ES2367227T3

ES2367227T3 - Adenovirus con mutaciones en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de la proteína e3-19k y su utilización en el tratamiento del cáncer.

Info

Publication number: ES2367227T3
Application number: ES08735417T
Authority: ES
Inventors: Manel Maria Cascallo Piqueras; Alena Gros; Ramon Alemany Bonastre
Original assignee: Institut Catala dOncologia
Current assignee: Institut Catala dOncologia
Priority date: 2007-03-14
Filing date: 2008-03-12
Publication date: 2011-10-31
Anticipated expiration: 2028-03-12
Also published as: EP2137301B1; EP2137301A2; CA2680659C; PT2137301E; US20100124546A1; CN101702918A; HK1143992A1; JP2010520762A; US8974777B2; CA2680659A1; WO2008110579A3; ATE510907T1; JP5746823B2; DK2137301T3; CN101702918B; WO2008110579A2; JP2015043777A

Abstract

Adenovirus replicativo que comprende una mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K que evita la retención de E3-19K en el retículo endoplasmático y además comprende una modificación genética para conseguir replicación selectiva en tumores.

Description

SECTOR DE LA INVENCIÓN

El sector de la invención está relacionado de forma general con el tratamiento del cáncer y más particularmente con los adenovirus que contienen el gen E3-19K mutado en su dominio de retención en el retículo endoplasmático y la utilización de estos adenovirus para tratar el cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El tratamiento actual del cáncer se basa principalmente en quimioterapia, radioterapia y cirugía. A pesar de existir una alta tasa de éxito cuando el tratamiento se aplica en las primeras etapas, la mayoría de los casos de enfermedad avanzada no son curables, porque los tumores no pueden extirparse mediante cirugía o las dosis de radio y quimioterapia que pueden ser administradas están limitadas por la toxicidad para las células normales. Para aliviar este problema, se han desarrollado estrategias de biotecnología que buscan una mayor selectividad y potencia. Entre ellas, la terapia génica y la viroterapia utilizan virus con una finalidad terapéutica contra el cáncer. En la terapia génica, el virus se modifica para evitar su replicación y para que funcione como un vehículo o vector de material genético terapéutico. Por el contrario, la viroterapia utiliza virus que se replican y se propagan de forma selectiva en células tumorales. En la viroterapia, la célula tumoral muere por el efecto citopático causado por la replicación del virus dentro de la célula en lugar de por el efecto de un gen terapéutico. La replicación preferencial en una célula tumoral se conoce como oncólisis. Los virus que se replican de manera selectiva en tumores se conocen como virus oncolíticos.

La viroterapia del cáncer es más antigua que la terapia génica. Los primeros informes sobre la cura del cáncer con virus datan del comienzo del siglo pasado. En 1912, De Pace obtuvo regresiones tumorales después de la inoculación del virus de la rabia en carcinomas de cuello uterino (De Pace N. Sulla scomparsa di un enorme cranco vegetante del collo dell'útero senza cura chirurgica. Ginecología 1912; 9:82-89). Desde entonces, se han inyectado muchos tipos de virus en tumores para su tratamiento. Hay virus que presentan un oncotropismo natural, tales como parvovirus autónomo, virus de la estomatitis vesicular y reovirus. Otros virus se pueden manipular genéticamente para lograr la replicación selectiva en tumores. Por ejemplo, el virus del herpes simple (HSV) se ha convertido en oncotrópico al eliminar el gen de la ribonucleótido reductasa, una actividad enzimática que no es necesaria en las células en curso de proliferación activa tales como las células tumorales. Sin embargo, el adenovirus, debido a su baja patogenicidad y alta eficacia para infectar las células tumorales ha sido el virus más comúnmente utilizado en viroterapia y terapia génica del cáncer.

Se han identificados cincuenta y un serotipos de adenovirus y se agrupan en seis grupos diferenciados, de A a F.

El adenovirus humano tipo 5 (Ad5), que pertenece al grupo C, consiste en una cápsida proteica icosaédrica que contiene un ADN lineal de 36 kilobases. En adultos, la infección por Ad5 suele ser asintomática y provoca resfriados y conjuntivitis en niños. En términos generales, Ad5 infecta las células epiteliales, que en una infección natural son las células epiteliales bronquiales. Entra en la célula mediante la interacción de la fibra, una proteína del virus que se extiende como una antena desde los doce vértices de la cápsida, con una proteína celular involucrada en la adhesión intercelular conocida como Receptor Coxsackie-Adenovirus (CAR). Cuando el ADN del virus alcanza el núcleo, comienza la transcripción de los genes tempranos (E1 a E4). Los primeros genes que se expresan son los de la región 1A temprana (E1A). E1A se une a la proteína celular pRb (proteína retinoblastoma) para liberar el factor de transcripción E2F para activar la transcripción de otros genes de virus tales como E2, E3 y E4, y de genes celulares que activan el ciclo celular. Por otro lado, E1 B se une al factor de transcripción p53 para activar el ciclo celular e inhibir la apoptosis de la célula infectada. E2 codifica proteínas para la replicación del virus. E3 codifica proteínas que inhiben la respuesta inmune antiviral. E4 codifica proteínas para transportar ARN del virus. La expresión de genes tempranos conduce a la replicación del genoma y, una vez replicado, a la activación del promotor tardío principal. Este promotor impulsa la expresión de un ARNm que se procesa mediante empalme diferencial para obtener todos los ARN que codifican las proteínas estructurales que forman la cápsida.

Como es particularmente relevante para la presente invención, las proteínas E3 se describen con más detalle. En la fase temprana del ciclo de vida del virus, antes de la replicación del genoma, los genes E3 se expresan a partir del promotor E3. Este promotor impulsa la expresión de un pre-ARNm, que genera nueve diferentes ARNm mediante empalme. En la mayoría de los serotipos de adenovirus, a saber los de los grupos B, C, D y E, se sintetizan siete proteínas (polipéptidos) a partir de estos ARNm: E3-12.5K, E3-6.7K, E3-19K, E3-11.6K (también conocida como proteína de muerte de adenovirus o ADP), E3-10.4K (RIDalpha), E3-14.5K (RIDbeta) y E3-14.7K (de la posición izquierda a la derecha en el genoma). En la fase tardía, el promotor E3 es reprimido y se activa el promotor tardío principal. A partir de este promotor se sintetiza un pre-ARNm que da diferentes ARNm mediante empalme. La única proteína E3 sintetizada a partir de estos ARNm tardíos es E3-11.6K (ADP). ADP o E3-11.6K es una proteína de membrana integral situada en las membranas del núcleo, del aparato de Golgi y del retículo endoplasmático. Ésta desempeña un papel en la lisis de la célula infectada. Las proteínas E3 restantes tienen funciones relacionadas con la inhibición de la respuesta inmune contra la célula infectada. Por ejemplo, E3-6.7K, RIDalpha, RIDbeta y E3-14.7K protegen la célula de la apoptosis mediada por TNF. E3-19K es una proteína de membrana que retiene las proteínas clase 1 del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC-I) en el retículo endoplasmático. Por lo tanto, E3-19K evita la presentación de antígenos en la membrana de las células infectadas. Existen dos regiones o dominios peptídicos principales para mediar esta función de E3-19K. Uno de ellos es el dominio de unión E3-19K MHC-I. El otro es una secuencia peptídica en el extremo carboxi-terminal de E3-19K que conserva la proteína en el retículo endoplasmático y evita su tránsito a la membrana celular. La descripción de estos dominios funcionales de E3-19K con mutaciones específicas de estos dominios se ha realizado utilizando E3-19K aislado en plásmidos de expresión (Gabathuler R, Kvist S. The endoplasmatic reticulum retention signal of the E3/19K protein of adenovirus type 2 consist of three separate amino acid segments at the carboxy terminus. J Cell Biol. 1990; 111 (5 Pt 1) :1803-10).

