ES2376716B1 - Composición detoxificante de alquenilglucosinolato. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una composición de alquenilglucosinolato que en las condiciones del estómago genera el correspondiente derivado epitionitrilo, que tiene propiedades detoxificantes. También se refiere a una composición alimentaria que la contiene, al uso de dicha composición como detoxificante, así como a un procedimiento para su preparación.

Description

Composición detoxificante de alquenilglucosinolato.

Campo de la técnica

La presenteinvenciónse refierea composicionesde alquenilglucosinolatos,que resultanventajosas para aportaral organismo sustancias quimioprotectorasde efecto detoxificante.

Estado de la técnica anterior

Losglucosinolatosson unas sustancias naturales,derivadasdela glucosa,queestán presentesendiversas especies vegetales, principalmentedelafamiliade las brasicáceas(Brassicaceae)o crucíferas(Cruciferae), por ejemplo, en la col, el brócoli, la coliflor, los rábanos, nabos o las coles de Bruselas.

Los glucosinolatos son compuestos que responden a la fórmula general (I):

donde Glc representa glucosa, de manera que todos ellos contienen un grupo β-D-tioglucosa, una oxima sulfonada, yun grupo variable (R) que da lugar a los diferentes glucosinolatos existentes.

Se ha comprobado que el consumo habitual de crucíferas en la dieta repercute de forma positiva en la salud, especialmente por suspropiedades quimioprotectoras frenteal cáncer,relacionadas con un efecto detoxificante frentea agentes cancerígenos, tales como compuestos con una estructura química poco frecuente en la naturaleza (xenobióticos).

Existen numerosos estudios que demuestran que las propiedades quimioprotectoras derivadas del consumo de glucosinolatos son debidas en realidad a sus productos de degradación, tal como se describe, por ejemplo, en el artículo Hayes etal.,The cancerchemopreventive actionsof phytochemicalsderivedfrom glucosinolates,Eur. J. Nutr., 2008, 47 (Suppl2), 73-88.Para que pueda producirse la hidrólisis de los glucosinolatos en sus derivados activos, es necesaria la presencia de una enzima, la mirosinasa, que se encuentra también de forma endógena en los mismos vegetales donde se hallan los glucosinolatos. En dicho artículo se describe que la naturaleza de los compuestos que se pueden generar por hidrólisis de un glucosinolato debido a la acción de la enzima mirosinasa depende de la estructura del glucosinolato, delpH, de la temperaturayla presencia de iones ferroso. Entre los compuestos que se formanpor hidrólisis de los glucosinolatos se encuentran: isotiocianatos (R-N=C=S), nitrilos (R-CN), tiocianatos (R-S-CN) y

epitionitrilos

La acciónquimioprotectora asociadaal consumodevegetalesdelafamiliadelas crucíferasesóptima cuando éstos se consumen crudos,yaque durantesu cocción,la enzima mirosinasase desnaturalizay,por consiguiente,la hidrólisis de los glucosinolatos queda muy disminuida. Es por ello que en el estado de la técnica se han desarrollado algunas composiciones, destinadas a proporcionar un aporte más eficiente de los derivados activos de los glucosinolatos al organismo, de forma complementaria a los que se aportan únicamente en la dieta.

En el artículo de revisión Sulforaphane glucosinolate monograph, Alter. Med. Chem., 2010, 15(4), 352-360, se describe que el sulforafano es un derivado terapéuticamente activo que tiene notables propiedades protectoras frente al cáncer. El sulforafano es elisotiocianato derivado de la hidrólisis del glucosinolato glucorafanina.

Enel estadodela técnica se handescritoformulaciones destinadas a aportar isotiocianatos. Así enla solicitud de patente europea EP-A-2065034 se describen composicionesfarmacéuticas con protección entérica que contienen glucosinolatos, preferentemente glucorafanina,yenzimas β-tioglucosidasas, por ejemplo mirosinasa, con la finalidad de generar in situ en el organismo los isotiocianatos derivados, en particular el sulforafano. La protección entérica tienela finalidaddeevitarquela hidrólisispueda tenerlugarenel estómago, dondeelpHbajo podríafavorecerla formación nitrilos, en lugar de los isotiocianatos deseados.

Así mismo, en la solicitud de patente europea número EP-A-2213280, se describen formulaciones que contienen glucorafaninay mirosinasa. El objetivo de las mismas es también la liberación del isotiocianato sulforafano en el organismo.Estascomposicionesse caracterizanporquealmenosunodeloscomponentes,el glucosinolatoolaenzima, está encapsulado o recubierto, para conseguir que dichos componentes no reaccionen en la composición, sino que lo hagan después de ser ingeridos.

Por otro lado, en la solicitud de patente internacional WO-A-02/45527, se describen composiciones obtenidas a partirvegetalesdelafamiliade las crucíferas, especialmente brócoliy rábano, procesadosy deshidratados,que contienen glucosinolatosymirosinasa,de manera que,cuandola composición es ingerida,la mirosinasa hidrolizalos glucosinolatos a isocianatos en el organismo.

Otrodelosderivadosactivosdelos glucosinolatossonlos epitionitrilosqueseformanapartirdela hidrólisisdeun tipo particularde glucosinolatos,los alquenilglucosinolatos,que presentanun doble enlace terminalenel grupoRdela fórmula (I) anterior. Así mismo, para su formación se requiere la presencia de la denominada proteína epitioespecífica (en adelante ESP), iones ferrosos (Fe2+),y unas condicionesdepH ácido.

Se ha demostrado que los epitionitrilos poseen unas notables propiedades detoxificantes, actuando como protectores frentea agentes carcinógenos, tal como se describe enel artículoKelleher et al.,1-Cyano-2,3-epithiopropane isanovelplant-derivedchemopreventiveagent whichinduces cytoprotectivegenes thatafford resistanceagainstthe genotoxicα,β-unsaturated aldehyde acrolein, Carcinogenesis, 2009, 30,1754-62, donde se estudia in vitro la capacidad de los epitionitrilos de inducir enzimas citoprotectores, así como sus propiedades quimiopreventivas frente a agentesxenobióticos genotóxicos.En este artículo se destacan las propiedades quimiopreventivas del compuesto1ciano-2,3-epitiopropano, el epitionitrilo derivado de la hidrólisis del alquenilglucosinolato sinigrina, compuesto de fórmula(I)en dondeel grupoR es 2-propenilo.

En el estado de la técnica no se han descrito composiciones que proporcionen un aporte óptimo de dichos epitionitrilos al organismo, a pesar de que debido a sus propiedades detoxificantes, es deseable disponer de composiciones para la administración de los epitionitrilos derivados de los alquenilglucosinolatos.

Existe, pues, la necesidad de disponer de una composición que permita proporcionar al organismo epitionitrilos derivadosde alquenilglucosinolatos que sea efectiva, establey segura.

Objeto de la invención

El objeto de la presente invención es una composición de alquenilglucosinolato.

Forma también parte del objetodelainvención un procedimiento parala preparacióndedicha composición.

Forma parte del objeto de la invención una composición alimentaria que comprende dicha composición.

Forma también parte del objeto de la invención dicha composición para su uso como detoxificante.

Breve descripción de los dibujos

Figura1

Enla Figura1 se representala induccióndela enzima quinona reductasa(QR) producidapor una muestra preparada a partir de una composición de la invención que comprende hoja de Lepidium latifolium deshidratadaymolida. En abscisas se representa la concentración de la muestra en mg/ml, referida al peso de hoja de Lepidium latifolium deshidratada porvolumende disolución,y en ordenadas se representala induccióndeQR que se calcula comoel cociente entrela absorbanciadela muestraa una longitudde ondade 610 nm,yla absorbancia del medio control.

Figura2

Enla Figura2se representala induccióndela enzima quinona reductasa(QR)producidaporel isotiocianato denominado sulforafano. En abscisas se representa la concentración de sulforafano en micromoles por litro de disolución, yen ordenadas se representa la inducción de QR que se calcula como el cociente entre la absorbancia de la muestra a una longitudde onda 610 nmyla absorbancia del medio control.

Figura3

EnlaFigura3 serepresentala cinética enzimáticadela enzimaquinona reductasa(QR)para cuatro muestras:1) composiciónsegúnlainvenciónque comprendehojade Lepidium latifolium deshidratadaymolida,2) sulforafano,3) controlde célulasymedio,y4) controldeDMSO.La concentracióndelproductodelainvenciónesde8mg/ml,referida al peso de hoja de Lepidium latifolium deshidratadaporvolumende disolución,yla concentraciónde sulforafano es5 µM.En abscisasse representael tiempoen minutosy en ordenadasse representala absorbanciadelas muestras a una longitud de onda 610 nm.

Figura4

Enla Figura4 se representala absorbanciade una muestra preparadaa partirde una composicióndelainvención que comprende hoja de Lepidiumlatifolium deshidratadaymolidaparael ensayode citotoxicidadsegúnel testXTT (sal sódica de la 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carboxanilida). Este test se basa en la capacidad de las células metabólicamente activas de reducir dicho compuesto (XTT) formando el correspondiente tinte de formazán anaranjado, de manera que la concentración deltinte, medida en función de la absorbancia, es proporcional al número de células metabólicamente activas.En abscisas se representa la concentración de la muestra en mg/ml, referida al peso de hoja de Lepidium latifolium deshidratada porvolumende disolución,y en ordenadas se representa la absorbancia de la muestra a una longitud de onda 500 nm.

