ES2380679T3 - Ensayos de polarización de fluorescencia para la actividad acetiltransferasa/desacetilasa - Google Patents

Ensayos de polarización de fluorescencia para la actividad acetiltransferasa/desacetilasa Download PDF

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Abstract

Un método para determinar la actividad de una desacetilasa que comprende: poner en contacto un conjunto de sustratos peptídicos con una desacetilasa, en el que los miembros de dicho conjunto de sustratos peptídicos comprenden un fluoróforo y al menos un residuo de lisina acetilada; poner en contacto el conjunto de sustratos peptídicos con un reactivo que escinde los miembros del conjunto de sustratos peptídicos que tienen residuos de lisina no acetilada; y determinar el valor de polarización de fluorescencia del conjunto de sustratos peptídicos; en el que una reducción del valor de polarización de fluorescencia del conjunto de sustratos peptídicos es indicativa de actividad desacetilasa.

Description

Ensayos de polarizaci6n de fluorescencia para la actividad acetiltransferasa/desacetilasa
ANTECEDENTES�
La acetilaci6n y desacetilaci6n de proteinas histonas, factores de transcripci6n y proteinas relacionadas
5 desempenan un papel importante en el control de los procesos celulares. En particular, el estado de acetilaci6n de las histonas controla lo estrechamente que las proteinas histonas interaccionan con el ADN, y por lo tanto lo accesible que es el ADN a los factores de transcripci6n. Las enzimas que anaden grupos acetilo a histonas u otras proteinas se denominan histona acetiltransferasas (HAT). Las enzimas que eliminan los grupos acetilo entran en dos familias: las histona desacetilasas (HDAC) y la familia de desacetilasas de Sir2. Actualmente, hay 11 miembros
10 conocidos de la familia de HDAC de mamiferos (Gray y Ekstrom, Exper. Cell Res. 2001, 262, 75-83; Zhou, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, 10572-10577; Kao et al. J. Biol. Chem. 2002, 277, 187-193; Gao et al. J. Biol. Chem. 2002, 277, 25748-25755) y 7 miembros de la familia de Sir2 (Gray y Ekstrom, Exper. Cell Res. 2001, 262, 7583).
Las histona acetiltransferasas catalizan la transferencia de un grupo acetilo desde la acetil-CoA al grupo £-amino de
15 un residuo de lisina en la proteina diana. Se han caracterizado muchas enzimas HAT a partir de organismos eucari6ticos (Sterner y Berger, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000, 64, 435-459). Las enzimas HDAC utilizan un i6n de cinc en el sitio activo de la proteina para catalizar la eliminaci6n del grupo acetilo de la acetil-lisina en forma de acetato. Los miembros de la familia de Sir2 de enzimas usan NAD como cofactor en la hidr6lisis de acetil-lisina.
El estado de acetilaci6n de las proteinas histonas desempena un papel importante en la expresi6n genica y el
20 control del ciclo celular y parece desempenar un papel en ciertas formas de cancer. En particular, se ha mostrado que el agrupamiento anormal de histona desacetilasas por proteinas correpresoras promueve el desarrollo de leucemia promielocitica. En estirpes celulares tumorales, varios estudios han mostrado que el tratamiento con inhibidores de HDAC puede conducir a la inhibici6n del crecimiento, detenci6n del crecimiento, diferenciaci6n terminal y/o apoptosis. Los estudios in vivo han demostrado inhibici6n del crecimiento de tumores y reducci6n de la
25 metastasis tumoral como resultado del tratamiento con inhibidores de HDAC (Kramer et al. Trends Endocrinol. Metab. 2001, 12, 294-300).
El estudio eficaz de la enzimologia y modulaci6n de enzimas HAT, HDAC y Sir2 depende de la disponibilidad de ensayos robustos que puedan efectuarse en formato de alto rendimiento. Se han desarrollado varias metodologias de ensayo para estas enzimas, con grados variables de utilidad para el cribado de inhibidores y activadores.
30 Los ensayos de histona acetiltransferasa estan tipicamente basados en la radiactividad. En estos formatos, se hace reaccionar acetil-CoA radiomarcada en el grupo acetilo con el peptido correspondiente a una secuencia aminoacidica de histona. Se cuantifica la transferencia del acetato radiomarcado al peptido mediante la uni6n del peptido a resina de afinidad (Ait-Si-Ali et al. Nucleic Acids Res. 1998, 26, 3869-3870), papel de fosfocelulosa (Tanner et al. J. Biol. Chem. 1999, 274, 18157-18160) o microplacas de centelleo (Wynne Aheme et al. Methods 2002, 26,
35 245-53) y la medida de la radiactividad asociada. En un formato de ensayo acoplado no radiactivo, la CoA libre formada en la reacci6n de acetiltransferasa sirve como sustrato para la a-cetoglutarato deshidrogenasa o la piruvato deshidrogenasa. La formaci6n de NADH sirve como medida de la tasa de actividad acetiltransferasa (Kim et al. Anal. Biochem. 2000, 280, 308-314).
La metodologia de ensayo de desacetilasa mas comun implica el marcaje de grupos de lisina en peptidos de histona
40 con acetato radiomarcado. La enzima desacetilasa elimina el grupo acetilo como acetato, que se aisla posteriormente mediante extracci6n y se cuantifica basandose en su radiactividad (Inoue y Fujimoto, Biochim. Biophys. Acta 1970, 220, 307-316). En una variante de este enfoque, el ensayo de centelleo por proximidad, los peptidos derivatizados con grupos acetilo radiomarcados se unen a una perla que contiene agente de centelleo que emite luz tras exposici6n a radiaci6n. En este formato de ensayo, la escisi6n de los grupos acetilo causa una
45 reducci6n de la emisi6n de luz por el agente de centelleo (Nare, et al., Anal. Biochem. 1999, 267, 390-396). Un ensayo no basado en radiactividad usa peptidos que contienen un grupo acetil-lisina y un marcador fluorescente. La reactividad se mide mediante cromatografia liquida de alta resoluci6n, usando la diferencia en el tiempo de retenci6n de los peptidos acetilado y no acetilado para aislar y cuantificar los productos de reacci6n (Hoffmann et al. Nucleic Acids Res. 1999, 27, 2057-8; Hoffmann et al. Bioconjug Chem. 2001, 12, 51-5; Hoffmann et al. Arch Pharm
50 (Weinheim) 2001, 334, 248-52). Un ensayo comercial usa un protocolo de detecci6n de dos etapas. En la primera etapa, se hace reaccionar un peptido que contiene acetil-lisina con una desacetilasa durante un periodo dado de tiempo. Despues de ello, se inactiva la reacci6n, se hace reaccionar la lisina expuesta con un agente de revelado que produce un fluor6foro y se cuantifica la cantidad de lisina desacetilada usando la fluorescencia del producto (Biomol, Plymouth Meeting, Pa., EE.UU.). Mas recientemente, se ha notificado un ensayo de dos etapas acoplado
55 con proteasa en el que se disen6 un peptido que contenia un par donante/inactivador de transferencia de energia por resonancia de fluorescencia (FRET) y una acetil-lisina. Despues de dejar transcurrir la reacci6n de desacetilasa, se inactiva la reacci6n y se cuantifica la cantidad de peptido desacetilado mediante reacci6n del peptido desacetilado con una enzima proteasa que escinde especificamente despues de residuos de lisina (Frey et al., presentado en la 224a reuni6n nacional de la American Chemical Society, Boston, Mass., agosto de 2002; articulo MEDI-121,
Marcotte et al., Anal. Biochem., 332: 90 (2004)). Hasta la fecha, no se han notificado ensayos de histona desacetilasa no radiactivos continuos.
El documento W00214543 da a conocer un metodo de ensayo de la actividad desacetilasa/acetilasa usando un sustrato marcado con un fluor6foro y al menos un residuo de lisina acetilada. El sustrato se incuba con la acetilasa o desacetilasa. La actividad enzimatica se detecta posteriormente, lo que puede efectuarse en un inmunoensayo de fluorescencia tal como un inmunoensayo de polarizaci6n de fluorescencia.
Wegener y colaboradores (Analytical Biochemistry, 2003, vol. 321, paginas 202-208) describen sustratos peptidicos fluorogenicos especificos de HDAC (histona desacetilasa) que comprenden un resto de lisina acetilada y un resto de 4-metilcumarin-7-amida adyacente en el extremo C de la cadena peptidica para uso en un ensayo de HDAC. Tras la desacetilaci6n del resto lisilo, se reconocen las moleculas como sustratos de tripsina, que libera moleculas altamente fluorescentes para medir.
Marcotte y colaboradores (Analytical Biochemistry, 2004, vol. 332, paginas 90-99) describen un sustrato peptidico de desacetilasa que comprende un fluor6foro (6-TAMRA), al menos un residuo de lisina acetilada y QSY-7 como grupo inactivador no fluorescente. El peptido desacetilado se escinde facilmente por tripsina, dando como resultado una potenciaci6n de la fluorescencia de 6-TAMRA
Los rasgos de los formatos de ensayo anteriores limitan su utilidad. Los ensayos basados en radiactividad tienden a ser costosos, y requieren precauciones de manejo especiales. Tambien son a menudo dificiles de efectuar en un formato de alto rendimiento. Por consiguiente, son necesarios ensayos mejorados para medir la actividad de acetiltransferasas o desacetilasas.
SUMARIO
Se proporcionan en la presente memoria metodos para determinar la actividad de enzimas que modulan la acetilaci6n de un sustrato proteico, incluyendo acetiltransferasas y desacetilasas. Se proporcionan tambien metodos para identificar compuestos que modulan la actividad de una acetiltransferasa o desacetilasa.
En un aspecto, la invenci6n proporciona un metodo para determinar la actividad de una desacetilasa que comprende: (a) poner en contacto un conjunto de sustratos peptidicos con una desacetilasa, en el que los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos comprenden un fluor6foro y al menos un residuo de lisina acetilada; (b) poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un reactivo que escinde los miembros del conjunto de sustratos peptidicos que tienen residuos de lisina no acetilada y (c) determinar el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos, en el que una reducci6n del valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos es indicativa de actividad desacetilasa.
En ciertas realizaciones, los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos pueden comprender adicionalmente un grupo voluminoso y al menos un residuo de lisina acetilada localizado entre el fluor6foro y el grupo voluminoso. El grupo voluminoso puede ser, por ejemplo, biotina, un complejo de biotina-avidina o un complejo de biotina-estreptavidina.
En ciertas realizaciones, los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos pueden comprender adicionalmente un sitio de uni6n, y dicho al menos un residuo de lisina acetilada esta localizado entre el fluor6foro y el sitio de uni6n. En dichas realizaciones, el metodo para determinar la actividad de una desacetilasa puede comprender adicionalmente poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un resto de uni6n que se une a dicho sitio de uni6n. En diversas realizaciones, los pares de sitio de uni6n/resto de uni6n pueden ser, por ejemplo, antigeno/anticuerpo, biotina/avidina, biotina/estreptavidina y una regi6n Fc o una porci6n de la misma/proteina A o proteina G.
En ciertas realizaciones, la desacetilasa puede ser, por ejemplo, una histona desacetilasa (HDAC) o una sirtuina. En ciertas realizaciones, la sirtuina puede ser, por ejemplo, una proteina SIRT1.
En ciertas realizaciones, el reactivo que escinde el sustrato peptidico puede ser una proteasa tal como, por ejemplo, lisilendopeptidasa, endoproteinasa, Lys-C, plasmina, calpaina o tripsina.
En ciertas realizaciones, el fluor6foro puede ser MR121 o 5TMR.
En ciertas realizaciones, la secuencia del sustrato peptidico puede derivar de una histona, una proteina HMG, p53, c-Myb, GATA-1, EKLF, MyoD, E2F, dTCF o TAT de VIH, o un fragmento de las mismas.
En otro aspecto, la invenci6n proporciona un metodo para identificar un compuesto que modula una desacetilasa que comprende: (a) poner en contacto un conjunto de sustratos peptidicos con una desacetilasa en presencia de un compuesto de ensayo, en el que los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos comprenden un fluor6foro y al menos un residuo de lisina acetilada; (b) poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un reactivo que escinde los miembros del conjunto de sustratos peptidicos que tienen residuos de lisina no acetilada y (c) determinar el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos, en el que un cambio en el
valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos en presencia del compuesto de ensayo, en comparaci6n con un control, es indicativo de un compuesto que modula la actividad de la desacetilasa.
En ciertas realizaciones, los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos pueden comprender adicionalmente un grupo voluminoso, y dicho al menos un residuo de lisina acetilada se localiza entre el fluor6foro y el grupo voluminoso. El grupo voluminoso puede ser, por ejemplo, biotina, un complejo de biotina-avidina o un complejo de biotina-estreptavidina.
En ciertas realizaciones, los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos pueden comprender adicionalmente un sitio de uni6n, y dicho al menos un residuo de lisina acetilada esta localizado entre el fluor6foro y el sitio de uni6n. En dichas realizaciones, el metodo para identificar un compuesto que modula una desacetilasa puede comprender adicionalmente poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un resto de uni6n que se une a dicho sitio de uni6n. En diversas realizaciones, los pares de sitio de uni6n/resto de uni6n pueden ser, por ejemplo, antigeno/anticuerpo, biotina/avidina, biotina/estreptavidina y una regi6n Fc o una porci6n de la misma/proteina A o proteina G.
En ciertas realizaciones, la desacetilasa puede ser, por ejemplo, una histona desacetilasa (HDAC) o una sirtuina. En ciertas realizaciones, la sirtuina puede ser, por ejemplo, una proteina SIRT1.
En ciertas realizaciones, el reactivo que escinde el sustrato peptidico puede ser una proteasa tal como, por ejemplo, lisilendopeptidasa, endoproteinasa, Lys-C, plasmina, calpaina o tripsina.
En ciertas realizaciones, el fluor6foro puede ser MR121 o 5TMR.
En ciertas realizaciones, la secuencia del sustrato peptidico puede derivar de una histona, una proteina HMG, p53, c-Myb, GATA-1, EKLF, MyoD, E2F, dTCF o Tat de VIH, o un fragmento de las mismas.
En ciertas realizaciones, se identifica un compuesto que aumenta la actividad de la desacetilasa. En dichas realizaciones, una reducci6n del valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos en presencia del compuesto de ensayo, en comparaci6n con un control, es indicativa de un compuesto que aumenta la actividad de la desacetilasa.
En ciertas realizaciones, se identifica un compuesto que inhibe la actividad de la desacetilasa. En dichas realizaciones, un aumento en el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos en presencia del compuesto de ensayo, en comparaci6n con un control, es indicativo de un compuesto que inhibe la actividad de la desacetilasa.
En ciertas realizaciones, el compuesto es una molecula pequena.
En otro aspecto, la invenci6n proporciona un metodo para determinar la actividad de una acetiltransferasa que comprende: (a) poner en contacto un conjunto de sustratos peptidicos con una acetiltransferasa, en el que los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos comprenden un fluor6foro y al menos un residuo de lisina; (b) poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un reactivo que escinde los miembros del conjunto de sustratos peptidicos que tienen residuos de lisina no acetilada y (c) determinar el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos, en el que un aumento en el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos es indicativo de actividad acetiltransferasa.
En ciertas realizaciones, los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos pueden comprender adicionalmente un grupo voluminoso y al menos un residuo de lisina localizado entre el fluor6foro y el grupo voluminoso. El grupo voluminoso puede ser, por ejemplo, biotina, un complejo biotina-avidina o un complejo biotinaestreptavidina.
En ciertas realizaciones, los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos pueden comprender adicionalmente un sitio de uni6n y al menos un residuo de lisina localizado entre el fluor6foro y el sitio de uni6n. En dichas realizaciones, el metodo para determinar la actividad de una acetiltransferasa puede comprender adicionalmente poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un resto de uni6n que se une a dicho sitio de uni6n. En diversas realizaciones, los pares de sitio de uni6n/resto de uni6n pueden ser, por ejemplo, antigeno/anticuerpo, biotina/avidina, biotina/estreptavidina y una regi6n Fc o una porci6n de la misma/proteina A o proteina G.
En ciertas realizaciones, la acetiltransferasa puede ser, por ejemplo, Gcn5 o p300/CBP.
En ciertas realizaciones, el reactivo que escinde el sustrato peptidico puede ser una proteasa tal como, por ejemplo, lisilendopeptidasa, endoproteinasa, Lys-C, plasmina, calpaina o tripsina.
En ciertas realizaciones, el fluor6foro puede ser, por ejemplo, MR121 o 5TMR.
En ciertas realizaciones, la secuencia del sustrato peptidico puede derivar de una histona, una proteina HMG, p53, c-Myb, GATA-1, EKLF, MyoD, E2F, dTCF o Tat de VIH o un fragmento de las mismas.
