CN110791519A - 玉米phol特异蛋白及特异分解的鉴定方法 - Google Patents

玉米phol特异蛋白及特异分解的鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种玉米PHOL特异蛋白及特异分解的鉴定方法。具体涉及了克隆并原核表达纯化玉米质体型磷酸化酶PHOL以及变异蛋白的过程，并在体外模拟PHOL、PHOM、PHOL‑AS、PHOL‑SA在造粉体内部的反应条件，直接研究PHOL及其各种变异蛋白的特异分解过程。最终的目的蛋白的表达量在1.5ng/μl以上，本发明提供的鉴定方法不受玉米生育期的限制，造粉体裂解液能够长期保存，具有操作简便易行的特点。

Description

玉米PHOL特异蛋白及特异分解的鉴定方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及玉米PHOL特异蛋白及特异分解的鉴定方法。
背景技术
PHOL为一种重要的淀粉合成相关酶，在植物中广泛分布。报道中有人通过提取甘薯块根中的PHOL发现PHOL存在特异降解的特点。水稻、玉米胚乳中提取出的PHOL也能发生一定程度的特异降解。
提取生物体内蛋白常用的是GPC法，按照预计的分子量来分离大分子的蛋白单体或多聚体。玉米PHOL已证实位于玉米胚乳中的造粉体中，并常与淀粉合酶、淀粉分支酶等其他淀粉合成相关酶形成复合体。现有的技术手段进行检查的一般程序为，利用基因工程利用原核表达蛋白的表达，采用生物方法进行纯化，利用免疫印迹、凝胶渗透色谱GPC(Gelpermeation chromatography)最终进行检测。
Ying等人在2001年(Identification of the Maize Amyloplast Stromal 112-kD Protein as a Plastidic Starch Phosphorylase)利用GPC技术成功分离了PHOL，但是步骤过于复杂，要求研究者熟练掌握GPC仪器操作与样品预处理，实验耗时较长，不利于动态研究玉米PHOL特异性分解等翻译后修饰过程。
PHOL发生的特异降解位置为其特有的***结构L80结构域。但是，PHOL常与淀粉合酶、淀粉分支酶等其他酶类形成“团粒淀粉复合体”，位于造粉体内部，采用常规的分子筛色谱分离法，能够实现PHOL的分离，但是耗时耗力，不利于快速简便研究PHOL的特异分解等翻译后修饰过程。
发明内容
针对以上的缺陷，本发明提供了一种简便的检测玉米PHOL特异分解的方法，有利于研究玉米PHOL的翻译后修饰。本发明从实际角度出发，克隆并表达纯化玉米质体型磷酸化酶PHOL，通过制备造粉体裂解液，在体外模拟PHOL在造粉体内部的反应条件，利用原核表达蛋白标签抗体、抗PHOL特异抗体，检测PHOL在多个温度下的特异分解。实现一种简便、快速检测玉米PHOL特异分解的方法。
本发明的第一个目的在于提供了玉米特异蛋白的表达载体，所述的表达载体含有PHOL、PHOM、PHOL-AS、PHOL-SA中的任意一种。
所述的表达载体含有PHOL特异基因序列，所述的PHOL的基因序列如SEQ NO：1所示。
所述的表达载体含有PHOM特异基因序列，所述的PHOM的基因序列如SEQ NO：2所示。PHOM人工合成去除了第1075至1295的基因序列的PHOL的CDS序列。
所述的表达载体含有PHOL-AS特异基因序列，所述的PHOL-AS的基因序列如SEQNO：3所示。扩增引物如下：
1muPHOL_F:5’TAGAGGCAGAAGAAGAGCGTTCTGAGGATGAGTT
1muPHOL_R:5’AACTCATCCTCAGAACGCTCTTCTTCTGCCTCTA。其中，PHOL-AS为将PHOL中430位的色氨酸突变为丙氨酸，即1290-1292位的序列ttc突变为gcc。
所述的表达载体含有PHOL-SA特异基因序列，所述的PHOL-SA的基因序列如SEQNO：4所示。扩增引物如：
2muPHOL_F:5’GAGGCAGAAGAAGAGAGGCCTGAGGATGAGTTAGAT3’
2muPHOL_R:5’ATCTAACTCATCCTCAGGCCTCTCTTCTTCTGCCTC3’。PHOL-SA为将PHOL431位的色氨酸突变为丙氨酸，即1293-1295位的序列突变为gct。
扩增：体系和反应程序如下
扩增PHOL-SA/PHOL-AS的PCR体系如下：
Figure BDA0002281115280000021
反应混合体系：5μL 10X缓冲液、50ng载体(50ng/μL))、125ng正向引物(125ng/μL)、125ng反向引物(125ng/μL)，1μL 50mM MgSO4和1μL 10mM dNTP混合物，补ddH2O水至50μL。
扩增PHOL-SA/PHOL-AS的PCR反应程序如下：
Figure BDA0002281115280000022
Figure BDA0002281115280000031
将产物每10μL PCR产物加入1μL Dpn I，37℃下处理2小时。Dpn I核酸内切酶(靶序列：5′-Gm6ATC-3′)对甲基化和半甲基化DNA具有特异性，用于剪切亲本DNA模板并选择含有突变的合成DNA。
在本发明的一实施例中，PHOL-SA/PHOL-AS的PCR产物的酶切反应体系如下：
Figure BDA0002281115280000032
所述的表达载体的基因序列的5’端加Bgl I切位点，3’端加XhoI酶切位点。
所述的PHOL的基因序列以及PHOM的基因序列表达载体的基因序列扩增引物如下：
SP-F:5’GCATGCGCGAAGTCTCCCGTTGCTC3’；
SP-R:5’GGATCCTGGTCGTCGCCATTGCTG3’。
PHOM的基因序列为删除L80后的PHOL CDS序列。
本发明的第二个目的提供一种玉米特异蛋白表达载体的表达方法，包括以下步骤：
a)玉米cDNA的制备；
b)玉米PHOL的CDS序列扩增，并将其连入pMD-19载体；
c)重组表达载体扩增；
d)表达载体的表达、纯化以及浓度的测定。
进一步地，当一种含玉米PHOL特异蛋白载体的表达方法，包括了玉米籽粒RNA的提取、cDNA的制备与扩增、载体构建与PHOL特异蛋白表达，具体包括以下步骤：
e)玉米cDNA的制备；具体包括玉米籽粒RNA的提取、cDNA的制备与扩。
f)玉米PHOL的CDS序列扩增，并将其连入pMD-19载体；
g)PHOL特异蛋白的扩增；
h)PHOL的表达、纯化以及浓度的测定。
PHOL特异蛋白表达的具体制备过程如下：
步骤1)原核表达蛋白的表达与纯化
A：玉米籽粒RNA的提取
①、本实验选用玉米骨干自交系B73，于授粉后20d(DAP 20)收获玉米果穗，超净工作台中，用75％的医用酒精充分消毒果穗，用高温高压灭菌消毒的手术刀和镊子剥取籽粒，于无菌的10mL冻存管中，每管10粒籽粒，迅速用液氮速冻，并放于-80℃冰箱保存。
