ES2330649T3 - Plantas que tienen un mayor rendimiento de semillas y metodo para su elaboracion. - Google Patents
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Abstract
Un método para incrementar el rendimiento de semillas en plantas con relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre, que comprende la transformación de una planta con una construcción génica que contiene un ácido nucleico que codifica para una proteína ribosomal de la pequeña subunidad 40S.
Description
Plantas que tienen un mayor rendimiento de
semillas y método para su elaboración.
La presente invención se relaciona generalmente
con el campo de la biología molecular y tiene que ver con un método
para incrementar el rendimiento de semillas, por medio de la
transformación de una planta con una construcción genética que
incluye un ácido nucleico que codifica para una proteína ribosomal
(S3a) de la pequeña subunidad 40S. La presente invención también se
relaciona con plantas a las cuales se le ha introducido un ácido
nucleico que codifica una S3a, que tienen un mayor rendimiento de
semillas con relación a las correspondientes plantas de tipo
silvestre.
La población mundial siempre en crecimiento y la
disminución de la oferta de tierras cultivables disponibles para
agricultura estimulan la investigación agrícola tendiente a mejorar
la eficiencia de la agricultura. Los medios convencionales para
mejorar los cultivos y la horticultura utilizan técnicas selectivas
de reproducción para identificar plantas que tienen características
deseables. Sin embargo, tales técnicas selectivas de reproducción
tienen varios inconvenientes, especialmente que esas técnicas son
típicamente de mano de obra intensiva y dan como resultado plantas
que a menudo contienen componentes genéticos heterogéneos que no
siempre resultan en las características deseables que son
transmitidas de las plantas progenitoras. Los avances en biología
molecular le han permitido a la humanidad modificar el germoplasma
de animales y plantas. La ingeniería genética de plantas implica el
aislamiento y manipulación de material genético (típicamente en la
forma de ADN o ARN) y la posterior introducción de ese material
genético en una planta. Tal tecnología tiene la capacidad de
permitir que los cultivos o las plantas tengan diferentes
características hortícolas o agronómicas económicamente mejoradas.
Una característica de particular interés económico es el
rendimiento. Normalmente se define el rendimiento como los
productos medibles de valor económico de un cultivo. Esto se puede
definir en términos de cantidad y/o de calidad. El rendimiento
depende directamente de diferentes factores, por ejemplo, del número
y el tamaño de los órganos, de la arquitectura de la planta (por
ejemplo, el número de ramas). La producción de semilla y más. El
desarrollo de raíces, la ingesta de nutrientes y la tolerancia al
estrés son también factores importantes para determinar el
rendimiento. El rendimiento de un cultivo se puede incrementar por
medio de la optimización de uno de los anteriores factores.
Un bosquejo de la ruta de ensamblado del
ribosoma surgió del análisis del gradiente de sacarosa a comienzos
de los años 70. Estos estudios identificaron tres partículas
preribosomales principales. Una primera partícula 90S (siendo 'S'
la velocidad de sedimentación) es posteriormente procesada en los
preribosomas 66S y 43S, los precursores de las subunidades 60S y
40S, respectivamente. La subunidad 60S, después del procesamiento,
está compuesta de ARN ribosomal de 25S, 5,8S y 5S. Una cantidad de
proteínas habrá interactuado a lo largo del proceso de maduración
para producir la estructura final. La subunidad 40S está compuesta
de un ARN ribosomal 18S, y nuevamente una cantidad de proteínas
habrán interactuado antes de que el complejo maduro esté listo.
Estas dos subunidades se ensamblan en un complejo mayor en el cual
la pequeña subunidad 40S se enlaza al ARNm y a los ARNt, mientas
que la subunidad mayor cataliza la formación del enlace peptídico.
Aproximadamente 2/3 de la masa del ribosoma consiste de ARN y 1/3
de proteína. Las proteínas son llamadas de acuerdo con la subunidad
del ribosoma a la cual ellas pertenecen: la subunidad pequeña (S1 a
S31) y la subunidad grande (L1 a L44). La mayoría de las proteínas
interactúa con elementos múltiples de ARN, a menudo de diferentes
dominios, para organizar y estabilizar la estructura terciaria del
ARNr. Aunque las actividades cruciales de decodificación y de
transferencia de péptidos son procesos con base en ARN, las
proteínas juegan un papel activo en las funciones que pueden haber
evolucionado para racionalizar el proceso de síntesis de proteína.
Además de sus funciones ribosomales típicas, muchas proteínas
ribosomales también tienen funciones no ribosomales, tales como la
reparación del ADN.
S3a (cyc07) fue clonado primero en 1991.
Codifica una proteína ribosomal 40S (pequeña subunidad) y es
homólogo al efector de transformación v-fos
(codificado por el gen fte-1 en humanos y en ratas),
al gen TU-11 inducido por TNF-alfa
en ratones, y es similar a PLC1 y PLC2 de levadura. Las expresiones
de fte-1 de mamífero, cyc-07 de
planta y PLC2 de levadura han mostrado ser todas reguladas por el
ciclo celular y estar involucradas en la síntesis de proteína a
nivel del ribosoma.
La habilidad para mejorar diferentes
características de crecimiento de una planta, tendría muchas
aplicaciones en áreas tales como la mejora de cultivos, la
reproducción de plantas, en la producción de plantas ornamentales,
arboricultura, horticultura, silvicultura, la producción de algas
para uso en biorreactores (para la producción biotecnológica de
sustancias tales como compuestos farmacéuticos, anticuerpos, o
vacunas, o para la bioconversión de residuos orgánicos) y otras
áreas por el estilo.
Se ha encontrado ahora que la transformación de
una planta con una construcción génica que comprende un ácido
nucleico que codifica para una proteína ribosomal (S3a) de la
pequeña subunidad 40S produce plantas que tienen un mayor
rendimiento de semilla con relación a las correspondientes plantas
de tipo silvestre. Por lo tanto, de acuerdo con una modalidad de la
presente invención, se provee un método para incrementar el
rendimiento de semillas en una planta, que comprende la
transformación de una planta con una construcción génica que
contiene un ácido nucleico que codifica para una proteína ribosomal
(S3a) de la pequeña subunidad 40S.
Convenientemente, el desempeño de los métodos de
acuerdo con la presente invención da como resultado plantas que
tienen mayor rendimiento de semilla.
\newpage
El término "mayor rendimiento" como se
define aquí pretende significar un incremento en uno cualquiera o
más de lo siguiente, cada uno con relación a las correspondientes
plantas de tipo silvestre: (i) mayor contenido de biomasa (peso) de
una o más partes de una planta, particularmente de las partes aéreas
(cosechables), mayor contenido de biomasa de raíces o mayor
contenido de biomasa de cualquier otra parte cosechable; (ii) mayor
rendimiento de semilla, que puede resultar de un incremento en la
biomasa de semillas (peso de semilla) y que puede ser un incremento
en el peso de la semilla por planta o con base en una semilla
individual, y cuyo incremento en el peso de la semilla puede ser
debido a dimensiones alteradas de la semilla, tal como longitud de
la semilla y/o ancho de la semilla y/o área de la semilla; (iii)
mayor número de semillas (llenas); (iv) mayor tamaño de la semilla,
que puede influir también en la composición de las semillas; (v)
mayor volumen de la semilla, que puede influir también en la
composición de las semillas; (vi) mayor índice de cosecha, que se
expresa como una proporción del rendimiento de las partes
cosechables, tal como semillas, sobre la biomasa total; y (vii)
mayor peso de mil granos (TKW), que se extrapola del número de
semillas llenas contadas y de su peso total. Un mayor TKW puede
resultar de un mayor tamaño de semilla y/o peso de semilla.
De acuerdo con la invención, el incremento en
rendimiento abarca un incremento en rendimiento sobre un nivel de
semillas como se define en uno cualquiera o más entre (ii) hasta
(vii) anteriores.
Tomando al maíz como ejemplo, un mayor
rendimiento se puede manifestar como uno o más de lo siguiente:
incremento en el número de plantas por hectárea o acre, un
incremento en el número de espigas por planta, un incremento en el
número de filas, número de granos por fila, peso de los granos, peso
de mil granos, diámetro/longitud de las espigas, entre otros.
Tomando al arroz como ejemplo, un incremento en rendimiento se puede
manifestar por medio de un incremento en uno o más de lo siguiente:
número de plantas por hectárea o acre, número de panículas por
planta, número de espiguillas por panículo, número de flores por
panículo, incremento en la velocidad de llenado de la semilla,
incremento en el peso de mil granos, entre otros. Un incremento en
rendimiento puede resultar también en una arquitectura modificada,
o puede presentarse como resultado de una arquitectura
modificada.
De acuerdo a una característica preferida de la
presente invención, el desempeño de los métodos de la invención
resultado en plantas que tienen un mayor rendimiento que se
manifiesta al menos por uno entre: un mayor TKW, un mayor número de
semillas (llenas), un mayor peso de las semillas y un mayor índice
de cosecha, cada uno con relación a las plantas de control. Por lo
tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un
método para incrementar el rendimiento de semillas en una planta, el
cual comprende transformar una planta con una construcción génica
que incluye un ácido nucleico que codifica para una proteína
ribosomal de la pequeña subunidad 40S (polipéptido S3a).