En otro aspecto, la invenci6n proporciona un metodo para identificar un compuesto que modula una acetiltransferasa que comprende: (a) poner en contacto un conjunto de sustratos peptidicos con una acetiltransferasa en presencia de un compuesto de ensayo, en el que los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos comprenden un fluor6foro y al menos un residuo de lisina localizado entre el fluor6foro y el sitio de uni6n; (b) poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un reactivo que escinde las moleculas del sustrato peptidico que tienen residuos de lisina no acetilada y (c) determinar el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos, en el que un cambio en el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos en presencia del compuesto de ensayo, en comparaci6n con un control, es indicativo de un compuesto que modula la actividad de la acetiltransferasa.
En ciertas realizaciones, los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos pueden comprender adicionalmente un grupo voluminoso y al menos un residuo de lisina localizado entre el fluor6foro y el grupo voluminoso. El grupo voluminoso puede ser, por ejemplo, biotina, un complejo de biotina-avidina o un complejo de biotina-estreptavidina.
En ciertas realizaciones, los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos pueden comprender adicionalmente un sitio de uni6n y al menos un residuo de lisina localizado entre el fluor6foro y el sitio de uni6n. En dichas realizaciones, el metodo para identificar un compuesto que modula una acetiltransferasa puede comprender adicionalmente poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un resto de uni6n que se une a dicho sitio de uni6n. En diversas realizaciones, los pares de sitio de uni6n/resto de uni6n pueden ser, por ejemplo, antigeno/anticuerpo, biotina/avidina, biotina/estreptavidina y una regi6n Fc o una porci6n de la misma/proteina A o proteina G.
En ciertas realizaciones, la acetiltransferasa puede ser, por ejemplo, Gcn5 o p300/CBP.
En ciertas realizaciones, el reactivo que escinde el sustrato peptidico puede ser una proteasa tal como, por ejemplo, lisilendopeptidasa, endoproteinasa, Lys-C, plasmina, calpaina o tripsina.
En ciertas realizaciones, el fluor6foro puede ser, por ejemplo, MR121 o 5TMR.
En ciertas realizaciones, la secuencia del sustrato peptidico puede derivar de una histona, una proteina HMG, p53, c-Myb, GATA-1, EKLF, MyoD, E2F, dTCF o Tat de VIH, o un fragmento de las mismas.
En ciertas realizaciones, se identifica un compuesto que inhibe la actividad de la acetiltransferasa. En dichas realizaciones, una reducci6n en el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos tras el contacto con la acetiltransferasa en presencia del compuesto de ensayo, en comparaci6n con un control, es indicativa de un compuesto que inhibe la actividad de la acetiltransferasa.
En ciertas realizaciones, se identifica un compuesto que aumenta la actividad de la acetiltransferasa. En dichas realizaciones, un aumento en el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos tras el contacto con la acetiltransferasa en presencia del compuesto de ensayo, en comparaci6n con un control, es indicativo de un compuesto que aumenta la actividad de la acetiltransferasa.
En ciertas realizaciones, el compuesto es una molecula pequena.
En otro aspecto, la invenci6n proporciona un metodo para determinar la actividad de una enzima que modula la acetilaci6n de un sustrato peptidico que comprende: (a) poner en contacto un conjunto de sustratos peptidicos con una enzima que modula la acetilaci6n; (b) poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un reactivo de escisi6n y (c) determinar el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos, en el que un cambio en el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos es indicativo de actividad de la enzima que modula la acetilaci6n.
En otro aspecto, la invenci6n proporciona un metodo para identificar un compuesto que modula la actividad de una enzima que modula la acetilaci6n de un sustrato peptidico que comprende: (a) poner en contacto un conjunto de sustratos peptidicos con una enzima que modula la acetilaci6n en presencia de un compuesto de ensayo; (b) poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un reactivo de escisi6n y (c) determinar el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos, en el que un cambio en el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos en presencia del compuesto de ensayo es indicativo de un compuesto que modula la actividad de la enzima que modula la acetilaci6n.
La practica de los presentes metodos empleara, a menos que se indique otra cosa, tecnicas convencionales de biologia celular, cultivo celular, biologia molecular, biologia transgenica, microbiologia, ADN recombinante e inmunologia, que estan dentro de las habilidades de la materia. Dichas tecnicas se explican detalladamente en la bibliografia. Veanse, por ejemplo, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2a Ed., ed. de Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); "DNA Cloning", volumenes I y II (D.N. Glover ed., 1985); "0ligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed., 1984); Mullis et al. p atente de EE.UU. nO 4.683.195; "Nucleic Acid Hybridization" (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); "Transcription And Translation" (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); "Culture 0f Animal Cells" (R.L. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); "Immobilized Cells And Enzymes"
(IRL Press, 1986); B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984); el tratado "Methods In Enzymology" (Academic Press, Inc., N.Y.); "Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells" (J. H. Miller y M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); "Methods In Enzymology", Vol. 154 y 155 (Wuet al. eds.), "Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology" (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); "Handbook 0f Experimental Immunology", volumenes I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986); "Manipulating the Mouse Embryo", (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).
DESCRIPCION�DETAAAADA
1.�Dfioeoionef�
Como se usan en la presente memoria, los siguientes terminos y frases tendran los significados expuestos a continuaci6n. A menos que se definan de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientificos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que se entiende comunmente por un especialista en la materia.
Las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen la referencia al plural a menos que el contexto imponga claramente otra cosa.
Los terminos "comprende" y "comprendiendo" se usan en el sentido inclusivo abierto, lo que significa que pueden incluirse elementos adicionales.
El termino "residuo conservado" designa un aminoacido que es un miembro de un grupo de aminoacidos que tienen ciertas propiedades comunes. El termino "sustituci6n aminoacidica conservativa" designa la sustituci6n (conceptual
o de otro modo) de un aminoacido de uno de dichos grupos por un aminoacido diferente del mismo grupo. Un modo funcional de definir las propiedades comunes entre aminoacidos individuales es analizar las frecuencias normalizadas de cambios aminoacidicos entre las correspondientes proteinas de organismos hom6logos (Schulz,
G.E. y R.H. Schirmer., "Principles of Protein Structure", Springer-Verlag). Segun dichos analisis, pueden definirse grupos de aminoacidos en que los aminoacidos de un grupo se intercambian preferiblemente entre si, y por lo tanto se parecen entre si sobre todo en su impacto sobre la estructura global de la proteina (Schulz, G.E. y R.H. Schirmer, "Principles of Protein Structure", Springer-Verlag). Un ejemplo de una serie de grupos de aminoacidos definida de esta manera incluye: (i) un grupo de residuos cargados constituido por Glu y Asp, Lys, Arg y His, (ii) un grupo de residuos cargados positivamente constituido por Lys, Arg e His, (iii) un grupo de residuos cargados negativamente, constituido por Glu y Asp, (iv) un grupo de residuos aromaticos constituido por Phe, Tyr y Trp, (v) un grupo de residuos con anillo nitrogenado constituido por His y Trp, (vi) un grupo de residuos no polares alifaticos grandes constituido por Val, Leu e Ile, (vii) un grupo de residuos ligeramente polares constituido por Met y Cys, (viii) un grupo de residuos pequenos constituido por Ser, Thr, Asp, Asn, Gly, Ala, Glu, Gln y Pro, (ix) un grupo de residuos alifaticos constituido por Val, Leu, Ile, Met y Cys y (x) un grupo de residuos hidroxilicos pequenos constituido por Ser y Thr.
El termino "incluye" se usa para indicar "incluye pero sin limitaci6n". "Incluye" e "incluye pero sin limitaci6n" se usan intercambiablemente.
El termino "mamifero" es conocido en la materia, y los mamiferos ejemplares incluyen seres humanos, primates, animales de granja (incluyendo bovinos, porcinos, etc.), animales de compania (por ejemplo, caninos, felinos, etc.) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas).
El termino "modula", cuando se usa con referencia a la actividad de una acetiltransferasa o desacetilasa, designa la regulaci6n positiva (por ejemplo, activaci6n o estimulaci6n), regulaci6n negativa (por ejemplo, inhibici6n o supresi6n) u otro cambio de la calidad de dicha actividad acetiltransferasa o desacetilasa.
El termino "identidad porcentual" designa la identidad de secuencia entre dos secuencias aminoacidicas o entre dos secuencias nucleotidicas. La identidad puede determinarse cada vez comparando una posici6n en cada secuencia que puede alinearse con fines de comparaci6n. Cuando una posici6n equivalente en las secuencias comparadas esta ocupada por la misma base o aminoacido, entonces las moleculas son identicas en esa posici6n; cuando el sitio equivalente esta ocupado por el mismo o similar residuo aminoacidico (por ejemplo, similar en la naturaleza esterica y/o electr6nica), entonces las moleculas pueden designarse como hom6logas (similares) en esa posici6n. La expresi6n de un porcentaje de homologia, similitud o identidad designa una funci6n del numero de aminoacidos identicos o similares en posiciones compartidas por las secuencias comparadas. Pueden usarse diversos algoritmos y/o programas de alineamiento, incluyendo FASTA, BLAST o ENTREZ. FASTA y BLAST estan disponibles como parte del paquete de analisis de secuencia GCG (University of Wisconsin, Madison, Wis.), y pueden usarse, por ejemplo, con los ajustes por defecto. ENTREZ esta disponible en el National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, MD. En una realizaci6n, la identidad porcentual de dos secuencias puede determinarse mediante el programa GCG con una ponderaci6n de hueco de 1, por ejemplo, cada hueco aminoacidico se pondera como si fuera un desapareamiento aminoacidico o nucleotidico individual entre las dos secuencias.
Se describen otras tecnicas de alineamiento en "Methods in Enzymology", vol. 266: "Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis" (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., una filial de Harcourt Brace & Co., San Diego, California, EE.UU.. Preferiblemente, se utiliza para alinear las secuencias un programa de alineamiento
que permita huecos en la secuencia. El Smith-Waterman es un tipo de algoritmo que permite huecos en los alineamientos de secuencia. Vease Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997). Tambien puede utilizarse el programa GAP, que usa el metodo de alineamiento de Needleman y Wunsch, para alinear secuencias. Una estrategia de busqueda alternativa usa el software MPSRCH, que funciona en un ordenador MASPAR. El MPSRCH usa un algoritmo de Smith-Waterman para puntuar las secuencias en un ordenador de procesamiento paralelo masivo. Este enfoque mejora la capacidad de captar coincidencias relacionadas lejanamente, y es especialmente tolerante con huecos pequenos y errores de la secuencia nucleotidica. Las secuencias aminoacidicas codificadas por acidos nucleicos pueden usarse para buscar tanto en bases de datos de proteinas como de ADN.
El termino "portador farmaceuticamente aceptable" esta reconocido en la materia y destina un material, composici6n o vehiculo farmaceuticamente aceptable, tal como una carga liquida o s6lida, diluyente, excipiente, disolvente o material encapsulante, implicado en llevar o transportar cualquier composici6n en cuesti6n o un componente de la misma. Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con la composici6n en cuesti6n y sus componentes y de no ser danino para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como portadores farmaceuticamente aceptables incluyen: (1) azucares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almid6n de maiz y almid6n de patata; (3) celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y celulosa acetato; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes tales como manteca de cacao y ceras de supositorios; (9) aceites tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algod6n, aceite de cartamo, aceite de sesamo, aceite de oliva, aceite de maiz y aceite de soja; (10) glicoles tales como propilenglicol; (11) polioles tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) esteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes de tamponaci6n tales como hidr6xido de magnesio e hidr6xido de aluminio; (15) acido alginico; (16) agua exenta de pir6genos; (17) disoluci6n salina isot6nica; (18) disoluci6n de Ringer; (19) alcohol etilico; (20) disoluciones tamp6n de fosfato y (21) otras sustancias compatibles no t6xicas empleadas en formulaciones farmaceuticas.
El termino "sustancialmente hom6logo", cuando se usa con relaci6n a secuencias aminoacidicas, designa secuencias que son sustancialmente identicas o similares en secuencia entre si, dando lugar a una homologia de conformaci6n y por tanto a la retenci6n en un grado util de una o mas actividades biol6gicas (incluyendo inmunol6gicas). No se pretende que el termino implique una evoluci6n comun de las secuencias.
El termino "sintetico" esta reconocido en la materia y designa la producci6n mediante sintesis quimica o enzimatica in vitro.
El termino "agente terapeutico" esta reconocido en la materia y designa cualquier resto quimico que sea una sustancia biol6gica, fisiol6gica o farmacol6gicamente activa que actue local o sistemicamente en un sujeto. El termino significa tambien cualquier sustancia pretendida para uso en el diagn6stico, cura, mitigaci6n, tratamiento o prevenci6n de la enfermedad o en la potenciaci6n del desarrollo y/o condiciones fisicas o mentales deseables en un animal o ser humano.
El termino "efecto terapeutico" esta reconocido en la materia y designa un efecto local o sistemico en animales, particularmente mamiferos, y mas particularmente seres humanos, causado por una sustancia farmacol6gicamente activa. La frase "cantidad terapeuticamente eficaz" significa aquella cantidad de dicha sustancia que produce algun efecto local o sistemico deseado a una relaci6n de beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento. La cantidad terapeuticamente eficaz de dicha sustancia variara dependiendo del sujeto y de la afecci6n patol6gica que se este tratando, y del peso y edad del sujeto, la gravedad de la afecci6n patol6gica, el modo de administraci6n y similares, que pueden determinarse facilmente por un especialista en la materia.
2. Eesayns df aiftoitraesifrasa/dfsaiftoiasa
Se proporcionan en la presente memoria metodos para determinar la actividad de enzimas acetiltransferasa (acetilasa) y desacetilasa. Los metodos pueden implicar, por ejemplo, poner en contacto un conjunto de sustratos peptidicos con una enzima acetiltransferasa o desacetilasa, escindir el conjunto de sustratos peptidicos y determinar el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos. En otras realizaciones, la invenci6n proporciona metodos para identificar compuestos que modulan la actividad de la enzima acetiltransferasa o desacetilasa. Los metodos pueden implicar, por ejemplo, poner en contacto un conjunto de sustratos peptidicos con una enzima acetiltransferasa o desacetilasa en presencia de un compuesto de ensayo, escindir el conjunto de sustratos peptidicos y determinar el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos.
Se determina la actividad de una enzima acetiltransferasa (o acetilasa) usando los metodos descritos en la presente memoria. Una acetilasa es una enzima que cataliza una reacci6n mediante la cual se transfiere un grupo acetilo (CH3C0-) desde una cierta sustancia (por ejemplo, acetil-CoA) hasta un peptido. Las acetilasas ejemplares incluyen, por ejemplo, miembros de la superfamilia GNAT (N-acetiltransferasa relacionada con Gcn5) tales como, por ejemplo, Hat1, Gcn5, PCAF, Elp3 y Hpa2; miembros de la familia MYST (M0Z, Ybf2/Sas3, Sas2 y Tip60) tales como, por ejemplo, Sas2, Sas3, Esa1, M0F, Tip60, M0Z, M0RF y HB01; p300/CBP; coactivadores de receptor nuclear tales como, por ejemplo, SRC-1, ACTR, y TIF2; TAFII250; proteinas TFIIIC tales como, por ejemplo, TFIIIC220, TFIllC110 y TFIIIC90. Pueden usarse tambien hom6logos, por ejemplo, ort6logos y paralogos, dominios, fragmentos, variantes
y derivados de los anteriores segun los metodos descritos en la presente memoria. Las acetilasas y sus sustratos se revisan, por ejemplo, en Sterner y Berger, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64: 453-459 (2000).
Se determina la actividad de una enzima desacetilasas usando los metodos descritos en la presente memoria. Una desacetilasa es una enzima que libera un grupo acetilo a partir de un peptido acetilado. Las enzimas desacetilasa ejemplares incluyen, por ejemplo, histona desacetilasas (HDAC) de clase I o II y HDAC de clase III (o sirtuinas). Las HDAC de clase I (HDAC 1, 2, 3 y 8) muestran similitud con la proteina RPD3 de levadura, estan localizadas en el nucleo y se encuentran en complejos asociados con correpresores transcripcionales. Las HDAC de clase II (HDAC 4, 5, 6, 7 y 9) son similares a la proteina HDA1 de levadura, y tienen localizaci6n subcelular tanto nuclear como citoplasmatica. Tanto las HDAC de clase I como II se inhiben por inhibidores de HDAC basados en acido hidroxamico tales como SAHA. Las HDAC de clase III forman una clase estructuralmente lejana de enzimas dependientes de NAD que estan relacionadas con las proteinas SIR2 de levadura y no se inhiben por inhibidores de HDAC basados en acido hidroxamico.
Las enzimas HDAC ejemplares de clase I o II que pueden usarse segun los metodos descritos en la presente memoria incluyen, por ejemplo, las HDAC 1-8 humanas, por ejemplo, HDAC-1 (nO de acceso a GenBank AAC50475 (nucleotidica), U50079 (aminoacidica)), HDAC-2 (nO de acceso a GenBank AAC50814 (nucleotidica), U31814 (aminoacidica)), HDAC-3 (nO de acceso a GenBank AAB88241 (nucleotidica), U75697 (aminoacidica)), HDAC-4 (nO de acceso a GenBank BAA22957 (nucleotidica), AB006626 (aminoacidica)), HDAC-5 (nO de acceso a GenBank BAA25526 (nucleotidica), AB011172 (aminoacidica)), HDAC-6 (nO de acceso a GenBank AAD29048 (nucleotidica), AJ011972 (aminoacidica)), HDAC-7 (nO de acceso a GenBank AAF63491.1 (nucleotidica), AF239243 (aminoacidica)) o HDAC-8 (nO de acceso a GenBank AAF73076.1 (nucleotidica), AF230097 (aminoacidica)), asi como hom6logos, por ejemplo, ort6logos y paralogos, dominios, fragmentos, variantes y derivados de las anteriores.
