ES2377617A1 - Procedimiento para la producción y purificación de proteínas recombinantes en plantas. - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a un procedimiento para la producción y purificación de proteínas recombinantes en plantas, mediante la producción de plantas transgénicas que expresan las proteínas recombinantes fusionadas con proteínas asociadas al gránulo de almidón a través de una secuencia reconocida por una proteasa. Este procedimiento permite la purificación de la proteína mediante etapas simples de homogeneización, centrifugación y tratamiento con la proteasa. Así mismo, la invención se refiere a los vectores, hospedadores, células y plantas empleados en dicho procedimiento.
Description
Procedimiento para la producción y purificación
de proteínas recombinantes en plantas.
La presente invención se engloba dentro del
campo de la ingeniería genética y de la biotecnología.
Concretamente, la invención se refiere a un procedimiento de
obtención de proteínas heterólogas recombinantes purificadas,
mediante la producción de plantas transgénicas que expresan las
proteínas recombinantes fusionadas con proteínas asociadas al
gránulo de almidón a través de una secuencia reconocida por una
proteasa. Este procedimiento permite la purificación de la proteína
mediante etapas simples de homogeneización, centrifugación y
tratamiento con la proteasa. Así mismo, la invención se refiere a
los vectores, hospedadores, células y plantas empleados en dicho
procedimiento.
La utilización de plantas como biofactorías
(molecular pharming) se refiere al empleo de plantas para producir
compuestos de alto valor añadido que puedan aplicarse a las
diferentes industrias, como la farmacéutica, alimenticia, química,
etc. Se trata de modificar genéticamente las plantas con el fin de
producir el compuesto de interés.
Los sistemas de producción de proteínas
recombinantes de interés industrial actualmente emplean bacterias,
levaduras y células de mamíferos en cultivo, pero cada uno de estos
sistemas presenta sus limitaciones. La utilización de plantas como
biofactorías presenta ventajas económicas (costes menores en la
producción a gran escala), de seguridad del producto (se evita el
riesgo de arrastrar patógenos desde tejidos animales en los procesos
de extracción y purificación) y técnicas (en algunos casos las
plantas pueden constituir el único sistema capaz de producir
eficientemente ciertas proteínas humanas, tales como reguladores
del crecimiento e inhibidores del ciclo celular, que tendrían un
impacto negativo en los animales transgénicos o en las células
animales cultivadas en las que se expresaran) (Giddings 2001; Ma
et al. 2003; Twyman et al. 2003). Por otro lado,
proteínas expresadas en semillas pueden permanecer estables durante
años a temperatura ambiente sin perder su actividad (Giddings 2001;
Ma et al. 2003). Actualmente se están produciendo proteínas
de interés terapéutico en una amplia variedad de plantas que
incluyen tabaco, cereales, oleaginosas, frutas, hortalizas,
forrajeras y algas unicelulares (Twyman et al. 2003; Fischer
et al. 2004).
Las proteínas recombinantes expresadas en
bacterias son proteínas que no requieren glicosilación para ser
activas y generalmente se acumulan en agregados insolubles cuyos
costes de purificación y renaturalización no son sostenibles. Cuando
las proteínas recombinantes requieren procesos de modificación
postraduccionales se utilizan otros sistemas de expresión tales como
cultivos celulares de mamíferos que implican un alto costo inicial
para su obtención y grandes inversiones adicionales cuando se
requiere incrementar la escala de producción. Este problema puede
ser solucionado mediante la utilización de plantas como
biofactorías, ya que los mecanismos de síntesis y secreción de
proteínas y las modificaciones post-traduccionales
son los propios de las células eucariotas y permiten la producción y
ensamblado de proteínas complejas.
Los objetivos actuales de la industria del
"molecular pharming" van encaminados a la obtención de nuevos
productos y al incremento de la productividad. Ésta última está
determinada en gran medida por los procesos de producción y
purificación (Twyman et al. 2005). La mayoría de los costes
de producción de una proteína recombinante no recaen en la fase de
producción, sino en los procesos posteriores de purificación del
producto. Así pues la producción de proteínas recombinantes en
ciertos órganos de las plantas o con tecnologías de expresión que
localicen a las proteínas recombinantes en un orgánulo en particular
de la célula que facilite su purificación, parece un objetivo
fundamental a la hora de plantearse el "molecular pharming"
como un negocio rentable. Ejemplos de estos nuevos avances son la
fusión de proteínas de interés a la oleosina, un tipo de proteína de
membrana que forma parte de los cuerpos grasos de las semillas
(Markley et al. 2006). Este método de purificación de
proteínas recombinantes unidas a oleosinas está basado en la
homogeneización de tejidos y posterior purificación de los cuerpos
grasos de plantas transgénicas tras un simple paso de centrifugación
del homogeneizado y flotación de los cuerpos grasos. Ello, sin
embargo, no impide que muchas proteínas solubles contaminen las
preparaciones de cuerpos grasos, dificultando la purificación
posterior de proteínas recombinantes unidas a las oleosinas. Otras
técnicas empleadas son la utilización de pequeñas proteínas de
carácter hidrofóbico (hidrofobinas) fusionadas a la proteína
recombinante que facilitan su purificación (Joensuu et al.
2010), la producción de proteínas recombinantes que contengan
secuencias de integración en la membrana plasmática de las células
(Schillberg et al. 2000) o la secreción de las proteínas
recombinantes al espacio extracelular o apoplasto (Borisjuk et
al. 1999). Sin embargo, todas estas técnicas de purificación de
proteínas recombinantes presentan problemáticas similares a la
descrita anteriormente basada en la utilización de oleosinas
recombinantes.