Figura5

Enla Figura5 se representala absorbanciade una muestrade sulforafano parael ensayodecitotoxicidad según el test XTT. En abscisas se representa la concentración de sulforafano en micromoles por litro de disolución,y en ordenadas se representa la absorbancia de la muestra a una longitud de onda 500 nm.

Descripción detallada de la invención

El objeto de la presente invención es una composición que comprende:

a) un alquenilglucosinolato de fórmula (I)

en donde Glc es glucosa,yR es un grupo alquenilo con un doble enlace terminal,

b) mirosinasa,

c) proteína epitioespecíficay

d) una salde hierro (II)farmacéuticamente aceptable.

Los autoresdela presenteinvenciónhan desarrolladouna composiciónconunalquenilglucosinolatoque, sorprendentemente, es establey en condiciones que simulan las condiciones fisiológicas del estómago, genera mayoritariamente derivados del tipo epitionitrilos.

Asímismo,dicha composiciónesaltamente estable,ypermiteelaportede epitionitrilosalorganismoevitandolos problemasorganolépticosyde estabilidadderivadosde formularunacomposiciónque contuviera directamentedichos epitionitrilos.

En el ámbito de la presente invención, es adecuada cualquier formulación sólida, con un bajo contenido en agua, preferiblemente inferioral10%,más preferiblemente inferioral8%,yaúnmáspreferiblemente inferioral6%.

También son adecuadas aquellas formulaciones en las que, aun no siendo sólidas, hay una separación física entre la enzima mirosinasayel alquenilglucosinolato, paraevitarla hidrólisisde éste último enla composición.

De acuerdo con estas premisas, la composición de la invención puede presentarse en una forma farmacéutica sólida; una combinaciónde una formafarmacéutica sóliday unaforma líquida;o bien puede ser incorporada,a una composición alimentaria, como, por ejemplo, un complemento dietético.

Forma parte del objeto de la invención una composición alimentaria que comprende una cantidad efectiva de la composición de la invención.

En el contexto de la invención se entiende por cantidad efectiva aquella cantidad de composición de alquenilglucosinolato que proporciona el efecto o beneficio deseado después de ser consumida.

Entre las composiciones alimentariasa las que se puede incorporar dicha composición se encuentran, por ejemplo, complementos dietéticos, complementos nutricionales, barritas nutritivas, cereales,ogalletas.

En una realización de la invención, la composición está en forma sólida. Entre las formas sólidas adecuadas para ser usadas en el marco de la presente invención están, por ejemplo, los comprimidos, cápsulas o presentaciones en polvo dispersable.

Losexcipientesfarmacéuticamente aceptables adecuadospara ser usadosenla preparacióndelas composiciones delainvención sonbien conocidosporelexpertoentecnologíafarmacéuticaypuedenelegirse,por ejemplo, entre sustancias de relleno, agentes aglutinantes, antiadherentes, lubricantes, agentes antiapelmazantes, materiales para el recubrimiento de comprimidos, gelatina para cápsulas durasyblandas, plastificantes, estabilizantes, agentes conservantes, colorantes, edulcorantes, aromatizantes, entre otros,ysus mezclas. Dichosexcipientes se describen, por ejemplo, en el manual R. C. Rowe,P. J. SheskeyyP.J.Weller, Handbook of Pharmaceutical Excipients, cuarta edición, Pharmaceutical Press, Londres, 2003.

En una realización preferida de la invención, la composición está en forma de comprimidos o de cápsulas.

En otra realización preferida de la invención, la composición está en forma de polvo dispersable. Dicho polvo es susceptible de dispersarse con agua inmediatamente antes de su ingestión. Preferiblemente, dicha composición en polvo contiene adicionalmente sustancias edulcorantes y/o aromatizantes, para mejorar el sabor de la dispersión a ingerir. Por ejemplo puede contener sacarosa o fructosa; edulcorantes como sorbitol, xilitol, sucralosa, acesulfamo, aspartamo o sacarina, entre otros; así como cualquier sustancia aromatizante tanto de origen natural como sintético. En una realización más preferida, la composición en polvo se dispone en un envase que es apropiado para añadirle un volumen adecuadode agua, para preparar in situ una dispersión mediante agitación,yproceder inmediatamentea su ingestión.

En otra realización de la invención, la composición está en forma mixta con una parte sóliday una parte líquida que deben mezclarse inmediatamente antes de la ingestión. Son aptas para este tipo de composiciones las presentaciones en forma de un envase, que contiene la parte líquida, provisto de un tapón que contiene la parte sólida,que es soluble o dispersable en la parte líquida, de manera que ambas se mezclan inmediatamente antes de su ingestión. Los diferentes ingredientes de la composición estarán distribuidos, o bien en la parte sólida, o bien en la parte líquida, o opcionalmente, alguno de ellos puede estar presente en ambas partes, con la condición de que la parte líquida no puede contener simultáneamenteel alquenilglucosinolatoyla mirosinasa, paraevitarla hidrólisis del primero. Preferiblemente,la salde hierro (II)farmacéuticamente aceptable,y eventualmenteel ácido ascórbico están enla parte líquida. Preferiblemente, la proteína epitioespecífica está en la parte sólida. Preferiblemente, la mirosinasa está enla parte sólidaobienestádistribuida entrelaparte líquidaylapartesólida.Más preferiblementela mirosinasaestáen la parte sólida. Preferiblementeel alquenilglucosinolato está enla parte sólida,obien está distribuido entrela parte sóliday enla parte líquida.Más preferiblemente,el alquenilglucosinolato está enla parte sólida.

La formulación de la parte líquida contiene los ingredientes activos disueltos en agua, así como, opcionalmente, otros componentes adicionales, tales como estabilizantes, agentes conservantes, colorantes, edulcorantes, aromatizantes, entre otros,y sus mezclas. Por ejemplo puede contener sacarosa o fructosa;edulcorantes como sorbitol, xilitol, sucralosa, acesulfamo, aspartamo o sacarina, entre otros; así como cualquier sustancia aromatizante tanto de origen natural como sintético.

En una realización preferida de la invención, la parte líquida de dicha composición mixta comprende un extracto vegetal líquido rico en sinigrina.

En otra realización preferida, la parte líquida de dicha composición mixta comprende la sal de hierro (II)farmacéuticamente aceptabley, opcionalmente, ácido ascórbico, mientras quela parte sólida comprendeel alquenilglucosinolato,la mirosinasaylaproteína epitioespecíficaconunaactividaddeagua suficientementebajaparaquelaenzima, aun estando en contacto con el alquenilglucosinolato, no sea capaz de hidrolizarlo. Preferiblemente la composición sólida presentaun contenidodeagua inferioral10%,máspreferiblemente inferioral8%,yaúnmás preferiblemente inferior al 6%.

El alquenilglucosinolato

El alquenilglucosinolatoqueformapartedela presenteinvenciónesun compuestoquerespondeala fórmula(I):

donde Glc representa glucosayR es un grupo alquenilo con un doble enlace terminal. El contracatión es habitualmente un catión de metal alcalino, por ejemplo el ión potasio. Preferiblemente el grupoR es un grupo alquenilo C3-C10.

Entre los alquenilglucosinolatos que resultan apropiados para ser empleados en la composición de la invención se encuentran, por ejemplo, sinigrina (R=2-propenilo), gluconapina (R=3-butenilo), glucobrasicanapina (R=4-pentenilo), glucowasabiamina (R=5-hexenilo), glucowasajaponicaina (R=6-heptenilo), progoitrina (R=(2R)-2-hidroxi-3butenilo), epiprogoitrina (R=(2S)-2-hidroxi-3-butenilo), napoleiferina (R=(2S)-2-hidroxi-4-pentenilo)y epinapoleiferina (R=(2R)-2-hidroxi-4-pentenilo). Todos estos compuestos se encuentran en la naturaleza, si bien también se pueden emplear alquenilglucosinolatosde origen sintético que contengan un grupoR con un doble enlace terminal.

Preferiblemente, la composición objeto de la presente invención comprende un alquenilglucosinolato que se selecciona entre el grupo formado por sinigrina, gluconapina, glucobrasicanapina,y sus mezclas,ymás preferiblemente, es sinigrina.

El alquenilglucosinolato que forma parte de la presente invención puede estar: a) en forma de una fuente vegetal deshidratadaymolida,b) comoextractovegetal,oc) en forma sustancialmente puraobtenida por síntesis química.

Enel contextodelainvención se entiende por fuentevegetaldeshidratadala matrizvegetal que contieneel alquenilglucosinolato que ha sido sometida a un proceso de deshidratación.

Por extracto vegetal se entiende un producto obtenido a partir de una fuente vegetal, que presenta un contenido sustancialmente elevado de alquenilglucosinolato, que es superior al contenido que se encuentra en la fuente vegetal que se ha utilizado para efectuar la extracción. Este contenido es significativamente superior al de la fuente vegetal deshidratada. El extracto vegetal puede estar en forma sólida, en cuyo caso es denominado extracto vegetal seco, o extracto seco;o bien puedeestar en forma líquida,y se denominaextractovegetal líquido,oextracto líquido.

Asímismo,el alquenilglucosinolatopuede obtenerse habitualmentede forma comercial tantoen formadeextracto como en forma sustancialmente pura.

En una realización preferida de la invención, el alquenilglucosinolato está en forma de una fuente vegetal deshidratada o como extracto vegetal seco, o como mezcla de los anteriores.

