ES2374530T3 - Formulaciones líquidas de interferón estabilizado. - Google Patents

Formulaciones líquidas de interferón estabilizado. Download PDF

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Abstract

Una composición farmacéutica líquida estabilizada que comprende un interferón beta (IFN-beta) o una de sus sales, donde dicha formulación es una disolución que comprende un tampón acetato, 2-hidroxipropil-beta- ciclodextrina ("HPBCD"), manitol y metionina y donde dicha HPBCD está presente a una razón molar frente a dicho IFN-beta de un exceso molar de 500 a un exceso molar de 700 veces.

Description

Formulaciones liquidas de interfer6n estabilizado
Campo de la Invenci6n
La invenci6n se refiere a una composici6n liquida farmaceutica estabilizada que comprende un interfer6n (IFN-beta)
5 o una de sus sales, donde dicha formulaci6n es una disoluci6n que comprende un tamp6n acetato, HPBCD, manitol y metionina y donde dicho HPBCD esta presente a una raz6n molar frente a dicho IFN-beta de un exceso molar de 600 veces hasta un exceso molar de 700 veces.
Antecedentes de la Invenci6n
Los interferones son citoquinas, esto es, proteinas solubles que transmiten mensajes entre celulas y juegan un papel
10 esencial en el sistema inmunitario ayudando a destruir los microorganismos que ocasionan infecciones y reparando cualquier dano resultante. Los interferones son secretados naturalmente por las celulas infectadas y fueron identificados por primera vez en 1957. Su nombre deriva del hecho de que "interfieren" en la replicaci6n y la producci6n virales.
Los interferones muestran actividad tanto antiviral como anti-proliferativa. Basandose en las propiedades
15 bioquimicas e inmunol6gicas, los interferones humanos de origen natural se agrupan en tres clases principales: Interfer6n-alfa (leucocitos), Interfer6n-beta (fibroblastos) e Interfer6n-gamma (inmunitario). El interfer6n alfa esta actualmente aprobado en los Estados Unidos y otros paises para el tratamiento de la leucemia de celulas pilosas, verrugas venereas, sarcoma de Kaposi (un cancer que afecta comunmente a pacientes aquejados de Sindrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA)), y hepatitis no A, no B cr6nica.
20 Adicionalmente, los interferones (IFN) son glicoproteinas producidas por el organismo en respuesta a una infecci6n viral. Inhiben la multiplicaci6n de virus en las celulas protegidas. Al consistir en una proteina de bajo peso molecular, los IFN tienen una acci6n notablemente no especifica, esto es, el IFN inducido por un virus es eficaz frente a una amplia gama de otros virus. Sin embargo son especificos de la especie, esto es, el IFN producido por una especie solamente estimulara la actividad antiviral en las celulas de la misma especie o de una especie intimamente
25 relacionada. Los IFN fueron el primer grupo de citoquinas a explotar por sus potenciales actividades anti-tumorales y antivirales.
Los tres IFN principales son referidos como IFN-a, IFN-� e IFN-y. Dichas clases principales de IFN fueron clasificadas inicialmente de acuerdo con sus celulas de origen (leucocitos, fibroblastos o celulas T). Sin embargo, qued6 claro que varios tipos podrian ser producidos por una celula. Por tanto el IFN de leucocitos se denomina
30 ahora IFN-a, el IFN de fibroblastos es el IFN-� y el IFN de celulas T es el IFN-y. Existe tambien un cuarto tipo de IFN, el IFN linfoblastoide, producido en la linea celular "Namalwa" (derivada de linfoma de Burkit), que parece producir una mezcla de IFN de leucocitos y de fibroblastos.
La unidad de interfer6n o la unidad internacional para el interfer6n (U o UI, para unidad internacional) ha sido referida como una medida de la actividad del IFN definida como la cantidad necesaria para proteger el 50% de las
35 celulas frente al dano viral. El analisis que se puede utilizar para medir la bioactividad es el analisis de inhibici6n del efecto citopatico descrito (Rubinstein, et al. 1981; Familletti , P. C., et al., 1981). En este analisis antiviral para el interfer6n aproximadamente 1 unidad/ml de interfer6n es la cantidad necesaria para producir un efecto citopatico de 50%. Las unidades se determinan con respecto al patr6n de referencia internacional para el Hu-IFN-beta proporcionado por el National Institute of Health (Pestka, S. 1986).
40 Cada clase de IFN contiene varios tipos distintos. Cada uno de IFN-� e IFN-y es el producto de un unico gen.
Las proteinas clasificadas como IFN-a son el grupo mas diverso, conteniendo aproximadamente 15 tipos. Existe una agrupaci6n de genes de IFN-a en el cromosoma 9, conteniendo al menos 23 miembros, de los cuales 15 son activos y se transcriben. Los IFN-a maduros no estan glicosilados.
Los IFN-a e IFN-� tienen la misma longitud (165 o 166 aminoacidos) con actividades biol6gicas similares. Los IFN-y
45 tienen 146 aminoacidos de longitud, y se asemejan menos a las clases a y �. Solamente los IFN-y pueden activar los macr6fagos o inducir la maduraci6n de las celulas T asesinas. Estos nuevos tipos de agentes terapeuticos pueden ser denominados a veces modificadores de la respuesta biol6gica (MRB), debido a que tienen un efecto sobre la respuesta del organismo frente al tumor, afectando al reconocimiento por medio de la inmunomodulaci6n.
El interfer6n de fibroblastos humanos (IFN-�) tiene actividad antiviral y tambien puede estimular las celulas asesinas
50 naturales contra las celulas neoplasicas. Es un polipeptido de aproximadamente 20.000 Da inducido por virus y ARN de doble hebra. A partir de la secuencia de nucle6tidos del gen para el interfer6n de fibroblastos, clonado mediante tecnologia de ADN recombinante, (Derynk et al. 1980) dedujeron la secuencia de aminoacidos completa de la proteina. Tiene 166 aminoacidos de longitud.
Shepard et al. (1981) describieron una mutaci6n en la base 842 (Cys-Tyr a la posici6n 141) que anulaba su actividad anti-viral, y un clon variante con una deleci6n de los nucle6tidos 1119-1121.
Mark et al. (1984) insertaron una mutaci6n artificial remplazando la base 469 (T) por (A) ocasionando un desplazamiento de aminoacidos de Cys-Ser en la posici6n 17. Se inform6 de que el IFN-resultante era tan activo como el IFN-"nativo" y estable durante el almacenamiento a largo plazo (-70° C.).
Rebif® (Serono -interfer6n-humano recombinante), el ultimo avance en terapia con interfer6n para la esclerosis multiple (EM), es interfer6n (IFN)-beta-1a, producido a partir de lineas celulares de mamifero. Su nombre no patentado internacional recomendado (INN por sus siglas en Ingles) es "Interfer6n beta-1a".
Como con todos los farmacos basados en proteinas, un obstaculo principal que debe ser superado en el uso del IFN-beta como agente terapeutico, es la perdida de eficacia farmaceutica que puede resultar de su inestabilidad en formulaciones farmaceuticas.
Las inestabilidades fisicas que amenazan la actividad y la eficacia de los polipeptidos en las formulaciones farmaceuticas incluyen la desnaturalizaci6n y la formaci6n de agregados solubles e insolubles, si bien las inestabilidades quimicas incluyen la hidr6lisis, la formaci6n de imidas, la oxidaci6n, la racemizaci6n, y la desamidaci6n. Se sabe que algunos de estos cambios conducen a la perdida o reducci6n de la actividad farmaceutica de la proteina de interes. En otros casos, los efectos precisos de estos cambios son desconocidos, pero se considera que los productos resultantes de la degradaci6n todavia son farmaceuticamente inaceptables debido al potencial de efectos secundarios indeseables.
La estabilizaci6n de polipeptidos en las composiciones farmaceuticas permanece en el area en la que la prueba y error juega un papel principal (revisado por Wang (1999) Int. J. Pharm. 185:129-188; Wang y Hanson (1988) J. Parenteral Sci. Tech. 42:S3-S26). Los excipientes que se anaden a las formulaciones farmaceuticas polipeptidicas para incrementar su estabilidad incluyen tampones, azucares, tensioactivos, aminoacidos, polietilenglicoles, y polimeros, pero los efectos estabilizadores de estos aditivos quimicos varian dependiendo de la proteina.
Las ciclodextrinas son oligosacaridos ciclicos. Las ciclodextrinas mas comunes son la alfa-ciclodextrina, que esta compuesta por un anillo de seis residuos de glucosa; la beta-ciclodextrina, que esta compuesta por un anillo de siete residuos de glucosa; y la gamma-ciclodextrina, que esta compuesta por un anillo de ocho unidades de glucosa. La cavidad interna de una ciclodextrina es lip6fila, mientras el exterior de la ciclodextrina es hidr6filo; esta combinaci6n de propiedades ha conducido a difundir el estudio de las ciclodextrinas, concretamente en relaci6n con los farmacos, y se ha informado sobre muchos complejos de inclusi6n. La beta-ciclodextrina ha tenido un interes especial debido al tamano de su cavidad, pero su solubilidad en agua relativamente baja (aproximadamente 1,8% p/v a 25°C) y la nefrotoxicidad que conlleva han limitado su uso en el campo farmaceutico. Los intentos para modificar las propiedades de las ciclodextrinas naturales han dado como resultado el desarrollo de hepta-(2,6-dimetil)-betaciclodextrina, hepta-(2,3,6-tri-O-metil)-beta-ciclodextrina, hidroxipropil-beta-ciclodextrina, polimero de betaciclodextrina-epiclorihidrina y otros. Para una revisi6n exhaustiva de las ciclodextrinas y su uso en la investigaci6n farmaceutica, vease Pitha et at, en Controlled Drug Deliver, ed. S. D. Bruck, Vol. I, CRC Press, Boca Raton, Fla., pags. 125-148 (1983). Para una visi6n general aun mas reciente, vease Uekama et at, en CRC Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, Vol. 3 (1), 1-40 (1987); Uekama, en Topics in Pharmaceutical Sciences 1987, eds. D. D. Breimer y P. Speiser, Elsevier Science Publishers B. V. (Biomedical Division), 181-194 (1987); y Pagington, Chemistry in Britain, pags. 455-458 (Mayo 1987). El uso de ciclodextrinas especificamente en el campo de la liberaci6n de peptidos y proteinas ha sido revisado por T. Ide et al en Adv. Drug Deliv. Rev, Vol 36, 101-123 (1999) y los ejemplos en el caso de la hormona del crecimiento ovina, la interleuquina 2 y la insulina bovina han sido descritos por Brewster et al., 1991, en Phamaceutical Research, 8(6), 792-795.