En la presente invención, se describe por
primera vez una estrategia para producir plantas transgénicas que
expresen ectópicamente proteínas fusionadas con proteínas unidas al
gránulo de almidón (p. ej.: GBSS) a través de una secuencia
reconocida por una proteasa. De esta forma la proteína de interés
queda anclada al gránulo de almidón, cuya elevada densidad permite
una fácil purificación del resto de componentes celulares tras un
simple paso de homogeneización del tejido, centrifugación,
tratamiento con proteasa y una nueva centrifugación. Por tanto, el
nuevo método propone la solubilización de la proteína de interés
unida a una estructura no soluble, fácilmente separable de las
proteínas solubles del medio. Consecuentemente, el método propuesto
es mucho más eficiente que los métodos empleados hasta la fecha, ya
que se basa en un simple paso de precipitación.
El problema a resolver por la presente invención
consiste en permitir la producción a gran escala de proteínas
recombinantes purificadas a bajo coste. La solución planteada
consiste en un procedimiento basado en la obtención de plantas
transgénicas que expresan ectópicamente la proteína recombinante
fusionada con una proteína unida al gránulo de almidón, a través de
una secuencia de corte de una proteasa. Esto facilita la
purificación mediante homogeneización, centrifugación, tratamiento
con la proteasa y nueva centrifugación.
Consecuentemente, un primer aspecto de la
invención se refiere a un procedimiento de obtención de proteínas
heterólogas recombinantes purificadas, que comprende las siguientes
etapas:
a) obtener una planta transgénica mediante
transformación de una planta silvestre con un vector de expresión
que comprende, en dirección 5'-3': un promotor unido
a una secuencia nucleotídica que codifica: una proteína unida al
gránulo de almidón, seleccionada de: almidón-sintasa
unida al gránulo de almidón (GBSS),
glucano-diquinasa (R1), enzimas ramificadoras de
almidón (BEI, BEIIa, BEIIb), almidón-sintasas
solubles (SSI, SSII, SSIII) y almidón-fosforilasa
plastidial; un sitio de corte de una proteasa; y una proteína de
interés.
b) cultivar la planta transgénica de la etapa a)
en condiciones apropiadas para su crecimiento;
c) homogeneizar cualquier tejido de la planta
que acumule almidón, seleccionado de: tubérculos, hojas, frutos y
semillas;
d) centrifugar y seleccionar la fracción de
densidad más elevada, que contiene las proteínas del gránulo de
almidón;
e) tratar con la proteasa que reconoce el sitio
de corte comprendido en la secuencia descrita en la etapa a);
f) centrifugar y purificar la proteína
heteróloga a partir del sobrenadante, mediante cualquier técnica de
separación por tamaños, immunoabsorción, intercambio iónico o
detección de fluorescencia.
\vskip1.000000\baselineskip
En el procedimiento de la invención, se utilizó
la GBSS como ejemplo de proteína unida al gránulo de almidón. Para
obtener el vector de transformación, se empleó un vector intermedio,
obtenido mediante la tecnología GATEWAY, que permite fusionar con
GBSS la secuencia codificadora de cualquier proteína de interés. Por
tanto, un aspecto adicional de la invención describe un vector
diseñado específicamente para su uso en el procedimiento de la
invención, que comprende, en sentido 5'-3-, un
promotor, una secuencia que codifica la GBSS y una secuencia
nucleotídica flanqueada por secuencias attR1 y attR2, el cual
permite clonar aguas abajo de GBSS cualquier secuencia
nucleotídica flanqueada por secuencias attL1 y attL2.
La invención se refiere así mismo a un organismo
hospedador que alberga el vector anteriormente descrito,
concretamente E. coli.
La obtención de la planta transgénica empleada
en el procedimiento descrito anteriormente requiere la
transformación con vectores de expresión específicamente diseñados,
según se describen en la etapa a) del procedimiento. Por tanto, un
aspecto adicional de la invención se refiere a un vector de
expresión utilizado para transformar la planta transgénica, que
comprende, en dirección 5'-3': un promotor unido a
una secuencia nucleotídica que codifica: una proteína unida al
gránulo de almidón, seleccionada de:
almidón-sintasa unida al gránulo de almidón (GBSS),
glucano-diquinasa (R1), enzimas ramificadoras de
almidón (BEI, BEIIa, BEIIb), almidón-sintasas
solubles (SSI, SSII, SSIII) y almidón-fosforilasa
plastidial; un sitio de corte de una proteasa; y una proteína de
interés.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
organismo hospedador que incluye dicho vector.
En aspectos adicionales de la invención se
describen las células vegetales transformadas con el hospedador
citado y las plantas transgénicas constituidas por dichas
células.
Los efectos técnicos mostrados en la presente
invención son extrapolabas a órganos de la planta que acumulen
almidón tales como tubérculos, hojas, frutos y semillas, así como a
cualquier tipo de planta que acumule almidón como por ejemplo
Arabidopsis, patata, tabaco, tomate, arroz, cebada, trigo y maíz.
Los resultados mostrados en la presente invención se consiguieron
expresando constitutivamente el casete formado por el gen
GBSS de Arabidopsis thaliana, una secuencia que
codifica para el sitio de corte de la proteasa trombina y un gen
clonado en una secuencia de recombinación GATEWAY flanqueada por
secuencias attR1 y attR2. Como caso concreto e ilustrativo de la
invención se presenta la purificación de la proteína verde
fluorescente (GFP), aunque la invención puede aplicarse a cualquier
otra proteína de interés. Para la expresión constitutiva de la
proteína se emplea el promotor 35S, pero cualquier otro promotor que
permita la expresión ectópica de GBSS fusionada a una proteína a
través de una secuencia reconocida por una proteasa, estaría
comprendido en la presente invención.