②、取150-200mg籽粒于RNase处理过的液氮预冷的研钵中，加液氮迅速研磨成粉；迅速将约100mg粉末转移至预冷的1.5mL离心管中，并迅速加入1mL预冷的Trizol，立即上下颠倒混合，并用涡旋仪快速混合；冰浴10-15min后，加入预冷的200mL氯仿并上下颠倒混合；冰浴5-10min后，4℃，1200rpm/min离心10-15min；小心吸取上清与1.5mL离心管中，加入等体积的氯仿，上下颠倒混合，室温放置10min，4℃ 10000rpm/min离心10min；小心吸取上清与1.5mL离心管中，加入登体积预冷的异丙醇(液相色谱级)，上下剧烈颠倒混合，室温静置10min；4℃ 10000rpm/min离心10min；弃上清，加入1mL 75％乙醇，于4℃ 10000rpm/min离心5min，重复此步骤2次；弃上清，加入1mL无水乙醇(液相色谱级)，于4℃ 10000rpm/min离心5min；弃上清，真空冷冻干燥乙醇，约10min；加入50-100μL无RNase的ddH2O，充分溶解，用紫外分光光度计测定籽粒RNA的质量，A260/A280＝1.6～1.8。
B：PHOL的cDNA的制备和扩增
制备：首先去除RNA中可能存在的基因组DNA，在进行cDNA的合成，具体做法是使用TAKARA公司的反转录试剂盒制备cDNA第一链，根据TAKARA公司的反转录试剂盒(No.DRR047S)的操作说明书。
扩增：体系和反应程序如下
扩增PHOL全长CDS的PCR体系如下：
Figure BDA0002281115280000051
扩增PHOL全长CDS的PCR反应程序如下：
Figure BDA0002281115280000052
回收：反应结束后，向PCR反应产物中添加5×PCR loading buffer，1％琼脂糖凝胶电泳检测，并回收大小正确且单一的条带。采用Axygene琼脂糖凝胶回收试剂盒回收片段。
检测：回收片段连入pMD-19载体进行测序，与GeneBank公布的B73序列同源性均在98％以上，则可以连入相应的原核表达载体，进行下一步实验。
C：pPHOL载体构建与增殖
酶切：用Bgl I和Xho I分别酶切pET32和连入pMD-19的ZmPHOL全长CDS片段。其中pET32质粒，选用OMIGA小量质粒提取试剂盒提取，回收符合预计大小的片段。
连接：将回收产物与T4连接酶混合，连接16℃反应过夜。
转入：连接产物用于后续转入大肠杆菌感受态的DH5α菌株。
增殖：菌液PCR检测与增殖。
D：重组蛋白PHOL的表达、纯化以及蛋白浓度的测定
将成功构建的载体pPHOL转入原核表达菌株Rosetta表达；选用Ni-Agarose作为纯化固相凝胶；BCA法标定样品浓度保证每个蛋白样品的浓度在1.5-2.5ng/μL。
步骤2)造粉体裂解液的制备
选取10-14DAP的B73玉米胚乳籽粒作为材料，取材后6hrs内处理，制备造粉体裂解液，-80℃保存备用。
步骤3)蛋白特异分解
将步骤2)造粉体裂解液和步骤1)中的纯化后的蛋白充分混合后，按照设定的温度梯度(37、43℃)孵育30min，反应结束后加入5×loading Buffer终止反应，并沸水浴5min。
步骤4)检测
样品用于特异抗体Anti-1、Anti-2和标签抗体anti-S-protein抗体免疫印迹检测。
在本发明的实施例中，所述的cDNA的制备中去除RNA中可能存在的基因组DNA的具体步骤如下：按照如下反应体系配制反应混合物。
Figure BDA0002281115280000061
反应混合物配制完成后，按照如上反应程序进行去基因组DNA反应：42℃ 2min，4℃保存。
在本发明的实施例中，所述的cDNA在去除基因组DNA结束后，将反应产物立即冰浴，并按照如下反应体系配制反转录反应体系：
Figure BDA0002281115280000062
反转录反应程序如下：37℃ 20min，85℃ 5sec，4℃保存。
在本发明的实施例中，cDNA的扩增步骤为，选取已经成功全基因组测序的B7320DAP的籽粒cDNA作为模板，参考报道的玉米ZmPHOL的(GeneBank登陆号为：EU857640)全长CDS，设计引物，扩增PHOL的CDS，所用引物如下：
SP-F:5’GCATGCGCGAAGTCTCCCGTTGCTC3’；
SP-R:5’GGATCCTGGTCGTCGCCATTGCTG3’，划线部分分别为BglI和XhoI酶切位点。
在本发明的实施例中，大肠杆菌感受态细胞DH5α的制备步骤如下：取-70℃保存的DH5α菌液于冰上解冻，超净台中用接种针蘸取菌液，于无抗性LB固体平板上划线，37℃倒置培养18h后，有乳白色克隆长出；挑取单克隆于1000μL LB液体培养基中，于1.5mL EP管中200rpm 37℃培养10hrs，全部接种于200mL LB液体培养基中，200rpm 37℃培养至OD260值达到0.3～0.5后，冰上静置30min；超净工作台中将菌液分装于4支50mL离心管中，4000rpm5min离心，弃上清；超净工作台中加入10mL 20mM NaCl，重悬，4000rpm 5min离心，弃上清；超净工作台中加入5mL 50mM CaCl2+20％甘油，重悬，冰上分装入1.5mL EP管，每管50μL；液氮速冻5min，-70°保存。
在本发明的实施例中，PHOL的载体构建中的酶切反应体系如下：
37℃反应3hrs。1％琼脂糖电泳检测，回收符合预计大小的片段。
在本发明的实施例中，pPHOL的载体构建中的连接具体操作为：将回收产物按照如下比例混合，连接16℃反应过夜。
Figure BDA0002281115280000072
在本发明的实施例中，PHOL的载体构建中的转入是连接产物用于后续转入大肠杆菌DH5α菌株。按照如下步骤转入大肠杆菌感受态细胞，并做检测：将-70℃保存的感受态细胞在冰上解冻，加入重组质粒后轻柔混匀，冰浴30min；于42℃水浴中热激30sec，加入700μLLB液体培养基，37℃振荡培养1h；将菌液12000rpm，15sec离心后，弃上清，保留约200μL液体，重悬菌体，涂布于LB+100mg/L Amp固体培养基平板上，37℃倒置培养13～16hrs；将平板上长出的菌落用接种环刮取至加入1mL LB+100mg/L Amp液体培养基中，37℃振荡培养4h。
在本发明的实施例中，pPHOL的载体构建中的将得到的菌液进行菌液PCR检测。体系如下：
Figure BDA0002281115280000081
菌液PCR反应程序按照下表进行：
Figure BDA0002281115280000082
在本发明的实施例中，将成功构建的载体pPHOL转入原核表达菌株Rosetta的过程为将-70℃保存的感受态细胞在冰上解冻，加入重组质粒后轻柔混匀，冰浴30min；于42℃水浴中热激30sec，加入700μL LB液体培养基，37℃振荡培养1h；将菌液12000rpm，15sec离心后，弃上清，保留约200μL液体，重悬菌体，涂布于LB+100mg/L Amp固体培养基平板上，37℃倒置培养13～16hrs；挑取克隆后培养过夜，按照1:10000比例接种到一定体积的加抗LB培养基中，培养到OD 260/280＝0.8左右时，加入终浓度0.8mM IPTG后24℃培养8hrs，吸取100μL菌液，加入5×裂解上样Buffer，沸水浴8min，1000g离心10min，吸取上清液，准备点样。SDS-PAGE电泳完毕后，考马斯亮蓝染色2hrs，洗脱液洗脱过夜，白板检测条带大小以及与诱导0hour的比较积累量。有明显的、正确大小的蛋白条带出现时，然后选用对应标签的抗进行免疫印迹(immunoblotting)检测。