En el documento WO 90/03784 y en la Patente de los Estados unidos Num. 5.997.856 se describe un metodo para la solubilizaci6n y/o estabilizaci6n de polipeptidos, especialmente proteinas, por medio de ciclodextrinas. No obstante, en este documento no se ha informado sobre datos de la estabilizaci6n de los interferones.
En la Patente de los Estados Unidos Num. 6.582.728 se describen composiciones de polvo seco para la administraci6n pulmonar que contienen interfer6n-beta que tambien contienen albumina de suero humano, que pueden contener adicionalmente ciclodextrinas. No obstante, incluso en este caso no se informa en el documento sobre datos de estabilizaci6n de la composici6n de interfer6n que tambien contiene ciclodextrinas.
En el documento WO 2003/002152 se describen composiciones estabilizadas que comprenden una molecula de interfer6n y un derivado especifico de ciclodextrina, esto es, sulfoalquileterciclodextrina.
Por consiguiente, existe la necesidad de composiciones de IFN-beta adicionales que comprendan estabilizadores fisiol6gicamente compatibles que mejoren la solubilidad de esta proteina y estabilicen la proteina frente a la formaci6n de agregados, aumentando de ese modo su utilidad farmaceutica.
Descripci6n de la Invenci6n
La presente invenci6n esta dirigida a composiciones farmaceuticas liquidas estabilizadas que comprenden (IFNbeta) o una de sus sales donde dicha formulaci6n es una disoluci6n que comprende un tamp6n acetato, HPBCD, manitol y metionina, de acuerdo con la reivindicaci6n 1 y a un metodo para preparar dicha composici6n farmaceutica. Ademas, se describe un recipiente que comprende dicha composici6n.
La composici6n se prepara preferiblemente en ausencia de albumina de suero humano (HSA), y de este modo esta libre de este excipiente farmaceutico. Esta composici6n es referida en la presente memoria como composici6n farmaceutica de IFN "libre de HSA" y comprende un interfer6n (IFN-beta) o una de sus sales.
De acuerdo con una realizaci6n de la presente invenci6n la composici6n tambien comprende un agente bacteriostatico.
Un "interfer6n-beta" o "IFN-beta", segun se utiliza en la presente memoria, hace referencia a un IFN-disponible en el mercado, por ejemplo, como Rebif® (Serono), Avonex®) (Biogen) o Betaferon® (Schering). Tambien se prefiere el uso de interfer6n-beta de origen humano de acuerdo con la presente invenci6n. Se pretende que el termino interfer6n, segun se utiliza en la presente memoria, incluya sus sales.
Se pretende que el termino "Interfer6n-beta (IFN-beta o IFN-)", segun se utiliza en la presente memoria, incluya el interfer6n de fibroblastos, en particular de origen humano, obtenido mediante aislamiento a partir de fluidos biol6gicos u obtenido por medio de tecnicas de ADN recombinante a partir de celulas anfitrionas procari6ticas o eucari6ticas, asi como sus sales, derivados funcionales, variantes, analogos y fragmentos activos. Preferiblemente se pretende que IFN-beta signifique Interfer6n beta-1a.
En la presente memoria, el termino "sales" hace referencia tanto a sales de grupos carboxilo como a sales de adici6n de acido de grupos amino de las proteinas descritas antes o sus analogos. Las sales de un grupo carboxilo se pueden formar mediante metodos conocidos en la tecnica e incluyen sales inorganicas, por ejemplo, sales de sodio, calcio, amonio, ferricas o de cinc, y similares, y las sales con bases organicas son aquellas formadas, por ejemplo, con aminas, tales como trietanolamina, arginina o lisina, piperidina, procaina y similares. Las sales de adici6n de acido incluyen, por ejemplo, sales con acidos minerales, tales como, por ejemplo, acido clorhidrico o acido sulfurico, y sales con acidos organicos, tales como por ejemplo, acido acetico o acido oxalico. Por supuesto, cualquiera de tales sales debe conservar la actividad biol6gica de la proteina (IFN-beta) relevante para la presente invenci6n, esto es, la capacidad para unirse al correspondiente receptor e iniciar la senalizaci6n del receptor.
De acuerdo con la presente invenci6n, el uso del IFN-beta humano recombinante es mas particularmente preferido.
La dosificaci6n administrada, en forma de una unica dosis o de multiples dosis, a un individuo variara dependiendo de una variedad de factores, incluyendo las propiedades farmacocineticas, la ruta de administraci6n, las condiciones y caracteristicas del paciente (sexo, edad, peso corporal, salud, tamano), el grado de los sintomas, los tratamientos concurrentes, la frecuencia del tratamiento y el efecto deseado.
Las dosificaciones convencionales de IFN-beta humano oscilan entre 80.000 UI/kg y 200.000 UI/kg por dia o 6 MUI (millones de unidades internacionales) y 12 MUI por persona por dia o de 22 a 44 Ig (microgramos) por persona. De acuerdo con la presente invenci6n, el IFN se puede administrar preferiblemente a una dosificaci6n de aproximadamente 1 a 50 Ig, mas preferiblemente de aproximadamente 10 a 30 Ig o de aproximadamente 10 a 20 Ig por persona por dia.
La administraci6n de los ingredientes activos de acuerdo con la presente invenci6n puede ser por medio de la ruta intravenosa, intramuscular o subcutanea. La ruta de administraci6n preferida para el IFN-beta es la ruta subcutanea.
El IFN tambien se puede administrar diariamente o en dias alternos, o menos frecuentemente. Preferiblemente, el IFN se administra una, dos o tres veces por semana.
La ruta de administraci6n preferida es la administraci6n subcutanea, administrada, p. ej., tres veces a la semana. Una ruta de administraci6n adicionalmente preferida es la administraci6n intramuscular, que puede ser aplicada, p. ej., una vez a la semana.
La dosificaci6n del IFN-en el tratamiento de recaida-remisi6n de la EM de acuerdo con la invenci6n depende del tipo de IFN-utilizado.
De acuerdo con la presente invenci6n, en la que el IFN-beta es IFN-1b recombinante producido en E. Coli, disponible en el mercado con la marca registrada Betaseron®, este se puede administrar preferiblemente subcutaneamente dia por medio a una dosificaci6n de aproximadamente 250 a 300 Ig o 8 MUI a 9,6 MUI por persona.
De acuerdo con la presente invenci6n, en la que el IFN-beta es IFN-1a recombinante, producido en celulas de ovario de hamster Chino (celulas CHO), disponible en el mercado con el nombre de fabrica Avonex®, este se puede
administrar preferiblemente intramuscularmente una vez a la semana a una dosificaci6n de aproximadamente 30 Ig a 33 Ig o 6 MUI a 6,6 MUI por persona.
De acuerdo con la presente invenci6n, cuando el IFN-beta es IFN-1a recombinante, producido en celulas de Ovario de Hamster Chino (celulas CHO), disponible en el mercado con el nombre de fabrica Rebif®, este puede ser administrado preferiblemente sub-cutaneamente tres veces a la semana (TVS) a una dosificaci6n de 22 a 44 Ig o 6 MUI a 12 MUI por persona.
El termino "estabilidad" hace referencia a la estabilidad fisica, quimica, y conformacional de las formulaciones de interfer6n de la presente invenci6n (incluyendo la conservaci6n de la potencia biol6gica). La inestabilidad de una formulaci6n de proteina puede estar ocasionada por la degradaci6n quimica o la agregaci6n de las moleculas de proteina para formar polimeros de mayor orden, la desglicosilaci6n, la modificaci6n de la glicosilaci6n, la oxidaci6n o cualquier otra modificaci6n estructural que reduzca al menos una actividad biol6gica de un polipeptido de interfer6n incluido en la presente invenci6n.
Una disoluci6n o formulaci6n "estable" o "estabilizada", es aquella en la que el grado de degradaci6n, modificaci6n, agregaci6n, perdida de actividad biol6gica y similares, de las proteinas de la misma esta aceptablemente controlado, y no se incrementa de manera inaceptable con el tiempo. Preferiblemente la formulaci6n conserva al menos 60% o aproximadamente 60%, mas preferiblemente al menos 70% o aproximadamente 70%, muy preferiblemente al menos 80% o aproximadamente 80% de la actividad del interfer6n marcado a lo largo de un periodo de 24 meses. Las composiciones de IFN-beta estabilizadas de la invenci6n tienen preferiblemente una vida util de al menos aproximadamente 6 meses, 12 meses, 18 meses, mas preferiblemente al menos 20 meses, aun mas preferiblemente al menos aproximadamente 22 meses, muy preferiblemente al menos aproximadamente 24 meses cuando se almacenan a 2-8°C
Los metodos para verificar la estabilidad de las composiciones farmaceuticas de IFN-beta de la invenci6n se encuentran disponibles en la tecnica, incluyendo aquellos metodos revelados en los ejemplos descritos en la presente memoria. De este modo, la formaci6n de agregados de IFN-beta durante el almacenamiento de una composici6n farmaceutica liquida de la invenci6n se puede determinar facilmente midiendo el cambio en el IFN-beta soluble en la disoluci6n a lo largo del tiempo. La cantidad de polipeptido soluble en la disoluci6n se puede cuantificar mediante numerosos ensayos analiticos adaptados para la detecci6n del IFN-beta. Tales ensayos incluyen, por ejemplo, la cromatografia de exclusi6n por tamanos (SEC)-HPLC y la espectroscopia de absorci6n UV, como se describe en los Ejemplos mas abajo.
La determinaci6n de agregados tanto solubles como insolubles durante el almacenamiento en las formulaciones liquidas se puede lograr, por ejemplo, utilizando la ultracentrifugaci6n analitica como se observa en los Ejemplos mas abajo para distinguir entre aquella porci6n del polipeptido soluble que esta presente en forma de agregados solubles y aquella porci6n que esta presente en la forma molecular biol6gicamente activa, no agregada.
