ES2363094T3 - Proceso para la producción de ésteres alquílicos de ácidos grasos a partir de triglicéridos y alcoholes que utilizan una combinación de dos enzimas lipolíticas. - Google Patents
Proceso para la producción de ésteres alquílicos de ácidos grasos a partir de triglicéridos y alcoholes que utilizan una combinación de dos enzimas lipolíticas. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2363094T3 ES2363094T3 ES06700945T ES06700945T ES2363094T3 ES 2363094 T3 ES2363094 T3 ES 2363094T3 ES 06700945 T ES06700945 T ES 06700945T ES 06700945 T ES06700945 T ES 06700945T ES 2363094 T3 ES2363094 T3 ES 2363094T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- lipolytic enzyme
- lipase
- activity
- oil
- fatty acids
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 110
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 109
- 230000002366 lipolytic effect Effects 0.000 title claims abstract description 82
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 title claims abstract description 37
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 title claims abstract description 37
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 title claims abstract description 37
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 37
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 title claims abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 41
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 37
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 claims abstract description 27
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 26
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 claims abstract description 23
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 claims abstract description 21
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 12
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims abstract description 5
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 claims description 27
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 claims description 27
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 claims description 27
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 claims description 27
- 108010005400 cutinase Proteins 0.000 claims description 23
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 239000003921 oil Substances 0.000 claims description 17
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 claims description 16
- 241001661345 Moesziomyces antarcticus Species 0.000 claims description 12
- 241001480714 Humicola insolens Species 0.000 claims description 11
- 239000003925 fat Substances 0.000 claims description 10
- 241000222173 Candida parapsilosis Species 0.000 claims description 8
- 229940055022 candida parapsilosis Drugs 0.000 claims description 8
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 7
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 claims description 7
- 101710098554 Lipase B Proteins 0.000 claims description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 6
- 241000235403 Rhizomucor miehei Species 0.000 claims description 6
- 241000223258 Thermomyces lanuginosus Species 0.000 claims description 6
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 claims description 6
- 244000168141 Geotrichum candidum Species 0.000 claims description 5
- 235000017388 Geotrichum candidum Nutrition 0.000 claims description 5
- 241000589513 Burkholderia cepacia Species 0.000 claims description 4
- 241000222175 Diutina rugosa Species 0.000 claims description 4
- 241001203975 Hyphozyma sp. Species 0.000 claims description 4
- 101710098556 Lipase A Proteins 0.000 claims description 4
- 101710099648 Lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase Proteins 0.000 claims description 4
- 102100026001 Lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase Human genes 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 claims description 4
- 241001337994 Cryptococcus <scale insect> Species 0.000 claims description 3
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 claims description 3
- 235000019484 Rapeseed oil Nutrition 0.000 claims description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 claims description 2
- 239000003760 tallow Substances 0.000 claims description 2
- 235000019482 Palm oil Nutrition 0.000 claims 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 claims 1
- ZOJBYZNEUISWFT-UHFFFAOYSA-N allyl isothiocyanate Chemical compound C=CCN=C=S ZOJBYZNEUISWFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000000828 canola oil Substances 0.000 claims 1
- 235000019519 canola oil Nutrition 0.000 claims 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 claims 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 claims 1
- 235000021323 fish oil Nutrition 0.000 claims 1
- 239000010460 hemp oil Substances 0.000 claims 1
- 239000008164 mustard oil Substances 0.000 claims 1
- 239000002540 palm oil Substances 0.000 claims 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 claims 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 96
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 102100021851 Calbindin Human genes 0.000 description 15
- 101000898082 Homo sapiens Calbindin Proteins 0.000 description 15
- 101001021643 Pseudozyma antarctica Lipase B Proteins 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 13
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 12
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 208000016444 Benign adult familial myoclonic epilepsy Diseases 0.000 description 8
- 241000221779 Fusarium sambucinum Species 0.000 description 8
- -1 alkyl fatty acid esters Chemical class 0.000 description 8
- 239000003225 biodiesel Substances 0.000 description 8
- 208000016427 familial adult myoclonic epilepsy Diseases 0.000 description 8
- ZGNITFSDLCMLGI-UHFFFAOYSA-N flubendiamide Chemical compound CC1=CC(C(F)(C(F)(F)F)C(F)(F)F)=CC=C1NC(=O)C1=CC=CC(I)=C1C(=O)NC(C)(C)CS(C)(=O)=O ZGNITFSDLCMLGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 6
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 6
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- UYXTWWCETRIEDR-UHFFFAOYSA-N Tributyrin Chemical compound CCCC(=O)OCC(OC(=O)CCC)COC(=O)CCC UYXTWWCETRIEDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 5
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 5
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 4
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 3
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101000984201 Thermomyces lanuginosus Lipase Proteins 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 3
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 3
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 3
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 3
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 3
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 3
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 3
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 2
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 2
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 2
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 2
- WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N Sodium methoxide Chemical compound [Na+].[O-]C WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006136 alcoholysis reaction Methods 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 2
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 2
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N dodecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 2
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 2
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 235000012045 salad Nutrition 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 235000019871 vegetable fat Nutrition 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N (9Z,12Z)-9,10,12,13-tetratritiooctadeca-9,12-dienoic acid Chemical compound C(CCCCCCC\C(=C(/C\C(=C(/CCCCC)\[3H])\[3H])\[3H])\[3H])(=O)O OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N 0.000 description 1
- KEQGZUUPPQEDPF-UHFFFAOYSA-N 1,3-dichloro-5,5-dimethylimidazolidine-2,4-dione Chemical compound CC1(C)N(Cl)C(=O)N(Cl)C1=O KEQGZUUPPQEDPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IPYNIQBMIIXLIG-UHFFFAOYSA-N 1h-indol-3-ylmethyl(trimethyl)azanium Chemical compound C1=CC=C2C(C[N+](C)(C)C)=CNC2=C1 IPYNIQBMIIXLIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- 101710146708 Acid alpha-amylase Proteins 0.000 description 1
- 241001133760 Acoelorraphe Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 1
- 102000004580 Aspartic Acid Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010017640 Aspartic Acid Proteases Proteins 0.000 description 1
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 1
- 241000193749 Bacillus coagulans Species 0.000 description 1
- 241000193422 Bacillus lentus Species 0.000 description 1
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 description 1
- 241001474374 Blennius Species 0.000 description 1
- 244000056139 Brassica cretica Species 0.000 description 1
- 235000003351 Brassica cretica Nutrition 0.000 description 1
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000003343 Brassica rupestris Nutrition 0.000 description 1
- 244000188595 Brassica sinapistrum Species 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 241000193764 Brevibacillus brevis Species 0.000 description 1
- 108010031797 Candida antarctica lipase B Proteins 0.000 description 1
