MXPA06006579A - Formulaciones liquidas de interferon estabilizadas - Google Patents

Abstract

Aquíse describe una composición farmacéutica líquida estabilizada que comprende un interferón (IFN) o una isoforma, muteína, proteína fusionada, derivado funcional, fracción activa o sal del mismo, en donde dicha formulación es una solución que comprende un regulador de pH, una ciclodextrina, un agente de isotonicidad y un antioxidante;preferiblemente el interferón es interferón beta-1a y la ciclodextrina es HPBCD;estas formulaciones son estables a temperatura ambiente, teniendo asíla ventaja de costos más bajos para almacenamiento de la formulación y seguridad incrementada para el paciente con respecto a posibles"errores"durante el manejo;de hecho, al tener dichas formulaciones estables a temperatura ambiente se reduce el riesgo de formación de productos de degradación potencialmente responsable de eventos adversos (v.gr., inmunogenicidad).

Description

FORMULACIONES LIQUIDAS DE 1NTERFERON ESTABILIZADAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere generalmente a una composición farmacéutica líquida estabilizada que comprende un interferón (IFN) o una isoforma, muteína, proteína fusionada, derivado funcional, fracción activa o sal del mismo, en donde dicha formulación es una solución que comprende un regulador de pH, una ciclodextrina, un agente de isotonicidad y un antioxidante y uso del mismo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los interferones son citocinas, es decir, proteínas solubles que transmiten mensajes entre células y juegan un papel esencial en el sistema inmune al ayudar a destruir microorganismos que causan infección y a reparar cualquier daño resultante. Los ¡nterferones son naturalmente secretados por células infectadas y fueron identificados por primera vez en 1957. Su nombre se deriva del hecho de que "interfieren" con la replicación y producción viral. Los interferones presentan tanto actividad antiviral como antiproliferativa. Con base en las propiedades bioquímicas e inmunológicas, los interferones humanos que ocurren en forma natural se agrupan en tres clases principales: interferón-alfa (leucocitos), interferón-beta (fibroblastos) e interferón-gamma (inmune). El alfa-interferón es actualmente aprobado en los Estados Unidos y en otros países para el tratamiento de leucemia de células pilosas, verrugas venéreas, sarcoma de Kaposi (un cáncer que comúnmente afecta a pacientes que padecen síndrome de ¡nmunodeficiencia adquirida (SIDA)), y hepatitis no-A, no-B crónica. Además, los interferones (IFNs) son glicoproteínas producidas por el cuerpo en respuesta a una infección viral. Inhiben la multiplicación de virus en células protegidas. Consistiendo de una proteína de peso molecular más bajo, los IFNs son remarcablemente no específicos en su acción, es decir, el IFN inducido por un virus es efectivo contra un amplio espectro de otros virus. Sin embargo, son específicos de la especie, es decir, el IFN producido por una especie únicamente estimulará la actividad antiviral en células de la misma especie o una especie estrechamente relacionada. Los IFNs fueron el primer grupo de citocinas por ser explotado para sus actividades antitumorales y antivirales potenciales. Los tres IFNs principales son referidos como IFN-a, IFN-ß y IFN-?. Dichos tipos principales de IFNs inicialmente se clasificaron de acuerdo con sus células de origen (leucocito, fibroblasto o células T). Sin embargo, se hizo claro que varios tipos podían ser producidos por una célula. De esta manera, el IFN de leucocito ahora se denomina IFN-a, el IFN de fibroblasto es IFN-ß y el IFN de células T es IFN-?. Existe un cuarto tipo de IFN, el IFN de linfoblastoide, producido en la línea de células "Namalwa" (derivadas de linfoma de Burkitt), que parece producir una mezcla de IFN tanto de leucocitos como de fibroblastos. La unidad de interferón o unidad internacional para interferón (U o IU, para unidad internacional) ha sido reportada como una medida de actividad de IFN definida como la cantidad necesaria para proteger 50% de las células contra daño viral. La prueba que se puede usar para medir bioactividad es la prueba de inhibición de efecto citopático como se describe (Rubinstein, et al. 1981 ; Familletti, P. C, et al, 1981). En esta prueba antivira! para ¡nterferón aproximadamente 1 unidad/ml de ¡nterferón es la cantidad necesaria para producir un efecto citopático de 50%. Las unidades se determinan con respecto al estándar de referencia internacional para Hu-IFN- beta provisto por National Institutes of Health (Pestka, S. 1986). Cada clase de IFN contiene varios tipos distintos. IFN-ß e IFN-? son cada uno el producto de un solo gen. Las proteínas clasificadas como IFNs-a son el grupo más diverso, conteniendo aproximadamente 15 tipos. Existe una agrupación de genes de IFN-a en el cromosoma 9, que contiene por lo menos 23 miembros, de los cuales 15 son activos y transcritos. Los IFNs-a maduros no son glicosilados. Los IFNs-a y IFN-ß son todos de la misma longitud (165 ó 166 aminoácidos) con actividades biológicas similares. Los IFNs-? son 146 aminoácidos de longitud y se asemejan a las clases a y ß menos estrechamente. Sólo los IFNs-? pueden activar macrófagos o inducir la maduración de células T asesinas. Esos nuevos tipos de agentes terapéuticos pueden ser algunas veces llamados modificadores de respuesta biológica (BRMs), porque tienen un efecto sobre la respuesta del organismo al tumor, afectando el reconocimiento por inmunomodulación. El interferón de fibroblasto humano (IFN-ß) tiene actividad antiviral y también puede estimular las células asesinas naturales contra células neoplásicas. Es un polipéptido de aproximadamente 20,000 Da inducido por virus y ARN de doble cadena. A partir de la secuencia de nucleótidos del gen para interferón de fibroblasto, clonado por tecnología de ADN recombinante (Derynk et al. 1980), se dedujo la secuencia de aminoácidos completa de la proteína. Es de 166 aminoácidos de longitud. Shepard et al. (1981) describen una mutación en la base 842 (Cys - Tyr en la posición 141) que anula su actividad antiviral, y un clon variante con una deleción de nucleótidos 1119-1121. Mark et al. (1984) insertaron una mutación artificial reemplazando la base 469 (T) con (A) causando un desplazamiento de aminoácidos de Cys -» Ser en la posición 17. Se reportó que el IFN-ß resultante era activo como el IFN-ß "nativo" y estable durante el almacenamiento a largo plazo (-70°C). Rebif® (Serono - interferón humano recombinante-ß), el más reciente desarrollo en terapia de ¡nterferón para esclerosis múltiple (MS), es interferón (IFN)-beta-la, producido a partir de líneas de células de mamífero. Su nombre sin propietario internacional (INN) es "Interferón beta-1a". Igual que con todos los compuestos farmacéuticos a base de proteína, un principal obstáculo que debe ser superado en el uso de IFN-beta como un agente terapéutico, es la pérdida de eficacia farmacéutica que puede resultar en su inestabilidad en formulaciones farmacéuticas. Las inestabilidades físicas que amenazan la actividad y la eficacia del polipéptido en formulaciones farmacéuticas incluyen desnaturalización y formación de agregados solubles e insolubles, mientras que las inestabilidades químicas incluyen hidrólisis, formación de imida, oxidación, racemización y desamidación. Se sabe que algunos de esos cambios conducen a la pérdida o reducción de la actividad farmacéutica de la proteína de interés. En otros casos, los efectos precisos de estos cambios se desconocen, pero aún se considera que los productos degenerativos resultantes son farmacéuticamente inaceptables debido al potencial para efectos colaterales indeseables. La estabilización de polipéptidos en composiciones farmacéuticas sigue siendo un área en la cual la prueba y error juega un papel importante (revisado por Wang (1999) Int. J. Pharm. 185:129-188; Wang y Hanson (1988) J. Parenteral Sci. Tech. 42:S3-S26). Excipientes que se añaden a formulaciones farmacéuticas de polipéptido para incrementar su estabilidad incluyen reguladores de pH, azúcares, agentes tensioactivos, aminoácidos, polietilenglicoles y polímeros, pero los efectos estabilizadores de estos aditivos químicos varían dependiendo de la proteína. Las ciclodextrinas son oligosacáridos cíclicos. Las ciclodextrinas más comunes son alfa-ciclodextrina, que está compuesta de seis anillos de residuos de glucosa; beta-ciclodextrina, que está compuesta de un anillo de siete residuos de glucosa; y gamma-ciclodextrina, que está compuesta de un anillo de ocho unidades de glucosa. La cavidad interna de una ciclodextrina es lipofílica, mientras que el exterior de la ciclodextrina es hidrofílica; esa combinación de propiedades ha conducido a un estudio ampliamente diseminado de las ciclodextrinas, particularmente en conexión con compuestos farmacéuticos, y se han reportado muchos complejos de inclusión. La beta-ciclodextrina ha sido de especial interés debido a su tamaño de cavidad, pero su solubilidad acuosa relativamente baja (aproximadamente p/v a 25°C) y nefrotoxicidad consecuente han limitado su uso en el campo farmacéutico. Intentos para modificar las propiedades de ias ciclodextrinas naturales han dado por resultado el desarrollo de polímero de heptakis (2,6-di- 0-metil)-beta-ciclodextrina, heptakis (2,3,6-tri-0-metil)-beta-ciclodextrina, hidroxipropil-beta-ciclodextrina, beta-ciclodextrina-epiclorohidrina y otros. Para una revisión completa de ciclodextrinas y su uso en investigación farmacéutica, véase Pitha et al, en Controlled Drug Deliver, ed. S. D. Bruck, Vol I, CRC Press, Boca Ratón, Fia., pp. 125-148 (1983). Para una vista general más reciente, véase Uekama et al, en CRC Crítical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, Vol. 3 (1), 1-40 (1987); Uekama, en Topics in Pharmaceutical Sciences 1987, eds. D. D. Breimer and P. Speiser, Elsevier Science Publishers B. V. (Bíomedical División), 181-194 (1987); y Pagington, Chemistry in Britain, pp. 455-458 (Mayo 1987). El uso de ciclodextrinas específicamente en el campo de suministro de péptidos y proteína ha sido revisado por T. Irle et al en Adv. Drug Deliv. Rev, Vol 36, 101-123 (1999) y ejemplos en el caso de hormona de crecimiento de ovino, interleucina-2 e insulina de bovino se describen en Brewster et al., 1991, Pharmaceutical Research, 8(6), 792-795. Los documentos WO 90/03784 y US 5,997,856 describen un método para la solubilización y/o estabilización de polipéptidos, especialmente proteínas, por medio de ciclodextrinas. Sin embargo, no se reportan datos sobre la estabilización de interferones en este documento. El documento US 6,582,728 describe composiciones de polvo seco para administración pulmonar que contienen interferón-beta que también contienen albúmina de suero humano, que pueden contener además ciclodextrinas. Sin embargo, incluso en este caso no se reportan datos sobre la estabilización de la composición de interferón que contiene también ciclodextrinas en este documento. El documento WO 2003/002152 describe composiciones estabilizadas que comprenden una molécula de interferón y un derivado de específico de ciclodextrina, es decir, ciclodextrina de éter sulfoalquílico. Consecuentemente, existe la necesidad de composiciones farmacéuticas de IFN-beta adicionales que comprenden estabilizadores fisiológicamente compatibles que mejoran la solubilidad de esta proteína y estabilizan la proteína contra formación de agregados, instrumentando así su utilidad farmacéutica.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a composiciones farmacéuticas estabilizadas que comprenden un interferón (IFN), métodos para su preparación y uso de las mismas. En particular, el principal objeto de la invención es proveer una composición farmacéutica líquida estabilizada que comprende un interferón (IFN) o una isoforma, muteína, proteína fusionada, derivado funcional, fracción activa o sal del mismo, en donde dicha formulación es una solución que comprende un regulador de pH, una ciclodextrina, preferiblemente un agente de isotonicidad y un antioxidante. Las composiciones se preparan preferiblemente en ausencia de albúmina de suero humano (HSA) y por lo tanto son libres de este excipiente farmacéutico. Dichas composiciones se refieren aquí como composiciones farmacéuticas IFN "libres de HSA" y comprenden un ¡nterferón (IFN) o una isoforma, muteína, proteína fusionada, derivado funcional, fracción activa o sal del mismo. De conformidad con una modalidad de la presente invención, las composiciones también comprenden un agente bacteriostático. Un "interferón" o "IFN", como se usa aquí, incluye cualquier molécula definida como tal en la literatura, que comprende por ejemplo cualesquiera tipos de IFNs mencionados en la sección anterior "Antecedentes de la invención". En particular, IFN-a, IFN-ß y IFN-? se incluyen en la definición anterior. IFN-ß es el IFN preferido de conformidad con la presente invención. IFN-ß adecuado de conformidad con la presente invención está comerciaimente disponible, v.gr., como Rebif® (Serono), Avonex® (Biogen) o Betaferon ® (Schering). El uso de interferones de origen humano también es preferido de conformidad con la presente invención. El término ¡nterferón, como se usa aquí, abarca sales, derivados funcionales, variantes, análogos y fragmentos activos del mismo. El término "¡nterferón-beta (IFN-beta o IFN-ß)", como se usa aquí, incluye interferón de fibroblasto en particular de origen humano, como se obtiene mediante aislamiento a partir de fluidos biológicos o como se obtiene mediante técnicas de ADN recombinante a partir de células hospedero procarióticas o eucarióticas, así como sus sales, derivados funcionales, variantes, análogos y fragmentos activos del mismo. El IFN-beta preferiblemente significa interferón beta-1a. Como se usa aquí, el término "muteínas" se refiere a análogos de IFN en los cuales uno o más de los residuos de aminoácidos de un IFN natural son remplazados por diferentes residuos de aminoácidos, o son deletados, o uno o más residuos de aminoácidos son agregados a la secuencia natural del IFN, sin cambiar considerablemente la actividad de los productos resultantes en comparación con el IFN de tipo silvestre. Estas muteínas se preparan por síntesis conocida y/o por técnicas de mutagénesis dirigida al sitio, o cualquier otra técnica conocida adecuada para el mismo. Las muteínas preferidas incluyen, v.gr., aquellas descritas por Shepard et al. (1981) o Mark et al. (1984).