En otras realizaciones, una desacetilasa que puede usarse segun los metodos descritos en la presente memoria es una proteina sirtuina. Una proteina sirtuina designa un miembro de la familia de proteinas desacetilasas sirtuinas, o preferiblemente la familia sir2, que incluye las proteinas Sir2 de levadura (nO de acceso a GenBank P53685), Sir-2.1 de C. elegans (nO de acceso a GenBank Nip 501912) y SIRT1 (nO de acceso a GenBank NM 012238 y NP 036370 (o AF083106)) y SIRT2 (nO de acceso a GenBank NM 012237, NM 030593, NP 036369, NP 085096 y AF083107) humanas. 0tros miembros de la familia incluyen los cuatro genes de tipo Sir2 de levadura adicionales denominados "genes HST' (hom6logos de Sir2) HST1, HST2, HST3 y HST4, y los cinco otros hom6logos humanos hSIRT3, hSIRT4, hSIRT5, hSIRT6 y hSIRT7 (Brachmann et al. (1995) Genes Dev. 9:2888 y Frye et al. (1999) BBRC 260: 273). Pueden usarse tambien hom6logos, por ejemplo, ort6logos y paralogos, dominios, fragmentos, variantes y derivados de las anteriores segun los metodos descritos en la presente memoria.
En una realizaci6n ejemplar, los metodos descritos en la presente memoria pueden usarse para determinar la actividad de una proteina SIRT1. Una proteina SIRT1 designa un miembro de la familia sir2 de desacetilasas sirtuinas. En una realizaci6n, una proteina SIRT1 incluye las proteinas Sir2 de levadura (nO de acceso a GenBank P53685), Sir-2.1 de C. elegans (nO de acceso a GenBank NP 501912), SIRT1 humana (nO de acceso a GenBank NM 012238 o NP 036370 (o AF083106)) y SIRT2 humana (nO de acceso a GenBank NM 012237, NM 030593, NP 036369, NP 085096 o AF083107), y equivalentes y fragmentos de las mismas. En otra realizaci6n, una proteina SIRT1 incluye un polipeptido que comprende una secuencia constituida, o constituida esencialmente, por la secuencia aminoacidica expuesta en los nO de acceso a GenBank NP 036370, NP 501912, NP 085096, NP 036369 o P53685. Las proteinas SIRT1 incluyen polipeptidos que comprenden toda o una porci6n de la secuencia aminoacidica expuesta en los nO de acceso a GenBank NP 036370, NP 501912, NP 085096, NP 036369 o P53685; la secuencia aminoacidica expuesta en los nO de acceso a GenBank NP 036370, NP 501912, NP 085096, NP 036369 o P53685, con 1 a aproximadamente 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 50, 75 o mas sustituciones aminoacidicas conservativas; una secuencia aminoacidica que es al menos un 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% identica a la de los nO de acceso a GenBank NP 036370, NP 501912, NP 085096, NP 036369 o P53685 y fragmentos funcionales de las mismas. Las proteinas SIRT1 incluyen tambien hom6logos (por ejemplo, ort6logos y paralogos), variantes o fragmentos de los nO de acceso a GenBank NP 036370, NP 501912, NP 085096, NP 036369 o P53685.
En una realizaci6n, los metodos descritos en la presente memoria pueden usarse para determinar la actividad de una proteina SIRT3. Una proteina SIRT3 se refiere a un miembro de la familia de proteinas desacetilasas sirtuinas y/o a un hom6logo de una proteina SIRT1. En una realizaci6n, una proteina SIRT3 incluye las proteinas SIRT3 humana (nO de acceso a GenBank AAH01042, NP 036371 o NP 001017524) y SIRT3 de rat6n (nO de acceso a GenBank NP 071878), y equivalentes o fragmentos de las mismas. En otra realizaci6n, una proteina SIRT3 incluye un polipeptido que comprende una secuencia constituida, o constituida esencialmente, por la secuencia aminoacidica expuesta en los nO de acceso a GenBank AAH01042, NP 036371, NP 001017524 o NP 071878. Las proteinas SIRT3 incluyen polipeptidos que comprenden toda o una porci6n de la secuencia aminoacidica expuesta en los nO de acceso a GenBank AAH01042, NP 036371, NP 001017524 o NP 071878; la secuencia aminoacidica expuesta en los nO de acceso a GenBank AAH01042, NP 036371, NP 001017524 o NP 071878, con 1 a aproximadamente 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 50, 75 o mas sustituciones aminoacidicas conservativas; una secuencia aminoacidica que es al menos un 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% identica a los nO de acceso a GenBank AAH01042, NP 036371, NP 001017524 o NP 071878 y fragmentos funcionales de las mismas. Las
proteinas SIRT3 incluyen tambien hom6logos (por ejemplo, ort6logos y paralogos), variantes o fragmentos de los nO de acceso a GenBank AAH01042, NP 036371, NP 001017524 o NP 071878.
En otra realizaci6n, puede usarse una porci6n biol6gicamente activa de una sirtuina segun los metodos descritos en la presente memoria. Una porci6n biol6gicamente activa de una sirtuina designa una porci6n de una proteina sirtuina que tiene actividad biol6gica, tal como la capacidad de desacetilar. Las porciones biol6gicamente activas de las sirtuinas pueden comprender el dominio central de una sirtuina. Las porciones biol6gicamente activas de SIRT1 que tienen el nO de acceso a GenBank NP 036370 que comprenden el dominio de uni6n a NAD+ y el dominio de uni6n a sustrato pueden incluir, por ejemplo y sin limitaci6n, los aminoacidos 62-293 del nO de acceso a GenBank NP 036370, que estan codificados por los nucle6tidos 237 a 932 del nO de acceso a GenBank No. NM 012238. Por lo tanto, esta regi6n se designa a veces como el dominio central. 0tras porciones biol6gicamente activas de SIRT1, designadas a veces tambien como dominios centrales, incluyen aproximadamente los aminoacidos 261 a 447 del nO de acceso a GenBank NP 036370, que estan codificados por los nucle6tidos 834 a 1394 del nO de acceso a GenBank NM 012238; aproximadamente los aminoacidos 242 a 493 del nO de acceso a GenBank NP 036370, que estan codificados por los nucle6tidos 777 a 1532 del nO de acceso a GenBank NM 012238; o aproximadamente los aminoacidos 254 a 495 del nO de acceso a GenBank NP 036370, que estan codificados por los nucle6tidos 813 a 1538 del nO de acceso a GenBank NM 012238. En otra realizaci6n, una porci6n biol6gicamente activa de una sirtuina puede ser un fragmento de una proteina SIRT3 que se produce mediante escisi6n con una peptidasa procesadora de matriz mitocondrial (MPP) y/o una peptidasa intermedia mitocondrial (MIP).
Pueden usarse una amplia variedad de sustratos peptidicos segun los metodos descritos en la presente memoria. Cuando se determina la actividad de una acetiltransferasa, el sustrato peptidico utilizado en la reacci6n comprende al menos un residuo de lisina no acetilada. Cuando se determina la actividad de una desacetilasa, el sustrato peptidico utilizado en la reacci6n comprende al menos un residuo de lisina acetilada.
La secuencia del sustrato peptidico puede obtenerse, o derivarse, a partir de una proteina que puede acetilarse o desacetilarse por una acetiltransferasa o desacetilasa, respectivamente. Los sustratos ejemplares para acetiltransferasas y desacetilasas incluyen, por ejemplo, histonas (por ejemplo, H1, H2, H2A, H2B, H3 y H4), proteinas de cromatina no histonas (por ejemplo, HMG1, HMG2, Sin1 de levadura, HMG14, HMG17 y HMGI(Y)), activadores transcripcionales (por ejemplo, p53, c-Myb, GATA-1, EKLF, MyoD, E2F, dTCF y Tat de VIH), coactivadores de receptor nuclear (por ejemplo, ACTR, SRC-1, TIF2), factores de transcripci6n generales (por ejemplo, TFIIE y TFIIF), importina-a7, Rch1 y a-tubulina. Los sustratos peptidicos usados segun los metodos descritos en la presente memoria comprenden un sustrato proteico completo o una porci6n del mismo que contiene al menos un residuo de lisina. En ciertas realizaciones, puede ser deseable modificar la secuencia de un sustrato proteico, o un fragmento del mismo, para eliminar uno o mas residuos de lisina y/o arginina. Por ejemplo, puede ser deseable tener un sustrato peptidico que comprenda residuos de lisina pero ningun otro residuo cargado positivamente (tal como arginina), de tal modo que tras la escisi6n con una proteasa tal como tripsina, la escisi6n del sustrato peptidico sera dependiente del estado de acetilaci6n de los residuos de lisina en el sustrato e independiente de los residuos de arginina. Adicionalmente, puede ser deseable tener un sustrato peptidico que contenga uno o mas residuos de lisina localizados solo en localizaciones deseadas en el sustrato peptidico, por ejemplo, entre un fluor6foro y un grupo de alto peso molecular o voluminoso. En ciertas realizaciones, puede ser deseable tener un sustrato peptidico que contenga solo un unico residuo de lisina y este exento de residuos de arginina. En una realizaci6n ejemplar, puede estar localizado un residuo de lisina en el sustrato peptidico de tal modo que, tras la escisi6n del sustrato peptidico en o cerca del sitio del residuo de lisina, el diferencial de tamano entre un sustrato peptidico no escindido y la porci6n de un sustrato peptidico escindido que contiene el fluor6foro sea suficiente para proporcionar un cambio de polarizaci6n de fluorescencia. Pueden eliminarse uno o mas residuos de lisina y/o arginina de una secuencia de sustrato peptidico reemplazando el residuo aminoacidico por un residuo aminoacidico diferente o eliminando el residuo aminoacidico de la secuencia sin sustituci6n por un aminoacido diferente. En ciertas realizaciones, pueden reemplazarse uno o mas residuos de lisina y/o arginina usando una sustituci6n aminoacidica conservativa en la que dicha sustituci6n no es lisina ni arginina.
Los sustratos peptidicos que pueden usarse segun los metodos descritos en la presente memoria pueden sintetizarse segun metodos convencionales. Los sustratos peptidicos pueden incluir peptidos de origen natural, peptidos preparados mediante tecnicas de recombinaci6n genetica y peptidos sinteticos. Los peptidos pueden estar condensados con otros peptidos (por ejemplo, glutation-S-transferasa, marcador HA, marcador FLAG, etc.) por conveniencia de purificaci6n, etc. Adicionalmente, el peptido puede comprender unidades estructurales distintas de aminoacidos a condici6n de que sirva como sustrato para una desacetilasa, o acetiltransferasa, y una proteasa. Tipicamente, se consigue la sintesis de un peptido anadiendo aminoacidos, residuo a residuo, al extremo carboxilo de la secuencia aminoacidica de interes. Adicionalmente, algunos de los fragmentos peptidicos sintetizados de ese modo pueden estar ligados conjuntamente, formando una molecula peptidica mayor. Para medir la actividad desacetilasa, el sustrato peptidico tiene que estar acetilado antes de realizarse la reacci6n. Un metodo ejemplar de acetilaci6n aminoacidica incluye la acetilaci6n de aminoacidos cuyos grupos a-amino y amino de cadena lateral estan bloqueados con grupos protectores, con anhidrido acetico, acetato de N-hidroxisuccinimida o reactivos similares. Estos aminoacidos acetilados se usan entonces para sintetizar peptidos que comprenden residuos de lisina acetilada, por ejemplo, usando el metodo en fase s6lida. Generalmente, los peptidos acetilados pueden sintetizarse usando un sintetizador peptidico segun el metodo de Fmoc. Por ejemplo, los suministradores comerciales, que proporcionan servicios de sintesis peptidica a medida, pueden sintetizar peptidos que tienen secuencias aminoacidicas especificas que comprenden residuos acetilados en posiciones predeterminadas.
El sustrato peptidico comprende tambien al menos un fluor6foro. Los fluor6foros ejemplares que pueden usarse segun los metodos descritos en la presente memoria se proporcionan a continuaci6n en la Tabla 1. Los metodos para marcar un peptido con un fluor6foro son conocidos en la materia y, por tanto, pueden realizarse segun metodos convencionales. El fluor6foro puede estar ligado covalentemente o conjugado con el peptido para no interferir con la emisi6n de fluorescencia del marcaje, la acetilaci6n o desacetilaci6n del(de los) residuo(s) de lisina, o la escisi6n del sustrato peptidico con una proteasa.
Tabla 1. Fluor6foros disponibles comercialmente y sus maximos de excitaci6n y emisi6n
Toetf
Exiotaio6e/fmoso6e�nem�
AF 350
346/442
AF 430
433/539
AF 488
495/519
AF 532
532/554
AF 546
556/573
AF 568
578/603
AF 594
590/617
AF 633
632/647
AF 647
650/668
AF 660
663/690
AF 680
679/702
Dinitrofenilo
349/NA
AMCA
346/442
Azul de cascada
400/420
Azul marino
365/460
Fluoresceina/FITC
494/518
Verde de 0reg6n 488
496/524
Verde de rodamina
505/527
B0DIPY FL
504/513
B0DIPY TMR
535/574
B0DIPY TR
588/617
Verde de 0reg6n 514
511/530
Rojo de rodamina
570/590
Tetrametilrrodamina
555/580
Rojo de Tejas
595/615
B0DIIPY 630/650
632/640
B0DTPY 650/665
651/660
QSY7
560/NA
FluorX
494/520
Toetf
Exiotaio6e/fmoso6e�nem�
Cy2 bis
489/506
Cy3 mono
550/570
Cy3.5 mono
581/596
Cy5 mono
649/670
Cy5.5 mono
675/694
Cy7 mono
743/767
DEAC
432/472
R6G
524/552
TAMRA
547/573
MR121
635/680
En ciertas realizaciones, el sustrato peptidico comprende adicionalmente un grupo de alto peso molecular o un grupo voluminoso. El grupo de alto peso molecular o grupo voluminoso esta separado del fluor6foro por al menos un residuo de lisina. Cuando el residuo de lisina esta en estado no acetilado, el sustrato peptidico es susceptible de escisi6n en o cerca del residuo de lisina por un reactivo de escisi6n tal como una proteasa. Cuando el residuo de lisina esta en estado acetilado, el sustrato peptidico es resistente a la escisi6n y permanece intacto tras el contacto con un reactivo de escisi6n. Tras la escisi6n, se separa el fluor6foro del grupo de alto peso molecular o voluminoso, reduciendo asi el valor de polarizaci6n fluorescente de la muestra.
La polarizaci6n de fluorescencia (PF) esta basada en la teoria de que cuando una molecula marcada fluorescentemente se excita con luz polarizada en un plano de la longitud de onda correcta, emitira luz polarizada despues de su vida media de emisi6n caracteristica (habitualmente nanosegundos). Durante el tiempo entre la excitaci6n y la emisi6n (vida media de fluorescencia), la molecula gira aleatoriamente con respecto al plano de excitaci6n original. La velocidad de giro es directamente proporcional a su volumen o tamano molecular. Las moleculas pequenas giran rapidamente, mientras que las moleculas grandes giran mucho mas lentamente. Si la molecula gira rapidamente durante su vida media de fluorescencia, la emisi6n de fluorescencia se despolariza respecto a la excitaci6n. Si el fluor6foro esta asociado con una molecula mucho mayor, el giro es lento y la emisi6n observada permanece mas polarizada respecto a la excitaci6n. Por tanto, al medir la extensi6n de la polarizaci6n de fluorescencia, puede decirse si un fluor6foro esta asociado con una molecula grande.
Una ventaja de la PF es que puede utilizarse en ensayos homogeneos y es por lo tanto util para ensayos de cribado de alto rendimiento (HTS en ingles). La PF es tambien apta para efectuar ensayos instantaneos, directamente en disoluci6n y sin necesidad de una fase inmovilizada. Los valores de polarizaci6n pueden medirse repetidamente y despues de la adici6n de reactivos, puesto que la medida de las muestras es rapida y no destruye la muestra.