本发明的第三个目的在于，本发明提供了一种重组蛋白PHOL的纯化的方法，在本发明的实施例中，重组蛋白PHOL的纯化操作为，选用Ni-Agarose作为纯化固相凝胶。本研究选用cwbiotech Cat.No.CW0894A的Ni-Agarose纯化***，纯化步骤按照厂家说明书进行；用300mmol/L咪唑洗脱蛋白后，用半透膜法置换蛋白缓冲液，去除咪唑以免影响后续实验结果。蛋白缓冲液的组成如下：500mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl，pH＝8.0；后用Millipore的Amicon-Ultra-15超滤管(MWCO10kD)对各个样品进行浓缩，用BCA法标定样品浓度，保证每个蛋白样品的浓度在1.5-2.5ng/μL。
重组蛋白PHOL的BCA法标定蛋白浓度的具体做法如下：按照试剂盒说明书做适当改变，根据待测样品浓度范围，采用0-20μg的BSA标准品配制标准品浓度曲线。用试剂盒附带的BSA标准品稀释成预计的浓度组合。按照按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀；将稀释好的蛋白浓度组合依次加入BCA工作液中，每份吸取20μL添加到BCA工作液中即可，室温孵育30min后，在562nm测定吸光度，蛋白浓度为。经过计算，选取拟合曲线相关系数大于0.9的作为标准曲线，后续的蛋白浓度测定，根据参与测定含量的样品体积，计算出蛋白浓度。
本发明的第四个目的在于，本发明提供了一种玉米造粉体裂解液的制备方法，具体操作步骤与所用试剂如下：
(1)大田种植B73自交系，选取10-14DAP的玉米果穗，取材后6hrs内超净工作台内剥取胚乳，放置于冰浴的玻璃培养皿中，用预冷的Endosperm Extra Buffer(50mmol/lHEPES/KOH(pH＝7.5)0.8mokl/l Sorbitol 1mmol/l KCI 3mM MgCI2)冰上浸泡至少30min。
(2)按照100mg胚乳1mL Endosperm Extra Buffer的比例；用一次性剃须刀横向切割胚乳至匀浆状态，用宽口吸头吸取匀浆，并用Miracloth小心过滤，避免气泡的混入，重复上述过程2次，按照5:3的比例加入3％的现配iohexol within Endosperm Extra Buffer，100×g离心10min；小心去除上清，沉淀富集造粉体。
(3)向沉淀中加入2mL的Repturing buffer，含有100mmol/l Tricine/KOH 1mmol/l DTT 5mmol/l MgCl2 phosphatase inhibitor(Pierce Cat.No.88667)proteaseinhibitor(Pierce Cat.No.88666used at 1tablet per 10mL buffer)并用移液器仔细重悬，避光静置至少1h，利用渗透压使造粉体破裂裂解，形成造粉体匀浆；低温高速(4℃13500×g)离心2min去除淀粉，收集上清液再低温超高速(4℃120000×g)离心15min去除细胞器膜，得到的上清液即为造粉体裂解液。
(4)造粉体裂解液利用液氮速冻后，-80℃保存备用，造粉体裂解液需要保证其中的蛋白含量在1.5-2.5ng/μL之间。
所述的PHOL的蛋白与造粉体裂解液质量用量比为1:0.5-3.5。
本发明的第四个目的在于，提供了准确的检测PHOL方法。所述的步骤3)蛋白特异分解按照如下反应体系混合；
充分混合后，按照设定的温度30-50℃(优选为37℃，43℃中的一种)孵育30min，反应结束后加入5×loading Buffer终止反应，并沸水浴5min。
在本发明的实施例中，所述的使用anti-S-protein抗体免疫印迹检测用来检测PHOL的自身稳定性，去除上述体系中的造粉体裂解液和ATP，用水补足体积，43℃处理1-6hrs，用5×loading Buffer终止反应，并沸水浴5min。
在本发明的实施例中，所述的步骤4)的特异抗体Anti-1和Anti-2的抗原表位分别选取L80***结构中两段不同序列，如图1所示。其中，Anti-2的表位包含了一部分预测的PEST region，位于氨基酸残基433-448位，Anti-1的抗原表位位于L80***序列的N端氨基酸残基371-388位；这两个二抗的表位分别位于L80***序列的N端与C端，Anti-2的表位包含了一部分预测的PEST region；采用新快速抗原亲和纯化多抗(PolyExpressTM)服务(金斯瑞合成多肽抗原，兔)合成图1中所示的抗原序列偶联至KLH蛋白上，抗体生成出后由厂家通过ELISA报告，检测到符合预测大小的抗原蛋白即可。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
(1)通过本发明制备的造粉体裂解液与适量的PHOL蛋白反应，最终的检测结果较好原核表达纯化的PHOL能够不受玉米生育期的限制。比较直接从胚乳中提取PHOL蛋白，再检测翻译后修饰、特异性分解，具有操作简便易行的特点。
(2)利用特异抗体Anti-1和Anti-2以及标签抗体anti-S-protein抗体免疫印迹检测，更能准确的完成对玉米中的PHOL的定性和定量的检测。
(3)一般研究玉米PHOL的翻译后修饰需从胚乳中直接分离提取PHOL，得到的PHOL往往已经发生了翻译后修饰，比如已经磷酸化、与其他蛋白、多糖形成复合体、已经发生了特异分解等。为了单独研究PHOL特异降解与L80***结构、430、431位氨基酸是否存在关系，本专利设计了一种特殊的实验方法，能够体外模拟玉米胚乳造粉体内部环境，研究PHOL的特异分解过程。
附图说明
图1 Anti-1 Anti-2抗原表位示意图
L80与PEST site均用线框标注，Anti-1和Anti-2的抗原表位具体如图所示。
图2玉米PHOL重组蛋白的纯化
第1泳道为诱导后的菌体裂解后离心上清液，第2泳道为过柱流穿液，第3泳道为洗涤液，第4泳道为用150mM咪唑洗脱结果，第5泳道为用300mM咪唑洗脱结果，第6泳道为用400mM咪唑洗脱结果，第7泳道为用500mM咪唑洗脱结果，黑色框内红色箭头指示为符合分子量预测的纯化后PHOL条带。
图3 Anti-1 Anti-2检测纯化后PHOL的免疫印迹结果
a为Anti-1检测结果，b为Anti-2检测结果。
泳道1：为免疫血清按照1：1000的比例稀释，泳道1：过柱流穿液，加入与PHOL全长蛋白同等量的原核表达蛋白L80多肽片段；泳道2中为加入与PHOL全长蛋白同等量的原核表达蛋白L80多肽片段；泳道3：纯化后抗体以5μg/mL的比例稀释。
图4 PHOL和PHOM体外降解后用不同一抗做免疫印迹的结果
红色箭头标记的是100kDa的PHOL降解带，PHOM未检测到降解。
图5特异抗Anti-1和Anti-2分别检测PHOL-AS和PHOL-SA的降解产物
红色箭头指示100kDa的降解带，PHOL-SA具有降解带。
图6抗S-protin的特异一抗检测PHOL自身稳定性实验
从左至右为不同的处理时长的产物，PHOL处理于缺少ATP与造粉体裂解液的反应体系中，处理时间从1小时到6小时，此处的WB选用S-protein抗体。
具体实施例
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