Cualquiera de dichas muteínas preferiblemente tiene una secuencia de aminoácidos suficientemente duplicativa de la de IFN, de tal manera que tiene una actividad sustancialmente similar o incluso mejor a un IFN. La función biológica de interferón es bien conocida por un experto en la técnica, y los estándares biológicos se establece y están disponibles, v.gr., del National Institute for Biological Standards and Control (http://immunoloqv.org/links/NIBSC). Se han descrito bioensayos para la determinación de actividad de IFN. Una prueba de IFN se puede llevar a cabo, por ejemplo, como lo describe Rubinstein et al., 1981. Por lo tanto, se puede determinar si cualquier muteína dada tiene sustancíalmente una actividad similar, o incluso mejor, que IFN por medio de experimentación de rutina. Las muteínas de IFN, que se pueden usar de conformidad con la presente invención, o ácido nucleico que codifica para el mismo, incluyen un conjunto finito de secuencias sustancialmente correspondientes como péptidos o polinucleótidos de sustitución que pueden ser obtenidos rutinariamente por un experto en la técnica, sin experimentación adicional, con base en las enseñanzas y guía aquí presentadas. Cambios preferidos para muteínas de conformidad con la presente invención son lo que se conoce como sustituciones "conservativas".

Las sustituciones de aminoácidos conservativas de polipéptidos o proteínas de la invención, pueden incluir aminoácidos sinónimos dentro de un grupo, que tienen propiedades fisicoquímicas suficientemente similares. Esa sustitución entre miembros del grupo conservará la función biológica de la molécula. Esta claro que las inserciones y deleciones de aminoácidos también se pueden hacer en las secuencias anteriormente definidas sin alterar su función, particularmente si las inserciones o deleciones sólo implican a unos cuantos aminoácidos, v.gr., menor que treinta, y preferiblemente menor que diez, y no remueven o desplazan aminoácidos que son críticos para una conformación funcional, v.gr., residuos de cisteína. Las proteínas y muteínas producidas por dichas deleciones y/o inserciones están dentro del alcance de la presente invención. Preferiblemente, los grupos de aminoácidos sinónimos son aquellos definidos en el cuadro I. Muy preferiblemente, los grupos de aminoácidos sinónimos son aquellos definidos en el cuadro II; y muy preferiblemente los grupos de aminoácidos sinónimos son aquellos definidos en el cuadro III.

CUADRO I Grupos preferidos de aminoácidos sinónimos Aminoácido Grupo sinónimo Ser Ser, Thr, Gly, Asn Arg Arg, Gln, Lys, Glu, His Leu lie, Phe, Tyr, Met, Val, Leu Pro Gly, Ala, Thr, Pro Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr Ala Gly, Thr, Pro, Ala Val Met, Tyr, Phe, lie, Leu, Val Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly lie Met, Tyr, Phe, Val, Leu, lie Phe Trp, Met, Tyr, He, Val, Leu, Phe Tyr Trp, Met, Phe, lie, Val, Leu, Tyr Cys Ser, Thr, Cys His Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His Gln Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln Asn Gin, Asp, Ser, Asn Lys Glu, Gln, His, Arg, Lys Asp Glu, Asn, Asp Glu Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu Met Phe, lie, Val, Leu, Met Trp Trp CUADRO II Grupos más preferidos de aminoácidos sinónimos Aminoácido Grupo sinónimo Ser Ser Arg His, Lys, Arg Leu Leu, lie, Phe, Met Pro Ala, Pro Thr Thr Ala Pro, Ala Val Val, Met, lie Gly Gly lie lie, Met, Phe, Val, Leu Phe Met, Tyr, He, Leu, Phe Tyr Phe, Tyr Cys Cys, Ser His Hls, Gln, Arg Gln Glu, Gln, His Asn Asp, Asn Lys Lys, Arg Asp Asp, Asn Glu Glu, Gln Met Met, Phe, He, Val, Leu Trp Trp CUADRO III Grupos aún más preferidos de aminoácidos sinónimos Aminoácido Grupo sino Ser Ser Arg Arg Leu Leu, He, Met Pro Pro Thr Thr Ala Ala Val Val Gly Gly He lile, Met, Leu Phe Phe Tyr Tyr Cys Cys, Ser His His Gln Gln Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu Met Met, lie, Leu Trp Met Ejemplos de producción de sustituciones de aminoácidos en proteínas que se pueden usar para obtener muteínas de IFN, para usarse en la presente invención incluyen cualesquiera pasos de método conocidos, tales como los que se presentan en las patentes de E.U.A. 4,959,314, 4,588,585 y 4,737,462, de Mark et al; 5,116,943 de Koths et al., 4,965,195 de Ñamen et al; 4,879,111 de Chong et al; y 5,017,691 de Lee et al; y proteínas sustituidas con lisina presentadas en la patente de E.U.A. No. 4,904,584 (Shaw et al). Muteínas específicas de IFN-beta han sido descritas, por ejemplo, por Mark et al., 1984. El término "proteína fusionada" se refiere a un polipéptido que comprende un IFN, o una muteína del mismo, fusionada a otra proteína, que, v.gr., tiene un tiempo de residencia extendido en fluidos corporales. Un IFN por lo tanto se puede fusionar a otra proteína, polípéptido o similares, v.gr., una inmunoglobulina o un fragmento de la misma. "Derivados funcionales" como se usa aquí, cubren derivados de IFN, y sus muteínas y proteínas fusionadas, que se pueden preparar a partir de los grupos funcionales que se presentan como cadenas laterales en los residuos o los grupos N- o C-terminales, por medios conocidos en la técnica, y se incluyen en la invención siempre que permanezcan farmacéuticamente aceptables, es decir, que no destruyan la actividad de la proteína que es sustancialmente similar a la actividad del IFN, y no confieran propiedades tóxicas en composiciones que los contienen. Estos derivados pueden incluir, por ejemplo, cadenas laterales de polietilenglicol, que pueden cubrir sitios antigénicos y extender la residencia de IFN en fluidos corporales. Otros derivados incluyen esteres alifáticos de los grupos carboxilo, amidas de los grupos carboxilo mediante reacción con amoniaco o con aminas primarias o secundarias, derivados de N-acilo de grupos amino libres de los residuos de aminoácidos formados con porciones acilo (v.gr., grupos alcanoilo o aroilo carbocíclico) o derivados de O-acilo de grupos hidroxilo libres (por ejemplo, el de residuos serilo o treonilo) formados con porciones acilo. Como "fracciones activas" de IFN, o muteínas y proteínas fusionadas, la presente invención cubre cualquier fragmento o precursor de la cadena de polipéptido de la molécula de proteína sola o junto con moléculas asociadas o residuos enlazados a las mismas, v.gr., azúcar o residuos de fosfato, o agregados de la molécula de proteína o los residuos de azúcar por sí mismos, siempre que la fracción no tenga actividad significativamente reducida en comparación con el IFN correspondiente. El término "sales" aquí se refiere tanto a sales de grupos carboxilo como sales acidas de adición de grupos amino de las proteínas anteriormente descritas o análogos de los mismos. Sales de un grupo carboxilo se pueden formar por medios conocidos en la técnica e incluyen sales inorgánicas, por ejemplo, sales de sodio, calcio, amonio, férricas o de zinc, y similares, y sales con bases orgánicas como aquellas formadas, por ejemplo, con aminas, tales como trietanolamina, arginina o lisina, piperidina, procaína y similares. Las sales acidas de adición incluyen, por ejemplo, sales con ácidos minerales tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, y sales con ácidos orgánicos, tales como, por ejemplo, ácido acético o ácido oxálico. Desde luego, cualesquiera de esas sales deben retener la actividad biológica de las proteínas (IFN) pertinentes a la presente invención, es decir, la capacidad para unirse al receptor correspondiente e iniciar señalización de receptor. De conformidad con la presente invención, el uso de IFN-beta humano recombinante y los compuestos de la invención es particularmente preferido.

