ES2360403T3 - Conjugado citotóxico específico para el antígeno ca6 y métodos para usar el mismo. - Google Patents

Conjugado citotóxico específico para el antígeno ca6 y métodos para usar el mismo. Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo humanizado o fragmento de unión a epítopo del mismo que comprende al menos una región variable de cadena pesada al menos un 98% idéntica a una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 10 ó 11 y al menos una región variable de cadena ligera al menos un 98% idéntica a una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 8, en el que dicha al menos una región variable de cadena pesada o fragmento de la misma comprende tres regiones determinantes de complementariedad secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos representadas por las SEC ID Nº: 1, 21 y 3, respectivamente y en el que dicha al menos una región variable de cadena ligera o fragmento de la misma comprende tres regiones determinantes de complementariedad secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos representadas por las SEC ID Nº: 4, 5 y 6 respectivamente.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal murino anti-glucótopo CA6, y versioneshumanizadas o revestidas del mismo. La presente invención también se refiere a fragmentos de unión a epítopo delanticuerpo monoclonal anti-glucótopo CA6, así como a fragmentos de unión a epítopo de versiones humanizadas y revestidas del anticuerpo monoclonal anti-glucótopo CA6.
[0002] La presente invención se refiere adicionalmente a conjugados citotóxicos que comprenden un agente deunión celular y un agente citotóxico, composiciones terapéuticas que comprenden el conjugado, métodos para usarlos conjugados en la inhibición del crecimiento celular y el tratamiento de enfermedades, y un kit que comprende elconjugado citotóxico. En particular, el agente de unión celular es un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a epítopo del mismo, que reconoce y se une al glucótopo CA6 o una versión humanizada o revestida del mismo.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0003] Ha habido numerosos intentos por desarrollar agentes terapéuticos anti-cáncer que destruyan específicamente células cancerosas diana sin dañar las células y el tejido no cancerosas adyacente. Dichos agentesterapéuticos tienen el potencial de mejorar enormemente el tratamiento del cáncer en pacientes humanos.
[0004] Un enfoque prometedor ha sido unir agentes de unión celular, tales como anticuerpos monoclonales, confármacos citotóxicos (Sela et al., en Immunoconjugates 189-216 (C. Vogel, ed. 1987); Ghose et al., en Targeted Drugs 1-22 (E. Goldberg, ed. 1983); Diener et al., en Antibody mediated delivery systems 1-23 (J. Rodwell, ed.1988); Pietersz et al., en Antibody mediated delivery systems 25-53 (J. Rodwell, ed. 1988); Bumol et al., en Antibodymediated delivery systems 55-79 (J. Rodwell, ed. 1988). Dependiendo de la selección del agente de unión celular,estos conjugados citotóxicos pueden diseñarse para que reconozcan y se unan solamente a tipos específicos decélulas cancerosas, en base al perfil de expresión de moléculas expresadas sobre la superficie de dichas células.
[0005] Se han usado fármacos citotóxicos tales como metotrexato, daunorrubicina, doxorrubicina, vincristina, vinblastina, melfalán, mitomicina C, y clorambucil en dichos conjugados citotóxicos, unidos a una diversidad deanticuerpos monoclonales mirinos. En algunos casos, las moléculas de fármacos se unieron a las moléculas deanticuerpo a través de una molécula vehículo intermediaria tal como albúmina sérica (Garnett et al., 46 Cancer Res. 2407-2412 (1986); Ohkawa et al., 23 Cancer Immunol. Immunother. 81-86 (1986); Endo et al., 47 Cancer Res. 10761080 (1980)), dextrano (Hurwitz et al., 2 Appl. Biochem. 25-35 (1980); Manabi et al, 34 Biochem. Pharmacol. 289291 (1985); Dillman et al., 46 Cancer Res. 4886-4891 (1986); Shoval et al., 85 Proc. Natl. Acad. Sci. 8276-8280(1988)), o ácido poliglutámico (Tsukada et al., 73 J. Natl. Canc. Inst. 721-729(1984); Kato et al., 27 J. Med. Chem.1602-1607 (1984); Tsukada et al., 52 Br. J. Cancer 111-116 (1985)).
[0006] Como ejemplo de un conjugado específico que se ha mostrado algo prometedor, está el conjugado delanticuerpo C242, dirigido contra CanAg, un antígeno expresado en tumores colorrectales y pancreáticos, y elderivado de maitansina DM1 (Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA, 93: 8618-8623 (1996)). La evaluación in vitro de este conjugado indicó que su afinidad de unión hacia CanAg expresada sobre la superficie celular era elevada con un valor de Kd aparente de 3 x 10-11 M, y su potencia citotóxica para células CanAg positivas era elevada con una IC50 de 6 x 10-11 M. Esta citotoxicidad era dependiente de antígeno ya que se bloqueaba por un exceso de anticuerpo no conjugado, y ya que las células negativas para el antígeno eran más de 100 veces menos sensibles alconjugado. Otros ejemplos de conjugados de anticuerpo-DM1 tanto con alta afinidad por células diana respectivas y alta citotoxicidad selectiva de antígeno incluyen los de huN901, una versión humanizada de un anticuerpo contra CD56 humano; huMy9-6, una versión humanizada de un anticuerpo contra CD33 humana; huC242, una versiónhumanizada de un anticuerpo contra el epítopo CanAg Muc1; huJ591, un anticuerpo desinmunizado contra PSMA;trastuzumab, un anticuerpo humanizado contra Her2/neu; y bivatuzumab, un anticuerpo humanizado contra CD44v6.
[0007] El desarrollo de conjugados citotóxicos adicionales que reconozcan específicamente tipos particulares de células cancerosas será importante en la mejora continuada de los métodos usados para tratar a pacientes concáncer.
[0008] Para ese fin, la presente invención se refiere al desarrollo de anticuerpos que reconozcan y se unan amoléculas/receptores expresados sobre la superficie de células cancerosas, y al desarrollo de nuevos conjugados citotóxicos que comprendan agentes de unión celular, tales como anticuerpos, y agentes citotóxicos que se dirijanespecíficamente a las moléculas/receptores expresados sobre la superficie de células cancerosas.
[0009] Más específicamente, la presente invención se refiere a la caracterización de un nuevo sialoglucótopo CA6 en el receptor de mucina Muc1 expresado por células cancerosas, y a la provisión de anticuerpos, preferiblemente anticuerpos humanizados, que reconozcan el nuevo sialoglucótopo CA6 de la mucina Muc1 y quepuedan usarse para inhibir el crecimiento de una célula que expresa el glucótopo CA6 en el contexto de un agentecitotóxico.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
[0010] La presente invención proporciona anticuerpos humanizados que reconocen específicamente y se unen aun nuevo sialoglucótopo CA6 del receptor de mucina Muc1, o un fragmento de unión a epítopo del mismo. En otrarealización, la presente invención incluye un anticuerpo humanizado, o un fragmento de unión a epítopo del mismo,que reconoce el nuevo sialoglucótopo CA6 ("el glucótopo CA6") del receptor de mucina Muc1. En un primer aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo humanizado de acuerdo con la reivindicación 1.
[0011] La invención se refiere a versiones revestidas o humanizadas del anticuerpo monoclonal murino anti-CA6,DS6 donde los restos expuestos en superficie del anticuerpo, o sus fragmentos de unión a epítopo, estánreemplazados tanto en la cadena ligera como en la cadena pesada para parecerse mucho más a las superficies deanticuerpos humanos conocidos. Los anticuerpos humanizados y los fragmentos de unión a epítopo de los mismos5 de la presente invención tienen propiedades mejoradas ya que son mucho menos inmunogénicos (o completamente no inmunogénicos) en sujetos humanos a los que se administran que las versiones completamente murina. Portanto, los anticuerpos DS6 humanizados y los fragmentos de unión a epítopo de los mismos de la presente invenciónreconocen específicamente un nuevo sialoglucótopo en el receptor de mucina Muc1, es decir, el glucótopo CA6, mientras que no son inmunogénicos para un ser humano. Los anticuerpos humanizados y los fragmentos de unión a
10 epítopo de los mismos pueden conjugarse con un fármaco, tal como un maitansinóide, para formar un profármaco que tenga citotoxicidad específica hacia células que expresan el antígeno dirigiendo el fármaco al sialoglucótopo CA6 Muc1. Los conjugados citotóxicos que comprenden dichos anticuerpos y fármacos pequeños, altamente tóxicos (por ejemplo, maitansinóides, taxanos, y análogos de CC-1065) por tanto pueden usarse como agente terapéuticopara el tratamiento de tumores, tales como tumores de mama y ovario.
15 [0012] Las versiones humanizadas del anticuerpo DS6 de la presente invención se caracterizan completamenteen este documento con respecto a sus secuencias de aminoácidos respectivas de las regiones variables tanto de lacadena ligera como de la cadena pesada, las secuencias de ADN de los genes de las regiones variables de cadenaligera y cadena pesada, la identificación de las CDR, la identificación de sus aminoácidos de superficie, y
20 descripción de un medio para su expresión en forma recombinante.
[0013] El anticuerpo DS6 humanizado o un fragmento de unión a epítopo del mismo tiene una cadena pesadaque incluye las CDR que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC ID Nº: 1, 21 y 3.
25 S Y N M H (SEC ID Nº: 1), Y I Y P O N G A T N (SEC ID Nº: 21) G D S V P F A Y (SEC ID Nº: 3),
y que tiene una cadena ligera que comprende las CDR que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por30 las SEC ID Nº: 4-6:
S A H S S V SF M H (SEC ID Nº: 4), S T S S L A S (SEC ID Nº: 5), Q Q R S S F P L T (SEC ID Nº: 6).
35 [0014] Los anticuerpos DS6 humanizados y los fragmentos de unión a epítopo de los mismos también tiene una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que comparte una identidad de secuencia de al menos el 98% con una secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 8:
40 EIVLTQSPATMSASPGERVTITCSAHSSVSFMHWFQQKPGTSPKLWIYS
TSSLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQRSSFPLTFG
AGTKLELKR (SEC ID Nº:8).
45 [0015] Así mismo, los anticuerpos DS6 humanizados y fragmentos de unión a epítopo de los mismos tienen una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que comparte una identidad de secuencia de al menos el 98% con una secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 10 o SEC ID Nº:
11:
50
QAQLQVSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLE
WIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVY
55 FCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA (SEC ID Nº:10)
QAQLQVSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLE
WIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADPSSSTAYMQISSLTSEDSAVY
60
FCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA (SEC ID Nº: 11).
[0016] En otra realización, se proporcionan anticuerpos DS6 humanizados y fragmentos de unión a epítopo delos mismos que tienen una región variable de cadena ligera humanizada o revestida que tiene una secuencia de
65 aminoácidos correspondiente a la SEC ID Nº: 8:
EIVLTQSPATMSASPGERVTITCSAHSSVSFMHWFQQKPGTSPKLWIYS
TSSLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQRSSFPLTFG
70
AGTKLELKR. (SEC ID Nº: 8).
[0017] Así mismo, se proporcionan anticuerpos DS6 humanizados y fragmentos de unión a epítopo de los mismos que tienen una región variable de cadena pesada humanizada o revestida que tiene una secuencia de
75 aminoácidos correspondiente a las SEC ID Nº: 10 ó la SEC ID Nº: 11, respectivamente:
QAQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLE
WIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVY
5 FCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA (SEC ID Nº: 10).
QAQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLE
WIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADPSSSTAYMQISSLTSEDSAVY
10
FCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA (SEC ID Nº: 11).
[0018] Los anticuerpos DS6 humanizados y fragmentos de unión a epítopo de los mismos de la presente
invención también pueden incluir la sustitución en restos de aminoácidos de la cadena ligera y/o pesada en una o
15 más posiciones definidas por los restos con un asterisco en la Taba 1 que representan los restos flanqueantes superficiales murinos encontrados en 5 Ángstrom de una CDR que requiere cambio a un resto humano. Por ejemplo,el primer resto aminoacídico Q en la secuencia murina (SEC ID Nº: 7) se ha reemplazado por E (SEC ID Nº: 8) para humanizar el anticuerpo. Sin embargo, a causa de la proximidad de este resto a una CDR, una retromutación alresto murino Q puede ser necesaria para mantener la afinidad del anticuerpo.
20
Tabla 1
Restos flanqueantes de muDS6 próximos a una CDR (numeración de Kabat)
Cadena ligera
Cadena pesada
Q1*
Q1
V3
K64*
T5
P73*
P40
S74
G57
A60
S67
E81
[0019] Adicionalmente se muestra en la Tabla 2 los restos superficiales de la región variable de muDS6 alineados con los tres restos superficiales de la región variable humana más homólogos. Los restos aminoacídicos25 de la Tabla 1 corresponden a los restos aminoacídicos subrayados de la Tabla 2.