El alquenilglucosinolatopuedeobtenerse,biencomo componenteenlafuentevegetal deshidratadaymolida,obien comoextractovegetal,a partirde diferentes especiesvegetales,mayoritariamente crucíferas.El alquenilglucosinolato, en general, se puede obtenera partirde las partes aéreasde losvegetales (semillas, flores, hojas, tallos, ...)ydelas partes subterráneas (raíces).

El alquenilglucosinolato en forma de una fuente vegetal deshidratada, puede preparase, por ejemplo, a partir de las hojas del vegetal. Para ello se parte preferiblemente de la planta recién recolectada, sin trocear, para evitar el contacto entre el glucosinolatoyla enzima mirosinasa presente también en la planta, lo cual puede desencadenar la hidrólisisdeaquél.Enunaprimeraetapalaplantaeslavadaconagua clorada.Trasunaetapade aclaradoseprocede a la deshidratación del vegetal, por ejemplo en un horno de secado, a una temperatura no superior a los 45ºC. Dichas condicionesseacostumbranamantenerhastaqueel contenidodeagua residualdelproducto alcanzaunvalor inferioro igualal10%.Eneste momentoyasepuedeprocederal troceadoymolidodelaplanta,sinqueseproduzcanreacciones de degradación. Alternativamente, puede procederse previamente a la desactivación de la enzima mirosinasa, por ejemplo, mediante un tratamiento térmico, lo que permite efectuar la deshidratación directamente sobre la planta troceada, con lo que se acelera el proceso de secado.

En casode prepararseel alquenilglucosinolatoen formade una fuentevegetaldeshidratadaa partirde semillaso raíces, el procedimiento es sustancialmente análogo al descrito para las hojas,adaptado convenientemente, según sabrá reconocer el experto en la materia. Así, por ejemplo, para el caso de semillas no será necesaria la etapa del troceado, y el proceso de deshidratación habitualmente será más breve, puesto que las semillas contienen normalmente un porcentaje de agua menor que las hojas.

El molido de la planta puede hacerse, preferiblemente, mediante un sistema de criogenización en elque previamentese ultracongelala planta con nitrógeno líquidoo anhídrido carbónico líquido.De esta formaseevitael deterioro de componentesactivos termolábiles.Por ejemplo,puede utilizarseun molinillodela marcaIKA®. Preferiblemente, el producto obtenido tieneun tamañodepartícula inferiora325 micras,ymás preferiblemente comprendido entre100 y200 micras.

Para prepararel alquenilglucosinolatodelainvenciónenformadeextractovegetal,puederealizarseunaextracción del mismoa partirdela fuentevegetal deshidratada utilizandoun disolventeorgánico, preferiblemente con una mezcla de etanolyagua, conal menosel 50%de etanol.

El procesodeextracciónpuedellevarseacabosegúncualquier método conocidoporelexpertoenla materia como, por ejemplo, extracción Soxhlet o maceración. En el caso de la maceración, posteriormente se retira el residuo sólido, yseprocedeal filtradodellíquidoque contieneelextracto, preferiblemente, atravésdeunamallade80 micras.A continuaciónel líquidofiltradoes concentradopor calentamientoa una temperatura inferiora45ºC.Elextractovegetal líquido obtenido puede utilizarse para la preparación de formulaciones líquidas. Alternativamente, puede obtenerse un extracto vegetal seco a partir del extracto vegetal líquido, por ejemplo, por un proceso de atomización a una temperatura no superior a los 80ºC, por secado en horno de vacío o por liofilización, obteniéndose un polvo fino homogéneo que es parcialmente soluble en agua.

Según estosprocedimientos,la sinigrina puede obtenerse como fuentevegetal deshidratadaocomoextractovegetal a partir de las hojas del rompepiedras (Lepidium latifolium) y otras especies de Lepidium, semillas de Lepidium sativum, las coles de Bruselas(Brassica oleracea var.gemmifera), col de Saboya(Brassica oleracea L. convar. capitata), la hierba del ajo(Alliaria officinalis),odelas semillasde mostazanegraoajenabe(Brassica nigra), entre otras.

En una realización preferida de la invención, la sinigrina está en forma de extracto vegetal seco de Lepidium latifolium,obien comoextractovegetal secodeBrassica oleracea var.gemmifera,obien en forma de hoja deLepidium latifolium deshidratadaymolida,o sus mezclas.Elextractovegetal secode Lepidium latifolium contiene sinigrina en una proporciónenpeso generalmente comprendida entreel8%yel12%;elextractovegetal secode Brassica oleracea var.gemmifera contienesinigrinaenunaproporciónenpeso generalmentecomprendidaentreel4%yel6%,ylahoja de Lepidium latifolium deshidratada contiene sinigrina en una proporción en peso generalmente comprendida entre el 1%yel 2%.

Segúnun procedimientoanálogo,la gluconapinapuedeobtenersecomofuentevegetal deshidratadaocomoextractovegetalapartirdediversasespeciesvegetales,porejemplo,lascolesde Bruselas(Brassica oleracea var.gemmifera), la colchina(Brassica campestris var. chinensis), el nabo(Brassica rapa var. rapa), el nabo silvestre(Brassica rapa var. nipposinica),la colza(Brassica napus),ola col lombarda(Brassica oleracea var. capitataf. rubra), entre otras.

Análogamente, la glucobrasicanapina puede obtenerse, por ejemplo, a partir de la col china (Brassica campestris var. chinensis), el nabo(Brassica rapa var. rapa), el nabo silvestre(Brassica rapa var. nipposinica), o la colza(Brassica napus), entre otras.

Alternativamente, el alquenilglucosinolato que forma parte de la presente invención puede obtenerse en forma pura por síntesis química. Así, la sinigrina, puede obtenerse por síntesis química, por ejemplo, según el procedimiento descrito en el artículo Kjaer et al., Synthesis of the3-butenylglucosinolate ion, Acta Chem. Scand. 1968, 22, 33243344.

El alquenilglucosinolato frecuentemente puede obtenerse también en forma comercial, por ejemplo la sinigrina puedeobtenersedeSigma Aldrich,la gluconapinapuede obtenersedela empresa ChromaDexyla glucobrasicanapina puede obtenerse de Simagchem Corporation.

La composicióndela presenteinvención contiene una cantidadde alquenilglucosinolato comprendida entre1mg y1000 mg, preferiblemente comprendida entre50mgy500 mg,ymás preferiblementeentre 100mgy300 mg.

En una realización preferida de la invención, la composición contiene sinigrina en una cantidad comprendida entre 1mgy1000 mg, preferiblemente comprendida entre50mgy500mg, más preferiblemente comprendida entre 100y 300 mg.

La mirosinasa

La enzima mirosinasa, también denominada tioglucosidasa, permite la hidrólisis de los glucosinolatos a diferentes derivados (isotiocianatos, tiocianatos, nitrilosyepitionitrilos, principalmente) en función del tipo de glucosinolatoy de las condiciones en las que se efectúa la hidrólisis.

La mirosinasaestápresenteenunagranvariedaddefuentesdela naturaleza,talcomose describe,porejemplo,en el artículo Bones et al., The myrosinase-glucosinolate system, its organisation and biochemistry, 1996, 97, 194-208. Habitualmente se encuentra en las mismas especies vegetales en las que se hallan los glucosinolatos, prácticamente en todas las especies de lafamilia de las crucíferas, así como en otrasfamilias tales como Akaniaceae, Bataceae, Capparaceae, Caricaceae, Euphorbiaceae, Gyrostemonaceae, Limnanthaceae, Moringaceae, Pentadiplandraceae, Resedaceae, Salvadoraceae, Tovariaceae y Tropaeolaceae, entre otras. También se encuentra en algunos hongos (Aspergillus niger o Aspergillus sydowi), en bacterias(Enterobacter cloacae o Paracolobactrum aerogenoides), y también en algunos insectosdelafamiliade los Aphidoidea (como Brevicoryne brassicae yLipaphis erisimi),o enla larvadela mariposadela col(Pieris brassicae).

La mirosinasa puede obtenerse a partir de cualquiera de dichas fuentes en las que se encuentra en la naturaleza.

En la composición de la presente invención la mirosinasa puede emplearse en forma pura o como fuente vegetal deshidratada.

En una realización preferida de la invención, la mirosinasa está en forma de una fuente vegetal deshidratada, preferiblemente obtenidaapartirdevegetalesdelafamiliadelas crucíferas,más preferiblementedehojasde Lepidium latifolium, hojas de Brassica campestris L, u hojas de Brassica napus L; semillas de Sinapis alba, o semillas de Lepidium sativum; o mezclas de los anteriores. En una realización más preferida, la mirosinasa está en forma de semillas de Lepidium sativum deshidratadasymolidas,ode hojasde Lepidium latifolium deshidratadasymolidas.

Dichas fuentes vegetales deshidratadas pueden prepararse, por ejemplo, por un proceso que comprende la deshidratacióndelaplanta recién recolectada,sin trocearyposteriormolido,segúnun procedimiento análogoal descrito para el alquenilglucosinolato. En este caso, obviamente, no es aplicable la alternativa de desactivar la mirosinasa para poder trocear la planta hidratada.

Así mismo, la mirosinasa puede obtenerse comercialmente en forma pura, obtenida a partir de extractos de origen vegetal, como por ejemplo la suministrada por la empresa Sigma-Aldrich a partir de extractos de Sinapis alba.