- 241001086914 Candida deformans Species 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 235000012766 Cannabis sativa ssp. sativa var. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 235000012765 Cannabis sativa ssp. sativa var. spontanea Nutrition 0.000 description 1
- 102000004308 Carboxylic Ester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000863 Carboxylic Ester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 1
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 229920000832 Cutin Polymers 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241000145614 Fusarium bactridioides Species 0.000 description 1
- 241000567163 Fusarium cerealis Species 0.000 description 1
- 241000223195 Fusarium graminearum Species 0.000 description 1
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 1
- 241000567178 Fusarium venenatum Species 0.000 description 1
- 101100001650 Geobacillus stearothermophilus amyM gene Proteins 0.000 description 1
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 101100295959 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) arcB gene Proteins 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000223198 Humicola Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005639 Lauric acid Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101710180012 Protease 7 Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101000968489 Rhizomucor miehei Lipase Proteins 0.000 description 1
- 241000303962 Rhizopus delemar Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000554265 Sphaerias Species 0.000 description 1
- 241000187432 Streptomyces coelicolor Species 0.000 description 1
- 241000187398 Streptomyces lividans Species 0.000 description 1
- 241001468239 Streptomyces murinus Species 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 101100157012 Thermoanaerobacterium saccharolyticum (strain DSM 8691 / JW/SL-YS485) xynB gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 108010048241 acetamidase Proteins 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 108010045649 agarase Proteins 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 1
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 101150069003 amdS gene Proteins 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 101150008194 argB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 235000019606 astringent taste Nutrition 0.000 description 1
- 229940054340 bacillus coagulans Drugs 0.000 description 1
- OGBUMNBNEWYMNJ-UHFFFAOYSA-N batilol Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCCCCOCC(O)CO OGBUMNBNEWYMNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl) sulfide Chemical compound ClCCSCCCl QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009120 camo Nutrition 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 235000005607 chanvre indien Nutrition 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- XTHPWXDJESJLNJ-UHFFFAOYSA-N chlorosulfonic acid Substances OS(Cl)(=O)=O XTHPWXDJESJLNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 101150005799 dagA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000001877 deodorizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000002283 diesel fuel Substances 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 1
- 108010061330 glucan 1,4-alpha-maltohydrolase Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000011487 hemp Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 1
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019626 lipase activity Nutrition 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 101150039489 lysZ gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910000000 metal hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004692 metal hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 238000006140 methanolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001160 methoxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])OC(*)=O 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 235000010460 mustard Nutrition 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 101150095344 niaD gene Proteins 0.000 description 1
- 235000021313 oleic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000005809 transesterification reaction Methods 0.000 description 1
- 101150110790 xylB gene Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6436—Fatty acid esters
- C12P7/649—Biodiesel, i.e. fatty acid alkyl esters
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Fats And Perfumes (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Método para producir ésteres alquílicos de ácidos grasos, donde se hace una mezcla reactiva contactando una solución que comprende (a) un sustrato, este sustrato comprende triglicéridos y ácidos grasos libres, preferiblemente en el intervalo de 0.01-95% por peso de ácidos grasos libres y (b) un alcohol, este alcohol es un alcohol inferior que contiene de 1 a 5 átomos de carbono (C1-C5), con una primera enzima lipolítica con una proporción de actividad en triglicérido a actividad en FFA por debajo de 0.2 y una segunda enzima lipolítica con una proporción de actividad en triglicérido a actividad en FFA por encima de 0.5.
Description
[0001] La presente invención se refiere a un método para producir ésteres alquílicos de ácidos grasos a partir de triglicéridos usando una primera enzima lipolítica que favorece la conversión de triglicéridos a ésteres alquílicos de ácido graso y una segunda enzima lipolítica que favorece la conversión de ácidos grasos libres a ésteres alquílicos de ácido graso.
[0002] El biodiesel, generalmente clasificado como ésteres de mono-alquilo de grasas y aceites, se ha vuelto más atractivo recientemente debido a sus beneficios medioambientales. Aunque el biodiesel es en la actualidad exitosamente producido químicamente (usando por ejemplo NaOH y/o metóxido sódico como catalizador), hay diferentes problemas asociados para restringir su desarrollo, tales como el pre-procesamiento del aceite debido a un alto contenido de ácidos grasos libres, la eliminación del catalizador químico de fase de éster y fase de glicerol y la eliminación de las sales inorgánicas durante la recuperación del glicerol.
[0003] Las desventajas provocadas por los catalizadores químicos son en gran medida evitadas usando enzimas lipolíticas como catalizadores y en los últimos años se ha desarrollado un interés en el uso de lipasas con o sin inmovilización en la transesterificación para la producción de biodiesel.
[0004] Las esterasas fúngicas se pueden utilizar en la producción enzimática de ésteres, donde pueden reemplazar a catalizadores como ácido mineral (p. ej. ácido sulfúrico, cloruro de hidrógeno, y ácido clorosulfónico), hidróxidos anfóteros de metales de los grupos I, II, III, y IV, y otros. El uso de enzimas para la síntesis de éster ha sido descrito en la técnica anterior, en particular las enzimas clasificadas en EC 3.1.1 hidrolasas de éster carboxílico según la nomeclatura enzimática (Recommendations of the Nomenclature Committee of the international Union of Biochemistry and Molecular Biology, 1992 o posterior).
[0005] La WO 88/02775 divulga lipasas A y B de Candida antarctica. Declara que la lipasa B de la C. antarctica (LBCA) es más eficaz para la síntesis del éster.
[0006] El documento de la patente US-A-5 713 965 divulga un método para producir ésteres alquílicos de ácido graso de un sustrato que comprende triglicéridos y ácidos grasos libres y un alcohol que contiene de 1 a 5 átomos de carbono que utilizan una enzima lipolítica tal como la lipasa B de Candida antarctica, o lipasas derivadas de Pseudomona cepacia, Geotrichum candidum, Rhizomucor miehei,o Rhizopus delemar.
[0007] El documento de la patente EP-A2-0 407 959 divulga un método para producir monoésteres de ácido graso de poliol a partir de ácidos grasos libres y polioles, o de triglicéridos, tales como grasa o aceite vegetal o de origen animal, y polioles en presencia de un alcohol que contiene de 1 a 5 átomos de carbono que utilizan la lipasa de Candida antarctica inmovilizada sp-382, que de hecho es una combinación de las dos enzimas lipolíticas lipasa A de Candida antarctica y lipasa B de Candida antarctica.
[0008] Las cutinasas son enzimas lipolíticas capaces de hidrolizar la cutina de sustrato. Las cutinasas son conocidas gracias a varios hongos (P.E. Kolattukudy en "Lipases", Ed. B. Borgström y H.L. Brockman, Elsevier 1984, 471-504 ). La secuencia de aminoácidos de una cutinasa de Humicola insolens ha sido publicada (US 5,827,719).
[0009] Muchos investigadores han informado de que un rendimiento elevado de ésteres alquílicos se podría alcanzar en presencia de solventes orgánicos, pero debido a la toxicidad e inflamabilidad de la alcoholisis catalizada de lipasa de solventes orgánicos es preferible en un medio sin solvente. Se ha demostrado que la metanólisis catalizada por lipasas se da en un sistema que contiene agua libre de solventes orgánicos. En tales sistemas, las lipasas que son menos sensibles al metanol son favorables (Kaieda et al. J. Biosci. Bioeng. 2001, 91:12-15). Es bien conocido que los alcoholes de cadena corta excesivos tales como metanol pueden inactivar seriamente la lipasa. No obstante, al menos tres equivalentes molares de metanol se requieren para la conversión completa del aceite a su éster metílico correspondiente. Du et al. (Biotechnol. Appl. Biochem. 2003, 38:103-106) estudiaron el efecto de la proporción molar de aceite/metanol comparativamente durante una operación por lotes no continuo y por lotes continuo.