Existen dos puntos importantes a considerar en relación con el diseño de adenovirus oncolíticos: selectividad y potencia. Para lograr selectividad hacia una célula tumoral se han utilizado dos estrategias: la supresión de las funciones del virus que no son necesarias en las células tumorales y la sustitución de promotores virales con promotores selectivos de tumor. Con dichas modificaciones genéticas, se ha obtenido un considerable nivel de selectividad, con una eficiencia replicativa en una célula tumoral 10000 veces superior a la de una célula normal. Con respecto a la potencia oncolítica, también se han descrito varias modificaciones genéticas para aumentarla. Estas modificaciones afectan tanto la entrada del virus en la célula o la liberación del virus de la célula. Para aumentar el paso de entrada, se han modificado las proteínas de la cápsida que el virus utiliza para infectar la célula. Por ejemplo, la inserción del péptido RGD (motivo arginina-glicina-asparagina) en la fibra permite al adenovirus utilizar integrinas para atracar en la célula y no sólo internalizar como es el caso de los adenovirus de tipo salvaje. El uso de las integrinas como receptores celulares del virus aumenta la infectividad y la potencia oncolítica. En cuanto a las modificaciones que aumentan la liberación de los virus de la célula infectada, se han descrito dos: la supresión de E1B-19K y la sobre-expresión de E3-11.6K (ADP). E1 B-19K es un homólogo del inhibidor de la apoptosis de Bcl

2. La supresión de E1B-19K aumenta la muerte celular por apoptosis prematura de la célula infectada. Esta apoptosis prematura a menudo resulta en una producción total de virus menor en muchas líneas celulares infectadas, sin embargo, acelera la liberación rápida del virus y, a su vez, la propagación del virus en un cultivo celular. En consecuencia, los mutantes que no expresan E1B-19K presentan un fenotipo de placas grandes en comparación con el adenovirus de tipo salvaje en un ensayo de placa. Otra estrategia utilizada para aumentar la potencia oncolítica del adenovirus es la sobre-expresión de la proteína E3-11.6K (ADP). Esta proteína desempeña un papel en la lisis de la célula infectada y la sobre-expresión de ADP aumenta la liberación de los virus acumulados en el interior del núcleo. El fenotipo de los virus que sobre-expresan ADP también se caracteriza por presentar placas grandes y la presencia de más virus en el sobrenadante de las células infectadas. La sobre-expresión de ADP se ha logrado mediante dos mecanismos: 1) La eliminación de otros genes E3, excepto ADP, o excepto ADP y E3-12.5K. Esta supresión elimina otros sitios de empalme en el pre-ARN impulsado por el promotor E3. Sin la competencia por estos sitios de empalme, el procesamiento del ARNm que codifica ADP se ve favorecido. 2) La inserción del gen ADP después de un promotor fuerte.

La presente invención da a conocer un mecanismo nuevo y mejorado para aumentar la liberación de los adenovirus de la célula infectada en base a una mutación de la proteína E3-19K.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

De forma específica, la presente invención se refiere a un aumento de la liberación de adenovirus en base a la mutación del dominio de retención en el retículo endoplasmático de la proteína E3-19K. La presente invención demuestra que el fenotipo asociado a la mutación que afecta la localización celular de E3-19K no está asociado a la sobre-expresión de ADP y, por lo tanto, es un mecanismo diferente que no se ha descrito anteriormente, ni se ha sugerido para aumentar la liberación de los adenovirus hacia fuera de la célula infectada.

Se llevó a cabo una mutagénesis aleatoria del genoma del adenovirus 5 seguida de una selección de mutantes que han adquirido una mayor potencia oncolítica. La mutagénesis con nitrito de sodio genera mutaciones en transición, en las que se produce una desaminación de bases de nucleótidos. Después de la replicación del ADN, estas bases desaminadas generan nuevos emparejamientos y se fijan las mutaciones. Después de la mutagénesis de un stock del adenovirus 5, el conjunto resultante se amplificó en una línea celular de cáncer y se purificó con procedimientos habituales. El stock de virus se corresponde con el Material de Referencia de Adenovirus (ARM) (archivo de secuencia de GenBank AY339568). El proceso de bioselección de mutantes oncolíticos se llevó a cabo in vivo en ratones inmunodeficientes (ratones desnudos) con tumores humanos previamente inoculados. Los virus que persistieron por más tiempo en la sangre y que se replicaron de manera más eficiente en los tumores se aislaron, se amplificaron y se inyectaron de nuevo en ratones portadores de tumores en las siguientes rondas de bioselección. Existe un ejemplo de la utilización de este método aleatorio para descubrir mutantes que presentan una mayor potencia oncolítica, aunque el proceso de bioselection utilizado en este precedente es diferente (Yan W, Kitzes G, Dormishian F, L Hawkins, Sampson-Johannes A, Watanabe J, y otros. Developing novel oncolytic adenoviruses through bioselection. J Virol 2003; 77 (4):2640-50). En este precedente se descubren otras mutaciones diferentes al objeto de la presente invención.

La presente invención se refiere a un adenovirus caracterizado porque comprende una mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K. En particular, se elimina o se modifica el dominio carboxi-teminal de E3-19K para evitar la retención de E3-19K en el retículo endoplasmático y provocar su tránsito a la membrana plasmática. Un adenovirus que se replica y que contiene esta mutación particular de E3-19K se libera de manera más eficiente de la célula infectada. Esta mayor liberación provoca un mayor efecto oncolítico. Este efecto oncolítico mejorado es útil para tratar el cáncer.

La identificación de que la mutación del extremo carboxi-terminal de E3-19K aumenta la liberación de adenovirus de la célula infectada es sorprendente ya que la función descrita de E3-19K es una función inmunomoduladora. En particular, una función descrita para E3-19K se refiere a la unión a MHC-I y a la retención de MHC-I en el retículo endoplasmático para evitar el tránsito de MHC-I a la membrana plasmática y la presentación de antígenos asociados a MHC-I. En consecuencia, el fenotipo de los mutantes de adenovirus que no expresan E3-19K se caracteriza por la presencia de MHC-I en la membrana plasmática y por una mayor respuesta inmunitaria contra el virus. Este fenotipo no afecta la propagación de los adenovirus en cultivos celulares in vitro y, por tanto, los expertos en el campo de los adenovirus como vectores de terapia génica comúnmente han eliminado toda la región E3 sin efectos adversos sobre la producción de virus. Además de este conocimiento sobre el fenotipo de los adenovirus que no expresan E319K, el fenotipo que caracteriza los adenovirus con eliminaciones parciales de E3-19K no es conocido porque el estudio funcional de los dominios de E3-19K se ha realizado con la proteína E3-19K aislada, fuera del contexto del adenovirus (Gabathuler R, Kvist S. The endoplasmatic reticulum retention signal of the E3/19K protein of adenovirus type 2 consists of three separate amino acid segments at the carboxy terminus. J Cell Biol 1990; 111 (5 Pt 1):180310). Estos estudios nunca han sugerido que la supresión de la cola carboxi-terminal o del dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K puede incrementar la liberación de virus. Por lo tanto, no existe conocimiento racional previo que sugiera que la modificación del dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K puede resultar en una mayor liberación de adenovirus de la célula infectada. Este resultado surge del cribado de una biblioteca de mutantes aleatorios de adenovirus, llevado a cabo en la presente invención, utilizando procedimientos que favorecen la selección de adenovirus que se liberan de manera más eficiente de las células infectadas.

De esta manera, la presente invención se refiere a un adenovirus replicativo que comprende una mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K. que evita la retención de E3-19K en el retículo endoplasmático, y además comprende una modificación genética para lograr la replicación selectiva en tumores.

La mutación de E3-19K considerada en la presente invención puede ser una inserción, modificación o supresión de uno o más pares de bases de la secuencia del gen que codifica E3-19K. En todos los casos el efecto es el mismo: se produce un cambio en el dominio de retención en el retículo endoplásmatico de E3-19K que se traduce en la reubicación de E3-19K de la membrana endoplásmatica a la membrana plasmática.