El valor de polarizaci6n (P) para una molecula dada es proporcional al tiempo de relajaci6n rotacional de la molecula, o a la cantidad de tiempo que le lleva a la molecula rotar alrededor de un angulo de 68,5O. Cuanto menor sea el tiempo de correlaci6n rotacional, mas rapido rota la molecula y se observara menor polarizaci6n. Cuanto mayor sea el tiempo de correlaci6n rotacional, mas lentamente rota la molecula y se observara mayor polarizaci6n. El tiempo de relajaci6n rotacional esta relacionado con la viscosidad (1), la temperatura absoluta (T), el volumen molecular (V) y la constante de los gases (R). El tiempo de relajaci6n rotacional se calcula generalmente segun la siguiente f6rmula:
tiempo de relajaci6n rotacional = 3ηV /RT
Como puede observarse de la ecuaci6n anterior, si se mantienen constantes temperatura y viscosidad, entonces el tiempo de relaci6n rotacional, y por lo tanto el valor de polarizaci6n, esta directamente relacionado con el volumen molecular. Por consiguiente, cuanto mayor sea la molecula, mayor es su valor de polarizaci6n fluorescente, y a la inversa, cuanto menor sea la molecula, menor es su valor de polarizaci6n fluorescente.
En la practica de los metodos descritos en la presente memoria, el sustrato peptidico de partida tiene un bajo tiempo de correlaci6n rotacional. El fluor6foro esta unido con una porci6n del sustrato peptidico que, tras la escisi6n en el residuo de lisina, se libera y exhibe un tiempo de correlaci6n rotacional relativamente rapido (por ejemplo, en comparaci6n con el tiempo de correlaci6n rotacional del sustrato peptidico no escindido). La escisi6n del sustrato peptidico es indirectamente proporcional al estado de acetilaci6n del sustrato peptidico y directamente proporcional a la polarizaci6n de fluorescencia del sustrato peptidico. Por lo tanto, tras un aumento en la acetilaci6n del sustrato
peptidico (por ejemplo, tras exposici6n a una acetiltransferasa), se reduce la escisi6n del sustrato peptidico y aumenta el valor de polarizaci6n de fluorescencia del sustrato peptidico (por ejemplo, el valor de rotaci6n del fluor6foro permanece bajo debido a que esta asociado con la molecula de sustrato peptidico mayor, aumentando asi el tiempo de correlaci6n rotacional). A la inversa, tras una reducci6n de la acetilaci6n del sustrato peptidico (por ejemplo, tras exposici6n a una desacetilasa), aumenta la escisi6n del sustrato peptidico y se reduce el valor de polarizaci6n de fluorescencia del sustrato peptidico (por ejemplo, el valor de rotaci6n del fluor6foro aumenta tras la liberaci6n de la molecula de sustrato peptidico mayor, reduciendo por lo tanto el tiempo de correlaci6n rotacional).
Generalmente, el nivel de polarizaci6n de fluorescencia se calcula usando la siguiente f6rmula:
P = [1(11)− 1 (⊥)[/[1(11)+ 1(⊥)]
en la que I(II) es la fluorescencia detectada en el plano paralelo a la luz de excitaci6n y I(⊥ ) es la fluorescencia detectada en el plano perpendicular a la luz de excitaci6n.
Al efectuar ensayos de cribado, por ejemplo de inhibidores, potenciadores, agonistas o antagonistas potenciales de acetiltransferasas o desacetilasas, se compara el cambio de polarizaci6n de fluorescencia del sustrato peptidico en presencia y ausencia de diferentes compuestos, para determinar si estos diferentes compuestos tienen algun efecto sobre las enzimas que se estan examinando. En particular, en presencia de un inhibidor de acetiltransferasa, se reducira la polarizaci6n de fluorescencia en comparaci6n con un control, ya que estara no acetilada una mayor proporci6n del conjunto de sustratos peptidicos y por lo tanto puede escindirse en el residuo de lisina no acetilada, liberando el fluor6foro de la molecula de sustrato peptidico mayor. En presencia de un activador de acetiltransferasa, aumentara la polarizaci6n de fluorescencia en comparaci6n con un control, ya que estara acetilada una mayor proporci6n del conjunto de sustratos peptidicos y por lo tanto no se escindira, de modo que el fluor6foro permanece asociado con la molecula de sustrato peptidico mayor. En presencia de un inhibidor de desacetilasa, aumentara la polarizaci6n de fluorescencia en comparaci6n con un control, ya que estara acetilada una mayor proporci6n del conjunto de sustratos peptidicos y por lo tanto no se escindira, de modo que el fluor6foro permanece asociado con la molecula de sustrato peptidico mayor. Finalmente, en presencia de un activador de desacetilasa, se reducira la polarizaci6n de fluorescencia en comparaci6n con un control, ya que una mayor proporci6n del conjunto de sustratos peptidicos se volvera no acetilada y por lo tanto puede escindirse en el residuo de lisina no acetilada liberando el fluor6foro de la molecula de sustrato peptidico mayor.
La polarizaci6n de fluorescencia puede monitorizarse en cualquiera de sus tres diferentes estados: estado estacionario, estado transitorio o estado dinamico. En PF en estado transitorio, se irradia con la fuente de luz de excitaci6n la muestra y se monitoriza la polarizaci6n de luz emitida encendiendo el tubo fotomultiplicador despues de apagar la fuente de luz de excitaci6n. Esto reduce la interferencia de dispersi6n de luz, ya que la fluorescencia dura mas que la dispersi6n de luz, pero se pierde algo de intensidad de fluorescencia. En PF de estado estacionario, la monitorizaci6n de la luz de excitaci6n y emisi6n es continua (concretamente, la fuente de excitaci6n y el tubo fotomultiplicador estan encendidos continuamente). Esto da como resultado la medida de un tiempo de giro medio durante el periodo de monitorizaci6n e incluye los efectos de la luz dispersada. La PF dinamica puede monitorizarse en el campo del tiempo o la frecuencia. Las tecnicas de fluorescencia dinamica implican la determinaci6n de la vida media de la molecula fluorescente en nanosegundos. La teoria de la monitorizaci6n de la fluorescencia dinamica se describe en 'Principles of Fluorescence Spectroscopy' (Lakowicz, Plenum Press, 1983). Mientras que la PF en estado estacionario proporciona una media o "instantanea" de los fen6menos de fluorescencia, la PF dinamica permite observar las contribuciones individuales de los componentes fluorescentes del sistema que se esta estudiando. El uso de estas tres tecnicas de fluorescencia se describe en Kumke, et al. (1995. Anal. Chem. 67, 3945-3951) y Devlin, et al. (1993. Clin. Chem. 39, 1939-1943). La metodologia para llevar a cabo la polarizaci6n de fluorescencia se expone en 'Fluorescence Polarization. Technical Resource Guide", 3a edici6n, disponible en PanVera Corporation, Madison, Wis., EE.UU.
Los grupos de alto peso molecular o grupos voluminosos que pueden usarse en asociaci6n con el sustrato peptidico descrito en la presente memoria incluyen cualquiera que sea suficiente para permitir un diferencial en el valor de polarizaci6n de fluorescencia del fluor6foro cuando se asocia con el sustrato peptidico no escindido, en contraposici6n con cuando se ha escindido o liberado de la molecula de sustrato peptidico. Los ejemplos de grupos de alto peso molecular o grupos voluminosos incluyen, por ejemplo, polipeptidos, acidos nucleicos, carbohidratos, etc. En ciertas realizaciones, el grupo de alto peso molecular o voluminoso puede ser simplemente una porci6n del sustrato proteico mismo (por ejemplo, el residuo de lisina esta colocado de tal modo que se libere una porci6n muy pequena de una molecula de sustrato mayor tras la escisi6n). En ciertas realizaciones, el grupo de alto peso molecular o voluminoso puede estar unido covalentemente o unido no covalentemente con el sustrato peptidico. En ciertas realizaciones, el sustrato peptidico puede comprender un sitio de uni6n y el grupo de alto peso molecular o grupo voluminoso puede ser un resto de uni6n que esta unido no covalentemente al sitio de uni6n. La asociaci6n entre el sitio de uni6n y el resto de uni6n puede llevarse a cabo antes o despues de la escisi6n del sustrato peptidico con un reactivo de escisi6n. Pueden usarse diversos pares de sitio de uni6n/resto de uni6n en asociaci6n con las moleculas de sustrato peptidico tales como, por ejemplo, un complejo de biotina/avidina, un complejo de biotina/estreptavidina, una regi6n Fc (o porci6n de la misma)/proteina A o proteina G, un antigeno (por ejemplo, una secuencia peptidica)/anticuerpo, una molecula de ligando/receptor, un aptamero/par de uni6n de aptamero, etc.
Cuando se usa un antigeno como sitio de uni6n, el antigeno puede ser una porci6n del sustrato peptidico mismo, o puede ser una secuencia que se anade, tal como glutation-S-transferasa (GST) o un marcador HA, myc o FLAG, con el fin de interaccionar con un anticuerpo dado. Los metodos para producir anticuerpos son bien conocidos en la materia. Estan comercialmente disponibles anticuerpos especificos de una variedad de secuencias, tales como por ejemplo marcadores GST, HA, Myc o FLAG.
Se muestran a continuaci6n en la Tabla 2 sustratos peptidicos ejemplares de las desacetilasas Sirt1, Sirt2 y Sirt3 que pueden usarse segun los metodos descritos en lapresente memoria.
Tabla 2. Sustratos peptidicos de Sirt1, Sirt2 y Sirt3
Eezoma/basf df ia sfiufeioa�pfptidoia
Sfiufeioa SEQ�ID�NO
Sirt1/p53
Ac-EE-K(biotina)-GQSTSSHS-K(Ac)-Nle-STEGK(MR121)-EE-NH2 SEQ ID N0: 1
Sirt1/p53
Ac-EE-K(biotina)-GQSTSSHS-K(Ac)-Nle-STEG-K(5-TMR)-EE-NH2 SEQ ID N0: 2
Sirt1/PGC1a
Biotina-TNPAIV-K(Ac)-TENS-K(MR121)-NH2 SEQ ID N0: 3
Sirt1/PGC1a
Biotina-TNPAIV-K(Ac)-TENS-K(5-TMR)-NH2 SEQ ID N0: 4
Sirt1/PGC1a
Biotina-QHLQA-K(Ac)-PTTLS-K(MR121)-NH2 SEQ ID N0: 5
Sirt1/PGC1a
Biotina-QHLQA-K(Ac)-PTTLS-K(5-TMR)-NH2 SEQ ID N0: 6
Sirt2/a-tubulina
Biotina-MPSD-K(Ac)-TIGG-K(MR121)-NH2 SEQ ID N0: 7
Sirt2/a-tubulina
Biotina-MPSD-K(Ac)-TIGG-K(5-TMR)-NH2 SEQ ID N0: 8
Sirt2/a-tubulina
Biotina-Nle-PSD-K(Ac)-TIGG-K(MR121)-NH2 SEQ ID N0: 9
Sirt2/a-tubulina
Biotina-Nle-PSD-K(Ac)-TIGG-K(5-TMR)-NH2 SEQ ID N0: 10
Sirt2/a-tubulina
Biotina-GQ-Nle-PSD-K(Ac)-TIGG-K(MR121)-NH2 SEQ ID N0: 11
Sirt2/a-tubulina
Biotina-GQ-Nle-PSD-K(Ac)-TIGG-K(5-TMR)-NH2 SEQ ID N0: 12
Sirt3/acetil-CoA sintasa 2
Biotina-SG-K(Ac)-IM-K(MR121)-NH2 SEQ ID N0: 13
Sirt3/acetil-CoA sintasa 2
Biotina-SG-K(Ac)-IM-K(5-TMR)-NH2 SEQ ID N0: 14
Sirt3/acetil-CoA sintasa 2
Biotina-TSSG-K(Ac)-I-Nle-S-K(MR121)-NH2 SEQ ID N0: 15
Sirt3/acetil-CoA sintasa 2
Biotina-TSSG-K(Ac)-I-Nle-S-K(5-TMR)-NH2 SEQ ID N0: 16
Sirt3/acetil-CoA sintasa 2
Biotina-PSTSSG-K(Ac)-I-Nle-SS-K(MR121)-NH2 SEQ ID N0: 17
Sirt3/acetil-CoA sintasa 2
Biotina-PSTSSG-K(Ac)-I-Nle-SS-K(5-TMR)-NH2 SEQ ID N0: 18
Sirt3/histona H4
Biotina-SGSG-K(Ac)-GGS-K(MR121)-NH2 SEQ ID N0: 19
Sirt3/histona H4
Biotina-SGSG-K(Ac)-GGS-K(5-TMR)-NH2 SEQ ID N0: 20
Sirt3/histona H4
Biotina-GSGGA-K(Ac)-SHS-K(MR121)-NH2 SEQ ID N0: 21
Sirt3/histona H4
Biotina-GSGGA-K(Ac)-SHS-K(5-TMR)-NH2 SEQ ID N0: 22
Sirt3/histona H4
Biotina-GASSHS-K(Ac)-VL-K(MR121)-NH2 SEQ ID N0: 23
Sirt3/histona H4
Biotina-GASSHS-K(Ac)-VL-K(5-TMR)-NH2 SEQ ID N0: 24
La invenci6n describe un sustrato peptidico para uso en la determinaci6n de la actividad de una acetiltransferasa o 10 desacetilasa usando polarizaci6n de fluorescencia. El sustrato peptidico comprende un grupo voluminoso (o grupo de alto peso molecular) o un sitio de uni6n de un grupo voluminoso, un fluor6foro y una lisina (para uso como sustrato de una acetiltransferasa) o una lisina acetilada (para uso como sustrato de una desacetilasa) localizada entre el grupo voluminoso y el fluor6foro. En ciertas realizaciones, el sustrato peptidico puede tener la f6rmula general X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7, en la que X1 es 0-50 residuos aminoacidicos, X2 es un sitio de uni6n de un grupo
voluminoso o un grupo voluminoso, X3 es 0-50 aminoacidos, X4 es una lisina o una lisina acetilada, X5 es 0-50 aminoacidos, X6 es un aminoacido modificado con un fluor6foro, X7 es 0-50 residuos aminoacidicos. En ciertas realizaciones, X1, X3, X5 y/o X7 son aminoacidos distintos de lisina o arginina. En ciertas realizaciones, el grupo voluminoso puede ser una secuencia aminoacidica, un sitio de uni6n de un grupo voluminoso, un residuo aminoacidico modificado con un grupo voluminoso o un aminoacido modificado con un sitio de uni6n de un grupo voluminoso. En ciertas realizaciones, el sustrato peptidico tiene la f6rmula general X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7, en la que X1 es 0-10, 0-5 o 0-2 aminoacidos, X2 es un aminoacido modificado con un sitio de uni6n de un grupo voluminoso tal como biotina, X3 es 1-20, 1-10 o 1-5 aminoacidos, X4 es una lisina o una lisina acetilada, X5 es 1-10, 1-5 o 2-5 aminoacidos, X6 es un aminoacido modificado con un fluor6foro y X7 es 0-10, 0-5 o 0-2 residuos aminoacidicos.
La invenci6n describe un sustrato peptidico para uso en la determinaci6n de la actividad de una acetiltransferasa o desacetilasa usando polarizaci6n de fluorescencia, en el que la secuencia del sustrato peptidico puede estar basada en, o derivada de, cualquier sustrato de una enzima acetiltransferasa o desacetilasa. En realizaciones ejemplares, la secuencia del sustrato peptidico esta basada en PGC1a, a-tubulina, acetil-CoA sintetasa 2 o una histona tal como, por ejemplo, histona H4, o porciones de las mismas. En una realizaci6n, el sustrato peptidico esta basado en una porci6n de p53 y comprende la secuencia aminoacidica EEX1GQSTSSHSX2X3STEGX4EE (SEQ ID N0: 25), en la que X1 es un grupo voluminoso o un sitio de uni6n de un grupo voluminoso, X2 es lisina o una lisina acetilada, X3 es un aminoacido distinto de lisina o arginina y X4 es un aminoacido modificado con un fluor6foro. En otra realizaci6n, el sustrato peptidico puede estar basado en una porci6n de PGC1a y comprende la secuencia aminoacidica X1NPAIVX2TENSX3 (SEQ ID N0: 26) o X1HLQAX2PTTLSX3 (SEQ ID N0: 27), en la que X1 es un grupo voluminoso
o un sitio de uni6n de un grupo voluminoso, X2 es lisina o una lisina acetilada y X3 es un aminoacido modificado con un fluor6foro. En una realizaci6n, el sustrato peptidico esta basado en una porci6n de a-tubulina y comprende la secuencia aminoacidica X1PSDX2TIGGX3 (SEQ ID N0: 28), en la que X1 es un grupo voluminoso o un sitio de uni6n de un grupo voluminoso, X2es lisina o lisina acetilada y X3 es un aminoacido modificado con un fluor6foro; o comprende la secuencia aminoacidica X1QX2PSDX3TIGGX4 (SEQ ID N0: 29), en la que X1 es un grupo voluminoso
o un sitio de uni6n de un grupo voluminoso, X2 es un aminoacido distinto de lisina o arginina, X3 es lisina o lisina acetilada y X4 es un aminoacido modificado con un fluor6foro. En una realizaci6n, el sustrato peptidico esta basado en una porci6n de acetil-CoA sintetasa 2 y comprende la secuencia aminoacidica X1GX2IMX3 (SEQ ID N0: 30), en la que X1 es un grupo voluminoso o un sitio de uni6n de un grupo voluminoso, X2 es lisina o lisina acetilada y X3 es un aminoacido modificado con un fluor6foro; o comprende la secuencia aminoacidica X1SSGX2IX3SX4 (SEQ ID N0: 31)
o X1STSSGX2IX3SSX4 (SEQ ID N0: 32), en la que X1 es un grupo voluminoso o un sitio de uni6n de un grupo voluminoso, X2 es lisina o lisina acetilada, X3 es un aminoacido distinto de lisina o arginina y X4 es un aminoacido modificado con un fluor6foro. En una realizaci6n, el sustrato peptidico esta basado en una porci6n de la histona H4 y comprende las secuencias aminoacidicas X1GSGX2GGSX3 (SEQ ID N0: 33), X1SGGAX2SHSX3 (SEQ ID N0: 34) o X1ASSHSX2VLX3 (SEQ ID N0: 35), en las que X1 es un grupo voluminoso o un sitio de uni6n de un grupo voluminoso, X2 es lisina o lisina acetilada y X3 es un aminoacido modificado con un fluor6foro.