以下实施方式所需试剂无特殊说明均可来自商业途径(市售可得)。
实施例1：大肠杆菌感受态细胞制备
取-70℃保存的DH5α菌液于冰上解冻，超净台中用接种针蘸取菌液，于无抗性LB固体平板上划线，37℃倒置培养18h后，有乳白色克隆长出；挑取单克隆于1000μL LB液体培养基中，于1.5mL EP管中200rpm 37℃培养10hrs，全部接种于200mL LB液体培养基中，200rpm37℃培养至OD260值达到0.3～0.5后，冰上静置30min；超净工作台中将菌液分装于4支50mL离心管中，4000rpm 5min离心，弃上清；超净工作台中加入10mL 20mM NaCl，重悬，4000rpm5min离心，弃上清；超净工作台中加入5mL 50mM CaCl2+20％甘油，重悬，冰上分装入1.5mLEP管，每管50μL；液氮速冻5min，-70°保存。
实施例2：原核表达蛋白的表达与纯化
A：玉米籽粒RNA的提取
①、本实验选用玉米骨干自交系B73，于授粉后20d(DAP 20)收获玉米果穗，超净工作台中，用75％的医用酒精充分消毒果穗，用高温高压灭菌消毒的手术刀和镊子剥取籽粒，于无菌的10mL冻存管中，每管10粒籽粒，迅速用液氮速冻，并放于-80℃冰箱保存。
②、取150-200mg籽粒于RNase处理过的液氮预冷的研钵中，加液氮迅速研磨成粉；迅速将约100mg粉末转移至预冷的1.5mL离心管中，并迅速加入1mL预冷的Trizol，立即上下颠倒混合，并用涡旋仪快速混合；冰浴10-15min后，加入预冷的200mL氯仿并上下颠倒混合；冰浴5-10min后，4℃，1200rpm/min离心10-15min；小心吸取上清与1.5mL离心管中，加入等体积的氯仿，上下颠倒混合，室温放置10min，4℃ 10000rpm/min离心10min；小心吸取上清与1.5mL离心管中，加入登体积预冷的异丙醇(液相色谱级)，上下剧烈颠倒混合，室温静置10min；4℃ 10000rpm/min离心10min；弃上清，加入1mL 75％乙醇，于4℃ 10000rpm/min离心5min，重复此步骤2次；弃上清，加入1mL无水乙醇(液相色谱级)，于4℃ 10000rpm/min离心5min；弃上清，真空冷冻干燥乙醇，约10min；加入50-100ul无RNase的ddH2O，充分溶解，用紫外分光光度计测定籽粒RNA的质量，A260/A280＝1.6～1.8。
B：PHOL的cDNA的制备和扩增
制备：(1)首先去除RNA中可能存在的基因组DNA，按照如下反应体系配制反应混合物。
反应混合物配制完成后，按照如上反应程序进行去基因组DNA反应：42℃ 2min，4℃保存。
(2)所述的cDNA在去除基因组DNA结束后，将反应产物立即冰浴，并按照如下反应体系配制反转录反应体系：
Figure BDA0002281115280000131
反转录反应程序如下：37℃ 20min，85℃ 5sec，4℃保存。
(3)cDNA的合成，具体做法是使用TAKARA公司的反转录试剂盒制备cDNA第一链，根据TAKARA公司的反转录试剂盒(No.DRR047S)的操作说明书。
扩增：扩增PHOL全长CDS的PCR体系如下：
Figure BDA0002281115280000132
所用引物如下：
SP-F:5’GCATGCGCGAAGTCTCCCGTTGCTC3’；
SP-R:5’GGATCCTGGTCGTCGCCATTGCTG3’，划线部分分别为BglI和XhoI酶切位点。
扩增PHOL全长CDS的PCR反应程序如下：
Figure BDA0002281115280000133
Figure BDA0002281115280000141
回收：反应结束后，向PCR反应产物中添加5×PCR loading buffer，1％琼脂糖凝胶电泳检测，并回收大小正确且单一的条带。采用Axygene琼脂糖凝胶回收试剂盒回收片段。
检测：回收片段连入pMD-19载体进行测序，与GeneBank公布的B73序列同源性均在98％以上，则可以连入相应的原核表达载体，进行下一步实验。
C：pPHOL载体构建与增殖
酶切：用Bgl I和Xho I分别酶切pET32和连入pMD-19的ZmPHOL全长CDS片段。其中pET32质粒，选用OMIGA小量质粒提取试剂盒提取，pPHOL的载体构建中的酶切反应体系如下：
Figure BDA0002281115280000142
37℃反应3hrs。1％琼脂糖电泳检测，回收符合预计大小的片段。
连接：pPHOL的载体构建中的连接具体操作为：将回收产物按照如下比例混合，连接16℃反应过夜。
Figure BDA0002281115280000143
转入：pPHOL的载体构建中的转入是连接产物用于后续转入实施例1的大肠杆菌DH5α菌株。
增殖：菌液PCR检测和增殖，具体如下：
pPHOL的载体构建中的将得到的菌液进行菌液PCR检测。体系如下：
Figure BDA0002281115280000151
菌液PCR反应程序按照下表进行：
Figure BDA0002281115280000152
D：重组蛋白PHOL的纯化以及蛋白浓度的测定
(1)重组蛋白PHOL的纯化：选用Ni-Agarose作为纯化固相凝胶。本研究选用cwbiotech Cat.No.CW0894A的Ni-Agarose纯化***，纯化步骤按照厂家说明书进行；用500mmol/L咪唑洗脱蛋白后，用半透膜法置换蛋白缓冲液，去除咪唑以免影响后续实验结果。蛋白缓冲液的组成如下：500mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl，pH＝8.0；后用Millipore的Amicon-Ultra-15超滤管(MWCO10kD)对各个样品进行浓缩，用BCA法标定样品浓度，保证每个蛋白样品的浓度在1.5-2.5ng/μL。
(2)重组蛋白PHOL的BCA法标定蛋白浓度：按照试剂盒说明书做适当改变，根据待测样品浓度范围，采用0-20μg的BSA标准品配制标准品浓度曲线。用试剂盒附带的BSA标准品稀释成预计的浓度组合。按照按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀；将稀释好的蛋白浓度组合依次加入BCA工作液中，每份吸取20μL添加到BCA工作液中即可，室温孵育30min后，在562nm测定吸光度。经过计算，选取拟合曲线相关系数大于0.9的作为标准曲线，后续的蛋白浓度测定，根据参与测定含量的样品体积，即可计算出蛋白浓度(μg/μL)。
将成功构建的载体pPHOL转入原核表达菌株Rosetta；选用Ni-Agarose作为纯化固相凝胶；BCA法标定样品浓度保证每个蛋白样品的浓度在1.5-2.5ng/μL。
实施例2：造粉体裂解液的制备