En una realización de la presente invención, el adenovirus replicativo es mutado en uno o más genes del grupo E1a, E1b y VA-ARNs para lograr la replicación selectiva en tumores.

En otra realización de la presente invención, el adenovirus replicativo comprende un promotor específico de tejido o un promotor específico de tumor para lograr la replicación selectiva en tumores.

En otra realización de la presente invención, el adenovirus replicativo comprende secuencias promotoras para controlar la expresión de uno o más genes del grupo E1a, E1b y VA-ARNs para lograr la replicación selectiva en tumores.

En otra realización de la presente invención, el adenovirus replicativo comprende modificaciones en la cápsida para aumentar su infectividad o fijar como diana a un receptor presente en una célula tumoral.

En otra realización de la presente invención, el adenovirus replicativo además comprende genes comúnmente utilizados en el sector de la terapia génica del cáncer. Preferentemente, los genes comúnmente utilizados en el sector de la terapia génica se seleccionan del grupo que comprende genes que activan profármacos, genes supresores de tumores y genes inmunoestimuladores.

En otra realización de la presente invención, el adenovirus replicativo comprende modificaciones del genoma que resultan en una mejora de la expresión de dicha proteína E3-19K.

En otra realización de la presente invención, el adenovirus replicativo comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 4.

El adenovirus replicativo de la presente invención expresa un dominio de retención en el retículo endoplásmatico de E3-19K con una cola carboxi-terminal que tiene una secuencia SEQ ID NO: 5.

En otra realización de la presente invención, el adenovirus replicativo comprende, como mínimo, la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8.

El adenovirus replicativo de la presente invención expresa un dominio de retención en el retículo endoplásmatico de E3-19K con una cola carboxi-terminal que tiene una secuencia SEQ ID NO: 2; y que contiene la inserción del motivo RGD (definido de la posición 1648 a 1656 de SEQ ID NO: 8); y regiones regulatorias que confieren replicación selectiva de dicho adenovirus en células tumorales, consistiendo dichas regiones regulatorias en aislante DM1 (definido de la posición 367 a 1095 de SEQ ID NO: 7), un fragmento del promotor E2F1 (definido de la posición 1282 a 1545 de SEQ ID NO: 7), la secuencia kozak ccacc (definida de la posición 1546 a 1550 de SEQ ID NO: 7) y el gen de adenovirus mutado E1a-Δ24 (definido de la posición 1551 a 2512 de SEQ ID NO: 7).

Otro objeto de la presente invención es un adenovirus replicativo que comprende una mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K, que evita la retención de E3-19K en el retículo endoplasmático, en el que dicho adenovirus comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1.

En otro aspecto de la presente invención, el adenovirus replicativo expresa un dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K con una cola carboxi-terminal que tiene una secuencia SEQ ID NO: 2.

Otro objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende una dosis farmacológicamente eficaz de un adenovirus replicativo y uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Otro objeto de la presente invención es un adenovirus replicativo, tal como se define anteriormente para su uso como medicamento.

El adenovirus replicativo de la presente invención es un agente profiláctico y/o terapéutico del cáncer.

La presente invención también da a conocer un nuevo procedimiento para tratar el cáncer que comprende la administración de un adenovirus replicativo que contiene una mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K.

Otro objeto de la presente invención es la utilización de los adenovirus replicativos tal como se definieron anteriormente, en la preparación de una formulación farmacéutica para el tratamiento o la prevención del cáncer o la enfermedad pre-maligna que conduce al cáncer.

En otra realización, el adenovirus mutante de E3-19K de la presente invención puede ser utilizado en combinación con otras terapias contra el cáncer tales como quimioterapia o radioterapia.

La presente invención se refiere a un adenovirus replicativo que contiene una mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K y la utilización de dicho adenovirus para el tratamiento o la prevención de cáncer o una enfermedad pre-maligna que conduce al cáncer. Existen informes anteriores sobre la sobreexpresión de E3-11.6K (ADP) o la eliminación de E1 B-19K en adenovirus oncolíticos. Contrario a la presente invención, estas modificaciones descritas anteriormente no implican ni requieren la localización de E3-19K en la membrana plasmática y su mecanismo de acción es diferente. Antes de la presente invención, la actividad de una proteína E319K incapaz de permanecer anclada en el retículo endoplasmático nunca ha sido analizada en el genoma del virus. La actividad de dicha proteína en relación con el aumento de la potencia oncolítica asociada con la liberación de virus es sorprendente, porque la única función que se describe para E3-19K es la de la unión a MHC-I y, a través de esta unión, E3-19K disminuye la presentación de antígenos y la respuesta inmune.

Los adenovirus que contienen una mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K objeto de la presente invención se propagan y se amplifican en líneas celulares de uso común en el sector de la terapia génica y viroterapia, tales como HEK-293 y A549. Los procedimientos para purificar un adenovirus que contiene una mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K para su utilización en el tratamiento del cáncer son los mismos procedimientos que los descritos para otros adenovirus y vectores de adenovirus utilizados en viroterapia y terapia génica del cáncer.

La presente invención se refiere a la necesidad de mejorar las terapias del cáncer, incluyendo, sin constituir limitación, cáncer de páncreas, cáncer de colon y cáncer de pulmón. El tratamiento del cáncer con un adenovirus oncolítico que contiene una mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K se puede llevar a cabo mediante inyección directa del virus en el interior del tumor o mediante administración sistémica en pacientes con cáncer utilizando métodos estándar en el sector de la terapia génica y viroterapia con adenovirus.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Los dibujos adjuntos se han incluido en el presente documento a fin de que se aclaren las características mencionadas anteriormente, las ventajas y las construcciones y se puedan entender en detalle. Estos dibujos forman parte de la memoria e ilustran realizaciones preferentes, pero no deben ser considerados como limitativos del alcance de la presente invención.

FIGURA 1. Representación esquemática del genoma del adenovirus humano serotipo 5 (archivo de secuencia en GenBank AY339865). Convencionalmente, el genoma lineal de 35.934 pares de bases se divide en 100 unidades de mapa (mu) de izquierda a derecha. Se indican las regiones que codifican ARNs tempranos (E1 a E4) y tardíos (L). La región E3 codifica siete proteínas derivadas de un transcripto de pre-ARNm mediante empalme diferencial. La presente invención se refiere a la proteína E3-19K y las mutaciones que afectan su cola carboxi-terminal.

FIGURA 2. Característica fenotípica de placas grandes del AdT1 mutante. Este mutante se obtuvo mediante mutagénesis aleatoria del genoma del adenovirus humano tipo 5 (archivo de secuencia en GenBank AY339865), seguida de un cribado en base al aislamiento del virus de sangre y tumores de ratones con tumores implantados. La citotoxicidad contra células tumorales del adenovirus AdT1 se comparó con la citotoxicidad del adenovirus de tipo salvaje (Adwt). Las células A549 tumorales humanas se sembraron en placas de 6 pocillos. A una confluencia del 80%, éstas se infectaron con diluciones seriadas de Adwt o AdT1. A las 4 horas después de la infección, el virus fue eliminado y la monocapa celular se cubrió con una capa de medio mezclado con agarosa. Las células infectadas se incubaron durante 6 días y, a continuación, se tiñeron con rojo neutro, un colorante absorbido sólo por las células vivas. El resultado muestra que las placas generadas por AdT1 tienen un diámetro mayor que las placas generadas por Adwt (paneles superiores). Los paneles inferiores muestran un aumento de las placas observado en el microscopio óptico (100X) donde se puede notar la mayor citotoxicidad del virus AdT1.