Un tipo especial de variante de interferón se ha descrito recientemente. Los llamados "interferones de consenso" son variantes de IFN que no se presentan en forma natural (US 6,013,253). De conformidad con una modalidad preferida de la invención, los compuestos de la invención se hacen en combinación con un interferón de consenso. Como se usa aquí, interferón de consenso humano (IFN-con) significa un polipéptido que no se presenta en forma natural, que predominantemente incluye aquellos residuos de aminoácido que son comunes a un subconjunto de IFN-alfa representativo de la mayoría de las secuencias de subtipo de interferón de leucocito humano que se presentan en forma natural y que incluye, en una o más de aquellas posiciones en donde no hay aminoácido común a todos los subtipos, un aminoácido que predominantemente se presenta en esa posición y en ningún caso incluye algún residuo de aminoácido que no sea existente en esa posición en por lo menos un subtipo que se presenta en forma natural. IFN-con abarca pero no se limita a las secuencias de aminoácidos designadas como IFN-con1 , IFN-con2 y IFN-con3 que se describen en U.S. 4,695,623, 4,897,471 y 5,541 ,293. Las secuencias de ADN que codifican IFN-con se pueden producir como se describe en las patentes antes mencionadas, o por otros métodos estándares. En una modalidad preferida adicional, la proteína fusionada comprende una fusión de Ig. La fusión puede ser directa o mediante un péptido de enlazador corto que puede ser tan corto como 1 a 3 residuos de aminoácido de longitud o más largo, por ejemplo, 13 residuos de aminoácido de longitud. Dicho enlazador puede ser un tripéptido de la secuencia E-F-M (Glu-Phe-Met) (SEQ ID: 1), por ejemplo, o una secuencia de enlazador de 13 aminoácidos que comprende Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-GIy-Gly-Gln- Phe-Met (SEQ ID: 2) introducida entre la secuencia de IFN y la secuencia de inmunoglobulina. La proteína de fusión resultante puede tener propiedades mejoradas, tales como un tiempo de residencia extendido en fluidos corporales (vida media), actividad específica incrementada, nivel de expresión incrementado, o la purificación de la proteína de fusión es facilitada. En una modalidad preferida adicional, IFN se usa para la región constante de una molécula de Ig. Preferiblemente, se usa para regiones de cadena pesada, como los dominios CH2 y CH3 de la lgG1 humana, por ejemplo. Otras ¡soformas de moléculas de Ig también son adecuadas para la generación de proteínas de fusión de conformidad con la presente invención, tales como las ¡soformas lgG , lgG3 o lgG4, u otras clases de Ig, como IgM o IgA, por ejemplo. Las proteínas de fusión pueden ser monoméricas o multiméricas, hetera- u homomultiméricas. En una modalidad preferida adicional, el derivado funcional comprende por lo menos una porción fijada a uno o más grupos funcionales, que se presenta como una o más cadenas laterales en los residuos de aminoácidos. Preferiblemente, la porción es una porción de polietileno (PEG). PEGilación se puede llevar a cabo por métodos conocidos, tales como, por ejemplo, aquellos descritos, en WO 99/55377. La dosis administrada, como una sola dosis o dosis múltiples, a un individuo variará dependiendo de una variedad de factores, incluyendo propiedades farmacocinéticas, la vía de administración, las condiciones y características del paciente (sexo, edad, peso corporal, salud, tamaño), grado de los síntomas, tratamientos concurrentes, frecuencia de tratamiento y efecto deseado. Las dosis estándares de IFN-beta humano varían de 80 000 lU/kg y 200 000 lU/kg por día o 6 MIU (millones de unidades internacinales) y 12 MIU por persona por día o 22 a 44 µg (microgramo) por persona. De conformidad con la presente invención, el IFN se puede administrar preferiblemente a una dosis de aproximadamente 1 a 50 µg, muy preferiblemente de aproximadamente 10 a 30 µg o aproximadamente 10 a 20 µg por persona por día. La administración de ingredientes activos de conformidad con la presente invención puede ser por vía intravenosa, intramuscular o subcutánea. La vía de administración preferida para IFN es la vía subcutánea. El IFN también se puede administrar diariamente o un día sí y un día no, o menos frecuentemente. De preferencia, IFN se administra una, dos o tres veces por semana. La vía de administración preferida es administración subcutánea, administrada, v.gr., tres veces a la semana. Una vía de administración aún más preferida es la administración intramuscular, que se puede aplicar, v.gr., una vez a la semana. La dosificación de IFN-ß en el tratamiento de MS recurrente- reemisora de conformidad con la invención depende del tipo de IFN-ß usado. De conformidad con la presente invención, en donde IFN es IFN- ß1 b recombinante producido por E. Coli, comerciaimente disponible bajo el nombre comercial Betaseron®, se puede administrar preferiblemente en forma subcutánea cada dos días a una dosis de aproximadamente 250 a 300 µg u 8 MIU a 9.6 MIU por persona. De conformidad con la presente invención, en donde IFN es IFN- ß1a recomblnante, producido por células de ovario de hámster chino (células CHO) comerciaimente disponibles bajo el nombre comercial Avonex®, se puede administrar preferiblemente por vía intramuscular una vez a la semana a una dosis de aproximadamente 30 µg a 33 µg o 6 MIU a 6.6 MIU por persona. De conformidad con la presente invención, cuando IFN es IFN-ß1a recombinante, producido en células de ovario de hámster chino (células CHO), comerciaimente disponible bajo el nombre comercial Rebif®, preferiblemente se puede administrar por vía subcutánea tres veces a la semana (TIW) a una dosis de 22 a 44 µg o 6 MIU a 12 MIU por persona. El término "estabilidad" se refiere a la estabilidad física, química y de conformación de las formulaciones de interferón de la presente invención (incluyendo mantenimiento de potencia biológica). La inestabilidad de una formulación de proteína puede ser causada por degradación química o agregación de la molécula de proteína para formar polímeros de orden mayor, desglicosilación, modificación de glicosilación, oxidación o cualquier otra modificación estructural que reduzca por lo menos una actividad biológica de un polipéptido de interferón incluido en la presente invención. Una solución o formulación "estable" o "estabilizada" es una en donde el grado de degradación, modificación, agregación, pérdida de actividad biológica y similar, de las proteínas en la misma, es aceptablemente controlada, y no incrementa inaceptablemente con el tiempo. Preferiblemente, la formulación retiene por lo menos de o aproximadamente 60%, muy preferiblemente en por lo menos o aproximadamente 70%, muy preferiblemente por lo menos de o aproximadamente 80% de la actividad de interferón marcada durante un periodo de 24 meses. Las composiciones de IFN estabilizadas de la invención preferiblemente tienen una vida de anaquel de por lo menos aproximadamente 6 meses, 12 meses, 18 meses, muy preferiblemente por lo menos 20 meses, muy preferiblemente aún por lo menos aproximadamente 22 meses, muy preferiblemente por lo menos aproximadamente 24 meses cuando se almacena a 2-8°C. Los métodos para monitorear la estabilidad de las composiciones farmacéuticas de IFN de la invención están disponibles en la técnica, incluyendo aquellos métodos descritos en los ejemplos aquí descritos. Por lo tanto, la formación de agregado de IFN durante el almacenamiento de un composición farmacéutica líquida de la invención se puede determinar fácilmente midiendo el cambio en IFN soluble en solución con el tiempo. La cantidad de polipéptido soluble en solución puede ser cuantificada por un número de pruebas analíticas adaptadas para detección de IFN. Dichas pruebas incluyen, por ejemplo, cromatografía de exclusión de tamaño (SEC)- HPLC y espectroscopia de absorción de UV, como se describe en los siguientes ejemplos. La determinación tanto de los agregados solubles como insolubles durante el almacenamiento en formulaciones líquidas se puede lograr, por ejemplo, usando ultracentrifugacíón analítica como se indica en los ejemplos más adelante para distinguir entre aquella porción del polipéptido soluble que está presente como agregados solubles y aquella porción que está presente en la forma molecular biológicamente activa no agregada. La expresión "uso de dosis múltiples" pretende incluir el uso de un solo vial, ampolleta o cartucho de una formulación de interferón para más de una inyección, por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6 o más inyecciones. Las inyecciones preferiblemente se hacen sobre un periodo de por lo menos de o aproximadamente 12 horas, 24 horas, 48 horas etc., preferiblemente hasta un periodo de o aproximadamente 12 días. Las inyecciones se pueden separar en el tiempo, por ejemplo, por un periodo de 6, 12, 24, 48 ó 72 horas. El término "regulador de pH" o "regulador de pH fisiológicamente aceptable" se refiere a soluciones de compuestos que son conocidas por ser seguras para uso farmacéutico o veterinario en formulaciones y que tiene el efecto de mantener o controlar el pH de la formulación en el intervalo de pH deseado de la formulación. Los regulares de pH aceptables para controlar el pH a un pH moderadamente ácido a un pH moderadamente básico incluyen, pero no se limitan a compuestos tales como fosfato, acetato, citrato, arginina, TRIS e histidina. "TRIS" se refiere a 2-amino-2-hidroximetil-1 ,3-propanodiol, y a cualquier sal farmacológicamente aceptable del mismo. Los reguladores de pH preferidos son reguladores de pH de acetato con solución salina o una sal aceptable. Las "ciclodextrinas" contempladas para usarse aquí son derivados de hidroxipropilo, hidroxietilo, glucosilo, maltosilo y maltotriosilo de beta-ciclodextrina y los derivados correspondientes de gamma-ciclodextrina. Las agrupaciones de hidroxialquilo pueden contener uno o más grupos hidroxilo, v.gr., hidroxipropilo (2-hidroxipropilo, 3-hidroxipropilo), dihidroxipropilo y similares. Los derivados de glucosilo, maltosilo y maltotriosilo pueden contener uno o más residuos de azúcar, v.gr., glucosilo o diglucosilo, maltosilo o dimaltosilo. Varias mezclas de los derivados de ciclodextrina se pueden usar también, v.gr., una mezcla de derivados de maltosilo y dimaltosilo. Derivados de ciclodextrina específicos para usarse aquí incluyen hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HPCD o HPBCD), hidroxietil-beta-ciclodextrina (HEBCD), hidroxipropil-gamma-ciclodextrina (HPGCD), hidroxietil-gamma-ciclodextrina (HEGCD), dihidroxipropil-beta-ciciodextrina (2HPBCD), glucosil-beta-ciclodextrina (G beta-CD o GiBCD), diglucosil-beta-ciclodextrina (2G G beta-CD o 2 G-iBCD), maltosil-beta-ciclodextrina (G2-beta-CD o G2BCD), maltosil-gamma-ciclodextrina (G2-gamma-CD o G2GCD), maltotriosil-beta-ciclodextrina (G3-beta-CD o G3BCD), maltotriosil-gamma-ciclodextrina (G3-gamma-CD o G3GCD) y dimaltosil-beta-ciclodextrina (2 G2-beta-CD o 2 G2BCD), y mezclas de los mismos tales como maltosil-beta- ciclodextrina/dimaltosil-beta-ciclodextrina. Hidroxipropil-beta-ciclodextrina para usarse en las composiciones de la presente invención está comerciaimente disponible y es la ciclodextrina preferida de conformidad con la invención. Alternativamente, se puede preparar por métodos conocidos, especialmente mediante el uso del procedimiento optimizado de Pitha et al, International Journal of Pharmaceutics, 29,73-82 (1986). Un "agente de isotonicidad" es un compuesto que es fisiológicamente tolerado e imparte una tonicidad adecuada a una formulación para evitar el flujo neto de agua a través de las membranas celulares que están en contacto con la formulación. Compuestos tales como glicerina, se usan comúnmente para esos propósitos a concentraciones conocidas. Otros agentes de isotonicidad adecuados incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos o proteínas (v.gr., glicina o albúmina), sales (v.gr., cloruro de sodio), y azúcares (v.gr., dextrosa, manitol, sacarosa y lactosa). Preferiblemente, el agente de isotonicídad es manitol. El término "antioxidante" se refiere a un compuesto que evita a radicales libres de oxígeno o derivados de oxígeno interactúen con otras sustancias. Los antioxidantes están entre un número de excipientes comúnmente añadidos a sistemas farmacéuticos para incrementar la estabilidad física y química. Los antioxidantes se añaden para reducir al mínimo o retardar los procesos oxidativos que ocurren a algunos fármacos o excipientes bajo exposición a oxígeno o en presencia de radicales libres.