Ya que las plantas transgénicas de acuerdo con
la presente invención tienen un mayor campo de semilla, es
grandioso que estas plantas exhiban una mayor velocidad de
crecimiento (al menos durante parte de su ciclo de vida), con
relación a la velocidad de crecimiento de las correspondientes
plantas de tipo silvestre en una etapa correspondiente en su ciclo
de vida. La mayor velocidad de crecimiento puede ser específica para
una o más partes de una planta (incluidas las semillas), o puede
ser sustancialmente a través de toda la planta. Una planta que
tiene una mayor velocidad de crecimiento puede exhibir incluso una
floración temprana. El incremento en la velocidad de crecimiento
puede tener lugar en una o más etapas en el ciclo de vida de una
planta o sustancialmente durante todo el ciclo de vida de la
planta.
Una mayor velocidad de crecimiento durante las
etapas tempranas en el ciclo de vida de una planta puede reflejar
un mayor vigor. El incremento en la velocidad de crecimiento puede
alterar el ciclo de cosecha de una planta permitiendo sembrar más
tarde las plantas y/o cosechar más pronto de lo que sería posible de
otra manera. Si se incrementa suficientemente la velocidad de
crecimiento, se permitiría la siembra de más semillas de la misma
especie de planta (por ejemplo, la siembra y cosecha de plantas de
arroz seguido por la siembra y cosecha de más plantas de arroz,
todo dentro de un período convencional de crecimiento). En forma
similar, si se incrementa suficientemente la velocidad de
crecimiento, se puede permitir la siembra de más semillas de
diferentes especies de plantas (por ejemplo, la siembra y cosecha de
plantas de arroz seguida, por ejemplo, por la siembra y cosecha
opcional de semillas de soja, patatas o cualquier otra planta
adecuada). También puede ser posible cosechar más veces a partir
del mismo rizoma en el caso de algunas plantas. La alteración del
ciclo de cosecha de una planta puede conducir a un incremento en la
producción anual de biomasa por acre (debido a un incremento en el
número de veces (digamos en un año) que cualquier planta particular
puede crecer y ser cosechada). Un incremento en la velocidad de
crecimiento puede permitir también el cultivo de plantas
transgénicas en un área geográfica más amplia que sus contrapartes
de tipo silvestre, ya que las limitaciones territoriales para el
crecimiento de un cultivo están a menudo determinadas por
condiciones ambientales adversas ya sea en el momento de la siembra
(principios de la temporada) o al momento de la cosecha (finales de
la temporada). Se pueden evitar tales condiciones adversas si se
acorta el ciclo de cosecha. Se puede determinar la velocidad de
crecimiento derivando diferentes parámetros a partir de experimentos
de crecimiento por medio de las gráficas de las curvas de
crecimiento; tales parámetros pueden ser: T- Mid (el tiempo que le
toma a las plantas alcanzar el 50% de su
tamaño máximo) y T-90 (el tiempo que le toma a las plantas alcanzar el 90% de su tamaño máximo), entre otros.
tamaño máximo) y T-90 (el tiempo que le toma a las plantas alcanzar el 90% de su tamaño máximo), entre otros.
La utilización de los métodos de la invención
produce plantas que tienen una mayor velocidad de crecimiento. Por
lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método
para incrementar la velocidad de crecimiento de las plantas, el
cual comprende la transformación de una planta con una construcción
génica que incluye un ácido nucleico que codifica para una proteína
ribosomal de la pequeña subunidad 40S (polipéptido S3a). Aquí se
ejemplifica una mayor velocidad de crecimiento por medio de un
incremento en TKW, en un mayor número de semillas (llenas), un
mayor peso de las semillas y un mayor índice de cosecha, cada uno
con relación a las plantas de control/a las correspondientes plantas
de tipo silvestre.
Se presenta un incremento en el rendimiento de
semillas y/o en la velocidad de crecimiento ya sea que la planta no
esté bajo condiciones de estrés o que la planta esté expuesta a
diferentes condiciones de estrés comparadas con las plantas de
control. Las plantas responden típicamente a la exposición al estrés
creciendo más lentamente. En condiciones de estrés severo, la
planta puede incluso detener su crecimiento totalmente. Por otro
lado, se define aquí un estrés suave como cualquier estrés al cual
se expone una planta, que no da como resultado la cesación total de
crecimiento de la misma. Debido a los avances en las prácticas
agrícolas (irrigación, fertilización, tratamientos con pesticidas)
no se encuentran a menudo condiciones severas de estrés en plantas
de cultivo cultivadas. En consecuencia, el crecimiento comprometido
inducido por un estrés suave es a menudo una característica
indeseable para la agricultura. Estreses suaves son los estreses
típicos a los cuales se puede exponer una planta. Estos estreses
pueden ser los estreses bióticos y/o abióticos diarios (ambientales)
a los cuales está expuesta una planta. Los estreses abióticos
típicos o ambientales incluyen los estreses por temperatura
provocados por temperaturas atípicamente altas o bajas/congelantes;
estrés por salinidad; estrés por agua (sequía o exceso de agua).
Los estreses abióticos pueden ser provocados también por compuestos
químicos. Los estreses bióticos son típicamente aquellos estreses
provocados por patógenos, tales como bacterias, virus, hongos e
insectos.
Se pueden modificar convenientemente las
características de crecimiento anteriormente mencionadas en
cualquier planta.
El término "planta" como se lo utiliza aquí
abarca plantas completas, ancestros y progenie de las plantas y
partes de la planta, incluidas semillas, brotes, tallos, hojas,
raíces (incluidos tubérculos), y tejidos y órganos, en donde cada
uno de los anteriormente mencionados incluyen al gen de interés. El
término "planta" también abarca embriones, regiones
meristemáticas, gametofitos, esporofitos, polen, y microesporas,
nuevamente en donde cada uno de los anteriormente mencionados
incluyen al gen de interés.
Las plantas que son particularmente útiles en
los métodos de la invención incluyen a todas las plantas que
pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas
monocotiledóneas y dicotiledóneas incluidos forrajes o legumbres
forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles o
arbustos seleccionados de la lista que comprende Acacia
spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp.,
Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor,
Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia
fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp.,
Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana,
Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis,
Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema
pubescens, Chaenomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea
arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster
serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus
spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica,
Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblongs,
Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp.,
Dicksonia squarosa. Diheteropogon amplectens, Dioclea spp,
Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis,
Ehrartia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp.,
Erythrina spp., Eucalyptus spp., Euclea schimperi,
Eulalia villosa, Fagopyrum spp., Feijoa sellowiana,
Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksii,
Geranium thunbergii, Ginkgo biloba, Glycine javanica,
Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp.,
Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemarthia
altissima, Heteropogon contortus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia
rufa, Hypericum erectum, Hyperthelia dissoluta, Indigo incarnata,
Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp.,
Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex,
Lotonus bainesii, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus
spp., Manihot esculenta, Medicago sativa, Metasequoia
glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp.,
Onobrychis spp., Omithopus spp., Oryza spp.,
Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea
gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix
canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea
glauca, Pinus spp., Pisum sativum, Podocarpus totara,
Pogonarthria fleckii, Pogonarthria squarrosa, Populus spp.,
Prosopis cineraria, Pseudolsuga menziesii, Pterolobium
stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolopsis
umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes
grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp.,
Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum,
Sciadopitys verticillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron
giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus
fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis,
Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra,
Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla,
Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia
pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto,
alcachofa, espárrago, brócoli, coles de Bruselas, col, canola,
zanahoria, coliflor, apio, hojas de col, lino, variedad de col
rizada, lentejas, semillas oleaginosas de colza, algalia, cebolla,
patata, arroz, soja, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar,
girasol, tomate, calabaza, té y algas, entre otros. De acuerdo a una
modalidad preferida de la presente invención, la planta es una
planta de cultivo tal como soja, girasol, canola, alfalfa, semilla
de colza, algodón, tomate, patata o tabaco. Preferiblemente además,
la planta es una planta monocotiledónea, tal como caña de azúcar.
Más preferiblemente, la planta es un cereal, tal como arroz, maíz,
trigo, cebada, mijo, centeno, sorgo o avena.
El término S3a es bien conocido en el arte. En
la Tabla 1 a continuación, se dan los nombres alternativos para S3a
tomados de Naora y Naora (Immunology and Cell Biology (1999) 77,
197-205).
Un S3a puede ser identificado fácilmente
alineando una secuencia de consulta (preferiblemente una secuencia
de proteína) con secuencias conocidas de proteína S3a (ver por
ejemplo los alineamientos mostrados en las Figuras 1 y 2). La
secuencia de consulta se puede alinear (con secuencias conocidas de
S3a) utilizando, por ejemplo, el programa de alineación múltiple
VNTI AlignX (InforMax, Bethesda, MD), con configuraciones
predeterminadas para penalizaciones por huecos de 10 y una
extensión de hueco de 0,05. Ya que las secuencias de S3a están
altamente conservadas, una persona capacitada en el arte podría
identificar fácilmente otras secuencias de S3a comparando
cualquiera de las regiones conservadas de la secuencia de consulta
contra aquellas de las secuencias conocidas de S3a. Estas regiones
de alta conservación están ilustradas en la Figura 2 por medio de
las tres regiones en cajas. Por lo tanto, una secuencia de consulta
que tiene las correspondientes regiones de conservación podría ser
identificada como una S3a. Las S3a también han mostrado que se
enlazan con factores eucariotas de iniciación elF-2
y elF-3 (Westermann y colaboradores (FEBS Letters
Vol. 97, No. 1 (Enero de 1979)).