Tabla 2
Las 3 primeras superficies de anticuerpo humano más homólogas
Anticuerpo
Cadena ligera SEC ID Nº:
muDS6
Q V T A I P K P G G A S R E K E V T A T P R P G G A S S E K E V T G T P R P G G D S R E K E V T G T P R P G G D S R E K SEC ID Nº: 12 SEC ID Nº: 13 SEC ID Nº: 14 SEC ID Nº: 15
28E4
HAZcPB
SSaPB
Anticuerpo
Cadena pesada SEC ID Nº:
muDS6
Q Y Q A L R S K K P G Q Q K K G P S S S E Q S Q Q V A V K P K K P G Q Q K Q G T S S S E Q S - Q V A V K P K K P G Q Q K Q G E S S S E Q S - Q V A V K P K K P G Q Q K Q G E S S S E Q S SEC ID Nº:16 SEC ID Nº:17 SEC ID Nº:18 SEC ID Nº:19
28E4
HAZcPB
SSaPB
[0020] La presente invención proporciona adicionalmente conjugados citotóxicos que comprenden (1) un agente
30 de unión celular que reconoce y se une al glucótopo CA6, y (2) un agente citotóxico. En los conjugados citotóxicos, el agente de unión celular tiene una elevada afinidad por el glucótopo CA6 y el agente citotóxico tiene un elevado grado de citotoxicidad para células que expresan el glucótopo CA6, de modo que los conjugados citotóxicos de lapresente invención forman agentes de eliminación eficaces.
35 [0021] El agente de unión celular es el anticuerpo humanizado anti-CA6 o un fragmento de unión a epítopo del mismo de las reivindicaciones 1-3, donde está unido covalentemente un agente citotóxico, directamente o medianteun enlazador escindible o no escindible, al anticuerpo o fragmento de unión a epítopo del mismo. En realizacionesmás preferidas, el agente de unión celular es el anticuerpo humanizado de las reivindicaciones 1-3, y el agente citotóxico es un taxol, un maitansinóide, CC-1065 o un análogo de CC-1065.
40 [0022] En realizaciones preferidas de la invención, el agente de unión celular es el anticuerpo humanizado de lasreivindicaciones 1-3 y el agente citotóxico es un fármaco citotóxico tal como un maitansinóide o un taxano.
[0023] Más preferiblemente, el agente de unión celular es el anticuerpo humanizado de las reivindicaciones 1-3 y 45 el agente citotóxico es un compuesto de maitansina, tal como DM1 o DM4.
[0024] La presente invención también incluye un método in vitro para inhibir el crecimiento de una célula queexpresa el glucótopo CA6 de acuerdo con la reivindicación 52. El método para inhibir el crecimiento de la célula queexpresa el glucótopo CA6 provoca la muerte de la célula.
50 [0025] La presente invención también proporciona una composición terapéutica que comprende el conjugado citotóxico, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
[0026] La presente invención incluye adicionalmente composiciones terapéuticas para su uso en la fabricaciónde medicamentos para tratar el cáncer. El conjugado citotóxico comprende el anticuerpo humanizado de la reivindicaciones 1-9 y un agente citotóxico. En realizaciones más preferidas, el conjugado citotóxico comprende unconjugado de anticuerpo humanizado DS6-DM1, anticuerpo humanizado DS6-DM4 o un conjugado de anticuerpohumanizado DS6-taxano donde el anticuerpo humanizado DS6 es el anticuerpo de las reivindicaciones 1-3, y el conjugado se administra junto con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
[0027] La presente invención también incluye un kit que comprende un conjugado de anticuerpo humanizadoanti-CA-agente citotóxico e instrucciones para su uso. El anticuerpo humanizado anti-CA6 es el anticuerpo
10 humanizado DS6 de las reivindicaciones 1-3, el agente citotóxico es un compuesto de maitansina, tal como DM1 o DM4, o un taxano, y las instrucciones son para usar los conjugados en el tratamiento de un sujeto que tiene cáncer.El kit también puede incluir componentes necesarios para la preparación de una formulación farmacéuticamenteaceptable, tal como un diluyente si el conjugado está en estado liofilizado o en forma concentrada, y para administración de la formulación.
15 [0028] La presente invención también incluye derivados de anticuerpos que se unen específicamente yreconocen el glucótopo CA6. En realizaciones preferidas, los derivados de anticuerpos se preparan revistiendo ohumanizando anticuerpos que se unen al glucótopo CA6, donde los derivados tienen inmunogenicidad disminuidahacia el hospedador.
20 [0029] La presente invención proporciona adicionalmente anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismosque están adicionalmente marcados para su uso en investigación o aplicaciones de diagnóstico. En realizacionespreferidas, el marcador es un radiomarcador, un fluoróforo, un cromóforo, un agente de formación de imágenes o unión metálico.
25 [0030] Un método para el diagnóstico del cáncer puede comprender el uso de dichos anticuerpos humanizadosmarcados o fragmentos de unión a epítopo de los mismos, administrados a un sujeto que se sospecha que tienecáncer, donde la distribución del marcador dentro del cuerpo del sujeto se mide o controla.
30 [0031] La presente invención también proporciona composiciones terapéuticas o farmacéuticas y medicamentos para tratar el cáncer, donde dichas composiciones o medicamentos pueden administrarse, solos o en combinacióncon otros agentes citotóxicos o terapéuticos, comprendiendo dichas composiciones o medicamentos el conjugado deanticuerpo humanizado de esta invención. El cáncer puede ser uno o más de, por ejemplo, cáncer de mama, cáncerde colon, carcinoma de ovario, cáncer endometrial, osteosarcoma, cáncer cervical, cáncer de próstata, cáncer
35 pulmonar, carcinoma sinovial, cáncer pancreático, un sarcoma o un carcinoma en el que se exprese CA6 u otro cáncer aún por determinar en el que se exprese predominantemente el glucótopo CA6.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
40 [0032] La Figura 1 muestra los resultados de estudios realizados para determinar la capacidad del anticuerpo DS6 de unirse a la superficie de líneas celulares cancerosas seleccionadas. Se midió la fluorescencia de líneascelulares incubadas con el anticuerpo primario DS6 y anticuerpos secundarios anti-IgG(H+L) de ratón conjugadoscon FITC por citometría de flujo. El anticuerpo DS6 se unía a células Caov-3 (Figura 1A) y T-47D (Figura 1B) conuna Kd aparente de 1,848 nM y 2,586 nM respectivamente. Las líneas celulares negativas a antígeno, SK-OV-3
45 (Figura 1C) y Colo205 (Figura 1D) no mostraron unión específica de antígeno.
[0033] La Figura 2 muestra los resultados de un análisis dot blot de la expresión de epítopos. Los lisadoscelulares Caov-3 (Figura 2A y Figura 2B), SKMEL28 (Figura 2C), y Colo205 (Figura 2D) se transfirieron individualmente en manchas sobre membranas de nitrocelulosa y después se incubaron individualmente con
50 pronasa, proteinasa K, neuraminidasa o ácido peryódico. Las membranas después se inmunotransfirieron con el anticuerpo DS6 (Figura 2A), el anticuerpo CM1 (Figura 2B), el anticuerpo R24 (Figura 2C), o el anticuerpo C242(Figura 2D).
[0034] La Figura 3 muestra los resultados de un análisis dot blot de la expresión de antígenos DS6. Los lisados
55 celulares Caov-3 se transfirieron individualmente en manchas en membranas de PVDF y después se incubaron en presencia de ácido trifluorometanosulfónico (TFMSA). Las membranas después se inmunotransfirieron con elanticuerpo CM1 (1 y 2) y el anticuerpo DS6 (3 y 4).
[0035] La Figura 4 muestra los resultados del análisis de glucótopos del antígeno DS6. Los lisados Caov-3
60 pretratados con N-glucanasa ("N-gly"), O-glucanasa ("O-gly"), y/o sialidasa ("S") se transfirieron en manchas sobre nitrocelulosa y después se inmunotransfirieron con el anticuerpo DS6 o el anticuerpo CM1 (Muc-1 VNTR).
[0036] La Figura 5 muestra los resultados del análisis de transferencia de western del antígeno DS6. Los lisadoscelulares se inmunoprecipitaron ("IP") y se inmunotransfirieron con el anticuerpo DS6. El anticuerpo corresponde a
65 una banda de proteína de >250 kDa observada en células Caov-3 (Figura 5A y Figura 5B) y T47D (Figura 5C) positivas al antígeno. Las líneas celulares SK-OV-3 (Figura 5D) y Colo205 (Figura 5E) negativas al antígeno nomuestran esta banda. Después de la inmunoprecipitación, se incubaron perlas de proteína G de los lisados celularesCaov-3 con (Figura 5A) neuraminidasa ("N") o (Figura 5B) ácido peryódico ("PA"). Se procesaron controles deanticuerpo ("a"), de lisado pre-IP ("Lis") y flujo post-IP ("FT") en el mismo gel. Los inmunoprecipitados Caov-3
70 también se incubaron con N-glucanasa ("N-gly"), O-glucanasa ("O-gly"), y/o sialidasa ("S") (véase Figura 5F), donde la mancha de transferencia se sondeó alternativamente con DS6 biotinilado y estreptavidina-HRP.
[0037] La Figura 6 muestra los resultados de inmunoprecipitaciones y/o inmunotransferencias del anticuerpoDS6 y el anticuerpo CM1 sobre lisados celulares Caov-3 (Figura 6A) y HeLa (Figura 6B). Las señales de
75 transferencia de western de CM1 y DS6 solapantes significan que el antígeno DS6 está en la proteína Muc1. En lisados HeLa, el doblete Muc1 es el resultado de la expresión Muc1 dirigida por alelos distintos que difieren en sucantidad de repeticiones en tándem.
[0038] La Figura 7 muestra un diseño ELISA tipo sándwich de anticuerpo DS6 (Figura 7A) y una curva patrón5 (Figura 7B). La curva patrón se generó usando concentraciones conocidas de patrones CA15-3 disponibles en el mercado (donde 1 unidad de CA15-3 = 1 unidad de DS6).
[0039] La Figura 8 muestra curvas patrón de ELISA cuantitativa. Las curvas patrón de la señal del anticuerpo de detección (estreptavidina-HRP / biotina-DS6) (Figura 8C) se determinaron usando concentraciones conocidas de
10 biotina-DS6 capturado por anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón sembrado en placas (Figura 8A) o unido directamente en la placa ELISA (Figura 8B).
[0040] La Figura 9 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera(Figura 9A) y la cadena pesada (Figura 9B) para el anticuerpo DS6 murino. Las tres CDR en cada secuencia están
15 subrayadas (definiciones de Kabat).
[0041] La Figura 10 muestra las CDR de cadena ligera (Figura 10A) y pesada (Figura 10B) del anticuerpo DS6murino determinadas por definiciones de Kabat. El software de modelado AbM produce una definición ligeramentediferente para las CDR de cadena pesada (Figura 10C).
20 [0042] La Figura 11 muestra las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera ("muDS6LC") (restos 1-95 de laSEC ID Nº:7) y la cadena pesada (muDS6HC") (restos 1-98 de la SEC ID Nº:9) para el anticuerpo DS6 murinoalineadas con las secuencias de la línea germinal para los genes IgV?ap4 (SEC ID Nº:23) y IgVh J558.41 (SEC IDNº:24). El gris indica divergencia de secuencia.
25 [0043] La Figura 12 muestra las diez secuencias de anticuerpo de cadena ligera y de cadena pesada máshomólogas con las secuencias de DS6 murino (muDS6) de cadena ligera ("muDS6LC") y cadena pesada ("muDS6HC") que tienen archivos de estructura resuelta en la base de datos de Brookhaven. Las secuencias están alineadas en orden de más a menos homólogas.
30 [0044] La Figura 13 muestra los datos de accesibilidad de superficie y los cálculos para predecir qué restos flanqueantes de la región variable de cadena ligera del anticuerpo DS6 murino son accesibles en la superficie. Lasposiciones con una accesibilidad superficial promedio del 25-35% están marcadas (*??*) y se sometieron a lasegunda ronda de análisis. Región variable de cadena ligera del anticuerpo DS6 (Figura 13A) y región variable de
35 cadena pesada (Figura 13B).
[0045] La Figura 14 muestra el mapa del plásmido de expresión de mamíferos prDS6 v1.0. Este plásmido se usópara construir y expresar los anticuerpos DS6 recombinantes quiméricos y humanizados.
40 [0046] La Figura 15 muestra las secuencias de aminoácidos de dominios variables de cadena ligera (Figura 15A) y cadena pesada (Figura 15B) del anticuerpo DS6 murino ("muDS6") y humanizado ("huDS6") (v1.0 y v1.2).
[0047] La Figura 16 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la región variable de cadena ligera para el anticuerpo DS6 humanizado ("huDS6") (v1.0 y v1.2).
45 [0048] La Figura 17 muestra las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la región variable de cadena pesadapara el anticuerpo DS6 humanizado ("huDS6") v1.0 (Figura 17A) y v1.2 (Figura 17B).
[0049] La Figura 18 muestra las curvas de unión por citometría de flujo de los clones muDS6 y huDS6 a partir de
50 un ensayo realizado en células WISH. Las afinidades de unión de los clones DS6 (Figura 18A) humanos quimérico, v1.0, y v1.2 (Kd = 3,15, 3,71, y 4,20 nM, respectivamente) son comparables con DS6 murino (Figura 18B) desnudo y biotinilado (Kd = 1,93 y 2,80 nM, respectivamente).