[0010] Para evitar la inactivación de las lipasas la concentración de metanol se ha mantenido baja añadiendo gradualmente metanol en toda la reacción (Shimada et al. J Mol Catalysis Enzymatic, 2002, 17:133-142; Xu et al. 2004, Biocat. Biotransform. 22:45-48 ).
[0011] Boutur et al. (J. Biotechnol. 1995, 42:23-33) divulgó una lipasa de Candida deformans que era capaz de catalizar tanto la alcoholisis de triglicérido (TG) y la esterificación de ácidos grasos libres (AGL), pero no bajo las mismas condiciones de reacción. Bajo las condiciones descritas por Boutur et al. sólo la esterificación fue catalizada.
[0012] Para obtener una producción más económica de ésteres de etilo de ácido graso para biodiesel, es necesaria una conversión más rápida de grasas y aceites a sus ésteres de metilo correspondientes y un rendimiento más alto en dicha conversión.
15
25
35
45
55
[0013] La presente invención se refiere a un método para producir ésteres alquílicos de ácido graso, tales como ésteres metílicos de ácidos grasos (EMAG) y ésteres etílicos de ácidos grasos. Tales ésteres son también llamados biodiesel, porque se usan como un aditivo al gasóleo mineral para dar como resultado un combustible sin azufre, con un número más alto de cetano, que está parcialmente basado en recursos renovables.
[0014] El método de la invención incluye una solución que comprende alcohol, triglicéridos y ácidos grasos libres, dicha solución se contacta con una primera enzima lipolítica y una segunda enzima lipolítica de diferente especificidad, donde las enzimas lipolíticas catalizan la conversión de una mezcla de triglicéridos y ácidos grasos libres a ésteres alquílicos de ácidos grasos. La actividad de las primeras y segundas enzimas lipolíticas es determinada usando los métodos descritos en el ejemplo 1 y 2 mencionados abajo.
[0015] La primera enzima lipolítica se define como una enzima que tiene una proporción de actividad de TG/actividad de FFA por debajo de 0.2. La segunda enzima lipolítica se define como una enzima que tiene una proporción de actividad de TG/actividad de FFA por encima de 0.5.
[0016] La combinación de una primera enzima lipolítica y una segunda enzima lipolítica según la presente invención resulta en un efecto sinergístico en la conversión de triglicéridos y triglicéridos en combinación con ácidos grasos libres a ésteres alquílicos de ácidos grasos, por la cual un porcentaje más alto de conversión se obtiene en un periodo de tiempo más corto.
[0017] Además, la invención se refiere a un proceso por lotes o un proceso continuo por etapas para producir ésteres alquílicos de ácidos grasos usando una primera y una segunda enzima lipolítica como se ha descrito anteriormente, donde el alcohol se añade continuamente o gradualmente, y donde las enzimas son recicladas o usadas sólo una vez.
[0018] La presente invención se refiere a un método para producir ésteres alquílicos de ácidos grasos. El método de la invención incluye una solución que comprende alcohol, y un sustrato, que comprende triglicéridos y ácidos grasos libres. La solución es contactada con una primera enzima lipolítica y una segunda enzima lipolítica de diferente especificidad, donde las enzimas lipolíticas catalizan la conversión de una mezcla de triglicéridos y ácidos grasos libres o una mezcla de ambos a ésteres alquílicos de ácidos grasos.
[0019] Sustratos Los sustratos adecuados para producir ésteres alquílicos de ácidos grasos conforme a la presente invención son una amplia variedad de aceites vegetales y grasas; aceites de semilla de soja y de semilla de colza son los que se utilizan con más frecuencia, aunque otros cultivos tales como aceite de mostaza, de girasol, de canola, de coco, de cáñamo, de palma e incluso de algas resultan prometedores. El sustrato puede ser de calidad cruda o más procesada (refinado, decolorado y desodorizado). También se pueden utilizar grasas animales, incluyendo sebo, manteca de cerdo, ave, aceite marino al igual que residuos vegetales y grasas y aceites animales, comúnmente conocidas como grasa marrón y amarilla. Las grasas y aceites adecuados pueden ser una mezcla de triglicéridos y ácidos grasos libres, comúnmente vistos en aceites de residuos vegetales y grasas animales. El sustrato puede también ser obtenido de los destilados desodorizantes de aceites vegetales. El tipo de ácidos grasos del sustrato comprende aquellos de origen natural como glicéridos de las grasas y aceites animales y vegetales. Estos incluyen ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico, ácido de palmético y ácido láurico por nombrar algunos. Ingredientes menores en aceites vegetales crudos son típicamente fosfolípidos, ácidos grasos libres y glicéridos parciales es decir mono-y diglicéridos. Cuando se usa aquí la frase "residuos de ácidos grasos" se refiere a ácidos grasos, bien libres o esterificados como en triglicéridos, diglicéridos, monoglicéridos o ésteres alquílicos de ácidos grasos.
[0020] Biodiesel Los ésteres alquílicos de ácidos grasos, tales como ésteres metílicos de ácidos grasos (EMAG) y ésteres etílicos de ácidos grasos son también llamados biodiesel, porque se usan como aditivo al gasóleo fósil. El biodiesel constituye un aditivo o sustituto importante en aumento para combustibles de gasóleo basados en aceite fósil porque se produce a partir de recursos renovables.
[0021] Alcohol El alcohol usado en el método de la invención es un alcohol inferior que contiene de 1 a 5 átomos de carbono (C1-C5 ), Los alcoholes preferidos son el metanol y el etanol.
[0022] Enzima lipolítica La actividad de las enzimas lipolíticas contra triglicéridos y ácido graso libre se determina como se describe en el ejemplo 1 y ejemplo 2, respectivamente.
[0023] Según la presente invención, la primera enzima lipolítica se define como una enzima que tiene una proporción de actividad en triglicéridos (medido durante la conversión de triglicéridos a ésteres alquílicos de ácido graso) a actividad en FFA (medido durante la conversión de los AGL a ésteres alquílicos de ácidos grasos) por debajo de 0.2. La segunda enzima lipolítica es definida como una enzima que tiene una proporción de actividad en triglicéridos (medido durante la conversión de triglicéridos a ésteres alquílicos de ácidos grasos) a actividad en FFA (medido durante la conversión de FFA a ésteres alquílicos de ácido graso) por encima de 0.5.
[0024] Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método para la producción de ésteres alquílicos de ácidos grasso, caracterizado por el hecho de que una solución que comprende triglicéridos, ácidos grasos libres y alcohol se contacta con una primera enzima lipolítica que tiene una proporción de actividad en triglicérido a actividad en FFA por debajo de 0.2 y una segunda enzima lipolítica con una proporción de actividad en triglicérido a actividad en FFA por
15
25
35
45
encima de 0.5.
[0025] La primera enzima lipolítica tiene preferiblemente una proporción de actividad en triglicéridos a actividad en FFA en el intervalo de 0.01 -0.2, más preferiblemente en el intervalo de 0.01 -0.1, más preferiblemente en el intervalo de 0.0125 -0.05, más preferiblemente en el intervalo de 0.015 -0.025, incluso más preferiblemente en el intervalo de 0.02
0.024. La segunda enzima lipolítica tiene preferiblemente una proporción de actividad en triglicérido a actividad en FFA en el intervalo de 0.5 -20, más preferiblemente en el intervalo de 0.6 -10, más preferiblemente en el intervalo de 0.7 -5, incluso más preferiblemente en el intervalo de 0.8 -1.5.