La composición de la presente invención contiene preferiblemente mirosinasa en una proporción comprendida entre0,1y2Ul (unidades internacionalesdeactividad enzimática),porcada0,025 milimolesde alquenilglucosinolato presente en la composición (correspondientes, por ejemplo, a 10 mg para el caso de la sinigrina).

Una Unidad Internacional de mirosinasa puede definirse como la cantidad de dicha enzima que libera1 µmol de glucosapor minutoa partirdela sinigrinaapH6y a 25ºCtal comose describepor ejemploenla páginawebdela compañía Sigma-Aldrich en la información correspondiente a la mirosinasa, o también como la cantidad de enzima que forma1 µmolde glucosapor minutoapartirdela sinigrinaapH7,6y a23ºC,tal comose describeenel artículo deVan Eylen et al.,Temperature and pressure stability of mustardseed (Sinapis alba L.)myrosinase,Food Chem., 2006, 97, 263-271.

La proteína epitioespecífica

La presencia de la proteína epitioespecífica (ESP) es necesaria para que se formen epitionitrilos a partir de la hidrólisis de los alquenilglucosinolatos, puesto que en su ausencia se forman preferentemente otros productos de degradación, principalmente nitrilos, isotiocianatosytiocianatos.

La proteína epitioespecífica está presente en muchosvegetalesdelafamiliade las Brassicaceae,y fue aislada por primeraveza partirde semillasde Crambe abyssinica, como se describe en el artículo H. L. Tookey, Crambe thioglucoside gluccohydrolase (EC 3.2.3.1): Separation of a protein required for epithiobutane formation, Can. J. Biochem., 1973, 23, 511-525.

Enla composicióndela presenteinvención,la proteína epitioespecíficapuede estar contenidaen una fuentevegetal deshidratada, o bien puede emplearse en forma pura.

En una realización preferida de la invención, la proteína epitioespecífica está en forma de una fuente vegetal deshidratada. Esta fuente vegetal deshidratada puede obtenerse, por ejemplo, según un proceso de deshidratación de la planta recién recolectada, sin trocear,y posterior molido, según un procedimiento análogo al descrito para el alquenilglucosinolato.

Según este procedimiento, la proteína epitioespecífica puede obtenerse, por ejemplo, a partir de Crambe abyssinica,Alyssumperenne,Alyssum saxatile,Arabidopsis thaliana, Berteroa incana,Brassicachinensis,Brassicajuncea, Brassica napus, Brassica oleracea, Brassica rapa, Cakile maritima, Cardamine pratensis, Hirchfeldia incana, Lepidium latifolium, Lepidum sativum, Lubularia maritima, Sisymbrium altissimum yTurritis glabra, entre otras.

En una realización preferida de la invención, la proteína epitioespecífica está en forma de una fuente vegetal deshidrataday molida obtenidaa partirdehojasde Lepidium latifolium, hojas de Brassica oleracea var. Gemmifera, semillas de Lepidium sativum, o como mezcla de las anteriores.

En una realización más preferida, la proteína epitioespecífica está en forma de hojas de Lepidium latifolium deshidratadas. Dichas hojasdeshidratadas contienen proteína epitioespecífica en unaproporción en peso generalmente comprendida entre 0,001%y0,2%.

La cuantificación de la proteína epitioespecífica puede llevarse a cabo, por ejemplo, por electroforesis según se describe en el artículo de Hooi et al., Purification and characterization of epithioespecifier protein from Brassica napus: enzymic intramolecular sulphur adittion within alkenyl thiohydroximates derived from alkenyl glucosynolate hydrolysis, FEBS Letters, 2000, 468, 243-246.

La composición de la presente invención contiene preferiblemente proteína epitioespecífica en una proporción comprendida entre0,01mgy1mgporcada0,025 milimolesdealquenilglucosinolato presenteenla composición, preferiblemente comprendida entre0,05mgy0,5mg.

Enlas composicionesdelainvención,el alquenilglucosinolatoestápreferiblementeenformadeuna fuentevegetal deshidratadao comoextractovegetal seco,o como mezclasde los anteriores,yla mirosinasayla proteína epitioespecífica están en forma de una fuente vegetal deshidratada.

En una realización de la invención, las composiciones comprenden una fuente vegetal deshidratada que contiene simultáneamente al menos dos de los ingredientes elegidos entre el glucosinolato, la proteína epitioespecíficayla mirosinasa. Preferiblemente en la composición de lainvención se emplea hoja deshidratada de Lepidium latifolium que contiene simultáneamente sinigrina, mirosinasayproteína epitioespecífica.

En otra realización, la composición de la invención comprende semilla deshidratada de Lepidium sativum que contiene simultáneamentemirosinasayproteína epitioespecífica.

Sal de hierro (II)

La composición de la invención contiene una sal de hierro (II)farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, la sal de hierro (II) se elige entre el grupo formado por ascorbato, lactato, gluconato, glutamato, sulfato, cualquiera de sus formas hidratadas,y mezclasde las mismas.Todas estas sales son productos comerciales fácilmente asequibles.

En una realización preferida de la invención, la sal de hierro (II) se elige entre sulfato ferroso pentahidratadoy fumarato ferroso.

La composición de la presente invención contiene preferiblemente la sal de hierro (II) en una proporción comprendida entre 0,1y1micromoles por cada 0,025 milimoles de alquenilglucosinolato, más preferiblemente entre 0,25y 0,75 micromoles.

Ácido ascórbico

Opcionalmente, las composiciones de la invención contienen ácido ascórbico, o vitamina C, que es un compuesto que se encuentra ampliamente distribuido en la mayoría de frutasy verduras frescas, por ejemplo, en los cítricos, manzana,pina,pimientos,o espinacas,entreotros muchos.Elácido ascórbicopuedeemplearsecomotal,obiencomo una sal dietéticamente aceptable, por ejemplo como ascorbato de sodio, potasio o calcio.

El ácido ascórbico puede así mismo obtenerse por síntesis química, por ejemplo según el procedimiento descrito en el artículo Reichstein et al., Helv. Chim. Acta, 1933, 16, 561, 1019. El ácido ascórbico puede obtenerse comercialmente a través de diversos suministradores, por ejemplo, a través de la empresa Sigma-Aldrich.

En una realización de la presente invención, la composición contiene preferiblemente ácido ascórbico en una proporción comprendida entre0,1mgy5mgpor cada 0,025 milimolesde alquenilglucosinolato.

El ácido ascórbico también puede estar en una proporción superior a la mencionada ya que puede ser empleado como agente antioxidante en la composición.

Procedimiento de preparación de la composición

Forma también parte de la presente invención un procedimiento para la preparación de la composición de alquenilglucosinolato.

El procedimiento de la invención comprende:

a) mezclarel alquenilglucosinolatode fórmula(I)en dondeResun grupo alquenilo conun doble enlace terminal,la mirosinasa,la proteína epitioespecíficay, opcionalmente,al menosunexcipientefarmacéuticamente aceptable para obtener una mezcla sólida que presenta un contenido en agua inferioral 10%,y

b1) para preparar una composición sólida:

i. añadir a la mezcla obtenida en la etapa a) una sal de hierro (II) farmacéuticamente aceptable y opcionalmente ácido ascórbico,y

ii. acondicionarla mezcla resultanteenformade comprimidos, cápsulas,opolvo dispersableen sobres; o

b2) para preparar una composición mixta con una parte sóliday una parte líquida:

i. depositar la mezcla obtenida en la etapa a) en un tapón que incluye un alojamiento para sólidos,

ii. preparar una solución acuosa que comprende una sal de hierro (II)farmacéuticamente aceptable, opcionalmente ácido ascórbico, opcionalmente mirosinasao alquenilglucosinolato,yopcionalmente al menos unexcipientefarmacéuticamente aceptable,

iii. introducirla solución acuosa obtenidaenlaetapaii)enunvial,ytaparloconeltapón resultantede la etapa i).

En una realización preferida, el alquenilglucosinolato, la mirosinasayla proteína epitioespecífica se incorporan en formade una fuentevegetal deshidratada,o como mezclade una fuentevegetal deshidrataday unextractovegetal seco.

Preferiblemente el alquenilglucosinolato es sinigrina.

La sinigrina se incorpora a la composición preferiblemente en forma de extracto vegetal seco de Lepidium latifolium, o bien como extracto vegetal seco de Brassica oleracea var. gemmifera, o bien en forma de hoja de Lepidium latifolium deshidratadaymolida,o sus mezclas.

La mirosinasa se incorpora a la composición preferiblemente en forma de una fuente vegetal seca procedente de semillas de Lepidium sativum o de hojas de Lepidium latifolium deshidratadasyposteriormente molidas. Alternativamente la mirosinasa se puede incorporar en forma pura.

La proteína epitioespecífica se incorpora a la composición preferiblemente en forma de una fuente vegetal seca procedente de hojas de Lepidium latifolium, hojas deBrassica oleracea var. Gemmifera,semillas deLepidium sativum deshidratadasyposteriormente molidas.

Para la preparación de las composiciones de la invención, según cualquier formafarmacéutica adecuada, pueden seguirse los procedimientos que son bien conocidos paraelexperto en tecnologíafarmacéutica, como se describe, por ejemplo, enel libroM.E. Aulton,Farmacia.La ciencia del diseñode las formasfarmacéuticas, segunda edición, Elsevier, Madrid, 2004.