[0050] La Figura 19 muestra los resultados de un ensayo de unión competitiva de anticuerpos huDS6 con
55 muDS6. (Figura 19A) se incubaron células WISH con biotina-muDS6 y estreptavidina-DTAF produciendo una curva de unión con una Kd aparente de 6,76 nM. (Figura 19B) se combinaron concentraciones variables de muDS6desnudo, huDS6 v1.0 y v1.2 con 2 nM de biotina-muDS6 y estreptavidina-DTAF secundario.
[0051] La Figura 20 muestra los resultados de una determinación de la afinidad de unión de anticuerpos DS6 no
60 conjugados frente a un conjugado de anticuerpos DS6-DM1. Los resultados demostraron que la conjugación con DM1 no afectaba de forma adversa a la afinidad de unión al anticuerpo. La Kd aparente del conjugado anticuerpoDS6-DM1 (3,902 nM) ("DS6-DM1") era ligeramente mayor que el anticuerpo desnudo (2,020 nM) ("DS6").
[0052] La Figura 21 muestra los resultados de un ensayo de viabilidad celular indirecta usando el anticuerpo DS6
65 en presencia o ausencia del conjugado DM1 anti-IgG (H+L) de ratón (2°Ab-DM1). Las células Caov-3 positivas a antígeno se eliminaron de un modo dependiente de anticuerpo DS6 (IC50 = 424,9 pM) solamente en presencia del conjugado secundario ("DS6 + 2°Ab-DM1").
[0053] La Figura 22 muestra los resultados de un ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)
70 del anticuerpo DS6 y el anticuerpo DS6 humanizado. Los resultados demostraron que no había efecto mediado por CDC del anticuerpo DS6 o el anticuerpo DS6 humanizado (v1.0 y v1.2) sobre células HPAC (Figura 22A) y ZR-75-1(Figura 22B).
[0054] La Figura 23 muestra los resultados de un ensayo de citotoxicidad in vitro de un conjugado anticuerpo
75 DS6-DM1 frente a maitansina libre. En un ensayo clonogénico, se ensayaron líneas celulares de cáncer de ovario (Figura 23A), mama (Figura 23B), cervical (Figura 23C), y pancreático (Figura 23D) positivas al antígeno DS6 para la
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75
citotoxicidad de exposición continua a un conjugado anticuerpo DS6-DM1 (paneles de la izquierda). Estas líneascelulares se ensayaron de forma similar para la sensibilidad a maitansina por una exposición de 72 horas amaitansina libre (paneles de la derecha). Las líneas celulares de cáncer de ovario ensayadas eran OVCAR5, TOV21G, Caov-4 y Caov-3. Las líneas celulares de cáncer de mama ensayadas fueron T47D, BT-20 y BT-483. Laslíneas celulares de cáncer cervical fueron KB, HeLa y WISH. Las líneas celulares de cáncer pancreático ensayadas fueron HPAC, Hs766T y HPAF-II.
[0055] La Figura 24 muestra los resultados de un ensayo de citotoxicidad in vitro de un conjugado anticuerpoDS6-DM1. En un ensayo de viabilidad celular con MTT, se eliminaron células cancerosas de ovario (Figura 24A,Figura 24B y Figura 24C), mama (Figura 24D y Figura 24E), cervical (Figura 24F y Figura 24G), y pancreático (Figura 24H y Figura 24I) humanas de un modo dependiente del conjugado anticuerpo DS6-DM1. DS6 desnudo noafectaba de forma adversa al crecimiento de estas células, lo que indica que la conjugación con DM1 es necesariapara la citotoxicidad.
[0056] La Figura 25A muestra los resultados de un estudio de eficacia antitumoral in vivo de un conjugado anticuerpo DS6-DM1 sobre senoinjertos de tumor KB subcutáneos establecidos. Las células tumorales se inocularonen el día 0, y el primer tratamiento se dio en el día 6. Los tratamientos con inmunoconjugado continuaron diariamente durante un total de 5 dosis. Los animales de control con PBS se sacrificaron con eutanasia una vez quelos volúmenes de los tumores excedieron de 1500 mm3. El conjugado se dio a una dosis de 150 o 225 µg/kg deDM1, que corresponde a concentraciones de anticuerpo de 5,7 y 8,5 mg/kg respectivamente. Los pesos corporales (Figura 25B) de los ratones se controlaron durante el transcurso del estudio.
[0057] La Figura 26 muestra los resultados de un estudio de eficacia antitumoral de un conjugado anticuerpoDS6-DM1 sobre senoinjertos de tumor subcutáneo establecidos. Se inocularon células OVCAR5 (Figura 26A y Figura 26B), TOV-21G (Figura 26C y Figura 26D), HPAC (Figura 26E y Figura 26F), y HeLa (Figura 26G y Figura 26H) en el día 0, y los tratamientos con inmunoconjugados se dieron en los días 6 y 13. Los animales de control conPBS se sacrificaron por eutanasia una vez que los volúmenes de los tumores excedieron de 1000 mm³. El conjugado se dio a una dosis de 600 µg/kg de DM1, que corresponde a una concentración de anticuerpo de 27,7 mg/kg. El volumen del tumor (Figura 26A, Figura 26C, Figura 26E, y Figura 26G) y el peso corporal (Figura 26B,Figura 26D, Figura 26F, y Figura 26H) de los ratones se controlaron durante el transcurso del estudio.
[0058] La Figura 27 muestra los resultados de un estudio de eficacia in vivo de un conjugado anticuerpo DS6DM1 sobre tumores OVCAR5 intraperitoneales. Las células tumorales se inyectaron por vía intraperitoneal en el día0, y los tratamientos con inmunoconjugados se dieron en los días 6 y 13. Los animales se sacrificaron por eutanasia una vez que la pérdida de peso corporal excedió del 20%.
[0059] La Figura 28 muestra la curva de unión por citometría de flujo a partir de un estudio de la afinidad de unión de anticuerpo DS6 desnudo y conjugado con taxano sobre células HeLa. La conjugación con taxano (MM1202) no afecta de forma adversa a la afinidad de unión del anticuerpo. La Kd aparente del conjugado DS6-MM1-202(1,24 nM) era ligeramente mayor que la del anticuerpo DS6 desnudo (620 pM).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0060] La presente invención proporciona, entre otras características, anticuerpos humanizados anti-CA6 y fragmentos de unión a epítopo de los mismos de acuerdo con la reivindicación 1. Cada uno de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la presente invención están diseñados para reconocer específicamente y unirse alglucótopo CA6 sobre la superficie de una célula. Se sabe que CA6 se expresa en muchos tumores humanos: el 95%de los carcinomas serosos de ovario, el 50% de los carcinomas endometrioides de ovario, el 50% de los neoplasmasdel cuello del útero, el 69% de los neoplasmas del endometrio, el 80% de los neoplasmas de la vulva, el 60% de loscarcinomas de mama, el 67% de los tumores pancráticos, y el 48% de los tumores del urotelio, pero raramente se expresa en tejido humano normal.
[0061] Un informe de Kearse et al., Int. J. Cancer 88(6):866-872 (2000) identificaba mal la proteína en la que sehaya el epítopo CA6 como una proteína de 80 kDa que tenía un carbohidrato N-unido que contiene el epítopo CA6cuando usaban un sobrenadante de hibridoma para caracterizarlo. Usando DS6 purificado se ha demostrado que el epítopo CA6 se encuentra en un carbohidrato O-unido de una glucoproteína no unida por disulfuro de más de 250kDa. Además, la glucoproteína se identificó como la mucina, Muc1. Como diferentes alelos Muc1 tienen cantidadesvariables de repeticiones en tándem en el dominio de repetición en tándem de cantidad variable (VNTR) las célulasa menudo expresan dos proteínas Muc1 distintas de diferente tamaño (Taylor-Papadimitriou, Biochim. Biophys. Acta1455(2-3):301-13 (1999). A causa de las diferencias en la cantidad de repeticiones en el dominio VNTR así como las diferencias en la glucosilación, el peso molecular de Muc1 varía de una línea celular a otra.
[0062] La susceptibilidad de inmunorreactividad CA6 a ácido peryódico indica que CA6 es un epítopo de carbohidrato "glucótopo". La susceptibilidad adicional de inmunorreactividad CA6 al tratamiento con neuraminidasade Vibrio cholerae indica que el epítopo CA6 es un glucótopo dependiente de ácido siálico, por tanto un "sialoglucótopo".
[0063] Pueden encontrarse detalles de la caracterización de CA6 en el Ejemplo 2 (véase a continuación). Pueden encontrarse detalles adicionales sobre CA6 en el documento WO 02/16401; Wennerberg et al., Am. J. Pathol. 143(4):1050-1054 (1993); Smith et al., Human Anti-bodies 9:61-65 (1999); Kearse et al., Int. J. Cancer 88(6):866-872 (2000); Smith et al., Int. J. Gynecol. Pathol. 20(3): 260-6 (2001); y Smith et al., Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 10(2):152-8 (2002).
[0064] La presente invención también incluye conjugados citotóxicos que comprenden dos componentesprincipales. El primer componente es un agente de unión celular de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 que reconoce y se une al glucótopo CA6. El agente de unión celular debe reconocer el sialoglucótopo CA6 en Muc1 con
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75
un alto grado de especificidad de modo que los conjugados citotóxicos reconozcan y se unan solamente a lascélulas pretendidas. Un elevado grado de especificidad permitirá que los conjugados actúen de un modo dirigido conpocos efectos secundarios resultantes de unión no específica.
[0065] En otra realización, el agente de unión celular de la presente invención también reconoce el glucótopo CA6 con un elevado grado de afinidad de modo que los conjugados estarán en contacto con la célula diana duranteun periodo suficiente de tiempo para permitir que la parte de fármaco citotóxica del conjugado actúe sobre la célula, y/o para permitir a los conjugados tiempo suficiente para que se internalizen por la célula.
[0066] Los conjugados citotóxicos de esta invención comprenden un anticuerpo DS6 humanizado o un fragmento de unión a epítopo del mismo de acuerdo con las reivindicaciones 1-3. El anticuerpo DS6 es capaz de reconocerCA6 con un elevado grado de especificidad y dirige el agente citotóxico a una célula anormal o a un tejido tal comocélulas cancerosas, de un modo dirigido.
[0067] El segundo componente de los conjugados citotóxicos de la presente invención es un agente citotóxico. En realizaciones preferidas, el agente citotóxico es un taxol, un maitansinoide tal como DM1 o DM4, CC-1065 o unanálogo de CC-1065. En realizaciones preferidas, los agentes de unión celular de la presente invención están unidoscovalentemente, de forma directa o mediante un enlazador escindible o no escindible, al agente citotóxico.
[0068] Los agentes de unión celular, los agentes citotóxicos, y los enlazadores se analizan a continuación con más detalle.
Agentes de unión celular
[0069] La eficacia de los compuestos de la presente invención como agentes terapéuticos depende de la cuidadosa selección de un agente de unión celular apropiado. Los agentes de unión celular incluyen péptidos y nopéptidos. Los agentes de unión celular pueden ser cualquier compuesto que pueda unirse a una célula, ya sea de unmodo específico o no específico. Generalmente, éstos pueden ser anticuerpos (especialmente anticuerposmonoclonales), linfoquinas, hormonas, factores de crecimiento, vitaminas, moléculas de transporte de nutrientes(tales como transferrina), o cualquier otra molécula o sustancia de unión celular.
[0070] Ejemplos más específicos de agentes de unión celular incluyen:
(a)
anticuerpos policlonales;
(b)
anticuerpos monoclonales;
(c)
fragmentos de anticuerpos tales como Fab, Fab', y F(ab')2, Fv (Parham, J. Immunol. 131:2895-2902 (1983); Spring et al. J. Immunol. 113:470-478 (1974); Nisonoffet al. Arch. Biochem. Biophys. 89:230-244(1960));
(d)
interferonas (por ejemplo, .alfa., .beta., .gamma.);
(e)
linfoquinas tales como IL-2, IL-3, IL-4, IL-6;
(f)
hormonas tales como la insulina, TRH (hormona liberadora de tirotropina), MSH (hormona estimuladora de melanocitos), hormonas esteroides, tales como andrógenos y estrógenos;
(g)
factores de crecimiento y factores estimuladores de colonias tales como EGF, TGF-alfa, FGF, VEGF, GCSF, M-CSF y GM-CSF (Burgess, Immunology Today 5:155-158 (1984));
(h)
transferrina (O'Keefe et al. J. Biol. Chem. 260:932-937 (1985)); y
(i)
vitaminas, tales como folato.
Anticuerpos
[0071] Las técnicas de anticuerpos monoclonales permiten la producción de agentes de unión celular extremadamente específicos en forma de anticuerpos monoclonales específicos. Son particularmente bien conocidas en las técnicas para crear anticuerpos monoclonales producidos por inmunización de ratones, ratas, hámsteres, o cualquier otro mamífero con el antígeno de interés tales como los antígenos de las células diana intactos de la célula diana, el virus completo, virus completo atenuado, y proteínas virales tales como proteínas deenvuelta viral. También pueden usarse células humanas sensibilizadas. Otro método para crear anticuerposmonoclonales es el uso de bibliotecas de fagos de scFv (región variable de cadena sencilla), específicamente scFv de humano (véase, por ejemplo, Griffiths et al., patentes de Estados Unidos Nº 5.885.793 y 5.969.108; McCafferty etal., documento WO 92/01047; Liming et al., documento WO 99/06587).