FIGURA 3. Identificación de la mutación que confiere el fenotipo de placas grandes a AdT1. Se construyó una serie de adenovirus mediante recombinación de Adwt y el mutante AdT1 y se estudiaron los recombinantes que presentan un fenotipo de placas grandes. En la figura se representa el genoma de Adwt como una línea fina y el genoma de AdT1 como una línea gruesa. Se secuenció la región común presente en todos los recombinantes que mostraron un fenotipo de placas grandes. En comparación con la secuencia del adenovirus tipo 5 de tipo salvaje se identificó una inserción de un par de bases (A en la cadena en sentido de izquierda a derecha del genoma del virus) en la posición 29173 del adenovirus tipo 5. Esta inserción cambia la señal de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K.

FIGURA 4. Secuencia de la mutación presente en AdT1 (SEQ ID NO: 1) en comparación con la secuencia del adenovirus serotipo 5 de tipo salvaje (Adwt). La secuencia de nucleótidos de Adwt representada corresponde al fragmento de AY339865 que codifica la cola carboxi-terminal de E3-19K (SEQ ID NO: 3). El virus AdT1 se aisló de una biblioteca aleatoria de adenovirus mutantes mediante una selección in vivo (en ratones inmunodeficientes con tumores humanos transplantados) para determinar la persistencia en sangre y en tumores tras la administración intravenosa. El virus AdT1 contiene una inserción de un nucleótido adenosina (A) en la posición 445 del ADN que codifica la proteína E3-19K. Esta mutación (en lo adelante denominada 445-A) cambia la secuencia de aminoácidos y elimina el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K. En comparación con la secuencia de tipo salvaje, la secuencia mutada produce una cola carboxi-terminal más corta.

FIGURA 5. Esquema de la proteína E3-19K y efecto de la mutación 445-A en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K. E3-19K es una glicoproteína transmembránica que se ancla en el retículo endoplasmático de las células infectadas por adenovirus. Funcionalmente, E3-19K contiene un dominio luminal (amino-terminal), que contiene los residuos de aminoácidos que interactúan con las proteínas de clase 1 del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC-1); y un dominio de citoplasma (carboxi-terminal) que contiene una señal positiva para la retención en el retículo endoplasmático (EKKMP o SEQ ID NO: 6). La figura muestra el epítopo reconocido por el anticuerpo Tw1.3, utilizado para la detección de E3-19K. La mutación 445-A es una mutación de cambio de marco en la cola C-terminal que elimina los residuos de aminoácidos 156 a 160 correspondientes a la señal de EKKMP. Esta mutación da lugar a una relocalización de E3-19K en la membrana plasmática.

FIGURA 6. El fenotipo de placas grandes transferido a adenovirus de tipo salvaje mediado por la inserción de la mutación 445-A del dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K. La mutación 445-A presente en AdT1 fue trasferida al virus de tipo salvaje (Adwt) utilizando técnicas de recombinación homóloga de levaduras para obtener el adenovirus Ad19K-445A. También se construyó otro adenovirus mutante que contiene una mutación independiente que elimina la señal de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K, el adenovirus Ad19K-KS, en el que las dos lisinas de la señal (KK) que son responsables de la retención de E3-19K en el retículo endoplasmático, fueron sustituidas por dos serinas (SS) (SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5). El tamaño de las placas de AdT1, Ad19K-445A y Ad19K-KS se comparó en un ensayo de placa. Los tres virus mostraron un fenotipo de placas grandes.

FIGURA 7. Efecto de la mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K sobre la localización celular de E3-19K. Para demostrar que la mutación introducida cambia la localización celular de la proteína E3-19K del adenovirus, se infectó una línea celular tumoral humana (A549) con las mismas dosis de Adwt y AdT1 (1500 partículas virales / célula). Treinta y seis horas después de la infección se recogieron las células y se incubaron en PBS o se permeabilizaron con etanol al 70%. A continuación, las células se incubaron con el anticuerpo Tw1.3 (anti-E3-19K) y este anticuerpo se detectó con un anticuerpo secundario marcado con proteína verde fluorescente. Las suspensiones celulares se pasaron a través de un citómetro de flujo y se muestra el valor medio de tres resultados independientes. Ante la ausencia de permeabilización de la membrana plasmática, la proteína E3-19K se detectó sólo en las células infectadas con AdT1, lo que indica su exposición en la superficie celular.

FIGURA 8. Efecto de la mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K sobre la localización celular de MHC-I. Para demostrar que los cambios en la localización subcelular de la forma mutante de E3-19K modifican la exposición de la clase 1 del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC-1), las células tumorales humanas (A549) se infectaron con dosis equivalentes de Adwt o AdT1 (1500 partículas virales / célula) y 24 horas después de la infección se colectaron las células. A continuación, las células se incubaron con el anticuerpo W6/32 (contra MHC-1) sin permeabilización para marcar exclusivamente la fracción de MHC-1 ubicada en la membrana plasmática. El W6/32 unido se detectó a continuación utilizando un anticuerpo secundario marcado con proteína verde fluorescente. Las células en suspensión se pasaron a través de un citómetro de flujo. Se muestra el valor medio de tres análisis independientes. El MHC-I de las células infectadas con AdT1 es expuesto en la membrana a un nivel similar a la MHC-I de células no infectadas y a un nivel mayor que el MHC-I de las células infectadas con Adwt.

FIGURA 9. Prueba de que el fenotipo de placas grandes asociado a la mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K no depende de la función de MHC-I. En (A) se construyó un adenovirus denominado Ad19K-445A-CS40 que contiene la mutación 445A, que elimina el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K y que también contiene una mutación (CS40) que afecta el dominio de unión a MHC-I de E3-19K. Tras la infección de A549, este mutante mostró el mismo fenotipo de placas grandes que AdT1 lo que indica que la unión a MHC-I no es necesaria para este fenotipo. En el panel inferior (B) se muestra un ensayo de placa de AdT1 en una línea celular que carece de MHC-1 (células DLD-1, de adenocarcinoma de colon humano) y se observa también el fenotipo placas grandes.

FIGURA 10. Prueba de que la mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K no resulta en la sobreexpresión de la proteína de muerte adenoviral (ADP). Se infectaron células de la línea celular A549 con Adwt o AdT1 (1500 partículas virales / célula) y la proteína celular total fue extraída en los puntos de tiempo indicados. Como un control, se utilizaron las mismas células pero sin infección (simulada). Se cargó una cantidad equivalente de extracto de proteína de cada muestra (30 microgramos) en un gel de acrilamida al 15% para separar las proteínas (SDS-PAGE). Después de ejecutar el gel, las proteínas se transfirieron a un filtro de nitrocelulosa (procedimiento Western-blot) y se detectaron con un anticuerpo contra ADP. El resultado muestra que AdT1 y Adwt expresan la misma cantidad de ADP con la misma cinética.

FIGURA 11. Prueba de mayor liberación del virus al sobrenadante de una célula infectada con un adenovirus que contiene una mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K. En (A) se infectaron células A549 con Adwt o AdT1 (1500 partículas virales / célula) y se midió la cantidad de virus liberado al sobrenadante o presente en un extracto de células (virus total) en diferentes momentos. Mientras que el virus total producido es el mismo para Adwt y AdT1, el mutante AdT1 se libera de manera más eficiente al sobrenadante. El panel inferior (B) muestra el mismo experimento aplicado a varias líneas celulares y representa la cantidad de virus detectada en el sobrenadante de las células infectadas en los momentos indicados después de la infección. En todas las líneas celulares AdT1 se libera de manera más eficiente al sobrenadante del cultivo.

FIGURA 12. Liberación del virus al sobrenadante de un cultivo de fibroblastos humanos infectados con un adenovirus que contiene una mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K. Se infectaron fibroblastos humanos con Adwt o AdT1 (4500 partículas virales / célula) y se midió la cantidad de virus liberado al sobrenadante o presente en el extracto de células (virus total) en diferentes momentos. El resultado muestra la mayor liberación de AdT1 virus que contiene una mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K.