[0026] Como se ha declarado anteriormente, la actividad de las enzimas lipolíticas contra triglicéridos y ácido graso libre se determina como se describe en el ejemplo 1 y ejemplo 2, respectivamente. Mencionada debajo, la proporción de actividad en triglicéridos (abreviado TG) como se mide en el ejemplo 1 a actividad en ácidos grasos libres (abreviado FFA) como medida en el ejemplo 2, ha sido calculada para las enzimas lipolíticas evaluadas:
- CALB:
- TG/FFA = 0.55/26.41 = 0.021
- Cutinasa de H. insolens:
- TG/FFA = 12.13/10 = 1.213
- Lipasa de T. Ianuginosus:
- TG/FFA = 13.22/16.25 = 0.814.
[0027] La combinación de una primera enzima lipolítica y una segunda enzima lipolítica según la presente invención resulta en un efecto sinergístico en la conversión de triglicéridos y/o ácidos grasos libres a ésteres alquílicos de ácidos grasos, con lo cual se obtiene un mayor porcentaje de conversión en un periodo de tiempo más corto.
[0028] En una forma de realización preferida del método de la presente invención, una primera enzima lipolítica de la presente invención es lipasa B de Candida antarctica (LBAC) como se describe en WO 88/02775, mientras que la segunda enzima lipolítica es una enzima de las variantes de lipasa de Thermomyces lanuginosus (previamente Humicola Ianuginosus) ejemplificadas en WO 00/60063 y las variantes de cutinasa de Humicola insolens descritas en el ejemplo 2 de WO 01/92502, de ahora en adelante referida como lipasa de T. Ianuginosus y cutinasa de H. insolens respectivamente. En una segunda forma de realización preferida, una primera enzima lipolítica incluye lipasa de Hyphozyma sp. y lipasa de Candida parapsilosis, mientras que una segunda enzima lipolítica de la presente invención incluye lipasa A de C. antarctica como se describe en WO 88/02775 y lipasas de Thermomyces lanuginosus (EP 258 068), Candida rugosa, Pseudomonas cepacia, Geotrichum candidum, Rhizomucor miehei, Cryptococcus spp. S-2 y Candida parapsilosis.
[0029] En una tercera forma de realización la primera enzima lipolítica es homóloga de CALB, lipasa de Hyphozyma sp. o lipasa de Candida parapsilosis, mientras que la segunda enzima lipolítica es homóloga de la cutinasa de H. insolens o cualquiera de las lipasas de Thermomyces lanuginosus (EP 258 068), Candida rugosa, Pseudomonas cepacia, Geotrichum candidum, Rhizomucor miehei, Criptococo spp. S-2 y Candida parapsilosis.
[0030] Preferiblemente, la primera enzima lipolítica según el método de la presente invención es un 60% idéntica a CALB, mientras que la segunda enzima lipolítica es un 60% idéntica a la lipasa de T. lanuginosus, la cutinasa de H. insolens. Más preferiblemente la primera enzima lipolítica es un 70% idéntica a CALB, incluso más preferiblemente la primera enzima lipolítica es un 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o incluso 99% idéntica a CALB. De forma similar, la segunda enzima lipolítica es preferiblemente un 70% idéntica a la lipasa de T. lanuginosus y a la cutinasa de H. insolens, más preferiblemente la segunda enzima lipolítica es en un 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o incluso un 99% idéntica a la lipasa de T. lanuginosus o cutinasa de H. insolens.
[0031] Las enzimas se pueden aplicar como polvo liofilizado, inmovilizadas o en solución acuosa.
[0032] Para objetivos de la presente invención, el grado de identidad puede ser adecuadamente determinado según el método descrito en Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-45, con los siguientes ajustes para la comparación de secuencias de polipéptidos: penalización de creación de GAPs (huecos) de
3.0 y penalización de extensión de GAPs de 0.1. La determinación puede realizarse mediante un programa de ordenador conocido tal como GAP proporcionado en el GCG program package (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711).
[0033] Dos secuencias dadas se pueden alinear según el método descrito en Needleman (supra) usando los mismos parámetros. Se puede realizar mediante el programa GAP (supra).
[0034] Además, la invención se refiere a un proceso por lotes y/o un proceso continuo, por etapas para producir ésteres alquílicos de ácidos grasos usando una primera y una segunda enzima lipolítica como se ha descrito anteriormente, donde el alcohol se añade continuamente o gradualmente, y donde las enzimas son recicladas o usadas sólo una vez. Si las enzimas están en una fase acuosa, esta fase se puede separar de la fase grasa por un decantador o por centrifugado. En el proceso continuo las dos fases, de aceite y acuosa, respectivamente, pueden ser procesadas contrariamente. Kosugi, Y; Tanaka, H. y Tomizuka, (1990), Biotechnology and Bioengineering, vol .36, 617-622, describe un proceso continuo, a contracorriente para hidrolizar aceite vegetal por lipasa inmovilizada.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Descripción general de la preparación de ésteres alquílicos de ácidos grasos
[0035] El sustrato que comprende triglicéridos y ácidos grasos libres se mezcla con alcohol, metanol o etanol preferiblemente y es calentado a 30-60 °C, preferiblemente 50 °C en un baño de agua con agitación recíproca (200 rpm). El agua se añade preferiblemente y la solución se mezcla y además se calienta a la temperatura deseada. Las enzimas se añaden y la solución se mezcla enérgicamente y se deja en baño de agua con agitación recíproca a la temperatura deseada, preferiblemente a 50°C y 200 rpm para que reaccione. Las fases de la mezcla reactiva pueden mezclarse usando mezcladores de alta cizalla, tales como los tipos de Silverson o IKA Labortechnik, como usados en el desgomado enzimático de aceite vegetal (Clausen, K. (2001), European Journal of Lipid Science and Technology, vol. 103, 333-340).
[0036] La proporción molar [metanol]/[residuo de ácidos grasos] debería ser por lo menos de 0.1 y como mucho de 10, preferiblemente en el intervalo de 0.3-5, más preferiblemente 0.4-2. El alcohol puede ser añadido gradualmente a la reacción con el paso del tiempo. El agua se puede añadir separadamente o dentro de una solución enzimática acuosa. La concentración final de agua en la mezcla reactiva puede ser de 0-50% (p/p), preferiblemente 5-40%, más preferiblemente 5-30%. El sustrato comprende un 1-99% (p/p) de triglicéridos, preferiblemente en el intervalo de 7095%. Además, el sustrato comprende ácidos grasos libres con un total de 0.01-95% (p/p), preferiblemente en el intervalo de 0.01-30%. También, puede haber mono-y diglicéridos y fosfolípidos.
[0037] El curso de la reacción se puede seguir retirando muestras de la mezcla reactiva después de un cierto periodo de tiempo de reacción. Las muestras se centrifugan durante 14 minutos a 14000 rpm. La capa superior consiste en material graso no soluble en la fase acuosa y se analiza por 1H RMN (usando CDCl3 como solvente). Después de que la reacción haya cesado, la fase de glicerol es eliminada bien por decantación o centrifugado.