[0072] Un anticuerpo típico está compuesto por dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticasque están unidas por puentes disulfuro. La región variable es una parte de las cadenas pesadas del anticuerpo y las cadenas ligeras que difieren en la secuencia entre anticuerpos y que coopera en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno. La variabilidad habitualmente no está distribuida uniformemente en todas lasregiones variables del anticuerpo. Está típicamente concentrada en tres segmentos de una región variable llamadosregiones determinantes de complementariedad (CDR) o regiones hipervariables, en las regiones variables tanto dela cadena ligera como de la cadena pesada. Las partes más altamente conservadas de las regiones variables se llaman regiones flanqueantes. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera comprenden cuatro regionesflanqueantes, que adoptan en gran medida una configuración de lámina-beta, con cada región flanqueanteconectada por las tres CDR, que forman bucles que conectan la estructura de lámina-beta, y en algunos casos que forman parte de la estructura de lámina-beta. Las CDR en cada cadena se mantiene en estrecha proximidad por lasregiones flanqueantes y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (E. A. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, 1991, NIH).
[0073] La región constante es una parte de la cadena pesada. Aunque no está implicada directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, muestra diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpo.
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[0074] El anticuerpo monoclonal DS6 murino se describe en la patente de Estados Unidos Nº 6.596.503 (númerode depósito en la ATCC PTA-4449).
Anticuerpos DS6 humanizados o revestidos
[0075] Un anticuerpo anti-CA6 humanizado se usa como agente de unión celular de la presente invención. Las realizaciones preferidas de dichos anticuerpos humanizados son las proporcionadas por las reivindicaciones 1-3(anticuerpo DS6 humanizado, o un fragmento de unión a epítopo del mismo).
[0076] El objetivo de la humanización es una reducción en la inmunogenicidad de un anticuerpo xenogénico, tal como un anticuerpo murino, para la introducción en un ser humano, manteniendo al mismo tiempo la afinidad deunión a antígeno completa y la especificidad del anticuerpo.
[0077] Los anticuerpos humanizados pueden producirse usando varias tecnologías tales como el revestimiento y el injerto de CDR. Como se usa en este documento, la tecnología de revestimiento usa una combinación de modelado molecular, análisis estadístico y mutagénesis para alterar las superficies no CDR de las regiones variablesdel anticuerpo para que se parezcan a las superficies de anticuerpos conocidos del hospedador diana.
[0078] Las estrategias y métodos para revestir los anticuerpos, y otros métodos para reducir la inmunogenicidadde los anticuerpos en un hospedador diferente, se describen en la patente de Estados Unidos 5.639.641 (Pedersen et al.).En resumen, en un método preferido, (1) se generan alineaciones de las posiciones de una combinación de regionesvariables de cadena pesada y ligera del anticuerpo para dar una serie de posiciones expuestas en la superficieflanqueantes de la región variables de cadena pesada y ligera donde las posiciones de alineación para todas lasregiones variables son al menos aproximadamente un 98% idénticas; (2) se define una serie de restos aminoacídicos expuestos en superficie flanqueantes de la región variable de cadena pesada y ligera para unanticuerpo de roedor (o fragmento del mismo); (3) se identifica una serie de restos aminoacídicos expuestos en superficie flanqueantes de la región variable de cadena pesada y ligera que es la más idéntica a la serie de restos aminoacídicos expuestos en superficie del roedor; (4) se sustituye la serie de restos aminoacídicos expuestos ensuperficie flanqueantes de la región variable de la cadena pesada y ligera definida en la etapa (2) con la serie de restos aminoacídicos expuestos en superficie flanqueantes de la región variable de cadena pesada y ligeraidentificada en la etapa (3), excepto para aquellos restos aminoacídicos que están a 5 Å de cualquier átomo decualquier resto de las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo de roedor; y (5) se produce elanticuerpo de roedor humanizado que tiene especificidad de unión.
[0079] Los anticuerpos pueden humanizarse usando una diversidad de otras técnicas incluyendo injerto de CDR(documento EP 0 239 400; documento WO 91/09967; patentes de Estados Unidos Nº 5.530.101; y 5.585.089),recubrimiento o revestimiento (documento EP 0 592 106; documento EP 0 519 596; Padlan E. A., 1991, MolecularImmunology 28(4/5):489-498; Studnicka G. M. et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; Roguska M.A. et al.,1994, PNAS 91:969-973), y arrastre de cadena (patente de Estados Unidos Nº 5.565.332). Los anticuerpos humanos pueden prepararse por una diversidad de métodos conocidos en la técnica incluyendo métodos de presentación enfagos. Véanse también las patentes de Estados Unidos Nº 4.444.887, 4.716.111, 5.545.806, y 5.814.318; y las publicaciones de solicitud de patente internacional Nº WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654,WO 96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741.
[0080] La presente invención proporciona anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos que reconocenun nuevo sialoglucótopo (el glucótopo CA6) en la mucina Muc1. En otra realización, los anticuerpos humanizados ofragmentos de unión a epítopo de los mismos tienen la capacidad adicional de inhibir el crecimiento de una célulaque expresa el glucótopo CA6.
[0081] La invención proporciona versiones revestidas o humanizadas del anticuerpo DS6 de acuerdo con lasreivindicaciones 1-3 donde los restos expuestos en superficie del anticuerpo o sus fragmentos están reemplazadostanto en la cadena ligera como en la cadena pesada para que se parezcan más a las superficies de anticuerpohumano conocidas. Los anticuerpos DS6 humanizados o fragmentos de unión a epítopo de los mismos de la presente invención tienen propiedades mejoradas. Por ejemplo, los anticuerpos DS6 humanizados o fragmentos de unión a epítopo de los mismos reconocen específicamente un nuevo sialoglucótopo (en glucótopo CA6) en lamucina Muc1. Más preferiblemente, los anticuerpos DS6 humanizados o fragmentos de unión a epítopo de losmismos tienen la capacidad adicional de inhibir el crecimiento de una célula que expresa el glucótopo CA6. Elanticuerpo humanizado o un fragmento de unión a epítopo del mismo puede conjugarse con un fármaco, tal como unmaitansinoide, para formar un profármaco que tenga citotoxicidad específica hacia las células que expresan el antígeno dirigiendo el fármaco al nuevo sialoglucótopo de Muc1, CA6. Los conjugados citotóxicos que comprendendichos anticuerpos y un fármaco pequeño, altamente tóxico (por ejemplo, maitansinoides, taxanos, y análogos deCC-1065) pueden usarse como medicamentos o para tratar tumores, tales como tumores de mama y ovario.
[0082] Las versiones humanizadas del anticuerpo DS6 también están completamente caracterizadas en este documento con respecto a sus secuencias respectivas de aminoácidos de las regiones variables tanto de cadenaligera como de cadena pesada, las secuencias de ADN de los genes para las regiones variables de cadena ligera y pesada, la identificación de las CDR, la identificación de sus aminoácidos de superficie, y la descripción de un mediopara su expresión en forma recombinante.
[0083] En una realización, se proporciona el anticuerpo humanizado o fragmento de unión a epítopo del mismo de la presente invención que tiene una cadena pesada que incluye las CDR que tienen las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC ID Nº: 1, 21 y 3
S Y N M H (SEC ID Nº: 1) Y I Y P G N G A T N (SEC ID Nº: 21)
G D S V P F A Y (SEC ID Nº: 3)
[0084] Cuando se determinan las CDR de cadena pesada por el software de modelado AbM se representan porlas SEC ID Nº: 20-22:
5
G Y T F T S YN M H (SEC ID Nº: 20) Y I Y P G N G A T N (SEC ID Nº: 21) G D S V P F A Y (SEC ID Nº: 22)
10 [0085] En la misma realización, el anticuerpo humanizado o fragmento de unión epítopo del mismo tiene una cadena ligera que comprende las CDR que tienen secuencias de aminoácidos representadas por las SEC ID Nº: 4-6:
S A H S S V SF M H (SEC ID Nº: 4) S T S S L A S (SEC ID Nº: 5)
15 Q Q R S S F P L T (SEC ID Nº: 6)
[0086] Los anticuerpos humanizados y fragmentos de unión a epítopo de los mismos también tienen una regiónvariable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que comparte una identidad de secuencia de almenos el 98% con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 8:
20
EIVLTQSPATMSASPGERVTITCSAHSSVSFMHWFQQKPGTSPKLWIYS
TSSLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQRSSFPLTFG
25 AGTKLELKR. (SEC ID Nº: 8)
[0087] Los anticuerpos humanizados y fragmentos de unión a epítopo de los mismos tienen una región variablede cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que comparte una identidad de secuencia de al menosel 98% con una secuencia de aminoácido representada por la SEC ID Nº: 10 ó la SEC ID Nº: 11:
30
QAQLQVSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLE
WIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVY
35 FCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA. (SEC ID Nº: 10)
QAQLQVSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLE
WIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADPSSSTAYMQISSLTSEDSAVY
40
FCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA. (SEC ID Nº: 11)
[0088] En otra realización, se proporcionan anticuerpos humanizados y fragmentos de unión a epítopo de losmismos que tienen una región variable de cadena ligera humanizada o revestida que tiene una secuencia de
45 aminoácidos correspondiente a la SEC ID Nº: 8
EIVLTQSPATMSASPGERVTITCSAHSSVSFMHWFQQKPGTSPKLWIYS
TSSLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQRSSFPLTFG
50
AGTKLELKR. (SEC ID Nº: 8)
[0089] Así mismo, se proporcionan anticuerpos humanizados o fragmentos de unión a epítopo de los mismosque tienen una región variable de cadena pesada humanizada o revestida que tiene una secuencia de aminoácidos
55 correspondiente a la SEC ID Nº:10 ó SEC ID Nº: 11:
QAQLQVSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLE
WIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVY
60
FCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA. (SEC ID Nº: 10)
QAQLQVSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLE
65 WIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADPSSSTAYMQISSLTSEDSAVY
FCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSA. (SEC ID Nº: 11)
[0090] Los anticuerpos humanizados y fragmentos de unión a epítopo de los mismos de la presente invención
70 también pueden incluir versiones de regiones variables de cadena ligera y/o pesada en las que los restos aminoacídicos superficiales humanos en proximidad a las CDR están reemplazados por los restos superficiales demuDS6 correspondientes en una o más posiciones definidas por los restos de la Tabla 1 (numeración de Kabat) marcados con un asterisco para retener la afinidad de unión y la especificidad de muDS6.
75
Tabla 1
Restos flanqueantes de muDS6 próximos a una CDR (numeración de Kabat)
Cadena ligera
Cadena pesada
Q1*
Q1
V3
K64*
T5
P73*
P40
S74
G57
A60
S67
E81
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
[0091] En este documento se describen las secuencias de aminoácidos primaria y de ADN de las cadenas ligeray pesada del anticuerpo DS6, y de versiones humanizadas del mismo. Preferiblemente, los anticuerpos y fragmentos proporcionados por esta invención que se unen específicamente a CA6 también antagonizan la actividad biológica del receptor. Más preferiblemente, dichos anticuerposadicionalmente están sustancialmente desprovistos de actividad agonista. Por tanto, los anticuerpos y fragmentos deanticuerpo de la presente invención pueden diferir del anticuerpo DS6 o los derivados humanizados del mismo, enlas secuencias de aminoácidos de su estructura, las CDR, y/o la cadena ligera y cadena pesada, y aún estar dentrodel alcance de la presente invención.
[0092] Las CDR del anticuerpo DS6 se identifican por modelado y se han predicho sus estructuras moleculares.
[0093] El gen de la línea germinal IgV? ap4 de cadena ligera de ratón y el gen de la línea germinal IgVh J558.41de cadena pesada a partir de los cuales probablemente se obtuvo DS6 se muestran en la Figura 11 alineados con la secuencia del anticuerpo DS6. La comparación identifica mutaciones somáticas probables en el anticuerpo DS6,incluyendo varias en las CDR.
[0094] La secuencia de la región variable de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo DS6, y lassecuencias de las CDR del anticuerpo DS6 no se conocían previamente y se muestran en las Figuras 9A y 9B. Dicha información puede usarse para producir versiones humanizadas del anticuerpo DS6.
Fragmentos de anticuerpo
[0095] Los anticuerpos de la presente invención incluyen tanto los anticuerpos de longitud completa analizados anteriormente, como los fragmentos a unión a epítopo. Como se usa en este documento, "fragmentos de anticuerpo"incluye cualquier parte de un anticuerpo que retiene la capacidad de unirse al epítopo reconocido por el anticuerpode longitud completa, generalmente llamados "fragmentos de unión a epítopo". Los ejemplos de fragmentos deanticuerpo incluyen, aunque sin limitación, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fv de cadena sencilla (scFv), anticuerpos decadena sencilla, Fv con puente disulfuro (dsFv) y fragmentos que comprenden una región VL o VH. Los fragmentos de unión a epítopo, incluyendo anticuerpos de cadena sencilla, pueden comprender la región o regiones variables solas o en combinación con la totalidad o una parte de los siguientes: región bisagra, dominios CH1, CH2, y CH3.