Estos procedimientos a menudo pueden ser catalizados por la luz, temperatura, hidrógeno sobre la concentración, presencia de metales traza o peróxidos. Los sulfitos, bisufitos, tiourea, metionina, sales de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), hidroxitolueno butilado (BHT), e hidroxianisol butilado (BHA) se usan frecuentemente como antioxidantes en los fármacos. Se ha encontrado que ei EDTA sódico incrementa la actividad de los antioxidantes por iones metálicos quelatadores que de otra manera catalizarían la reacción de oxidación. El antioxidante más preferido es metionina. El término "bacteriostático" se refiere a un compuesto o composiciones añadidas a una formulación para actuar como un agente antibacteriano. Una formulación que contiene interferón conservada de la presente invención preferiblemente satisface lineamientos estatutarios o reguladores para efectividad conservadora para que sea un producto de usos múltiples comerciaimente viables. Ejemplos de bacteriostáticos incluyen fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico, alquilparabeno (metil-, etil-, propil-, butil- y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato de sodio y timerosal. Preferiblemente, el agente bacteriostático es alcohol bencílico. En una modalidad preferida, la invención provee una composición farmacéutica líquida estabilizada que comprende un interferón (IFN) o una ¡soforma, muteína, proteína fusionada, derivado funcional, fracción activa o sal del mismo, en donde dicha formulación es una solución que comprende un regulador de pH, 2-hidroxipropil-beta-ciclodextrina, un agente de isotonicidad y un antioxidante. En una modalidad preferida, la invención provee una composición farmacéutica líquida estabilizada en donde dicho interferón es IFN-beta tal como IFN-beta humano recombinante. En otra modalidad preferida, la invención provee una composición farmacéutica líquida estabilizada en donde dicho regulador de pH está presente en una cantidad suficiente para mantener el pH de la composición dentro de más o menos 0.5 unidades de un pH especificado, en donde el pH especificado es aproximadamente 3 a aproximadamente 6, tal como un valor de pH de o aproximadamente 3.0 a aproximadamente 6.0, incluyendo un valor de pH de o aproximadamente 3.8. En otra modalidad preferida, la invención provee una composición farmacéutica líquida estabilizada en donde el regulador de pH está presente a una concentración de aproximadamente 5 M a 500 mM tal como una concentración de o aproximadamente 50 mM. En otra modalidad preferida, la invención provee una composición farmacéutica líquida estabilizada en donde el regulador de pH es un regulador de pH de acetato. En otra modalidad preferida, la invención provee una composición farmacéutica líquida estabilizada en donde el agente de isotonicidad es manitol. En otra modalidad preferida, la invención provee una composición farmacéutica líquida estabilizada en donde el agente de isotonicidad está presente a una concentración de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 500 mg/ml, tal como una concentración de o aproximadamente 50 mg/ml. En otra modalidad preferida, la invención provee una composición farmacéutica líquida estabilizada en donde el antioxidante es metionina. En otra modalidad preferida, la invención provee una composición farmacéutica líquida estabilizada en donde el antioxídante está presente a una concentración de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5 mg/ml, incluyendo concentraciones de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5.0 mg/ml, tal como de una concentración de o aproximadamente 0.1 mg/ml. En otra modalidad preferida, la invención provee una composición farmacéutica líquida estabilizada en donde el interferón está presente a una concentración de aproximadamente 10 µg/ml a aproximadamente 800 µg/ml, tal como una concentración de o aproximadamente 44, 88 o 276 µg/ml. En otra modalidad preferida, la invención provee una composición farmacéutica líquida estabilizada en donde la ciclodextrina está presente a una relación molar vs. interferón de aproximadamente 500 veces el exceso molar hasta aproximadamente 700 veces el exceso molar. En otra modalidad preferida, la invención provee una composición farmacéutica líquida estabilizada en donde la composición es una solución acuosa. En otra modalidad preferida, la invención provee una composición farmacéutica líquida estabilizada en donde la composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprende además un agente bacteriostático tal como alcohol bencílico. En otra modalidad preferida, la invención provee una composición farmacéutica líquida estabilizada en donde la composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprende además un agente bacteriostático y en donde el agente bacteriostático está presente a una concentración de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 2%, incluyendo concentraciones de o aproximadamente 0. 1 % to aproximadamente 2.0%, tales como concentraciones de o aproximadamente 0.2 o aproximadamente 0.3%. En una modalidad preferida adicional, la invención provee una composición farmacéutica líquida estabilizada en donde el agente de isotonicidad es manitol, el antioxidante es metionina y el interferón es interferón beta. En otra modalidad preferida adicional, la invención provee una composición farmacéutica líquida estabilizada en donde la composición es la siguiente formulación líquida: En otra modalidad, la invención provee un método para preparar una composición farmacéutica líquida estabilizada de conformidad con la invención, en donde el método comprende añadir cantidades calculadas de 2- hidroxipropil-beta-ciclodextrina, antioxidante y agente de isotonicidad a la solución regulada en su pH y después añadir el interferón (IFN) o una isoforma, muteína, proteína fusionada, derivado funcional, fracción activa o sal del mismo. En otra modalidad, ia invención provee un contenedor herméticamente sellado en condiciones estériles y apropiado para almacenarse antes de usarse, que comprende la formulación farmacéutica líquida de conformidad con la invención. Ejemplos de dicho contenedor son un vial o un cartucho para auto-inyector. Los contenedores de conformidad con la invención son para administración de una sola dosis o dosis múltiples. En una modalidad preferida, la invención provee un contenedor de conformidad con la invención en donde dicho contenedor es una jeringa pre-llenada para administración de una sola dosis. En otra modalidad, la invención provee un equipo para administración de dosis múltiples de una composición farmacéutica de conformidad con la invención, en donde el equipo comprende un primer contenedor llenado con una composición farmacéutica de conformidad con la invención y un segundo cartucho llenado con una solución del agente bacteriostático. Preferiblemente, la concentración de IFN-beta en la formulación es de o aproximadamente 10 µg/ml a de o aproximadamente 800 µg/ml, muy preferiblemente de o aproximadamente 20 µg/ml hasta de o aproximadamente 500 µg/ml, muy particularmente preferiblemente de o aproximadamente 30 hasta de o aproximadamente 300, muy particularmente aún de o aproximadamente 44, 88 ó 264 µg/ml. Preferiblemente, las formulaciones de la presente invención tienen un pH entre aproximadamente 3.0 y de o aproximadamente 4.5, muy particularmente de o aproximadamente 3.8. Un regulador de pH preferido es acetato, con contraiones preferidos siendo iones de sodio o potasio. Los reguladores de pH salinos de acetato son bien conocidos en la técnica. Las concentraciones de regulador de pH en la solución total pueden variar entre de o aproximadamente 5 mM, 9.5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM y 500 mM. Preferiblemente la concentración del regulador de pH es de o aproximadamente 10 M. Particularmente preferido es un regulador de pH 50 mM en iones de acetato con un pH de 3.8. Preferiblemente, en la composición de la invención el antioxidante, por ejemplo metionina, está presente a una concentración de o aproximadamente 0.01 hasta de o aproximadamente 5 mg/ml, muy preferiblemente de o aproximadamente 0.05 hasta de o aproximadamente 0.3 mg/ml, muy preferiblemente aún de o aproximadamente 0.1 mg/ml. Preferiblemente, la concentración del agente de isotonicidad (por ejemplo, manitol) en formulaciones líquidas es de o aproximadamente 0.5 mg/ml hasta de o aproximadamente 500 mg/ml, muy preferiblemente de o aproximadamente 1 mg/ml hasta de o aproximadamente 250 mg/ml, muy particularmente preferiblemente de o aproximadamente 10 mg/ml hasta de o aproximadamente 100 mg/ml, muy preferiblemente aún de o aproximadamente 5 0 mg/ml. En una modalidad preferida adicional, la invención provee una composición de conformidad con la invención en donde el agente de isotonicidad es manitol, el antioxidante es metionina y el interferón es ¡nterferón beta. En otra modalidad preferida, la invención provee a composición de conformidad con la invención en donde la composición líquida es la siguiente: La invención incluye formulaciones líquidas. El solvente preferido es agua para inyección. Las formulaciones líquidas pueden ser una sola dosis o dosis múltiples. Aquellas formulaciones líquidas de ¡nterferón de la invención que están diseñadas para uso de dosis múltiples preferiblemente comprende un bacteriostático, tal como fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico, alquilparabeno (metil-, etil-, propil-, butil- y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, deshidroacetato de sodio y timerosal. Particularmente preferidos son fenol, alcohol bencílico y m-cresol, muy preferido es alcohol bencílico. El agente bacteriostático se usa en una cantidad que dará una concentración que es efectiva para mantener la formulación esencialmente libre de bacterias (adecuada para inyección) durante el período de inyección de dosis múltiples, que puede ser de o aproximadamente 12 ó 24 horas hasta de o aproximadamente 12 días, preferiblemente de o aproximadamente 6 hasta de o aproximadamente 12 días. El bacteriostático está preferiblemente presente en una concentración de o aproximadamente 0-1% (bacteriostático en masa/masa de solvente) hasta de o aproximadamente 2.0%, muy preferiblemente de o aproximadamente 0.2%o hasta de o aproximadamente 1.0%. En el caso de alcohol bencílico, particularmente preferidas son concentraciones de 0.2 ó 0.3%). El bacteriostático también puede estar presente en formulaciones de una sola dosis. El intervalo de interferón en las formulaciones de la invención incluye cantidades que dan, bajo reconstitución, concentraciones de aproximadamente 1.0 µg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, aunque concentraciones más bajas o más altas son operables y dependen del vehículo de suministro destinado, v.gr., formulaciones en solución diferirán de los métodos de parche transdérmico, pulmonar, transmucosa, o osmótico o de micro-bomba. La concentración de interferón es preferiblemente de o aproximadamente 5 µg/ml hasta de o aproximadamente 2 mg/ml, muy preferiblemente de o aproximadamente 10 µg/ml hasta de o aproximadamente 1 mg/ml, muy preferiblemente aún de o aproximadamente 30 µg/ml hasta de o aproximadamente 100 µg/ml. Preferiblemente, las formulaciones de la invención retienen por lo menos de o aproximadamente 60%, muy preferiblemente por lo menos de o aproximadamente 70 %, muy preferiblemente aún por lo menos de o aproximadamente 80% de la actividad del interferón en el tiempo de empacar durante un período de 24 meses. En una modalidad preferida adicional, la invención provee un método para fabricar una composición líquida farmacéutica como se describió antes. En otra modalidad preferida más, la invención provee un método para fabricar una composición farmacéutica empacada que comprende colocar una solución que comprende el ingrediente activo y los excipientes como se describió antes. En otra modalidad preferida más, la invención provee un artículo de fabricación para uso farmacéutico humano, que comprende un vial que comprende las composiciones farmacéuticas como se describió antes, y material escrito que informa que la solución puede estar contenida durante un período de o aproximadamente veinticuatro horas o más después del primer uso. Preferiblemente el material escrito dice que la solución puede estar contenida hasta de o aproximadamente 12 días. Después del primer uso de una formulación de dosis múltiple, puede ser mantenida y usada durante por lo menos de o aproximadamente 24 horas, preferiblemente por lo menos de o aproximadamente 4, 5 ó 6 días, muy preferiblemente durante hasta 12 días. Después del primer uso, la formulación es preferiblemente almacenada en por debajo de la temperatura ambiente (es decir, por debajo de o aproximadamente 25°C), muy preferiblemente por debajo de o aproximadamente 