Se pretende que la expresi6n "uso de multiples dosis" incluya el uso de un unico vial, ampolla o cartucho de una formulaci6n de interfer6n para mas de una inyecci6n, por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6 o mas inyecciones. Las inyecciones se pueden aplicar preferiblemente lo largo de un periodo de al menos 12 horas, 24 horas, 48 horas o aproximadamente 12 horas, 24 horas, 48 horas, etc., preferiblemente hasta un periodo de 12 dias o aproximadamente 12 dias. Las inyecciones se pueden espaciar en el tiempo, por ejemplo, por un periodo de 6, 12, 24, 48 o 72 horas.
El termino "tamp6n" o "tamp6n fisiol6gicamente aceptable" hace referencia a disoluciones de compuestos que son conocidos por ser seguros para el uso farmaceutico o veterinario en formulaciones y que tienen el efecto de mantener o controlar el pH de la formulaci6n en el intervalo de pH deseado para la formulaci6n. Los tampones aceptables para controlar el pH de un pH moderadamente acido a un pH moderadamente alcalino incluyen, pero no estan limitados a, compuestos tales como fosfato, acetato, citrato, arginina, TRIS, e histidina. "TRIS" hace referencia a 2-amino 2-hidroximetil-1,3-propanodiol, y a cualquier sal farmacol6gicamente aceptable del mismo. El tamp6n utilizado en la presente invenci6n es un tamp6n de acetato.
Las "ciclodextrinas" hacen referencia a los derivados hidroxipropilicos, hidroxietilicos, glucosilicos, maltosilicos y maltotriosilicos de beta-ciclodextrina y los correspondientes derivados de gamma-ciclodextrina. Los agrupamientos hidroxialquilicos pueden contener uno o mas grupos hidroxilo, p. ej. hidroxipropilo (2-hidroxipropilo, 3-hidroxipropilo), dihidroxipropilo y similares. Los derivados glucosilicos, maltosilicos y maltotriosilicos pueden contener uno o mas residuos de azucar, p. ej. glucosilo o diglucosilo, maltosilo o dimaltosilo, o diversas mezclas de los derivados de ciclodextrina, p. ej. una mezcla de derivados maltosilicos y dimaltosilicos. El derivado de ciclodextrina utilizado en la presente invenci6n es 2-hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HPBCD)
El tamp6n utilizado se encuentra disponible en el mercado o se puede preparar mediante metodos conocidos, especialmente por medio del uso del procedimiento optimizado de Pitha et al, International Journal of Pharmaceutics, 29, 73-82 (1986).
Un "agente de isotonicidad" hace referencia a un compuesto que es tolerado fisiol6gicamente y confiere una tonicidad adecuada a una formulaci6n para prevenir el flujo neto de agua a traves de las membranas celulares que estan en contacto con la formulaci6n. Los compuestos tales como la glicerina, son utilizados comunmente para tales
fines a concentraciones conocidas. Otros agentes de isotonicidad adecuados incluyen, pero no estan limitados a, aminoacidos o proteinas (p. ej., glicina o albumina), sales (p. ej., cloruro de sodio), y azucares (p. ej., dextrosa, manitol, sacarosa y lactosa). El agente de isotonicidad utilizado en la presente invenci6n es el manitol.
El termino "antioxidante" hace referencia a un compuesto que evita que el oxigeno y los radicales libres derivados del oxigeno interaccionen con otras sustancias. Los antioxidantes se encuentran entre un numero de excipientes comunmente anadidos a los sistemas farmaceuticos para aumentar la estabilidad fisica y quimica. Los antioxidantes se anaden para minimizar o retardar la aparici6n de procesos oxidativos con algunos farmacos o excipientes despues de la exposici6n a oxigeno en presencia de radicales libres. Estos procesos pueden estar catalizados a menudo por la luz, la temperatura, la concentraci6n de hidr6geno, la presencia de metales vestigiales o per6xidos. Con frecuencia se utilizan sulfitos, bisulfitos, tiourea, metionina, sales de acido etilenediaminotetraacetico (EDTA), hidroxitolueno butilado (BHT), e hidroxianisol butilado (BHA) como antioxidantes en los farmacos. Se ha encontrado que el EDTA s6dico intensifica la actividad de los antioxidantes quelando los iones metalicos que de otro modo catalizarian la reacci6n de oxidaci6n. El antioxidante utilizado en la presente invenci6n es la metionina.
El termino "bacterostatico" hace referencia a un compuesto o a composiciones anadidas a una formulaci6n para que actue como agente anti-bacteriano. Una formulaci6n que contiene interfer6n conservado de la presente invenci6n satisface preferiblemente las pautas establecidas por la ley o reguladoras para la eficacia del conservante para que sea un producto de multiples usos viable comercialmente. Los ejemplos de los bacteriostaticos incluyen fenol, mcresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencilico, alquil-parabeno (metil-, etil-, propil-, butil-y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio, deshidroacetato de sodio y timerosal. Preferiblemente el agente bacteriostatico es el alcohol bencilico.
La invenci6n proporciona una composici6n farmaceutica liquida estabilizada de acuerdo con la reivindicaci6n 1.
En una realizaci6n adicionalmente preferida de la invenci6n el IFN-beta es IFN-beta humano recombinante.
En otra realizaci6n preferida, la invenci6n proporciona la composici6n farmaceutica liquida estabilizada en la que dicho tamp6n esta presente en una cantidad suficiente para mantener el pH de dicha composici6n a mas o menos 0,5 unidades de un pH especificado, donde el pH especificado es de aproximadamente 3 a aproximadamente 6, tal como un valor de pH de 3,0 o aproximadamente 3,0 a aproximadamente 6,0, incluyendo un valor de pH de 3,8 o aproximadamente 3,8.
En otra realizaci6n preferida, la invenci6n proporciona la composici6n farmaceutica liquida estabilizada donde dicho tamp6n esta presente a una concentraci6n de aproximadamente 5 mM a 500 mM tal como una concentraci6n de 50 mM o aproximadamente 50 mM.
En otra realizaci6n preferida, la invenci6n proporciona la composici6n farmaceutica liquida estabilizada donde dicho agente de isotonicidad esta presente a una concentraci6n de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 500 mg/ml, tal como una concentraci6n de 50 mg/ml o aproximadamente 50 mg/ml.
En otra realizaci6n preferida, la invenci6n proporciona la composici6n farmaceutica liquida estabilizada en la que dicha metionina esta presente a una concentraci6n de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 mg/ml, incluyendo concentraciones de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5,0 mg/ml, tal como una concentraci6n de 0,1 mg/ml o aproximadamente 0,1 mg/ml.
En otra realizaci6n preferida, la invenci6n proporciona la composici6n farmaceutica liquida estabilizada en la que dicho interfer6n-beta esta presente a una concentraci6n de aproximadamente 10 Ig/ml a aproximadamente 800 Ig/ml, tal como una concentraci6n de 44, 88 o 276 Ig/ml o aproximadamente 44, 88 o 276 Ig/ml.
En otra realizaci6n preferida, la invenci6n proporciona la composici6n farmaceutica liquida estabilizada en la que dicha composici6n es una disoluci6n acuosa.
En otra realizaci6n preferida, la invenci6n proporciona una composici6n farmaceutica liquida estabilizada en la que la composici6n de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, comprende adicionalmente un agente bacteriostatico tal como alcohol bencilico.
En otra realizaci6n preferida, la invenci6n proporciona una composici6n farmaceutica liquida estabilizada en la que la composici6n de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, comprende adicionalmente un agente bacteriostatico y en la que dicho agente bacteriostatico esta presente a una concentraci6n de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 2%, incluyendo concentraciones de 0,1% o aproximadamente 0,1% a aproximadamente 2,0%, tal como concentraciones de 0,2 o aproximadamente 0,2 o aproximadamente 0,3%.
En otra realizaci6n adicionalmente preferida, la invenci6n proporciona una composici6n farmaceutica liquida estabilizada en la que la composici6n tiene la siguiente formulaci6n liquida:
Interfer6n beta-1a
44 Ig/mL
HPBCD
1,9 mg/mL
Metionina
0,1 mg/mL
Manitol
50 mg/mL
tamp6n acetato hasta
1 mL
En otra realizaci6n, la invenci6n proporciona un metodo para preparar una composici6n farmaceutica liquida estabilizada de acuerdo con la invenci6n, donde dicho metodo comprende anadir cantidades calculadas de 2hidroxipropil-beta-ciclodextrina, antioxidante y agente de isotonicidad a la disoluci6n tamponada y despues anadir el interfer6n (IFN-beta) o una de sus sales.
En otra realizaci6n, la invenci6n proporciona un recipiente hermeticamente sellado en condiciones esteriles y apropiadas para el almacenamiento antes de su uso, que comprende la formulaci6n farmaceutica liquida de acuerdo con la invenci6n. Son ejemplos de semejante recipiente un vial o un cartucho para un autoinyector. Los recipientes de acuerdo con la invenci6n son para la administraci6n de mono-dosis o de multiples dosis.
En una realizaci6n preferida, la invenci6n proporciona un recipiente de acuerdo con la invenci6n donde dicho recipiente es una jeringa precargada para la administraci6n de monodosis.
En otra realizaci6n, la invenci6n proporciona un kit para la administraci6n de multiples dosis de una composici6n farmaceutica de acuerdo con la invenci6n, donde el kit comprende un primer recipiente cargado con una composici6n farmaceutica de acuerdo con la invenci6n y un segundo cartucho cargado con una disoluci6n de agente bacteriostatico.
Preferiblemente la concentraci6n de IFN beta en la formulaci6n es de 10 Ig/ml o aproximadamente 10 Ig/ml a 800 Ig/ml o aproximadamente 800 Ig/ml, mas preferiblemente de 20 Ig/ml o aproximadamente 20 Ig/ml a 500 Ig/ml o aproximadamente 500 Ig/ml, mas concretamente preferiblemente de 30 o aproximadamente 30 a 300 o aproximadamente 300, muy preferiblemente a 44, 88 o 264 Ig/ml o aproximadamente 44, 88 o 264 Ig/ml.