[0096] Dichos fragmentos pueden contener uno o ambos fragmentos Fab o el fragmento F(ab')2. Preferiblemente, los fragmentos de anticuerpo contienen las seis CDR del anticuerpo completo, aunque también son funcionales fragmentos que contienen no todas estas regiones, tales como tres, cuatro o cinco CDR. Además, losfragmentos pueden ser o pueden combinar con miembros de una cualquiera de las siguientes clases de inmunoglobulina: IgG, IgM, IgA, IgD, o IgE, y las subclases de las mismas.
[0097] Los fragmentos Fab y F(ab')2 pueden producirse por escisión proteolítica, usando encimas tales como papaina (fragmentos Fab) o pepsina (fragmentos F(ab')2).
[0098] Los fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv) son fragmentos de unión a epítopo que contienen al menosun fragmento de una región variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) unido a al menos un fragmento de una región variable de cadena ligera de anticuerpo (VL). El enlazador puede ser un péptido corto, flexible seleccionado para asegurar que exista el plegamiento tridimensional apropiado de las regiones (VL) y (VH) una vez se han unidopara mantener la especificidad de unión a la molécula diana del anticuerpo completo del que se obtiene el fragmentode anticuerpo de cadena sencilla. El extremo carboxilo de la secuencia (VL) o (VH) puede estar unido covalentemente por un enlazador al aminoácido terminal de una secuencia (VL) o (VH) complementaria.
[0099] Los fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla de la presente invención contienen secuencias deaminoácidos que tienen las regiones variables o determinantes de complementariedad (CDR) de los anticuerposcompletos descritos en esta memoria descriptiva, pero que carecen de algunos o todos los dominios constantes deesos anticuerpos. Estos dominios constantes no son necesarios para la unión al antígeno, pero constituyen unaparte principal de la estructura de los anticuerpos completos. Los fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla, por lo tanto, pueden superar algunos de los problemas asociados con el uso de anticuerpos que contienen una parte otodo un dominio constante. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla tienden a estar libres deinteracciones indeseadas entre moléculas biológicas y la región constante de cadena pesada, u otra actividadbiológica no deseada. Adicionalmente, los fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla son considerablemente máspequeños que los anticuerpos completos y por lo tanto pueden tener mayor permeabilidad capilar que los anticuerpos completos, permitiendo que los fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla se localicen y se unan asitios de unión a antígeno diana de forma más eficaz. Además, los fragmentos de anticuerpo pueden producirse auna escala relativamente grande en células procariotas, facilitando de este modo su producción. Adicionalmente, eltamaño relativamente pequeño de los fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla los hace ser menos probables aprovocar una respuesta inmune en un receptor que los anticuerpos completos.
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[00100] Los fragmentos de unión a anticuerpo de cadena sencilla pueden generarse por clonación molecular,biblioteca de presentación en fagos de anticuerpo o técnicas similares bien conocidas para los especialistas en latécnica. Estas proteínas pueden producirse, por ejemplo, en células eucariotas o células procariotas, incluyendobacterias. Los fragmentos de unión a epítopo de la presente invención también pueden generarse usando diversos métodos de presentación en fagos conocidos en la técnica. En los métodos de presentación en fagos, los dominiosdel anticuerpo funcional se presentan en la superficie de partículas fágicas que portan las secuencias polinucleotídicas que los codifican. En particular, dicho fago puede utilizarse para presentar dominios de unión aepítopo expresados a partir de un repertorio o biblioteca combinatoria de anticuerpos (por ejemplo, humanos omurinos). El fago expresa un dominio de unión a epítopo que se une al antígeno de interés puede seleccionarse o identificarse con el antígeno, por ejemplo, usando un antígeno marcado unido o capturado en una superficie sólida operla. El fago usado en estos métodos es típicamente un fago filamentoso que incluye los dominios de unión fd y M13 expresados a partir del fago con Fab, Fv o dominios de anticuerpos Fv estabilizados con puente disulfurofusionados de forma recombinante con la proteína del gen III o gen VIII del fago.
[00101] Los ejemplos de métodos de presentación en fagos que pueden usarse para preparar los fragmentos deunión a epítopo de la presente invención incluyen los descritos en Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol.24:952-958; Persic et al., 1997, Gene 187:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57:191-280; publicación PCT WO 92/014047; publicaciones PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y las patentes de Estados Unidos Nº 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484;5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 y
5.969.108.
[00102] Después de la selección del fago, las regiones del fago que codifican los fragmentos pueden aislarse y usarse para generar los fragmentos de unión a epítopo a través de la expresión en un hospedador seleccionado,incluyendo células de mamífero, células de insecto, células vegetales, levaduras y bacterias, usando tecnología deADN recombinante, por ejemplo, como se describe a continuación en detalle. Por ejemplo, también puedenemplearse técnicas para producir de forma recombinante fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 usando métodos conocidos en la técnica tales como los descritos en la publicación PCT WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12(6):864-869; Sawai et al., 1995, AJRI 34:26-34; y Better et al., 1988, Science 240:1041-1043. Los ejemplos de técnicas que pueden usarse para producir Fv de cadena sencilla y anticuerpos incluyen lasdescritas en las patentes de Estados Unidos Nº 4.946.778 y 5.258.498; Huston et al., 1991, Methods in Enzymology203:46-88; Shu et al., 1993, PNAS 90: 7995-7999; Skerra et al., 1988, Science 240:1038-1040.
Equivalentes funcionales
[00103] La expresión "equivalentes funcionales" incluye anticuerpos con secuencias homólogas, anticuerposquiméricos, anticuerpos artificiales y anticuerpos modificados, por ejemplo, donde cada equivalente funcional estádefinido por su capacidad de unirse a CA6. Los especialistas en la técnica entenderán que existe un solapamiento en el grupo de moléculas llamadas "fragmentos de anticuerpos" y el grupo llamado "equivalentes funcionales". Losmétodos para producir equivalentes funcionales se describen, por ejemplo, en la solicitud PCT WO 93/21319, lasolicitud de patente Europea Nº 239.400; la solicitud PCT WO 89/09622; la solicitud de patente Europea Nº 338.745; y la solicitud de patente Europea EP 332.424.
[00104] Los anticuerpos con secuencias homólogas son aquellos anticuerpos con secuencias de aminoácidos que tienen homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo anti-CA6 y un anticuerpo antiCA6 humanizado de la presente invención. Preferiblemente, la homología es con la secuencia de aminoácidos delas regiones variables del anticuerpo anti-CA6 y el anticuerpo anti-CA6 humanizado de la presente invención."Homología de secuencia" que se aplica a una secuencia de aminoácidos en este documento se define como una secuencia con una homología de secuencia de al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, ó 94%, y más preferiblementeuna homología de secuencia de al menos aproximadamente el 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% con otra secuencia deaminoácidos, determinada, por ejemplo, por el método de búsqueda FASTA de acuerdo con Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85.2444-2448 (1988).
[00105] Como se usa en este documento, un anticuerpo quimérico es uno en el que diferentes partes de unanticuerpo se obtienen de diferentes especies animales. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una región variableobtenida de un anticuerpo monoclonal murino apareada con una región constante de inmunoglobulina humana. Losmétodos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Morrison, 1985,Science 229:1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202; patentes de Estados Unidos Nº 5.807.715; 4.816.567; y 4.816.397.
[00106] Las formas humanizadas de anticuerpos quiméricos se preparan sustituyendo las regiones determinantes de complementariedad de, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, en un dominio flanqueante humano, por ejemplo,véase la publicación PCT Nº W092/22653. Los anticuerpos quiméricos humanizados preferiblemente tienen regiones constantes y regiones variables diferentes de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) obtenidassustancial o exclusivamente de las regiones de anticuerpo humano correspondientes y las CDR obtenidas sustancial
o exclusivamente de un mamífero diferente a un ser humano.
[00107] Los anticuerpos artificiales incluyen fragmentos scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y mru (véanse las revisiones de Winter, G. y Milstein, C., 1991, Nature 349:293-299; Hudson, P.J., 1999, Current Opinion inImmunology 11: 548-557), cada uno de los cuales tiene capacidad de unión a antígeno. En el fragmento Fv decadena sencilla (scFv), los dominios VH y VL de un anticuerpo se unen por un péptido flexible. Típicamente, estepéptido enlazador es de aproximadamente 15 restos aminoacídicos de longitud. Si el enlazador es mucha más pequeño, por ejemplo de 5 aminoácidos, se forman diacuerpos, que son dímeros scFv bivalentes. Si el enlazador se reduce a menos de 3 restos aminoacídicos, se forman estructuras triméricas y tetraméricas que se llaman
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triacuerpos y tetracuerpos. La unidad de unión más pequeña de un anticuerpo es una CDR, típicamente la CDR2 dela cadena pesada que tiene suficiente reconocimiento específico y unión que puede usarse por separado. Dichofragmento se llama unidad de reconocimiento molecular o mru. Pueden unirse varias de dichas mru junto con cortospéptidos enlazadores, formando por lo tanto una proteína de unión artificial con mayor avidez que un único mru.
[00108] Los equivalentes funcionales de la presente solicitud también incluyen anticuerpos modificados, por ejemplo, anticuerpos modificados por la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo. Por ejemplo, losanticuerpos modificados incluyen anticuerpos que se han modificado, por ejemplo, por glucosilación, acetilación,pegilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisiónproteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. La unión covalente no evita que el anticuerpo genere una respuesta anti-idiotípica. Estas modificaciones pueden realizarse por técnicas conocidas incluyendo, aunque sinlimitación, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, los anticuerpos modificados pueden contener uno o más aminoácidos no clásicos.
[00109] Los equivalentes funcionales pueden producirse intercambiando diferentes CDR sobre diferentes cadenas en diferentes regiones flanqueantes. Por tanto, por ejemplo, son posibles diferentes clases de anticuerpo para unaserie dada de CDR por sustitución de diferentes cadenas pesadas, por lo cual pueden producirse, por ejemplo, tipose isotipos de anticuerpos IgG1-4, IgM, IgA1-2, IgD, IgE. Así mismo, pueden producirse anticuerpos artificiales dentrodel alcance de la invención incluyendo una serie dada de CDR en una región flanqueante completamente sintética.
[00110] Los equivalentes funcionales pueden producirse fácilmente por mutación, deleción y/o inserción en lassecuencias de región variable y/o constante que flanquean una serie particular de CDR, usando una amplia diversidad de métodos conocidos en la técnica.
[00111] Los fragmentos de anticuerpo y equivalentes funcionales de la presente invención abarcan aquellas moléculas con un grado detectable de unión a CA6, en comparación con el anticuerpo DS6. Un grado detectable deunión incluye todos los valores en el intervalo de al menos el 10-100%, preferiblemente de al menos el 50%, 60%, ó70%, más preferiblemente de al menos el 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ó 99% de la capacidad de unión del anticuerpo DS6 murino a CA6.
Anticuerpos mejorados
[00112] Las CDR son de gran importancia para el reconocimiento de epítopo y la unión del anticuerpo. Sinembargo, pueden hacerse cambios de los restos que comprenden las CDR sin interferir con la capacidad delanticuerpo para reconocer y unirse a su epítopo afín. Por ejemplo, pueden hacerse cambios que no afectan al reconocimiento de epítopo, pero aumentan la afinidad de unión del anticuerpo por el epítopo.
[00113] Varios estudios han examinado los efectos de introducir uno o más cambios de aminoácidos en diversas posiciones de la secuencia de un anticuerpo, en base al conocimiento de la secuencia primaria del anticuerpo, sobresus propiedades tales como la unión y el nivel de expresión (Yang, W. P. et al., 1995, J. Mol. Biol., 254, 392-403; Rader, C. et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 8910-8915; Vaughan, T. J. et al., 1998, Natukre Biotechnology, 16, 535-539).
[00114] En estos estudios, se han generado equivalentes del anticuerpo primario cambiando las secuencias de los genes de cadena pesada y ligera en la CDR1, CDR2, CDR3, o las regiones flanqueantes, usando métodos tales como mutagénesis dirigida al sitio mediada por oligonucleótido, mutagénesis de casete, PCR propensa a errores,arrastre de ADN, o cepas de mutación de E. Coli (Vaughan, T. J. et al., 1998, Nature Biotechnology, 16, 535-539; Adey, N. B. et al., 1996, Chapter 16, pág. 277-291, en "Phage Display of Peptides and Proteins", Eds. Kay, B. K. etal., Academic Press). Estos métodos para cambiar la secuencia del anticuerpo primario han provocado afinidadesmejoradas de los anticuerpos secundarios (Gram, H. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 3576-3580; Boder,
E. T. et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 10701-10705; Davies, J. y Riechmann, L., 1996, Immunotechnolgy, 2, 169-179; Thompson, J. et al., 1996, J. Mol. Biol., 256, 77-88; Short, M. K. et al., 2002, J. Biol. Chem., 277, 1636516370; Furukawa, K. et al., 2001, J. Biol. Chem., 276, 27622-27628).
[00115] Mediante una estrategia dirigida similar para cambiar uno o más restos de aminoácidos el anticuerpo, pueden usarse las secuencias de anticuerpo descritas en esta invención para desarrollar anticuerpos anti-CA6 confunciones mejoradas, incluyendo afinidad mejorada por CA6.