FIGURA 13. Efecto antitumoral de un adenovirus que contiene una mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K en comparación con un adenovirus de tipo salvaje. Las células adenocarcinoma de páncreas humano (NP-9) se inocularon por vía subcutánea en ratones inmunodeficientes (desnudos). Cuando se desarrollaron los tumores, los ratones se trataron por vía intravenosa con 2.1010 partículas virales / ratón de adenovirus de tipo salvaje (Adwt) o adenovirus mutante AdT1 (10 ratones / grupo) en una dosis única. Se muestra el porcentaje de crecimiento del tumor como una función del tiempo en relación con el día 0 (tiempo de tratamiento). El resultado demuestra que la mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K aumenta la potencia oncolítica de los adenovirus.

FIGURA 14. Fenotipo de placas grandes transferido a un adenovirus oncolítico mediado por la inserción de la mutación 445-A (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) del dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K. ICOVIR5 (tal como se describe en CASCALLO M, Alonso MM, Rojas JJ, Pérez-Giménez A, Fueyo J. y Alemany R. "Systemic Toxicity-Efficacy Profile of ICOVIR-5, a Potent and Selective Oncolytic Adenovirus Based on the pRB Pathway". Molecular Therapy. 2007 Sep; 15(9):1607-15) es un adenovirus oncolítico, que contiene una mutación en el gen E1a (mutación Δ24, mutación delta-24, una deleción de los nucleótidos 922 a 946 de AD5 que elimina el sitio de unión a pRb de E1a, una secuencia promotora de E2F1 para controlar la expresión de dicho E1a-Δ24, el aislante DM1, y la secuencia kozak ccacc (todas estas mutaciones tal como se definen en la SEC ID NO: 7) , y una modificación de la cápsida (inserción del péptido RGD) para aumentar su capacidad de infección hacia células tumorales (mutación de la SEQ ID NO: 8). Las posiciones 1 a 366 de SEQ ID NO: 7 contienen el ITR y la señal de empaquetamiento del adenovirus humano tipo (serotipo) 5 (AY339865). En la SEQ ID NO: 8, las posiciones de 1 a 1638, y las posiciones de 1666 a 1773, son regiones codificadoras de la fibra del adenovirus humano tipo 5, que corresponden, respectivamente, a las posiciones desde el nucleótido 31037 a 32674, y desde el nucleótido 32675 a 32782 de AY339865. La mutación 445-A presente en AdT1 fue trasferida al adenovirus oncolítico ICOVIR5 utilizando técnicas de recombinación homóloga de levaduras para obtener el adenovirus ICOVIR5-T1. AdΔ24RGD (tal como se describe en Suzuki, K., Fueyo J., KRASNYKH V., REYNOLDS, P., CURIEL, DT, y ALEMANY, R. 2001. "A conditionally replicative adenovirus with enhanced infectivity shows improved oncolytic potency". Clinical Cancer Research-2001; 7(1): 120-126) es otro mutante el de adenovirus que contiene las mutaciones Δ24 y RGD. Se comparó el tamaño de las placas de ICOVIR5-T1, ICOVIR5 y AdΔ24RGD en un ensayo de placa infectando una monocapa de células de adenocarcinoma de pulmón A549 con una partícula de virus por célula (paneles de la izquierda) o de 0,1 partículas de virus por célula (paneles de la derecha) de ICOVIR5-T1, ICOVIR5 o AdΔ24RGD. Después de 10 días se fotografiaron las placas. ICOVIR5-T1 mostró un fenotipo de placas grandes en comparación con ICOVIR5 y AdΔ24RGD.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

A. Estructura y función de los adenovirus con mutaciones en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K y su utilización en el tratamiento del cáncer.

La presente invención se refiere al uso de adenovirus con mutaciones en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K para el tratamiento del cáncer. El tratamiento se basa en la replicación de estos virus en tumores.

Se utilizaron varios métodos para manipular el genoma viral. Los métodos utilizados para la construcción de los adenovirus modificados genéticamente están bien establecidos en el sector de la terapia génica y viroterapia de adenovirus. El método más comúnmente utilizado se basa en la introducción de la modificación genética deseada en un plásmido que contiene la región del genoma del adenovirus a ser modificado, y a continuación llevar a cabo una recombinación homóloga en bacterias con un plásmido que contiene el resto del genoma viral.

Se han llevado a cabo varios tipos de mutaciones y manipulaciones genéticas para obtener replicación selectiva del tumor. Uno de ellos es la inserción de promotores que están activos en las células tumorales y se utilizan para controlar la expresión de los genes virales. Entre estos promotores se incluyen el promotor E2F, el promotor de la telomerasa (hTERT), el promotor de tirosinasa, el promotor del antígeno específico de la próstata (PSA), el promotor de alfa-fetoproteína, el promotor de la ciclooxigenasa 2 (cox-2) y promotores artificiales basados en la introducción de sitios de unión a factores de transcripción, tales como HIF-1 (factor inducible de hipoxia), Ets (factores de transcripción de la familia E26) y TCF (factor de células T). Una realización de la presente invención es la utilización de adenovirus con mutaciones en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K en combinación con estos promotores.

Otra modificación descrita para conseguir replicación selectiva de tumores es la supresión de las funciones de E1A tempranas, que bloquean la ruta de pRB. La replicación selectiva de dichos mutantes ha sido demostrada en varios documentos de la técnica anterior. Otros genes virales que interactúan directamente con pRB tales como E4 y E4orf6/7 son candidatos a ser suprimidos a fin de lograr la replicación selectiva en las células tumorales. Una realización de la presente invención es la utilización de adenovirus con mutaciones en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K en combinación con estos mutantes con E1 eliminado que confieren replicación selectiva.

Otra modificación descrita para conseguir la replicación selectiva de tumores es la supresión de genes de adenovirus que codifican para ARNs asociados a virus (VA-ARNs). Estos ARN bloquean la actividad antiviral del interferón y su eliminación da como resultado adenovirus que son sensibles a la inhibición del interferón. Debido a la característica de truncamiento en la ruta del interferón en las células tumorales dichos adenovirus se replican normalmente en tumores. Una realización de la presente invención es la utilización de adenovirus con mutaciones en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K en combinación con estas supresiones en los ARN asociados a virus que confieren replicación selectiva.

En otra realización de la presente invención, los adenovirus con mutaciones en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K pueden contener modificaciones en su cápsida para aumentar su capacidad de infección

o directamente a los receptores presentes en la célula tumoral. Las proteínas de la cápsida adenoviral se han modificado genéticamente para incluir ligandos que aumentan la capacidad de infección o dirigen el virus hacia un receptor presente en la célula tumoral. La dirección de virus hacia el tumor también se puede lograr con ligandos bifuncionales que se unen al virus en un extremo y al receptor del tumor en el otro. Para aumentar la persistencia en sangre de los adenovirus con el fin de aumentar las posibilidades de alcanzar los ganglios tumorales diseminados, la cápsida también se puede recubrir con polímeros tal como el polietilenglicol. Una realización de la presente invención es la utilización de adenovirus con mutaciones en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K en combinación con estas modificaciones de la cápsida.

En otra realización de la presente invención, el adenovirus que se replica (adenovirus replicativo) contiene otras modificaciones genómicas que dan como resultado el mejoramiento de la expresión de dicha proteína E3-19K mutada. Podrían haber varias maneras de aumentar la expresión de la E3-19K mutada. Por ejemplo, las modificaciones del promotor E3 para aumentar la transcripción de genes o mutaciones que aumenten la actividad de las proteínas del virus implicadas en el procesamiento de los ARN del virus y la síntesis de proteínas. A medida que la mutación E3-19K ofrece una nueva función, esta sobreexpresión se traduciría en una función aumentada.

En otra realización de la presente invención, el adenovirus contiene otros genes para aumentar su citotoxicidad en células tumorales, tales como el gen de la timidina quinasa, el gen de la citosina deaminasa, genes pro-apoptóticos, genes inmunoestimuladores o genes supresores de tumores.