Clonación de una secuencia de ADN que codifica una enzima lipolítica
[0038] La secuencia de ADN que codifica una enzima lipolítica madre se puede aislar a partir de cualquier célula o microorganismo que produzca la enzima lipolítica en cuestión, usando varios métodos bien conocidos en la materia. Primero, un ADN genómico y/o genoteca de ADNc debería ser construido usando ADN cromosómico o ARN mensajero del organismo que produce la enzima lipolítica que debe ser estudiada. Entonces, si la secuencia de aminoácidos de la enzima lipolítica es conocida, las investigaciones etiquetadas oligonucleótidas se pueden sintetizar y se pueden utilizar para identificar clones codificadores de enzimas lipolíticas de una genoteca obtenida a partir del organismo en cuestión. Alternativamente, una sonda de las investigaciones oligonucleótidas que contiene secuencias homólogas de otro gen de enzima lipolítica conocido podría ser usado como una investigación para identificar clones codificadores de enzimas lipolíticas, usando hibridación y condiciones de lavado de astringencia inferior.
[0039] Otro método para identificar clones codificadores de enzimas lipolíticas implicarían insertar fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido, transformando bacterias cutinasas negativas con el ADN de la genoteca resultante, y luego colocando en placas la bacteria transformada en un agar que contenga un sustrato para enzima lipolítica (es decir, triglicérido), permitiendo así identificar los clones que expresan la enzima lipolítica.
[0040] Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica la enzima se puede preparar sintéticamente por métodos estándar establecidos, por ejemplo el método de fosforamidita descrito por S.L. Beaucage and M.H. Caruthers, (1981), Tetrahedron Letters 22, págs. 1859-1869, o el método descrito por Matthes et al., (1984), EMBO J.3, págs. 801-805. En el método de fosforamidita, los oligonucleótidos son sintetizados, por ejemplo en un sintetizador de ADN automático, purificado, recocido, ligado y clonado en vectores apropiados.
[0041] Finalmente, la secuencia de ADN puede ser de origen sintético y genómico mezclado, origen mezclado sintético y de origen de ADNc u origen mezclado genómico y de ADNc, preparado ligando fragmentos de origen sintético, genómico o de ADNc (como es apropiado, los fragmentos que corresponden a varias partes de toda la secuencia de ADN), conforme a técnicas estándar. La secuencia de ADN puede también ser preparada por reacción en cadena de polimerasa (RCP) usando cebadores específicos, por ejemplo como se describe en US 4,683,202 o R.K. Saiki et al., (1988), Science 239, 1988, págs. 487-491.
Vector de expresión
[0042] El vector de expresión recombinante que lleva la secuencia de ADN que codifica una enzima lipolítica usada en la invención puede ser cualquier vector que pueda convenientemente ser sometido a procedimientos de ADN recombinantes, y la elección del vector frecuentemente dependerá de la célula huésped que ha de ser introducida. El vector puede ser uno que, cuando sea introducido en una célula huésped, se integre en el genoma de la célula huésped y se replique junto con el(los) cromosoma(s) en el que ha sido integrado. Ejemplos de vectores de expresión adecuados incluyen pMT838.
[0043] El vector de expresión usado en la invención puede también comprender un terminador de transcripción adecuado y, en secuencias de eucariotas y de poliadenilación operativamente conectadas a la secuencia de ADN que codifica la enzima lipolítica usada en la invención. Secuencias de terminación y poliadenilación pueden adecuadamente derivar de las mismas fuentes que el promotor.
[0044] El vector puede comprender además una secuencia de ADN que permite al vector replicar en la célula huésped en cuestión. Ejemplos de tales secuencias son los orígenes de replicación de plásmidos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 y pIJ702.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
[0045] El vector puede también comprender un marcador seleccionable, por ejemplo un gen producto del cual complementa un defecto en la célula huésped, tal como los genes dal de B. subtilis o B. licheniformis, o uno que confiera resistencia antibiótica tal como resistencia a la ampicilina, a la canamicina, al cloranfenicol o a la tetraciclina. Además, el vector puede comprender marcadores de selección de Aspergillus tales como amdS, argB, niaD y sC, un marcador que aumenta la resistencia a la higromicina, o la selección se puede realizar por cotransformación, por ejemplo como se describe en WO 91/17243.
[0046] Los procedimientos usados para enlazar el constructo de ADN usado en la invención que codifica una variante de cutinasa, el promotor, terminador y otros elementos, respectivamente, y que los inserta en vectores adecuados con la información necesaria para una replicación, son conocidos por personas expertas en la técnica (cf., por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989 ).
Promotor
[0047] En el vector, la secuencia de ADN debería estar operativamente conectada a una secuencia del promotor adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad transcripcional en la célula huésped elegida y se pueden derivar de genes que codifican proteínas ya sean heterólogas o bien homólogas a la célula huésped.
[0048] Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica una enzima lipolítica usada en la invención, especialmente en un huésped bacteriano, son el promotor del operón lac de E.coli, los promotores del gen de agarasa dagA de Streptomyces coelicolor, los promotores del gen de alfa-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, los promotores del gen de amilasa maltogénica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, los promotores de la alfa-amilasa (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, los promotores de los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis etc. Para la transcripción en un huésped fúngico, ejemplos de promotores útiles son aquellos derivados del gen que codifica TAKA amilasa de A. oryzae, el promotor de TPI (triosa fosfato isomerasa) de S. cerevisiae (Alber et al. (1982), J. Mol. Appl. Genet 1, págs. 419-434, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilasa neutra de A. niger, alfa-amilasa ácido estable de A. niger, glucoamilasa de A. niger, lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de A. oryzae, triosafosfato isomerasa de A. oryzae, o acetamidasa de A. nidulans.
Células huéspedes
[0049] La célula usada en la invención, que comprende sea un constructo de ADN o sea un vector de expresión de la invención tal como se ha definido anteriormente, es ventajosamente usada como una célula huésped en la producción recombinante de una enzima lipolítica usada en la invención. La célula se puede transformar con el constructo de ADN usado en la invención que codifica la enzima lipolítica, integrando convenientemente el constructo de ADN (en una o más copias) en el cromosoma huésped. Esta integración es generalmente considerada ventajosa dado que la secuencia de ADN es más propensa a mantenerse estable en la célula. La integración de los constructos de ADN en el cromosoma huésped se puede realizar según métodos convencionales, por ejemplo por recombinación homóloga o heteróloga. Alternativamente, la célula se puede transformar con un vector de expresión como se ha descrito anteriormente en relación con los diferentes tipos de células huéspedes.
[0050] La célula usada en la invención puede ser una célula de un organismo superior tal como un mamífero o un insecto, particularmente una célula microbiana, por ejemplo una célula bacteriana o fúngica (incluyendo levadura).
[0051] Ejemplos de bacterias adecuadas son bacterias Gram positivas tales como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, o Streptomyces lividans o Streptomyces murinus, o bacterias gram negativas tales como la E.coli. La transformación de las bacterias se puede, por ejemplo, efectuar transformando el protoplasto o usando células competentes en cierto modo conocidas per se.