10°C, muy preferiblemente de o aproximadamente 2-8°C, muy preferiblemente aún de o aproximadamente 5°C. Las formulaciones de la presente invención se pueden preparar mediante un procedimiento que comprende añadir las cantidades calculadas de los excipientes a la solución regulada en su pH y después añadir el interferón. La solución resultante es después colocada en viales, ampolletas o cartuchos. Variaciones de este procedimiento serían reconocidas por un experto en la técnica. Por ejemplo, el orden en que se añaden los componentes, si se usan aditivos adicionales, la temperatura y pH a los cuales se prepara la formulación, son todos ellos factores que pueden ser optimizados para la concentración y medios de administración usados. En el caso de usar una formulación de dosis múltiple, el agente bacteriostático se puede añadir a la solución que contiene el ingrediente activo (interferón) o alternativamente se puede mantener en un vial o cartucho separado y subsecuentemente mezclar con la solución que contiene el ingrediente activo al momento de usarse. Las formulaciones de la invención se pueden administrar usando dispositivos reconocidos. Ejemplos que comprenden estos sistemas de vial individuales incluyen dispositivos de auto-inyector o inyector de tipo pluma para el suministro de una solución tal como Rebiject®. Los productos actualmente reclamados incluyen material de empaque. El material de empaque provee, además de la información requerida por las agencias reguladoras, las condiciones bajo las cuales el producto se puede usar. El material de empaque de la presente invención provee instrucciones para que el paciente, si es necesario, prepare la solución final y use dicha solución final durante un período de veinticuatro horas o más para el producto de dos viales, en húmedo/seco. Para el producto en solución de un solo vial, la etiqueta indica que dicha solución se puede usar durante un período de veinticuatro horas o más. Los productos actualmente reclamados son útiles para uso de producto farmacéutico humano. Las formulaciones conservadas estables se pueden proveer a pacientes como soluciones claras. La solución puede ser para un solo uso o se puede reutilizar múltiples veces y puede ser suficiente para un solo ciclo o ciclos múltiples de tratamiento de un paciente y por lo tanto provee un régimen de tratamiento más conveniente que los actualmente disponibles. El interferón ya sea en las formulaciones o soluciones estables o conservadas aquí descritas, se puede administrar a un paciente de conformidad con la presente invención mediante una variedad de métodos de suministro que incluyen inyección subcutánea o intramuscular; transdérmica, pulmonar, transmucosa, implante, bomba osmótica, cartucho, micro-bomba, oral u otros medios apreciados por el experto en la técnica, como se conoce en la técnica. El término "vial" se refiere ampliamente a un depósito adecuado para retener interferón en forma sólida o líquida en un estado estéril contenido. Ejemplos de un vial, como se usa aquí, incluyen ampolletas, cartuchos, empaques de burbujas, u otro depósito adecuado para suministrar el ¡nterferón al paciente mediante jeringa, bomba (incluyendo osmótica), catéter, parche transdérmico, aspersión pulmonar o transmucosa. Los viales adecuados para empacar productos para administración parenteral, pulmonar, transmucosa o transdérmica son bien conocidos y reconocidos en la técnica. El término "tratamiento", dentro del contexto de esta invención, se refiere a cualquier efecto benéfico sobre la progresión de la enfermedad, incluyendo atenuación, reducción, reducción o disminución del desarrollo patológico después del inicio de la enfermedad. Las composiciones farmacéuticas de la invención que comprenden IFN o una ¡soforma, muteína, proteína fusionada, derivado funcional, fracción activa o sal son útiles en el diagnóstico, prevención y tratamiento (local o sistémico) de indicaciones clínicas que responden a terapia con este polipéptido. Dichas indicaciones clínicas incluyen, por ejemplo, trastornos o enfermedades del sistema nervioso central (CNS), cerebro, y/o médula espinal, incluyendo esclerosis múltiple; enfermedades autoinmunes, incluyendo artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad de Crohn; y cánceres, incluyendo cánceres de mama, próstata, vejiga, riñon y colon. En una modalidad, la invención incluye el uso de composiciones de la invención para la preparación de una formulación farmacéutica para el tratamiento de trastornos o enfermedades que afectan el sistema nervioso central (CNS), cerebro, y/o médula espinal, incluyendo esclerosis múltiple; enfermedades autoinmunes, incluyendo artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad de Crohn; y cánceres, incluyendo cánceres de mama, próstata, vejiga, riñon y colon. En otra modalidad, la invención provee un método de tratamiento de trastornos o enfermedades que afectan el sistema nervioso central (CNS), cerebro, y/o médula espinal, incluyendo esclerosis múltiple; enfermedades autoinmunes, incluyendo artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad de Crohn; y cánceres, incluyendo cánceres de mama, próstata, vejiga, riñon y colon, que comprende la administración de la composición de la invención en un paciente que necesita la misma. En otra modalidad de la invención, las composiciones de la invención son útiles para el tratamiento de trastornos o enfermedades que afectan el sistema nervioso central (CNS), cerebro, y/o médula espinal, incluyendo esclerosis múltiple; enfermedades autoinmunes, incluyendo artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad de Crohn; y cánceres, incluyendo cánceres de mama, próstata, vejiga, riñon y colon. Todas las referencias aquí citadas, incluyendo artículos o resúmenes de revistas especializadas, solicitudes de patente de E.U.A. o extranjeras publicadas o no publicadas, patentes de E.U.A. o extranjeras expedidas o cualesquiera otras referencias, se incorporan aquí por referencia en su totalidad, incluyendo todos los datos, cuadros, figuras y texto presentados en las referencias citadas. Además, el contenido completo de las referencias citadas dentro de las referencias aquí también se incorporan aquí por referencia en su totalidad. Referencia a pasos de métodos conocidos, pasos de métodos convencionales, métodos conocidos o métodos convencionales no es una forma de admitir que cualquier aspecto, descripción o modalidad de la presente invención se describe, enseña o sugiere en la técnica pertinente. La descripción anterior de las modalidades específicas revelará completamente la naturaleza general de la invención que otros, al aplicar el conocimiento dentro del alcance de la técnica (incluyendo el contenido de las referencias aquí citadas), pueden fácilmente modificar y/o adaptar para las diversas aplicaciones de dichas modalidades específicas, sin experimentación adicional, sin apartarse del concepto general de la presente invención. Por lo tanto, se pretende que dichas adaptaciones y modificaciones estén dentro del significado de una gama de equivalentes de las modalidades descritas, con base en las enseñanzas y lineamientos aquí presentados. Cabe entender que la fraseología y terminología de la presente es para el propósito de descripción y no de limitación, de tal manera que la fraseología y terminología de la presente especificación debe ser interpretada por el experto en la técnica a la luz de las enseñanzas y lineamientos aquí presentados, en combinación con el conocimiento de un experto en la técnica.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 : muestra la cinética de agregación de interferón beta-1a 0.116 mg/ml (5.16, µM) en PEG/PBS, después de incubación a 62+/-2°C 10 min, en presencia de diferentes concentraciones de HPBCD: 1.19 mg/ml (150 veces el exceso molar con respecto a la cantidad molar de interferón beta-1a), 3.97 mg/ml (500 veces el exceso molar con respecto a la cantidad molar de interferón beta-1a), 5.56 mg/ml (700 veces el exceso molar con respecto a la cantidad molar de interferón beta-1a) y 7.94 mg/ml (1000 veces el exceso molar con respecto a la cantidad molar de interferón beta-1a). En el eje de Y se reporta la densidad óptica medida a 360 nm que es directamente proporcional a la turbidimertía (Cancellíeri et al, BIOPOLYMERS, Vol 13, 735-743, 1974). Figura 2: muestra el efecto de 10,000, 20,000 y 40,000 exceso molar de manitol sobre la agregación de 0.116 mg/ml (5.1 pM) interferón beta-l a en PBS/PEG10000 (después de incubarse a 62+3°C 10 min). Figura 3: muestra la agregación cinética de interferón beta-1a en presencia de diferentes concentraciones de L-metionina: 0.077 mg/ml (100 veces el exceso molar con respecto a la cantidad molar de interferón beta-1 a), 0.158 mg/ml (205 veces el exceso molar con respecto a la cantidad molar de interferón beta-1 a), 0.308 mg/ml (400 veces el exceso molar con respecto a la cantidad molar de interferón beta-1 a), 0.769 mg/ml (1000 veces el exceso molar con respecto a la cantidad molar de interferón beta-1 a) y 7.69 mg/ml (10000 veces el exceso molar con respecto a la cantidad molar de interferón beta-1 a). Figura 4: muestra la agregación cinética de interferón beta-1 a sola y en presencia de metionina 400 veces el exceso molar con respecto a la cantidad molar de interferón beta-1 a (0.308 mg/ml) y/o HPBCD 700 veces el exceso molar con respecto a la cantidad molar de interferón beta-1 a (5.56 mg/ml). Figura 5: muestra el efecto de L-ascorbato 50 veces el exceso molar con respecto a la cantidad molar de interferón beta-1 a (0.045 mg/ml), 150 veces el exceso molar con respecto a la cantidad molar de interferón beta-1 a (0.136 mg/ml), 500 veces el exceso molar con respecto a la cantidad molar de interferón beta-1 a (0.453 mg/ml) y 10000 veces el exceso molar con respecto a la cantidad molar de interferón beta-1 a (9.07 mg/ml) sobre la agregación de ¡nterferón beta-1a 0.116 mg/ml (5.16 µM) en PEG/PBS, después de incubarse a 62 +/- 2°C, 10 minutos. Figuras 6A y 6B: reportan la desnaturalización térmica (es decir, el efecto de la temperatura sobre la señal de CD a 222 nm) del ¡nterferón beta-1 a voluminoso (aproximadamente 44 µg/ml) en la figura 6A y el espectro de CD relativo antes (línea sólida) y después (línea discontinua) de la transición de fusión en la figura 6B. De aquí en adelante, se reportan las desconvoluciones de CDNN (red neural de dicroismo circular) (promedio de cuatro análisis). N.B.: La curva de transición de fusión o desnaturalización térmica representa el efecto de la temperatura sobre la señal de CD a 222 nm. Todas las gráficas de CD tienen en el eje de Y la elípcicidad molar como deg M_1 crrf1 (eje Y). En el cuadro, la hélice alfa residual en el intervalo de 200-260 nm se ha considerado para comparación de estabilidad conformacional de IFN en las desconvoluciones de CDNN de pre/post-fusión (promedio de cuatro análisis). Figura 7A y 7B: la curva de desnaturalización térmica se reporta para una solución que contiene interferón beta-1 a aproximadamente 44 ug/ml y HPBCD 2.11 mg/ml (700 veces el exceso molar con respecto a la cantidad molar de interferón beta-1 a), es decir, el efecto de la temperatura sobre la señal de CD a 222 nm, expresada como elipcicidad molar, deg M"1 cm"1. En la figura 7A (línea sólida) comparada con la proteína sola (línea discontinua) y el espectro de CD relativo antes (línea sólida) y después (línea discontinua) de la transición de fusión en la figura 7B. De aquí en adelante, se reportan las desconvoluciones de CDNN (red neural de dicroismo circular) (promedio de tres análisis). Figura 8: muestra la desnaturalización térmica de interferón beta- 1a solo (curva discontinua) y en presencia de L-ascorbato de Na 500 veces el exceso molar con respecto a la cantidad molar de interferón beta-1 a (curva sólida). Figura 9: muestra el espectro de CD [interferón beta- 1a/ascorbato 500x] antes (curva sólida) y después (curva discontinua) de la transición de fusión y las desconvoluclones de CDNN respectivas (véase lo anterior). Figura 10: muestra la agregación cinética de interferón beta-1 a 0-116 mg/ml (5.16 p. M) en PEG/PBS (final pH = 4.7) después de incubarse a 62 +/- 2°C, 10 minutos, y el efecto de un exceso de 700x M de HPBCD (5.56 mg/ml). En el eje de Y se reporta la densidad óptica medida a 360 nm que es directamente proporcional a turbidimetría. Figura 11: muestra la agregación cinética de interferón beta-1 a 0.116 mg/ml (5.16, uM) en PEG/PBS (final pH = 5.1 ) después de incubarse a 62 +/- 2°C, 10 minutos, y el efecto de un exceso de 700x M de HPBCD (5.56 mg/ml) y exceso de 500x M de RMBCD (3.38 mg/ml). Figura 12 : muestra la agregación cinética de ¡nterferón beta-1 a 0.116 mg/ml (5.16 µM) en PEG/PBS (pH final = 5.7) después de incubarse a 62 +/- 2°C, 10 minutos, y el efecto de un exceso de 700x M de HPBCD (5.56 mg/ml).