La invenci6n describe un sustrato peptidico para uso en la determinaci6n de la actividad de una acetiltransferasa o desacetilasa usando polarizaci6n de fluorescencia, en el que el sustrato comprende una o mas de las SEQ ID N0: 1
24.
Los metodos descritos en la presente memoria utilizan un reactivo de escisi6n que escinde los sustratos peptidicos que contienen residuos de lisina no acetilada pero que no escindira los sustratos peptidicos que contengan residuos de lisina acetilada. El reactivo de escisi6n puede ser un reactivo quimico o enzimatico. En una realizaci6n ejemplar, el reactivo de escisi6n es una proteasa tal como, por ejemplo, una proteasa que escinde en o cerca de un residuo de lisina. Las proteasas ejemplares incluian, por ejemplo, lisilendopeptidasa, endoproteinasa, Lys-C, plasmina, calpaina
o tripsina.
En ciertas realizaciones, los metodos descritos en la presente memoria se llevan a cabo en condiciones que permiten la acetilaci6n o desacetilaci6n del sustrato peptidico por una acetiltransferasa o desacetilasa, respectivamente.
En ciertas realizaciones, el conjunto de sustratos peptidicos comprende una pluralidad de copias de uno o mas sustratos peptidicos. En una realizaci6n ejemplar, un conjunto de sustratos peptidicos comprende una pluralidad de copias del mismo sustrato peptidico. Dichos conjuntos de sustratos peptidicos pueden comprender el sustrato peptidico libre flotando en disoluci6n o unido a una superficie s6lida tal como una placa, perla, filtro, etc. Pueden usarse tambien combinaciones de moleculas de sustrato peptidico flotantes libres y ancladas segun los metodos descritos en la presente memoria.
En ciertas realizaciones, los metodos descritos en la presente memoria pueden llevarse a cabo en un solo recipiente de reacci6n sin necesidad de eliminar reactivos de la mezcla de reacci6n (por ejemplo, un ensayo homogeneo). En diversas realizaciones, los componentes de las reacciones descritas en la presente memoria pueden anadirse secuencial o simultaneamente. Por ejemplo, es posible anadir el reactivo de escisi6n simultanea o posteriormente a la exposici6n del sustrato peptidico a la acetiltransferasa o desacetilasa.
En ciertas realizaciones, la invenci6n proporciona un metodo para identificar un compuesto que modula la actividad de una acetiltransferasa o desacetilasa. Los metodos pueden implicar comparar la actividad de una acetiltransferasa o desacetilasa en presencia de un compuesto de ensayo con la actividad de la acetiltransferasa o desacetilasa en una reacci6n de control. La reacci6n de control puede ser simplemente una reacci6n duplicada en que el compuesto de ensayo no se incluye. Como alternativa, la reacci6n de control puede ser una reacci6n duplicada en presencia de un compuesto que tiene un efecto conocido sobre la actividad acetiltransferasa o desacetilasa (por ejemplo, un
5 activador, inhibidor o un compuesto que no tenga efecto sobre la actividad enzimatica).
Debido a la flexibilidad disponible en el diseno de sustratos peptidicos para los metodos basados en polarizaci6n de fluorescencia descritos en la presente memoria, es posible optimizar los sustratos peptidicos, proporcionando una Km aparente baja y permitiendo por tanto usar una menor concentraci6n de sustrato con respecto a los metodos. La Tabla 3 mostrada a continuaci6n proporciona los valores de Km de una variedad de sustratos peptidicos de sirtuina
10 proporcionados segun los metodos descritos en la presente memoria, en comparaci6n con los valores de Km de varios ensayos de sirtuina publicados o disponibles comercialmente. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, los sustratos peptidicos para uso segun los metodos descritos en la presente memoria pueden optimizarse para proporcionar una Km aparente baja.
Tabla 3. Comparaciones de Km para diversos ensayos de sirtuina
Rfifrfeioa
Eesayn Eezoma Sustratn pfptidoin n*FA ine mariadnr�iiunrfsifetf� Km dfi peptodn nMM) Km df NAD�nMM�
Biomol (Fluor de Lys)1
Fluorescente Sirt1 p53 (aa 379-382) *FL 64 558
Fluorescente
Sirt2 p53 (aa 317-320) *FL 186 547
Fluorescente
Sirt3 p53 (aa 317-320) *FL 32 2034
2Kaeberlein et al.
Liberaci6n de nicotinamida Sirt1 p53 (aa 368-386) sin FL 10,3 132,5
Liberaci6n de nicotinamida
Sirt1 p53 (aa 368-386) *FL 87,6 192
3Marcotte et al.
FRET Sirt1 p53 20-mero (aa 372-387) *FL ND 90
FRET
Sirt2 p53 20-mero (aa 372-387) *FL ND 42
4McDonagh et al.
Liberaci6n de nicotinamida Sirt1 p53 19-mero (aa 368-386) sin FL 10,3 133
Presente invenci6n
Polarizaci6n fluorescente Sirt1 SEQ ID N0: 2 7,8 464
Presente invenci6n
Polarizaci6n fluorescente Sirt2 SEQ ID N0: 9 50 37
Presente invenci6n
Polarizaci6n fluorescente Srit3 SEQ ID N0: 23 ND 50
1Biomol (Fluor de Lys) como se describe en la bibliografia del producto para los kits SIRT1 Fluorimetric Drug Discovery Kit (AK-555), SIRT2 Fluorimetric Drug Discovery Kit (AK-556), SIRT3 Fluorimetric Drug Discovery Kit (AK-557) (Biomol International, Plymouth Meeting, PA); 2Kaeberlein et al., JBC, 280 (17), 17038, 2005; 3Marcotte et al., Anal. Biochem., 332, 90, 2004; 4McDonagh et al., Methods, 36, 346, 2005.
15 En ciertas realizaciones, la invenci6n proporciona metodos para cribar compuestos que modulan la actividad de una acetiltransferasa o desacetilasa. En ciertas realizaciones, los metodos descritos en la presente memoria pueden usarse para identificar un compuesto de ensayo que reduce o aumenta la actividad acetilasa o desacetilasa en al menos aproximadamente un 10%, 25%, 50%, 75%, 80%, 90% o 100% o mas, respecto a en ausencia del compuesto de ensayo.
20 Los compuestos de ensayo pueden ser agentes farmacol6gicos ya conocidos en la materia o pueden ser compuestos anteriormente desconocidos que tengan cualquier actividad farmacol6gica. Los compuestos pueden ser de origen natural o disenados en laboratorio. Pueden aislarse de microorganismos, animales o plantas y pueden
producirse recombinantemente, o sintetizarse mediante metodos quimicos conocidos en la materia. Si se desea, los compuestos de ensayo pueden obtenerse usando cualquiera de los numerosos metodos de colecci6n combinatoria conocidos en la materia incluyendo, pero sin limitaci6n, colecciones biol6gicas, colecciones en paralelo en formato espacialmente definido en fase s6lida o en disoluci6n, metodos de colecciones sinteticas que requieren deconvoluci6n, el metodo de colecci6n de "una perla-un compuesto" y metodos de colecciones sinteticas que usan selecci6n por cromatografia de afinidad. El enfoque de colecciones biol6gicas esta limitado a colecciones polipeptidicas, mientras que los otros cuatro enfoques son aplicables a polipeptidos, olig6meros no peptidicos o colecciones de compuestos de molecula pequena. Vease Lam, Anticancer Drug Des. 12, 145, 1997.
Los metodos para la sintesis de colecciones moleculares son bien conocidos en la materia (veanse, por ejemplo, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med Chem. 37, 1233, 1994). Las colecciones de compuestos pueden presentarse en disoluci6n (vease, por ejemplo, Houghten, BioTechniques 13, 412-421, 1992) o sobre perlas (Lam, Nature 354, 82-84, 1991), chips (Fodor, Nature 364, 555556, 1993), bacterias o esporas (Ladner, patente de EE.UU. nO 5.223.409), plasmidos (Cull et al., Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 89, 1865-1869, 1992) o fagos (Scott y Smith, Science 249, 386-390, 1990; Devlin, Science 249, 404-406, 1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 6378-6382, 1990; Felici, J. Mol. Biol. 222, 301-310, 1991 y Ladner, patente de EE.UU. nO 5.223.409).
Puede cribarse en los compuestos la capacidad de modular la actividad acetiltransferasa o desacetilasa usando cribado de alto rendimiento. Usando cribado de alto rendimiento, pueden ensayarse muchos compuestos discretos en paralelo de modo que pueden cribarse rapidamente un gran numero de compuestos de ensayo. Las tecnicas mas ampliamente establecidas utilizan placas de microvaloraci6n de 96 pocillos. Ademas de las placas, estan comercialmente disponibles muchos instrumentos, materiales, pipeteadores, robots, lavadores de placas y lectores de placas que se ajustan al formato de 96 pocillos.
Como alternativa, pueden usarse ensayos de formato libre o ensayos que no tienen una barrera fisica entre las muestras. Se describen ensayos que implican formatos libres, por ejemplo, en Jayawickreme et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 19, 1614-18 (1994); Chelsky, 'Strategies for Screening Combinatorial Libraries: Novel and Traditional Approaches,' notificado en la First Annual Conference of The Society for Biomolecular Screening en Filadelfia, Pa. (7-10 de nov., 1995) y Salmon et al., Molecular Diversity 2, 57-63 (1996). Se describe otro metodo de cribado de alto rendimiento en Beutel et al., patente de EE.UU. nO 5.976.813.
Los compuestos que activan o inhiben la actividad acetiltransferasa o desacetilasa, que pueden seleccionarse segun el metodo de cribado de la presente invenci6n, son utiles como compuestos candidatos a sustancias antimicrobianas, agentes anticancerosos y una variedad de otros usos. Por ejemplo, los compuestos que activan una proteina desacetilasa sirtuina pueden ser utiles para aumentar la vida media de una celula y para tratar y/o prevenir una amplia variedad de enfermedades y trastornos incluyendo, por ejemplo, enfermedades o trastornos relacionados con el envejecimiento o el estres, diabetes, obesidad, enfermedades neurodegenerativas, neuropatia inducida por quimioterapia, neuropatia asociada con un evento isquemico, enfermedades y/o trastornos oculares, enfermedades cardiovasculares, trastornos de la coagulaci6n sanguinea, inflamaci6n y/o eritema, etc. En otras realizaciones, los inhibidores de desacetilasa sirtuina pueden ser utiles para una variedad de aplicaciones terapeuticas incluyendo, por ejemplo, aumentar la sensibilidad celular al estres, aumentar la apoptosis, el tratamiento del cancer, la estimulaci6n del apetito y/o la estimulaci6n de la ganancia de peso, etc.
La invenci6n describe un sustrato peptidico para uso en la determinaci6n de la actividad de una sirtuina usando polarizaci6n de fluorescencia, en el que el sustrato peptidico comprende la secuencia aminoacidica GQSTSSHSK(Ac)NleSTEG (SEQ ID N0: 36), en la que el sustrato peptidico esta marcado con un fluor6foro y biotina. En diversas realizaciones, el fluor6foro puede ser MR121 o 5TMR. En ciertas realizaciones, el sustrato peptidico es un sustrato de SIRT1 o SIRT3. En ciertas realizaciones, el sustrato peptidico esta marcado en el extremo N con biotina y en el extremo C con el fluor6foro.
La invenci6n describe un sustrato peptidico para uso en la determinaci6n de la actividad de una sirtuina usando polarizaci6n de fluorescencia, en el que el sustrato peptidico comprende la secuencia aminoacidica GASSHSK(Ac)VLK (SEQ ID N0: 37), en la que el sustrato peptidico esta marcado con un fluor6foro y biotina. En diversas realizaciones, el fluor6foro puede ser MR121 o 5TMR. En ciertas realizaciones, el sustrato peptidico comprende la secuencia aminoacidica biotina-GASSHSK(Ac)-VL-K(MR121)-NH2 (SEQ ID N0: 23) o biotina-GASSHS-K(Ac)-VL-K(5-TMR)-NH2 (SEQ ID N0: 24). En ciertas realizaciones, el sustrato peptidico es un sustrato de SIRT1 o SIRT3. En ciertas realizaciones, el sustrato peptidico esta marcado en el extremo N con biotina y en el extremo C con el fluor6foro.
La invenci6n describe un sustrato peptidico para uso en la determinaci6n de la actividad de una sirtuina usando polarizaci6n de fluorescencia, en el que el sustrato peptidico comprende la secuencia aminoacidica EEKGQSTSSHSK(Ac)NleSTEGKEE (SEQ ID N0: 38), en la que el sustrato peptidico esta marcado con un fluor6foro y biotina. En diversas realizaciones, el fluor6foro puede ser MR121 o 5TMR. En ciertas realizaciones, el sustrato peptidico comprende la secuencia aminoacidica Ac-EE-K(biotina)-GQSTSSHS-K(Ac)-Nle-STEG-K(MR121)
EE-NH2 (SEQ ID N0: 1) o Ac-EE-K(biotina)-GQSTSSHS-K(Ac)-Nle-STEG-K(5-TMR)-EE-NH2 (SEQ ID N0: 2). En ciertas realizaciones, el sustrato peptidico es un sustrato de SIRT1 o SIRT3. En ciertas realizaciones, el sustrato peptidico esta marcado en la lisina N-terminal con biotina y en la lisinaC-terminal con el fluor6foro.
La invenci6n describe un sustrato peptidico que determina la actividad de una acetiltransferasa o desacetilasa usando polarizaci6n de fluorescencia, en el que el sustrato peptidico comprende un grupo voluminoso o un sitio de uni6n de un grupo voluminoso, un fluor6foro y una lisina o lisina acetilada localizada entre el grupo voluminoso, o el sitio de uni6n de un grupo voluminoso, y el fluor6foro, con la condici6n de que el sustrato peptidico no comprenda (a) la secuencia aminoacidica GQSTSSHSK(Ac)NleSTEG (SEQ ID N0: 36), en la que el sustrato peptidico de SEQ ID N0: 36 esta marcado con un fluor6foro y biotina; (b) la secuencia aminoacidica GQSTSSHSK(Ac)NleSTEG (SEQ ID N0: 36), en la que el sustrato peptidico esta marcado en el extremo N con biotina y en el extremo C con el fluor6foro; (c) la secuencia aminoacidica GQSTSSHSK(Ac)NleSTEG (SEQ ID N0: 36), en la que el sustrato peptidico esta marcado en el extremo N con biotina y en el extremo C con MR121 y/o (d) la secuencia aminoacidica GQSTSSHSK(Ac)NleSTEG (SEQ ID N0: 36), en la que el sustrato peptidico esta marcado en el extremo N con biotina y en el extremo C con 5TMR.
La invenci6n describe un sustrato peptidico para uso en la determinaci6n de la actividad de una acetiltransferasa o desacetilasa usando polarizaci6n de fluorescencia, en el que el sustrato peptidico comprende un grupo voluminoso o un sitio de uni6n de un grupo voluminoso, un fluor6foro y una lisina o lisina acetilada localizada entre el grupo voluminoso, o el sitio de uni6n de un grupo voluminoso, y el fluor6foro, con la condici6n de que el sustrato peptidico no comprenda (a) la secuencia aminoacidica GASSHSK(Ac)VLK (SEQ ID N0: 37), en la que el sustrato peptidico de SEQ ID N0: 37 esta marcado con un fluor6foro y biotina; (b) la secuencia aminoacidica biotina-GASSHS-K(Ac)-VLK(MR121)-NH2 (SEQ ID N0: 23) y/o (c) la secuencia aminoacidica biotina-GASSHS-K(Ac)-VL-K(5-TMR)-NH2 (SEQ ID N0: 24).