Las secuencias de ácido nucleico que codifican
para S3A y las secuencia de proteína S3A útiles en los métodos de
la presente invención codifican o reflacionan para una proteína
ribosomal de la pequeña subunidad 40S. Cualquier referencia aquí
para el término "S3A" se refiere por lo tanto a una proteína
ribosomal de la pequeña subunidad 40S.
El término "S3a" como se define aquí se
entiende como una proteína, que cuando se la utiliza en un
alineamiento, tal como aquellos mostrados en las Figuras 1 ó 2, se
alinea con secuencias conocidas de la proteína S3a y contiene
regiones de conservación correspondientes a las regiones entre
cajones mostradas en la alineación de la Figura 2. La referencia
que se hace aquí a un ácido nucleico que codifica para S3a es para
un ácido nucleico que codifica una proteína, que cuando se lo
utiliza en una alineación, tal como aquella mostrada en las Figuras
1 ó 2 se alinea con las secuencias conocidas de la proteína S3a e
incluye las regiones de conservación correspondientes a las
regiones entre cajas mostradas en la alineación de la Figura 2. Las
S3a y los ácidos nucleicos que codifican para S3a como se definió
anteriormente son útiles en los métodos de la invención.
El ácido nucleico que va a ser introducido en
una planta puede ser cualquier secuencia que codifica para S3a como
se definió aquí anteriormente. Preferiblemente, el ácido nucleico es
como el representado por medio de la SEQ ID No: 1. El ácido
nucleico que va a ser introducido en una planta está preferiblemente
operativamente enlazado a un promotor constitutivo para
sobreexpresión en una planta. El promotor constitutivo es
preferiblemente un promotor GOS2, preferiblemente además un
promotor GOS2 de arroz. Debe ser claro que la aplicabilidad de la
presente invención no está restringida a la S3a representada por la
SEQ ID No: 1, ni tampoco está restringida la aplicabilidad de la
invención a la expresión de un gen/ácido nucleico para S3a cuando es
dirigida por un promotor GOS2.
De acuerdo con un aspecto preferido de la
presente invención, está prevista una expresión mejorada o reforzada
del ácido nucleico que codifica para S3a. Los métodos para obtener
una expresión mejorada o reforzada de los genes o de los productos
génicos están bien documentados en el arte e incluyen, por ejemplo,
una sobreexpresión dirigida por un promotor fuerte, el uso de
reforzadores de transcripción o reforzadores de traducción.
El ácido nucleico que codifica una S3a puede ser
obtenido de cualquier fuente. El ácido nucleico/gen que codifica
una S3a puede ser aislado de una fuente microbiana, tal como una
fuente bacteriana, levadura u hongo, o a partir de una planta, alga
o animal (incluida humana). Este ácido nucleico puede ser modificado
a partir de su forma nativa en composición y/o en ambiente genómico
a través de manipulación humana deliberada. El ácido nucleico es
preferiblemente un ácido nucleico homólogo, es decir un ácido
nucleico obtenido a partir de una planta, ya sea de la misma
especie de planta en la cual va a ser introducido o de una especie
diferente de planta. El ácido nucleico puede ser aislado a partir
de una especie dicotiledónea, preferiblemente de la familia
Brassicaceae, preferiblemente además de Arabidopsis
thaliana. Más preferiblemente, la S3a aislada a partir de
Arabidopsis thaliana está representada por la SEQ ID No: 1 y
la secuencia de aminoácidos como la representada por la SEQ ID No:
2.
La secuencia representada por SEQ ID No: 1
describe una S3a de Arabidopsis thaliana, con una SEQ ID No:
2 la correspondiente secuencia de aminoácidos. Convenientemente,
la aplicabilidad de la presente invención no está restringida al
uso de una S3a de Arabidopsis thaliana, como la representada
por la SEQ ID No: 1. Los métodos de acuerdo con la presente
invención también se pueden llevar a cabo utilizando cualquier S3a
o secuencia que codifica a S3a como se definió aquí
anteriormente.
La S3a o los ácidos nucleicos que codifican a la
S3a útiles en la práctica del método de acuerdo con la invención
pueden ser:
- (i)
- Una secuencia que hibrida bajo condiciones rigurosas a un ácido nucleico que codifica para una proteína ribosomal de la pequeña subunidad 40S;
- (ii)
- Una variante alternativa de empalme de un ácido nucleico que codifica para una proteína ribosomal de la pequeña subunidad 40S;
- (iii)
- Una variante alélica de un ácido nucleico que codifica para una proteína ribosomal de la pequeña subunidad 40S; y
- (iv)
- Un ácido nucleico que codifica a un ortólogo que tiene en orden creciente de preferencia al menos un 80%, 85% 90%, 95% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con una proteína ribosomal de la pequeña subunidad 40S.
\vskip1.000000\baselineskip
También útil en la realización de los métodos de
la invención son los ácido nucleicos que hibridan bajo condiciones
rigurosas con un ácido nucleico que codifica para S3a,
preferiblemente ácidos nucleicos que hibridan bajo condiciones
rigurosas a una secuencia de ácido nucleico que codifica para S3a
como la representada por medio de la SEQ ID No: 1. Tales secuencias
de hibridación son aquellas que codifican proteínas S3a que se
alinean con secuencias conocidas de proteína S3a y que incluyen
regiones de conservación correspondientes a las regiones entre cajas
mostradas en la alineación de la Figura 2.
El término "hibridación" como se define
aquí es un proceso en donde secuencias sustancialmente homólogas de
nucleótidos complementarios se aparean entre sí. El proceso de
hibridación puede presentarse enteramente en solución, es decir,
ambos ácidos nucleicos complementarios están en solución. Las
herramientas en biología molecular que cuentan con tales procesos
incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; y todos los
métodos con base en la misma), hibridación sustractiva, extensión
aleatoria del iniciador, mapeo de la nucleasa S1, extensión del
iniciador, transcripción inversa, síntesis del ADNc, presentación
diferencial de los ARN, y determinación de la secuencia de ADN. El
proceso de hibridación puede ocurrir también con uno de los ácidos
nucleicos complementarios inmovilizado a una matriz tal como perlas
magnéticas, perlas de Sefarosa o cualquier otra resina. Las
herramientas en biología molecular que cuentan con tal proceso
incluyen el aislamiento de ARN poli(A*). El proceso de
hibridación puede presentarse además con uno de los ácidos nucleicos
complementarios inmovilizado a un soporte sólido tal como una
membrana de nitrocelulosa o de nylon, o inmovilizado, por ejemplo
por litografía, por ejemplo a un soporte de vidrio silíceo (este
último conocido como arreglos o microarreglos de ácido nucleico o
como chips de ácido nucleico). Las herramientas en biología
molecular que cuentan con tal proceso incluyen análisis de
transferencias en gel de ADN y ARN, hibridación de colonias,
hibridación en placa, hibridación in situ e hibridación de
microarreglos. Con el propósito de permitir que ocurra la
hibridación, se desnaturalizan las moléculas de ácido nucleico
generalmente térmica o químicamente para fundir una cadena doble en
dos cadenas sencillas y/o para remover horquillas u otras
estructuras secundarias de ácidos nucleicos monocatenarios. La
rigurosidad de la hibridación está influenciada por condiciones
tales como temperatura, concentración salina y composición del
amortiguador de hibridación. La hibridación se presenta
preferiblemente bajo condiciones rigurosas. Condiciones rigurosas
son aquellas que (1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura
para lavado, por ejemplo, amortiguador de fosfato de sodio 0,5 M pH
7,2, EDTA 1 mM pH 8,0 en SDS al 7% ya sea a 65ºC o a 55ºC, o (2)
emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante tal como
formamida, por ejemplo, formamida al 50% (vol/vol) con albúmina de
suero bobino al 0,1%, Ficoll al 0,1%, polivinilpirrolidona al 0,1%,
amortiguador de fosfato de sodio 0,05 M a pH 6-5 con
NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M a 42ºC. Un ejemplo específico
incluye el uso de formamida al 50%, 5XSSC (NaCl 0,75 M, citrato de
sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de
sodio al 0,1%, solución de Denhard 5X, ADN sonicado de esperma de
salmón (50 nm/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 55ºC,
con lavados a 55ºC en 0,2XSSC y SDS al 0,1%. Una persona capacitada
puede determinar fácilmente y variar las condiciones de rigurosidad
en forma apropiada para obtener una señal de hibridación clara y
detectable.
Por lo tanto, de acuerdo a la invención se
proporciona un método para incrementar el rendimiento de semillas
en las plantas, que comprende transformar una planta con una
construcción génica que incluye una secuencia de ácido nucleico
capaz de hibridar bajo condiciones estrictas a una secuencia de
ácido nucleico que codifica para S3a, preferiblemente a un ácido
nucleico que codifica para S3a como el representado por la SEQ ID
No: 1.
También útil para llevar a cabo los métodos de
la invención son las variantes alternativas de empalme de un ácido
nucleico que codifica para S3a, preferiblemente una variante
alternativa de empalme de un ácido nucleico que codifica para S3a
como el representado por la secuencia de la SEQ ID No: 1. Las
variantes de empalme adecuadas para uso en la realización de los
métodos de la invención son aquellas que codifican a las proteínas
S3a que se alinean con secuencias conocidas de la proteína S3a y
que incluyen a las regiones de conservación correspondientes a las
regiones dentro de cajas mostradas en la alineación de la Figura 2.