EJEMPLOS Las siguientes abreviaturas se refieren respectivamente a las siguientes definiciones: cm (centímetro), mg (miligramo), µg (microgramo), min (minuto), mM (milimolar), ml (mililitro), nm (nanómetro), BHT (hidroxitolueno butilado), CD (dicroismo circular), EDTA (ácido etilendiaminotetraacético), HPBCD (hídroxipropil-beta-ciclodextrina), CLAR (cromatografía de líquidos de alto rendimiento), IFN (interferón), IM (intramuscular), DO (densidad óptica), PBS (solución salina regulada en su pH con fosfato), PEG (polietilenglicol), RMBCD (metil-beta-ciclodextrina aleatoriamente sustituida), SC (subcutánea), TFA (ácido trifluoroacético), TRIS (2-amino-2-hidroximetil-1 ,3-propanodiol, UV (ultravioleta), WFI (agua para inyección).

Métodos Mediciones de turbidimetría La agregación de proteína se monitoreó durante 30 minutos a 360 nm usando un sistema de espectrofotómetro de luz UV-visible (Perkin Elmer Lambda 40). Estudios preliminares establecieron las condiciones operativas bajo las cuales la proteína despliega comportamiento de agregación apropiado, es decir, dilución de volumen de interferón beta-1 a 1:2 con una solución de PEG 10,000 30 mg/ml en PBS (0.2 µm 0 filtrado), en un vial de polipropileno, seguido por incubación en un baño de agua íermostático a T = 62.2°C durante 10 min El calentamiento y PEG se usaron para incrementar el proceso de asociación de proteína a través de desnaturalización térmica y efecto de volumen de exclusión, respectivamente. El análisis de UV-visible se realizó en una célula que contenía un volumen de muestra de 3 ml (concentración final de interferón beta-1 a = 0.116 mg/ml). Cada análisis de turbidez se repitió por lo menos por triplicado y se reporta la curva promedio de densidad óptica (DO) 360 nm versus tiempo. La agregación de la proteína sola se comparó con ¡nterferón beta-1 a en presencia de excipientes a diferentes concentraciones.

Mediciones de dicroismo circular Las mediciones de CD se realizaron con un espectropolarímetro Jasco J810 equipado con un controlador de temperatura Peltier. Las muestras estaban contenidas en una celda de cuarzo de 1 cm con tapa y, para escudriñamientos térmicos, la velocidad de agitación magnética fue de aproximadamente 150 rpm. Para el espectro de lejano-UV (260-185 nm), se utilizaron una concentración de proteína de aproximadamente 44 µg/ml, una resolución de 0.2 nm y una velocidad de escudriñamiento de 2 nm/min con un tiempo de respuesta de 2 segundos y 3 acumulaciones.

A fin de monitorear la perturbación térmica de estructura técnica de ¡nterferón beta-1 a, señal de CD a 222 nm como una función de temperatura se siguió entre intervalos de 25°C y 85°C a 0.2°C, usando una tasa de rampa de temperatura de 1 °C/min y un tiempo de demora de 60 segundos. Cada medición se realizó por lo menos por triplicado sobre volumen de interferón beta-1 a, como un control, y sobre soluciones de ¡nterferón beta-1 a que contenían diferentes concentraciones de excipientes.

Análisis de cromatografía de exclusión de tamaño (Sec) Las formulaciones líquidas de interferón beta-1 a en puntos de tiempo prefijados de los estudios de estabilidad, se analizaron por SE-CLAR a fin de determinar pureza y prueba de ¡nterferón beta-1 a (expresada como % de recuperación). Las condiciones operativas usadas fueron: • columna cromatográfica: TSK G2000 SWxL (7.8 mm ID x 30 cm, µ, 125 A); volumen de inyección: 100 µl; temperatura de la columna: temperatura ambiente; • temperatura de la muestra: temperatura ambiente; velocidad de flujo: 0.5 ml/min; fase móvil: 70 % v/v de agua purificada (MILLIQ-Millipore)-30 % v/v de acetonitrilo- 0,2 % v/v de TFA; • tiempo de operación: 27 min; • tiempo de equilibrio: 3 min; • longitud de onda: 214 nm; • Una curva de calibración, que varió de 25 µg hasta 100 µg, se utilizó para cuantificar la prueba de ¡nterferón beta-1 a.

Materiales • Volumen de interferón beta-1 a (Serono S. A., lote G4D024) • PEG 10000 (polietilenglicol) • Lutrol F68 (copolímero de bloque de polioxietileno- polioxipropileno) • L-Metionina • D-Manitol • Acido L-ascórb¡co • Regulador de pH de solución salina regulado en su pH con fosfato, pH 7.4 ± 0.1 (composición: KH2P04 0.19 g/l, Na2HP04.12H20 2.38 g/l, NaCI 8 g/l) • Hidroxipropil-beta-ciclodextrina Equipo • Sistemas de CLAR (Waters and PE) equipado con columna TSK.