Ensayo de formación de epitionitrilos

La finalidad de las composiciones de la presente invención es que, tras su ingestión, se produzca la hidrólisis del alquenilglucosinolato, formándose en el organismo su correspondiente epitionitrilo, de efecto detoxificante, según se representa en el Esquema 1:

Esquema1

Según este esquema,la hidrólisisdela sinigrina(n=1, R’=H)dalugaral1-ciano-2,3-epitiopropanoo CETP,la hidrólisisdela gluconapina(n=2,R’=H)dalugaral1-ciano-3,4-epitiobutanooCETB,yla hidrólisisdela glucobrasicanapina (n=3, R’=H)dalugaral 1-ciano-4,5-epitiopentanoo CETPent.

Para verificar la formación de los epitionitrilos tras la ingestión de dichas composiciones se puede emplear, por ejemplo, un ensayo en el que se simulan las condiciones fisiológicas delestómago humano en presencia de alimentos con un valor de pH aproximadamente 2. En dichas condiciones se pueden ensayar las composiciones de la invención ydeterminar analíticamente las cantidades formadas de epitionitrilos.

Aefectos comparativos, también se pueden ensayar las composicionesdelainvención en condicionesdepH7.

Los productos de hidrólisis del alquenilglucosinolato sinigrina que se pueden formar se muestran en el Esquema

2:

Esquema2

A partir del análisis de los resultados obtenidos en este ensayo, que se muestran detalladamente en el Ejemplo 20, los autores observaron que, sorprendentemente, las composiciones de la presente invención experimentan una conversión superior al 60%del alquenilglucosinolato mayoritariamente en su epitionitrilo correspondiente cuando se someten a unas condiciones que simulan las condiciones fisiológicas en el estómago. Dicha conversión se ve drásticamente disminuida si se altera el pH, o si las composiciones carecen de mirosinasa o de proteína epitioespecífica.

También de forma sorprendente, los autores constataron que las composiciones de la invención presentan una alta estabilidad incluso en condiciones de estabilidad acelerada, tal como se demuestra en los estudios de estabilidad del Ejemplo 23.

Ensayo de la actividad detoxificante

La actividad detoxificante de las composiciones de la invención se puede valorar, por ejemplo, según un modelo in vitro basado en medir su capacidadpara inducirla enzimaNADPH quinona oxidoreductasa,o quinona reductasa (QR).La quinona reductasaes una conocida enzimade detoxificacióndefaseII,que cataliza reducciones obligatorias de dos electrones dependientesdeNAD(P)Hyprotegea las células contra los efectos tóxicosyneoplásicosdelos radicales libresyespecies reactivas de oxígeno que se originan en las reducciones de un electrón. La determinación del gradode induccióndelaQR seha usado para aislar agentes anticancerígenosypara diseñar quimioprotectores, tal como se describe en el artículo Eun-Sun Hwang et al., Effects of Different Processing Methods on Induction of Quinone Reductase by Dietary Broccoli in Rats,J. Med.Food., 2004,7(1), 95-99.

Para determinar la capacidadde inducción de la QR de las composiciones de la invención, se puede utilizar una línea celularde hepatomade ratónHepa 1c1c7,queexpresaQR.En este ensayose determinala reducciónexperimentadaporel tintede tetrazolio asociadoa menadiona,segúnel método descrito,por ejemplo,enlas publicacionesde Prochaska et al., Direct measurementofNAD(P)H: quinonereductasefrom cells culturedin microtiter wells:a screening assay for anticarcinogenic enzyme inducers, Anal. Biochem, 1988, 169, 328-336y Rapid detection of inducers of enzymes that protect against carcinogens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 2394-2398.Aefectos comparativos, también se puede realizar el ensayo con un inductor de la quinona reductasa bien conocido como es el sulforafano, el isotiocianato activo derivado de la hidrólisis del glucosinolato glucorafanina.

Los resultados de este ensayo se presentan en el Ejemplo 21,yponen de manifiesto que las composiciones de la invención poseen una actividad detoxificante significativa, comparable con la del sulforafano, que es un reconocido agente detoxificante.

Ensayo de toxicidad

La toxicidad de las composiciones de la invención se puede determinar, por ejemplo, mediante el empleo de un Kit de Proliferación Celular XTT (suministrado por la empresa Roche). Este ensayo está basado en la reducción de la sal sódica de 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carboxanilida (XTT), para formar el tinte formazán anaranjado, conversión que sólo puede ser llevada a cabo por las células metabólicamente activas.

Los resultadosdel ensayodetoxicidadse muestranenel Ejemplo22,yponende manifiestoquelos compuestosde lainvención muestran ausenciade citotoxicidaden este ensayo, con unos resultados comparablesalosdel sulforafano, que se tomó como referencia.

Uso de la composición

Los autores comprobaron que la composición de la invención presenta una actividad detoxificante significativa, según se observa en el Ejemplo 21.

Se ha observado que las composiciones de la invención son capaces de inducir la enzima quinona reductasa (QR) en un grado comparable al sulforafano. Dicha enzima protege las células contra los efectos tóxicosyneoplásicos de los radicales libresyespecies reactivasde oxígeno.LaQR activa también importantes quinonas quimioterapéuticas tales como mitomicinasyaziridilbenzoquinonas.

Así mismo, dicha composición se comporta de forma óptima en el ensayo de toxicidad, según los resultados obtenidos en el Ejemplo 22.

Es por ello que también forma parte del objeto de la presente invención una composición que comprende un alquenilglucosinolato de fórmula (I), en dondeR es ungrupo alqueniloC3-C10 con un doble enlace terminal, mirosinasa, proteína epitioespecíficay una salde hierro (II)farmacéuticamente aceptablepara su uso como detoxificante frentea agentes cancerígenos, tales como compuestos con una estructura química poco frecuente en la naturaleza (xenobióticos). En el contexto de la invención se entiende por detoxificante un compuesto quimioprotector frente a agentes cancerígenos, es decir, un compuesto efectivo para reducirla susceptibilidadde los mamíferosa los efectos tóxicosy neoplásicos de los agentes carcinogénicos.

Los ejemplos que siguen a continuación sirven para ilustrar la invención si bien no deben considerarse limitantes de la misma.

Ejemplos

Ejemplo1

Preparación de comprimidos

Se prepararon comprimidosutilizandolos ingredientesquese indicanenlaTabla1:

TABLA1

Para prepararlos comprimidos,sepesaronlos ingredientes,se pasaronporun tamizde325 micrasyse introdujeron todosellos,exceptoel estearato,enunbombovolteadorparasu mezclado.Tras homogeneizaciónseañadióel estearato yse continuóel procesode mezclado duranteun tiemponosuperiora5minutos.Acontinuación,se prepararonlos comprimidos utilizando unamáquinade comprimir, aplicando una presión entre1,5y3Tm/cm2.

Se comprobó que los comprimidos se disolvían en menos de 10 minutos, según el test de disolución que figura en laFarmacopea Europea.

Ejemplos 2-7

Preparación de comprimidos

Siguiendo un procedimiento análogo al descrito en el Ejemplo 1, se prepararon otras formulaciones también en formade comprimidos, utilizandolas composicionesquese detallanenlaTabla2:

TABLA2

Ejemplo8

Preparación de cápsulas

Para preparar las cápsulas, se mezclaron los ingredientes que se indican en la Tabla 3, y con dicha mezcla se llenaron cápsulas de celulosa, utilizado una máquina encapsuladora:

TABLA3

Ejemplos 9-12

Preparación de cápsulas

Siguiendo un procedimiento análogo al descrito para el Ejemplo 8, se prepararon otras formulaciones en forma de cápsulas, utilizando cápsulasde gelatinaenlugarde celulosa,yllenándolas conlas composicionesquesedetallanen laTabla 4:

TABLA4

Ejemplo 13

Preparación de una formulación en polvo dispersable

Se procedió a la molienda, por separado, de cada uno de los componentes de la composición, empleando las cantidades especificadas enlaTabla5,ytras su cribado por una mallade 325 micras, se mezclaron en un dispositivo de mezclado de sólidos. El producto en polvo se introdujo en una envasadora de sólidos para dosificar en un envase susceptibledeañadirleunvolumen determinadode agua, aproximadamente comprendidoentre25mly100mly,tras su agitación, proceder inmediatamente a la ingestión de la dispersión preparada.

TABLA5

Ejemplos 14y15

Preparación de formulaciones en polvo dispersable

Siguiendo un procedimiento análogo al descrito para el Ejemplo 13, se prepararon así mismo las composiciones de losEjemplos14y15, tambiénen formade formulaciónenpolvo dispersable, utilizandolos componentesycantidades que se muestran enlaTabla6:

TABLA6

Ejemplo 16

Preparaciónde una formulación mixta formada por una parte líquiday una parte sólida La composición se elaboróapartirde los componentesycantidades que se muestran enlaTabla7: TABLA7

Se procedióal mezcladodelos componentes activosdela parte líquiday a su disolución con agua; esta mezcla se pasteurizó a través de un intercambiador de placas a una temperatura de 85ºC durante 3 segundos, después se sometióaunenfriadorápidoa10ºC,yseguidamenteseprocedióal llenadoenzonaasépticadelosvialespreviamente esterilizados, los cuales fueron inmediatamente cerrados con un tapón diseñado para contener la parte sólida del producto.Trasel llenadodel productoenpolvo,quepreviamentehabíasido mezcladoyhomogeneizado,setapótodo elconjuntoconunatapaprovistadeunpercutor afiladoquepermiterompereltapóndelapartesólidaenpolvopara queéstacaigasobrelapartelíquidayprocederasu mezclapor agitación,previamenteasu ingestión.

