JP5943996B2 - 腫瘍溶解性強化Ｂ型ヒトアデノウイルスＡｄ１１突然変異体の構築とその応用 - Google Patents
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Description
本発明は、アデノウイルスベクター及び応用に係り、特にB型再構成ヒトアデノウイルスベクターAd11-5EPとAd11-5ETel-GFPの構築方法及び応用に係る。
ここ数年来、腫瘍のウイルス治療、特にアデノウイルスの腫瘍治療における応用の面で非常に速い発展を遂げた。2005年、E1B 55KとE3B欠陥型アデノウイルス(H101)は、初めて中国で頭頸腫瘍治療への使用が批准され、ただし、アデノウイルス腺源のH101は一セグメントの悪性腫瘍、例えば、発病率が高く、致死性が強い膵臓がんに対する治療効果が極めて悪い。腫瘍治療効果を制限する原因の一つとして、これらの腫瘍がアデノウイルス受容体(CAR)を低く発現し、それに静脈で注射されたアデノウイルスが抗体及び補体により速く中和されて不活化され、それに、アデノウイルスがKuffer細胞により貪食され、ウイルスhexon蛋白が血液凝固因子Xと結合してから、肝細胞に形質導入するので、過量のアデノウイルスは著しい肝細胞毒性及び肝臓損傷を引き起こし易い。
Ad11はB型ヒトアデノウイルスの一種の亜型である。腫瘍溶解治療の面で、Ad11はAd5より著しく優れている。CD46受容体を除いて、Ad11もそのほかの細胞表面受容体Xと結合してもよい。Tuve等の報道によりますと、Ad11は、Bアデノウイルス亜群の中で唯一のCD46とXに皆結合するウイルスであるので、これで、Ad11がより広範的な腫瘍細胞を感染できるのを説明する。これで、Ad5応用の中で、ウイルス受容体の下調整による低い感染率の難題を解決した。Ad11は、Ad5と比べると、そのほかの優位性として、ヒトの群でのAd11の中和抗体が10-31％と低く、Ad5が45-90％であり、それに、中間に交差活性がないことである。Ad11を、CD46が発現される遺伝子組み換え鼠に静脈で注射する際に、明らかな肝臓内トランスデューシンと肝臓毒性を発見しなかった。それに、Ad11は、樹状突起細胞に高速に形質導入できるので、再構成Ad11は腫瘍特異抗原を発現し、免疫反応を強化することによって腫瘍免疫治療に一層よく応用できる。
Ad5以外のそのほかのアデノウイルス血清型をワクチンまたは遺伝子転換ベクターとする応用について、すでに大量な報道がある。ただし、これらを腫瘍溶解ウイルスとする研究は開始したばかりで、関連報道も徹底ではない。Sandberg等による最近の体内研究によりますと、Ad11が、前立腺癌細胞系PC-3で形質導入、複製と***分解を行えることになったが、当該作者は、通用のAd5と比べなかった。Shashkova等は、ヒト腫瘍細胞系体外試験及びヒト前立腺癌細胞系DU145体内研究によって、Ad5、Ad6、Ad11とAd35の間の腫瘍溶解効率を比べた結果、Ad5、Ad6とAd11が類似的な抗腫瘍効果を有するが、Ad35が抗腫瘍作用を有していないことを発見した。重要なこととしては、Ad5だけ肝臓毒性を引き起こすことである。その後、人々は、この為に嵌合型腫瘍溶解性Ad5(Ad5の繊毛をB亜群アデノウイルスの繊毛に切り替える)を作り上げ、目的としては、嵌合型腫瘍溶解性Ad5が細胞膜でのCD46受容体と結合することによって抗腫瘍効果を向上することである。完全なB亜群アデノウイルスと比べると、この方法は、Ad5 hexon抗体に対する中和能力を依然として克服できない。
循環腫瘍細胞（Circulating tumour cells,CTCs）数は、腫瘍患者の臨床段階、治療効果及び短い生存率と関わる。腫瘍患者の末梢血のCTCsレベルは、監視、治療調整及び予後判定の根拠としてもよい。これで、一種の特異な且つ敏感的な方法でこれらの細胞を検定する必要がある。ここ数年来、免疫細胞計数分析と定量PCR等の方法を応用することによって、血液で小量なCTCsを検出できるが、特異な生物学表記物の欠乏及び高額の検定費用により、これらの方法の普及と応用が制限された。