El término "variante alternativa de empalme" como se lo
utiliza aquí abarca variantes de una secuencia de ácido nucleico en
la cual los intrones y/o los exones seleccionados han sido
cortados, reemplazados o añadidos. Tales variantes serán aquellas en
las cuales la actividad biológica de la proteína permanece sin
cambio, lo cual se puede lograr reteniendo selectivamente los
segmentos funcionales de la proteína. Tales variantes de empalme se
pueden encontrar en la naturaleza o pueden ser sintéticas. Los
métodos para elaborar tales variantes de empalme son bien conocidos
en el arte.
Por lo tanto, la invención también proporciona
un método para incrementar el rendimiento de semillas en las
plantas, que comprende la transformación de una planta con una
construcción génica que contiene una variante alternativa de
empalme de un ácido nucleico que codifica para una subunidad 40S de
proteína ribosomal (S3a), preferiblemente una variante alternativa
de empalme de un ácido nucleico que codifica para S3a como el
representado por la SEQ ID No: 1.
También son útiles en la realización de los
métodos de la invención las variantes alélicas de un ácido nucleico
que codifica para S3a, preferiblemente una variante alélica de un
ácido nucleico que codifica para S3a como el representado por la
SEQ ID No: 1. Las variantes alélicas adecuadas para uso en la
realización de los métodos de la invención son aquellas que
codifican proteínas S3a que se alinean con secuencias conocidas de
la proteína S3a y que incluyen regiones de conservación
correspondientes a las regiones entre cajas mostradas en la
alineación de la Figura 2.
En la naturaleza existen variantes alélicas y
dentro de los métodos abarcados por la presente invención está el
uso de estos alelos naturales. Las variantes alélicas abarcan a los
Polimorfismos de Nucleótidos Individuales (SNP), así como los
Polimorfismos Pequeños de Inserción/Supresión (INDEL). El tamaño de
los INDEL es usualmente menor a 100 pb. Los SNP y los INDEL forman
el conjunto más grande de variantes de secuencia en las cadenas
polimórficas naturales de la mayoría de los organismos.
Por lo tanto, la invención también proporciona
un método para incrementar el rendimiento de semillas en las
plantas, que comprende la transformación de una planta con una
construcción génica que contiene una variante alélica de un ácido
nucleico que codifica para una proteína ribosomal (S3a) de la
pequeña subunidad 40S como la representada por la SEQ ID No: 1.
Convenientemente además, los métodos de acuerdo
con la presente invención se pueden practicar también utilizando
ortólogos de una S3a, tales como una S3a representada por la SEQ ID
No: 2. Se pueden determinar fácilmente los ácidos nucleico que
codifican a los homólogos o derivados de las S3a utilizando técnicas
de rutina bien conocidas por las personas capacitadas en el
arte.
Se pueden encontrar fácilmente ortólogos, por
ejemplo en especies de plantas monocotiledóneas llevando a cabo la
así llamada búsqueda recíproca por explosión. Esto se puede hacer
por medio de una primera explosión que involucra la voladura de la
secuencia en cuestión (por ejemplo, de la SEQ ID No: 1 o de la SEQ
ID No: 2) contra cualquier base de datos de secuencias, tal como la
base de datos NCBI públicamente disponible que puede ser encontrada
en http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Si se buscaran ortólogos en el
arroz, la secuencia en cuestión sería explotada por ejemplo contra,
los 28.469 clones de ADNc de longitud completa del genotipo de arroz
Nipponbare Oryza sativa disponible en el NCBI. Se puede
utilizar BLASTn cuando se parte de nucleótidos o TBLASTX cuando se
parte de la proteína, con valores estándar por defecto (expectativa
10, alineamiento 50). Los resultados de blast se pueden filtrar. La
longitud completa de las secuencias, ya sea de los resultados
filtrados o de los resultados sin filtrar, son pasados nuevamente
por blast (segundo blast) contra la secuencia en cuestión (SEQ ID
No: 1 ó 2). Se comparan luego los resultados del primero y segundo
blast. En el caso de las familias más grandes, se utiliza ClustalW
seguido por un árbol vecino de unión para ayudar a visualizar el
agrupamiento.
Por lo tanto, la invención también provee un
método para incrementar el rendimiento de semilla en plantas, que
comprende transformar una planta con una construcción génica que
incluye un ácido nucleico que codifica un ortólogo que tiene en
orden creciente de preferencia al menos 80%, 85%, 90%, 95% o más de
identidad de secuencia de aminoácidos con una proteína ribosomal de
la pequeña subunidad 40S. Preferiblemente, el ortólogo tiene en
orden creciente de preferencia al menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%,
80%, 85%, 90%, 95% o más de identidad de secuencia de aminoácidos
con una secuencia de aminoácidos como la representada por la SEQ ID
No: 2 y cuyo ortólogo se alinea con secuencias conocidas de la
proteína S3a e incluye regiones de conservación correspondientes a
las regiones dentro de cajas mostradas en el alineamiento de la
Figura 2.
La invención también provee construcciones
genéticas y vectores para facilitar la introducción y/o expresión de
las secuencias de nucleótidos útiles en los métodos de acuerdo con
la invención.
Por lo tanto, se provee una construcción génica
que comprende:
- (i)
- Un ácido nucleico que codifica para S3a, preferiblemente como el representado por la SEQ ID No: 1;
- (ii)
- Una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ácido nucleico de (i); opcionalmente
- (iii)
- Una secuencia de terminación de la transcripción.
\vskip1.000000\baselineskip
Las construcciones útiles en los métodos de
acuerdo con la presente invención pueden ser construidas utilizando
tecnología de ADN recombinante bien conocida por las personas
capacitadas en el arte. Se pueden insertar las construcciones
génicas en vectores, que pueden estar disponibles en el comercio,
adecuados para transformarse dentro de las plantas y adecuados para
la expresión del gen de interés en las células transformadas.
Las plantas se transforman con una construcción
génica que contiene la secuencia de interés (es decir, un ácido
nucleico que codifica para S3a como se definió aquí anteriormente).
La secuencia de interés está operativamente enlazada a una o más
secuencias de control (al menos a un promotor). Los términos
"elemento regulador", "secuencia de control" y
"promotor" son todos utilizados aquí en forma intercambiable y
se deben tomar en un contexto amplio para referirse a secuencias
reguladoras de ácido nucleico capaces de efectuar la expresión de
las secuencias a las cuales están ligadas. Abarcados por los
términos anteriormente mencionados están las secuencias reguladoras
de la transcripción derivadas de un gen genómico eucariota clásico
(incluida la caja TATA que es requerida para una iniciación precisa
de la transcripción, con o sin una secuencia de caja CCAAT) y
elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias activadoras
secuencia arriba, reforzadores y silenciadores) que alteran la
expresión génica en respuesta a estímulos externos y/o de
desarrollo, o en una forma específica para el tejido. También está
incluida dentro del término una secuencia reguladora de la
transcripción de un gen procariota clásico, en cuyo caso puede
incluir una secuencia de caja -35 y/o secuencias reguladoras de la
transcripción de caja -10. El término "elemento regulador"
también abarca una molécula sintética de fusión o derivada que
confiere, activa o refuerza la expresión de una molécula de ácido
nucleico en una célula, tejido u órgano. El término
"operativamente enlazado" como se lo utiliza aquí se refiere a
un enlace funcional entre la secuencia promotora y el gen de
interés, de tal manera que la secuencia promotora es capaz de
iniciar la trascripción del gen de interés.
Convenientemente, se puede utilizar cualquier
tipo de promotor para dirigir la expresión del ácido nucleico que
codifica para S3a.
Preferiblemente, el ácido nucleico que codifica
una S3a está operativamente enlazado a un promotor constitutivo. El
término "constitutivo" como se lo define aquí se refiere a un
promotor que se expresa predominantemente en más de un tejido u
órgano y predominantemente en cualquier etapa en el ciclo de vida de
una planta. Preferiblemente, el promotor constitutivo se expresa
predominantemente a través de toda la planta. Preferiblemente, el
promotor constitutivo es el promotor GOS2 de arroz.
Los ejemplos de otros promotores constitutivos
adecuados para uso en los métodos de la invención están enlistados
en la Tabla A a continuación.
Opcionalmente, se pueden utilizar también una o
más secuencias terminadoras en la construcción introducida en una
planta. El término "terminador" abarca una secuencia de control
que es una secuencia de ADN al extremo de una unidad
transcripcional que señala el procesamiento y poliadenilación 3' de
un transcripto primario y de terminación de la transcripción. Los
elementos reguladores adicionales pueden incluir reforzadores
transcripcionales así como de traducción. Aquellos capacitados en
el arte se darán cuenta de cuáles son las secuencias terminadoras y
reforzadoras que pueden ser adecuadas para el uso en la realización
de la invención. Tales secuencias serían conocidas o pueden ser
obtenidas fácilmente por una persona capacitada en el arte.
Las construcciones genéticas de la invención
pueden incluir además un origen de secuencia de replicación que es
requerido para el mantenimiento y/o la replicación en un tipo de
célula específico. Un ejemplo es cuando se requiere mantener una
construcción genética en una célula bacteriana como un elemento
genético episomal (por ejemplo, una molécula de plásmido o de
cósmido). Los orígenes preferidos de replicación incluyen, pero no
se limitan a, f1-ori y colE1.