B. Producción, purificación y formulación de adenovirus con mutaciones en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K.

Los adenovirus descritos en la presente invención pueden propagarse siguiendo los métodos estándar en el sector de la adenovirología y vectores adenovirales, tal como se da a conocer en Graham FL, Prevec L. Manipulation of adenoviral vectors. Clifton, N.J.: Humana Press, 1991, y Alemany R, Zhang W. Oncolytic adenoviral vectors. Totowa, NJ: Humana Press, 1999. El método preferencial de propagación consiste en la infección de una línea celular que permite la replicación de adenovirus con mutaciones en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E319K. La línea celular de adenocarcinoma de pulmón A549 es un ejemplo de dicha línea celular. La propagación se lleva a cabo, por ejemplo, de la siguiente manera: se cultivan células A549 en placas de plástico de cultivo celular y se infectan con 50 partículas virales por célula. Dos días después, el efecto citopático evidencia la producción viral cuando las células se separan formando racimos "en forma de uva". Las células se recogen y se almacenan en tubos. Las células se centrifugan a 1000g durante 5 minutos y el precipitado de células se congela y se descongela tres veces para liberar el virus intracelular. El extracto de células resultante se centrifuga a 1000g durante 5 minutos y el sobrenadante que contiene el virus se deposita en un gradiente de cloruro de cesio y se centrifuga durante 1 hora a 35.000g. La banda del virus obtenido se recoge y se deposita nuevamente en otro gradiente de cloruro de cesio y se centrifuga durante 16 horas a 35.000g. La banda de virus se recoge y se dializa frente a PBS-glicerina al 10%. El virus dializado se separa en alícuotas y se mantiene a -80ºC. La cuantificación del número de partículas virales y unidades formadoras de placas se realiza siguiendo protocolos estándar.

Tampón fosfato salino (PBS) con 10% de glicerol es una formulación estándar que se utiliza para el almacenamiento de adenovirus. Sin embargo, se han descrito otras formulaciones que mejoran la estabilidad del virus.

C. Utilización de adenovirus con mutaciones en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K en el tratamiento del cáncer.

La presente invención se refiere al uso de adenovirus con mutaciones en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K para el tratamiento del cáncer. El tratamiento se basa en la replicación de estos virus en células tumorales.

Los protocolos para la utilización de los virus descritos en la presente invención para el tratamiento del cáncer siguen los mismos procedimientos que se utilizan en los sectores de la viroterapia y la terapia génica con adenovirus. Existe una amplia experiencia en el uso de adenovirus con defectos de replicación y de replicación competente en el sector de la terapia génica. Varias publicaciones describen el tratamiento de células tumorales in vitro, en modelos animales o en ensayos clínicos con pacientes. Para el tratamiento de las células in vitro el adenovirus purificado, en cualquiera de las formulaciones descritas anteriormente, se añade al medio de cultivo para infectar las células tumorales. Para el tratamiento de tumores en modelos animales o pacientes se pueden administrar adenovirus mediante administración local o regional a través de una inyección intratumoral o intracavital

o de forma sistémica mediante inyección intravenosa. El tratamiento de tumores con los adenovirus descritos en la presente invención se puede utilizar en combinación con otras modalidades terapéuticas tales como quimioterapia o radioterapia, tal como se describió anteriormente en el sector de adenovirus oncolíticos.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1

Un adenovirus con una mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K se propaga de manera más eficiente.

Se construyó una biblioteca de adenovirus mutadas de la siguiente manera: se llevó a cabo la mutagénesis de 2x1010 partículas virales de adenovirus humano tipo 5 (Adwt) mediante tratamiento con de ácido nitroso 0,7 M durante 8 minutos. A continuación, la solución viral se diluyó y se dializó para eliminar el agente mutagénico. Con el fin de fijar las mutaciones, el virus mutagénico se utilizó para infectar células A549 tumorales humanas y se amplificó y se purificó con un gradiente de cloruro de cesio, tal como se describió anteriormente. El stock mutagénico se inyectó en ratones inmunosuprimidos con xenoinjertos de tumor NP-9 de páncreas por vía subcutánea. El virus presente en la sangre de los ratones cuatro horas después de la inyección se amplificó in vitro en células A549, se purificó, y se inyectó una vez más por vía intravenosa en rondas posteriores de bioselección. Después de varias rondas, fue extraído el virus contenido en el tumor que había mostrado la mejor regresión tumoral (mejor actividad oncolítica) (extracto T1). Por último, se aisló un virus denominado AdT1 del extracto T1 utilizando un ensayo de placa. Este ensayo consiste en la infección de una monocapa de células tumorales con una solución diluida de virus y la adición de una capa de agarosa después de la infección. El Agar forma un polímero que gelifica e impide la propagación del virus a través del cultivo y provoca que el virus se propague focalmente de las células infectadas inicialmente lo que da como resultado la formación de áreas más o menos redondas sin células denominadas placas. Un ensayo de placas demostró que las placas de T1 eran más grandes que las placas de Ad5 parentales (véase la figura 2 de la presente invención). Este fenotipo indicó que la propagación de célula a célula de AdT1 fue más rápida que la de Adwt. Esta propagación mejorada es muy interesante para su aplicación en la viroterapia del cáncer, ya que puede aumentar la actividad antitumoral tal como se demuestra en la presente invención.

Una vez que fue aislado el virus AdT1, el siguiente paso fue la determinación de la modificación genética responsable del fenotipo de. Se construyeron varios virus mediante la inserción de fragmentos del genoma de AdT1 en el genoma de tipo salvaje Ad5 (véase la figura 3). Este mapa fenotípico indicó que la mutación responsable del fenotipo de placas grandes estuvo presente en una región de 75,8 (posición 27.300 de Ad5) a 100 unidades de mapeo de la secuencia de adenovirus. Esta región de AdT1 fue secuenciada y se comparó con la secuencia de Adwt. La única mutación que se encontró fue localizada en la región C-terminal de la proteína E3-19K en el dominio de retención en el retículo endoplasmático (véase figuras 4 y 5 de la presente invención). Esta mutación, denominada 445-A, inserta un par de bases (una adenina en la cadena traduccional y la timina respectiva en la cadena complementaria tal como se puede observar en la SEQ ID NO: 1) que cambia el marco de lectura del ARNm y da como resultado un cambio en los residuos 5'-SRRSFIDEKKMP-3’ del extremo C-terminal de la proteína nativa (SEC ID NO: 3). Para demostrar que esta mutación era la responsable del fenotipo del virus AdT1, se construyó un adenovirus tipo 5 que contiene esta mutación mediante mutagénesis dirigida. Este virus, denominado Ad-19K-445A dio el mismo fenotipo de placas grandes que el virus AdT1, lo que demuestra que el fenotipo de AdT1 fue provocado por mutación E3-19K 445-A. (véase figura 6 de la presente invención).

Con anterioridad a esta invención, el fenotipo de placas grandes indicativo de una mejor propagación de célula a célula en cultivos celulares nunca había sido asociado a mutaciones en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K. De hecho, para el conocimiento de los inventores, no existen publicaciones de virus que contienen mutaciones en este dominio de E3-19K ya que el estudio de los dominios de E3-19K se había realizado con el ADNc de la proteína aislada y no en el contexto viral, tal como se menciona anteriormente. En este estudio anterior se ha descrito que la mutación de la cola C-terminal de E3-19K resulta en la presencia de la proteína en la membrana plasmática. Con el fin de comprobar si el mutante de la proteína E3-19K de AdT1 se localiza en la membrana plasmática, se llevó a cabo la detección de la proteína E3-19K con un anticuerpo específico contra esta proteína (anticuerpo Tw1.3) en las células que no habían sido permeabilizadas. En estas condiciones, las células infectadas con AdT1 presentaron expresión en la superficie celular de E3-19K, mientras que las células infectadas con Adwt no lo hacían (véase la figura 7 de la presente invención). Cuando se permeabilizaron las membranas, la fracción de E3-19K en el retículo endoplasmático se hizo accesible a los anticuerpos y se detectó en las células infectadas con AdT1 y con Adwt.