複製選択性腫瘍溶解アデノウイルスは、新型腫瘍治療薬物である。注意に値することとしては、最近、GFPを発現する複製選択性腫瘍溶解アデノウイルスAd5で数億の末梢血細胞でCTCsを検定することを報道した。しかし、腫瘍細胞の遺伝性変化がアデノウイルス感染に影響を与える重要な要素で、腫瘍細胞での低い発現CARはAd5の感染能力を著しく削減するので、腫瘍細胞の陽性検出率に影響を与える。それに、CARの低い発現のような既知の影響を除いて、CEACAM6のようなそのほかの一部分の腫瘍関連遺伝子CEACAM6もAd5の細胞核への進入に影響を与え、これでAd5の腫瘍細胞に対する感染能力を削減する。これらのデータは、一セグメントの腫瘍細胞の中でAd5でCTCsを検定する方法が低い敏感性を持つ可能性があるのを表す。
一種の腫瘍標的と抗腫瘍効果のあるアデノウイルスベクターAd11-5EPを提供すると同時に、一種の腫瘍治療と循環血液での腫瘍細胞検定用B型再構成ヒトアデノウイルスベクターAd11-5ETel-GFPを提供する。
発明者は、初めてヒト腫瘍細胞系に対して体外でAd11とAd5の潜在的な抗腫瘍能力を比べて、25個の検査された細胞系の中でわずか九つがAd11に敏感であることを発見した。その中でPC-3はAd5に敏感でないが、Ad11に敏感である。Ad5と比べると、Ad11は、体内で明らかにPC-3細胞の皮下腫瘍の成長を抑制し、それに担癌動物の腫瘍除去率を向上した。同じように、Ad5に敏感であるが、Ad11に敏感でないMIA PaCa-2細胞で前記実現を重複した結果、Ad11の抗腫瘍能力は明らかに降下した。
ヒト腫瘍細胞で普遍にAd11の受容体を高く発現するが、野生型Ad11はこれらの腫瘍細胞を有効に殺傷できない。発明者は、これに対して広範な且つ徹底的な研究を行った。二種の異なる方法で、発明者は、Ad5と比べると、より多いAd11が腫瘍細胞膜に吸い付けられていることを論証し、この結果は、当該細胞のAd11に対する敏感性と関わらない。吸い付けられているAd11ウイルス顆粒が有効に細胞核内に進入できるので、Ad5と比べると、ウイルス感染の早期段階で細胞核内に高いレベルAd11があるのを説明する。発明者は、二種のウイルスの腫瘍細胞での早期遺伝子発現を調査・比較し、特異なプライマーを定量PCRとする方法でE1AのmRNAレベルを検定・比較する。これらのすべての細胞系の中で、ウイルス感染2時間後、高いレベルのAd11感染により高いレベルのE1A mRNA発現を引き起こすのを発見した。その中で、Ad11に敏感でない細胞の中で(MIA PaCa-2とLNCaP)Ad5のE1A mRNA発現レベルは、感染2時間後明らかに削減した。同じように、Ad11に敏感であるCapan-2とPC-3の細胞でAd11 E1A mRNAが高いレベルを呈している。Ad11 E1A mRNAがウイルスの複製に直接影響を与えるので、Ad11 E1A mRNAのMIA PaCa-2とLNCaP細胞での下調整は、ウイルス複製のレベルを削減し、相応にhexon蛋白の合成能力を削減する。この発見は、最初観察されたAd11の低いレベルのビリオン形成及び細胞毒性と合致している。これらの結果から見ると、Ad11の複製及び殺傷力がこれの感染性と関わらず、これの早期遺伝子のエンハンサーとプロモーターの活性と関わる。
前記問題を解決するために、本発明は、一種の腫瘍標的性アデノウイルスベクター(Ad11-5EP)を構築した。実験の結果、Ad11-5EPが非常に役に立つ基本的なベクターで、新しい複製選択性腫瘍溶解アデノウイルスの開発に応用でき、これで一層広範な人類腫瘍を治療できる。
血液循環腫瘍細胞の検定感度を強化する為に、Ad11-5EPの基礎の上に、Ad5プロモーターをヒトテロメラーゼ遺伝子プロモーターで取り替えてから、相同組換えを通じて、信号遺伝子を発現する複製選択型アデノウイルス(Ad11-5ETel-GFP)を生成する。テロメラーゼが95％ヒト腫瘍細胞に高い発現性があるので、Ad11-5ETel-GFPは選択的に腫瘍細胞で複製し、それにGFPを発現し、しかし、正常上皮細胞で活性がない。