La construcción genética puede incluir
opcionalmente un marcador genético seleccionable. Como se lo utiliza
aquí, el término "gen marcador seleccionable" incluye
cualquier gen que confiere un fenotipo sobre una célula en la cual
se expresa para facilitar la identificación y/o selección de células
que son transfectadas o transformadas con una construcción de ácido
nucleico de la invención. Los marcadores adecuados se pueden
seleccionar a partir de marcadores que confieren resistencia
antibiótica o herbicida, que introduce un nuevo rasgo metabólico o
que permite selección visual. Los ejemplos de genes marcadores
seleccionables incluyen genes que confieren resistencia a los
antibióticos (tal como nptII que fosforila neomicina y kanamicina, o
hpt, que fosforila higromicina), a herbicidas (por ejemplo bar que
proporciona resistencia a Basta; aroA o gox que proporciona
resistencia contra glifosato), genes que proveen un rasgo metabólico
(tales como mana que permite que las plantas utilicen manosa como
única fuente de carbono). Los genes marcadores visuales resultan en
la formación de color (por ejemplo
\beta-glucuronidasa, GUS), luminiscencia (tal como
luciferasa) o florescencia (Proteína Verde de Fluorescencia, GFP, y
derivados de la misma).
La presente invención también abarca plantas que
pueden ser obtenidas por medio de los métodos de acuerdo con la
presente invención. La presente invención proporciona por lo tanto
plantas que pueden ser obtenidas por medio del método de acuerdo
con la presente invención, a las cuales se les ha introducido y
expresan dentro de ellas un ácido nucleico que codifica una
proteína S3a, como se definió aquí anteriormente.
La invención también provee un método para la
producción de plantas transgénicas que tienen un mayor rendimiento
de semilla, que comprende la introducción y expresión en una planta
de un ácido nucleico que codifica para una S3a, preferiblemente como
el representado por la SEQ ID No: 1.
Más específicamente, la presente invención
provee un método para la producción de plantas transgénicas que
tienen un mayor rendimiento de semilla, el cual comprende:
- (i)
- la transformación de una planta con una construcción génica que contiene un ácido nucleico que codifica para una proteína ribosomal (S3a) de la pequeña subunidad 40S, preferiblemente como el representado por la SEQ ID No: 1;
- (ii)
- el cultivo de la célula de la plante bajo condiciones que promuevan la regeneración y crecimiento de la planta madura.
Se puede introducir el ácido nucleico
directamente dentro de una célula de una planta o dentro de la misma
planta (incluida la introducción dentro de un tejido, órgano o
cualquier otra parte de una planta). De acuerdo a una característica
preferida de la presente invención, se introduce preferiblemente el
ácido nucleico dentro de una planta por medio de transformación.
El término "transformación" como se lo
utiliza aquí abarca la transferencia de un polinucleótido exógeno
dentro de una célula huésped, independientemente del método
utilizado para la transferencia. El tejido de la planta capaz de
una propagación clonal posterior, ya sea por organogénesis o por
embriogénesis puede ser transformado con una construcción genética
de la presente invención y se puede regenerar una planta completa a
partir del mismo. El tejido particular escogido variará dependiendo
de los sistemas clonales de propagación disponibles para, y más
adecuados para, la especie particular que está siendo transformada.
Los ejemplos de tejidos objetivo incluyen discos de hojas, polen,
embriones, cotiledones, hipocotiledónes, megagametofitos, tejido de
callos, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristemo
apical, yemas auxiliares, y meristemas de la raíz), y tejido
inducido de meristema (por ejemplo, meristema de cotiledón y
meristema de hipocotiledón). Se puede introducir el polinucleótido
en forma transitoria o estable dentro de una célula huésped y se lo
puede mantener no integrado, por ejemplo, como un plásmido.
Alternativamente, se lo puede integrar dentro del genoma del
huésped. La célula resultante de la planta transformada puede ser
utilizada entonces para regenerar una planta transformada en una
forma conocida por las personas capacitadas en el arte.
La transformación de especies de plantas es hoy
en día una técnica bastante rutinaria. Convenientemente, se puede
utilizar cualquiera de los diferentes métodos de transformación para
introducir el gen de interés dentro de un ancestro adecuado de una
célula. Los métodos de transformación incluyen el uso de liposomas,
electroporación, compuestos químicos que incrementan la captación
de ADN libre, inyección del ADN directamente dentro de la planta,
bombardeo con pistola de partículas, transformación utilizando virus
o polen y microinyección. Se pueden seleccionar los métodos a
partir del método de calcio/polietilén glicol para protoplastos
(Krens, F.A. y colaboradores, 1882, Nature 296,
72-74; Negrutiu I. y colaboradores, Junio 1987,
Plant Mol. Biol. 8, 363-373); electroporación de
protoplastos (Shillito R. D. y colaboradores, 1985 Bio/Technol 3,
1099-1102); microinyección en material de la planta
(Crossway A. y colaboradores, 1986, Mol, Gen Genet 202,
179-185); bombardeo de partículas recubiertas con
ADN o ARN (Klein T. M. y colaboradores, 1987, Nature 327, 70)
infección con (no integradora) virus y similares. Las plantas de
arroz transgénico que expresan una S3a son producidas
preferiblemente a través de transformación mediada por
Agrobacterium utilizando cualquiera de los métodos conocidos
para transformación de arroz, tal como los descritos en cualquiera
de los siguientes documentos: solicitud europea de patente
publicada EP 1198985 A1, Aldemita y Hodges (Planta, 199,
612-617, 1996); Chan y colaboradores (Plant Mol.
Biol. 22 (3) 491-506, 1993), Hiei y colaboradores
(Plant J. 6 (2) 271-282, 1994), cuyas descripciones
se incorporan aquí como referencia como si estuvieran expuestas en
su totalidad. En el caso de la transformación del maíz, el método
preferido es como el descrito ya sea en Ishida y colaboradores
(Nat. Biotechnol. 1996 Junio; 14(6): 745-50)
o en Frame y colaboradores (Plant Physiol. 2002 Mayo; 129(1):
13-22), cuyas descripciones se incorporan aquí como
referencia como si estuvieran expuestas en su totalidad.
Generalmente después de la transformación, se
seleccionan células de la planta o agrupaciones celulares por la
presencia de uno o más marcadores que son codificados por genes que
pueden expresarse en la planta transferidos en forma conjunta con
el gen de interés, después de lo cual se regenera el material
transformado dentro de una planta completa.
Después de la transferencia y regeneración del
ADN, se pueden evaluar las plantas putativamente transformadas,
utilizando por ejemplo análisis tipo Southern, para la presencia del
gen de interés, el número de copia y/o la organización genómica.
Alternativamente o adicionalmente, se pueden monitorear los niveles
de expresión del ADN recientemente introducido utilizando análisis
tipo Northern y/o Westhern, siendo ambas técnicas conocidas por las
personas ordinariamente capacitadas en el arte.
Las plantas transformadas generadas se pueden
propagar por medio de una variedad de medios, tales como por medio
de técnicas de propagación clonal o técnicas clásicas de
reproducción. Por ejemplo, una primera generación de plantas
transformadas (o T1) puede ser autofecundadas para producir
transformantes homocigotos de segunda generación (o T2), y las
plantas T2 propagadas adicionalmente a través de técnicas clásicas
de reproducción.
Los organismos transformados generados pueden
tomar una variedad de formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de
células transformadas y de células no transformadas; transformantes
clonados (por ejemplo, todas las células transformadas para
contener el casete de expresión); injertos de tejidos transformados
y no transformados (por ejemplo, en plantas, un rizoma transformado
injertado a un retoño no transformado).
La presente invención se extiende claramente a
cualquier célula de planta o planta producida por medio de
cualquiera de los métodos descritos aquí, y a todas las partes de la
planta y propágulos de la misma. La presente invención se extiende
además para abarcar la progenie de una célula, tejido, órgano o la
planta completa primaria transformada o transfectada que ha sido
producida por medio de cualquiera de los métodos anteriormente
mencionados, siendo el único requisito que la progenie exhiba
la(s) misma(s) característica(s)
genotípica(s) y/o fenotípica(s) como aquellas
producidas en el progenitor por medio de los métodos de acuerdo con
la invención. La invención también incluye células huésped que
contienen un ácido nucleico aislado que codifica para S3a. Las
células huésped preferidas de acuerdo con la invención son células
de plantas. La invención también se extiende a las partes
cosechables de una planta tales como, pero sin limitarse a,
semillas, hojas, frutos, flores, cultivos de tallo, rizomas,
tubérculos y bulbos.
La recombinación homóloga permite la
introducción de un ácido nucleico seleccionado en un genoma en una
posición seleccionada definida. La recombinación homóloga es una
tecnología estándar utilizada rutinariamente en ciencias biológicas
para los organismos inferiores tales como levaduras o el musgo
Physcomitrella. Los métodos para llevar a cabo la recombinación
homóloga en plantas han sido descritos no solamente para plantas
modelo (Offringa y colaboradores Extrachromosomal homologous
recombination and gene targeting in plant cells after
Agrobacterium-mediated transformation. 1990 EMBO J.