大田种植B73自交系，选取10-14DAP的玉米果穗，取材后6hrs内超净工作台内剥取胚乳，放置于冰浴的玻璃培养皿中，用预冷的Endosperm Extra Buffer(50mmol/l HEPES/KOH(pH＝7.5)0.8mol/l Sorbitol 1mmol/l KCI 3mM MgCI2)冰上浸泡至少30min，按照100mg胚乳1mL Endosperm Extra Buffer的比例；用一次性剃须刀横向切割胚乳至匀浆状态，用宽口吸头吸取匀浆，并用Miracloth小心过滤，避免气泡的混入，重复上述过程2次，按照5:3的比例加入3％的现配iohexol within Endosperm Extra Buffer，100×g离心10min；小心去除上清，沉淀富集造粉体，当在沉淀的顶端观察到黄色的指环型结构，说明提取到大量完整的造粉体，如果沉淀全部是白色的，说明造粉体被严重破坏，造粉体中的酶类基本释放到上清中了；向沉淀中加入2mL的Repturing buffer，含有100mmol/l Tricine/KOH 1mmol/l DTT 5mmol/l MgCl2 phosphatase inhibitor(Pierce Cat.No.88667)protease inhibitor(Pierce Cat.No.88666used at 1tablet per 10mL buffer)并用移液器仔细重悬，避光静置至少1h，利用渗透压使造粉体破裂裂解，形成造粉体匀浆；低温高速(4℃13500×g)离心2min去除淀粉，收集上清液再低温超高速(4℃120000×g)离心15min去除细胞器膜，得到的上清液即为造粉体裂解液，液氮速冻后，-80℃保存备用，造粉体裂解液需要保证其中的蛋白含量在1.0-1.5μg/μL之间。实施例4：蛋白特异分解
蛋白特异分解按照如下反应体系混合；
Figure BDA0002281115280000161
充分混合后，按照设定的温度30-50℃(优选为37℃，43℃中的一种)孵育30min，反应结束后加入5×loading Buffer终止反应，并沸水浴5min。
实施例5：anti-S-protein抗体免疫印迹检测用来检测PHOL的自身稳定性
去除上述体系中的造粉体裂解液和ATP，用水补足体积，43℃处理1-6hrs，用5×loading Buffer终止反应，并沸水浴5min，WB选用anti-S-protein作为一抗。在附图6中可以看出，1-6h内PHOL的稳定性均较好，可以进一步试验。
实施例6：特异抗体Anti-1、Anti-2免疫印迹检测。
Anti-1和Anti-2的抗原表位分别选取L80***结构中两段不同序列。其中，Anti-2的表位包含了一部分预测的PEST region，位于氨基酸残基433-448位，Anti-1的抗原表位位于L80***序列的N端氨基酸残基371-388位；这两个二抗的表位分别位于L80***序列的N端与C端，Anti-2的表位包含了一部分预测的PEST region；采用新快速抗原亲和纯化多抗(PolyExpressTM)服务(金斯瑞合成多肽抗原，兔)合成附图1中所示的抗原序列偶联至KLH蛋白上，抗体生成出后由厂家通过ELISA报告，检测到符合预测大小的抗原蛋白。
对纯化后的PHOL进行免疫印迹结果实验，具体见附图3。
实施例7：PHOL、PHOM体外降解后用不同一抗做免疫印迹检测
结合实施例4和实施例5的操作方法，为了比较L80***序列对于PHOL分解的影响，在温度37℃和43℃下，将PHOL、PHOM以及等体积的水，在设置温度25-37℃的条件下处理30min后，添加适量的5×loading buffer终止反应并迅速沸水灭活，SDS-PAGE电泳后，WB转膜，分别用多抗Anti-1和Anti-2检测，得到结果如附图4A所示。
PHOM是缺失了L80的片段，用S-protein-tag作为免疫印迹检测蛋白，anti-S-protein检测同等反应条件下的PHOM样品，发现在37℃和43℃处理下，没有明显的变化，Anti-1和Anti-2均不能检测到PHOM，如图附图4B所示。
实施例8：特异抗Anti-1和Anti-2分别检测PHOL-AS和PHOL-SA的降解产物
结合实施例4和实施例5的操作方法，为了研究Ser430、Ser431两个残基对于ATP存在下PHOL稳定性的影响，纯化后PHOL-AS和PHOL-SA进行37、43℃的处理，对上清液用Anti-1和Anti-2做免疫印迹检测；Ser430、Ser431位的两个Ser残基突变为Ala对于PHOL的ATP存在下的体外降解反应的影响相近。具体结果见附图5。
序列表
<120> 玉米PHOL特异蛋白及特异分解的鉴定方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2550
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaatgtaa aacaagcata ttacctgtcc atggagtttt tacagggaag ggctctcaca 60
aatgctattg gcaatctaga gattaccggt gaatatgcag aagcattaaa acaacttgga 120
caaaacctgg aggatgtcgc tagccaggaa ccagatgctg ccctgggcaa tggtggttta 180
ggccgcctgg cttcttgttt tttggattct ttagcaacat taaattatcc agcatgggga 240
tatggacttc gctatgaata tggcctcttt aagcagatca taacaaagga tggtcaggag 300
gagattgctg agaattggct tgagatggga tatccttggg aggttgtaag aaatgatgtc 360
tcttatcctg tgaaattcta tggtaaagtg gtggaaggca ctgatggtag gaagcactgg 420
attggaggag aaaatatcaa ggctgtggca catgatgtcc ctattcctgg ctacaaaact 480
agaactacca ataatctgcg tctttggtca acaactgtac cagcacaaga ttttgacttg 540
gcagctttta attctggaga tcataccaag gcatatgaag ctcatctaaa cgctaaaaag 600
atatgccaca tattgtatcc tggggatgaa tcactagagg ggaaagttct ccgcttgaag 660
caacaatata cattgtgttc agcctcacta caggacatca ttgctcgttt tgagagtaga 720
gctggcgagt ctctcaactg ggaggacttc ccctccaaag ttgcagtgca gatgaatgac 780
actcatccaa cactatgcat tcctgagtta atgagaatac tgatggatgt taagggatta 840
agctggagtg aggcatggag tattacagaa agaaccgtgg catacactaa ccatacagtg 900
cttcctgaag ctctagagaa gtggagcttg gacataatgc agaaactttt acctcgacat 960
gttgagataa tagaaacaat tgatgaagag ctgataaaca acatagtctc aaagtatgga 1020
accacagata ctgaactgtt gaaaaagaag ctgaaagaga tgaggattct ggataatgtt 1080