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B型再構成アデノウイルスベクターAd11-5ETel-GFPの構築方法で、下記の手順を含む。
（1）まず二種の異なる抗生物質耐性発現カセットでベクターpSS-ChlとpSS-Knaを構築してから、アンチクロラムフェニコール遺伝子発現カセット配列の両側にSwaI制限酵素切断部位を導入し、アンチカナマイシン遺伝子発現カセット配列の両側にSbfI制限酵素切断部位を導入すること、
（2）pUC18クローンから、pBR32複製の開始配列を得、人工合成された多重クローニング部位を含むヌクレオチド配列とアンチクロラムフェニコール遺伝子発現カセット配列と接続してpSS-Chlを生成し、アンチクロラムフェニコール遺伝子発現カセット配列の左アーム配列の上流と右アーム配列の下流に対して相同組換えを行い、アンチクロラムフェニコール遺伝子発現カセット配列の左アーム配列の上流と右アーム配列の下流を、それぞれ平滑末端又は粘着端末によってpSS-Chl両側の多重クローニング部位に挿入して、再構成用シャトルベクターを構築すること、
（3）pUC18クローンにより、pBR32複製の開始配列を取得し、人工合成された多重クローニング部位を含むヌクレオチド配列をアンチカナマイシン遺伝子発現カセット配列と接続してpSS-Knaを生成し、アンチカナマイシン遺伝子発現カセット配列の左アーム配列の上流と右アーム配列の下流に対して相同組換えを行い、アンチカナマイシン遺伝子発現カセット配列の左アーム配列の上流と右アーム配列の下流を、それぞれ平滑末端又は粘着末端によってpSS-Kna両側の多重クローニング部位に挿入し、再構成用シャトルベクターを構築すること、
（4）pSSENTelを構築すること、即ち、左アーム配列がAd11ゲノムの0-392bp配列で、右アームがAd5 E1Aエンハンサーの195-378bpセグメント、ヒト TERT プロモーターの-714-0bpセグメントと Ad11 E1Aの568-1125bp配列を順に接続して形成したセグメントであり、これと同時に、ヒト TERT プロモーターの両側にそれぞれ二つの制限酵素切断部位XbaI とNcoIを導入し、左アームと右アームに対して、平滑末端をpSS-Chlの両側のSnabIとEcoRVに挿入し、最終にpSSENTelを生成すること、
（5）pSSGFPを構築すること、即ち、左アームがAd11ゲノムの27301から27837bpまでのDNAセグメントとEGFP遺伝子とを、NcoI切断部位において接続する産物で、それにEGFPの3’末端にSnaBI切断部位を導入すること、右アームがAd11ゲノムの28337から28920bpまでのDNAセグメントで、左アームと右アームに対して、それぞれ平滑末端をpSS-Kna両側のSnabIとEcoRV切断部位に挿入し、最終にpSSGFPを生成すること、
（6）pSSENTelとpSSGFPをそれぞれPmeIで酵素切断し、二つのPmeI消化セグメントを同時にpAd11とBJ5183細胞内で相同組換えしてから、アンピシリン、カナマイシン及びクロラムフェニコールという三種の抗生物質を含む寒天板の上で選別すること。陽性クローンに対して、それぞれSwaIとSbfIで酵素切断を行うことによって、アンチクロラムフェニコール遺伝子発現カセット配列とカナマイシン遺伝子発現カセット配列を除去し、pAd11-5ETel-GFPを生成すること、pAd11-5ETel-GFPに対して、NotIで酵素切断と線形化を行ってから、293細胞に導入してアデノウイルスAd11-5ETel-GFPを生成することを含むことを特徴とするB型再構成ヒトアデノウイルスベクターAd11-5ETel-GFPの構築方法。
（1）まず二種の異なる抗生物質耐性発現カセットでベクターpSS-ChlとpSS-Knaを構築してから、アンチクロラムフェニコール遺伝子発現カセット配列の両側にSwaI制限酵素切断部位を導入し、アンチカナマイシン遺伝子発現カセット配列の両側にSbfI制限酵素切断部位を導入すること、