La mutación 445-A presente en el adenovirus AdT1 afecta el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K y da como resultado el fenotipo de placas grandes que indica una mejora de la propagación viral de célula a célula. Para demostrar que este fenotipo está asociado a un cambio en la localización de la proteína E3-19K desde el retículo endoplasmático a la membrana celular y no a la mutación específica 445-A sin asociación con el cambio en la localización, se construyó otro virus con una mutación que difiere de 445-A, pero que también se ve afectado el dominio de retención en el retículo endoplasmático de la proteína E3-19K. Este adenovirus, denominado Ad19K-KS se caracteriza por la sustitución de dos lisinas del dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K por dos serinas (SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5). Esta modificación en E3-19K, cuando se estudió la proteína aislada, ha sido descrita para eliminar la retención de E3-19K en el retículo endoplasmático (Pahl HL, Sester M, Burgert HG, Baeuerle PA. Activation of transcription factor NF-kappaB by the adenovirus E3/19K protein requires its ER retention. J Cell Biol. 1996; 132(4): 511-22). Como se muestra en la figura 6 de la presente invención, el adenovirus construido (Ad19K-KS) también presenta un fenotipo de placas grandes. Este resultado demuestra que mutaciones diferentes que afectan a la localización en el retículo endoplasmático de E3-19K dan como resultado propagación viral mejorada.

Dado que la función principal de E3-19K es unirse a MHC I y retener a MHC I en el retículo endoplasmático evitando la respuesta inmune contra la célula infectada, se estudió la relación entre el fenotipo de AdT1 y esta función. La infección con AdT1, que contiene una mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K resulta en un aumento de la expresión en la superficie celular de E3-19K (véase la figura 7). De forma paralela, se produjo un aumento en la expresión en la superficie celular de MHC I en comparación con células infectadas con adenovirus de tipo salvaje (véase la figura 8). Este cambio en la localización del complejo E3-19K/MHC-I podría ser responsable del fenotipo de placas grandes. Para probar esta hipótesis, se construyó un virus que contiene ambas mutaciones 445-A de AdT1 y una mutación en el dominio de unión a MHC I de E3-19K, denominado CS-40 (cambio del aminoácido 40 de la proteína nativa de cisteína por serina). El virus Ad19K-445a-CS40 aún presentó un fenotipo de placas grandes (véase la figura 9) que indica que no es necesaria la presencia del complejo E3-19K/MHC I en la membrana celular para la inducción del fenotipo de placas grandes. Una prueba más que confirma que MHC-I no era responsable del fenotipo de placas grandes fue la infección de células DLD-1 con AdT1. Aunque estas células carecen de expresión de MHC I en la superficie celular, AdT1 aún presentó placas más grandes que las de Adwt (véase la figura 9).

Anteriormente, se había descrito la sobreexpresión de ADP (E3-11.6K) que da como resultado un fenotipo similar al presentado en la presente invención. Los adenovirus con sobreexpresión de ADP se caracterizan por un fenotipo placas grandes como resultado de una liberación viral más eficiente y temprana de la célula infectada. La sobreexpresión de ADP se puede lograr mediante la eliminación de E3-19K y otras proteínas E3, mejorando de esta manera el empalme del ARNm de E3-11.6K. Para probar si un adenovirus con una mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K, el objeto de la presente invención, resulta en la sobreexpresión de ADP, lo que podría explicar el fenotipo, se determinó la expresión de ADP en las células infectadas con AdT1. Tal como se observa en la Figura 10 de la presente invención, la detección de ADP mediante Western-blot con un anticuerpo anti-ADP indicó que los extractos de proteínas de las células infectadas por AdT1 contenían la misma cantidad de ADP que los extractos de células infectadas por Adwt y que se expresan con una cinética similar. Esto demuestra que la propagación mejorada provocada por la mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K no depende de la sobreexpresión de ADP e implica un nuevo mecanismo diferente a los anteriormente descritos en el sector de la presente invención.

En resumen, este ejemplo ilustra que las mutaciones en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K dan como resultado una propagación mejorada de los adenovirus. Dos mutaciones diferentes, que afectan a este dominio, tienen el mismo efecto lo que indica que el fenotipo está asociado a un cambio en la localización de E3-19K y no a la secuencia mutante específica. La propagación mejorada de los adenovirus con mutaciones en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K no depende de la interacción con MHC I ni de la sobreexpresión de ADP.

EJEMPLO 2

Un adenovirus con mutaciones en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K se libera de manera más eficiente de las células infectadas en el sobrenadante.

El fenotipo de placas grandes descubierto en el ejemplo 1 indica una propagación mejorada de los adenovirus con mutaciones en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K. El ensayo de placa comienza con un pequeño número de células infectadas y refleja la propagación célula a célula del virus como resultado de varios ciclos virales. Para determinar si las mutaciones en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K produce un cambio fenotípico evidente durante el transcurso de un ciclo viral se infectó una monocapa de células con una gran cantidad de AdT1 y se compararon la producción y la liberación de la progenie viral con Adwt. Para obtener información acerca de la producción viral total y de la liberación en un ciclo de replicación viral se miden por separado el virus intracelular y el virus presente en el sobrenadante del cultivo celular. Se infectó una monocapa de células A549 en placas de seis pocillos con 1500 partículas virales por célula. Se midió el virus presente en el sobrenadante y el extracto celular en diferentes momentos después de la infección. El resultado indica que el adenovirus AdT1, que contiene una mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K, se libera 100 veces más eficientemente que Adwt, mientras que la producción viral total no se vio afectada (véase figura 11 de la presente invención, parte superior). Este ensayo se realizó en un panel de líneas celulares tumorales de diferente origen. Se liberó AdT1 con más eficiencia que Adwt en todas las líneas celulares estudiadas (véase figura 11, parte inferior) y las diferencias en la liberación viral estuvieron en el intervalo de 5 a 125 veces. Para confirmar si este fenotipo de liberación mejorada en el sobrenadante era también evidente en células no tumorales, fueron aisladas fibroblastos humanos asociados a carcinomas a partir de biopsias de tumores humanos. El resultado indicó que el adenovirus AdT1 con mutaciones en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K también fue liberado de manera más eficiente en estos fibroblastos. En resumen, este ejemplo demuestra que un adenovirus competente para la replicación con mutaciones en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K se libera de manera más eficiente de las células infectadas. La liberación mejorada del virus de la célula infectada es una característica adecuada de un adenovirus de replicación para el tratamiento del cáncer.

EJEMPLO 3

La mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K aumenta la potencia oncolítica de los adenovirus y un adenovirus con esta mutación se puede utilizar para tratar tumores de manera eficiente.

Se realizó un experimento in vivo en ratones Balb/c desnudos que albergaban tumores humanos pancreáticos subcutáneos. Se inyectaron un total de 8x106 células NP-9 por vía subcutánea en los flancos de los ratones. Después de 15 días, cuando el volumen del tumor llegó a 80-100 mm3, los ratones fueron asignados de forma aleatoria a los diferentes grupos experimentales (n=10 por grupo). Los tumores de control se les inyectó por vía intravenosa a través de vena de la cola con tampón fosfato salino (150 microlitros). El grupo tratado con AdT1 recibió una única inyección intravenosa de 2x1010 partículas virales / ratón. Se midieron los tumores cada dos días y se calculó el volumen con la fórmula: V (mm3) = A(mm) B2(mm2) x 3,14 / 6, en la que B es la longitud del tumor. La figura 13 muestra el crecimiento del tumor a partir del día de la inyección (día 0). Los resultados se presentan como media ± SEM. La significación de las diferencias se calculó mediante la prueba no paramétrica Mann-Whitney para muestras no apareadas. Se compararon las curvas de crecimiento aplicando un análisis de varianza. Los resultados fueron considerados significativos cuando p<0,05. Los cálculos se realizaron con el paquete estadístico SPSS (SPSS Inc., Chicago, IL). Se observó una diferencia significativa en el crecimiento de los tumores tratados con AdT1 desde el día 10 después de la inyección hasta el final del experimento.