gaccttccag cttccatttc ccaactattt gttaaaccca aagacaaaaa ggaatctcct 1140
gctaaatcaa agcaaaagtt acttgttaaa tctttggaga ctattgttga tgttgaggag 1200
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tggatccggt tttgtaatcc tgcattaagt gcattaattt caaagtggat tggttctgat 1560
gactgggtgc ttaatacaga caaactggca gaactgaaga agtttgctga taatgaagat 1620
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agggagaaga caggatatat tgtcagtcca gatgcaatgt ttgatgtgca ggtgaaaagg 1740
atacatgaat ataagcggca gctgctaaat atccttggaa ttgtctaccg ctacaagaag 1800
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ggtgggaaag catttgccac atatatacag gcaaaaagga tcgttaaatt tattacagat 1920
gtggcagcta ccgtgaacca tgattcagac attggagatt tgttgaaggt cgtatttgtt 1980
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tgcattctta ttggaacttt agatggtgca aatgtggaga tcagagagga ggttggagaa 2160
gaaaactttt tcctttttgg tgcagaggca catgaaattg ctggtttgcg gaaagaaaga 2220
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tacggacgtg cagattattt ccttgttggc aaggacttcc ccagctatat tgaatgccaa 2400
gaaaaagttg atgaggcgta ccgagatcag aagttatgga caaggatgtc tatcctcaac 2460
acggctggct catccaagtt cagcagcgat aggacgattc atgagtacgc caaggatatc 2520
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<210> 2
<211> 2329
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<210> 3
<211> 2550
<212> DNA
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<400> 3
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caaaacctgg aggatgtcgc tagccaggaa ccagatgctg ccctgggcaa tggtggttta 180
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gagattgctg agaattggct tgagatggga tatccttggg aggttgtaag aaatgatgtc 360
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tgcattctta ttggaacttt agatggtgca aatgtggaga tcagagagga ggttggagaa 2160
gaaaactttt tcctttttgg tgcagaggca catgaaattg ctggtttgcg gaaagaaaga 2220
gccgagggaa agtttgtgcc tgacccaaga tttgaggagg ttaaggaatt tgtccgcagt 2280
ggtgtctttg ggacttacag ctatgatgaa ttgatgggtt ctttggaagg aaatgaaggt 2340
tacggacgtg cagattattt ccttgttggc aaggacttcc ccagctatat tgaatgccaa 2400
gaaaaagttg atgaggcgta ccgagatcag aagttatgga caaggatgtc tatcctcaac 2460
acggctggct catccaagtt cagcagcgat aggacgattc atgagtacgc caaggatatc 2520
tgggatatca gccctgccat ccttccctag 2550
<210> 4
<211> 2550
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgaatgtaa aacaagcata ttacctgtcc atggagtttt tacagggaag ggctctcaca 60
aatgctattg gcaatctaga gattaccggt gaatatgcag aagcattaaa acaacttgga 120
caaaacctgg aggatgtcgc tagccaggaa ccagatgctg ccctgggcaa tggtggttta 180
ggccgcctgg cttcttgttt tttggattct ttagcaacat taaattatcc agcatgggga 240
tatggacttc gctatgaata tggcctcttt aagcagatca taacaaagga tggtcaggag 300
gagattgctg agaattggct tgagatggga tatccttggg aggttgtaag aaatgatgtc 360
tcttatcctg tgaaattcta tggtaaagtg gtggaaggca ctgatggtag gaagcactgg 420
attggaggag aaaatatcaa ggctgtggca catgatgtcc ctattcctgg ctacaaaact 480
agaactacca ataatctgcg tctttggtca acaactgtac cagcacaaga ttttgacttg 540
gcagctttta attctggaga tcataccaag gcatatgaag ctcatctaaa cgctaaaaag 600
atatgccaca tattgtatcc tggggatgaa tcactagagg ggaaagttct ccgcttgaag 660