[00116] Los anticuerpos mejorados también incluyen aquellos anticuerpos que tienen características mejoradas que se preparan por las técnicas convencionales de inmunización animal, formación de hibridomas y selección de anticuerpos con características específicas.
Agentes citotóxicos
[00117] El agente citotóxico usado en el conjugado citotóxico de la presente invención puede ser cualquier compuesto que provoque la muerte de una célula, o induzca la muerte celular, o disminuya de algún modo laviabilidad celular. Los agentes citotóxicos preferidos incluyen, por ejemplo, maitansinoides y análogos de maitansinoides, taxoides, CC-1065 y análogos de CC-1065, dolastatina y análogos de dolastatina, definidos a continuación. Estos agentes citotóxicos se conjugan con los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, equivalentesfuncionales, anticuerpos mejorados y sus análogos descritos en este documento.
[00118] Los conjugados citotóxicos pueden prepararse por métodos in vitro. Para unir un fármaco o profármaco alanticuerpo, se usa un grupo enlazador. Los grupos enlazadores adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen grupos de disulfuro, grupos tioéter, grupos inestables en ácido, grupos fotolabiles, grupos inestables enpeptidasa y grupos inestables en esterasa. Los grupos enlazadores preferidos son grupos disulfuro y grupos tioéter.
Por ejemplo, pueden construirse conjugados usando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlacetioéter entre el anticuerpo y el fármaco o profármaco.
Maitansinoides
5
[00119] Entre los agentes citotóxicos que pueden usarse en la presente invención para formar un conjugadocitotóxico, están los maitansinoides y los análogos de maitansinoides. Los ejemplos de maitansinoides adecuadosincluyen maitansinol y análogos de maitansinol. Los maitansinoides son fármacos que inhiben la formación demicrotúbulos y que son altamente tóxicos para las células de mamífero.
10 [00120] Los ejemplos de análogos de maitansinol adecuados incluyen aquellos que tienen un anillo aromáticomodificado y aquellos que tienen modificaciones en otras posiciones. Dichos maitansinoides adecuados se describen en las patentes de Estados Unidos Nº 4.424.219; 4.256.746; 4.294.757; 4.307.016; 4.313.946; 4.315.929; 4.331.598; 4.361.650; 4.362.663; 4.364.866; 4.450.254; 4.322.348; 4.371.533; 6.333.410; 5.475.092; 5.585.499; y
15 5.846.545.
[00121] Los ejemplos de análogos adecuados de maitansinol que tienen un anillo aromático modificado incluyen:
[00122] (1) C-19-descloro (patente de Estados Unidos Nº 4.256.746) (preparado por reducción con LAH de20 ansamitocina P2);
[00123] (2) C-20-hidroxi (o C-20-desmetilo) +/-C-19-descloro (patentes de Estados Unidos Nº 4.361.650 y 4.307.016) (preparado por desmetilación usando Streptomyces o Actinomyces o descloración usando LAH); y
25 [00124] (3) C-20-desmetoxi, C-20-aciloxi (-OCOR), +/-descloro (patente de Estados Unidos Nº 4.294.757) (preparado por acilación usando cloruros de acilo).
[00125] Los ejemplos de análogos adecuados de maitansinol que tienen modificaciones de otras posiciones incluyen:
30
[00126] (1) C-9-SH (patente de Estados Unidos Nº 4.424.219) (preparado por la reacción de maitansinol con H2S
o P2S5);
[00127] (2) C-14-alcoximetilo (desmetoxi/CH2OR) (patente de Estados Unidos Nº 4.331.598);
35 [00128] (3) C-14-hidroximetilo o aciloximetilo (CH2OH o CH2OAc) (patente de Estados Unidos Nº 4.450.254) (preparado a partir de Nocardia);
[00129] (4) C-15-hidroxi/aciloxi (patente de Estados Unidos Nº 4.364.866) (preparado por la conversión de 40 maitansinol por Streptomyces);
[00130] (5) C-15-metoxi (patentes de Estados Unidos Nº 4.313.946 y 4.315.929) (aislado de Trewia nudiflora);
[00131] (6) C-18-N-desmetilo (patentes de Estados Unidos Nº 4.362.663 y 4.322.348) (preparado por la45 desmetilación de maitansinol por Streptomyces); y
[00132] (7) 4,5-desoxi (patente de Estados Unidos Nº 4.371.533) (preparado por la reducción con tricloruro detitanio/LAH del maitansinol).
50 [00133] En una realización preferida, los conjugados citotóxicos de la presente invención utilizan el maitansinoide que contiene tiol (DM1), formalmente llamado N2-desacetil- N2-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina, como agentecitotóxico. El DM1 está representado por la siguiente fórmula estructural (I): imagen1
[00134] En otra realización preferida, los conjugados citotóxicos de la presente invención utilizan el maitansinoide
55 que contiene tiol N2-desacetil-N-2'(4-metil-4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina como agente citotóxico. El DM4 está representado por la siguiente fórmula estructural (II): [00135] En realizaciones adicionales de la invención, pueden usarse otras maitansinas, incluyendo maitansionides
imagen1
que contienen tiol y disulfuro que albergan una sustitución mono o di-alquilo en el átomo de carbono que alberga el
átomo de azufre. Estos incluyen un maitansinoide que tiene, en C-3, C-14 hidroximetilo, C-15 hidroxi, o C-20
5 desmetilo, una cadena lateral de aminoácido acilada con un grupo acilo que alberga un grupo sulfhidrilo impedido,
donde el átomo de carbono del grupo acilo que alberga la funcionalidad tiol tiene uno o dos sustituyentes, siendo
dichos sustituyentes CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 átomos de carbono,
alquilo o alquenilo cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o un radical heterocíclico
aromático o heterocicloalquilo, y adicionalmente donde uno de los sustituyentes puede ser H, y donde el grupo acilo10 tiene una longitud de cadena lineal de al menos tres átomos de carbono entre la funcionalidad carbonilo y el átomo
de azufre.
imagen2
20 25 30
R1 y R2 son cada uno independientemente CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo,fenilo sustituido o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo, y además R2 pude ser H; A, B, D son cicloalquilo o cicloalquenilo que tiene 3-10 átomos de carbono, arilo simple o sustituido o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo; R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R11, y R12 son cada uno independientemente H, CH3, C2H5, alquilo oalquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo; l, m, n, o, p, q, r, s, y t son cada uno independientemente 0 o un número entero de 1 a 5, con la condiciónde que la menos dos de l, m, n, o, p, q, r, s y t no sean cero en cualquier momento dado; yZ es H, SR o -COR, donde R es alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo oalquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, o arilo simple o sustituido o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo.
[00137]
Las realizaciones preferidas de fórmula (III) incluyen compuestos de fórmula (III) en la que:
35
R1 es H, R2 es metilo y Z es H. R1 y R2 son metilo y Z es H. R1 es H, R2 es metilo, y Z es -SCH3.
R1 y R2 son metilo, y Z es -SCH3.
imagen3
[00138] Dichas maitansinas adicionales también incluyen compuestos representados por la fórmula (IV-L), (IV-D),
o (IV-D,L):
R1 y R2 son cada uno independientemente CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos
10 de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo, y además R2 puede ser H; R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son cada uno independientemente H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo;
15 l, m y n son cada uno independientemente un número entero de 1 a 5, y además n puede ser 0; Z es H, SR o -COR donde R es alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 átomos decarbono, alquilo o alquenilo cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, o arilo simple o sustituido o unradical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo; yMay representa un maitansinoide que alberga la cadena lateral en C-3, C-14 hidroximetilo, C-15 hidroxi o
20 C-20 desmetilo.
[00139] Las realizaciones preferidas de las fórmulas (IV-L), (IV-D) y (IV-D,L) incluyen compuestos de fórmulas (IVL), (IV-D) y (IV-D,L) en las que:
25 R1 es H, R2 es metilo, R5, R6, R7, y R8 son cada uno H, l y m son cada uno 1, n es 0, y Z es H. R1 y R2 son metilo, R5, R6, R7, R8 son cada uno H, l y m son 1, n es 0, y Z es H. R1 es H, R2 es metilo, R5, R6, R7, y R8 son cada uno H, l y m son cada uno 1, n es 0, y Z es -SCH3. R1 y R2 son metilo, R5, R6, R7, R8 son cada uno H, l y m son 1, n es 0, y Z es -SCH3.
imagen4
Y representa (CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ, donde:
R1 y R2 son cada uno independientemente CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo
5
sustituido o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo, y además R2 puede ser H; R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son cada uno independientemente H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo; l, m y n son cada uno independientemente un número entero de 1 a 5, y además n puede ser 0; y Z es H, SR o -COR, donde R es alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo oalquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, o arilo simple o sustituido o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo.
10
[00142] Las realizaciones preferidas de fórmula (V) incluyen compuestos de fórmula (V) en la que:
15
R1 es H, R2 es metilo, R5, R6, R7, y R8 son cada uno H; l y m son cada uno 1; n es 0; y Z es H. R1 y R2 son metilo; R5, R6, R7, R8 son cada uno H, l y m son 1; n es 0; y Z es H. R1 es H, R2 es metilo, R5, R6, R7, y R8 son cada uno H, l y m son cada uno 1, n es 0, y Z es -SCH3-. R1 y R2 son metilo, R5, R6, R7, R8 son cada uno H, l y m son 1, n es 0, y Z es -SCH3.
imagen5
Y2 representa (CR7CR8)l(CR5CR6)m(CR3CR4)nCR1R2SZ2, donde:
25 R1 y R2 son cada uno independientemente CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilosustituido o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo, y además R2 puede ser H; R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son cada uno independientemente H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal o cíclicoque tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos
30 de carbono, fenilo, fenilo sustituido o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo; 1, m y n son cada uno independientemente un número entero de 1 a 5, y además n puede ser 0; Z2 es SR o COR, donde R es alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo oalquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, o arilo simple o sustituido o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo; y
35 May es un maitansinoide.
imagen6
en la que: Y2' representa (CR7CR8)l(CR9=CR10)p(C=C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11=CR12)r(C=C)s Bt(CR3CR4)nCR1R2SZ2,
donde:
5 R1 y R2 son cada uno independientemente CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilosustituido o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo, y además R2 puede ser H; A, B, y D cada uno independientemente es cicloalquilo o cicloalquenilo que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, arilo simple o sustituido, o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo;
10 R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R11, y R12 son cada uno independientemente H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, arilo o alquenilo ramificado o lineal que tiene de 3 a 10átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo; 1, m, n, o, p, q, r, s, y t son cada uno independientemente 0 o un número entero de 1 a 5, con la condiciónde que al menos dos de l, m, n, o, p, q, r, s y t no sean cero en cualquier momento dado; y
15 Z2 es SR o -COR, donde R es alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene 3 - 10 átomos de carbono, o arilo simple o sustituido o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo.
[00145] Las realizaciones preferidas de fórmula (VII) incluyen compuestos de fórmula (VII) en la que: R1 es H y 20 R2 es metilo.
[00146] Los maitansinoides mencionados anteriormente pueden conjugarse con un anticuerpo anti-CA6 DS6, o unhomólogo o fragmento del mismo, donde el anticuerpo es une al maitansinoide usando la funcionalidad tiol odisulfuro que está presente en el grupo acilo de una cadena lateral de aminoácido acilada encontrada en C-3, C-1425 hidroximetilo, C-15 hidroxi o C-20 desmetilo del maitansinoide, y donde el grupo acilo de la cadena lateral de aminoácido acilada tiene su funcionalidad tiol o disulfuro en un átomo de carbono que tiene uno o dos sustituyentes,siendo dichos sustituyentes CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo, y además uno de los sustituyentes puede ser H, y donde el grupo acilo
30 tiene una longitud de cadena lineal de al menos tres átomos de carbono entre la funcionalidad carbonilo y el átomo de azufre.
imagen7
Y1' representa (CR7CR8)l(CR9=CR10)p(C=C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11=CR12)r(C=C)s Bt(CR3CR4)nCR1R2S-,
40 donde:
A, B, y D, cada uno independientemente es cicloalquilo o cicloalquenilo que tiene 3-10 átomos de carbono, arilo simple o sustituido, o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo; R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R11, y R12 son cada uno independientemente H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo
45 lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo; y 1, m, n, o, p, q, r, s, y t son cada uno independientemente 0 o un número entero de 1 a 5, con la condiciónde que al menos dos de l, m, n, o, p, q, r, s y t no sean cero en cualquier momento dado.
[00148] Preferiblemente, R1 es H y R2 es metilo o R1 y R2 son metilo.
50 [00149] Un conjugado incluso más preferido de la presente invención es uno que comprende el anticuerpo antiCA6 DS6, o un homólogo o fragmento del mismo, conjugado con un maitansinoide de fórmula (IX-L), (IX-D), o (IXD,L): en la que:
imagen1
5 Y, representa (CR7CR8)l(CR5R6)m(CR3CR4)nCR1R2S-,
donde: R1 y R2 son cada uno independientemente CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo
10 sustituido, un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo, y además R2 puede ser H; R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son cada uno independientemente H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo;1, m y n son cada uno independientemente un número entero de 1 a 5, y además n pude ser 0; y
15 May representa un maitansinol que alberga la cadena lateral en C-3, C-14 hidroximetilo, C-15 hidroxi o C20 desmetilo.
[00150] Realizaciones preferidas de las fórmulas (IX-L), (IX-D) y (IX-D,L) incluyen compuestos de fórmulas (IX-L),(IX-D) y (IX-D,L) en las que:
20
R1 es H y R2 es metilo o R1 y R2 son metilo, R1 es H, R2 es metilo, R5, R6, R7 y R8 son cada uno H; l y m son cada uno 1; n es 0, R1 y R2 son metilo; R5, R6, R7 y R8 son cada uno H; l y m son 1; n es 0.