EJEMPLO 4

Un adenovirus condicionalmente replicativo oncolítico (ICOVIR5) con una mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K se propaga de manera más eficiente.

ICOVIR5 (Cascallo y otros. Molecular Therapy 15:1607.2007) es un adenovirus selectivo de tumor que está mutado en el gen E1a (mutación Δ24), contiene una secuencia del promotor E2F1 para controlar la expresión de dicho E1a (mutaciones reflejadas en la SEQ ID NO: 7), y contiene una modificación de la cápsida (inserción del péptido RGD) para aumentar su capacidad de infección hacia las células tumorales, tal como se define en SEC ID NO: 8. Para demostrar que una mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K se puede combinar de forma eficaz con estas modificaciones genéticas características de los adenovirus oncolíticos, se construyó un derivado de ICOVIR5 que contiene la mutación 445-A en E3-19K (de acuerdo con la SEC ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) y se denominó ICOVIR5-T1. Este virus se comparó en un ensayo de placa con el virus parental ICOVIR5, y con un segundo control de virus con mutaciones Δ24 y RGD (denominado AdΔ24RGD). Un ensayo de placa consiste en la infección de una monocapa de células tumorales con una solución de virus diluida y la adición de una capa de agar después de la infección. El agar forma un polímero que gelifica que impide la propagación del virus a través del cultivo y provoca que el virus se propague focalmente desde las células inicialmente infectadas, dando como resultado la formación de agujeros en la monocapa de células conocidos como "placas". Se llevó a cabo un ensayo de placa infectando una monocapa de células de adenocarcinoma de pulmón A549 con 1 ó 0,1 partículas de virus por célula de ICOVIR5-T1, ICOVIR5 o AdΔ24RGD. Después de 10 días las placas se fotografiaron (figura 14 de la presente invención). Las placas de ICOVIR5-T1 eran más grandes que las placas de ICOVIR5 y AdΔ24RGD.

Aunque los ejemplos mencionados anteriormente muestran adenovirus con una mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K obtenidos a partir del serotipo 5, el experto en la materia entenderá que todos los serotipos que tienen los genes E3 y que son capaces de traducir la proteína E3-19K también se pueden utilizar en la presente invención.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> INSTITUT CATALA D’ONCOLOGIA

<120> Adenovirus con mutaciones en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de la proteína E3-19K y su utilización en el tratamiento del cáncer

<130> P1101PC00

<150> ES 200700665

<151> 2007-03-14

<160> 8

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

<211> 484

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Mutante de región de codificación para la proteína E3-19K de adenovirus humano serotipo 5

<400> 1

imagen1

<210> 2

<211> 7

<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Fragmento de fragmento carboxi-terminal mutado de la proteína E3-19K de adenovirus humano tipo S

10 <400> 2

imagen1

<210> 3

<211> 13

<212> PRT 15 <213> Fragmento de fragmento C-terminal de tipo salvaje de E3-19K de adenovirus tipo 5 humano

<400> 3

imagen1

20

<210> 4

<211> 483

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 25

<220>

<223> Mutante la región codificadora de la proteína E3-19K de adenovirus tipo 5 humano

<400> 4 30

imagen1

<210> 5

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Fragmento del fragmento carboxi-terminal mutado de la proteína E3-19K de adenovirus tipo 5 humano

<400> 5

imagen1

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia señal para la retención en el retículo endoplasmático de E3-19K del adenovirus tipo 5 humano de tipo salvaje

<400> 6

imagen1

<210> 7

<211> 2512

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia con las regiones reguladoras del aislante DM1 (de la posición 367 a 1095); un fragmento del promotor E2F1 (de la posición 1282 a 1545); la secuencia kozak ccacc (de la posición 1546 a 1550); y el gen E1a24 (de la posición 1551 a 2512).

<400> 7

imagen1

<210> 8

<211> 1773 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia que codifica la fibra del adenovirus humano tipo 5 (de la posición 1 a 1638; y posición 1666 a

10 1773) que contiene una inserción del péptido RGD (de la posición 1639 a 1665) que contiene el motivo RGD (de 1648 a 1656).

<400> 8

imagen1

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Adenovirus replicativo que comprende una mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K que evita la retención de E3-19K en el retículo endoplasmático y además comprende una modificación genética para conseguir replicación selectiva en tumores.
2.

Adenovirus replicativo, según la reivindicación 1, en el que dicho adenovirus comprende mutaciones en uno o más genes del grupo que comprende E1a, E1b, E4, y VA-ARNs, para conseguir replicación selectiva en tumores.
3.

Adenovirus replicativo, según la reivindicación 1, en el que dicho adenovirus comprende un promotor específico de tejido o un promotor específico de tumor, para conseguir replicación selectiva en tumores.
4.

Adenovirus replicativo, según la reivindicación 3, en el que el promotor específico de tejido o el promotor específico de tumor son secuencias promotoras para controlar la expresión de uno o más genes del grupo que comprende E1a, E1b, E2 y E4, para conseguir replicación selectiva en tumores.
5.

Adenovirus replicativo, según la reivindicación 1, en el que dicho adenovirus comprende además modificaciones en la cápsida para aumentar su infectividad o dirigirlo a un receptor presente en una célula tumoral.
6.

Adenovirus replicativo, según la reivindicación 1, en el que dicho adenovirus comprende además genes utilizados en el sector de la terapia génica contra el cáncer.
7.

Adenovirus replicativo, según la reivindicación 6, caracterizado porque dichos genes utilizados en el sector de la terapia contra el cáncer es, como mínimo, un gen seleccionado del grupo que comprende genes activadores de profármacos, genes supresores de tumores, o genes inmunoestimuladores.
8.

Adenovirus replicativo, según la reivindicación 1, en el que dicho adenovirus comprende además modificaciones del genoma que dan lugar a una mejora de la expresión de la proteína E3-19K.
9.

Adenovirus replicativo que comprende una mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K que evita la retención de E3-19K en el retículo endoplasmático, en el que dicho adenovirus comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1.
10.

Adenovirus replicativo, según la reivindicación 9, que expresa un dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K con una cola carboxi-terminal que tiene una SEQ ID NO: 2.
11.

Adenovirus replicativo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, en el que dicho adenovirus tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 4.
12.

Adenovirus replicativo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 -8 y 11, que expresa un dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K con una cola carboxi-terminal que tiene una SEQ ID NO: 5.
13.

Adenovirus replicativo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, en el que dicho adenovirus comprende, como mínimo, las secuencias de nucleótidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8.
14.

Adenovirus replicativo, según la reivindicación 13, que expresa un dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K con una cola carboxi-terminal que tiene una SEQ ID NO: 2.
15.

Composición farmacéutica que comprende una dosis farmacológicamente eficaz de un adenovirus según las reivindicaciones 1 a 14 y uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
16.

Adenovirus replicativo, según las reivindicaciones 1 a 14, para utilizar como medicamento.
17.

Adenovirus replicativo para utilizar, según la reivindicación 16, como agente profiláctico y/o terapéutico del cáncer.
18.

Utilización del adenovirus replicativo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para preparar una formulación farmacéutica para el tratamiento o la prevención del cáncer o la enfermedad pre-maligna que conduce al cáncer.
19.

Adenovirus replicativo que comprende una mutación en el dominio de retención en el retículo endoplasmático de E3-19K que evita la retención de E3-19K en el retículo endoplasmático para utilizar en el tratamiento del cáncer o la enfermedad pre-maligna que conduce al cáncer.