[0052] El organismo de levadura puede favorablemente ser seleccionado de unas especies de Saccharomyces o Schizosaccharomyces, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae.
[0053] La célula huésped puede también ser un hongo filamentoso por ejemplo una cepa de unas especies de Aspergillus, particularmente Aspergillus oryzae o Aspergillus niger, o una cepa de Fusarium, tal como una cepa de Fusarium oxysporum, Fusarium Graminearum (en la Gibbarella zeae nombrada de estado perfecto, previamente Sphaeria zeae, sinónimo de Gibberella roseum y Gibberella roseumf. sp. cerealis), o Fusarium sulphureum (en el estado prefecto nombrada Gibberella puricaris, sinónimo de Fusarium trichothecioides, Fusarium bactridioides, Fusarium sambucinum, Fusarium roseum,y Fusarium roseum var. graminearum), Fusarium cerealis (sinónimo de Fusarium crokkwellense), o Fusarium venenatum.
[0054] La célula huésped puede ser una proteasa deficitaria o cepa menor de proteasa. Ésta puede por ejemplo ser la cepa carente de proteasa Aspergillus oryzae JaL 125 con el gen de proteasa alcalina llamado "alp" eliminado. Esta cepa es descrita en WO 97/35956 (Novo Nordisk).
[0055] Las células de hongos filamentosas se pueden transformar por un proceso que implica la formación de protoplasto y la transformación de los protoplastos seguida de la regeneración de la pared celular en cierto modo conocido per se. El uso de Aspergillus como un microorganismo huésped es descrito en la EP 238 023 (Novo Nordisk A/S).
15
25
35
45
Producción de enzima lipolítica por cultivo de transformante
[0056] Se describe un método para producir una enzima lipolítica usada en la invención, este método comprende el cultivo de una célula huésped bajo condiciones propicias para la producción de la enzima lipolítica y recuperación de la enzima lipolítica de las células y/o medio de cultivo.
[0057] El medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para el crecimiento de la célula huésped en cuestión y la obtención de expresión de la enzima lipolítica usada en la invención. Los medios adecuados están disponibles gracias a proveedores comerciales o se pueden preparar según recetas publicadas (p. ej. como se describe en catálogos de la American Type Culture Collection).
[0058] La enzima lipolítica segregada de las células huéspedes puede convenientemente ser recuperada del medio de cultivo por procedimientos bien conocidos, incluyendo la separación de las células del medio por centrifugado o filtración, y la precipitación de componentes proteínicos del medio mediante una sal tal como sulfato de amonio, seguido por el uso de procedimientos cromatográficos tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o similares.
MATERIALES Y MÉTODOS
Actividad lipásica en la tributirina (LU)
[0059] Un sustrato para enzimas lipolíticas se prepara emulsionando tributirina (glicerina tributirato) usando goma arábiga como emulsionante. La hidrólisis de tributirina a 30°C con pH 7 se sigue en un experimento de titulación del pHstat. Una unidad de actividad lipásica (1 LU) iguala la cantidad de enzima capaz de liberar 1 µmol de ácido butírico/min en las condiciones estándares.
[0060] 8.00 gramos de sustrato se mezclan con metanol (0.500 ml => 0.395 gramos). Los siguientes tipos de sustratos fueron usados:
Ejemplo 1) 100% aceite para ensaladas (aceite de soja refinado, decolorado y desodorizado, RBD SBO);
Ejemplo 2) 100% ácido oleico;
Ejemplo 3) Mezcla de 20% p/p de ácido oleico en RBD SBO
[0061] La mezcla de metanol como sustrato se calienta a 50 °C en un baño de agua con agitación recíproca (200 rpm). Se añade agua desmineralizada (el volumen depende del volumen de enzima adicionada; cantidad total de agua: 4.00 ml incluyendo agua de adición enzimática), correspondiente a 32 % p/p de la mezcla total. La mezcla se calienta a 50°C. Luego se añade la enzima a la mezcla y es enérgicamente mezclada durante 10 seg. y dejada en baño de agua con agitación recíproca a 50°C y 200 rpm. Las fases de la mezcla reactiva pueden mezclarse por el uso de mezcladores de alta cizalla, tales como los de Silverson Ltd. UK o IKA Kunkel.
[0062] Las muestras se retiran de la mezcla reactiva después de 3 horas de tiempo de reacción y son centrifugadas durante 14 minutos a 14000 rpm. La capa superior consiste en material graso no soluble en fase acuosa y se analiza por 1H RMN (usando CDCl3 como solvente) espectrómetro Varian 400 MHz (Varian Inc. CA, USA). La conversión de los residuos de ácidos grasos en éster metílico de ácido graso se determina por la proporción de las señales de metilo de los ésteres metílicos de ácidos grasos, -COOCH3 (3.70 ppm) y CH3CH2-(1.0 -0.9 ppm) de los residuos de ácidos grasos.
[0063] La dosis enzimática se basa en un total 0.4 mg de proteína / 8.00 gramos de sustrato. Para examinar un efecto sinergístico de dos enzimas combinadas; 0.2 mg de cada enzima fueron adicionadas a 8 gramos de sustrato y comparadas con cada una de las enzimas a una dosis de 0.4 mg / 8 gramos de sustrato. Para relacionar la cantidad de proteína con una actividad enzimática, un ensayo de actividad enzimática estándar se puede aplicar, en este caso el ensayo LU como se ha descrito anteriormente (actividad lipásica en tributirina). Las siguientes preparaciones enzimáticas fueron evaluadas:
- 1.
- lipasa de T. lanuginosus (TLL, actividad específica 7000 LU/mg proteína)
- 2.
- lipasa B de C. antarctica (LBCA, actividad específica 500 LU/mg proteína)
- 3.
- cutinasa de H. insolens (cutinasa, actividad específica 1800 LU/mg proteína) [0064] Dosis enzimática y volúmenes de agua adicionales para experimentos con enzimas únicas:
- 1.
- TLL: 0.700 ml de 4000 LU/ml de solución enzimática + 3.30 ml agua
- 2.
- LBCA: 1.680 ml de 119 LU/m) de solución enzimática + 2.32 ml agua
- 3.
- Cutinasa: 0.450 ml de 1600 LU/ml de solución enzimática + 3.55 ml agua [0065] Dosis enzimática y volúmenes de agua adicionales para experimentos con combinación de enzimas:
1. TLL + LBCA: (0.350 ml de 4000 LU/ml de solución de TLL + 0.840 ml de un 119 LU/ml de solución de CALB
+ 2.810 ml agua)
2. Cutinasa + CALB: (0.225 ml de 1600 LU/ml de solución de cutinasa + 0.840 ml de 119 LU/ml de solución de CALB + 2.935 ml agua).
5 Ejemplo 1, preparación de ésteres alquílicos de ácido graso a partir de triglicéridos
[0066] Aceite de soja refinado, decolorado y desodorizado (RBD SBO, aceite para ensaladas) fue usado como sustrato según el método general anteriormente descrito.
Las conversiones (%) de residuos de ácido graso en FAME después de 3 horas de tiempo de reacción usando diferentes enzimas lipolíticas se muestran en la Tabla 1, mientras que la conversión (%) conseguida con una
10 combinación de CALB y TLL se muestra en la Tabla 2. Se determinó que el Coeficiente de Variación en % (CV%) de cuatro experimentos idénticos era 2.2%.