Ejemplos 17-19

Preparaciónde formulaciones mixtas formadas por una parte líquidayuna parte sólida

Se prepararon según un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 16, según las composiciones que se muestran enlaTabla8:

TABLA8

Ejemplosde Referencia1 a3

El Ejemplode Referencia1(comprimido)se preparó siguiendoun procedimiento análogoaldel Ejemplo7,pero eliminando de la composición la hojadeshidratada de Lepidium latifolium,de manera que el comprimido de referencia no contenía mirosinasa, ni proteína epitioespecífica.

El Ejemplo de Referencia 2 (cápsula) se preparó siguiendo un procedimiento análogo al del Ejemplo 12 pero eliminando de la composición la hoja deshidratada de Lepidium latifolium, de manera que la cápsula de referencia no contenía mirosinasa, ni proteína epitioespecífica.

El Ejemplo deReferencia3(formulación mixta sólido-líquido), se preparó siguiendo un procedimiento análogo al del Ejemplo 19 pero eliminando de la composición la hoja deshidratada de Lepidium latifolium, de manera que la formulación mixta sólido-líquido de referencia no contenía mirosinasa, ni proteína epitioespecífica.

Ejemplosde Referencia4 a6

El Ejemplode Referencia4(comprimido)se preparó siguiendoun procedimiento análogoaldel Ejemplo7,pero eliminando de la composición la hoja deshidratada de Lepidium latifolium,ysustituyéndolapor2Ulde enzima mirosinasa pura proveniente de Sinapis alba (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), de manera que dichas composiciones no contenían proteína epitioespecífica.

El Ejemplo de Referencia 5 (cápsula) se preparó siguiendo un procedimiento análogo al del Ejemplo 12, pero eliminando de la composición la hoja deshidratada de Lepidium latifolium,ysustituyéndolapor2Ulde enzima mirosinasa pura proveniente de Sinapis alba (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), de manera que dichas composiciones no contenían proteína epitioespecífica.

El Ejemplo deReferencia6(formulación mixta sólido-líquido), se preparó siguiendo un procedimiento análogo al del Ejemplo 19, pero eliminando de la composición la hoja deshidratada de Lepidium latifolium,ysustituyéndola por2Ulde enzimamirosinasapuraprovenientede Sinapis alba (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), de manera que dichas composiciones no contenían proteína epitioespecífica.

Ejemplo 20

Ensayo de formación de epitionitrilos

La formación de epitionitrilos se verificó mediante un ensayo en el que se simularon las condiciones fisiológicas del estómago humano en presencia de alimentos y bajo las que se ensayaron las composiciones de la invención, cuantificando analíticamente la formación de los epitionitrilos.

Para cada ensayo, se introdujeron en sendas bolsas de plástico con cierre tipo zip los siguientes componentes: 50 ml de solución de pepsina, 50 ml de solución de HCly 50g de clara de huevo cocida. La solución de pepsina se preparó inmediatamente antes de cada uso, disolviendo1gde pepsina en 200 ml de agua destilada. La solución de ácido clorhídrico se preparó disolviendo4ml de ácido clorhídrico concentrado en 250 ml de agua destilada. De este modo, el pH de la mezcla era aproximadamente 2, reproduciéndose así las condiciones fisiológicas del estómago.

A efectos comparativos, se ensayaron también las composiciones de la invención en condiciones de pH 7, para lo cual se siguió el mismo procedimiento descrito anteriormente, pero sin añadir solución de HCl en las bolsas de plástico, es decir, éstas contenían únicamente50mlde soluciónde pepsinay50mlde clarade huevo cocida.

Cada composición a ensayar se introdujo en una bolsa con esta mezcla. A continuación, se introdujo la bolsa durante2 minutos en un dispositivo homogeneizador “Masticator basic” (IUL Instruments, Barcelona, España) que disponedeun dispositivodepalasyrodillosque emulael procesode trituraciónpropiadel masticado.Seguidamente, labolsase depositóenunbañoa37ºC,para simularla temperatura corporal humana.Tras120 minutosde incubación se procedióa recuperarel contenidodela bolsaya suextracción mediante treslavados con 100mlde diclorometano. Tras centrifugaciónysecado con sulfato sódico anhidro, seinyectó una muestra en uncromatógrafodegasespara cuantificar los productos de la hidrólisisdel alquenilglucosinolato. Cada composición se ensayó por triplicado,y se calculó el valor promedio de los resultados.

Se ensayaronlas composicionesdelos Ejemplos7,12y19, correspondientesaun comprimido,unacápsulayuna formulación mixta sólido-líquido, respectivamente.

Las tres composiciones se habían formulado de manera que todas ellas contenían 10 mg de sinigrina, que se cuantificó por cromatografía HPLC,ytodas contenían iguales cantidades de mirosinasaytambién de proteína epitioespecífica. Dichas composiciones se ensayaronapH2y apH7.

También se ensayaron los Ejemplosde Referencia1,2y3, que carecíandela enzima mirosinasayla proteína epitioespecífica,ylos Ejemplosde Referencia4,5y6que carecíandela proteínaepitioespecífica.

Las tablasquese incluyena continuación muestranlos resultadosdel análisisdelosproductos resultantesdela hidrólisis, donde las cantidades se refierenamgde producto.Paravalorarla tasade conversióna epitionitrilo en cada caso,secalculó(últimafiladecadatabla),la relaciónentrela cantidadde 1-ciano-2,3-epitiopropanoformado,respecto a la suma de todos los productos de la hidrólisis de sinigrina, incluida, de haberla, la sinigrina que queda sin hidrolizar.

EnlaTabla9 se muestran los resultados del ensayo realizado con las composicionesde los Ejemplos7,12y19a pH 2:

TABLA9

Se puede observar que las composiciones objeto de la presente invención, en unas condiciones que simulan las fisiológicas en el estómago, experimentan una alta tasa de conversión de la sinigrina en su epitionitrilo (1-ciano-2,3epitiopropano), convaloresde conversión comprendidos entreel 61,5%yel 66,2%.

EnlaTabla10 se muestran los resultados del ensayo realizado con las mismas composiciones, peroapH7:

TABLA 10

En este caso puede observarse que, al cambiar el pH a un valor más alcalino en comparación con el pH del estómago,la tasade conversióna epitionitrilo seve sensiblementedisminuida, hasta unosvalores comprendidos entre el 3,2%yel 9,3%.Se demuestra asíqueelpH ácido del estómago es unfactor determinante para quela hidrólisisde los alquenilglucosinolatos sea dirigida mayoritariamente hacia la formación de epitionitrilos.

EnlaTabla11 se muestran los resultados del ensayo realizadoapH7 con las composiciones que no conteníanla enzima mirosinasayla proteína epitioespecífica,que correspondenalos Ejemplosde Referencia1,2y3.

TABLA 11

Se puede observar que sin la presencia de la enzima mirosinasa, no tiene lugar la hidrólisis del alquenilglucosinolato.

Finalmente,enlaTabla12se muestranlos resultadosdel ensayoapH2 conlas composicionesqueno contenían proteína epitioespecífica,que correspondena los Ejemplosde Referencia4,5,y6.

TABLA 12

También en este caso se confirma que la proteína epitioespecífica es imprescindible en las composiciones, puesto que sin ellala tasade conversióna epitionitrilo seve muy disminuida, hastavaloresde tan solo entreel 0,2%y el 1,3%.

Ejemplo 21

Ensayo de la actividad detoxificante

Laactividad detoxificantedelascomposicionesdelainvenciónsevalorósegúnun ensayo in vitro basado enmedir su capacidad para inducir la enzima quinona reductasa (QR).

En dicho ensayo se utilizó una línea celular de hepatoma de ratón Hepa 1c1c7, que expresa QR, determinándose la reducción experimentada por el tinte de tetrazolio asociado a menadiona, según el método descrito, por ejemplo, en las publicaciones de Prochaska etal.,Direct measurementofNAD(P)H: quinonereductasefrom cells culturedin microtiter wells:ascreening assay for anticarcinogenic enzyme inducers. Anal. Biochem, 1988, 169, 328-336y Rapid detection of inducers of enzymes that protect against carcinogen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 2394-2398. Mediante la lectura de la absorbancia, se determina la formación del tinte reducido de tetrazolio azul. Dicha formación resulta lineal duranteal menos los5primerosminutos,de modo que se tomala lecturaa los5minutosde iniciadala reacción como la más representativa para cada producto ensayado.

También se determinó la cinética enzimática de la QR durante 15 minutos.A efectos comparativos, se incluyó el ensayo con sulforafano, el isotiocianato activo derivado de la hidrólisis del glucosinolato glucorafanina, que es un conocido inductor de la quinona reductasa.

En dicho ensayo se evaluó un extracto preparado a partir de una composición según la presente invención, que contenía un alquenilglucosinolato,la enzima mirosinasaylaproteína epitioespecífica en forma de hoja de Lepidium latifolium deshidratadaymolida,yquese sometióa unascondicionesanálogasalasdel estómagopara permitirla hidrólisis en sus correspondientes epitionitrilos activos.

Para ello se preparó una composición que contenía 200 mg de hoja deLepidium latifolium deshidratadaymolida, 70mgde sulfatode hierro(II)y80mgde ácido ascórbico.