（2）pUC18クローンから、pBR32複製の開始配列を得、人工合成された多重クローニング部位を含むヌクレオチド配列とアンチクロラムフェニコール遺伝子発現カセット配列と接続してpSS-Chlを生成し、アンチクロラムフェニコール遺伝子発現カセット配列の左アーム配列の上流と右アーム配列の下流に対して相同組換えを行い、アンチクロラムフェニコール遺伝子発現カセット配列の左アーム配列の上流と右アーム配列の下流を、それぞれ平滑末端又は粘着端末によってpSS-Chl両側の多重クローニング部位に挿入して、再構成用シャトルベクターを構築すること、
（3）pUC18クローンにより、pBR32複製の開始配列を取得し、人工合成された多重クローニング部位を含むヌクレオチド配列をアンチカナマイシン遺伝子発現カセット配列と接続してpSS-Knaを生成し、アンチカナマイシン遺伝子発現カセット配列の左アーム配列の上流と右アーム配列の下流に対して相同組換えを行い、アンチカナマイシン遺伝子発現カセット配列の左アーム配列の上流と右アーム配列の下流を、それぞれ平滑末端又は粘着末端によってpSS-Kna両側の多重クローニング部位に挿入し、再構成用シャトルベクターを構築すること、
（4）pSSENTelを構築すること、即ち、左アーム配列がAd11ゲノムの0-392bp配列で、右アームがAd5 E1Aエンハンサーの195-378bpセグメント、ヒト TERT プロモーターの-714-0bpセグメントと Ad11 E1Aの568-1125bp配列を順に接続して形成したセグメントであり、これと同時に、ヒト TERT プロモーターの両側にそれぞれ二つの制限酵素切断部位XbaI とNcoIを導入し、左アームと右アームに対して、平滑末端をpSS-Chlの両側のSnabIとEcoRVに挿入し、最終にpSSENTelを生成すること、
（5）pSSGFPを構築すること、即ち、左アームがAd11ゲノムの27301から27837bpまでのDNAセグメントとEGFP遺伝子とを、NcoI切断部位において接続する産物で、それにEGFPの3’末端にSnaBI切断部位を導入すること、右アームがAd11ゲノムの28337から28920bpまでのDNAセグメントで、左アームと右アームに対して、それぞれ平滑末端をpSS-Kna両側のSnabIとEcoRV切断部位に挿入し、最終にpSSGFPを生成すること、
（6）pSSENTelとpSSGFPをそれぞれPmeIで酵素切断し、二つのPmeI消化セグメントを同時にpAd11とBJ5183細胞内で相同組換えしてから、アンピシリン、カナマイシン及びクロラムフェニコールという三種の抗生物質を含む寒天板の上で選別すること。陽性クローンに対して、それぞれSwaIとSbfIで酵素切断を行うことによって、アンチクロラムフェニコール遺伝子発現カセット配列とカナマイシン遺伝子発現カセット配列を除去し、pAd11-5ETel-GFPを生成すること、pAd11-5ETel-GFPに対して、NotIで酵素切断と線形化を行ってから、293細胞に導入してアデノウイルスAd11-5ETel-GFPを生成することを含むことを特徴とするB型再構成ヒトアデノウイルスベクターAd11-5ETel-GFPの構築方法。
前記アンピシリン、カナマイシン及びクロラムフェニコールの濃度がそれぞれ100mg/ml、50ug/ml、25mg/mlである。
前記pSSENTelでのTel配列がそのほかの腫瘍特異遺伝子のプロモーターにより取り替えられ、一つの腫瘍特異の腫瘍溶解性アデノウイルスを生成する。
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前記B型再構成ヒトアデノウイルスベクターAd11-5ETel-GFPを含有する腫瘍治療剤。前記B型再構成ヒトアデノウイルスベクターAd11-5ETel-GFPを含有する血液循環での腫瘍細胞検定用薬剤。
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本発明のＢ型再構成ヒトアデノウイルスAd11-5ETel-GFPの構築方法は、構築されたシャトルベクターpSSENTel、pSSGFPをAd11-5EPゲノムと同時に相同組換えを行うことによってAd11-5ETel-GFPを生ずることである。Ad11-5ETel-GFPは、腫瘍治療又は血液循環での腫瘍細胞検定に使用でき、Ad11-5ETel-GFPでのGFPのヒト正常上皮細胞及び癌細胞での発現試験及びCTCs検定の実験から見ると、d11-5ETel-GFPは、腫瘍細胞に非常に敏感で、ほとんどの腫瘍細胞を感染でき、当該ベクターで特異に、敏感に且つ経済的に血液循環での腫瘍細胞を検定できる。