Preferiblemente las formulaciones de la presente invenci6n tienen un pH entre aproximadamente 3,0 y 4,5 o de aproximadamente 4,5, mas preferiblemente 3,8 o aproximadamente 3,8. Un tamp6n preferido es acetato, siendo los contraiones preferidos los iones sodio o potasio. Los tampones salinos de acetato son bien conocidos en la tecnica. Las concentraciones de tamp6n en la disoluci6n total pueden variar entre 5 mM, 9,5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, y 500 mM o aproximadamente 5 mM, 9,5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, y 500 mM. Preferiblemente la concentraci6n de tamp6n es 10 mM o aproximadamente 10 mM. Es particularmente preferido un tamp6n 50 mM en iones acetato con un pH de 3,8.
Preferiblemente en la composici6n de la invenci6n, la metionina esta presente a una concentraci6n de 0,01 o aproximadamente 0,01 a 5 mg/ml o aproximadamente 5 mg/ml, mas preferiblemente de 0,05 o aproximadamente 0,05 a 0,3 mg/ml o aproximadamente 0,3 mg/ml, muy preferiblemente a 0,1 mg/ml o aproximadamente 0,1 mg/ml.
Preferiblemente la concentraci6n de manitol en las formulaciones liquidas es de 0,5 mg/ml o aproximadamente 0,5 mg/ml a 500 mg/ml o aproximadamente 500 mg/ml, mas preferiblemente de 1 mg/ml o aproximadamente 1 mg/ml a 250 mg/ml o aproximadamente 250 mg/ml, mas concretamente preferiblemente de 10 mg/ml o aproximadamente 10 mg/ml a 100 mg/ml o aproximadamente 100 mg/ml, muy preferiblemente de 50 mg/ml o aproximadamente 50 mg/ml.
En otra realizaci6n preferida, la invenci6n proporciona una composici6n de acuerdo con la invenci6n en la que la composici6n liquida es la siguiente:
Interfer6n beta-1a
44 Ig/mL
HPBCD
1,9 mg/mL
Metionina
0,1 mg/mL
Manitol
50 mg/mL
tamp6n acetato hasta
1 mL
La invenci6n incluye formulaciones liquidas. El disolvente preferido es agua para inyectables.
Las formulaciones liquidas pueden ser para monodosis o multiples dosis. Aquellas formulaciones liquidas de interfer6n de la invenci6n que estan destinadas a un uso en multiples dosis comprenden preferiblemente un agente bacteriostatico, tal como fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencilico, alquil-parabeno (metil-, etil-, propil-, butil-y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio, deshidroacetato de sodio y timerosal. Son particularmente preferidos fenol, alcohol bencilico y m-cresol, es mas preferido el alcohol bencilico. El agente bacteriostatico se utiliza en una cantidad que produzca una concentraci6n que sea eficaz para mantener la formulaci6n esencialmente libre de bacterias (adecuada para inyectables) a lo largo del periodo de inyecci6n de las multiples dosis, que puede ser de 12 o 24 horas o aproximadamente 12 o 24 horas hasta 12 dias o aproximadamente 12 dias, preferiblemente de 6 o aproximadamente 6 a 12 o aproximadamente 12 dias. El agente bacteriostatico esta presente preferiblemente a una concentraci6n de 0,1% o aproximadamente 0,1% (masa de agente bacteriostatico/masa de disolvente) a 2,0% o aproximadamente 2,0%, mas preferiblemente de 0,2% o aproximadamente 0,2% a 1,0% o aproximadamente 1,0%. En el caso del alcohol bencilico, son particularmente preferidas concentraciones de 0,2 o 0,3%).
El agente bacteriostatico tambien puede estar presente en formulaciones para monodosis.
El intervalo de interfer6n en la formulaciones de la invenci6n incluye cantidades que producen, tras la reconstituci6n, concentraciones de aproximadamente 1,0 Ig/ml a aproximadamente 50 mg/ml, aunque son operables concentraciones mas bajas y mas altas y dependen del vehiculo de liberaci6n pretendido, p. ej., las formulaciones en disoluci6n diferiran del parche transdermico, pulmonar, transmucosal, u osm6tico o de los metodos con microbombas. La concentraci6n de interfer6n es preferiblemente de 5 Ig/ml o aproximadamente 5 Ig/ml a 2 mg/ml o aproximadamente 2 mg/ml, mas preferiblemente de 10 Ig/ml o aproximadamente 10 Ig/ml a 1 mg/ml o aproximadamente 1 mg/ml, muy preferiblemente de 30 Ig/ml o aproximadamente 30 Ig/ml a 100 Ig/ml o aproximadamente 100 Ig/ml.
Preferiblemente las formulaciones de la invenci6n conservan al menos 60% o aproximadamente 60%, mas preferiblemente al menos 70% o aproximadamente 70%, muy preferiblemente al menos 80% o aproximadamente 80% de la actividad del interfer6n en el momento del envasado a lo largo de un periodo de 24 meses.
En una realizaci6n adicionalmente preferida, la invenci6n proporciona un metodo para preparar una composici6n farmaceutica liquida como se ha descrito antes.
En un caso de la presente descripci6n, se describe un metodo para manufacturar una composici6n farmaceutica empaquetada que comprende colocar una disoluci6n que comprende el ingrediente activo y los excipientes como se ha descrito antes.
En otro caso de la presente descripci6n, se describe un articulo de manufactura para uso farmaceutico humano, que comprende un vial que incluye las composiciones farmaceuticas descritas antes, material escrito que establezca que dicha disoluci6n se puede conservar durante un periodo de tiempo de veinticuatro horas o aproximadamente veinticuatro horas o mas despues del primer uso. Preferiblemente el material escrito establece que la disoluci6n se puede conservar hasta 12 dias o aproximadamente 12 dias.
Despues del primer uso de una formulaci6n de multiples dosis, esta se puede guardar y utilizar durante al menos 24 horas o aproximadamente 24 horas, preferiblemente al menos 4, 5 o 6 dias o aproximadamente 4, 5 o 6 dias, mas preferiblemente hasta 12 dias. Despues del primer uso la formulaci6n se almacena preferiblemente por debajo de la temperatura ambiente (esto es, por debajo de 25°C o aproximadamente 25°C), mas preferiblemente por debajo de 10°C o aproximadamente 10°C, mas preferiblemente a 2-8°C o aproximadamente 2-8°C, muy preferiblemente a 5°C
o aproximadamente 5°C
Las formulaciones de la presente invenci6n se pueden preparar mediante un procedimiento que comprende anadir las cantidades calculadas de los excipientes a la disoluci6n tamponada y despues anadir el interfer6n-beta.
La disoluci6n resultante se coloca despues en viales, ampollas o cartuchos. Las variaciones de este procedimiento seran reconocidas por un experto normal en la tecnica. Por ejemplo, el orden en el que los componentes son anadidos, que se utilicen otros aditivos, la temperatura y el pH a los cuales se prepara la formulaci6n, son todos factores que pueden ser optimizados para la concentraci6n y los medios de administraci6n utilizados.
En el caso de una formulaci6n para uso en multiples dosis, el agente bacteriostatico se puede anadir a la disoluci6n que contiene el ingrediente activo (interfer6n-beta) o alternativamente se puede mantener en un vial o cartucho separado y mezclarlo con posterioridad con la disoluci6n que contiene el ingrediente activo en el momento de su uso.
Las formulaciones de la invenci6n se pueden administrar utilizando dispositivos reconocidos. Los ejemplos que comprenden estos sistemas de viales individuales incluyen dispositivos autoinyectores o inyectores de boligrafo para la liberaci6n de una disoluci6n tal como Rebiject®.
Los productos reivindicados ahora incluyen el material de envasado. El material de envasado proporciona, ademas de la informaci6n requerida por las agencias reguladoras, las condiciones en las cuales se puede utilizar el producto. El material de envasado de la presente invenci6n proporciona instrucciones para el paciente, si fuera necesario, para preparar la disoluci6n final y para utilizar dicha disoluci6n final a lo largo de un periodo de veinticuatro horas o mas para el producto humedo/seco, de dos viales. Para el producto de disoluci6n de un solo vial, la etiqueta indica que dicha disoluci6n se puede utilizar a lo largo de un periodo de veinticuatro horas o mas. Los productos reivindicados ahora son utiles para su uso en productos farmaceuticos humanos.
Las formulaciones conservadas estables se pueden proporcionar a los pacientes en forma de soluciones claras. La disoluci6n puede ser para un solo uso o se puede reutilizar multiples veces y puede bastar para un solo ciclo o para multiples ciclos de tratamiento del paciente y de ese modo proporciona un regimen de tratamiento mas conveniente que el disponible en la actualidad.
El interfer6n, en cualquiera de las formulaciones o soluciones estables o conservadas descritas en la presente memoria, puede ser administrado a un paciente de acuerdo con la presente invenci6n a traves de una variedad de metodos de liberaci6n incluyendo la inyecci6n SC o IM; transdermica, pulmonar, transmucosal, implante, bomba osm6tica, cartucho, micro-bomba, oral, u otros medios apreciados por el experto en la tecnica, como es bien sabido en la tecnica.
El termino "vial" hace referencia en sentido amplio a un reservorio utilizado para retener el interfer6n en forma s6lida
o liquida en un estado esteril contenido. Los ejemplos de viales segun se utiliza en la presente memoria incluyen ampollas, cartuchos, envases de tipo burbuja, u otros reservorios semejantes adecuados para la liberaci6n del interfer6n al paciente por medio de una jeringa, bomba (incluyendo osm6tica), cateter, parche transdermico, pulverizaci6n pulmonar o transmucosal. Los viales adecuados para los productos envasados para la administraci6n parenteral, pulmonar, transmucosal, o transdermica son bien conocidos y admitidos en la tecnica.