\newpage
A efectos de la presente invención, se hacen
constar los siguientes términos:
- \bullet
- Planta transgénica: planta cuyo genoma ha sido modificado mediante ingeniería genética con el objetivo de conseguir características biológicas diferentes y/o mejoradas respecto a las de la planta silvestre control (WT).
- \bullet
- Célula vegetal transformada: son células vegetales que presentan una alteración genética resultado de la introducción y expresión de material genético externo en su genoma.
- \bullet
- Expresión ectópica de la proteína quimérica GBSS-trombina-GFP: una planta expresa ectópicamente la proteína quimérica GBSS-trombina-GFP cuando una inmunotransferencia anti-GFP detecta una banda en un extracto de planta transformada que no se detecta en un extracto de planta WT cultivadas en las mismas condiciones y en el mismo momento. A modo ilustrativo, en la Figura 1 se puede observar que en un extracto proteico de plantas transgénicas de Nicotiana benthamiana que expresan GBSS-thr-GFP se detecta una banda del tamaño correspondiente a la proteína quimérica que no se detecta en extractos de plantas WT utilizando un anticuerpo específico de GFP. Otro método para confirmar que una planta expresa la proteína GBSS-trombina-GFP es mediante la detección de la fluorescencia emitida por la proteína GFP. Como muestra la Figura 2 la fluorescencia está localizada única y exclusivamente en el gránulo de almidón, confirmando que la GFP está unida a la GBSS.
Figura 1: Detección mediante inmunotransferencia
anti-GFP de la proteína
GBSS-trombina-GFP en plantas
transgénicas de N. benthamiana que expresan
GBSS-thr-GFP.
Figura 2: Localización subcelular de
GBSS-trombina-GFP. Las fotografías
muestran la fluorescencia en células de plantas de Arabidopsis que
expresan GBSS-thr-GFP, que
han sido sometidas a análisis mediante un microscopio confocal
D-Eclipse C1 (NIKON) equipado con un láser con
excitación Ar 488, un filtro para emisión verde BA515/30 y un filtro
para emisión roja BA650LP. En las fotografías puede observarse que
la fluorescencia verde emitida por
GBSS-trombina-GFP está asociada a
los gránulos de almidón, confirmando así la unión de la GFP a la
proteína GBSS. La fluorescencia roja es emitida por la clorofila
existente en los plastidios.
Figura 3: Etapas para la construcción del
plásmido pGWB2-GBSS gtw, que permite la introducción
de la secuencia codificante de cualquier proteína de interés unida a
la de la GBSS. Figura 3A: generación mediante tecnología GATEWAY de
la construcción pGWB2-GBSS, que contiene el gen GBSS
bajo el control del promotor 35S. Figura 3B: generación del plásmido
pGWB2-GBSS gtw, que incorpora el casete de
recombinación GATEWAY.
Figura 4: Etapas para la construcción del
plásmido
pGWB2-GBSS-Thr-GFP,
necesario para la producción de plantas vía A. tumefaciens
que expresen ectópicamente la GFP unida a la GBSS a través de una
secuencia de aminoácidos reconocida por trombina
(GBSS-trombina-GFP). Introducción de
la secuencia Thr-GFP, mediante tecnología GATEWAY,
en el vector pGWB2-GBSS gtw de la figura 3.
Figura 5: Análisis mediante inmunotransferencia
de la proteína GFP usando anticuerpos anti-GFP. Los
gránulos de almidón purificados de plantas transgénicas que expresan
GBSS-Thr-GFP fueron sometidos a
tratamiento con o sin la proteasa trombina. Tras ello fueron
sometidos a un paso de centrifugación a 1.000 g durante 10 minutos.
De izquierda a derecha: gránulos de almidón y sobrenadantes
obtenidos tras centrifugación de gránulos de almidón no tratados y
tratados con trombina, respectivamente.
A fin de evaluar la eficacia de la fusión de
proteínas heterólogas con proteínas asociadas al gránulo de almidón,
se fusionó la secuencia codificadora de la proteína GFP con la de la
GBSS a través de una secuencia reconocida por trombina,
introduciendo dicha construcción, p. ej.: vía Agrobacterium
tumefaciens, en células de plantas transgénicas. Como conclusión
general, se observó que la transformación con la secuencia quimérica
obtenida facilita considerablemente la obtención en forma purificada
de la proteína heteróloga.
Un primer aspecto de la invención se refiere a
un procedimiento de obtención de proteínas heterólogas recombinantes
purificadas, que comprende las siguientes etapas:
a) obtener una planta transgénica mediante
transformación de una planta silvestre con un vector de expresión
que comprende, en dirección 5-3': un promotor unido
a una secuencia nucleotídica que codifica, una proteína unida al
gránulo de almidón, seleccionada de: almidón-sintasa
unida al gránulo de almidón (GBSS),
glucano-diquinasa (R1), enzimas ramificadoras de
almidón (BEI, BEIIa, BEIIb), almidón-sintasas
solubles (SSI, SSII, SSIII) y almidón-fosforilasa
plastidial; un sitio de corte de una proteasa; y una proteína de
interés.
b) cultivar la planta transgénica de la etapa a)
en condiciones apropiadas para su crecimiento;
\newpage
c) homogeneizar cualquier tejido de la planta
que acumule almidón, seleccionado de: tubérculos, hojas, frutos y
semillas;
d) centrifugar y seleccionar la fracción de
densidad más elevada, que contiene las proteínas del gránulo de
almidón;
e) tratar con la proteasa que reconoce el sitio
de corte comprendido en la secuencia descrita en la etapa a);
f) centrifugar y purificar la proteína
heteróloga a partir del sobrenadante, mediante cualquier técnica de
separación por tamaños, inmunodetección, intercambio iónico o
detección de fluorescencia.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida de la invención el
promotor empleado en la etapa a) es constitutivo, siendo
preferentemente el promotor de RNA 35S, no obstante, se podría
utilizar cualquier otro promotor empleado habitualmente.