下記内容は、本発明をさらに説明し、本発明の保護範囲を限定することではなく、本分野の技術が説明書によって、これらの実施形態を修正でき、本発明の精神と範囲を離れない前提の下で、類似する又は同じ結果を得られ、皆本発明の保護範囲内に属する。
B型再構成ヒトアデノウイルスベクターAd11-5EPの構築方法。
相同組換えを利用して、Ad5 E1Aコード配列上流の365bpセグメント（Ad5 E1Aのエンハンサーとプロモーターを含む）を、B型ヒトアデノウイルス11亜型Ad11の相応な領域に置換し、B型再構成ヒトアデノウイルスベクターAd11-5EPを構成する。
相同組換えを利用して、Ad5 E1Aコード配列上流の365bpセグメント（Ad5 E1Aのエンハンサーとプロモーターを含む）を、B型ヒトアデノウイルス11亜型Ad11の相応な領域に置換し、B型再構成ヒトアデノウイルスベクターAd11-5EPを構成する。
左アーム配列がAd11ゲノムの前392bpで、右アームがAd5 E1A のエンハンサーとプロモーター配列(195-559bp)を Ad11 E1A (568-1125bp)と順に一緒に接続するセグメントで、左アームと右アームがそれぞれpSS-Chl両側の多重クローニング部位に接続し、シャトルベクターpSS-A1A7を作り上げる。pSS-A1A7をPmeIで酵素切断し、それに純化する。PmeIの消化セグメントを同時にpAd11とBJ5183細胞内で相同組換えしてから、アンピシリン及びクロラムフェニコールという二種の抗生物質（濃度がそれぞれ100mg/mlと25mg/mlである）を含む寒天板で選別する。陽性クローンに対して、それぞれSwaI酵素切断を行うことによって、アンチクロラムフェニコール遺伝子発現カセット配列を除去し、最終にpAd11-Ad5EPを生成する。pAd11-Ad5EPに対して、NotI酵素切断と線形化を行ってから、293細胞に導入して、アデノウイルスAd11-Ad5EP（図1参照）を生む。
Ad5、Ad11とAd11-5EPのAd11敏感性と非敏感性ヒト腫瘍細胞での潜在的な腫瘍溶解能力。
Ad11敏感なヒト腫瘍細胞Capan-2、PaTu8988s、PC-3、MCF7、HT-29と敏感でないヒト腫瘍細胞MIA PaCa-2、MDA-MB-231、HCT116、LNCaP及びA549の中で、Ad5、Ad11とAd11-5EPに対して体外殺傷実験を行い、2%ウシ胎児血清の培地で前記10種の細胞を細胞懸濁液に調製し、96穴板の中央に接種し、14〜18hの後に、倍比率でウイルスｋを希釈する。1x104 pt/細胞を開始濃度とし、10倍比率でウイルスｋを希釈し、10μl/穴を入れて96穴板での各種の細胞を感染し、感染6日後、MTSを入れてこれらの潜在的な腫瘍溶解能力を検定する。
下記の結果を示した。すべてのAd11敏感な細胞系の中で、Ad11-5EPはAd5より、より良い細胞殺傷力を示し、Ad11より一層強い細胞毒性を生んだ（図2参照）。一方、Ad11敏感でない細胞系の中で、Ad11-5EPの性能も著しく向上した（図3参照）。Ad11-5EPは、90％（9／10）の細胞系で皆高い敏感性を示しているので、Ad5及びAd11より、一層よい腫瘍殺傷効力を持ち、Ad11-5EPが体外で腫瘍細胞の有効な殺傷範囲を拡大した。
Ad5、Ad11とAd11-5EPのMIA PaCa-2細胞皮下インプラント他家腫瘍モデルでの抗腫瘍効果。
BALA/c裸の鼠(n＝8／組)の右側背部皮下にMIA PaCa-2細胞（MIA PaCa-2がAd11に敏感でないが、Ad5に敏感である）を接種し、皮下移植腫瘍モデルを構築し、腫瘍体積が180 mm3に達する時、第1、3、5日で腫瘍内にそれぞれPBS又はウイルス(Ad5、Ad11とAd11-5EP、1X1010ウイルス顆粒／注射)を注射して腫瘍成長と腫瘍除去率を観察する。その結果、Ad11-5EPがAd5と同じように腫瘍の成長を有効に抑制（図４参照）でき、それに担癌鼠の腫瘍除去率はAd11処理組と比べて（図5参照）著しく良いことになった。
