra manera o se contradiga claramente por el contexto (por ejemplo, una composicion descrita en el presente documento c omo q ue c omprende un el emento partic ular s e ha de com prender qu e tamb ien descri be un a composicion que consiste en ese elemento, a menos que se indique de otra manera o se contradiga claramente por el contexto).

LISTAD0 DE SECUENCIAS

<110> N0V0 N0RDISK A1S

<120> C0MP0SICI0NES � PR0CEDIMIENT0S DE TRATAMIENT0 DE UNA INFECCI�N VIRAL

<130> 6874.204-W0

<150> PA 2005 00027

<151> 2005-01-06

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 450

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 42 10 <212> ADN

<213> Artificial

<220> <223> Cebador

<400> 3 ggaattccag gaggaattta aaatgcatga gggagtccac ag

42

5

<210> 4 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial

10

<220> <223> Cebador

<400> 4 cccaagcttg ggttatgtga cagaaacaag cagtgg

36

Claims (4)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto que bloquea un receptor inhibidor de una celula asesina natural parasu uso en el tratamiento de una enfermedad viral causada por VIH en un sujeto humano que lo necesita, en el que el sujeto humano ha sido tratado con terapia antirretroviral altamente activa y en el que el compuesto es un anticuerpo que se une al Receptor

   5 similar a Ig de Celulas Asesinas 2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3 y que bloquea la inhibicion mediada por KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3 de citotoxicidad de celulas NK.

2. 2.

   El compuesto de la reivindicacion 1, para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que el anticuerpo inhibe especificamente la union de moleculas de HLA-C a receptores KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3.

3. 3.

   El compuesto de la reiv indicacion 1, para su uso d e acuerdo con la reivindicacion 1 en e l que el anticuerpo

   10 compite con un anticuerpo producido por el hibridoma depositado como CNCM I-3224, en la union a al menos uno de KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3.
4. 4. El compuesto de la reiv indicacion 1, para su uso d e acuerdo con la reivindicacion 1 en e l que el anticuerpo compite con un anticuerpo que comprende las secuencias de cadena variable pesada (VH) y variable ligera (VL) de SEC ID N°: 1 y SEC ID N°: 2, respectivamente, en la union a al menos uno de KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3.

   15 5. El compuesto de la reivindicacion 4, para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que el anticuerpo comprende las secuencias de cadena variable pesada (VH) y variable ligera (VL) de SEC ID N°: 1 y SEQ ID N°: 2, respectivamente.