Cualquiera de las proteínas que se unen al
gránulo de almidón o cualquier proteína con un porcentaje de
homología de al menos 60% con las mismas y que mantenga su capacidad
de unión al gránulo de almidón, está incluida dentro del alcance de
la invención, constituyendo realizaciones preferentes aquéllas en
las que, en la etapa a) del procedimiento, la proteína unida al
gránulo de almidón codificada por la secuencia nucleotídica es: R1;
una enzima ramificadora de almidón, seleccionada de BEI, BEIIa, y
BEIIb; almidón-fosforilasa plastidial;
almidón-sintasa soluble, seleccionada de SSI, SSII y
SSIII; ó GBSS.
Una realización preferente se refiere al caso en
el que la proteína unida al gránulo de almidón codificada es la GBSS
o una proteína con al menos un 60% de homología con la GBSS, que se
una al gránulo de almidón. El caso más preferido es aquel en el que
dicha proteína es la GBSS.
La molécula quimérica descrita en la etapa a) de
este último procedimiento podría incluir un sitio de corte para
cualquier proteasa, a condición de que la proteasa empleada
posteriormente en el proceso de purificación reconozca dicho sitio y
no una secuencia interna de la proteína de interés. En una
realización preferida, el sitio de corte es específico para
trombina.
En la etapa a) del procedimiento descrito, la
proteína recombinante de interés codificada por la secuencia
nucleotídica puede ser cualquier proteína de interés. En la presente
invención, se realizaron pruebas experimentales con proteína verde
fluorescente (GFP), que permite una fácil visualización de los
resultados. Por tanto, una realización preferida de la invención se
refiere a un caso particular del procedimiento descrito
anteriormente, en el que la proteína de interés codificada, es la
GFP.
Con mayor preferencia, la secuencia nucleotídica
codificante descrita en la etapa a) del procedimiento comprende la
secuencia quimérica o casete de expresión, representado por SEQ ID
Nº: 1, que consiste en las secuencias nucleotídicas que,
secuencialmente, codifican la proteína GBSS, un sitio de corte para
trombina y la proteína GFP.
La secuencia SEQ ID Nº: 1 expresa un polipéptido
de fusión, de secuencia SEQ ID Nº: 2, consecuentemente, una
realización adicional se refiere al procedimiento en el que la
secuencia nucleotídica expresa un polipéptido purificado, cuya
secuencia comprende la secuencia representada por SEQ ID Nº: 2.
En una realización del procedimiento de la
invención, se utilizó la GBSS como ejemplo de proteína unida al
gránulo de almidón. Para obtener el vector de transformación, se
empleó un vector intermedio diseñado específicamente para su uso en
dicho procedimiento, obtenido mediante la tecnología GATEWAY, que
permite fusionar con la GBSS la secuencia codificadora de cualquier
proteína de interés. Por tanto, una realización adicional de la
invención describe un procedimiento de obtención de proteínas
heterólogas en el que, para la obtención del vector de la etapa a),
se emplea un vector que comprende, en sentido 5'-3-,
el promotor de RNA 35S, una secuencia que codifica la GBSS y una
secuencia nucleotídica flanqueada por secuencias attR1 y attR2, que
es el vector pGWB2-GBSS gtw, descrito en
detalle en el ejemplo 1 y en la figura 3, el cual permite clonar
aguas abajo de GBSS cualquier secuencia nucleotídica flanqueada por
secuencias attL1 y attL2.
En realizaciones aún más preferidas, el citado
vector se introduce en un hospedador bacteriano. El caso más
preferido es aquel en el que el hospedador es E. coli.
La tecnología GATEWAY simplifica
considerablemente el procedimiento de clonaje, sin embargo, el
vector de expresión utilizado en el procedimiento de la invención se
puede obtener mediante cualquier otra estrategia de clonaje
conocida, p. ej.: corte y pegado mediante enzimas de restricción,
ligasas, y cualquier otra empleada en el sector.
En el procedimiento de la invención, para la
obtención de la planta transgénica se utiliza preferiblemente el
vector
pGWB2-GBSS-Thr-GFP,
que comprende, en sentido 5'-3': el promotor
constitutivo de RNA 35S, una secuencia que codifica la GBSS, una
secuencia nucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos
reconocida por trombina y una secuencia que codifica la GFP. Dicho
vector se introduce preferentemente a través de un hospedador
bacteriano, preferiblemente Agrobacterium tumefaciens.
\newpage
Una realización preferida de la invención se
refiere al caso en el que la planta transgénica empleada en el
procedimiento descrito, pertenece a las especies Solanum
tuberosum, Nicotiana tabacum o Arabidopsis thaliana, si
bien la invención podría aplicarse a cualquier especie que produzca
almidón.
Un aspecto adicional de la invención describe un
vector diseñado específicamente para su uso en el procedimiento de
la invención, que comprende, en sentido 5'-3-, un
promotor, una secuencia que codifica la GBSS y una secuencia
nucleotídica flanqueada por secuencias attR1 y attR2, el cual
permite clonar aguas abajo de GBSS cualquier secuencia nucleotídica
flanqueada por secuencias attL1 y attL2. Dicho vector, podría
incluir cualquier promotor habitualmente utilizado al efecto, así
como cualquier terminador apropiado, y distintos marcadores de
resistencia a antibióticos, sin alterar la esencia de la invención.
Una realización preferida de la invención se refiere al caso en el
que el promotor es el promotor de RNA 35S y el vector concreto es el
vector pGWB2-GBSS gtw, según se describe en
el ejemplo 1 y en la figura 3, especialmente diseñado para llevar a
cabo el procedimiento de la invención.