caacaatata cattgtgttc agcctcacta caggacatca ttgctcgttt tgagagtaga 720
gctggcgagt ctctcaactg ggaggacttc ccctccaaag ttgcagtgca gatgaatgac 780
actcatccaa cactatgcat tcctgagtta atgagaatac tgatggatgt taagggatta 840
agctggagtg aggcatggag tattacagaa agaaccgtgg catacactaa ccatacagtg 900
cttcctgaag ctctagagaa gtggagcttg gacataatgc agaaactttt acctcgacat 960
gttgagataa tagaaacaat tgatgaagag ctgataaaca acatagtctc aaagtatgga 1020
accacagata ctgaactgtt gaaaaagaag ctgaaagaga tgaggattct ggataatgtt 1080
gaccttccag cttccatttc ccaactattt gttaaaccca aagacaaaaa ggaatctcct 1140
gctaaatcaa agcaaaagtt acttgttaaa tctttggaga ctattgttga tgttgaggag 1200
aaaactgagt tggaagagga ggcggaggtt ctatcagaga tagaggagga aaaacttgaa 1260
tctgaagaag tagaggcaga agaagagagt tcgctggatg agttagatcc atttgtaaag 1320
tctgatccta agttaccaag agttgtccga atggcaaacc tctgtgttgt tggtgggcat 1380
tcagtaaatg gtgtagctga aattcacagt gaaattgtga aacaggatgt gttcaacagc 1440
ttctatgaga tgtggccaac taaatttcag aataaaacaa atggagtgac tcccaggcgt 1500
tggatccggt tttgtaatcc tgcattaagt gcattaattt caaagtggat tggttctgat 1560
gactgggtgc ttaatacaga caaactggca gaactgaaga agtttgctga taatgaagat 1620
ctgcattcag agtggcgtgc tgctaagaag gctaacaaaa tgaaggttgt ttctcttata 1680
agggagaaga caggatatat tgtcagtcca gatgcaatgt ttgatgtgca ggtgaaaagg 1740
atacatgaat ataagcggca gctgctaaat atccttggaa ttgtctaccg ctacaagaag 1800
atgaaagaaa tgagcacaga agaaagagca aagagctttg ttccaagggt atgcatattc 1860
ggtgggaaag catttgccac atatatacag gcaaaaagga tcgttaaatt tattacagat 1920
gtggcagcta ccgtgaacca tgattcagac attggagatt tgttgaaggt cgtatttgtt 1980
ccagactata atgttagtgt tgccgaggca ctaattcctg ccagtgaatt gtcacagcat 2040
atcagtactg ctggaatgga agctagtggg accagtaaca tgaagtttgc aatgaacggt 2100
tgcattctta ttggaacttt agatggtgca aatgtggaga tcagagagga ggttggagaa 2160
gaaaactttt tcctttttgg tgcagaggca catgaaattg ctggtttgcg gaaagaaaga 2220
gccgagggaa agtttgtgcc tgacccaaga tttgaggagg ttaaggaatt tgtccgcagt 2280
ggtgtctttg ggacttacag ctatgatgaa ttgatgggtt ctttggaagg aaatgaaggt 2340
tacggacgtg cagattattt ccttgttggc aaggacttcc ccagctatat tgaatgccaa 2400
gaaaaagttg atgaggcgta ccgagatcag aagttatgga caaggatgtc tatcctcaac 2460
acggctggct catccaagtt cagcagcgat aggacgattc atgagtacgc caaggatatc 2520
tgggatatca gccctgccat ccttccctag 2550

Claims (18)

1.一种含有玉米特异蛋白的表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有PHOL序列、PHOM序列、PHOL-AS序列、PHOL-SA序列中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述的PHOL的基因序列如SEQ NO：1所示。
3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述的PHOM的基因序列如SEQ NO：2所示。
4.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述的PHOL-AS的基因序列如SEQNO：3所示。
5.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述的PHOL-SA的基因序列如SEQNO：4所示。
6.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体的基因序列的5’端加BglI切位点，3’端加XhoI酶切位点。
7.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述的PHOL序列、PHOM序列的扩增引物为：SP-F:5’GCATGCGCGAAGTCTCCCGTTGCTC3’；SP-R:5’GGATCCTGGTCGTCGCCATTGCTG3’；PHOL-AS序列的扩增引物为：1muPHOL_F:5’TAGAGGCAGAAGAAGAGCGTTCTGAGGATGAGTT，1muPHOL_R:5’AACTCATCCTCAGAACGCTCTTCTTCTGCCTCTA；PHOL-SA的基因序列扩增引物为：2muPHOL_F:5’GAGGCAGAAGAAGAGAGGCCTGAGGATGAGTTAGAT3’2muPHOL_R:5’ATCTAACTCATCCTCAGGCCTCTCTTCTTCTGCCTC3’。