B型再構成ヒトアデノウイルスベクターAd11-5ETel-GFPの構築方法。
（1）まず、二種の異なる抗生物質抗性発現カセットで二つの異なるベクター、すなわち、pSS-ChlとpSS-Knaを構築し、その中で、アンチクロラムフェニコール遺伝子発現カセットの配列両側にSwaI制限酵素切断部位を導入し、それに、アンチカナマイシンの遺伝子発現カセット配列両側をSbfI制限酵素切断部位を導入する。
（2）pUC18クローンからpBR32複製開始配列を得てから、人工合成された多重クローニング部位（PmeI-KpnI-SacII-NotI-XhoI-XbaI-SgfI-SnabI-SwaIとSwaI-EcoRV-FseI-HindIII-SrfI-SalI-BglII-PmeI）を含むヌクレオチド配列をアンチクロラムフェニコール遺伝子発現カセット配列と接続しpSS-Chlを生み、相同組換えに必要である上流(左臂)と下游(右臂)配列について、それぞれ平滑末端又は粘着端末を両側の多重クローニング部位に挿入し、再構成用シャトルベクターを構築する。
（3）pUC18クローンからpBR32複製開始配列を得てから、人工で合成された多重クローニング部位（PmeI-KpnI-SacII-NotI-XhoI-XbaI-SgfI-SnabI-SwaI-SbfIとSbfI-SwaI-EcoRV-FseI-HindIII-SrfI-SalI-BglII-PmeI）を含むヌクレオチド配列とアンチカナマイシン遺伝子発現カセット配列と接続してpSS-Knaを生成し、相同組換えに必要な上流(左アーム)と下流(右アーム)配列に対して、それぞれ平滑末端または粘着末端をpSS-Knaの両側の多重クローニング部位内に挿入して、再構成用シャトルベクターを構築する。
（4）pSSENTelは、左アーム配列がAd11ゲノムの前392bpで、右アームがAd5 E1A エンハンサー(195-378bp)、ヒト TERT プロモーター (-714-0bp)及び Ad11 E1A (568-1125bp)を順に接続したセグメント片であり、ヒト TERT プロモーター両側に、それぞれ二つの制限酵素切断部位XbaIとNcoIを導入し、左アームと右アームに対して、それぞれ平滑末端をpSS-Chlの両側(SnabIとEcoRV)に挿入し、最終にpSSENTelを生成する。
（5）pSSGFPは、左アームがDNAセグメント(Ad11 ゲノム DNA の27301から27837bpまで)とEGFP遺伝子を、NcoI切断部位において接続する産物で、EGFPの3’に一つのSnaBI切断部位を導入し、右アームがAd11 ゲノム DNA の28337から28920bpまでのDNAセグメントで、左アームと右アームに対して、それぞれ平滑末端をpSS-Knaの相応な両側のSnabIとEcoRV切断部位に挿入し、最終にpSSGFPを生成する。
（6）pSSENTelとpSSGFPをそれぞれPmeIにより酵素切断して純化し、二つのPmeI消化セグメントを同時にpAd11と、BJ5183細胞内で相同組換えしてから、アンピシリン、カナマイシン及びクロラムフェニコールという三種の抗生物質（濃度がそれぞれ100mg/ml、50ug/ml、25mg/mlである）を含む寒天板の上で選別する。陽性クローンに対して、それぞれSwaI と SbfI酵素切断を行うことによって、アンチクロラムフェニコール遺伝子発現カセット配列とカナマイシン遺伝子発現カセット配列を除去し、最終にpAd11-5ETel-GFP（図6参照）を生成する。
（2）pUC18クローンからpBR32複製開始配列を得てから、人工合成された多重クローニング部位（PmeI-KpnI-SacII-NotI-XhoI-XbaI-SgfI-SnabI-SwaIとSwaI-EcoRV-FseI-HindIII-SrfI-SalI-BglII-PmeI）を含むヌクレオチド配列をアンチクロラムフェニコール遺伝子発現カセット配列と接続しpSS-Chlを生み、相同組換えに必要である上流(左臂)と下游(右臂)配列について、それぞれ平滑末端又は粘着端末を両側の多重クローニング部位に挿入し、再構成用シャトルベクターを構築する。