Otro aspecto de la invención se refiere a los
hospedadores transformados con el vector citado. Dentro del alcance
de la invención se puede considerar incluido cualquier hospedador
que permita albergar dicho vector. Como realización preferida se
contemplan los hospedadores bacterianos, y más concretamente E.
coli.
La invención se refiere así mismo a un vector de
expresión para uso en el procedimiento descrito, que comprende, en
dirección 5'-3': un promotor unido a una secuencia
nucleotídica que codifica: una proteína unida al gránulo de almidón,
seleccionada de: almidón-sintasa unida al gránulo de
almidón (GBSS), glucano-diquinasa (R1), enzimas
ramificadoras de almidón (BEI, BEIIa, BEIIb),
almidón-sintasas solubles (SSI, SSII, SSIII) y
almidón-fosforilasa plastidial; un sitio de corte de
una proteasa; y una proteína de interés. En una realización
preferida, el promotor empleado es el 35S y el vector es
pGWB2-GBSS-Thr-GFP,
según se describe en el ejemplo 1 y en la figura 4.
Otro aspecto de la invención describe un
organismo hospedador transformado con dichos vectores, siendo
preferentemente dichos hospedadores bacterias, especialmente A.
tumefaciens.
Un aspecto adicional se refiere a una célula
vegetal transformada con estos organismos hospedadores.
Un aspecto relevante de la invención se refiere
a las plantas transgénicas, sus semillas o material de propagación,
constituidas por células vegetales transformadas con el hospedador
que contiene el vector genérico, prefiriéndose el caso en el que el
hospedador es A. tumefaciens. El tal caso, la planta lleva
integrada en su genoma la secuencia SEQ ID Nº: 1 y expresa en sus
células la secuencia SEQ ID Nº: 2. Se prefiere el caso en que dicha
planta pertenece a las especies Solanum tuberosum, Nicotiana
tabacum o Arabidopsis thaliana.
Los siguientes ejemplos ilustran en detalle la
invención. No deben interpretarse como una limitación del alcance de
la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se procede a la exposición de los
ejemplos, en los que se muestra detalladamente el procedimiento para
la obtención de las plantas transgénicas que expresan proteínas
recombinantes fusionadas a la proteína GBSS a través de una
secuencia específicamente reconocida por una proteasa. Como ejemplo
de proteína unida a la GBSS se utilizó la proteína fluorescente GFP.
Como ejemplo de secuencia específicamente reconocida por una
proteasa se utilizó la secuencia aminoacídica reconocida por la
trombina.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.900000\baselineskip
La producción de plantas transgénicas que
expresen proteínas unidas a la GBSS a través de una secuencia
aminoacídica reconocida específicamente por proteasas requiere la
producción previa de un plásmido binario cuyas etapas de elaboración
se ilustran en la Figura 3. La GBSS está codificada por el gen
At1g32900 de A. thaliana. A partir de su secuencia
nucleotídica se sintetizaron oligonucleótidos específicos para el
gen GBSS. Estos oligonucleótidos se emplearon para amplificar
mediante RT-PCR a partir de RNA total de hojas de
Arabidopsis el fragmento completo de cDNA que codifica la
GBSS. El fragmento amplificado se clonó en el vector
pGEM-T easy (Promega), dando lugar al plásmido
pGBSS que fue amplificado en la bacteria hospedadora XL1
Blue. A partir del plásmido pGBSS se amplificó el cDNA que
codifica la GBSS flanqueado por sitios de recombinación attB
utilizando los oligonucleótidos GBSS-attB1
(5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaatggcaactgtgactgcttcttc-3')
y GBSS-attB2
(5'-ggggaccactttgta
caagaaagctgggtatcacggcgtcgctacgttctc-3'). El producto de PCR generado se clonó en el vector pDONR/Zeo mediante recombinación GATEWAY con los sitios de recombinación attP1 y attP2, dando lugar al plásmido pDONR-GBSS. Mediante una reacción de recombinación GATEWAY el gen GBSS fue transferido del plásmido pDONR-GBSS al plásmido pGWB2 generando la construcción pGWB2-GBSS que contiene el gen GBSS bajo el control del promotor 35S. Utilizando como molde el plásmido pGWB2-GBSS y los oligonucleótidos 35S-HindIII (5'-cgtgctcccaagcttacta
gagccaagctgatctcc-3') y GBSS-XbaI (5'-ggctctagactcggcgtcgctacgttctcc-3') se amplificó mediante PCR la secuencia 35S-GBSS (formada por el promotor 35S fusionado al gen GBSS flanqueada por los sitios de restricción HindIII y XbaI). En el plásmido pGWB2 se reemplazó el promotor 35S por el producto de PCR 35S-GBSS mediante los sitios de restricción HindIII y XbaI, creándose el plásmido pGWB2-GBSS gtw, el cual comprende el promotor constitutivo 35S, el gen GBSS y un casete de recombinación GATEWAY flanqueado por secuencias attR1 y attR2 que permite la introducción de cualquier gen de interés para producir una proteína recombinante formada por la proteína de interés fusionada al extremo C-terminal de la proteína GBSS. El vector pGWB2-GBSS gtw se introdujo por electroporación en E. coli.