25 [00151] Preferiblemente, el agente citotóxico está representado por la fórmula (IX-L). [00152] Un conjugado preferido adicional de la presente invención es uno que comprende el anticuerpo anti-CA6DS6, o un homólogo o fragmento del mismo, conjugado con un maitansinoide de fórmula (X):
imagen8
[00153] Son especialmente preferidos cualquiera de los compuestos descritos anteriormente, donde R1 es H, R2 es metilo, R5, R6, R7 y R8 son cada uno H, l y m son cada uno 1, y n es 0.
[00154] Además son especialmente preferidos cualquiera de los compuestos descritos anteriormente, donde R1 y35 R2 son metilo, R5, R6, R7, R8 son cada uno H, l y m son 1, y n es 0.
[00155] Además, se prefiere el estereoisómero L-aminoacilo.
[00156] Cada uno de los maitansinoides mostrados en la publicación de patente de Estados Unidos en trámite40 número US 2004235840, también puede usarse en el conjugado citotóxico de la presente invención.
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75
Grupos enlazadores que contienen disulfuro
[00157] Para enlazar el maitansinoide a un agente de unión celular, tal como el anticuerpo DS6, el maitansinoidecomprende un resto enlazador. El resto enlazador contiene un enlace químico que permite la liberación de maitansinoides completamente activos en un sitio particular. Los enlaces químicos adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen enlaces disulfuro, enlaces inestables en ácido, enlaces fotolábiles, enlaces inestables enpeptidasa y enlaces inestables en esterasa. Se prefieren los enlaces disulfuro.
[00158] El resto enlazador también comprende un grupo químico reactivo. En una realización preferida, el grupo químico reactivo puede unirse covalentemente al maitansinoide mediante un resto enlazador de enlace disulfuro.
[00159] Los grupos químicos reactivos particularmente preferidos son ésteres de N-succinimidilo y ésteres de Nsulfosuccinimidilo.
[00160] Los maitansinoides particularmente preferidos que comprende un resto enlazador que contiene un grupo químico reactivo son ésteres C-3 de maitansinol y sus análogos donde el resto enlazador contiene un enlacedisulfuro y el grupo reactivo químico comprende un éster de N-succinimidilo o N-sulfosuccinimidilo.
[00161] Muchas posiciones en los maitansinoides pueden servir como la posición para enlazar químicamente elresto enlazador. Por ejemplo, la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con hidroxi y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxi se espera que todas sean útiles. Sin embargo, se prefiere la posición C-3 y la posición C-3 del maitansinol es especialmentepreferida.
[00162] Aunque se describe la síntesis de ésteres de maitansinol que tienen un resto enlazador en términos de restos enlazadores que contienen un enlace disulfuro, un especialista en la técnica entenderá que también pueden usarse restos enlazadores con otros enlaces químicos (como se ha descrito anteriormente) con la presenteinvención, así como otros maitansinoides. Los ejemplos específicos de otros enlaces químicos incluyen enlaces inestables en ácido, enlaces fotolábiles, enlaces inestables en peptidasa y enlaces inestables en esterasa. Ladescripción de la patente de Estados Unidos Nº 5.208.020, incorporada en este documento, muestra la producción de maitansinoides que albergan dichos enlaces.
[00163] La síntesis de maitansinoides y derivados de maitansinoides que tienen un resto disulfuro que alberga ungrupo reactivo se describe en las patentes de Estados Unidos Nº 6.441.163 y 6.333.410, y la publicación de EstadosUnidos US 2003055226.
[00164] Los maitansinoides que contienen un grupo reactivo, tal como DM1, se hacen reaccionar con un anticuerpo, tal como el anticuerpo DS6, para producir conjugados citotóxicos. Estos conjugados pueden purificarsepor HPLC o por filtración en gel.
[00165] Se proporcionan varios esquemas excelentes para producir dichos conjugados de anticuerpomaitansinoide en la patente de Estados Unidos Nº 6.333.410, y las solicitudes de Estados Unidos Nº
[00166] US 6441163, US 2003055226, US 2004001838.
[00167] En general, puede incubarse una solución de un anticuerpo en tampón acuoso con un exceso molar demaitansinoides que tienen un resto disulfuro que alberga un grupo reactivo. La mezcla de reacción puede inactivarse por la adición de un exceso de amina (tal como etanolamina, taurina, etc.). El conjugado de maitansinoideanticuerpo después puede purificarse por filtración en gel.
[00168] La cantidad de moléculas de maitansinoide unidas por molécula de anticuerpo puede determinarse midiendo espectrofotométricamente la proporción de la absorbancia a 252 nm y 280 nm. Se prefiere un promedio de1-10 moléculas de maitansinoide/moléculas de anticuerpo.
[00169] Los conjugados de anticuerpos con fármacos maitansinoides pueden evaluarse para su capacidad de suprimir la proliferación de diversas líneas celulares indeseadas in vitro. Por ejemplo, pueden usarse fácilmentelíneas celulares tales como la línea de carcinoma epidermoide humano A-431, la línea celular de cáncer pulmonarmicrocítico humano SW2, la línea de tumor de mama humano SKBR3 y la línea de linfoma de Burkitt Namalwa para la evaluación de la citotoxicidad de estos compuestos. Las células a evaluar pueden exponerse a los compuestosdurante 24 horas y medirse las fracciones supervivientes de las células en ensayos directos por métodos conocidos. Después pueden calcularse los valores de IC50 a partir de los resultados de los ensayos.
Grupos enlazadores que contienen PEG
[00170] Los maitansinoides también pueden enlazarse a agentes de unión celular usando grupos enlazadores de PEG, como se expone en la publicación de Estados Unidos US 2004001838. Estos grupos enlazadores de PEG sonsolubles tanto en agua como en disolventes no acuosos, y pueden usarse para unir uno o más agentes citotóxicos aun agente de unión celular. Los grupos enlazadores de PEG ejemplares incluyen enlazadores de PEG heterobifuncionales que se unen a agentes citotóxicos y a agentes de unión celular en extremos opuestos de los enlazadores a través de un grupo sulfhidrilo o disulfuro funcional en un extremo, y un éster activo en el otro extremo.
[00171] Como ejemplo general de la síntesis de un conjugado citotóxico usando un grupo enlazador de PEG, se hace de nuevo referencia a la publicación de Estados Unidos US US20041838 Nº 10/024.290 para detallesespecíficos. La síntesis comienza con la reacción de uno o más agentes citotóxicos que albergan un resto PEGreactivo con un agente de unión celular, provocando el desplazamiento del éster activo terminal de cada resto de PEG reactivo por un resto aminoacídico del agente de unión celular, para producir un conjugado citotóxico que
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comprende uno o más agentes citotóxicos unidos covalentemente a un agente de unión celular a través de un grupoenlazador de PEG.
Taxanos
[00172] El agente citotóxico usado en los conjugados citotóxicos de acuerdo con la presente invención tambiénpuede ser un taxano o derivado del mismo.
[00173] Los taxanos son una familia de compuestos que incluye paclitaxel (Taxol), un producto natural citotóxico,y docetaxel (Taxotere), un derivado semi-sintético, dos compuestos que se usan ampliamente en el tratamiento del cáncer. Los taxanos son toxinas del huso mitótico que inhiben la despolimerización de la tubulina, provocando lamuerte celular. Aunque el docetaxel y el paclitaxel son agentes útiles en el tratamiento del cáncer, su actividadantitumoral está limitada a causa de su toxicidad no específica hacia las células normales. Además, compuestoscomo el paclitaxel y el docetaxel por sí mismos no son suficientemente potentes para usarse en conjugados deagentes de unión celular.
[00174] Un taxano preferido para su uso en la preparación de conjugados citotóxicos es el taxano de fórmula (XI): imagen1
[00175] Se describen con detalle métodos para sintetizar taxanos que pueden usarse en los conjugadoscitotóxicos de la presente invención, junto con métodos para conjugar los taxanos a agentes de unión celular tales como anticuerpos, en las patentes de Estados Unidos Nº 5.416.064, 5.475.092, 6.340.701, 6.372.738 y 6.436.931, y en las publicaciones de Estados Unidos Nº US 2004001838, US 6596757, US 1715795, WO 2004/013093 y US2004024049.
Análogos de CC-1065
[00176] El agente citotóxico usado en los conjugados citotóxicos de acuerdo con la presente invención tambiénpuede ser CC-1065 o un derivado del mismo.
[00177] CC-1065 es un potente antibiótico anti-tumoral aislado del caldo de cultivo de Streptomyces zelensis. CC1065 es aproximadamente 1000 veces más potente in vitro que los fármacos anti-cáncer habitualmente usados,tales como doxorrubicina, metotrexato y vincristina (B.K. Bhuyan et al., Cancer Res., 42, 3532-3537 (1982)). CC1065 y sus análogos se describen en las patentes de Estados Unidos Nº 6.372.738, 6.340.701, 5.846.545 y
5.585.499.
[00178] La potencia citotóxica de CC-1065 se ha correlacionado con su actividad alquilante y su actividad deunión a ADN o intercalante en el ADN. Estas dos actividades residen en partes diferentes de la molécula. Por tanto,la actividad alquilante está contenida en la subunidad ciclopropapirroloindol (CPI) y la actividad de unión a ADNreside en las dos subunidades pirroloindol.
[00179] Aunque CC-1065 tienen ciertas características atractivas como agente citotóxico, tiene limitaciones enuso terapéutico. La administración de CC-1065 a ratones causaba una hepatotoxicidad retardada que conducía amortalidad en el día 50 después de una única dosis intravenosa de 12,5 µ/kg {V. L. Reynolds et al., J. Antibiotics, XXIX, 319-334 (1986)}. Esto ha estimulado los esfuerzos por desarrollar análogos que no causen toxicidad retardada, y se ha descrito la síntesis de análogos más simples modelados sobre CC-1065 {M.A. Warpehoski et al.,
J. Med. Chem., 31, 590-603 (1988)}.
[00180] En otra serie de análogos, el resto CPI se remplazó por un resto ciclopropabenzindol (CBI) {D.L. Boger etal., J. Org. Chem., 55, 5823-5833, (1990), D.L. Boger et al., BioOrg. Med. Chem. Lett., 1, 115-120 (1991)}. Estoscompuestos mantienen la elevada potencia in vitro del fármaco parental, sin causar toxicidad retardada en ratones. Como CC-1065, estos compuestos son agentes alquilantes que se unen al surco menor del ADN de un modocovalente para causar la muerte celular. Sin embargo, la evaluación clínica de los análogos más prometedores,Adozelesina y Carzelesina, ha conducido a resultados decepcionantes {B.F. Foster et al., Investigational New Drugs,13, 321-326(1996); I. Wolff et al., Clin. Cancer Res., 2, 1717-1723 (1996)}. Estos fármacos presentan pobres efectos terapéuticos a causa de su alta toxicidad sistémica.
[00181] La eficacia terapéutica de los análogos de CC-1065 puede mejorarse enormemente cambiando ladistribución in vivo a través del suministro dirigido en el sitio del tumor, lo que provoca una toxicidad inferior en lostejidos no marcados como diana y, por tanto, toxicidad sistémica inferior. Para conseguir este objetivo, se han
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75
descrito conjugados de análogos y derivados de CC-1065 con agentes de unión celular que se dirigen específicamente a células tumorales {patentes de Estados Unidos; 5.475.092; 5.585.499; 5.846.545}. Estosconjugados típicamente presentan alta toxicidad específica de diana in vitro, y actividad anti-tumoral excepcional enmodelos de xenoinjerto de tumor humano en ratones {R.V. J. Chari et al., Cancer Res., 55, 4079-4084 (1995)}.
[00182] Se describen en detalle métodos para sintetizar análogos de CC-1065 que pueden usarse en losconjugados citotóxicos de la presente invención, junto con métodos para conjugar los análogos a agentes de unióncelular tales como anticuerpos, en las patentes de Estados Unidos Nº 5.475.092, 5.846.545, 5.585.499, 6.534.660 y
6.586.618 y en las publicaciones de Estados Unidos Nº US 2003199519 y US 2003195365.
Otros fármacos
[00183] También son adecuados fármacos tales como metotrexato, daunorrubicina, doxorrubicina, vincristina, vinblastina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, caliqueamicina, tubulisina y análogos de tubulisina, duocarmicina y análogos de duocarmicina, dolastatina y análogos de dolastatina para la preparación de conjugados de la presente invención. Las moléculas de fármaco también pueden enlazarse a las moléculas de anticuerpo a través de una molécula vehículo intermediaria tal como albúmina sérica. Los compuestos Doxarrubicina y Danorrubicina, que sedescriben, por ejemplo, en la publicación de Estados Unidos Nº US 20010036923, también pueden ser agentescitotóxicos útiles.