1990 Oct; 9 (10): 3077-84) sino también para plantas
de cultivos, por ejemplo arroz (Terada R, Urawa H, Inagaki Y,
Tsugane K, Iida S. Efficient gene targeting by homologous
recombination in rice. Nat Biotechnol. 2002. Iida and Terada: A
tale of two integrations, transgene and T-DNA: gene
targeting by homologous recombination in rice. Curr Opin
Biotechnol. 2004 Abr; 15 (2): 132-8). El ácido
nucleico que va a ser destinado (que puede ser un ácido nucleico
que codifica para S3a como se definió aquí anteriormente) no
necesita ser dirigido al locus de un gen que codifica para S3a, sino
que puede ser introducido, por ejemplo, en regiones de alta
expresión. El ácido nucleico que va a ser destinado puede ser un
alelo mejorado utilizado para reemplazar al gen endógeno o puede
ser introducido además del gen endógeno.
La presente invención también abarca el uso de
ácidos nucleicos que codifican a las S3a y el uso de polipéptidos
S3a.
Uno de tales usos desde luego se relaciona con
el uso de una S3a como se definió aquí anteriormente para mejorar
el rendimiento de semillas en las plantas. El rendimiento de
semillas puede incluir uno o más de lo siguiente: un mayor número
de semillas (llenas), un mayor peso de las semillas, un mayor índice
de cosecha y mayor TKW, entre otros. El ácido nucleico que codifica
para S3a puede ser como el representado por la SEQ ID No: 1 y la
proteína S3a puede ser un aminoácido como el representado por la SEQ
ID No: 2.
Los ácidos nucleicos que codifican las S3a, y
los polipéptidos S3a, como se definió aquí anteriormente pueden
encontrar uso también en programas de reproducción. El ácido
nucleico que codifica para S3a puede ser como el representado por
la SEQ ID No: 1; o la S3a puede ser un aminoácido como el
representado por la SEQ ID No: 2. Por ejemplo, el ácido nucleico
que codifica para S3a o una parte del mismo puede estar sobre un
cromosoma (o una parte del mismo), preferiblemente junto con uno o
más miembros relacionados de la familia. En un ejemplo de tal
programa de reproducción, se identifica un marcador de ADN que puede
estar genéticamente enlazado a un gen capaz de modular la expresión
de un ácido nucleico que codifica una proteína S3a en una planta,
cuyo gen puede ser un gen que codifica a la misma proteína S3a o
cualquier otro gen que pude influir directa o indirectamente la
expresión de un gen que codifica a una proteína S3a y/o la actividad
de la misma proteína S3a. Este marcador de ADN puede ser luego
utilizado en programas de reproducción para seleccionar plantas que
tienen mejores características de crecimiento.
Se pueden utilizar también variantes alélicas de
una S3a en programas convencionales de reproducción, tales como en
la reproducción asistida por un marcador. Tales programas de
reproducción requieren algunas veces de la introducción de
variaciones alélicas en las plantas por medio de tratamiento
mutagénico de una planta. Un método mutagénico adecuado es la
mutagénesis EMS. Tiene lugar luego la identificación de variantes
alélicas, por ejemplo, por PCR. Esta es seguida por una etapa de
selección para la selección de variantes alélicas superiores de la
secuencia en cuestión y que producen características mejoradas de
crecimiento en una planta. La selección se lleva a cabo típicamente
monitoreando el desempeño de crecimiento de las plantas que
contienen diferentes variantes alélicas de la secuencia en
cuestión, por ejemplo, diferentes variantes alélicas de la SEQ ID
No: 1. El monitoreo del desempeño de crecimiento se puede hacer en
un invernadero o en el campo. Otras etapas opcionales incluyen
cruzamiento de plantas, en las cuales se identificó la variante
alélica superior, con otra planta. Esto se podría utilizar, por
ejemplo, para hacer una combinación de características de
interés.
Se puede utilizar también un ácido nucleico que
codifica para S3a como sondas para mapear física y genéticamente
los genes de los cuales hacen parte, y como marcadores para rasgos
relacionados con esos genes. Tal información puede ser útil en la
reproducción de plantas con el propósito de desarrollar líneas con
fenotipos deseados. Tal uso de un ácido nucleico que codifica para
S3a requiere únicamente de una secuencia de ácido nucleico de al
menos 15 nucleótidos de longitud. El ácido nucleico que codifica
para S3a puede ser utilizado como marcador del polimorfismo de la
longitud del fragmento de restricción (RFLP). Las transferencias
tipo Southern (Maniatis) del ADN genómico de la planta digerido por
restricción pueden ser sondeadas con el ácido nucleico que codifica
para S3a. Los patrones de las bandas resultantes pueden ser
sometidos luego a análisis genético utilizando programas de
computador tales como MapMaker (Lander y colaboradores (1987)
Genomics 1: 174-181) con el propósito de construir
un mapa genético. Además, se pueden utilizar los ácidos nucleico
para sondear las transferencias tipo Southern que contienen a los
ADN genómicos tratados con endonucleasa de restricción de un grupo
de individuos que representan a los progenitores y a la progenie de
un cruce genético definido. Se observa la segregación de los
polimorfismos de ADN y se la utiliza para calcular la posición del
ácido nucleico que codifica para S3a en el mapa genético
previamente obtenido utilizando esta población (Botstein y
colaboradores (1980) Am, J. Hum. Genet. 32:
314-331).
La producción y el uso de sondas derivadas del
gen de una planta para uso en mapeo genético está descrito en
Bematzky y Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4:
37-41. Numerosas publicaciones describen el mapeo
genetic de clones específicos de ADNc utilizando la metodología
esbozada anteriormente o variaciones de la misma. Por ejemplo,
poblaciones entrecruzadas F2, poblaciones retrocruzadas, poblaciones
acopladas en forma aleatoria, líneas isogénicas cercanas, y otros
conjuntos de individuos pueden ser utilizados para mapeo. Tales
metodologías son conocidas por aquellos capacitados en el arte.
Se pueden utilizar también sondas de ácido
nucleico para mapeo físico (es decir, la ubicación de secuencias
sobre mapas físicos; ver Hoheisel y colaboradores En,
Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide,
Academic press 1996, páginas 319-346, y las
referencias citadas allí).
En otra modalidad, se pueden utilizar sondas de
ácido nucleico para el mapeo directo de hibridación in situ
con fluorescencia (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7:
149-154). Aunque los métodos actuales de mapeo por
FISH favorecen el uso de clones grandes (entre unos pocos y varios
cientos de KB; ver Laan y colaboradores (1995) Genome Res. 5:
13-20), las mejoras en sensibilidad pueden permitir
el uso del mapeo por FISH utilizando sondas más cortas.
Se pueden llevar a cabo una variedad de métodos
con base en la amplificación de ácido nucleico para mapeo genético
y físico utilizando los ácidos nucleicos. Los ejemplos incluyen
amplificación específica del alelo (Kazazian (1989) J. Lab. Clin.
Med 11: 95-96), polimorfismo de fragmentos
amplificados por PCR (CAPS; Sheffield y colaboradores (1993)
Genomics 16: 325-332), ligamiento específico del
alelo (Landegren y colaboradores (1988) Science 241:
1077-1080), reacciones de extensión del nucleótido
(Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Mapeo Hibrido por
Radiación (Walter y colaboradores (1997) Nat. Genet. 7:
22-28) y Happy Mapping (Dear y Cook (1989) Nucleic
Acid Res. 17: 6795-6807). Para estos métodos, se
utiliza la secuencia de un ácido nucleico para diseñar y producir
pares iniciadores para uso en la reacción de amplificación o en
reacciones de extensión del iniciador. El diseño de tales
iniciadores es conocido por aquellos capacitados en el arte. En los
métodos que emplean mapeo genético con base en PCR, puede ser
necesario identificar las diferencias en la secuencia de ADN entre
los progenitores del cruce de mapeo en la región correspondiente a
la presente secuencia de ácido nucleico. Esto, sin embargo,
generalmente no es necesario para los métodos de mapeo.
Los ácidos nucleicos que codifican para las S3a
y los polipéptidos S3a pueden encontrar uso también como reguladores
del crecimiento. El ácido nucleico que codifica para S3a puede ser
un ácido nucleico como el representado por la SEQ ID NO: 1 y la
proteína/polipéptido S3a puede ser un aminoácido como el
representado por la SEQ ID NO: 2. Ya que éstas S3a son útiles en el
mejoramiento del rendimiento de semillas en las plantas, las S3a
serían también reguladores útiles de crecimiento, tal como
herbicidas o estimuladores del crecimiento.
Los métodos de acuerdo con la presente invención
dan como resultado plantas que tienen mayor rendimiento de
semillas, como se describió aquí anteriormente. Estas
características mejoradas de rendimiento de semillas pueden ser
combinadas también con otros rasgos económicamente convenientes,
tales como otros rasgos que refuerzan el rendimiento, la tolerancia
a diferentes tipos de estrés, rasgos que modifican diferentes
características de arquitectura y/o rasgos bioquímicos y/o
fisiológicos.
A continuación se describirá la presente
invención con referencia a las siguientes figuras en las cuales:
La Fig. 1 muestra un alineamiento de las
secuencias de la proteína S3a utilizando el programa de alineamiento
múltiple VNTI AlignX (InforMax, Bethesda, MD), con configuraciones
predeterminadas para penalizaciones por huecos de 10 y una extensión
de hueco de 0,05. Los residuos que aparecen en blanco contra un
fondo negro son idénticos; los residuos que aparecen en blanco
contra un fondo verde son o conservados o un bloque de residuos
similares, como lo definido por las opciones de VNTI.