8.一种玉米特异蛋白表达载体的表达方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)玉米cDNA的制备；
b)玉米PHOL的CDS序列扩增，并将其连入pMD-19载体；
c)重组表达载体扩增；
d)表达载体的表达、纯化以及浓度的测定。
其中，所述的表达载体含有PHOL序列、PHOM序列、PHOL-AS序列、PHOL-SA序列中的任意一种。
9.根据权利要求8所述的表达方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)玉米cDNA的制备；
b)玉米PHOL的CDS序列扩增，并将其连入pMD-19载体；
c)重组PHOL序列扩增；
d)PHOL序列表达载体的表达、纯化以及浓度的测定。
10.根据权利要求9所述的表达方法，其特征在于，所述的重组质粒载体扩增步骤包括：PHOL的CDS片段和pET32质粒用BglI酶/SmaI酶和XhoI酶进行双酶切，通过T4连接酶连接，得到重组的PHOL序列；将重组的PHOL序列转入至大肠杆菌DH5α菌株进行扩增。
11.根据权利要求9所述的表达方法，其特征在于，所述的PHOL的蛋白用BCA法标定，PHOL的蛋白浓度在1.5-2.5ng/μl之间。
12.一种玉米特异蛋白的检测方法，其特征在于，包含以下步骤：
步骤1)造粉体裂解液的制备；
步骤2)权利要求1-11任意一种玉米特异蛋白与造粉体裂解液混合；
步骤3)利用特异抗体Anti-1、Anti-2进行免疫印迹检测。
13.根据权利要求12所述的检测方法，其特征在于，包含以下步骤
步骤1)造粉体裂解液的制备；
步骤2)玉米特异蛋白PHOL与造粉体裂解液混合；
步骤3)利用特异抗体Anti-1、Anti-2进行免疫印迹检测。
14.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤1)造粉体裂解液中的PHOL蛋白含量在1.0-1.5ng/μl之间。
15.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤2)的过程为：在造粉体裂解液中加入蛋白磷酸酶抑制剂、500mmol/LATP、水、PHOL蛋白，采用温度30-50℃孵育30min，加入5×loading Buffer，并沸水浴5min。
16.根据权利要求15所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤2)温度为37℃或43℃中的一种孵育30min；PHOL的蛋白与造粉体裂解液质量用量比为1:0.5-3.5。
17.根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤3)Anti-1的抗原表位位于L80***序列的N端氨基酸残基371-388位；Anti-2的表位位于氨基酸残基433-448位。
18.一种含有权利要求1-17任一项所述的重组表达载体在生产特异蛋白中的应用。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1809636A (zh) * 2003-06-18 2006-07-26 江崎格力高株式会社 耐热化α－葡聚糖磷酸化酶(GP)的方法
CN1930301A (zh) * 2004-03-05 2007-03-14 拜尔作物科学有限公司 鉴定具有淀粉磷酸化酶促活性的蛋白质的方法
ES2377617A1 (es) * 2010-08-31 2012-03-29 Iden Biotechnology, S.L. Procedimiento para la producción y purificación de proteínas recombinantes en plantas.
CN106084056A (zh) * 2016-06-08 2016-11-09 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 一种淀粉磷酸化酶单克隆抗体及其制备方法
CN108218991A (zh) * 2018-01-26 2018-06-29 四川农业大学 一种玉米AGPase磷酸化鉴定方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1809636A (zh) * 2003-06-18 2006-07-26 江崎格力高株式会社 耐热化α－葡聚糖磷酸化酶(GP)的方法
CN1930301A (zh) * 2004-03-05 2007-03-14 拜尔作物科学有限公司 鉴定具有淀粉磷酸化酶促活性的蛋白质的方法
ES2377617A1 (es) * 2010-08-31 2012-03-29 Iden Biotechnology, S.L. Procedimiento para la producción y purificación de proteínas recombinantes en plantas.
CN106084056A (zh) * 2016-06-08 2016-11-09 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 一种淀粉磷酸化酶单克隆抗体及其制备方法
CN108218991A (zh) * 2018-01-26 2018-06-29 四川农业大学 一种玉米AGPase磷酸化鉴定方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAN-MIN CHEN 等: "Regulatioon of the catalytic behaviour of L-form starch phosphorylase from sweet potato roots by proteolysis", 《PHYSIOLOGIA PLANTARUM》 *
RENUKA M.SUBASINGHE: "Role and Regulation of Starch Phosphorylase and Starch Synthase IV in Starch Biosynthesis in Maize Endosperm Amyloplasts", 《A THESIS PRESENTED TO THE UNIVERSITY OF GUELPH》 *
YAN,H 等: "Zea mays strach phosphorylase 1 precursor,mRNA,complete cds", 《GENBANK DATABASE》 *
YI-CHEN LIN 等: "Plastidial Starch Phosphorylase in Sweet Potato Roots is Proteolytically Modified by Protein-Protein Interaction with the 20S Proteasome", 《PLOS ONE》 *
申蕾阳 等: "玉米质体型淀粉磷酸化酶抗体的制备", 《玉米科学》 *
谢樱: "玉米淀粉合酶I和淀粉磷酸化酶生化特性研究", 《中国博士学位论文全文数据库（电子期刊）农业科技辑》 *

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