Dicha composición se sometió a hidrólisis a pH ácido, para lo cual se suspendió en 10 mlde agua destilada, se ajustóelpH a4 conuna disolución0,5MdeHCly se mantuvoen agitaciónenun recipiente herméticoenunbañoa 37ºC, traslo cualse centrifugóa 4000rpm durante20 minutos.El sobrenadantese filtróporun filtrode0,22 µm, se hicieron alícuotasyse congelarona -20ºC hasta su uso.

Se efectuóel ensayodelextractoa diferentes concentraciones:0,03;0,06;0,12;0,25;0,50;1,00;2,00;4,00y8,00 mg de Lepidium latifolium deshidratado por ml de disolución.

Aefectos comparativos, también se realizó el ensayo con sulforafano, en forma de una disolución en dimetilsulfóxido (DMSO).En este casoel ensayo se efectuóa las siguientes concentraciones micromolares: 0,1; 0,3; 0,5; 0,8;1,0; 2,0; 3,0; 4,0y5,0.

Para el ensayo, se utilizaron células de hepatoma de ratón Hepa 1c1c7 (Colección Europea de Cultivos Celulares, ECACC). Las células se sembraron en placas de 96 pocillos con una densidad de 10.000 células/pocillo en 100 µl de MEM(α-Minimum essential medium sin nucleósidos) suplementado con 10%de Suero FetalBovino, glutamina2 mM, penicilina 100 U/mlyestreptomicina 100 µg/ml,ycrecidas en un incubador humidificado en 5% CO2 a 37ºC (mediode cultivoysuplementosde GibcoInvitrogen, Carlsbad, California USA).

Para realizarel ensayo,el mediode cultivo se eliminóylas células se lisaron mediante incubacióna 37ºC con50 µlde digitoninaal 0,08%yEDTA2mM,apH7,8, conagitación suave durante30 min. Durante esta incubación,se preparó una solución stock mezclando 16,7 mg de BSA (albúmina sérica bovina), 7,5 mg de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)2,5-difenil-2H-bromurode tetrazolio(MTT),0,6mgdeNADP,1,25mlde solucióntampónTris-HCl0,5M(pH=7.4), 166,7 µldeTween20 (polisorbato20)al 1,5%, 166,7µlde soluciónde glucosa-6-fosfato150mM,16,7µlde solución deFAD(flavinadenin dinucleótido disodio)7,5mM,50 unidadesde glucosa-6-fosfato deshidrogenasadelevaduray agua destilada, hasta un volumen final de 25 ml por placa (reactivos obtenidos de Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri USA). Inmediatamente antes su uso, se añadieron a la solución stock 25 µl de solución 50 mM de menadiona en acetonitrilo (también de Sigma-Aldrich). Posteriormente, se dispensaron 200 µlde la soluciónstock completa a cada uno de los pocillos de la placa, con la ayuda de una pipeta multicanal. La placa se colocó en un lector SynergyHT (BioTek,Winooski,Vermont, USA)y se hicieron lecturas a 610 nm,cada50 segundos durante15 minutos, trasel inicio del tratamiento.

Se tomaron medidas de la absorbancia para cinco ensayos realizados para cada concentración de los extractos de la invención, tres ensayos con el control de DMSO y de células con medio de cultivo, y un ensayo para cada concentración de sulforafano, calculándose el valor promedio para los casos en que se realizó más de una medida.

La potencia de inducción de la enzima QR se expresó como la proporción de la actividad QR de las células tratadas respecto a la actividad QR de los pocillos control: células con medio de cultivo en el caso de los extractos de lainvención,yDMSO enel caso del sulforafano.

EnlaTabla13se muestranlos resultadosalos5minutosde comenzarla reacción, paraelextractodelainvención, a diferentes concentraciones. La concentración está en peso de hoja de Lepidium latifolium deshidratada por ml de disolución.Elvalor promediodela absorbanciade las células del medio fue0,934,de manera quela potenciade inducción se calculó según la relación absorbancia:0,934. Los resultados están representados de forma gráfica enla Figura 1.

TABLA 13

Se observa un claro efecto dosis-respuesta a lo largo del rango de concentraciones de Lepidium latifolium ensayadas, ya que la potencia de inducción aumenta con la concentración.

EnlaTabla14 se muestranlos resultadosa los5minutosde comenzarla reacción, parala soluciónde sulforafano en DMSO,a diferentes concentraciones.Elvalor promediodela absorbancia del DMSO fue 1,253,de manera quela potencia de inducción se calculó en cada caso según la relación absorbancia: 1,253. Los resultados están representados de forma gráfica enla Figura2.

TABLA 14

También en este caso se observa un claro efecto dosis-respuesta a lo largo del rango de concentraciones de sulforafano ensayadas.

Comparando la potencia de inducción de QR de las hojas deshidratadas de Lepidium latifolium con la potencia del sulforafano, se observaque las composiciones de la invención presentan un comportamiento análogo al del sulforafano.

También se realizaronmedidasde cinética enzimáticadelaQRalo largode quince minutos.EnlaTabla15 se muestran los valores de la absorbancia obtenidos para las medidas efectuadas cada 50 segundos, durante 15 minutos, para el producto de la invención a la concentración más alta (8 mg/ml de Lepidium latifolium), para el sulforafano también a la concentración más alta (5 µM), y también para los controles de células más medio, y DMSO. Los resultados se han representado gráficamente en la Figura 3.

(Tabla pasa a página siguiente) TABLA 15

En los cuatro casos se observa un aumento en la absorbancia a medida que transcurre la reacción, signo de la inducción enzimática. Se observa también que esa inducción enzimática es significativamente menor en los ensayos de control.

Así mismo, cabe destacar que, en las condiciones ensayadas, la inducción enzimática debida al producto de la invención es algo mayor que en el caso del sulforafano.

Ejemplo 22

Ensayo de toxicidad

La toxicidad se determinó en placas paralelas tratadas de manera idéntica a las usadas en el ensayo de la enzima quinona reductasa. Despuésde48hy72hdeexposiciónal tratamiento correspondiente,las células fueron tratadas con el Kit de Proliferación Celular XTT (Roche, Basilea, Suiza), de manera que se añadieron 50 µlde la mezcla de mareaje XTTa cada pocillo, hasta una concentración final0,3 mg/ml.La placafue incubada durante4h en una atmósfera humidificada,a 37ºCy con un5%deCO2,y a continuación se midió espectrofotométricamentela absorbancia del formazán producido, a 500 nm en un lector ELISA. La longitud de onda de referencia fue de 700 nm.

Se determinóla citotoxicidaden funcióndela absorbancia obtenida.Se repitióel ensayo5 veces para cada concentración de Lepidium latifolium enlas composicionesdelainvención,3 veces paralos controles DMSOycélulas másmediodecultivoy1paraelsulforafano.Paralos ensayosconmásdeuna repetición,setomóelvalormediode la absorbancia.

En laTabla 16 se muestran los resultados de citotoxicidad de la composición de la invencióny se representan en la Figura 4. En este ensayo, elpromedio de la absorbancia del control de células+medio fue de 1,976.

TABLA 16

Se puede observar que los valores de absorbancia se mantienen aproximadamente constantes a lo largo del rango de las nueve concentraciones ensayadas, lo que revela ausencia de citotoxicidad en los tratamientos.

EnlaTabla17se muestran los resultados del ensayodecitotoxicidad parael sulforafano, que se representan enla Figura 5. El valor promedio de absorbancia del control de DMSO de 2,290.

TABLA 17

Tambiénenestecaso,sepuedeobservarquelosvaloresde absorbanciasemantienen aproximadamente constantes alolargodelrangodelasnueveconcentraciones ensayadas,loquerevela ausenciadecitotoxicidadenlos tratamientos.

La comparación de los resultados obtenidos con la composición de la invención y con el sulforafano permite concluirquese comportandeforma análogaen cuantoa citotoxicidad.

Ejemplo 23

Ensayos de estabilidad

Se diseñaron sendos ensayos para comprobarla estabilidaddela sinigrina,la mirosinasayla proteína epitioespecífica.

Todos los estudios de estabilidad se realizaron según dos protocolos distintos:

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Estabilidad a tiempo real, donde las muestras se almacenaron a 25ºC ± 2ºC, a una humedad relativa del 60% ± 5%, durante un período de 12 meses, en un vial de PET (polietilen tereftalato) de color topacio. Se tomaron medidasde los parámetros cada3 meses durante1año.

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Estabilidad en condiciones aceleradas, donde las muestras se almacenaron a 40ºC ± 2ºC, a una humedad relativa de 75% ± 5%, durante un períodode6 meses, en un vialde PETde colortopacio.Se tomaron medidas cada mes durante6 meses.

En todos los estudios, cada ensayo se efectuó por triplicadoyse calculóelvalor promedio.

El estudiode estabilidaddela sinigrinasellevóacabo mediantelacuantificacióndela sinigrinapor cromatografía de HPLC, a lo largo del proceso de envejecimiento, a partir de dos fuentes distintas de sinigrina:

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un extracto vegetal líquido concentrado de Lepidium latifolium con un 3,26% de sinigrina,y al que se añadió glicerol como conservante en una cantidad equivalente al 40% del volumen del extracto;

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mezcla al 50% en peso de hoja deshidratada de Lepidium latifolium en polvoy extractovegetal secode Lepidium latifolium con un contenido total en sinigrina del 6,87%;

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EnlaTabla18se muestranlos resultadosdelosestudiosde estabilidadde sinigrinaa tiempo real,mientras quelaTabla19 muestra los estudiosde estabilidadde sinigrina en condiciones aceleradas.