Descripci6n de las Figuras (Ejemplos Comparativos)
Figura 1: muestra la cinetica de agregaci6n del interfer6n beta-1 a 0,116 mg/mL (5,16 IM) en PEG/PBS, despues de la incubaci6n a 62+/-2°C 10 min., en presencia de diferentes concentraciones de HPBCD: 1,19 mg/mL (exceso molar de 150 veces con respecto a la cantidad molar de interfer6n beta-1a), 3,97 mg/mL (exceso molar de 500 veces con respecto a la cantidad molar de interfer6n beta-1a), 5,56 mg/mL (exceso molar de 700 veces con respecto a la cantidad molar de interfer6n beta-1a) y 7,94 mg/mL (exceso molar de 1000 veces con respecto a la cantidad molar de interfer6n beta-1a). En el eje de las Y se informa sobre la densidad 6ptica medida a 360 nm que es directamente proporcional a la turbidimetria (Cancellieri et al, BIOPOLYMERS, VOL 13, 735-743,1974).
Figura 2: muestra el efecto de un exceso molar de 10.000, 20.000 y 40.000 de manitol sobre la agregaci6n de 0,116 mg/mL (5,1 IM) de interfer6n beta-1a en PBS/PEG 10000 (despues de la incubaci6n a 62 ± 3°C 10 min).
Figura 3: muestra la cinetica de agregaci6n del interfer6n beta-1a en presencia de diferentes concentraciones de Lmetionina: 0,077 mg/mL (exceso molar de 100 veces con respecto a la cantidad molar de interfer6n beta-1a), 0,158 mg/mL (exceso molar de 205 veces con respecto a la cantidad molar de interfer6n beta-1a), 0,308 mg/mL (exceso molar de 400 veces con respecto a la cantidad molar de interfer6n beta-1a), 0,769 mg/mL (exceso molar de 1000 veces con respecto a la cantidad molar de interfer6n beta-1a) y 7,69 mg/mL (exceso molar de 10000 veces con respecto a la cantidad molar de interfer6n beta-1a).
Figura 4: muestra la cinetica de agregaci6n del interfer6n beta-1a solo y en presencia de un exceso molar de 400 veces de metionina con respecto a la cantidad molar de interfer6n beta-1a (0,308 mg/mL) y/o un exceso molar de 700 veces de HPBCD con respecto a la cantidad molar de interfer6n beta-1a (5,56 mg/mL).
Figura 5: muestra el efecto de un exceso molar de 50 veces de L-ascorbato con respecto a la cantidad molar de interfer6n beta-1a (0,045 mg/mL), un exceso molar de 150 veces con respecto a la cantidad molar de interfer6n beta-1a (0,136 mg/mL), un exceso molar de 500 veces con respecto a la cantidad molar de interfer6n beta-1a (0,453 mg/mL) y un exceso molar de 10000 veces con respecto a la cantidad molar de interfer6n beta-1a (9,07 mg/mL) sobre la agregaci6n del interfer6n beta-1a 0,116 mg/mL (5,16 IM) en PEG/PBS, despues de la incubaci6n a 62+/-2°C, 10 minutos.
Figura 6: informa sobre la desnaturalizaci6n termica del interfer6n beta-1a en masa (aproximadamente 44 Ig/mL) (esto es, el efecto de la temperatura sobre la senal DC a 222 nm) en la porci6n superior de la figura y el espectro de DC relativo antes (linea continua) y despues (linea discontinua) la transici6n de fusi6n en la porci6n inferior de la figura. En adelante se informa de las respectivas desconvoluciones de CDNN (Red Neural de Dicroismo Circular) (media de cuatro analisis).
N.B.: La curva de transici6n de fusi6n o desnaturalizaci6n termica representa el efecto de la temperatura sobre la senal de DC a 222 nm. Todos los graficos de DC tienen en el eje de la Y la elipticidad molar en forma de grados
M-1
cm-1(eje Y)
En la tabla se ha considerado la helice alfa residual en el intervalo de 200-260 nm para la comparaci6n de la estabilidad conformacional de IFN en las desconvoluciones CDNN pre/post fusi6n (media de cuatro analisis).
Figura 7: se informa sobre la curva de desnaturalizaci6n termica para una disoluci6n que contiene interfer6n beta-1a aproximadamente 44 Ig/mL y HPBCD 2,11 mg/mL (exceso molar de 700 veces con respecto a la cantidad molar del interfer6n beta-1a), esto es, el efecto de la temperatura sobre la senal de DC a 222 nm, expresado como la elipticidad molar, grados M-1cm-1.En la parte superior de la figura (linea continua), comparado con la proteina sola (linea discontinua) y el espectro de DC relativo antes (linea continua) y despues (linea discontinua) de la transici6n de fusi6n en la parte inferior de la figura. En adelante se informa sobre las respectivas desconvoluciones de CDNN (Red Neural de Dicroismo Circular) (media de tres analisis).
Figura 8: muestra la desnaturalizaci6n termica del interfer6n beta-1a solo (curva discontinua) y en presencia de un exceso molar de 500 veces de L-ascorbato de Na con respecto a la cantidad molar de interfer6n beta-1a (curva continua).
Figura 9: muestra el espectro de DC [interfer6n beta-1a/ascorbato 500x] antes (curva continua) y despues (curva discontinua) de la transici6n de fusi6n y las respectivas desconvoluciones CDNN (vease mas arriba).
Figura 10: muestra la cinetica de agregaci6n del interfer6n beta-1a 0,116 mg/mL (5,16 IM) en PEG/PBS (pH final = 4,7) despues de la incubaci6n a 62 +/- 2°C 10 min. y el efecto de un exceso M de 700x de HPBCD (5,56 mg/mL). En el eje de la Y se informa sobre la densidad 6ptica medida a 360 nm que es directamente proporcional a la turbidimetria.
Figura 11: muestra la cinetica de agregaci6n del interfer6n beta-1a 0,116 mg/mL (5,16 IM) en PEG/PBS (pH final = 5,1) despues de la incubaci6n a 62 +/- 2°C 10 min. y el efecto de un exceso M de 700x de HPBCD (5,56 mg/mL) y un exceso M de 500x de RMBCD (3,38 mg/mL).
Figura 12: muestra la cinetica de agregaci6n del interfer6n beta-1a 0,116 mg/mL (5,16 IM) en PEG/PBS (pH final = 5,7) despues de la incubaci6n a 62 +/- 2°C 10 min. y el efecto de un exceso M de 700x de HPBCD (5,56 mg/mL).
Ejemplos Comparativos:
Las siguientes abreviaturas hacen referencia respectivamente a las definiciones de mas abajo:
cm (centimetro), mg (miligramo), Ig (microgramo), min (minuto), mM (milimolar), mL (mililitro), nm (nan6metro), BHT (hidroxitolueno butilado), DC (Dicroismo Circular), EDTA (acido etilendiaminotetraacetico), HPBCD (Hidroxipropilbeta-ciclodextrina), HPLC (Cromatografia Liquida de Alta Resoluci6n), IFN (interfer6n), IM (intra-muscular), DO (Densidad Optica), PBS (Soluci6n Salina tamponada con Fosfato), PEG (Polietilenglicol), RMBCD (metil-betaciclodextrina sustituida al azar), SC (subcutaneo), TFA (acido trifluoro-acetico), TRIS (2-amino 2-hidroximetil-1,3 propanodiol, UV (Ultravioleta), WFI (Agua para Inyectables).
Metodos
Medidas de la Turridimetrra
La agregaci6n de proteinas se control6 durante 30 minutos a 360 nm utilizando un sistema espectrofometrico UVvisible (Perkin Elmer Lambda 40).
Los estudios preliminares establecieron las condiciones operativas en las cuales la proteina presenta un comportamiento de agregaci6n apropiado, esto es diluci6n del interfer6n beta-1a en masa 1:2 con una disoluci6n de PEG 10.000 30 mg/mL en PBS (filtrado con 0,2 Im 0), en un vial de polipropileno, seguido de incubaci6n en un bano de agua termostatico a T= 62 ± 2°C durante 10 min.
Se utilizaron el calentamiento y el PEG con el fin de intensificar el proceso de asociaci6n de proteinas a traves de la desnaturalizaci6n termica y el efecto del volumen de exclusi6n, respectivamente. El analisis de UV visible se realiz6 en una celula que contenia un volumen de muestra de 3 mL (concentraci6n final de interfer6n beta-1a = 0,116 mg/mL).
Cada analisis de la turbidez se repiti6 al menos por triplicado y se inform6 sobre la densidad 6ptica (DO)360nm frente a la curva de tiempo medio. Se compar6 la agregaci6n de la proteina sola con la del interfer6n beta-1a en presencia de excipientes a diferentes concentraciones.
Medidas del Dicroismo Circular
Se realizaron las medidas del DC con un espectropolarimetro Jasco J810 equipado con un controlador de la temperatura Peltier. Las muestras estaban contenidas en una celula de cuarzo de 1 cm tapada y, para los barridos termicos, la tasa de agitaci6n magnetica fue de aproximadamente 150 rpm.
Para el espectro de UV lejano (260-185 nm), se emplearon una concentraci6n de proteina de aproximadamente 44 Ig/mL, una resoluci6n de 0,2 nm y una velocidad de barrido de 2 nm/min con un tiempo de respuesta de 2 segundos y 3 acumulaciones.
Con el fin de controlar la perturbaci6n termica de la estructura secundaria del interfer6n beta-1a, se realiz6 un 5 seguimiento de la senal de DC a 222 nm como una funci6n de la temperatura entre 25°C y 85°C a intervalos de 0,2°C, utilizando una tasa de aumento de la temperatura de 1°C/min y un tiempo de demora de 60 segundos.
Cada medida se realiz6 al menos por triplicado sobre interfer6n beta-1a en masa, como control, y sobre disoluciones de interfer6n beta-1a que contenian diferentes concentraciones de excipientes.
Analisis de Cromatografra de Exclusiin por Tamanos (Sec)
10 Se analizaron formulaciones liquidas de interfer6n beta-1a en momentos puntuales previamente fijados de los estudios de estabilidad, mediante SE-HPLC con el fin de determinar la pureza del interfer6n beta-1a y analizarla (expresada como % de recuperaci6n).