La invenci6n describe un sustrato peptidico para uso en la determinaci6n de la actividad de una acetiltransferasa o desacetilasa usando polarizaci6n de fluorescencia, en el que el sustrato peptidico comprende un grupo voluminoso o un sitio de uni6n de un grupo voluminoso, un fluor6foro y una lisina o lisina acetilada localizada entre el grupo voluminoso, o el sitio de uni6n de un grupo voluminoso, y el fluor6foro, con la condici6n de que el sustrato peptidico no comprenda (a) la secuencia aminoacidica EEKGQSTSSHSK(Ac)NleSTEGKEE (SEQ ID N0: 38), en la que el sustrato peptidico de SEQ ID N0: 38 esta marcado con un fluor6foro y biotina; (b) la secuencia aminoacidica Ac-EEK(biotina)-GQSTSSHS-K(Ac)-Nle-STEG-K(MR121)-EENH2 (SEQ ID N0: 1) y/o (c) la secuencia aminoacidica Ac-EE-K(biotina)-GQSTSSHS-K(Ac)-Nle-STEG-K(5-TMR)-EENH2 (SEQ ID N0: 2).
La invenci6n describe un metodo para determinar la actividad de una proteina sirtuina que comprende: (a) exponer un sustrato peptidico a una proteina sirtuina, en el que el sustrato peptidico comprende la secuencia aminoacidica GQSTSSHSK(Ac)NleSTEG (SEQ ID N0: 36) y esta marcado con un fluor6foro y biotina; (b) escindir el sustrato peptidico con tripsina y (c) observar el valor de polarizaci6n de fluorescencia, en el que una reducci6n del valor de la polarizaci6n de fluorescencia del sustrato peptidico es indicativa de actividad sirtuina. En ciertas realizaciones, el fluor6foro del sustrato peptidico puede ser MR121 o 5TMR. En ciertas realizaciones, la proteina sirtuina es una proteina SIRT1 o SIRT3. En ciertas realizaciones, el sustrato peptidico esta marcado en el extremo N con biotina y en el extremo C con el fluor6foro. En ciertas realizaciones, el metodo comprende adicionalmente poner en contacto el sustrato peptidico con estreptavidina.
En una realizaci6n, la invenci6n proporciona un metodo para determinar la actividad de una proteina sirtuina que comprende: (a) exponer un sustrato peptidico a una proteina sirtuina, en el que el sustrato peptidico comprende la secuencia aminoacidica GASSHSK(Ac)VLK (SEQ ID N0: 37) y esta marcado con un fluor6foro y biotina; (b) escindir el sustrato peptidico con tripsina y (c) observar el valor de polarizaci6n de fluorescencia del sustrato peptidico, en el que una reducci6n del valor de polarizaci6n de fluorescencia del sustrato peptidico es indicativa de actividad sirtuina. En ciertas realizaciones, el fluor6foro del sustrato peptidico puede ser MR121 o 5TMR. En ciertas realizaciones, el sustrato peptidico comprende la secuencia aminoacidica biotina-GASSHS-K(Ac)-VL-K(NM121)-NH2 (SEQ ID N0: 23) o biotina-GASSHS-K(Ac)-VL-K(5-TMR)-NH2 (SEQ ID N0: 24). En ciertas realizaciones, la proteina sirtuina es una proteina SIRT1 o SIRT3. En ciertas realizaciones, el sustrato peptidico esta marcado en el extremo N con biotina y en el extremo C con el fluor6foro. En ciertas realizaciones, el metodo comprende adicionalmente poner en contacto el sustrato peptidico con estreptavidina.
En una realizaci6n, la invenci6n proporciona un metodo para determinar la actividad de una proteina sirtuina que comprende: (a) exponer un sustrato peptidico a una proteina sirtuina, en el que el sustrato peptidico comprende la secuencia aminoacidica EEKGQSTSSHSK(Ac)NleSTEGKEE (SEQ ID N0: 38) y esta marcado con un fluor6foro y biotina; (b) escindir el sustrato peptidico con tripsina y (c) observar el valor de polarizaci6n de fluorescencia del sustrato peptidico, en el que una reducci6n del valor de polarizaci6n de fluorescencia es indicativa de actividad sirtuina. En ciertas realizaciones, el fluor6foro del sustrato peptidico puede ser MR121 o 5TMR. En ciertas realizaciones, el sustrato peptidico comprende la secuencia aminoacidica Ac-EE-K(biotina)-GQSTSSHS-K(Ac)-NleSTEG-K(MR121)-EE-NH2 (SEQ ID N0: 1) o Ac-EE-K(biotina)-GQSTSSHS-K(Ac)-Nle-STEG-K(5-TNM)-EE-NH2 (SEQ ID N0: 2). En ciertas realizaciones, la proteina sirtuina es una proteina SIRT1 o SIRT3. En ciertas realizaciones, el sustrato peptidico esta marcado en el extremo N con biotina y en el extremo C con el fluor6foro. En
ciertas realizaciones, el metodo comprende adicionalmente poner en contacto el sustrato peptidico con estreptavidina.
En una realizaci6n, la invenci6n proporciona un metodo para identificar un modulador de una proteina sirtuina que comprende: (a) exponer un sustrato peptidico a una proteina sirtuina en presencia de un compuesto de ensayo, en el que el sustrato peptidico comprende la secuencia aminoacidica GQSTSSHSK(Ac)NleSTEG (SEQ ID N0: 36) y esta marcado con un fluor6foro y biotina; (b) escindir el sustrato peptidico con tripsina y (c) observar el valor de polarizaci6n de fluorescencia del sustrato peptidico, en el que un cambio del valor de polarizaci6n de fluorescencia en presencia del compuesto de ensayo, en comparaci6n con un control, es indicativo de un compuesto que modula la actividad sirtuina. En ciertas realizaciones, el fluor6foro del sustrato peptidico puede ser MR121 o 5TMR. En ciertas realizaciones, la proteina sirtuina es una proteina SIRT1 o SIRT3. En ciertas realizaciones, el sustrato peptidico esta marcado en el extremo N con biotina y en el extremo C con el fluor6foro. En ciertas realizaciones, el metodo comprende adicionalmente poner en contacto el sustrato peptidico con estreptavidina.
En una realizaci6n, la invenci6n proporciona un metodo para identificar un modulador de una proteina sirtuina que comprende: (a) exponer un sustrato peptidico a una proteina sirtuina en presencia de un compuesto de ensayo, en el que el sustrato peptidico comprende la secuencia aminoacidica GASSHSK(Ac)VLK (SEQ ID N0: 37) y esta marcado con un fluor6foro y biotina; (b) escindir el sustrato peptidico con tripsina y (c) observar el valor de polarizaci6n de fluorescencia del sustrato peptidico, en el que un cambio en el valor de polarizaci6n de fluorescencia del sustrato peptidico en presencia del compuesto de ensayo, en comparaci6n con un control, es indicativo de un compuesto que modula la actividad sirtuina. En ciertas realizaciones, el fluor6foro del sustrato peptidico puede ser MR121 o 5TMR. En ciertas realizaciones, el sustrato peptidico comprende la secuencia aminoacidica biotinaGASSHS-K(Ac)-VL-K(MR121)-NH2 (SEQ ID N0: 23) o biotina-GASSHS-K(Ac)-VL-K(5-TMR)-NH2 (SEQ ID N0: 24). En ciertas realizaciones, la proteina sirtuina es una proteina SIRT1 o SIRT3. En ciertas realizaciones, el sustrato peptidico esta marcado en el extremo N con biotina y en el extremo C con el fluor6foro. En ciertas realizaciones, el metodo comprende adicionalmente poner en contacto el sustrato peptidico con estreptavidina.
En una realizaci6n, la invenci6n proporciona un metodo para identificar un modulador de una proteina sirtuina que comprende: (a) exponer un sustrato peptidico a una proteina sirtuina en presencia de un compuesto de ensayo, en el que el sustrato peptidico comprende la secuencia aminoacidica EEKGQSTSSHSK(Ac)NleSTEGKEE (SEQ ID N0: 38) y esta marcado con un fluor6foro y biotina; (b) escindir el sustrato peptidico con tripsina y (c) observar el valor de polarizaci6n de fluorescencia del sustrato peptidico, en el que un cambio en el valor de polarizaci6n de fluorescencia del sustrato peptidico en presencia del compuesto de ensayo, en comparaci6n con un control, es indicativo de un compuesto que modula la actividad sirtuina. En ciertas realizaciones, el fluor6foro del sustrato peptidico puede ser MR121 o 5TMR. En ciertas realizaciones, el sustrato peptidico comprende la secuencia aminoacidica Ac-EEK(biotina)-GQSTSSHS-K(Ac)-Nle-STEG-K(MR121)-EENH2 (SEQ ID N0: 1) o Ac-EE-K(biotina)-GQSTSSHS-K(Ac)-Nle-STEG-K(5-TMR)-EE-NH2 (SEQ ID N0: 2). En ciertas realizaciones, la proteina sirtuina es una proteina SIRT1 o SIRT3. En ciertas realizaciones, el sustrato peptidico esta marcado en el extremo N con biotina y en el extremo C con el fluor6foro. En ciertas realizaciones, el metodo comprende adicionalmente poner en contacto el sustrato peptidico con estreptavidina.
En ciertas realizaciones, la invenci6n proporciona un metodo para determinar la actividad de una desacetilasa que comprende: (i) poner en contacto un conjunto de sustratos peptidicos con una desacetilasa, en el que los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos comprenden un fluor6foro y al menos un residuo de lisina acetilada; (ii) poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un reactivo que escinde los miembros del conjunto de sustratos peptidicos que tienen residuos de lisina no acetilada y (iii) determinar el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos, en el que una reducci6n del valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos es indicativa de actividad desacetilasa, con la condici6n de que (a) el metodo no comprenda determinar la actividad de una proteina sirtuina exponiendo la proteina sirtuina a un sustrato peptidico que comprende la secuencia aminoacidica GQSTSSHSK(Ac)NleSTEG (SEQ ID N0: 36), en el que dicho sustrato peptidico esta marcado con un fluor6foro y biotina; (b) el metodo no comprenda determinar la actividad de una proteina sirtuina exponiendo la proteina sirtuina a un sustrato peptidico que comprende la secuencia aminoacidica GASSHSK(Ac)VLK (SEQ ID N0: 37), en el que dicho sustrato peptidico esta marcado con un fluor6foro y biotina; (c) el metodo no comprenda determinar la actividad de una proteina sirtuina exponiendo la proteina sirtuina a un sustrato peptidico que comprende la secuencia aminoacidica EEKGQSTSSHSK(Ac)NleSTEGKEE (SEQ ID N0: 38), en el que dicho sustrato peptidico esta marcado con un fluor6foro y biotina y/o (d) el metodo no comprenda determinar la actividad de una proteina sirtuina exponiendo la proteina sirtuina a un sustrato peptidico que comprende una o mas de las siguientes: SEQ ID N0: 1, 2, 23 o 24.
En ciertas realizaciones, la invenci6n proporciona un metodo para determinar la actividad de una desacetilasa que comprende: (a) poner en contacto un conjunto de sustratos peptidicos con una desacetilasa, en el que los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos comprenden un fluor6foro y al menos un residuo de lisina acetilada; (ii) poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un reactivo que escinde los miembros del conjunto de sustratos peptidicos que tienen residuos de lisina no acetilada y (iii) determinar el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos, en el que una reducci6n del valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos es indicativa de actividad desacetilasa, con la condici6n de que (a) la desacetilasa no sea una proteina sirtuina, (b) la desacetilasa no sea SIRT2 humana, (c) la desacetilasa no sea
una proteina SIRT1, (d) la desacetilasa no sea SIRT3 humana, (e) la desacetilasa no sea una proteina SIRT3, (f) la desacetilasa no sea una proteina SIRT1 o SIRT3, (g) el sustrato peptidico no sea Ac-EE-K(biotina)GQSTSSHSK(Ac)NleSTEG-K(MR121)-EE-NH2 (SEQ ID N0: 1), (h) el sustrato peptidico no sea Ac-EE-K(biotina)-GQSTSSHSK(Ac)NleSTEG-K(5TMR)-EE-NH2 (SEQ ID N0: 2), (i) el sustrato peptidico no sea biotina-GASSHSK(Ac)VLK(MR121) (SEQ ID N0: 23), (j) el sustrato peptidico no sea GQSTSSHSK(Ac)NleSTEG (SEQ ID N0: 36), en el que el sustrato peptidico esta marcado con un fluor6foro y biotina, (k) el sustrato peptidico no sea GASSHSK(Ac)VLK (SEQ ID N0: 37), en el que el sustrato peptidico esta marcado con un fluor6foro y biotina y/o (l) el sustrato peptidico no sea EEKGQSTSSHSK(Ac)NleSTEGKEE (SEQ ID N0: 38), en el que el sustrato peptidico esta marcado con un fluor6foro y biotina.
En ciertas realizaciones, la invenci6n proporciona un metodo para identificar un compuesto que modula una desacetilasa que comprende: (i) poner en contacto un conjunto de sustratos peptidicos con una desacetilasa en presencia de un compuesto de ensayo, en el que los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos comprenden un fluor6foro y al menos un residuo de lisina acetilada; (ii) poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un compuesto que escinde los miembros del conjunto de sustratos peptidicos que tienen residuos de lisina no acetilada y (iii) determinar el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos, en el que un cambio del valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos en presencia del compuesto de ensayo, en comparaci6n con un control, es indicativo de un compuesto que modula la actividad de la desacetilasa, con la condici6n de que (a) el metodo no comprenda identificar un modulador de una proteina sirtuina exponiendo la proteina sirtuina a un sustrato peptidico en presencia de un compuesto de ensayo, en el que el sustrato peptidico comprende la secuencia aminoacidica GQSTSSHSK(Ac)NleSTEG (SEQ ID N0: 36) y esta marcado con un fluor6foro y biotina; (b) el metodo no comprenda identificar un modulador de una proteina sirtuina exponiendo la proteina sirtuina a un sustrato peptidico en presencia de un compuesto de ensayo, en el que el sustrato peptidico comprende la secuencia aminoacidica GASSHSK(Ac)VLK (SEQ ID N0: 37) y esta marcado con un fluor6foro y biotina; (c) el metodo no comprenda identificar un modulador de una proteina sirtuina exponiendo la proteina sirtuina a un sustrato peptidico en presencia de un compuesto de ensayo, en el que el sustrato peptidico comprende la secuencia aminoacidica EEKGQSTSSHSK(Ac)NleSTEGKEE (SEQ ID N0: 38) y esta marcado con un fluor6foro y biotina y/o (d) el metodo no comprenda identificar un modulador de una proteina sirtuina exponiendo la proteina sirtuina a un sustrato peptidico en presencia de un compuesto de ensayo, en el que el sustrato peptidico comprende una o mas de las siguientes: SEQ ID N0: 1, 2, 23 o 24.
En ciertas realizaciones, la invenci6n proporciona un metodo para identificar un compuesto que modula una desacetilasa que comprende: (i) poner en contacto un conjunto de sustratos peptidicos con una desacetilasa en presencia de un compuesto de ensayo, en el que los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos comprenden un fluor6foro y al menos un residuo de lisina acetilada; (ii) poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un compuesto que escinde los miembros del conjunto de sustratos peptidicos que tienen residuos de lisina no acetilada y (iii) determinar el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos, en el que un cambio en el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos en presencia del compuesto de ensayo, en comparaci6n con un control, es indicativo de un compuesto que modula la actividad de la desacetilasa, con la condici6n de que (a) la desacetilasa no sea una proteina sirtuina, (b) la desacetilasa no sea SIRT1 humana, (c) la desacetilasa no sea una proteina SIRT1, (d) la desacetilasa no sea SIRT3 humana, (e) la desacetilasa no sea una proteina SIRT3, (f) la desacetilasa no sea una proteina SIRT1 o SIRT3, (g) el sustrato peptidico no sea Ac-EE-K(biotina)-GQSTSSHSK(Ac)NIeSTEG-K(MR121)-EE-NH2 (SEQ ID N0: 1), (h) el sustrato peptidico no sea Ac-EE-K(biotina)-GQSTSSHSK(Ac)NleSTEG-K(5TMR)-EE-NH2 (SEQ ID N0: 2), (i) el sustrato peptidico no sea biotina-GASSHSK(Ac)VLK(MR121) (SEQ ID N0: 23), (j) el sustrato peptidico no sea GQSTSSHSK(Ac)NleSTEG (SEQ ID N0: 36), en el que el sustrato peptidico esta marcado con un fluor6foro y biotina, (k) el sustrato peptidico no sea GASSHSK(Ac)VLK (SEQ ID N0: 37), en el que el sustrato peptidico esta marcado con un fluor6foro y biotina y/o (l) el sustrato peptidico no sea EEKGQSTSSHSK(Ac)NleSTEGKEE (SEQ ID N0: 38), en el que el sustrato peptidico esta marcado con un fluor6foro y biotina.