caagaaagctgggtatcacggcgtcgctacgttctc-3'). El producto de PCR generado se clonó en el vector pDONR/Zeo mediante recombinación GATEWAY con los sitios de recombinación attP1 y attP2, dando lugar al plásmido pDONR-GBSS. Mediante una reacción de recombinación GATEWAY el gen GBSS fue transferido del plásmido pDONR-GBSS al plásmido pGWB2 generando la construcción pGWB2-GBSS que contiene el gen GBSS bajo el control del promotor 35S. Utilizando como molde el plásmido pGWB2-GBSS y los oligonucleótidos 35S-HindIII (5'-cgtgctcccaagcttacta
gagccaagctgatctcc-3') y GBSS-XbaI (5'-ggctctagactcggcgtcgctacgttctcc-3') se amplificó mediante PCR la secuencia 35S-GBSS (formada por el promotor 35S fusionado al gen GBSS flanqueada por los sitios de restricción HindIII y XbaI). En el plásmido pGWB2 se reemplazó el promotor 35S por el producto de PCR 35S-GBSS mediante los sitios de restricción HindIII y XbaI, creándose el plásmido pGWB2-GBSS gtw, el cual comprende el promotor constitutivo 35S, el gen GBSS y un casete de recombinación GATEWAY flanqueado por secuencias attR1 y attR2 que permite la introducción de cualquier gen de interés para producir una proteína recombinante formada por la proteína de interés fusionada al extremo C-terminal de la proteína GBSS. El vector pGWB2-GBSS gtw se introdujo por electroporación en E. coli.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia designada con el nombre
GFP-Thr fue amplificada por PCR a partir de
de un cDNA que codifica para la proteína GFP utilizando los
oligonucleótidos Thr-Egfp-attB1
(5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaatgctggtgccgcgc
ggcagcatggtgagccagggcgaggagc-3') y Egfp-attB2 (5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtattacttgtacagctcgtccatgc-3'). El oligonucleótido Thr-Egfp-attB1 posee la secuencia attB1 (5'-atgctggtgccgcgcggcagc-3') seguida de la secuencia (5'-atgctggtgccgcgcggcagc-3) que codifica para un sitio de corte de la proteasa trombina y una secuencia (5'-catggtgagcaagggcgaggagc-3) que codifica para el extremo N-terminal de la proteína de interés (en este caso la GFP). El oligonucleótido Egfp-attB2 posee una secuencia nucleotídica (5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggta-3') que codifica para el extremo C-terminal de la proteína de interés (en este caso la GFP) seguida de la secuencia attB2 (5'-ttacttgtacagctcgtccatgc-3'). El producto de PCR generado se clonó mediante recombinación GATEWAY en el vector pDONR/Zeo, dando lugar al plásmido pDONR-Thr-GFP. A partir de pDONR-Thr-GFP y pGWB2-GBSS gtw se obtuvo por recombinación GATEWAY el plásmido pGWB2-GBSS-Thr-GFP, el cual comprende el promotor constitutivo 35S, el gen quimérico GBSS-thromb-GFP y el terminador Nos.
ggcagcatggtgagccagggcgaggagc-3') y Egfp-attB2 (5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtattacttgtacagctcgtccatgc-3'). El oligonucleótido Thr-Egfp-attB1 posee la secuencia attB1 (5'-atgctggtgccgcgcggcagc-3') seguida de la secuencia (5'-atgctggtgccgcgcggcagc-3) que codifica para un sitio de corte de la proteasa trombina y una secuencia (5'-catggtgagcaagggcgaggagc-3) que codifica para el extremo N-terminal de la proteína de interés (en este caso la GFP). El oligonucleótido Egfp-attB2 posee una secuencia nucleotídica (5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggta-3') que codifica para el extremo C-terminal de la proteína de interés (en este caso la GFP) seguida de la secuencia attB2 (5'-ttacttgtacagctcgtccatgc-3'). El producto de PCR generado se clonó mediante recombinación GATEWAY en el vector pDONR/Zeo, dando lugar al plásmido pDONR-Thr-GFP. A partir de pDONR-Thr-GFP y pGWB2-GBSS gtw se obtuvo por recombinación GATEWAY el plásmido pGWB2-GBSS-Thr-GFP, el cual comprende el promotor constitutivo 35S, el gen quimérico GBSS-thromb-GFP y el terminador Nos.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido
pGWB2-GBSS-Thr-GFP
se introdujo por electroporación en A. tumefaciens. La cepa
resultante se utilizó para transformar plantas de Nicotiana
benthamiana, Solanum tuberosum y A. thaliana según
protocolos descritos en la literatura (Rocha-Sosa
et al. 1989; Clough and Bent 1998; Voinnet et al.
1999).
El plásmido
pGWB2-GBSS-Thr-GFP
contiene el casete formado por el gen GBSS de A.
thaliana, una secuencia que codifica el sitio de corte de la
proteasa trombina y el gen que codifica para la GFP. La secuencia
nucleotídica de este casete de expresión se representa en SEQ ID Nº:
1. La secuencia aminoacídica deducida de la proteína
GBSS-trombina-GFP se representa en
SEQ ID Nº: 2. Utilizando una cepa de A. tumefaciens (que
alberga al plásmido
pGWB2-GBSS-Thr-GFP)
se obtuvieron plantas transgénicas de N. berithamiana, A.
thaliana y patata que expresan
GBSS-thr-GFP de manera
constitutiva. Cuando se comparan con plantas no transformadas, las
plantas que expresan la proteína quimérica
GBSS-trombina-GFP acumulan una
proteína de aproximadamente 96 kDa que es reconocida por el
anticuerpo policlonal específico de la GFP que no aparece en plantas
no transformadas (Figura 1). Las plantas transformadas fueron
sometidas a análisis de la localización subcelular de la
fluorescencia de GFP mediante un microscopio confocal
D-Eclipse C1 (NIKON) equipado con un láser con
excitación Ar 488, un filtro para emisión verde BA515/30, un filtro
para emisión roja BA650LP y un detector de luz. En las fotografías
de la Figura 2 puede observarse que la proteína GFP está localizada
en los gránulos de almidón.