Tabla 1. Enzimas únicas % conversión de residuos de ácido graso en FAME
- CALB
- 0.55
- Cutinasa
- 12.13
- TLL
- 13.22
Tabla 2. Combinación de enzimas, % conversión de residuos de ácido graso en FAME.
- CALB + TLL
- 16, 21
15 Ejemplo 2, preparación de ésteres alquílicos de ácidos grasos a partir de ácido oleico
[0067] El ácido oleico fue usado como sustrato según el método general anteriormente descrito. Las conversiones (%) de residuos de ácidos grasos en FAME después de 3 horas tiempo de reacción usando diferentes enzimas lipolíticas se muestran en la tabla 3.
Tabla 3. Encimas únicas, % conversión de residuos de ácido graso en FAME.
- CALB
- 26.41
- Cutinasa
- 10
- TLL
- 16.25
20 Ejemplo 3. Preparación de ésteres alquílicos de ácido graso a partir de triglicéridos que contienen ácidos grasos libres [0068] Una mezcla de un 20% p/p de ácido oleico en RBD SBO fue usada como sustrato según el método general
anteriormente descrito. Las conversiones (%) de residuos de ácidos grasos en FAME después de 3 horas tiempo de reacción usando enzimas lipolíticas y combinaciones de dichas enzimas diferentes se muestran en la tabla 4 y 5.
25 Tabla 4. Encimas únicas, % conversión de residuos de ácidos grasos en FAME.
- CALB
- 16.58
- Cutinasa
- 11.22
- TLL
- 14.09
Tabla 5. Combinación de enzimas, % conversión de residuos de ácidos grasos en FAME.
- CALB + cutinasa
- 18.82
- CALB + TLL
- 20
Claims (11)
- REIVINDICACIONES1. Método para producir ésteres alquílicos de ácidos grasos, donde se hace una mezcla reactiva contactando una solución que comprende (a) un sustrato, este sustrato comprende triglicéridos y ácidos grasos libres, preferiblemente en el intervalo de 0.01-95% por peso de ácidos grasos libres y (b) un alcohol, este alcohol es5 un alcohol inferior que contiene de 1 a 5 átomos de carbono (C1-C5), con una primera enzima lipolítica con una proporción de actividad en triglicérido a actividad en FFA por debajo de 0.2 y una segunda enzima lipolítica con una proporción de actividad en triglicérido a actividad en FFA por encima de 0.5.
- 2. Método según la reivindicación 1, donde el triglicérido se deriva de una o más materias primas de aceite vegetal, aceite de semilla de colza, aceite de soja, aceite de mostaza, aceite de girasol, aceite de canola,10 aceite de coco, aceite de cáñamo, aceite de palma, aceite de resina, grasas animales incluyendo aceite de sebo, de manteca de cerdo, de ave y de pescado.
- 3. Método según las reivindicaciones 1 a 2, donde la proporción molar entre el alcohol y los residuos de ácidos grasos es mínimo de 0.1 y máximo de 10, preferiblemente en el intervalo de 0.3-5, más preferiblemente de 0.4-2.15 4. Método según las reivindicaciones 1 a 3, donde el alcohol es metanol o etanol.
-
- 5.
- Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la mezcla reactiva además comprende agua, preferiblemente hasta un 50% (p/p).
-
- 6.
- Método según todas las reivindicaciones precedentes, donde la primera enzima lipolítica tiene una proporción
de actividad en triglicérido a actividad en FFA en el intervalo de 0.01-0.2 y la segunda enzima lipolítica tiene 20 una proporción de actividad en triglicérido a actividad en FFA en el intervalo de 0.5-20. - 7. Método según todas las reivindicaciones precedentes, donde la primera enzima lipolítica es en un 60% idéntica a una enzima lipolítica seleccionada del grupo que consiste en lipasa B de Candida antarctica, lipasa de Hyphozyma sp. y lipasa de Candida parapsilosis.
- 8. Método según la reivindicación 7, donde la primera enzima lipolítica es lipasa B de Candida antarctica, lipasa 25 de Hyphozyma sp. o lipasa de Candida parapsilosis.
- 9. Método según todas las reivindicaciones precedentes, donde la segunda enzima lipolítica es en un 60% idéntica a una enzima lipolítica seleccionada del grupo que consiste en lipasa de T. lanuginosus, cutinasa de H. Insolens, lipasa A de C. antarctica, lipasas de Candida rugosa, Pseudomonas cepacia, Geotrichum candidum, Rhizomucor miehei, Cryptococcus spp.S-2, y Candida parapsilosis.30 10. Método según la reivindicación 9, donde la segunda enzima lipolítica es una de lipasa de T. lanuginosus, cutinasa de H. insolens, lipasa A de C. antarctica, lipasas de Candida rugosa, Pseudomonas cepacia, Geotrichum candidum, Rhizomucor miehei, Cryptococcus spp. S-2, y Candida parapsilosis.
-
- 11.
- Método según todas las reivindicaciones precedentes, donde el proceso procede en un modo por lotes.
-
- 12.
- Método según todas las reivindicaciones precedentes, donde el proceso procede en un modo continuo.