Las condiciones operativas utilizadas fueron:
-
columna cromatografica: TSK G2000 SWXL (7,8 mm DI x 30 cm, 5 I, 125 );
15 - volumen de la inyecci6n: 100 IL; -temperatura de la columna: temperatura ambiente; -temperatura de la muestra: temperatura ambiente;
-velocidad de flujo: 0,5 mL/min; -fase m6vil: agua purificada al 70% v/v (MILLIQ-Millipore) - acetonitrilo al 30% v/v -TFA al 0,2% v/v;
20 -tiempo de proceso: 27 min; -tiempo de equilibrado: 3 min; -longitud de onda: 214 nm; -Se emple6 una curva de calibraci6n, que oscilaba de 25 Ig a 10 Ig, para cuantificar el analisis del
interfer6n beta-1a
Materiales
-Interfer6n beta-1a en masa (Serono S. A., lote G4D024) -PEG 10000 (polietilenglicol) -Lutrol F68 (copolimero de bloques de polioxietileno-polioxipropileno)
30 -L-Metionina
-D-Manitol -Acido L-asc6rbico -Soluci6n Salina Tamponada con Fosfato pH del tamp6n 7,4 ± 0,1 (composici6n: KH2PO4 0,19 g/L,
Na2HPO4.12H2O 2,38 g/L, NaCl 8 g/L) 35 -Hidroxipropil-beta-ciclodextrina
Equipo
-Sistemas de HPLC (Waters y PE) equipado con una columna TSK G2000. -Sistema espectrofotometrico UV-visible (Perkin Elmer Lambda 40) -Espectropolarimetro Jasco J810 equipado con un controlador de la temperatura Peltier
40 -Osm6metro (OSMOMAT 030D, Gonotech)
-
Medidor de la conductividad con el pH MPC 227-Mettler Toledo
-
Equilibrio analitico AG 245 y AG 285 (Mettler Toledo)
-
Pipetas calibradas (Gilson)
-
Placa caliente con agitador magnetico (Stuart Scientific)
-
Bano ultras6nico, Falc
-
Term6metros
Resultados y Discusi6n
Anmlisis de Turbidimetria
Mas abajo se informa sobre el efecto de la agregaci6n de la HPBCD, el manitol y la L-metionina en el interfer6n beta-1a, detectado mediante un metodo de turbidez. Tambien se incluye sal ascorbato de sodio como ejemplo de excipiente que tiene un efecto de intensificaci6n de la agregaci6n.
La Figura 1 muestra la cinetica de agregaci6n del interfer6n beta-1a en presencia de diferentes concentraciones de HPBCD: 1,9 mg/mL (exceso molar de 150 veces con respecto a la cantidad molar de interfer6n beta-1a), 3,97 mg/mL (exceso molar de 500 veces), 5,56 mg/mL (exceso molar de 700 veces) y 7,94 mg/mL (exceso molar de
1.000 veces). Se puede observar que en el intervalo de concentraci6n investigado este excipiente no evita completamente la desestabilizaci6n del interfer6n beta-1a y que las razones molares intermedias muestran el mejor efecto inhibidor.
Se eligi6 un exceso molar de 700 veces como concentraci6n de referencia para la preparaci6n de la formulaci6n de interfer6n beta-1a y posterior caracterizaci6n fisico-quimica (p. ej. dicroismo circular). La concentraci6n de ciclodextrina se expresa mejor en forma de una raz6n molar frente al interfer6n beta-1a (exceso molar en veces) a medida que la concentraci6n varia dependiendo de la cantidad de interfer6n beta-1a utilizada en la preparaci6n y por consiguiente se puede calcular.
La influencia del manitol sobre la agregaci6n de interfer6n beta-1a se control6 despues pero no se encontr6 un efecto significativo ni siquiera a un exceso molar de 40.000 veces (correspondiente a 37,35 mg/mL) en las condiciones utilizadas (62°C en PEG/PBS), como se muestra en la Figura 2.
No obstante se anadi6 manitol a formulaciones liquidas de interfer6n beta-1a con el fin de alcanzar la isotonicidad necesaria para la administraci6n parenteral.
Finalmente, se someti6 a ensayo la L-Metionina en un experimento de turbidimetria. La Figura 3 muestra la cinetica de agregaci6n del interfer6n beta-1a (0,116 mg/mL, en PEG/PBS, despues de la incubaci6n a 62 +/- 2°C, 10') en presencia de diferentes concentraciones de L-metionina.
Se puede observar que la L-metionina tiene menos efecto inhibidor sobre la agregaci6n de proteinas que la HPBCD: incluso a la maxima concentraci6n investigada no evita completamente la desestabilizaci6n del interfer6n beta-1a y la curva alcanza una "meseta" similar a la de control de interfer6n beta-1a.
En la Figura 4, se informa sobre la cinetica de agregaci6n del interfer6n beta-1a solo en presencia de un exceso molar de 400 veces de metionina (0,308 mg/mL) y/o un exceso molar de 700 veces de HPBCD (5,56 mg/mL).
Este experimento se llev6 a cabo con el fin de evaluar eventualmente un efecto sinergico o la interferencia de estos dos excipientes. Esta claro que la metionina no ejerce un efecto protector frente a la agregaci6n de proteinas ademas de la actividad de la ciclodextrina.
Despues de las consideraciones anteriores se confirm6 que la HPBCD estaba jugando un papel principal en la estabilizaci6n del interfer6n beta-1a hacia la agregaci6n y se investig6 adicionalmente la interacci6n entre la proteina y la ciclodextrina por medio del dicroismo circular
Como ejemplo de excipiente que tiene un "efecto negativo" sobre la agregaci6n de proteinas en la Figura 5 se informa sobre la cinetica de turbidez del interfer6n beta-1a en presencia de diferentes concentraciones de sal ascorbato.
El efecto de un exceso molar de 50 veces de L-ascorbato (0,045 mg/mL), un exceso molar de 150 veces (0,136 mg/mL), un exceso molar de 500 veces (0,453 mg/mL) y un exceso molar de 10.000 veces (9,07 mg/mL) sobre la agregaci6n del interfer6n beta-1a 0,116 mg/mL (5,16 IM) en PEG/PBS, despues de una incubaci6n a 62 +/- 2°C., 10 min. se muestra en la Figura 5.
Resulta interesante observar que el efecto sobre la agregaci6n de proteinas varia de una manera dependiente de la concentraci6n: a una elevada concentraci6n las cargas negativas parecen presentar un efecto desestabilizador, mientras a razones molares mas bajas este excipiente parece tener una influencia inhibidora.
No obstante fue posible identificar una concentraci6n (0,453 mg/mL correspondiente a una raz6n molar de excipiente/interfer6n beta-1a igual a 500) que parece impedir la agregaci6n de proteinas.
Despues se seleccion6 el ascorbato como posible excipiente para las formulaciones con interfer6n beta-1a, con el prop6sito de combinar su acci6n antioxidante con un efecto anti-agregaci6n especifico.
Dicroismo Circular
En la Figura 6 se informa sobre el desplegamiento inducido termicamente, entre 25°C y 85°C, y el espectro UV lejano de una muestra de interfer6n beta-1a en masa (aproximadamente 44 Ig/mL). Se puede observar que el valor de Tm estimado es de 64,97 ± 0,31 DC, mientras la desconvoluci6n del espectro muestra una diferencia notable en el contenido de helice a antes y despues de la desnaturalizaci6n, tal como 48,0 frente a 41,2%, respectivamente.
Como comparaci6n, se analiz6 una muestra analoga que contenia hidroxipropil-beta-ciclodextrina mediante dicroismo circular a un exceso molar de 700 veces con respecto a la cantidad molar de interfer6n beta-1a, que es la concentraci6n a la que la agregaci6n de la proteina resulta parcialmente inhibida en el experimento de turbidimetria. En la Figura 7 se informa sobre la desnaturalizaci6n termica para una disoluci6n que contiene interfer6n beta-1a aproximadamente 44 Ig/mL y HPBCD 2,11 mg/mL (exceso molar de 700 veces). El valor de la temperatura de fusi6n estimada fue de 65,46 ± 0,50°C, identico al referente a la proteina sola (64,97°C) en las mismas condiciones operativas (vease la Figura 5).
Aunque la temperatura de fusi6n de la proteina es constante en presencia del aditivo sometido a ensayo, la reversibilidad del desplegamiento termino es muy diferente. Se puede observar que en presencia de HPBCD existe un espacio en la helice a del interfer6n claramente mas pequeno entre la situaci6n de pre-y post-desnaturalizaci6n (aproximadamente una diferencia de 4% frente a aproximadamente 7% para la proteina sola), sugiriendo que la ciclodextrina podria evitar reacciones irreversibles del interfer6n beta-1a, tales como la agregaci6n inducida por calor despues del desplegamiento, o ayudar al replegamiento de la proteina. Estas observaciones son muy interesantes porque encontrar composiciones de formulaci6n que hagan irreversible el desplegamiento puede ser realmente mas importante para la estabilidad a largo plazo (vida util) que elevar la temperatura de fusi6n (vease tambien Arakawa et al, en Adv. Drug Deliv. Rev. 46(1-3):307-326 (2001)).
Con el fin de caracterizar mejor la interacci6n del interfer6n beta-1a con la sal ascorbato de sodio se realiz6 un analisis de DC sobre una muestra de interfer6n beta-1a que contenia un exceso molar de 550 veces de sal ascorbato. En efecto los estudios cineticos de turbidez revelaron que una disoluci6n de ascorbato-interfer6n beta-1a, a una raz6n molar igual a 500, no presenta agregaci6n de proteinas.
En la Figura 8 se muestran el efecto de la temperatura sobre la senal de DC (222 nm) del interfer6n beta-1a (aproximadamente 44 Ig/mL) solo y en presencia de un exceso molar de 500 veces de ascorbato (0,194 mg/mL). En el caso de la muestra que contiene ascorbato no fue posible ajustar la curva del experimento con el fin de estimar el valor de Tm, sugiriendo un efecto desnaturalizante del excipiente hacia la proteina.
En efecto la comparaci6n de la estructura secundaria de la muestra anterior, antes y despues de la transici6n de fusi6n confirm6 un residuo muy bajo de helice alfa ya en la situaci6n de pre-fusi6n, tal como 35,0 (frente a 48,0 del interfer6n beta-1a en masa en las mismas condiciones). La estructura secundaria del interfer6n beta-1a estaba incluso mas alterada por la presencia del ascorbato despues de la transici6n de fusi6n, disminuyendo hasta 28,8% (vease la Figura 9).