TABLA 18 TABLA 19

Apartir de los resultados obtenidos se observa que la sinigrina presenta una alta estabilidad, especialmente en los productos con baja proporción de agua, con unas tasas de degradación relativamente bajas en un plazo mayor de6 mesesen condiciones aceleradas,equivalentesaal menos24 mesesen condiciones normales. Esto demuestraquela estabilidad de la composición no queda mermada durante el tiempo de vida del producto.

El estudio de la estabilidad de la mirosinasa se basó en la cuantificación de su capacidad de hidrólisis de la sinigrinaalolargo del procesode envejecimiento, utilizandola técnicade cromatografíadegases.La estabilidaddela mirosinasa se estudió en dos sustratos distintos:

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una mezcla al 50% en peso de hoja deshidratada de Lepidium latifolium en polvo y extracto seco de Lepidium latifolium,

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una mezcla al 50% en peso de semilla de Sinapis alba yextracto seco deLepidium latifolium.

Para cada ensayo, a los tiempos indicados a lo largo del proceso de envejecimiento, se tomó la cantidad necesaria del producto que contenía 10 mg de sinigrina, añadiéndose, de ser necesario, sinigrina pura (Sigma-Aldrich) hasta completar los 10 mg por muestra. Se llevó a cabo la hidrólisis en el sistema de “estómago artificial” previamente descrito,apH7, adicionando80mgde ácido ascórbicoy70mgde sulfato ferroso,y se analizaronlos productosde hidrólisis de la sinigrina.

En lasTablas20y21 se muestran los resultadosde estabilidadde mirosinasa realizados conel primer sustrato, es decir, conla mezcla 1:1deextracto secoyplanta deshidratadade Lepidium latifolium, en condiciones de tiempo real yen condiciones aceleradas, respectivamente.

TABLA 20

TABLA 21

Se observa quela actividad de la mirosinasa se mantiene durante un plazo de al menos6 meses en condiciones aceleradas, equivalentes al menos a 24 meses en condiciones normales, de manera que permite hidrolizar toda la sinigrina presente, lo que demuestra que su funcionalidad no queda mermada durante eltiempo de vida del producto.

EnlasTablas22y23se muestranlosresultadosde estabilidadde mirosinasa realizados conelsegundosustrato,es decir, con una mezcla 1:1 de extracto seco de Lepidium latifolium ysemilla deSinapis alba, en condiciones de tiempo realy en condiciones aceleradas, respectivamente.Todas las cantidades están enmg.

TABLA 22

TABLA 23

Se observa también en este caso que la actividad dela mirosinasa se mantiene durante un plazo de al menos6 meses en condiciones aceleradas, equivalentes al menos a 24 meses en condiciones normales, de manera que permite hidrolizar toda la sinigrina presente, lo que demuestra que su funcionalidad no queda mermada durante el tiempode vida del producto.

Finalmente, el estudio de la estabilidad de la proteína epitioespecífica se basó en el análisis de la tasa de conversiónde sinigrina en1-ciano-2,3-epitiopropanoalo largo delprocesode envejecimiento, utilizandola técnicade cromatografía degases.

La estabilidad de la proteína epitioespecífica se estudió en una mezcla al 50% en peso de hoja deshidratada de Lepidium latifolium enpolvoy extracto secode Lepidium latifolium.Para cada ensayo, a los tiempos indicados a lo largo del proceso de envejecimiento, se tomó la cantidad necesaria del producto que contenía 10 mg de sinigrina,y se llevó a cabo la hidrólisis en el sistema de “estómago artificial” previamente descrito, a pH 2, adicionando 80 mg de ácido ascórbicoy70 mg de sulfato ferroso,y se analizaron los productos de hidrólisis de la sinigrina.Todas las cantidades están en mg.LaTabla24 muestrael resultadode los estudiosde estabilidaddela proteína epitioespecífica a tiempo real, mientras quelaTabla25 muestra los estudios realizados en condiciones aceleradas.

TABLA 24

TABLA 25

Se comprueba que durante un plazo de al menos6 meses en condiciones aceleradas, la actividad de la proteína epitioespecífica se mantiene, puesto que conservan unas altas tasas de conversión de la sinigrina en el epitionitrilo, 1,ciano-2,3-epitiopropano,loque demuestra que su funcionalidad perduraalo largo deltiempode vida del producto.

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES

   1. Composición caracterizada porque comprende: a) un alquenilglucosinolato de fórmula (I)

   en donde Glc es glucosa,yRes un grupo alquenilo con un doble enlace terminal, b) mirosinasa, c) proteína epitioespecíficay d) una salde hierro (II)farmacéuticamente aceptable.

2. 2.

   Composición según la reivindicación 1, caracterizada porque el alquenilglucosinolato se elige entre sinigrina, gluconapina, glucobrasicanapina, o mezclas de los anteriores.

3. 3. Composición según la reivindicación 2, caracterizada porque el alquenilglucosinolato es la sinigrina.

4. 4.

   Composición según cualquierade las reivindicaciones1 a3, caracterizada porque el alquenilglucosinolato, está en forma de una fuente vegetal deshidratada, o como extracto vegetal seco, o como mezcla de los anteriores.

5. 5.

   Composiciónsegúnlareivindicación3, caracterizada porquela sinigrinaestáen formadeextractovegetal seco de Lepidium latifolium, o bien como extracto vegetal seco de Brassica oleracea var.gemmifera, o bien en forma de hoja de Lepidium latifolium deshidratada, o bien es una mezcla de cualquiera de los anteriores

6. 6.Composiciónsegún cualquieradelasreivindicaciones1 a5, caracterizada porquelamirosinasayla proteína epitioespecífica están en forma de una fuente vegetal deshidratada.

7. 7.

   Composición según la reivindicación 6, caracterizada porquela mirosinasa estáen formade una fuentevegetal deshidratada obtenida a partir de hojas de Lepidium latifolium, hojas de Brassica campestris L, hojas de Brassica napusL;semillas deSinapis alba, o semillas de Lepidium sativum;o mezclas de los anteriores.

8. 8.

   Composición según la reivindicación 6, caracterizada porque la proteína epitioespecífica está en forma de hoja de Lepidium latifolium deshidratada, hoja de Brassica oleracea var. Gemmifera deshidratada, semillas de Lepidium sativum deshidratadas, o como mezcla de las anteriores.

9. 9.

   Composición según cualquierade las reivindicacionesde1 a8, caracterizada porque contiene una cantidad de alquenilglucosinolato comprendida entre1mgy1000mg.

10. 10.

    Composiciónsegún cualquieradedelasreivindicaciones1a9, caracterizada porque, por cada 0,025 milimolesde alquenilglucosinolato, contiene entre0,1y2Ulde mirosinasa, entre0,01mgy1mgde proteína epitioespecífica, yentre0,1y1micromolesdesalde hierro(II)farmacéuticamente aceptable.

11. 11.

    Composición según cualquierade las reivindicaciones1a10 caracterizada porque comprende también ácido ascórbico.

12. 12.

    Composición según la reivindicación 11, caracterizada porque contiene entre0,1mgy5mgdeácido ascórbico por cada 0,025 milimoles de alquenilglucosinolato.

13. 13. Composiciónsegún cualquieradelasreivindicaciones1 a12, caracterizada porque está en forma sólida.

14. 14.

    Composición según la reivindicación 13, caracterizada porque está en forma de cápsulas, comprimidos o polvo dispersable.

15. 15.

    Composiciónsegúncualquieradelasreivindicaciones1 a12, caracterizada porque está en forma mixta, con una parte sólidayuna partelíquida que deben mezclarse antesdela ingestión.

16. 16.

    Composición alimentaria caracterizada porque comprende una cantidad efectiva de la composición de cualquierade las reivindicaciones1 a 12.

17. 17.

    Procedimientopara prepararuna composiciónsegúncualquieradelasreivindicaciones1 a15, caracterizado porque comprende:

    a) mezclar el alquenilglucosinolato de fórmula (I) en dondeR es un grupo alquenilo con un doble enlace terminal,la mirosinasa,la proteína epitioespecíficay, opcionalmente,al menos unexcipientefarmacéuticamente aceptable para obtener una mezcla sólida que presenta un contenido en agua inferior al 10%, y

    b1) para preparar una composición sólida:

    i. añadirala mezcla obtenida enla etapaa) una salde hierro (II)farmacéuticamente aceptabley opcionalmente ácido ascórbico,y

    ii. acondicionar la mezcla resultante en forma de comprimidos, cápsulas, o polvo dispersable en sobres; o

    b2) para preparar una composición mixta con una parte sóliday una parte líquida:

    i. depositar la mezcla obtenida en la etapa a) en un tapón que incluye un alojamiento para sólidos,

    ii. prepararuna solución acuosaque comprendeunasaldehierro(II)farmacéuticamente aceptable, opcionalmente ácido ascórbico, opcionalmentemirosinasao alquenilglucosinolato,yopcionalmenteal menos unexcipientefarmacéuticamente aceptable,

    iii. introducirla solución acuosa obtenidaenlaetapaii)enunvial,ytaparloconeltapón resultante de la etapa i).
18. 18. Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado porque en la etapa a) el alquenilglucosinolato, la mirosinasayla proteína epitioespecífica se incorporan en formade una fuentevegetal deshidratada,o como mezcla de una fuentevegetal deshidrataday unextractovegetal seco.
19. 19. Composición según cualquierade las reivindicaciones1 a15 para su uso como detoxificante.