La Fig. 2 muestra un alineamiento tomado de
Lyamouri y colaboradores (Gene 294 (2002) 147 -156) que muestra el
alto grado de conservación en proteínas S3a de diferentes especies:
H. sapiens (Hs), M. musculus (Mm), T rubripes
(Tr), X. laevis (XI), D. melanogaster (Dm), D.
virilis (Dv), C. elegans (Ce), S. cerovisiae (Sc),
A. thaliana (At), O. sativa (Os) y H. holobium
(Hh). El sombreado negro representa aminoácidos idénticos, mientras
que el verde claro representa sustituciones de aminoácidos
conservados. Los huecos se indican por medio de guiones. Las
regiones de más alta conservaciones están entre cajas.
La Fig. 3 muestra un vector binario para
expresión en Oryza sativa del gen putativo cyc07 para una
proteína ribosomal (S3a) de la pequeña subunidad 40S específica de
la fase S de Arabidopsis thaliana (referencia interna
CDS0730) bajo el control del promotor GOS2 de arroz (referencia
interna PRO0129).
La Fig. 4 detalla ejemplos de secuencias útiles
en la realización de los métodos de acuerdo con la presente
invención.
La presente invención será descrita ahora con
referencia a los siguientes ejemplos, que son a modo de ilustración
únicamente.
Las técnicas de ADN recombinante, para
manipulación del ADN, a menos que se indique lo contrario, se
realizan de acuerdo a protocolos estándar descritos en (Sambrook
(2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3ra Edición, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nueva York) o en los Volumenes
1 y 2 de Ausubel y colaboradores (1994), Current Protocols in
Molecular Biology, Current Protocols. Los materiles y métodos
estándar para el trabajo molecular con plantas están descritos en
Plant Molecular Biology Labfase (1993) por R. D. D. Croy, publicado
por BIOS Scientific Publications Ltd (RU) y Blackwell Scientific
Publications (RU).
Se amplificó cyc07 que codifica para 40S
específica de la fase S de S3a de Arabidopsis por medio de
PCR utilizando como molde una biblioteca de ADNc de plántulas de
Arabidopsis thaliana (Invitrogen, Paisley, RU). Después de
la transcripción inversa del ARN extraído de las plántulas, se
clonaron los ADNc dentro de pCMV Sport 6.0. El tamaño promedio del
inserto del banco era de 1,5 kb, y el número original de clones era
de 1,59 x 10^{7} cfu. Se determine que el título original era de
9,6 x 10^{8} cfu/ml, y se convirtió después de una primera
amplificación en 6 x 10^{11} cfu/ml. Después de la extracción del
plásmido, se utilizaron 200 ng del molde en una mezcla de la PCR de
50 \mul, Iniciadores prm02255 (sentido, codón de inicio en
negrilla, sitio AttB1 en itálicas: se utilizaron 5'
GGGGACAAGTTTGTA
CAAAAAAGCAGGCTTCACAATGGCTGTCGGGAAGAA 3') y prm02256 (inverso, complementario, codón de detención en negrilla, sitio AttB2 en itálicas: 5' GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTAAGCTCC
GATGATTTCT 3'), que incluyen los sitios AttB para recombinación Gateway, para amplificación PCR. Se llevó a cabo la PCR utilizando ADN polimerasa Hifi Taq bajo condiciones estándar. Se amplificó un fragmento de la PCR de 789 pb y se lo purificó utilizando también métodos estándar. Se llevó a cabo luego la primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción BP, durante la cual se recombina el fragmento de la PCR in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología Gateway, un "clon de entrada", p2782. El plásmido pDONR201 fue adquirido a Invitrogen, como parte de la tecnología Gateway®.
CAAAAAAGCAGGCTTCACAATGGCTGTCGGGAAGAA 3') y prm02256 (inverso, complementario, codón de detención en negrilla, sitio AttB2 en itálicas: 5' GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTAAGCTCC
GATGATTTCT 3'), que incluyen los sitios AttB para recombinación Gateway, para amplificación PCR. Se llevó a cabo la PCR utilizando ADN polimerasa Hifi Taq bajo condiciones estándar. Se amplificó un fragmento de la PCR de 789 pb y se lo purificó utilizando también métodos estándar. Se llevó a cabo luego la primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción BP, durante la cual se recombina el fragmento de la PCR in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología Gateway, un "clon de entrada", p2782. El plásmido pDONR201 fue adquirido a Invitrogen, como parte de la tecnología Gateway®.
El clon de entrada p2782 fue utilizado
posteriormente en una reacción LR con p0640, un vector de
destinación utilizado para la transformación de Oryza
sativa. Este vector contiene como elementos funcionales dentro
de los límites del T-ADN: un marcador seleccionable
de una planta; un marcador de apantallamiento de la planta; y
casete Gateway destinado a recombinación in vivo LR con la
secuencia de interés ya clonada en el clon de entrada. Se ubica un
promotor GOS2 de arroz para expresión constitutiva (PRO0129)
secuencia arriba de este casete Gateway. Después de la etapa de
recombinación LR, se transformó el vector de expresión resultante
como se muestra en la Figura 3 dentro de Agrobacterium y
posteriormente dentro de plantas Oryza sativa. Se les
permitió crecer a las plantas transformadas de arroz y luego fueron
examinadas por los parámetros descritos en el Ejemplo 3.
Se generaron aproximadamente de 15 a 20
transformantes independientes de arroz T0. Se transfirieron los
transformantes primarios de las cámaras para cultivo de tejidos a
un invernadero para crecimiento y cosecha de las semillas T1. Seis
eventos, de los cuales se retuvo la progenie de T1 segregada 3:1 por
la presencia/ausencia del transgén. Para cada uno de estos eventos,
se seleccionaron aproximadamente 10 plántulas de T1 contenían al
transgén (hetero y homocigotos), y aproximadamente 10 plántulas de
T1 carecían del transgén (nulicigotos), por medio de monitoreo
visual de la expresión del marcador. Algunos eventos de T1 fueron
evaluados adicionalmente en la generación T2 siguiendo el mismo
procedimiento de evaluación que para la generación T1.
Se utilizó un ANOVA (análisis de varianza) de
dos factores como modelo estadístico para la evaluación total de
las características fenotípicas de una planta. Se llevó a cabo una
prueba F sobre todos los parámetros medidos de todas las plantas de
todos los eventos transformados con el gen de la presente invención.
Se llevó a cabo la prueba F para revisar un efecto del gen sobre
todos los eventos de transformación y para verificar el efecto
total del gen, también conocido como un efecto génico global. El
umbral de significancia para un efecto génico global verdadero fue
establecido con un nivel de probabilidad del 5% para la prueba F.
Los puntos de valor significativo de la prueba F para un efecto
génico, significan que no es solamente la presencia o la posición
del gen la que causa las diferencias en el fenotipo.
Se cosecharon, empacaron y marcaron con código
de barras panículos primarios maduros y luego se los secó durante
tres días en horno a 37ºC. Se trillaron luego los panículos y se
recolectaron y contaron todas las semillas. Se separaron las
cáscaras llenas de las vacías utilizando un dispositivo para soplado
de aire. Se descartaron las cáscaras vacías y se contó nuevamente
la fracción restante. Se pesaron las cáscaras llenas en una balanza
analítica. Este procedimiento condujo al conjunto de parámetros
relacionados con la semilla que se describen más adelante.
Las Tablas de resultados que se presentan más
adelante muestran los valores p de la prueba F para las evaluaciones
de T1, las evaluaciones de T2 y los valores p combinados de las
pruebas F para las evaluaciones de T1 y de T2. Se puede considerar
un análisis combinado cuando se han llevado a cabo dos experimentos
sobre los mismos eventos. Esto puede ser útil para revisar la
consistencia de los efectos sobre los dos experimentos y para
incrementar la confianza en la conclusión. El método utilizado es
una aproximación de un modelo mezclado que tiene en cuenta la
estructura multinivel de los datos (es decir,
experimento-evento-segregantes). Se
obtienen los valores p comparando el análisis de probabilidad de las
proporciones con las distribuciones de chi cuadrado. Cada una de
las tablas presenta también la diferencia en % entre los
transgénicos y los correspondientes nulicigotos para cada
generación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó el número de semillas llenas
contando el número de cáscaras llenas que quedó después de la etapa
de separación. Como se muestra en la Tabla 1 a continuación, el
valor p de la prueba F para la evaluación combinada de T1 y T2 fue
significativo (con un valor p de 0,0071) indicando que la presencia
de la construcción en las plantas tiene un efecto significativo
sobre el número de semillas llenas de las plantas transgénicas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se midió el rendimiento total de semilla pesando
todas las cáscaras llenas cosechadas de una planta. Como se muestra
en la Tabla 2 más abajo, el valor p de la prueba F para la
evaluación combinada de T1 y T2 fue significativo (con un valor p de
0,0016) indicando que la presencia de la construcción en las plantas
tiene un efecto significativo sobre el peso total de las semillas de
las plantas transgénicas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El índice de cosecha en la presente invención se
define como la relación entre el rendimiento total de semillas y el
área por encima del suelo (mm^{2}), multiplicado por un factor de
10^{6}. Como se muestra en la Tabla 3 a continuación, el valor p
de la prueba F para la evaluación combinada de T1 y T2 (y en forma
individual) fue significativo (con un valor p de 0,0005) indicando
que la presencia de la construcción en las plantas tiene un efecto
significativo sobre el índice de cosecha de las plantas
transgénicas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Este parámetro se extrapola del recuento del
número de semillas llenas, y su peso total. Como se muestra en la
Tabla 4 a continuación, el valor p de la prueba F para la evaluación
combinada de T1 y T2 fue significativo (con un valor p de 0,0405)
indicando que la presencia de la construcción en las plantas tiene
un efecto significativo sobre el TKW de las plantas
transgénicas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Este listado de referencias citado por el
solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma
parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran
cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las
omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.