Este resultado contrasta con el efecto protector mostrado en la turbidimetria y sugiere que el ascorbato podria inducir cambios conformacionales en el interfer6n beta-1a que podrian desestabilizar la proteina con el tiempo. Por esta raz6n se prepar6 una formulaci6n liquida que contenia ascorbato de sodio, se mantuvo estable a 25°C y se analiz6 en los momentos puntuales previamente fijados por medio de SE-HPLC.
Estudio de Estarilidad
A continuaci6n de los resultados anteriores, se prepararon dos formulaciones liquidas de interfer6n beta-1a, que tenian las composiciones mostradas en la Tabla 1 y en la Tabla 2, y se mantuvieron a 25°C y 50°C a lo largo del tiempo en el caso de FORM 1 y a 25°C en el caso de FORM 2.
Como control, tambien se someti6 a ensayo interfer6n beta-1a en masa (50 mM en tamp6n acetato a la misma concentraci6n).
Tabla 1: Composici6n de la formulaci6n liquida de interfer6n beta-1a que contiene HPBCD (FORM 1)
Intefer6n beta-1a
44 Ig/mL
HPBCD
1,9 mg/mL
Metionina
0,1 mg/mL
Manitol
50 mg/mL
tamp6n acetato (50 mM; pH 3,8) hasta
1 mL
Tabla 2: Composici6n de la formulaci6n liquida de interfer6n beta-1a que contiene ascorbato de sodio (FORM 2)
Intefer6n beta-1a
44 Ig/mL
Ascorbato de sodio
0,2 mg/mL
Lutrol F68
0,8 mg/mL
Manitol
50 mg/mL
tamp6n acetato (50 mM; pH 3,8) hasta
hasta 1 mL
Las muestras del estudio de estabilidad se analizaron mediante SE-HPLC como se ha descrito en la secci6n Metodo y los resultados son referidos en la Tabla 3 (FORM 1), la Tabla 4 (FORM 2) y la Tabla 5 (interfer6n beta-1a en masa/Control).
Tabla 3: Resultados de la SE-HPLC del estudio de estabilidad sobre la formulaci6n FORM 1 a 25°C y 50°C
FORM 1
Tiempo
Inspecci6n visual pureza % area mediante HPLC % recuperaci6n analisis (P/P)
T = 0
clara 96,96 102,9
t = 1 semana/25°C
clara 96,86 100,29
t = 1 mes/25°C
clara 97,06 100,43
FORM 1
Tiempo
Inspecci6n visual pureza % area mediante HPLC % recuperaci6n analisis (P/P)
t = 0
Clara 96,96 102,9
t = 24 h/50°C
Clara 97,56 99,29
t = 48 h/50°C
Clara 97,3 98,79
t = 1 semana/50°C
Clara 95,63 94,31
Tabla 4 Resultados de la SE-HPLC del estudio de estabilidad sobre la formulaci6n FORM 2 a 25°C
FORM 2
Tiempo
Inspecci6n visual pureza % area mediante HPLC % recuperaci6n analisis (P/P)
T = 0 t = 24 h t = 1 semana/25°C t = 1 mes/25°C
clara 97,49 116,2
clara
NA NA
clara
97,84 70,27
clara
60,305� 36,54
� pico de degradaci6n con rrt: 1,13: area 5,37%
Tabla 5: Resultados de la SE-HPLC del estudio de estabilidad sobre la formulaci6n de control de interfer6n beta-1aa 25°C y 50°C
Intefer6n beta 1a en masa
Tiempo
Inspecci6n visual pureza % area mediante HPLC % recuperaci6n analisis (P/P)
t = 0
clara 97,95 102,7
t = 24 h/25°C
clara N/A N/A
t = 1 semana/25°C
clara 97,41 95,73
t = 1 mes/25°C
clara 97,65 93,12
Intefer6n beta 1a en masa
Tiempo
Inspecci6n visual pureza % area mediante HPLC % recuperaci6n analisis (P/P)
t = 24 h/50°C
Clara 93,94 95,90
t = 48 h/50°C
Clara 91,19 94,60
t = 72 h/50°C
Clara 89,32 91,69
t = 1 semana/50°C
Clara 83,42 73,26
A partir de los resultados de la Tabla 3 se puede observar claramente que las formulaciones liquidas de interfer6n beta-1a que contienen HPBCD son estables a 25°C y 50°C a lo largo de un mes: el nivel de agregaci6n es muy bajo, siendo el contenido de mon6mero superior al 90% incluso despues de 1 semana a 50°C. Por anadidura, la recuperaci6n de masa es superior al 90% sugiriendo que tambien la formaci6n de agregados insolubles podria ser minimizada por la presencia de la ciclodextrina.
En comparaci6n el interfer6n beta-1a en masa solo tiende a la agregaci6n a ambas temperaturas consideradas (vease la Tabla 5): a 50°C despues de 1 semana el contenido de mon6mero disminuy6 hasta 83% y en paralelo la recuperaci6n de masa fue solamente de aproximadamente 73%.
Los ultimos resultados concuerdan con las medidas de la turbidimetria y dicroismo circular que han sugerido un efecto beneficioso de la HPBCD sobre la agregaci6n y la estabilidad conformacional del interfer6n beta-1a.
Finalmente, los resultados mostrados en la Tabla 4 relacionados con la FORM 2 (que contiene la sal ascorbato) indican que la formulaci6n no es estable a 25°C: se registr6 un incremento significativo de los dimeros y agregados y un descenso paralelo de la recuperaci6n de masa despues de 1 mes a 25°C. Ademas, apareci6 un pico desconocido en el cromatograma que sugeria la presencia una conformaci6n posiblemente cambiada, como tambien sugerian los resultados del DC. Esta fue la raz6n por la cual la estabilidad de la formulaci6n que contenia ascorbato no se observ6 a temperaturas superiores (p. ej. 50°C).
En el ultimo caso fue importante verificar el resultado inicial prometedor obtenido por medio del analisis de turbidimetria con metodos alternativos tales como el dicroismo circular que es capaz de controlar el efecto de un excipiente conocido sobre la estabilidad de conformaci6n de la proteina.
Analisis de Turridimetrra a un pH Superior
Se investig6 el efecto sobre la agregaci6n del interfer6n beta-1a de la HPBCD en un intervalo de pH mas amplio de la formulaci6n liquida (esto es, un pH de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 4,0).
El metodo consisti6 en el analisis turbidimetrico descrito previamente: se diluy6 interfer6n beta-1a en masa 1:2 con una disoluci6n de PEG 10.000 30 mg/mL en PBS (filtrado a traves de 0-2 Im de 0 y alcalinizado apropiadamente anadiendo un pequeno volumen de NaOH 1N) y despues se incub6 en un bano de agua termostatico a T = 62 ± 2°C durante 10 min. La agregaci6n de proteinas se control6 durante 30 min a 360 nm utilizando un sistema espectrofotometrico UV visible (Perkin Elmer Lambda 40). Cada analisis de turbidez se repiti6 por duplicado y se inform6 sobre la densidad 6ptica (DO)380 min frente a la curva media del tiempo. La agregaci6n de la proteina sola se compar6 con el interfer6n beta-1a en presencia de ciclodextrina.
La diluci6n del tamp6n acetato 50 mM (esto es, medio con IFN en masa) 1:1 mediante PBS conduce a un pH de la disoluci6n final de 4,4. El prop6sito fue por lo tanto investigar la agregaci6n de la proteina para un pH final mas elevado.
La Figura 10 muestra la cinetica de agregaci6n del interfer6n beta-1a en ausencia y en presencia de un exceso molar de 700x de HPBCD (5,56 mg/mL), con un pH de la disoluci6n analizada igual a 4,7 a la temperatura ambiente.
Se puede observar que un incremento del pH aumenta el grado de agregaci6n del IFN, pero la presencia de ciclodextrina todavia inhibe parcialmente la desestabilizaci6n de la proteina. El porcentaje de DO relativa (esto es, la raz6n en porcentaje entre la DO a 96 nm despues de 30 minutos en presencia y en ausencia del excipiente) calculado para este experimento es del 66%, no muy lejos del observado en las condiciones operativas habituales a un pH mas bajo (52,7%).
El estudio se ampli6 a un pH mas elevado, esto es, 5,1, como se muestra en la Figura 11: se investig6 el efecto de la HPBCD a un exceso molar de 700 (5,56 mg/mL) y de RMBCD a un exceso molar de 500 (3,38 mg/mL) sobre la agregaci6n del IFN. Se puede observar una desestabilizaci6n de la proteina mas marcada debido al incremento del pH y la casi total ausencia de una pauta cinetica (esto es, regi6n meseta al principio del analisis). El descubrimiento interesante es que la agregaci6n del IFN todavia es parcialmente inhibida por las ciclodextrinas, con un porcentaje de DO relativa igual a 69,7% en el caso de la HPBCD (no se puede observar ninguna ventaja debida al uso del derivado metilado en este caso).
Se investig6 un tercer valor de pH. La Figura 12 muestra la cinetica de agregaci6n del IFN en PEG/PBS a un pH de 5,7 y el efecto de la adici6n de un exceso molar de 700x de HPBCD. El excipiente no evita la desestabilizaci6n de la proteina, pero reduce significativamente su grado con respecto al control de IFN (porcentaje de DO relativa 62,5%).
Las consideraciones anteriores indican que el uso de la HPBCD como excipiente estabilizador se podria ampliar a la formulaci6n liquida a un pH superior al valor caracteristico de la proteina en masa (esto es, pH 3,8 ± 0,5).
Conclusiones
-
Se prepararon algunas formulaciones liquidas de interfer6n beta-1a y se mantuvieron en condiciones de estabilidad a la temperatura ambiente (25°C) y en condiciones aceleradas (50°C).
-
La formulaci6n mas estable contiene L-metionina, HPBCD y manitol. Los resultados de la SE-HPLC muestran un contenido de mon6mero por encima del 90% despues de 1 semana a 50°C o 1 mes a 25°C.