（3）pUC18クローンからpBR32複製開始配列を得てから、人工で合成された多重クローニング部位（PmeI-KpnI-SacII-NotI-XhoI-XbaI-SgfI-SnabI-SwaI-SbfIとSbfI-SwaI-EcoRV-FseI-HindIII-SrfI-SalI-BglII-PmeI）を含むヌクレオチド配列とアンチカナマイシン遺伝子発現カセット配列と接続してpSS-Knaを生成し、相同組換えに必要な上流(左アーム)と下流(右アーム)配列に対して、それぞれ平滑末端または粘着末端をpSS-Knaの両側の多重クローニング部位内に挿入して、再構成用シャトルベクターを構築する。
（4）pSSENTelは、左アーム配列がAd11ゲノムの前392bpで、右アームがAd5 E1A エンハンサー(195-378bp)、ヒト TERT プロモーター (-714-0bp)及び Ad11 E1A (568-1125bp)を順に接続したセグメント片であり、ヒト TERT プロモーター両側に、それぞれ二つの制限酵素切断部位XbaIとNcoIを導入し、左アームと右アームに対して、それぞれ平滑末端をpSS-Chlの両側(SnabIとEcoRV)に挿入し、最終にpSSENTelを生成する。
（5）pSSGFPは、左アームがDNAセグメント(Ad11 ゲノム DNA の27301から27837bpまで)とEGFP遺伝子を、NcoI切断部位において接続する産物で、EGFPの3’に一つのSnaBI切断部位を導入し、右アームがAd11 ゲノム DNA の28337から28920bpまでのDNAセグメントで、左アームと右アームに対して、それぞれ平滑末端をpSS-Knaの相応な両側のSnabIとEcoRV切断部位に挿入し、最終にpSSGFPを生成する。
（6）pSSENTelとpSSGFPをそれぞれPmeIにより酵素切断して純化し、二つのPmeI消化セグメントを同時にpAd11と、BJ5183細胞内で相同組換えしてから、アンピシリン、カナマイシン及びクロラムフェニコールという三種の抗生物質（濃度がそれぞれ100mg/ml、50ug/ml、25mg/mlである）を含む寒天板の上で選別する。陽性クローンに対して、それぞれSwaI と SbfI酵素切断を行うことによって、アンチクロラムフェニコール遺伝子発現カセット配列とカナマイシン遺伝子発現カセット配列を除去し、最終にpAd11-5ETel-GFP（図6参照）を生成する。
pAd11-5ETel-GFPに対して、NotIで酵素切断と線形化を行ってから、293細胞に導入してアデノウイルスAd11-5ETel-GFPを生成する。
Ad11-5ETel-GFPでのGFPのヒト正常上皮細胞および腫瘍細胞での発現。
Ad11-5ETel-GFPでヒト膵臓がん細胞系SUIT-2とヒト正常気管支上皮細胞系NHBE（感染濃度100pfu/細胞）を感染して、24時間後免疫蛍光顕微鏡でGFPの発現を観察する。GFPは腫瘍細胞SUIT-2で高い発現を呈しているが、正常細胞NHBEで発現が低い（図7参照）。これは、Ad11-5ETel-GFPが腫瘍細胞に敏感であることを説明する。
Ad11-5ETel-GFPＦで循環腫瘍細胞CTCsを検定する。
それぞれ10、25、50、100、200個のヒト膵臓がん細胞SUIT-2を3ml血液に混入し、赤血球を***分解した後、核のある細胞を遠心で収集してから、900μl DMEM培地で核のある細胞を再度懸濁液にして、1x104 pfu のAd11-5ETel-GFPを入れて24時間培養し、最後に免疫蛍光顕微鏡でGFP陽性細胞を計数する（図8参照）。末梢血細胞に0、10、100、1000個のヒト膵臓がん細胞SUIT-2細胞（感染濃度100pfu/細胞）を混入し、24時間後、免疫蛍光顕微鏡の下で蛍光細胞（図9参照）を観察した結果、d11-5ETel-GFPが腫瘍細胞に対して非常に敏感であることをあらわす。
Claims (5)
- 下記の手順、即ち、