G2000. Sistema de espectrofotómetro de luz UV-visible (Perkin Elmer Lambda 40) • Espectropolarímetro Jasco J810 equipado con un controiador de temperatura Peltier. Osmómetro (OSMOMAT 030D, Gonotech) Medidor de conductiv¡dad-PH MPC 227-Mettler Toledo Balanza analítica AG245 y AG 285 (Mettler Toledo) Pipetas calibradas (Gilson) Placa caliente de agitador magnético (Stuart Scientific) Baño ultrasónico, Fair, Termómetros Resultados y discusión Prueba de turbidimetría El efecto sobre agregación de interferón beta-1 a de HPBCD, manitol y L-metionina, detectado por el método de turbidez, se reporta a continuación. La sal de ascorbato de sodio también se incluye como ejemplo de excipiente que tiene un efecto incrementador de agregación. La figura 1 muestra la cinética de agregación de ¡nterferón beta-1a en presencia de diferentes concentraciones de HPBCD: 1.19 mg/ml (150 veces el exceso molar con respecto a la cantidad molar de ¡nterferón beta-1 a), 3.97 mg/ml (500 veces el exceso molar), 5.56 mg/ml (700 veces el exceso molar) y 7.94 mg/ml (1 ,000 exceso molar). Cabe notar que en la tasa de concentración investigada este excipiente no evita completamente la desestabilización de interferón beta-1 a y las relaciones molares del intermediario muestran el mejor efecto inhibidor. 700 veces el exceso molar se escogió como concentración de referencia para preparación de formulación de interferón beta-1 á y caracterización fisico-química posterior (v.gr. dicroismo circular). La concentración de ciclodextrina se expresa mejor como relación molar vs interferón beta-1 a (veces el exceso molar) a medida que la concentración varía dependiendo de la cantidad de interferón beta-1 a usada en la preparación y se puede calcular de acuerdo con ello. La influencia de manitol sobre agregación de ¡nterferón beta-1 a se monitoreó después pero no se encontró efecto significativo incluso a 40,000 veces el exceso molar (correspondiente a 37,35 mg/ml) bajo las condiciones usadas (62°C en PEG/PBS), como se muestra en la figura 2. Sin embargo, el manitol se usó para formulaciones líquidas de interferón beta-1 a a fin de alcanzar la isotonicidad necesaria para administración parenteral. Finalmente, L-metionina se probó en un experimento de turbidimetría. La figura 3 muestra la cinética de agregación de ¡nterferón beta-1a (0.116 mg/ml, en PEG/PBS, después de incubarse a 62 +/-2°C, 10') en presencia de diferentes concentraciones de L-metionina. Cabe notar que la L-metionina tiene un efecto inhibidor sobre la agregación de proteína que HPBCD: incluso a la concentración investigada máxima no evita completamente desestabilización de interferón beta-1 a y la curva alcanza una "meseta" similar a control de interferón beta-1 a. En la figura 4, se reporta la cinética de agregación de interferón beta-1 a solo y en presencia de metionina 400 veces el exceso molar (0.308 mg/ml) y/o HPBCD 700 veces el exceso molar (5.56 mg/ml). Este experimento se llevó a cabo a fin de evaluar eventualmente un efecto sinergístico o interferencia de estos dos excipientes. Está claro que la metionina no ejerce efecto protector contra protein agregación además de la actividad de la ciclodextrina. Siguiendo las consideraciones anteriores, se confirmó que el HPBCD jugó un papel importante en la estabilización de interferón beta-1 a hacia la agregación y la interacción entre la proteína y la ciclodextrina se investigó adicionalmente por dicroismo circular. Como ejemplo de excipiente que tiene "efecto negativo" sobre la agregación de proteínas en la figura 5, se reporta la cinética de turbidez de ¡nterferón beta-1 a en presencia de diferentes concentraciones de sal de ascorbato. El efecto de L-ascorbato 50 veces el exceso molar (0.045 mg/ml), 150 veces el exceso molar (0.136 mg/ml), 500 veces el exceso molar (0.453 mg/ml) y 10,000 veces el exceso molar (9.07 mg/ml) sobre la agregación de interferón beta-1a 0.116 mg/ml (5.16 uM) en PEG/PBS, después de incubarse a 62 +/- 2°C, 10 minutos se muestra en la figura 5. Es interesante notar que el efecto sobre la agregación de proteína varía de una manera dependiente de la concentración: a concentración alta, la cargas negativas parecen exhibir un efecto desestabilizador, mientras que a relaciones molares más bajas parece tener una influencia inhibidora. Sin embargo, fue posible identificar una concentración (0.453 mg/ml correspondiente a una relación molar de excipiente/interferón beta-1 a igual a 500) que parece impedir la agregación de proteína. El ascorbato se escogió entonces como posible excipiente para formulaciones de interferón beta-1 a, con el propósito de combinar su acción antioxidante con un efecto de anti-agregación específico.

Dicroismo circular En las figuras 6A y 6B, el desdoblamiento térmicamente inducido, entre 25°C y 85°C, y espectros lejano-UV de una muestra volumétrica de interferón beta-1 a (aproximadamente 44 µg/ml) se reportaron. Cabe notar que el valor de Tm estimado es de 64.97 ± 0.31 °C, mientras que la desconvolución de espectro muestra una diferencia remarcable en el contenido de hélice a antes y después de la desnaturalización, tal como 48.0 vs 41.2 % respectivamente. Como comparación, una muestra análoga que contenía hidroxipropíl-beta-ciclodextrina se analizó por dicroismo circular a 700 veces el exceso molar con respecto a la cantidad molar de interferón beta-1 a, siendo la concentración en donde la agregación de proteína es parcialmente inhibida en el experimento de turbidimetría. En las figuras 7A y 7B, la curva de desnaturalización térmica se reporta para una solución que contiene interferón beta-1a aproximadamente 44 µ/mL y HPBCD 2.11 mg/ml (700 exceso molar). El valor de temperatura de fusión estimado fue de 65.46 + 0.50°C, idéntico al concerniente a la proteína sola (64.97°C) en las mismas condiciones operativas (véase figura 5). Aunque la temperatura de fusión de la proteína es constante en presencia del aditivo probado, la reversibilidad del desdoblamiento térmico es muy diferente. Cabe notar que en presencia de HPBCD hay claramente un espacio de hélice alfa de interferón beta-1 a más pequeño entre la situación de pre- y post-desnaturalización (aproximadamente 4% de diferencia versus aproximadamente 7% para la proteína sola), lo que sugiere que la ciclodextrina podría prevenir reacciones irreversibles del interferón beta-1 a, tales como agregación inducida por calor después del desdoblamiento, o ayudar al redoblez de la proteína. Estas observaciones son muy interesantes porque el hallazgo de composiciones de formulación que hacen el desdoblamiento reversible puede ser realmente muy importante para estabilidad a largo plazo (vida de anaquel) que aumentar la temperatura de fusión (véase también Arakawa et al, en Adv. Drug Deliv. Rev. 46 (1-3). 307-326 (2001 )). A fin de caracterizar mejor la interacción de ¡nterferón becta-1a con sal de ascorbato de sodio, se realizó un análisis de CD sobre una muestra de interferón beta-1 a que contenía 500 veces el exceso molar de sal de ascorbato. De hecho, estudios de turbidez cinética revelaron que una solución de ascorbato-interferón beta-1 a, a una relación molar igual a 500, no exhibe agregación de proteína. En la figura 8, el efecto de la temperatura sobre la señal de CD (222 nm) de interferón beta-1 a (aproximadamente 44 g/ml) solo y en presencia de 500 veces el exceso molar de ascorbato (0.194 mg/ml) se muestran. En el caso de la muestra que contiene ascorbato, no fue posible ajustar la curva experimental para estimar el valor de Tm, lo que sugirió un efecto desnaturalizador del excipiente hacia la proteína. De hecho, la comparación de la segunda estructura de la muestra anterior, antes y después de la transición de fusión confirmó un residuo muy bajo de hélice alfa ya en la situación de pre-fusión, tal como 35.0 (vs 48.0 de volumen de interferón beta-1 a en las mismas condiciones). La estructura secundaria del interferón beta-1 a fue incluso más alterada por la presencia del ascorbato después de la transición de fusión, disminuyendo hasta 28.8% (véase la figura 9). Este resultado contrasta con el efecto protector mostrado en la turbidimetría y sugiere que el ascorbato podría inducir cambios conformacionales del ¡nterferón beta-1 a que podrían desestabilizar a la proteína con el tiempo. Por esta razón, se preparó una formulación líquida que contenía ascorbato de sodio, se mantuvo en estabilidad a 25°C y se analizó en puntos de tiempo pre-fijados por SE-CLAR.

Estudio de estabilidad Siguiendo los resultados anteriores, se prepararon dos formulaciones líquidas interferón beta-1 a, que tenían las composiciones mostradas en el cuadro 1 y el cuadro 2, y se mantuvieron a 25°C y 50°C con el tiempo en el caso de la formulación 1 y a 25°C en el caso de la formulación 2. Como un control, el volumen de interferón beta-1 a (50 mM en regulador de pH de acetato a la misma concentración) también se probó.

CUADRO 1 Composición de formulación líquida de interferón beta-1 a que contiene HPBCD (formulación 1) CUADRO 2 Composición de formulación líquida de interferón beta-1 a que contiene ascorbato de sodio (formulación 2) Las muestras del estudio de estabilidad se analizaron por SE-CLAR como se describe en la sección de método y los resultados se reportan en el cuadro 3 (formulación 1 ), cuadro 4 (formulación 2) y cuadro 5 (volumen de interferón beta-1 a/control).

CUADRO 3 Resultados del estudio de estabilidad por SE-CLAR sobre la formulación 1 a 25°C v 50°C CUADRO 4 Resultados del estudio de estabilidad por SE-CLAR sobre la formulación 2 a 25°C CUADRO 5 Resultados del estudio de estabilidad por SE-CLAR sobre la formulación de control de interferón beta-1 a a 25°C v 50°C A partir de los resultados en el cuadro 3, se puede ver claramente que la formulación líquida de interferón beta-1 a que contiene HPBCD es estable a 25°C y 50°C durante 1 mes: el nivel de agregación es muy bajo, siendo el contenido de monómero por arriba de 90% incluso después de 1 semana a 50°C. Además, la recuperación de masa es por arriba de 90% lo que sugiere que también la formación de agregados insolubles se podría reducir al mínimo por la presencia de la ciclodextrina. En comparación, el volumen de interferón beta-1 a por sí solo conduce a agregado a ambas temperaturas consideradas (véase cuadro 5): a 50°C después de 1 semana, el contenido de monómero disminuye hasta 83 % y en paralelo, la recuperación de masa fue sólo de aproximadamente 73%. Los últimos resultados concuerdan con las mediciones de turbidimetría y dicroismo circular que han sugerido un efecto benéfico de HPBCD sobre la agregación de interferón beta-1 a y estabilidad conformacional. Finalmente, los resultados mostrados en el cuadro 4 relacionados con la formulación 2 (que contiene sal de ascorbato) indican que la formulación no es estable a 25°C: un incremento significativo de dímeros y agregados y una disminución paralela de recuperación de masa se registraron después de 1 mes a 25°C. Más aún, un pico desconocido apareció en el cromatograma, lo que sugirió la presencia de conformación posiblemente cambiada, como lo sugieren también los resultados de CD. Esta fue la razón por la cual la estabilidad de la formulación que contenía ascorbato no se realizó a temperaturas más altas (v.gr. 50°C). En el último caso, fue importante verificar el resultado prometedor inicial obtenido por análisis de turbidimetría con métodos alternativos tales como dicroismo circular que es capaz de monitorear el efecto de un excipiente conocido sobre la estabilidad de conformación de la proteína.