35 13. Método según todas las reivindicaciones precedentes, donde las fases de solución en la mezcla reactiva son mezcladas usando un mezclador de alta cizalla. - 14. Método según todas las reivindicaciones precedentes, donde el proceso se conduce a modo de contracorriente.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK200500041 | 2005-01-10 | ||
DKPA200500041 | 2005-01-10 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2363094T3 true ES2363094T3 (es) | 2011-07-20 |
Family
ID=36572405
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES06700945T Active ES2363094T3 (es) | 2005-01-10 | 2006-01-10 | Proceso para la producción de ésteres alquílicos de ácidos grasos a partir de triglicéridos y alcoholes que utilizan una combinación de dos enzimas lipolíticas. |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20080113419A1 (es) |
EP (1) | EP1838860B1 (es) |
JP (1) | JP5133701B2 (es) |
CN (1) | CN101103118B (es) |
AT (1) | ATE503019T1 (es) |
BR (1) | BRPI0606389B1 (es) |
CA (1) | CA2593282C (es) |
DE (1) | DE602006020837D1 (es) |
ES (1) | ES2363094T3 (es) |
WO (1) | WO2006072256A2 (es) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100199548A1 (en) * | 2007-07-06 | 2010-08-12 | Ls9, Inc. | Systems and methods for the production of fatty esters |
US8183028B2 (en) | 2007-12-21 | 2012-05-22 | Ls9, Inc. | Methods and compositions for producing olefins |
WO2010115764A2 (en) * | 2009-04-06 | 2010-10-14 | Novozymes A/S | Triglycerides with high content of unsaturated fatty acids |
US9040263B2 (en) | 2010-07-28 | 2015-05-26 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Production of alcohol esters and in situ product removal during alcohol fermentation |
US20110312053A1 (en) | 2010-06-18 | 2011-12-22 | Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc | Supplementation of fatty acids for improving alcohol productivity |
AR084876A1 (es) | 2011-01-21 | 2013-07-10 | Novozymes As | Produccion de esteres alquilicos de acidos grasos |
AR087146A1 (es) | 2011-02-04 | 2014-02-26 | Novozymes As | Proceso para la preparacion de derivados de acidos carboxilicos |
CN106460018A (zh) | 2014-05-28 | 2017-02-22 | 诺维信公司 | 采用碱处理进行脂肪酸烷基酯生产 |
CN105062697B (zh) * | 2015-08-24 | 2021-06-15 | 华南农业大学 | 一种利用预处理提高餐厨油脂酶法制备生物柴油产量的方法 |
CN106480114B (zh) * | 2015-08-25 | 2021-10-08 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | 制备生物柴油的方法 |
EP3359679A1 (en) | 2015-10-09 | 2018-08-15 | Novozymes A/S | Enzymatic or non-enzymatic biodiesel polishing process |
WO2023209070A1 (en) * | 2022-04-29 | 2023-11-02 | Novozymes A/S | Production of fatty acid alkyl esters |
Family Cites Families (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4056442A (en) * | 1976-06-01 | 1977-11-01 | The Dow Chemical Company | Lipase composition for glycerol ester determination |
JPS60234588A (ja) * | 1984-05-07 | 1985-11-21 | Asahi Denka Kogyo Kk | 長鎖高度不飽和脂肪酸アルコ−ルエステルの製造法 |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
DK122686D0 (da) | 1986-03-17 | 1986-03-17 | Novo Industri As | Fremstilling af proteiner |
DE3750450T2 (de) | 1986-08-29 | 1995-01-05 | Novo Industri As | Enzymhaltiger Reinigungsmittelzusatz. |
WO1988002775A1 (en) | 1986-10-17 | 1988-04-21 | Novo Industri A/S | Positionally non-specific lipase from candida sp, a method for producing it, its use and a recombinant dna process for producing it |
EP0407959A3 (en) * | 1989-07-11 | 1992-01-02 | Lion Corporation | Process for producing polyol fatty acid monoesters |
US5288619A (en) * | 1989-12-18 | 1994-02-22 | Kraft General Foods, Inc. | Enzymatic method for preparing transesterified oils |
ES2068586T5 (es) | 1990-05-09 | 2004-12-01 | Novozymes A/S | Una preparacion de celulasa que comprende una enzima endoglucanasa. |
US5173965A (en) | 1991-09-30 | 1992-12-29 | Panner Donna J | Releasably attached two section gown |
EP0785994A1 (en) * | 1994-10-26 | 1997-07-30 | Novo Nordisk A/S | An enzyme with lipolytic activity |
WO1997035956A1 (en) | 1996-03-27 | 1997-10-02 | Novo Nordisk A/S | Alkaline protease deficient filamentous fungi |
US5713965A (en) * | 1996-04-12 | 1998-02-03 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Production of biodiesel, lubricants and fuel and lubricant additives |
EP1171581A1 (en) | 1999-03-31 | 2002-01-16 | Novozymes A/S | Lipase variant |
AU2001260085A1 (en) | 2000-06-02 | 2001-12-11 | Novozymes A/S | Cutinase variants |
JP4530311B2 (ja) * | 2000-07-13 | 2010-08-25 | 日本水産株式会社 | リパーゼを用いたグリセライドの製造方法 |
CN1238469C (zh) * | 2004-01-16 | 2006-01-25 | 清华大学 | 有机介质反应体系中脂肪酶转化油脂生产生物柴油新工艺 |
US7473539B2 (en) * | 2004-09-20 | 2009-01-06 | Sunho Biodiesel Corporation | Methods for producing alkyl esters |
-
2006
- 2006-01-10 JP JP2007549795A patent/JP5133701B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-01-10 US US11/813,121 patent/US20080113419A1/en not_active Abandoned
- 2006-01-10 AT AT06700945T patent/ATE503019T1/de not_active IP Right Cessation
- 2006-01-10 DE DE602006020837T patent/DE602006020837D1/de active Active
- 2006-01-10 ES ES06700945T patent/ES2363094T3/es active Active
- 2006-01-10 CA CA2593282A patent/CA2593282C/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-01-10 BR BRPI0606389-6A patent/BRPI0606389B1/pt active IP Right Grant
- 2006-01-10 CN CN2006800019976A patent/CN101103118B/zh active Active
- 2006-01-10 EP EP06700945A patent/EP1838860B1/en active Active
- 2006-01-10 WO PCT/DK2006/000016 patent/WO2006072256A2/en active Application Filing
-
2011
- 2011-04-28 US US13/096,448 patent/US9593352B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP5133701B2 (ja) | 2013-01-30 |
EP1838860B1 (en) | 2011-03-23 |
US9593352B2 (en) | 2017-03-14 |
EP1838860A2 (en) | 2007-10-03 |
CA2593282A1 (en) | 2006-07-13 |
WO2006072256A2 (en) | 2006-07-13 |
DE602006020837D1 (de) | 2011-05-05 |
ATE503019T1 (de) | 2011-04-15 |
CA2593282C (en) | 2016-03-15 |
WO2006072256A3 (en) | 2007-02-08 |
US20110201066A1 (en) | 2011-08-18 |
CN101103118A (zh) | 2008-01-09 |
BRPI0606389B1 (pt) | 2018-02-14 |
JP2008526217A (ja) | 2008-07-24 |
US20080113419A1 (en) | 2008-05-15 |
CN101103118B (zh) | 2012-04-18 |
BRPI0606389A2 (pt) | 2011-08-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2363094T3 (es) | Proceso para la producción de ésteres alquílicos de ácidos grasos a partir de triglicéridos y alcoholes que utilizan una combinación de dos enzimas lipolíticas. | |
Monteiro et al. | Liquid lipase preparations designed for industrial production of biodiesel. Is it really an optimal solution? | |
Moazeni et al. | Enzymatic transesterification for biodiesel production from used cooking oil, a review | |
US8012724B2 (en) | Production of degummed fatty acid alkyl esters using both lipase and phospholipase in a reaction mixture | |
Shi et al. | Prospects for microbial biodiesel production | |
Adamczak et al. | The application of biotechnological methods for the synthesis of biodiesel | |
Akoh et al. | Enzymatic approach to biodiesel production | |
Röttig et al. | Fatty acid alkyl esters: perspectives for production of alternative biofuels | |
Fjerbaek et al. | A review of the current state of biodiesel production using enzymatic transesterification | |
Mounguengui et al. | Are plant lipases a promising alternative to catalyze transesterification for biodiesel production? | |
Surendhiran et al. | Biodiesel production from marine microalga Chlorella salina using whole cell yeast immobilized on sugarcane bagasse | |
Haas et al. | Enzymatic approaches to the production of biodiesel fuels | |
CN101270375B (zh) | 叔丁醇体系中酶法制备1,3-甘油二酯的工艺 | |
US20130252291A1 (en) | Processing Of Oils and Fats | |
Chakraborty et al. | Enzymatic biodiesel production | |
US11987832B2 (en) | Endogenous lipase for metal reduction in distillers corn oil | |
WO2023209070A1 (en) | Production of fatty acid alkyl esters | |
Yan | Progress in Lipases, Its Immobilization and Application in Biodiesel Preparation with Emphasis on Our Practice | |
BRPI0611892B1 (pt) | A method for producing fatty acid alkyl esters of reduced phosphorus content by the combined transesterification and degumming | |
WO2023222648A2 (en) | Process for reducing free fatty acids |