（1）まず二種の異なる抗生物質耐性発現カセットでベクターpSS-ChlとpSS-Knaを構築してから、アンチクロラムフェニコール遺伝子発現カセット配列の両側にSwaI制限酵素切断部位を導入し、アンチカナマイシン遺伝子発現カセット配列の両側にSbfI制限酵素切断部位を導入すること、
（2）pUC18クローンから、pBR32複製の開始配列を得、人工合成された多重クローニング部位を含むヌクレオチド配列とアンチクロラムフェニコール遺伝子発現カセット配列と接続してpSS-Chlを生成し、アンチクロラムフェニコール遺伝子発現カセット配列の左アーム配列の上流と右アーム配列の下流に対して相同組換えを行い、アンチクロラムフェニコール遺伝子発現カセット配列の左アーム配列の上流と右アーム配列の下流を、それぞれ平滑末端又は粘着端末によってpSS-Chl両側の多重クローニング部位に挿入して、再構成用シャトルベクターを構築すること、
（3）pUC18クローンにより、pBR32複製の開始配列を取得し、人工合成された多重クローニング部位を含むヌクレオチド配列をアンチカナマイシン遺伝子発現カセット配列と接続してpSS-Knaを生成し、アンチカナマイシン遺伝子発現カセット配列の左アーム配列の上流と右アーム配列の下流に対して相同組換えを行い、アンチカナマイシン遺伝子発現カセット配列の左アーム配列の上流と右アーム配列の下流を、それぞれ平滑末端又は粘着末端によってpSS-Kna両側の多重クローニング部位に挿入し、再構成用シャトルベクターを構築すること、
（4）pSSENTelを構築すること、即ち、左アーム配列がAd11ゲノムの0-392bp配列で、右アームがAd5 E1Aエンハンサーの195-378bpセグメント、ヒト TERT プロモーターの-714-0bpセグメントと Ad11 E1Aの568-1125bp配列を順に接続して形成したセグメントであり、これと同時に、ヒトTERT プロモーターの両側にそれぞれ二つの制限酵素切断部位XbaIとNcoIを導入し、左アームと右アームに対して、平滑末端をpSS-Chlの両側のSnabIとEcoRVに挿入し、最終にpSSENTelを生成すること、
（5）pSSGFPを構築すること、即ち、左アームがAd11 ゲノムの27301 から 27837bpまでのDNAセグメントとEGFP遺伝子とを、NcoI切断部位において接続する産物で、それにEGFPの3’末端にSnaBI切断部位を導入すること、右アームがAd11ゲノムの28337 から28920bpまでのDNAセグメントで、左アームと右アームに対して、それぞれ平滑末端をpSS-Kna両側のSnabIとEcoRV切断部位に挿入し、最終にpSSGFPを生成すること、
（6）pSSENTelとpSSGFPをそれぞれPmeIにより酵素切断し、二つのPmeI消化セグメントを同時にpAd11と、BJ5183細胞で相同組換えしてから、アンピシリン、カナマイシン及びクロラムフェニコールという三種の抗生物質を含む寒天板の上で選別すること、陽性クローンに対して、それぞれSwaIとSbfIで酵素切断を行うことによって、アンチクロラムフェニコール遺伝子発現カセット配列とカナマイシン遺伝子発現カセットを除去し、pAd11-5ETel-GFPを生成すること、pAd11-5ETel-GFPに対して、NotIで酵素切断と線形化を行ってから、293細胞に導入してアデノウイルスAd11-5ETel-GFPを生成することを含むことを特徴とするB型再構成ヒトアデノウイルスベクターAd11-5ETel-GFPの構築方法。 - 前記アンピシリン、カナマイシン及びクロラムフェニコールの濃度がそれぞれ100mg/ml、50ug/mlと25mg/mlであることを特徴とする請求項１に記載の構築方法。
- 前記pSSENTelでのTel配列をそのほかの腫瘍特異遺伝子のプロモーターで代替し、一つの腫瘍特異腫瘍溶解アデノウイルスを生成することを特徴とする請求項１に記載の構築方法。
- 請求項１のB型再構成ヒトアデノウイルスベクターAd11-5ETel-GFPを含有する腫瘍治療剤。
- 請求項１のB型再構成ヒトアデノウイルスベクターAd11-5ETel-GFPを含有する血液循環での腫瘍細胞検定用薬剤。
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