-
El resultado positivo de la HPBCD fue anticipado y confirmado por la medida de la turbidimetria que mostraba un efecto de inhibici6n dependiente de la concentraci6n de este excipiente, (y parcialmente tambien de la L-metionina), hacia la agregaci6n del interfer6n beta-1a. Ademas el analisis de DC demostr6 que en presencia de HP-beta-ciclodextrina existe una perdida de la helice a del intefer6n beta-1a claramente mas pequena despues de la transici6n de fusi6n.
-
El interfer6n beta-1a en masa, mantenido en las mismas condiciones de almacenamiento, presenta un perfil de estabilidad diferente; el contenido de mon6mero disminuy6 hasta el 83% despues de 1 semana a 50°C.
Es digno de observar que a 25°C el contenido de mon6mero despues de 1 mes todavia es igual a 97%, lo que es sorprendentemente elevado. Este resultado podria ser explicado por el hecho de que el grueso contiene tamp6n acetato a pH 3,8. Esta condici6n tiene a su vez un cierto grado de efecto estabilizador para el interfer6n beta-1a.
-
Se encontr6 un resultado negativo claro en el estudio de estabilidad con la formulaci6n que contenia sal ascorbato. La SEC muestra una perdida de mon6mero notable (por debajo de 60%) a 25°C al cabo de 1 mes. Paralelamente tambien se mostr6 un efecto negativo sobre la conformaci6n del interfer6n beta-1a por medio del DC. Manufacturaciin Farmaceutica Preparaciin de Soluciin de Hidrixido de Sodio 1M
Se prepar6 una disoluci6n de hidr6xido de sodio 1 M en WFI.
Preparaciin de Tampin Acetato de Sodio 0,05 M pH 3,8 (100 mL)
En un matraz volumetrico que contenia 80 mL agua MilliQ, se anadieron 0,286 mL de acido acetico (Glacial), y, despues de sacudir, se anadieron 0,500 mL de NaOH 1M y agua hasta 100 mL; pH = 3,8 ± 0,05.
Preparaciin de la Soluciin de Excipiente
Se prepara una disoluci6n concentrada (10 veces) de HPBCD y L-Metionina en tamp6n acetato en un matraz volumetrico de polipropileno.
En el matraz de polipropileno se anade la cantidad adecuada de tamp6n acetato 50 mM que contiene 5 g de manitol. La disoluci6n se lleva a la homogeneidad volteando arriba y abajo tres veces.
Elaroraciin de la Soluciin de la Sustancia Farmaco
Se anade la cantidad requerida B (g) de la sustancia farmaco interfer6n beta-1a a la cantidad requerida de disoluci6n de excipiente V (g) y se agitan suavemente hasta su homogeneidad.
Llenado de Jeringas
Se pueden cargar asepticamente jeringas de 1 ml con 0,5 ml de la disoluci6n final.
REFERENCIAS
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38.
Patente de los Estados Unidos Num. 4.695.623;
39.
Patente de los Estados Unidos Num. 4.588.585.

Claims (23)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una composici6n farmaceutica liquida estabilizada que comprende un interfer6n beta (IFN-beta) o una de sus sales, donde dicha formulaci6n es una disoluci6n que comprende un tamp6n acetato, 2-hidroxipropil-betaciclodextrina ("HPBCD"), manitol y metionina y donde dicha HPBCD esta presente a una raz6n molar frente a dicho IFN-beta de un exceso molar de 500 a un exceso molar de 700 veces.
  2. 2.
    La composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 1, donde dicho IFN-beta es IFN-beta humano recombinante.
  3. 3.
    La composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 1 o 2, donde dicho tamp6n acetato esta presente en una cantidad suficiente para mantener el pH de dicha composici6n a mas o menos 0,5 unidades de un pH especificado, donde el pH especificado es de 3 a 6.
  4. 4.
    La composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 3, donde dicho pH es de 3,8.
  5. 5.
    La composici6n de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho tamp6n acetato esta presente a una concentraci6n de 5 mM a 500 mM.
  6. 6.
    La composici6n de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho tamp6n acetato esta presente a una concentraci6n de 50 mM.
  7. 7.
    La composici6n de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho manitol esta presente a una concentraci6n de 0,5 mg/ml a 500 mg/ml.
  8. 8.
    La composici6n de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho manitol esta presente a una concentraci6n de 50 mg/ml.
  9. 9.
    La composici6n de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha metionina esta presente a una concentraci6n de 0,01 mg/ml a 5 mg/ml.
  10. 10.
    La composici6n de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha metionina esta presente a una concentraci6n de 0,1 mg/ml.
  11. 11.
    La composici6n de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho IFN-beta esta presente a una concentraci6n de 10 Ig/ml a 800 Ig/ml.
  12. 12.
    La composici6n de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho IFN-beta esta presente a una concentraci6n de 44, 88 o 276 Ig/ml.
  13. 13.
    La composici6n de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha composici6n es una disoluci6n acuosa.
  14. 14.
    La composici6n de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente un agente bacteriostatico.
  15. 15.
    La composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 14, donde dicho agente bacteriostatico es alcohol bencilico.
  16. 16.
    La composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 14 o 15, donde dicho agente bacteriostatico esta presente a una concentraci6n de 0,1% a 2%.
  17. 17.
    La composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 16, donde dicho agente bacteriostatico esta presente a una concentraci6n de 0,2 o 0,3%.
  18. 18.
    La composici6n de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la composici6n es la siguiente formulaci6n liquida:
    Interfer6n beta-1a
    44 Ig/mL
    HPBCD
    1,9 mg/mL
    Metionina
    0,1 mg/mL
    Manitol
    50 mg/mL
    tamp6n acetato
    mL
    hasta
  19. 19. Un metodo para preparar una composici6n farmaceutica liquida estabilizada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, donde dicho metodo comprende anadir cantidades calculadas de 2-hidroxipropil-betaciclodextrina, metionina y manitol a la disoluci6n tamponada y despues anadir el interfer6n beta (IFN-beta) o una de
    5 sus sales.
  20. 20.
    Un recipiente sellado hermeticamente en condiciones esteriles y apropiadas para el almacenamiento antes de su uso, que comprende la formulaci6n farmaceutica liquida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.
  21. 21.
    El recipiente de acuerdo con la reivindicaci6n 20, donde dicho recipiente es una jeringa pre-cargada para la administraci6n de mono-dosis.
    10 22. El recipiente de acuerdo con la reivindicaci6n 20, donde dicho recipiente es un vial.
  22. 23.
    El recipiente de acuerdo con la reivindicaci6n 20, donde dicho recipiente es un cartucho para un autoinyector.
  23. 24.
    El recipiente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, donde dicho recipiente es para la administraci6n de una sola dosis o de multiples dosis.
    Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura a Figura 5 Figura 6
    Contenido estructura secundaria pre-fusi6n:
    190-200 nm
    195-260 nm 200-260 nm 205-260 nm 210-260 nm
    5
    Helice 37,88% 45,33% 47,95% 48,63% 47,78%
    Antiparalela
    5,95% 4,78% 5,30% 5,28% 5,28%
    Paralela
    7,73% 6,28% 5,85% 5,73% 6,03%
    Giro beta
    16,33% 14,80% 14,45% 14,50% 14,50%
    Enroll. al azar
    29,55% 24,18% 24,18% 24,08% 24,80%
    10
    Contenido estructura secundaria post-fusi6n:
    190-200 nm
    195-260 nm 200-260 nm 205-260 nm 210-260 nm
    Helice
    33,58% 39,38% 41,18% 41,98% 41,03%
    Antiparalela
    8,95% 6,58% 6,58% 6,26% 6,45%
    15
    Paralela 8,45% 7,28% 7,28% 6,95% 7,13%
    Giro beta
    17,15% 15,75% 15,75% 15,38% 15,58%
    Enroll. al azar
    31,40% 28,40% 28,40% 27,70% 28,43%
    Figura �
    Contenido estructura secundaria pre-fusi6n:
    5
    190-200 nm 195-260 nm 200-260 nm 205-260 nm 210-260 nm
    Helice
    32,87% 41,13% 42,97% 42,83% 42,27%
    Antiparalela
    8,90% 5,70% 6,13% 6,10% 6,20%
    Paralela
    8,83% 7,10% 8,73% 8,73% 6,90%
    Giro beta
    17,20% 15,37% 15,13% 15,23% 15,30%
    10
    Enroll. al azar 33,23% 28,57% 27,20% 27,23% 27,63%
    Contenido estructura secundaria post-fusi6n:
    190-200 nm
    195-260 nm 200-260 nm 205-260 nm 210-260 nm
    Helice
    30,03% 37,40% 39,03% 39,10% 38,37%
    15
    Antiparalela 11,93% 7,07% 7,00% 6,73% 7,00%
    Paralela
    9,37% 7,77% 7,50% 7,63% 7,60%
    Giro beta
    17,83% 16,03% 15,83% 15,77% 15,93%
    Enroll. al azar
    34,37% 30,30% 29,27% 29,47% 29,90%
    Figura �
    Figura �
    Contenido estructura secundaria pre-fusi6n:
    190-200 nm
    195-260 nm 200-260 nm 205-260 nm 210-260 nm
    5
    Helice 25,50% 30,30% 35,00% 30,60% 28,70%
    Antiparalela
    21,70% 11,40% 8,70% 8,80% 9,80%
    Paralela
    9,80% 9,20% 8,40% 9,90% 10,00%
    Giro beta
    19,30% 17,60% 17,20% 17,50% 17,90%
    Enroll. al azar
    33,70% 32,60% 30,00% 34,80% 36,30%
    10
    Contenido estructura secundaria post-fusi6n:
    190-200 nm
    195-260 nm 200-260 nm 205-260 nm 210-260 nm
    Helice
    24,20% 25,60% 28,80% 21,70% 20,70%
    Antiparalela
    18,70% 13,20% 10,30% 11,50% 13,20%
    15
    Paralela 11,20% 11,50% 10,70% 13,60% 12,80%
    Giro beta
    18,50% 18,20% 18,00% 19,10% 19,80%
    Enroll. al azar
    40,50% 40,00% 37,40% 43,00% 43,40%
    Figura 1� Figura 11 Figura 12
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