\vskip1.000000\baselineskip
El protocolo para la purificación de la proteína
GFP a partir de gránulos de almidón de plantas transformadas con
35S-GBSS-thr-GFP
se describe a continuación:
- -
- 1 g de hojas de plantas transformadas con 35S-GBSS-thr-GFP fue homogeneizado con una batidora en 10 ml de tampón de extracción (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0.05% Tritón).
- -
- El homogeneizado se filtró a través de dos capas de Miracloth y se dejó sedimentar a 4ºC.
- -
- Se descartó el sobrenadante y el pellet enriquecido en almidón se resuspendió en 300 \mul de tampón de digestión de trombina (20 mM Tris-HCl, pH 8.4, 150 mM NaCl, 2.5 mM CaCl_{2}). 150 \mul de esta suspensión fueron sometidos a digestión con 0.16 U de trombina durante 12 h a 22ºC. Los restantes 150 \mul de la suspensión fueron utilizados como control negativo.
- -
- Finalizada la digestión con trombina la muestra se centrifugó a 10,000 g durante 10 minutos. El sobrenadante fue sometido a electroforesis en geles de acrilamida SDS-PAGE y a immunodetección de GFP mediante inmunotransferencia haciendo uso de un anticuerpo primario anti-GFP.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La identificación de GFP puede realizarse de
cualquiera de las maneras siguientes: (a) mediante immunoblots
haciendo uso de anticuerpos específicos contra GFP y (b) mediante
detección de la fluorescencia emitida por la proteína GFP.
Por inmunotransferencia: La detección de
la GFP se llevó a cabo haciendo uso de un anticuerpo específico
anti-GFP según la metodología de inmunotransferencia
descrita en (Towbin et al. 1979). El complejo
antígeno-anticuerpo se detectó mediante incubación
con un anticuerpo secundario anti-IgG de conejo
conjugado con fosfatasa alcalina.
Por análisis de su fluorescencia mediante
microscopía confocal. Plantas de patata y Arabidopsis fueron
transformadas con la construcción quimérica
GBSS-thr-GFP obtenida según se
ilustra en la Figura 4. Las plantas fueron sometidas a observación
mediante microscopía confocal para identificar la localización
subcelular de la fluorescencia de GFP (Figura 2).
Plantas de N. benthamiana fueron
transformadas con la construcción quimérica
GBSS-thr-GFP obtenida según
el procedimiento ilustrado en la Figura 3 y en la Figura 4. Los
gránulos de almidón obtenidos de estas hojas tras un paso de
homogeneización y posterior centrifugación a baja aceleración fueron
sometidos a la digestión con trombina para liberar la proteína GFP.
Mediante un paso adicional de centrifugación se separó la proteína
soluble GFP de los gránulos de almidón, obteniéndose un sobrenadante
enriquecido en proteína GFP. Para confirmar la liberación de GFP de
los gránulos de almidón se realizó un inmunotransferencia usando un
anticuerpo específico anti-GFP. Como se observa en
la Figura 5, en el sobrenadante de la muestra tratada con trombina
se detecta una proteína de aproximadamente 29 kDa que corresponde a
la GFP liberada de los granos de almidón. Esta proteína no aparece
cuando los granos de almidón no son tratados con trombina, lo cual
indica que la liberación de la proteína unida a la GBSS tan solo
tiene lugar en presencia de la proteasa trombina. En los gránulos de
almidón insolubles, el anticuerpo anti-GFP reconoce
una proteína de 96 kDa que corresponde a la proteína de fusión
GBSS-trombina-GFP.
\vskip1.000000\baselineskip
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\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> IDEN BIOTECHNOLOGY, S.L.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la producción y
purificación de proteínas recombinantes en plantas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P-100995
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2613
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Comprende secuencia codificadora de
GBSS, vestigio del sitio de clona je, sitio de corte de trombina y
secuencia codificadora de GFP.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2613)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia quimérica completa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1830)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> source
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1830)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_recomb
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1831)..(1872)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Vestigio del sitio de clonaje
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> protein_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1873)..(1893)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de unión de trombina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1894)..(2613)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificadora de GFP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 870
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (33)
1. Procedimiento de obtención de proteínas
heterólogas recombinantes purificadas, que comprende las siguientes
etapas:
a) obtener una planta transgénica mediante
transformación de una planta silvestre con un vector de expresión
que comprende, en dirección 5'-3': un promotor unido
a una secuencia nucleotídica que codifica: una proteína unida al
gránulo de almidón, seleccionada de: almidón-sintasa
unida al gránulo de almidón (GBSS),
glucano-diquinasa (R1), enzimas ramificadoras de
almidón (BEI, BEIIa, BEIIb), almidón-sintasas
solubles (SSI, SSII, SSIII) y almidón-fosforilasa
plastidial; un sitio de corte de una proteasa; y una proteína de
interés.
b) cultivar la planta transgénica de la etapa a)
en condiciones apropiadas para su crecimiento;
c) homogeneizar cualquier tejido de la planta
que acumule almidón, seleccionado de: tubérculos, hojas, frutos y
semillas;
d) centrifugar y seleccionar la fracción de
densidad más elevada, que contiene las proteínas del gránulo de
almidón;
e) tratar con la proteasa que reconoce el sitio
de corte comprendido en la secuencia descrita en la etapa a);
f) centrifugar y purificar la proteína
heteróloga a partir del sobrenadante, mediante cualquier técnica de
separación por tamaños, immunoabsorción, intercambio iónico o
detección de fluorescencia.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el promotor descrito en la etapa a) es constitutivo.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que dicho promotor es el promotor de RNA 35S.
4. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en el que la proteína unida
al gránulo de almidón descrita en la etapa a) es R1.
5. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en el que, la proteína unida
al gránulo de almidón descrita en la etapa a) es una enzima
ramificadora de almidón, seleccionada del grupo formado por: BEI,
BEIIa y BEIIb.
6. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en el que la proteína unida al
gránulo de almidón descrita en la etapa a) es la
almidón-fosforilasa plastidial.
7. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en el que la proteína unida al
gránulo de almidón descrita en la etapa a) es una
almidón-sintasa soluble seleccionada del grupo
formado por: SSI, SSII y SSIII.
8. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en el que la proteína unida al
gránulo de almidón codificada, descrita en la etapa a) es la GBSS o
una proteína con al menos un 60% de homología con la GBSS, que se
una al gránulo de almidón.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que la proteína unida al gránulo de almidón codificada, descrita
en la etapa a) es la GBSS.
10. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 8 ó 9, en el que la secuencia reconocida
específicamente por proteasa, descrita en la etapa a) es una
secuencia reconocida por trombina.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que la proteína recombinante de interés codificada, descrita en
la etapa a) es la proteína verde fluorescente (GFP).
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que la secuencia nucleotídica codificante de la etapa a)
comprende la secuencia representada por SEQ ID Nº: 1.
13. Procedimiento, según la reivindicación 12,
en el que la secuencia nucleotídica codificante expresa un
polipéptido purificado, cuya secuencia comprende la secuencia
representada por SEQ ID Nº: 2.
14. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 9-13, en el que el vector utilizado
en la etapa a) se obtiene partiendo del vector
pGWB2-GBSS gtw, que comprende, en sentido
5'-3', el promotor de RNA 35S; una secuencia que
codifica la GBSS y una secuencia nucleotídica flanqueada por
secuencias attR1 y attR2; mediante incorporación en esta última
secuencia, de una secuencia que codifica un sitio de corte de
trombina seguido de una secuencia que codifica la GFP.
\newpage
15. Procedimiento según la reivindicación 14, en
el que el vector pGWB2-GBSS gtw se introduce en un
hospedador bacteriano.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que el hospedador es E. coli.
17. Procedimiento según las reivindicaciones
11-13, en el que el vector de expresión utilizado en
la etapa a) es
pGWB2-GBSS-Thr-GFP,
que comprende, en sentido 5'-3-, el promotor de RNA
35S, una secuencia que codifica la GBSS; una secuencia que codifica
un sitio de corte de trombina; y una secuencia que codifica la
GFP.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, en
el que el vector
pGWB2-GBSS-Thr-GFP
se introduce en un hospedador bacteriano.
19. Procedimiento según la reivindicación 18, en
el que dicho hospedador es Agrobacterium tumefaciens.
20. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-19, en el que la planta
transgénica de la etapa a) pertenece a las especies Solanum
tuberosum, Nicotiana tabacum o Arabidopsis thaliana.
21. Un vector para uso en el procedimiento de
las reivindicaciones 9-20, que comprende, en sentido
5'-3-, un promotor, una secuencia que codifica la
GBSS y una secuencia nucleotídica flanqueada por secuencias attR1 y
attR2, el cual permite clonar aguas abajo de GBSS cualquier
secuencia nucleotídica flanqueada por secuencias attL1 y attL2.
22. Vector según la reivindicación 21, en el que
el promotor es el promotor de RNA 35S, que es el vector pGWB2
GBSS gtw.
23. Un organismo hospedador para uso en el
procedimiento de las reivindicaciones 9-20,
transformado con un vector según una cualquiera de las
reivindicaciones 21 ó 22.
24. Organismo hospedador según la reivindicación
23, transformado con el vector de la reivindicación 22, siendo dicho
organismo la bacteria E. coli.
25. Un vector de expresión para uso en el
procedimiento de las reivindicaciones 1-20, que
comprende en dirección 5'-3': un promotor unido a
una secuencia nucleotídica que codifica: una proteína unida al
gránulo de almidón, seleccionada de: almidón-sintasa
unida al gránulo de almidón (GBSS),
glucano-diquinasa (R1), enzimas ramificadoras de
almidón (BEI, BEIIa, BEIIb), almidón-sintasas
solubles (SSI, SSII, SSIII) y almidón-fosforilasa
plastidial; un sitio de corte de una proteasa; y una proteína de
interés.
26. Vector según la reivindicación 25, en el que
el promotor es el promotor de RNA 35S, la proteína unida al gránulo
de almidón es la GBSS, la proteasa es trombina y la proteína de
interés es la GFP, que es el vector
pGWB2-GBSS-Thr-GFP.
27. Un organismo hospedador para uso en el
procedimiento de las reivindicaciones 1-20,
transformado con un vector según una cualquiera de las
reivindicaciones 25-26.
28. Organismo hospedador según la reivindicación
27, siendo dicho organismo una bacteria.
29. Organismo hospedador según la reivindicación
28, transformado con el vector de la reivindicación 26, siendo
dicho organismo Agrobacterium tumefaciens.
30. Una célula vegetal transformada con el
organismo hospedador de las reivindicaciones
27-29.
31. Una planta transgénica, sus semillas o
material de propagación, cuyas células son las de la reivindicación
30.
32. Planta transgénica según la reivindicación
31, caracterizada porque su genoma lleva integrada la
secuencia representada por SEQ ID Nº: 1 y expresa la secuencia
representada por SEQ ID Nº: 2.
33. Planta transgénica según una cualquiera de
las reivindicaciones 31-32, perteneciente a las
especies Solanum tuberosum, Nicotiana tabacum o
Arabidopsis thaliana.
Priority Applications (4)
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ES201001115A ES2377617B1 (es) | 2010-08-31 | 2010-08-31 | Procedimiento para la producción y purificación de proteínas recombinantes en plantas. |
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