Prueba de turbidimetría a pH superior Se investigó el efecto sobre la agregación de interferón beta-1 a de HPBCD en un intervalo de pH más amplio de la formulación líquida (es decir, pH de aproximadamente 3.0 a aproximadamente 4 0). El método consistió en la prueba turbidimétrica anteriormente descrita: volumen de interferón beta-1 a se diluyó 1 :2 con una solución de PEG ,000 30 mg/ml en PBS (0.2 µm 0 filtrado y apropiadamente basificado añadiendo un volumen pequeño de NaOH 1 N) y después se incubó en un baño de agua termostático a T = 62+2°C durante 10 minutos. La agregación de proteína se monitoreó durante 30 minutos a 360 nm usando un sistema de espectrofotómetro de luz UV-visible (Perkin Elmer Lambda 40). Cada análisis de turbidez se repitió por duplicado y se reportó la curva de densidad óptica (DO) 360 nm versus promedio de tiempo. La agregación de la proteína sola se comparó con interferón beta-1 a en presencia de ciclodextrina. La dilución de regulador de pH de acetato 50 mM (es decir, medio de volumen de IFN) 1 :1 por PBS conduce a un pH de solución final de 4.4. La finalidad, por lo tanto, fue investigar la agregación de proteína para pH final más alto. La figura 10 muestra la cinética de agregación de interferón beta- la en ausencia y en presencia de un exceso de 700x M de HPBCD (5.56 mg/ml), con un pH de la solución analizada igual a 4.7 a temperatura ambiente. Cabe notar que un incremento de pH aumenta el grado de agregación de 1FN, pero la presencia de ciclodextrina aún inhibe parcialmente la desestabilización de proteína. El porcentaje relativo de DO (es decir, la relación de porcentaje entre DO de 360 nm después de 30 minutos en presencia y en ausencia del excipiente) calculado para este experimento es 66 %, no tan lejos de lo que se observó en las condiciones operativas usuales a pH más bajo (52. 7 %). El estudio se extendió a un pH superior, es decir, 5.1 , como se muestra en la figura 11 : se investigó el efecto de HPBCD a un exceso de 700 M (5.56 mg/ml) y de RMBCD a un exceso de 500 M (3.38 mg/ml) sobre la agregación de IFN. Cabe notar una desestabilización de proteína más marcada debido al incremento de pH y la casi total ausencia de una tendencia cinética (es decir, la región de meseta al principio del análisis). El hallazgo interesante es que la agregación de IFN es aún parcialmente inhibida por ciclodextrinas, con un porcentaje relativo de DO igual a 69.7% en el casó de HPBCD (no se puede observar ventaja por el uso del derivado de metilo en este caso). Se investigó un tercer valor de pH. La figura 12 muestra cinética de agregación de IFN en PEG/PBS a pH 5.7 y el efecto de adición de un exceso molar de 700x de HPBCD. El excipiente no evita desestabilización de proteína, pero reduce significativamente su extensión con respecto a control de IFN (porcentaje relativo de DO 62-5 %). Las consideraciones anteriores indican que el uso de HPBCD como excipiente estabilizador se podría extender a la formulación líquida a pH mayor que el valor característico del volumen de proteína (es decir, pH 3.8 0.5).

Conclusiones • Algunas formulaciones líquidas de interferón beta-1 a se prepararon y mantuvieron en estabilidad a temperatura ambiente (25°C) y en condiciones aceleradas (50°C). • La formulación más estable contiene L-metionina, HPBCD y manitol. Los resultados de SE-CLAR muestran un contenido de monómero por arriba de 90% después de 1 semana a 50°C o 1 mes a 25°C. • El resultado positivo de HPBCD se previo y se confirmó por medición de turbidimetría que mostró un efecto de inhibición dependiente de la concentración de este excipiente, (y parcialmente también de L-metionína), hacia agregación de interferón beta-1 a. Además, el análisis de CD mostró que en presencia de HP-beta-ciclodextrina hay claramente una pérdida de hélice a de interferón beta-1 a más pequeña después de transición de fusión. • El volumen de interferón beta-1 a, mantenido en las mismas condiciones de almacenamiento, exhibe un perfil de estabilidad diferente; el contenido de monómero disminuyó hasta 83% después de 1 semana a 50°C. Cabe notar que a 25°C el contenido de monómero después de 1 mes es aún igual a 97 %, lo que es sorprendentemente alto. Este resultado se podría explicar por el hecho de que el volumen contiene regulador de pH de acetato a pH 3.8. Esta condición tiene por sí misma un cierto grado de efecto de estabilización para interferón beta-1 a. • Un resultado negativo claro en el estudio de estabilidad se encontró con la formulación que contiene sal de ascorbato. SEC muestra una pérdida de monómero remarcable (hasta 60%) a 25°C después de 1 mes. En paralelo, un efecto negativo sobre la conformación de interferón beta-1 a también se mostró por análisis de CD.

Fabricación de la sustancia farmacéutica Preparación de una solución 9M de hidróxido de sodio Una solución 1 M de hidróxido de sodio se preparó en WFI.

Preparación de regulador de pH de acetato de sodio 0.05 M, pH 3.8 (100 ml) En un matraz volumétrico que contiene 80 ml de agua MilliQ se añade 0.286 ml de ácido acético (glacial), y después de agitarse, se añade 0.500 ml de NaOH 1 M y agua hasta 100 ml; pH=3.8±0.05.

Preparación de la solución de excipiente Una solución concentrada (10-veces) de HPBCD y L-metionina en regulador de pH de acetato se prepara en un matraz volumétrico de polipropileno. En el matraz de polipropileno se añade la cantidad adecuada de regulador de pH de acetato 50 mM que contiene 5 g de manitol. La solución se lleva a homogeneidad al voltear de arriba hacia abajo tres veces.

Combinación de la solución de sustancia de fármaco La cantidad requerida B (g) de sustancia de fármaco de Interferón beta-1 a se añade a la cantidad requerida de solución de excipiente V (g) y se agita suavemente hasta homogeneidad.

Llenado de jeringas Jeringas de vidrio de 1 ml pueden ser llenadas asépticamente la solución final.

Referencias 1. Arakawa, Prestrelski, Kenney y Carpenter (2001), "Factors affecting short-term and long-term stabilities of proteins", Adv. Drug Deliv. Rev. 46 (1-3): 307-326; 2. Brewster et al., 1991 , Pharmaceutical research, New York, 8 (6), 792-795; 3. Cancellierí et al., Biopolymers, Vol 13,735-743, 1974; 4. Clegg y Bryant, Exp. Opin. Parmacother 2001; 2 (4): 623-639; 5. Derynk R. et al., Nature 1980; 285,542-547; 6. Familletti, P.C., Rubinstein, S., y Pestka, S. 1981 "A Convenient and Rapid Cytopathic Effect Inhibition Assay for Interferon," en Methods in Enzymology, Vol. 78 (S. Pestka, ed.), Academic Press, New York, 387-394; 7. Hultgren C, Milich DR, Weiland O, Sallberg M. (1998) The antiviral compound ribavirin modulates the T helper (Th) 1/Th2 subset balance in hepatitis B and C virus-specific immune responses. J Gen Virol 1998; 79: 2381-2391 ; 8. Irie et al., 1999, Adv. Drug Deliv. Rev, Vol 36, 101-123; 9. McCormick JB, King IJ, Webb PA, Scribner CL, Craven RB, Johnson KM, Elliott LH, Belmont-Williams R. Lassa fever. Effective therapy with ribavirin. N Engl J Med. 1986 Jan 2; 314 (1) : 20-6; 10. Mark D. F. et al, Proc. Nati Acad. Sci. U. S. A, 81 (18) 5662-5666 (1984); 11. Pagington, Chemistry in Britain, pp. 455-458 (1987); 12. Pestka, S. (1986) "Interferon Standards and General Abbreviations, in Methods in Enzymology (S. Pestka, ed. ), Academic Press, New York 119,14-23; 13. Pitha et al, International Joumal of Pharmaceutics, 29,73-82 (1986); 14. Pitha et al, en Controlled Drug Deliver, ed. S. D. Bruck, Vol. I, CRC Press, Boca Ratón, Fia., pp. 125-148 (1983); 15. Rubinstein, S., Familletti, P.C., y Pestka, S-Convenient Assay for Interferons. J. Virol 1981 ; 37, 755-758; 16. Shepard H. M. et al., Nature 1981 ; 294,563-565; 17. T. Irie et al., Cyclodextrins in peptide and protein delivery, Adv. Drug Deliv. Rev, Vol 36,101-123 (1999); 18. Study Group. The Lancet 1998; 352,1498-1504; 19. Uekama et al, ¡n CRC Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, Vol. 3 (1 ), 1-40 (1987); 20. Uekama, en Topics in Pharmaceutical Sciences 1987, eds.

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Claims (31)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una composición farmacéutica líquida estabilizada que comprende un ¡nterferón (IFN) o una isoforma, muteína, proteína fusionada, derivado funcional, fracción activa o sal del mismo, en donde dicha formulación es una solución que comprende un regulador de pH, 2- hidroxipropil-beta-ciclodextrina, un agente de isotonicidad y un antioxidante.

2.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el ¡nterferón es IFN-beta.

3.- La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada además porque el IFN-beta es IFN-beta humano recombinante.

4.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque el regulador de pH está presente en una cantidad suficiente para mantener el pH de la composición dentro de más o menos 0.5 unidades de un pH especificado, en donde el pH especificado es aproximadamente 3 a aproximadamente 6.

5.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque el pH es 3.8.

6.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque el regulador de pH está presente a una concentración de aproximadamente 5 mM a 500 mM.

7.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque el regulador de pH está presente a una concentración de aproximadamente 50 mM.

8.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque el regulador de pH es un regulador de pH de acetato.

9.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque el agente de isotonicidad es manitol.

10.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque el agente de isotonicidad está presente a una concentración de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 500 mg/ml.

11.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque el agente de ¡sotonicidad está presente a una concentración de aproximadamente 50 mg/ml.

12.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque el antioxidante es metionina.

13.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque el antioxidante está presente a una concentración de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5 mg/ml.

14.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque el antioxidante está presente a una concentración de aproximadamente 0.1 mg/ml.

15.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque el interferón está presente a una concentración de aproximadamente 10 µg/ml a aproximadamente 800 µg/ml.

16.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque la ciclodextrina está presente a una relación molar vs. interferón de 500 veces el exceso molar hasta 700 veces el exceso molar.

17.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque el interferón está presente a una concentración de aproximadamente 44, 88 ó 276 µg/ml.

18.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque la composición es una solución acuosa.

19.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque comprende un agente bacteriostático.

20.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque el agente bacteriostático es alcohol bencílico.

21.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque el agente bacteriostático está presente a una concentración de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 2%.

22.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque el agente bacteriostático está presente a una concentración de aproximadamente 0.2 ó 0.3%.

23.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque el agente de isotonicidad es manitol, el antioxidante es metionina y el interferón es interferón beta.

24.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada además porque la composición es la siguiente formulación líquida: ¡nterferón beta-1 a 44 pg/ml; HPBCD 1.9 mg/ml; metionina 0.1 mg/ml; manitol 50 mg/ml; regulador de pH de acetato hasta 1 ml.

25.- Un método para preparar una composición farmacéutica líquida estabilizada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en donde el método comprende añadir cantidades calculadas de 2-hidroxipropil-beta-ciclodextrina, antioxidante y agente de ¡sotonicidad a la solución regulada en su pH y después añadir el interferón (IFN) o una isoforma, muteína, proteína fusionada, derivado funcional, fracción activa o sal del mismo.

26.- Un contenedor herméticamente sellado en condiciones estériles y apropiado para almacenarse antes de usarse, que comprende ia formulación farmacéutica líquida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24.

27.- El contenedor de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque el contenedor es una jeringa pre-llenada para administración de una sola dosis.

28.- El contenedor de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque el contenedor es un vial.

29.- El contenedor de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque el contenedor es un cartucho para un auto-inyector.

30. El contenedor de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29, caracterizado además porque el contenedor es para administración de una sola dosis o dosis múltiples.

31.- Un equipo para administración de dosis múltiples de una composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29, en donde dicho equipo comprende un primer contenedor llenado con una composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 y un segundo cartucho llenado con una solución del agente bacteriostático.