En una realizaci6n, la invenci6n proporciona un metodo para determinar la actividad de una enzima que modula la acetilaci6n de un sustrato peptidico que comprende (i) poner en contacto un conjunto de sustratos peptidicos con una enzima que modula la acetilaci6n; (ii) poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un reactivo de escisi6n y (iii) determinar el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos, en el que un cambio en el valor de polarizaci6n del conjunto de sustratos peptidicos es indicativo de actividad de la enzima que modula la acetilaci6n, con la condici6n de que (a) el metodo no comprenda determinar la actividad de una proteina sirtuina exponiendo la proteina sirtuina a un sustrato peptidico que comprende la secuencia aminoacidica GQSTSSHSK(Ac)NleSTEG (SEQ ID N0: 36), en el que dicho sustrato peptidico esta marcado con un fluor6foro y biotina; (b) el metodo no comprenda determinar la actividad de una proteina sirtuina exponiendo la proteina sirtuina a un sustrato peptidico que comprende la secuencia aminoacidica GASSHSK(Ac)VLK (SEQ ID N0: 37), en el que dicho sustrato peptidico esta marcado con un fluor6foro y biotina; (c) el metodo no comprenda determinar la actividad de una proteina sirtuina exponiendo la proteina sirtuina a un sustrato peptidico que comprende la secuencia aminoacidica EEKGQSTSSHSK(Ac)NleSTEGKEE (SEQ ID N0: 38), en el que dicho sustrato peptidico esta marcado con un fluor6foro y biotina y/o (d) el metodo no comprenda determinar la actividad de una proteina sirtuina exponiendo la proteina sirtuina a un sustrato peptidico que comprende una o mas de las siguientes: SEQ ID N0: 1, 2, 23, o 24.
En una realizaci6n, la invenci6n proporciona un metodo para determinar la actividad de una enzima que modula la acetilaci6n de un sustrato peptidico que comprende (i) poner en contacto un conjunto de sustratos peptidicos con una enzima que modula la acetilaci6n; (ii) poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un reactivo de escisi6n y (iii) determinar el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos, en el que un cambio en el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos es indicativo de actividad de la enzima que modula la acetilaci6n, con la condici6n de que (a) la enzima que modula la acetilaci6n no sea una proteina sirtuina, (b) la enzima que modula la acetilaci6n no sea SIRT1 humana, (c) la enzima que modula la acetilaci6n no sea SIRT1 humana, (e) la enzima que modula la acetilaci6n no sea una proteina SIRT3, (f) la enzima que modula la acetilaci6n no sea una proteina SIRT1 o SIRT3, (g) el sustrato peptidico no sea Ac-EE-K(biotina)GQSTSSHSK(Ac)NleSTEG-K(MR121)-EE-NH2 (SEQ ID N0: 1), (h) el sustrato peptidico no sea Ac-EE-K(biotina)-GQSTSSHSK(Ac)NleSTEG-K(5TMR)-EE-NH2 (SEQ ID N0: 2), (i) el sustrato peptidico no sea biotina-GASSHSK(Ac)VLK(MR121) (SEQ ID N0: 23), (j) el sustrato peptidico no sea GQSTSSHSK(Ac)NleSTEG (SEQ ID N0: 36), en el que el sustrato peptidico esta marcado con un fluor6foro y biotina, (k) el sustrato peptidico no sea GASSHSK(Ac)VLK (SEQ ID N0: 37), en el que el sustrato peptidico esta marcado con un fluor6foro y biotina y/o (l) el sustrato peptidico no sea EEKGQSTSSHSK(Ac)NleSTEGKEE (SEQ ID N0: 38), en el que el sustrato peptidico esta marcado con un fluor6foro y biotina.
Un metodo para identificar un compuesto que modula la actividad de una enzima que modula la acetilaci6n de un sustrato peptidico comprende (i) poner en contacto un conjunto de sustratos peptidicos con una enzima que modula la acetilaci6n en presencia de un compuesto de ensayo, (ii) poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un reactivo de escisi6n y (iii) determinar el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos, en el que un cambio en el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos en presencia del compuesto de ensayo es indicativo de un compuesto que modula la actividad de la enzima que modula la acetilaci6n, con la condici6n de que (a) el metodo no comprenda la identificaci6n de un modulador de una proteina sirtuina exponiendo la proteina sirtuina a un sustrato peptidico en presencia de un compuesto de ensayo, en el que el sustrato peptidico comprende la secuencia aminoacidica GQSTSSHSK(Ac)NleSTEG (SEQ ID N0: 36) y esta marcado con un fluor6foro y biotina; (b) el metodo no comprenda identificar un modulador de una proteina sirtuina exponiendo la proteina sirtuina a un sustrato peptidico en presencia de un compuesto de ensayo, en el que el sustrato peptidico comprende la secuencia aminoacidica GASSHSK(Ac)VLK (SEQ ID N0: 37) y esta marcado con un fluor6foro y biotina; (c) el metodo no comprenda identificar un modulador de una proteina sirtuina exponiendo la proteina sirtuina a un sustrato peptidico en presencia de un compuesto de ensayo, en el que el sustrato peptidico comprende la secuencia aminoacidica EEKGQSTSSHSK(Ac)NleSTEGKEE (SEQ ID N0: 38) y esta marcado con un fluor6foro y biotina y/o (d) el metodo no comprenda identificar un modulador de una proteina sirtuina exponiendo la proteina sirtuina a un sustrato peptidico en presencia de un compuesto de ensayo, en el que el sustrato peptidico comprende una o mas de las siguientes: SEQ ID N0: 1, 2, 23 o 24.
Un metodo para identificar un compuesto que modula la actividad de una enzima que modula la acetilaci6n de un sustrato peptidico comprende (i) poner en contacto un conjunto de sustratos peptidicos con una enzima que modula la acetilaci6n en presencia de un compuesto de ensayo; (ii) poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un reactivo de escisi6n y (iii) determinar el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos, en el que un cambio del valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos en presencia del compuesto de ensayo es indicativo de un compuesto que modula la actividad de la enzima que modula la acetilaci6n, con la condici6n de que (a) la enzima que modula la acetilaci6n no sea una proteina sirtuina,
(b)
la enzima que modula la acetilaci6n no sea SIRT1 humana, (c) la enzima que modula la acetilaci6n no sea una proteina SIRT1, (d) la enzima que modula la acetilaci6n no sea SIRT3 humana, (e) la enzima que modula la acetilaci6n no sea una proteina SIRT3, (f) la enzima que modula la acetilaci6n no sea una proteina SIRT1 o SIRT3,
(g)
el sustrato peptidico no sea Ac-EE-K(biotina-GQSTSSHSK(Ac)NleSTEG-K(MR121)-EB-NH2 (SEQ ID N0: 1), (h) el sustrato peptidico no sea Ac-EE-K(biotina)-GQSTSSHSK(Ac)NleSTEG-K(5TMR)-EE-NH2 (SEQ ID N0: 2), (i) el sustrato peptidico no sea biotina-GASSHSK(Ac)VLK(MR121) (SEQ ID N0: 23), (j) el sustrato peptidico no sea GQSTSSHSK(Ac)NleSTEG (SEQ ID N0: 36), en el que el sustrato peptidico esta marcado con un fluor6foro y biotina, (k) el sustrato peptidico no sea GASSHSK(Ac)VLK (SEQ ID N0: 37), en el que el sustrato peptidico esta marcado con un fluor6foro y biotina y/o (l) el sustrato peptidico no sea EEKGQSTSSHSK(Ac)NIeSTEGKEE (SEQ ID N0: 38), en el que el sustrato peptidico esta marcado con un fluor6foro y biotina.
EJEMPAIFICACION
Al describirse ahora en general la invenci6n, se entendera mas facilmente por referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen unicamente con fines de ilustraci6n de ciertos aspectos y realizaciones de la presente invenci6n.
EJEMPLO 1: Identificaci6n de moduladores de sirtuina usando SIRT1
Se us6 un ensayo basado en la polarizaci6n de fluorescencia para identificar moduladores de la actividad SIRT1. Puede usarse el mismo ensayo para identificar moduladores de cualquier proteina sirtuina. Los ensayos de polarizaci6n de fluorescencia utilizan uno de dos peptidos diferentes basados en un fragmento de p53, una diana de desacetilaci6n de sirtuina conocida. Se ensayaron los compuestos usando un sustrato que contiene un peptido 1 que tiene 20 residuos aminoacidicos como sigue: Ac-EE-K(biotina)-GQSTSSHSK(Ac)NleSTEG-K(MR121)-EE-NH2 (SEQ ID N0: 1), en el que K(biotina) es un residuo de lisina biotinilada, K(Ac) es un residuo de lisina acetilada, Nle
es norleucina y K(MR121) es un residuo de lisina modificada por un fluor6foro MR121. Este peptido esta marcado con el fluor6foro MR121 (excitaci6n 635 nm/emisi6n 680 nm) en el extremo C y con biotina en el extremo N. La secuencia de los sustratos peptidicos esta basada en p53 con varias modificaciones. En particular, se han reemplazado todos los residuos de arginina y leucina distintos de los residuos de lisina acetilada por serina, de modo que los peptidos no son susceptibles de escisi6n por tripsina en ausencia de desacetilaci6n. Ademas, los residuos de metionina presentes naturalmente en las secuencias se han reemplazado por norleucina debido a que la metionina puede ser susceptible de oxidaci6n durante la sintesis y purificaci6n. Como sustrato alternativo en el ensayo, se ha usado tambien el siguiente peptido 2: Ac-EE-K(biotina)-GQSTSSHSK(Ac)NleSTEG-K(5TMR)-EE-NH2 (SEQ ID N0: 2), en el que K(Ac) es un residuo de lisina acetilada y Nle es norleucina. El peptido esta marcado con el fluor6foro 5TMR (excitaci6n 540 nm/emisi6n 580 nm) en el extremo C. La secuencia del sustrato peptidico esta tambien basada en p53 con varias modificaciones. Ademas, el residuo de metionina naturalmente presente en la secuencia se reemplaz6 por norleucina debido a que la metionina puede ser susceptible de oxidaci6n durante la sintesis y purificaci6n.
Se expusieron los sustratos peptidicos a una proteina sirtuina en presencia de NAD+ para permitir la desacetilaci6n del sustrato y volverlo sensible a la escisi6n por tripsina. Se anadi6 entonces tripsina y se llev6 a termino la reacci6n (concretamente, se escinde el sustrato desacetilado) liberando el fragmento MR121 o 5TMR. Se anade entonces estreptavidina a la reacci6n, donde puede unirse tanto al sustrato no escindido (concretamente, cualquier sustrato acetilado restante) como a la porci6n no fluorescente del sustrato peptidico escindido (concretamente, el fragmento que contiene biotina). La senal de polarizaci6n de fluorescencia observada para los sustratos peptidicos completos unidos a estreptavidina era mayor que la senal de polarizaci6n de fluorescencia observada para el fragmento Cterminal MR121 o 5TMR liberado. De este modo, la polarizaci6n de fluorescencia obtenida es inversamente proporcional al nivel de desacetilaci6n (por ejemplo, la senal es inversamente proporcional a la actividad de la proteina sirtuina). Se leyeron los resultados en un lector de polarizaci6n de fluorescencia en microplaca (Molecular Devices Spectramax MD) con los filtros de excitaci6n y emisi6n apropiados.
Se realizan los ensayos de polarizaci6n de fluorescencia usando el peptido 1 como sigue: se incuban sustrato peptidico 0,5 �M y �NAD+ 150 �M con SIRT1 0,1 �g/ml durante 60 minutos a 37OC en un tamp6n de reacci6n (Trisacetato 25 mM, pH 8, Na-Ac 137 mM, K-Ac 2,7 mM, Mg-Ac 1 mM, 0,05% de Tween-20, 0,1% de Pluronic F127, CaCl2 10 mM, DTT 5 mM, 0,025% de BSA, nicotinamida 0,15 mM). Se disolvieron los compuestos de ensayo 1-18 en DMS0 y se anadieron a la reacci6n a 11 concentraciones en el intervalo de 0,7 �M a 100 �M.
Se realizan los ensayos de polarizaci6n de fluorescencia usando el peptido 2 como sigue: se incubaron sustrato peptidico 0,5 �M y �NAD+ 120 �M con SIRT1 3 nM durante 20 minutos a 25OC en tamp6n de reacci6n (Tris-acetato 25 mM, pH 8, Na-Ac 137 mM, K-Ac 2,7 mM, Mg-Ac 1 mM, 0,05% de Tween-20, 0,1% de Pluronic F127, CaCl2 10 mM, DTT 5 mM, 0,025% de BSA). Se disolvieron los compuestos de ensayo 19-56 en DMS0 y se anadieron a la reacci6n a 10 concentraciones en el intervalo de 300 �M a 0,15 �M en diluciones triples.
Despues de incubar con SIRT1, se anadi6 nicotinamida a la reacci6n hasta una concentraci6n final 3 mM para detener la reacci6n de desacetilaci6n y se anadi6 tripsina 0,5 �g/ml para escindir el sustrato desacetilado. Se incub6 la reacci6n durante 30 minutos a 37OC en presencia de estreptavidina 1 �M. Se determin6 la polarizaci6n fluorescente a las longitudes de onda de excitaci6n (650 nm) y emisi6n (680 nm). Se determina entonces el nivel de actividad de la proteina sirtuina en presencia de diversas concentraciones de compuesto de ensayo, y puede compararse con el nivel de actividad de proteina sirtuina en ausencia del compuesto de ensayo y/o el nivel de actividad de proteinas sirtuinas en el control negativo (por ejemplo, el nivel de inhibici6n) y el control positivo (por ejemplo, el nivel de activaci6n) descritos a continuaci6n.
Para los ensayos de polarizaci6n de fluorescencia, se realiza un control de la inhibici6n de la actividad sirtuina anadiendo 1 �l de nicotinamida 500 mM como control negativo al inicio de la reacci6n (por ejemplo, permite la determinaci6n de la inhibici6n maxima de sirtuina). Se realiz6 un control de la activaci6n de la actividad sirtuina usando proteina sirtuina 3 nM, con 1 �l de DMS0 en lugar de compuesto, para conseguir la desacetilaci6n de base del sustrato (por ejemplo, para determinar la actividad sirtuina normalizada).
Para cada uno de los ensayos anteriores, se expres6 y purific6 la proteina SIRT1 como sigue. Se clon6 el gen SirT1 en un vector que contiene el promotor T7 y se transform6 en BL21 (DE3). Se expres6 la proteina mediante inducci6n con IPTG 1 mM como proteina de fusi6n con marcador His N-terminal a 18OC durante una noche y se recogi6 a
30.000 x g. Se lisaron las celulas con lisozima en tamp6n de lisis (Tris-HCl 50 mM, tris-�2-carboxietil�fosfina (TCEP) 2 mM, ZnCl2 10 �M, NaCl 200 mM) y se trataron adicionalmente con sonicaci6n durante 10 min para completar la lisis. Se purific6 la proteina sobre una columna de Ni-NTA (Amersham) y se combinaron las fracciones que contenian proteina pura, se concentraron y se procesaron por una columna de exclusi6n molecular (Sephadex S200 26/60 global). Se recogi6 el pico que contenia la proteina soluble y se proces6 en una columna de intercambio i6nico (MonoQ). La eluci6n en gradiente (NaCl 200 mM-500 mM) proporcion6 proteina pura. Se concentr6 esta proteina y se dializ6 frente a tamp6n de dialisis (Tris-HCl 20 mM, TCEP 2 mM) durante una noche. Se tomaron alicuotas de la proteina y se congelaron a -80OC hasta su uso posterior.
Se identificaron los compuestos moduladores de sirtuina que activaban SIRT1 usando el ensayo descrito anteriormente y se muestran a continuaci6n en la Tabla 4. Se identificaron los compuestos moduladores de sirtuina que inhibian SIRT1 usando el ensayo descrito anteriormente y se muestran a continuaci6n en la Tabla 5. Se representan los valores de DE50 para los compuestos activadores por A (DE50 : 50 �M), B (DE50= 51-100 �M), C (DE50 =101-150 �M) y D (DE50; 150 �M). NT denota compuestos que no se ensayaron, a menudo debido a problemas de solubilidad. La DE50 del resveratrol para activaci6n de SIRT1 es 16 �M. De forma similar, se representan los valores de CI50 para los compuestos inhibidores por A (CI50 : 50 �M), B (CI50= 51-100 �M), C (CI50= 101-150 �M) y D (CI50 ; 150 �M).
Tabla 4.
Tabla 5
EJEMPLO �: Identificaci6n de moduladores de sirtuina usando SIRT�
Se us6 un ensayo de polarizaci6n de fluorescencia para identificar moduladores de la actividad SIRT2. Puede usarse el mismo ensayo para identificar moduladores de cualquier proteina sirtuina. El ensayo utiliza un sustrato
5 peptidico basado en un fragmento de a-tubulina, una diana de desacetilaci6n de sirtuina conocida. El sustrato contiene un peptido que tiene 14 residuos aminoacidicos como sigue: biotina-Nle-PSD-K(Ac)-TIGG-K(NIR121)-NH2 (SEQ ID N0: 9) en el que K(Ac) es un residuo de lisina acetilada. El peptido esta marcado con el fluor6foro MR121 (excitaci6n 635 nm/emisi6n 680 nm) en el extremo C y con biotina en el extremo N.