- \bullet EP 1198985 A1 [0054]
- \bullet US 60556847 B [0085]
\bullet EP 04101179 A [0085]
\bulletNaora; Naora. Immunology and
Cell Biology, 1999, vol. 77, 197-205
[0019]
\bulletWestermann y colaboradores,
FEBS Letters, January 1979, vol. 97 (1 [0020]
\bulletMcElroy y colaboradores,
Plant Cell, 1990, vol. 2, 163-171
[0045]
\bulletOdell y colaboradores,
Nature, 1985, vol. 313, 810-812
[0045]
\bulletNilsson y colaboradores,
Physiol. Plant., 1997, vol. 100, 456-462
[0045]
\bullet de Pater y colaboradores,
Plant J, November 1992, vol. 2 (6), 837-44
[0045]
\bulletChristensen y colaboradores,
Plant Mol. Biol., 1992, vol. 18, 675-689
[0045]
\bulletBuchholz y colaboradores,
Plant Mol Biol., 1994, vol. 25 (5),
837-43 [0045]
\bulletLepetit y colaboradores,
Mol. Gen. Genet., 1992, vol. 231, 276-285
[0045]
\bulletAn y colaboradores, Plant
J., 1996, vol. 10 (1), 107-121 [0045]
\bulletKrens, F.A. y colaboradores,
Nature, vol. 296, 72-74 [0054]
\bulletNegrutiu I. y colaboradores,
Plant Mol. Biol., July 1987, vol. 8, 363-373
[0054]
\bulletShillito R.D. y
colaboradores, Bio/Technol, 1985, vol. 3,
1099-1102 [0054]
\bulletCrossway A. y colaboradores,
Mol, Gen Genet, 1986, vol. 202, 179-185
[0054]
\bulletKlein T.M. y colaboradores,
Nature, 1987, vol. 327, 70 [0054]
\bulletAldemita; Hodges.
Planta, 1996, vol. 199, 612-617
[0054]
\bulletChan y colaboradores, Plant
Mol. Biol., 1993, vol. 22 (3), 491-506
[0054]
\bulletHiei y colaboradores, Plant
J., 1994, vol. 6 (2), 271-282 [0054]
\bulletIshida y colaboradores, Nat.
Biotechnol., June 1996, vol. 14 (6), 745-50
[0054]
\bulletFrame y colaboradores, Plant
Physiol., May 2002, vol. 129 (1), 13-22
[0054]
\bulletOffringa y
colaboradores, Extrachromosomal homologous recombination and
gene targeting in plant cells after
Agrobacterium-mediated transformation. EMBO
J., October 1990, vol. 9 (10), 3077-84
[0060]
\bulletTerada R; Urawa H;
Inagaki Y; Tsugane K; Iida S. Efficient gene
targeting by homologous recombination in rice. Nat
Biotechnol., 2002 [0060]
\bulletlida; Terada. A tale of two
integrations, transgene and T-DNA: gene targeting by
homologous recombination in rice. Curr Opin Biotechnol.,
April 2004, vol. 15 (2), 132-8 [0060]
\bulletLander y colaboradores,
Genomics, 1987, vol. 1, 174-181
[0065]
\bulletBotstein y colaboradores,
Am, J. Hum. Genet., 1980, vol. 32,
314-331 [0065]
\bulletBematzky; Tanksley. Plant
Mol. Biol. Reporter, 1986, vol. 4, 37-41
[0066]
\bulletHoheisel y
colaboradores, Non-mammalian Genomic Analysis: A
Practical Guide. Academic press, 1996,
319-346 [0067]
\bulletTrask. Trends Genet.,
1991, vol. 7, 149-154 [0068]
\bulletLaan y colaboradores, Genome
Res., 1995, vol. 5, 13-20 [0068]
\bulletKazazian. J. Lab. Clin.
Med, 1989, vol. 11, 95-96 [0069]
\bulletSheffield y colaboradores,
Genomics, 1993, vol. 16, 325-332
[0069]
\bulletLandegren y colaboradores,
Science, 1988, vol. 241, 1077-1080
[0069]
\bulletSokolov. Nucleic Acid
Res., 1990, vol. 18, 3671 [0069]
\bulletWalter y colaboradores, Nat.
Genet., 1997, vol. 7, 22-28 [0069]
\bulletDear; Cook. Nucleic Acid
Res., 1989, vol. 17, 6795-6807 [0069]
\bulletLyamouri y colaboradores,
Gene, 2002, vol. 294, 147-156 [0072]
\bulletSambrook. Molecular Cloning: a
laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press,
2001 [0074]
\bulletAusubel y colaboradores,
Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols.
1994, vol. 1, 2 [0074]
\bullet R.D.D. Croy. Plant Molecular
Biology Labfase. BIOS Scientific Publications Ltd (UK) and Blackwell
Scientific Publications (UK), 1993 [0074]
<110> CropDesign N.V.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Plantas que tienen características
mejoradas de crecimiento y métodos para su elaboración
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
CD-112-PCT
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 04101179.2
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-03-22
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/556..847
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-03-28
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 830
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 261
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1169
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharum officinarum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 263
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharum officinarum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador prm02255
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggct gtcgggaaga a
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador prm02256
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ctaagctccg atgatttct
\hfill49
Claims (11)
1. Un método para incrementar el rendimiento de
semillas en plantas con relación a las correspondientes plantas de
tipo silvestre, que comprende la transformación de una planta con
una construcción génica que contiene un ácido nucleico que codifica
para una proteína ribosomal de la pequeña subunidad 40S.
2. Un método de acuerdo a la reivindicación 1,
en donde dicho ácido nucleico es:
- (i)
- Una secuencia que hibrida bajo condiciones rigurosas a un ácido nucleico que codifica para una proteína ribosomal de la pequeña subunidad 40S;
- (ii)
- Una variante alternativa de empalme de un ácido nucleico que codifica para una proteína ribosomal de la pequeña subunidad 40S;
- (iii)
- Una variante alélica de un ácido nucleico que codifica para una proteína ribosomal de la pequeña subunidad 40S; y
- (iv)
- Un ácido nucleico que codifica a un ortólogo que tiene en orden creciente de preferencia al menos un 80%, 85% 90%, 95% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con una proteína ribosomal de la pequeña subunidad 40S.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un método de acuerdo a la reivindicación 1,
en donde dicha proteína ribosomal de la pequeña subunidad 40S es
como la representada por medio de la SEQ ID No: 2.
4. Un método de acuerdo a la reivindicación 1,
en donde dicho rendimiento incrementado de semillas se selecciona
entre uno o más de: (i) mayor contenido de biomasa semilla; (ii)
mayor número de semillas (llenas); (iii) mayor tamaño de semilla;
(iv) mayor volumen de semilla; (v) mayor índice de cosecha; o (vi)
mayor peso de mil granos (TKW).
5. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho ácido nucleico que codifica
para una proteína ribosomal de la pequeña subunidad 40S, se deriva
de una planta, preferiblemente a partir de una planta dicotiledónea,
preferiblemente además de la familia Brassicaceae, más
preferiblemente el ácido nucleico es de Arabidopsis
thaliana.
6. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha secuencia de ácido nucleico
que codifica para una proteína ribosomal de la pequeña subunidad
40S, se sobreexpresa en una planta.
7. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en donde la sobreexpresión de dicho ácido
nucleico que codifica para una proteína ribosomal de la pequeña
subunidad 40S, está dirigida por un promotor constitutivo,
particularmente el promotor GOS2.
8. Un método para la producción de una planta
transgénica que tiene mayor rendimiento de semilla con relación a
las correspondientes plantas de tipo silvestre, el cual
comprende:
- (i)
- la transformación de una planta con una construcción génica que contiene un ácido nucleico que codifica para una proteína ribosomal de la pequeña subunidad 40S como se define en las reivindicaciones 2 ó 3;
- (ii)
- el cultivo de la célula de la planta bajo condiciones que promuevan la regeneración y crecimiento de la planta madura.
\vskip1.000000\baselineskip
9. El uso de una construcción génica que
contiene un ácido nucleico que codifica para una proteína ribosomal
de la pequeña subunidad 40S como se define en las reivindicaciones 2
ó 3, para incrementar el rendimiento de semillas de las plantas con
relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre.
10. El uso de acuerdo a la reivindicación 9, en
donde dicho rendimiento de semillas incluye uno o más de lo
siguiente: un mayor número de semillas (llenas), un mayor peso de
las semillas, un mayor índice de cosecha y un mayor TKW.
11. El uso de acuerdo a la reivindicación 9 ó
10, en donde dicho ácido nucleico que codifica para una proteína
ribosomal de la pequeña subunidad 40S es como el representado por la
SEQ ID No: 1 y en donde dicha proteína ribosomal de la pequeña
subunidad 40S es un aminoácido como el representado por la SEQ ID
No: 2.
Applications Claiming Priority (4)
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|---|---|---|---|
| EP04101179 | 2004-03-22 | ||
| EP04101179 | 2004-03-22 | ||
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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