Se expone el sustrato peptidico a una proteina sirtuina en presencia de NAD+ para permitir la desacetilaci6n del
10 sustrato y volverlo sensible a escisi6n por tripsina. Se anade entonces tripsina y se lleva a cabo la reacci6n hasta su terminaci6n (concretamente, se escinde el sustrato desacetilado) liberando el fragmento MR121. Se anade entonces estreptavidina a la reacci6n, donde puede unirse tanto al sustrato no escindido (concretamente, cualquier sustrato acetilado restante) como a la porci6n no fluorescente del sustrato peptidico escindido (concretamente, el fragmento que contiene biotina). La senal de polarizaci6n de fluorescencia observada para el sustrato peptidico completo unido
15 a la estreptavidina es mayor que la senal de polarizaci6n de fluorescencia observada para el fragmento C-terminal MR121 liberado. Por lo tanto, la polarizaci6n de fluorescencia obtenida es inversamente proporcional al nivel de desacetilaci6n (por ejemplo, la senal es inversamente proporcional a la actividad de la proteina sirtuina). Se leen los resultados en un lector de polarizaci6n de fluorescencia de microplaca (Molecular Devices Spectramax MD) con filtros de excitaci6n y emisi6n apropiados.
Los ensayos de polarizaci6n de fluorescencia pueden realizarse como sigue: se incuban sustrato peptidico 0,5 �M y �NAD+ 35,7 �M con SIRT2 215 nM durante 60 minutos a 37OC en tamp6n de reacci6n (Tris-acetato 25 mM, pH 8, Na-Ac 137 mM, K-Ac 2,7 mM, Mg-Ac 1 mM, 0,1% de Pluronic F127, CaCl2 10 mM, TCEP 1 mM, 0,025% de BSA). Se disuelven los compuestos de ensayo en DMS0 y se anaden a la reacci6n a 11 concentraciones en el intervalo de 0,7 �M a 100 �M. Se adquiri6 la enzima SIRT2 humana usada en el ensayo (Biomol International, nO de cat. SE-251, Plymouth Meeting, PA). Como fuente alternativa, puede usarse la proteina SIRT2 usada en los ensayos correspondiente a los residuos aminoacidicos 1-319 de SIRT2 humana, con un marcador His N-terminal. Se sobreexpresa la proteina en �. �oli y se purifica en una columna de quelato de niquel usando tecnicas estandares. Despues de 60 minutos de incubaci6n con SIRT2, se anade nicotinamida a la reacci6n a una concentraci6n final 3 mM para detener la reacci6n de desacetilaci6n y se anade tripsina 0,5 �g/ml para escindir el sustrato desacetilado. Se incuba la reacci6n durante 30 minutos a 37OC en presencia de estreptavidina 1 mM. Se determina la polarizaci6n fluorescente a las longitudes de onda de excitaci6n (650 nm) y emisi6n (680 nm). Se determina entonces el nivel de actividad de la proteina sirtuina en presencia de diversas concentraciones del compuesto de ensayo y puede compararse con el nivel de actividad de la proteina sirtuina en ausencia del compuesto de ensayo y/o el nivel de actividad de las proteinas sirtuinas en el control negativo (por ejemplo, nivel de inhibici6n) y control positivo (por ejemplo, nivel de activaci6n) descritos a continuaci6n.
Se realiza un control de la inhibici6n de la actividad sirtuina anadiendo nicotinamida 30 mM al inicio de la reacci6n (por ejemplo, permite la determinaci6n de la inhibici6n maxima de sirtuina). Se realiza un control de la activaci6n de la actividad sirtuina usando proteina sirtuina 0,5 �g/ml para conseguir la desacetilaci6n de base del sustrato (por ejemplo, para determinar la actividad sirtuina normalizada).
EJEMPLO �: Identificaci6n de moduladores de sirtuina usando SIRT�
Se us6 un ensayo de polarizaci6n de fluorescencia para identificar moduladores de la actividad SIRT3. Puede usarse el mismo ensayo para identificar moduladores de cualquier proteina sirtuina. El ensayo utiliza un sustrato peptidico basado en un fragmento de la histona H4, una diana de desacetilaci6n de sirtuina conocida. El sustrato contiene un peptido que tiene 14 residuos aminoacidicos como sigue: biotina-GASSHSK(Ac)VLK(MR121) (SEQ ID N0: 23), en el que K(Ac) es un residuo de lisina acetilada. El peptido se marca con el fluor6foro MR121 (excitaci6n 635 nm/emisi6n 680 nm) en el extremo C y con biotina en el extremo N.
Se expone el sustrato peptidico a una proteina sirtuina en presencia de NAD+ para permitir la desacetilaci6n del sustrato y volverlo sensible a la escisi6n por tripsina. Se anade entonces tripsina y se lleva la reacci6n a su terminaci6n (concretamente, se escinde el sustrato desacetilado) liberando el fragmento MR121. Se anade entonces estreptavidina a la reacci6n, donde puede unirse tanto al sustrato no escindido (concretamente, cualquier sustrato acetilado restante) como a la porci6n no fluorescente del sustrato peptidico escindido (concretamente, el fragmento que contiene biotina). La senal de polarizaci6n de fluorescencia observada para el sustrato peptidico completo unido a estreptavidina es mayor que la senal de polarizaci6n de fluorescencia observada para el fragmento C-terminal MR121 liberado. Por lo tanto, la polarizaci6n de fluorescencia obtenida es inversamente proporcional al nivel de desacetilaci6n (por ejemplo, la senal es inversamente proporcional a la actividad de la proteina sirtuina). Los resultados se leen en un lector de polarizaci6n de fluorescencia de microplaca (Molecular Devices Spectramax MD) con filtros de excitaci6n y emisi6n apropiados.
Los ensayos de polarizaci6n de fluorescencia pueden realizarse como sigue: se incuban sustrato peptidico 0,5 �M y �NAD+ 50 �M con SIRT3 2 nM durante 60 minutos a 37OC en un tamp6n de reacci6n (Tris-acetato 25 mM, pH 8, Na-Ac 137 mM, K-Ac 2,7 mM, Mg-Ac 1 mM, 0,1% de Pluronic F127, CaCl2 10 mM, TCEP 1 mM, 0,025% de BSA). Se disuelven los compuestos de ensayo en DMS0 y se anaden a la reacci6n a 11 concentraciones en el intervalo de 0,7 �M a 100 �M. La proteina SIRT3 usada en los ensayos correspondia a los residuos aminoacidicos 102-399 de SIRT3 humana con un marcador His N-terminal. Se sobreexpres6 la proteina en �. �oli y se purific6 en una columna de quelato de niquel usando tecnicas estandares. Despues de 60 minutos de incubaci6n con SIRT3, se anade nicotinamida a la reacci6n a una concentraci6n final 3 mM para detener la reacci6n de desacetilaci6n y se anade tripsina 0,5 �g/ml para escindir el sustrato desacetilado. Se incuba la reacci6n durante 30 minutos a 37OC en presencia de estreptavidina 1 mM. Se determina la polarizaci6n de fluorescencia a las longitudes de onda de excitaci6n (650 nm) y emisi6n (680 nm). Se determina entonces el nivel de actividad de la proteina sirtuina en presencia de diversas concentraciones del compuesto de ensayo y puede compararse con el nivel de actividad de la proteina sirtuina en ausencia del compuesto de ensayo y/o el nivel de actividad de proteinas sirtuinas en el control negativo (por ejemplo, nivel de inhibici6n) y control positivo (por ejemplo, nivel de activaci6n) descritos a continuaci6n.
Se realiza un control de la inhibici6n de la actividad sirtuina anadiendo nicotinamida 30 mM al inicio de la reacci6n (por ejemplo, permite la determinaci6n de la inhibici6n maxima de sirtuina). Se realiza un control de la activaci6n de la actividad sirtuina usando proteina sirtuina 0,5 �g/ml para conseguir la desacetilaci6n de base del sustrato (por ejemplo, para determinar la actividad sirtuina normalizada).
Se identificaron los compuestos moduladores de sirtuina que activaban SIRT3 usando el ensayo descrito anteriormente, y se muestran a continuaci6n en la Tabla 6. Se identificaron los compuestos moduladores de sirtuina que inhibian SIRT3 usando el ensayo descrito anteriormente, y se muestran a continuaci6n en la Tabla 7. Se representan los valores de DE50 de los compuestos activadores por A (DE50 : 50 �M), B (DE50 = 51-100 �M), C (DE50 =101-150 �M) y D (DE50 ; 150 �M). El DE50 del resveratrol para la activaci6n de SIRT3 es �300 �M. De forma similar, se representan los valores de CI50 para los compuestos inhibidores por A (CI50 : 50 �M), B (CI50 = 51-100 �M), C (CI50 = 101-150 �M) y D (CI50 ; 150 �M).
Tabla 6. Tabla 7 5

Claims (35)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para determinar la actividad de una desacetilasa que comprende:
    poner en contacto un conjunto de sustratos peptidicos con una desacetilasa, en el que los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos comprenden un fluor6foro y al menos un residuo de lisina acetilada; poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un reactivo que escinde los miembros del conjunto de
    sustratos peptidicos que tienen residuos de lisina no acetilada; y determinar el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos; en el que una reducci6n del valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos es indicativa
    de actividad desacetilasa.
  2. 2. Un metodo para identificar un compuesto que modula una desacetilasa que comprende:
    poner en contacto un conjunto de sustratos peptidicos con una desacetilasa en presencia de un compuesto de ensayo, en el que los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos comprenden un fluor6foro y al menos un residuo de lisina acetilada;
    poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un reactivo que escinde los miembros del conjunto de sustratos peptidicos que tienen residuos de lisina no acetilada; y
    determinar el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos;
    en el que un cambio en el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos en presencia del compuesto de ensayo, en comparaci6n con un control, es indicativo de un compuesto que modula la actividad desacetilasa.
  3. 3.
    El metodo de la reivindicaci6n 1 o 2, en el que los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos comprenden adicionalmente un grupo voluminoso y dicho al menos un residuo de lisina acetilada esta localizado entre el fluor6foro y el grupo voluminoso.
  4. 4.
    El metodo de la reivindicaci6n 3, en el que dicho grupo voluminoso es biotina, un complejo de biotinaavidina o un complejo de biotina-estreptavidina.
  5. 5.
    El metodo de la reivindicaci6n 1 o 2, en el que los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos comprenden adicionalmente un sitio de uni6n y dicho al menos un residuo de lisina acetilada esta localizado entre el fluor6foro y el sitio de uni6n.
  6. 6.
    Un metodo para determinar la actividad de una acetiltransferasa que comprende:
    poner en contacto un conjunto de sustratos peptidicos con una acetiltransferasa, en el que los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos comprenden un fluor6foro y al menos un residuo de lisina; poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un reactivo que escinde los miembros del conjunto de
    sustratos peptidicos que tienen residuos de lisina no acetilada; y determinar el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos, en el que un aumento del valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos es indicativo de
    actividad acetiltransferasa.
  7. 7. Un metodo para identificar un compuesto que modula una acetiltransferasa que comprende:
    poner en contacto un conjunto de sustratos peptidicos con una acetiltransferasa en presencia de un compuesto de ensayo, en el que los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos comprenden un fluor6foro y al menos un residuo de lisina localizado entre el fluor6foro y el sitio de uni6n;
    poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un reactivo que escinde los miembros del conjunto de sustratos peptidicos que tienen residuos de lisina no acetilada; y
    determinar el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos;
    en el que un cambio del valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos en presencia del compuesto de ensayo, en comparaci6n con un control, es indicativo de un compuesto que modula la actividad acetiltransferasa.
  8. 8.
    El metodo de la reivindicaci6n 6 o 7, en el que los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos comprenden adicionalmente un grupo voluminoso y dicho residuo de lisina esta localizado entre el fluor6foro y el grupo voluminoso.
  9. 9.
    El metodo de la reivindicaci6n 8, en el que dicho grupo voluminoso es biotina, un complejo de biotinaavidina o un complejo de biotina-estreptavidina.
  10. 10.
    El metodo de la reivindicaci6n 6 o 7, en el que los miembros del conjunto de sustratos peptidicos comprenden adicionalmente un sitio de uni6n y dicho al menos un residuo de lisina esta localizado entre el fluor6foro y el sitio de uni6n.
  11. 11.
    El metodo de la reivindicaci6n 5 o 10, en el que dicho metodo comprende adicionalmente el conjunto de sustratos peptidicos con un resto de uni6n que se une a dicho sitio de uni6n.
  12. 12.
    El metodo de la reivindicaci6n 11, en el que el sitio de uni6n es un antigeno.
  13. 13.
    El metodo de la reivindicaci6n 12, en el que el resto de uni6n es un anticuerpo.
  14. 14.
    El metodo de la reivindicaci6n 11, en el que el sitio de uni6n es biotina.
  15. 15.
    El metodo de la reivindicaci6n 14, en el que el resto de uni6n es avidina o estreptavidina.
  16. 16.
    El metodo de la reivindicaci6n 11, en el que el sitio de uni6n comprende una regi6n Fc o una porci6n de la misma.
  17. 17.
    El metodo de la reivindicaci6n 16, en el que el resto de uni6n es proteina A o proteina G.
  18. 18.
    El metodo de la reivindicaci6n 1 o 2, en el que la desacetilasa es histona desacetilasa (HDAC) o una sirtuina.
  19. 19.
    El metodo de la reivindicaci6n 18, en el que la sirtuina es una proteina SIRT1.
  20. 20.
    El metodo de la reivindicaci6n 6 o 7, en el que la acetiltransferasa es Gcn5 o p300/CBP.
  21. 21.
    El metodo de la reivindicaci6n 1, 2, 6 o 7, en el que el reactivo que escinde el sustrato peptidico es una proteasa.
  22. 22.
    El metodo de la reivindicaci6n 21, en el que la proteasa es lisilendopeptidasa, endoproteinasa, Lys-C, plasmina, calpaina o tripsina.
  23. 23.
    El metodo de la reivindicaci6n 1, 2, 6 o 7, en el que el fluor6foro es MR121 o 5TMR.
  24. 24.
    El metodo de la reivindicaci6n 1, 2, 6 o 7, en el que la secuencia del sustrato peptidico deriva de una histona, una proteina HMG, p53, c-Myb, GATA-1, EKLF, MyoD, E2F, dTCF o Tat de VIH, o un fragmento de las mismas.
  25. 25.
    El metodo de la reivindicaci6n 2 o 7, en el que el compuesto es una molecula pequena.
  26. 26.
    El metodo de la reivindicaci6n 2, en el que se identifica un compuesto que aumenta la actividad de la desacetilasa.
  27. 27.
    El metodo de la reivindicaci6n 28, en el que una reducci6n en el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos en presencia del compuesto de ensayo, en comparaci6n con un control, es indicativa de un compuesto que aumenta la actividad de la desacetilasa.
  28. 28.
    El metodo de la reivindicaci6n 2, en el que se identifica un compuesto que inhibe la actividad de la desacetilasa.
  29. 29.
    El metodo de la reivindicaci6n 28, en el que un aumento del valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos en presencia del compuesto de ensayo, en comparaci6n con un control, es indicativo de un compuesto que inhibe la actividad de la desacetilasa.
  30. 30.
    El metodo de la reivindicaci6n 7, en el que se identifica un compuesto que inhibe la actividad de la acetiltransferasa.
  31. 31.
    El metodo de la reivindicaci6n 30, en el que una reducci6n del valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos tras el contacto con la acetiltransferasa en presencia del compuesto de ensayo, en comparaci6n con un control, es indicativa de un compuesto que inhibe la actividad de la acetiltransferasa.
  32. 32.
    El metodo de la reivindicaci6n 7, en el que se identifica un compuesto que aumenta la actividad de la acetiltransferasa.
  33. 33.
    El metodo de la reivindicaci6n 32, en el que un aumento del valor de polarizaci6n de fluorescencia del
    conjunto de sustratos peptidicos tras el contacto con la acetiltransferasa en presencia del compuesto de ensayo, en 5 comparaci6n con un control, es indicativo de un compuesto que aumenta la actividad de la acetiltransferasa.
  34. 34. Un metodo para determinar la actividad de una enzima que modula la acetilaci6n de un sustrato peptidico que comprende:
    poner en contacto un conjunto de sustratos peptidicos con una enzima que modula la acetilaci6n, en el que dichos miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos comprenden un fluor6foro y al menos un residuo de lisina o 10 residuo de lisina acetilada;
    poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un reactivo de escisi6n que escinde los miembros del conjunto de sustratos peptidicos que tienen residuos de lisina no acetilada; y
    determinar el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos;
    en el que un cambio del valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos es indicativo de 15 actividad de una enzima que modula la acetilaci6n.
  35. 35. Un metodo para identificar un compuesto que modula la actividad de una enzima que modula la acetilaci6n de un sustrato peptidico, que comprende:
    poner en contacto un conjunto de sustratos peptidicos con una enzima que modula la acetilaci6n en presencia de un compuesto de ensayo, en el que los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos comprenden un fluor6foro y 20 al menos un residuo de lisina o residuo de lisina acetilada;
    poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un reactivo de escisi6n que escinde los miembros del conjunto de sustratos peptidicos que tienen residuos de lisina no acetilada; y
    determinar el valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos;
    en el que un cambio del valor de polarizaci6n de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos en presencia del 25 compuesto de ensayo es indicativo de un compuesto que modula la actividad de la enzima que modula la acetilaci6n.
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