Composición terapéutica
[00184] La presente invención también proporciona una composición terapéutica que comprende:
(a)
una cantidad eficaz de uno o más conjugados citotóxicos, y
(b)
un vehículo farmacéuticamente aceptable.
[00185] Asimismo, la presente invención proporciona un método in vitro para inhibir el crecimiento de poblacionescelulares seleccionadas que comprende poner en contacto las células diana, o el tejido que contiene las célulasdiana, con una cantidad eficaz de un conjugado citotóxico, o agente terapéutico que comprende un conjugadocitotóxico, solo o en combinación con otros agentes citotóxicos o terapéuticos.
[00186] La presente invención también comprende medicamentos y composiciones para tratar a un sujeto quetiene cáncer, comprendiendo dichos medicamentos y composiciones la composición terapéutica de la presente invención.
[00187] Los conjugados citotóxicos pueden evaluarse para la potencia y especificidad in vitro por métodospreviamente descritos (véase, por ejemplo, R.V.J. Chari et al., Cancer Res. 55:4079-4084 (1995)). La actividad antitumoral puede evaluarse en modelos de xenoinjerto de tumor humano en ratones por métodos también descritospreviamente (véase, por ejemplo, Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:8618-8623 (1996)).
[00188] Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados son bien conocidos y pueden determinarlos losespecialistas en la técnica que justifiquen la situación clínica. Como se usa en este documento, los vehículosincluyen diluyentes y excipientes.
[00189] Los ejemplos de vehículos, diluyentes y/o excipientes adecuados incluyen: (1) solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, pH ~ 7,4, que contiene o no contiene aproximadamente 1 mg/ml a 25 mg/ml de albúminasérica humana, (2) solución salina al 0,9% (cloruro sódico (NaCl) al 0,9% p/v), y (3) dextrosa al 5% (p/v); y tambiénpuede contener un antioxidante tal como triptamina y un agente estabilizador tal como Tween 20.
[00190] El método para inhibir el crecimiento de poblaciones celulares seleccionadas puede ponerse en práctica in vitro, in vivo, o ex vivo. Como se usa en este documento, inhibir el crecimiento significa ralentizar el crecimiento de una célula, disminuir la viabilidad celular, causar la muerte de una célula, lisar una célula e inducir la muerte celular, ya sea en un periodo corto o largo de tiempo.
[00191] Los ejemplos de usos in vitro incluyen tratamientos de médula ósea autóloga antes de su transplante en el mismo paciente para eliminar las células enfermas o malignas; tratamientos de médula ósea antes de su transplante para eliminar las células T competentes y evitar la enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD);tratamientos de cultivos celulares para eliminar todas las células excepto las variantes deseadas que no expresan elantígeno diana; o para eliminar las variantes que expresan antígeno indeseado.
[00192] Las condiciones de uso no clínico in vitro las determinan fácilmente los especialistas en la técnica.
[00193] Los ejemplos de uso clínico ex vivo son para eliminar las células tumorales o células linfoides de lamédula ósea antes de su transplante autólogo en el tratamiento contra el cáncer o en el tratamiento de unaenfermedad autoinmune, o para eliminar las células T y otras células linfoides de médula ósea o tejido autólogo o alogénico antes de su transplante para evitar la enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD). El tratamiento puede realizarse de siguiente modo. Se recoge la médula ósea del paciente u otro individuo y después se incuba enmedio que contiene suero al que se añade el agente citotóxico de la invención. Las concentraciones varían deaproximadamente 10 µM a 1 pM, durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 48 horas a aproximadamente 37ºC. Las condiciones exactas de concentración y tiempo de incubación, es decir, la dosis, las determinan fácilmente los especialistas en la técnica. Después de la incubación, las células de la médula ósea selavan con medio que contiene suero y se devuelven al paciente por infusión i.v. de acuerdo con métodos conocidos.En circunstancias en las que el paciente recibe otro tratamiento tal como un tratamiento de quimioterapia ablativa oirradiación total del cuerpo entre el tiempo de recolección de la médula y la reinfusión de las células tratadas, lascélulas de la médula tratadas se almacenan congeladas en nitrógeno líquido usando un equipo médico convencional.
[00194] Para uso clínico in vivo, el conjugado citotóxico de la invención se suministrará en forma de solucionesque se ensayan para su esterilidad y para los niveles de endotoxina. Los ejemplos de protocolos adecuados deadministración del conjugado citotóxico son los siguientes. Los conjugados se dan semanalmente durante 4 5 semanas en forma de un bolo i.v. cada semana. Las dosis en embolada se dan en 50 a 100 ml de solución salina normal a la que puede añadirse de 5 a 10 ml de albúmina sérica humana. Las dosificaciones serán de 10 µg a 100 mg por administración, i.v. (intervalo de 100 ng a 1 mg/kg por día). Más preferiblemente, las dosificaciones variaránde 50 µg a 30 mg. Más preferiblemente, las dosificaciones variarán de 1 mg a 20 mg. Después de cuatro semanasde tratamiento, el paciente puede continuar recibiendo tratamiento en una base semanal. Los especialistas en la
10 técnica pueden determinar los protocolos clínicos específicos con respecto a la vía de administración, los excipientes, los diluyentes, las dosificaciones, los tiempos, etc., que justifiquen la situación clínica.
[00195] Los ejemplos de afecciones médicas que pueden tratarse con los medicamentos y composicionesdescritos en este documento incluyen malignidades de cualquier tipo incluyendo, por ejemplo, cáncer de pulmón, de15 mama, de colon, de próstata, de riñón, de páncreas, de ovario, de cuello del útero y de órganos linfáticos, osteosarcoma, carcinoma sinovial, un sarcoma o un carcinoma en el que se exprese CA6, y otros cánceres aún pordeterminar en los que se exprese el glucótopo CA6 de forma predominante; enfermedades autoinmunes, tales comolupus sistémico, artritis reumatoide, y esclerosis múltiple; rechazo de injertos, tales como rechazo de transplanterenal, rechazo de transplante hepático, rechazo de transplante pulmonar, rechazo de transplante cardiaco, y rechazo
20 de transplante de médula ósea; la enfermedad de injerto contra hospedador; infecciones víricas, tales como infección por mV, infección por VIH, SIDA, etc.; e infecciones por parásitos, tales como giardiasis, amebiasis,esquistosomiasis, y otras determinadas por los especialistas en la técnica.
Kit
25 [00196] La presente invención también incluye kits, por ejemplo, que comprenden un conjugado citotóxico descritoe instrucciones para el uso del conjugado citotóxico para eliminar tipos celulares particulares. Las instrucciones pueden incluir directrices para usar los conjugados citotóxicos in vitro, in vivo o ex vivo.
30 [00197] Típicamente, el kit tendrá un compartimiento que contiene el conjugado citotóxico. El conjugado citotóxico puede estar en forma liofilizada, forma líquida, u otra forma susceptible de incluirse en un kit. El kit también puedecontener elementos adicionales necesarios para poner en práctica el método descrito en las instrucciones del kit, tales como una solución esterilizada para reconstituir un polvo liofilizado, agentes adicionales para combinarlos conel conjugado citotóxico antes de administrarlo a un paciente, y herramientas que ayuden a la administración del
35 conjugado a un paciente.
Realizaciones adicionales
[00198] La presente invención proporciona adicionalmente anticuerpos humanizados y fragmentos de unión a
40 epítopo de los mismos que se marcan adicionalmente para su uso en aplicaciones de investigación o diagnóstico. En realizaciones preferidas, el marcador es un radiomarcador, un fluoróforo, un cromóforo, un agente de formaciónde imágenes o un ión metálico.
[00199] También se proporciona un método para diagnóstico en el que dichos anticuerpos o fragmentos de unión
45 a epítopo de los mismos marcados se administran a un sujeto que se sospecha que tiene un cáncer, y se mide o controla la distribución el marcador en el cuerpo del sujeto.
Ejemplos
50 [00200] El amplio alcance de esta invención es entiende mejor con referencia a los siguientes ejemplos, que no pretenden limitar la invención a las realizaciones específicas. Ejemplo 1: Identificación de líneas celulares positivas y negativas al antígeno por ensayos de unión por citometría deflujo
55 [00201] Se usó un análisis citométrico de flujo para localizar el epítopo de DS6, CA6, en la superficie celular. Las líneas celulares humanas se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC) con la excepción deOVCARS (Kearse et al., Int. J. Cancer 88(6):866-872 (2000)), las células OVCAR8 y IGROV1 (M. Seiden,Massachusetts General Hospital). Todas las células se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con L-glutamina 4mM, 50 U/ml de penicilina, 50 µg/ml de estreptomicina (Cambrex Bio Science, Rockland, ME) y suero bovino fetal al
60 10% v/v (Atlas Biologicals, Fort Collins, CO), mencionado a partir de ahora como medio de cultivo. Las células se mantuvieron en un incubador humidificado a 37C, al 5% de CO2.
[00202] Las células (1-2 x 10-5 células/pocillo) se incubaron en hielo durante 3-4 h, con concentraciones diluidasen serie del anticuerpo DS6 preparado en tampón FACS (suero de cabra al 2%, RPMI) en placas de 96 pocillos. Las65 células se agitaron en una centrífuga de sobremesa a 1500 rpm durante 5 min. a 4ºC. Después de eliminar el medio, los pocillos se volvieron a cargar después con 150 µl de tampón FACS. Después se repitió la etapa de lavado. Elanticuerpo de cabra anti-IgG de ratón marcado con FITC (Jackson Immunoresearch) se diluyó 1:100 en tampón FACS y se incubó con las células durante 1 h en hielo. La placa se cubrió con una lámina metálica para evitar lafotodecoloración de la señal. Después de dos lavados, las células se fijaron con formaldehído al 1% y se analizaron
70 en un citómetro de flujo.
[00203] De forma predominante, el epítopo CA6 se encontró en líneas celulares de origen ovárico, mamario,cervical, y pancreático (Tabla 3) como se había predicho a partir de la inmunohistoquímica del tumor. Sin embargo,algunas líneas celulares de otros tipos de tumor mostraban una expresión limitada de CA6. El anticuerpo DS6 se
75 une con una KD aparente de 135,6 pM (en células PC-3, Tabla 3). La fluorescencia media máxima (Tabla 3) de las curvas de unión (Figura 1) en las líneas celulares positivas al antígeno sugiere la densidad relativa del antígeno.
Tabla 3 Línea celular Tejido Antígeno MMF* Kd aparente (M) Línea celular Tejido Antígeno MMF* Kd aparente (M)
HL-60 Sangre Caov-3 Ovario + 465,20 5,478 x 10-9 Jurkat Sangre Caov-4 Ovario + 149,00 4,043 x 10-9 Namalwa Sangre ES-2 Ovario -U-937 Sangre IGROVI Ovario -T98G Cerebro + 35,94 1,775 x 10-10 OV-90 Ovario -BT-20 Mama + 232,20 9,142 x 10-10 OVCAR-3 Ovario -BT-474 Mama OVCAR5 Ovario + 97,10 1,473 x 10-9 BT-483 Mama + 1911,00 1,366 x 10-8 OVCAR8 Ovario -BT-549 Mama + 71,39 1,046 x 10-9 PA-1 Ovario -CAMA-1 Mama + 12,46 2,330 x 10-9 SK-OV-3 Ovario -MCF-7 Mama + 81,41 2,890 x 10-9 SW 626 Ovario -MDA-MB-157 Mama + 8,635 1,972 x 10-10 TOV-112D Ovario -MDA-MB-231 Mama + 31,85 1,460 x 10-9 TOV-21G Ovario + 87,79 3,067 x 10-10 MDA-MB-468 Mama + 71,58 8,127 x 10-10 AsPC-1 Páncreas -SK-BR-3 Mama BxPC-3 Páncreas + 79,99 5,263 x 10-9 T-47D Mama + 559,58 3,424 x 10-9 HPAC Páncreas + 2228,00 2,348 x 10-8 ZR-75-1 Mama + 811,67 4,299 x 10-9 HPAF-II Páncreas + 266,50 2,81 x 10-9 HeLa Cuello del útero + 242,50 6,938 x 10-10 Hs766T Páncreas + 182,90 2,319 x 10-9 KB Cuello del útero + 119,56 1,110 x 10-9 MIAPaCa2 Páncreas -WISH Cuello del útero + 1133,55 2,380 x 10-9 MPanc96 Páncreas -Colo205 Colon SU.86.86 Páncreas + 36,86 1,043 x 10-9 DLD-1 Colon SW1990 Páncreas + 36,17 3,679 x 10-10 HCT-8 Colon PC-3 Próstata + 24,81 1,356 x 10-10 HT-29 Colon A375 Piel -Caki-1 Riñón SKMEL28 Piel -A549 Pulmón KLE Útero -SW2 Pulmón
*fluorescencia media relativa máxima promedio
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75
Ejemplo 2: Caracterización del epítopo de DS6
[00204] Las propiedades del antígeno de DS6, CA6, se analizaron por inmunotransferencia de los dot blot delisados celulares CA6-positivos (Caov-3) que se digirieron con tratamientos proteolíticos (pronasa y proteinasa K) y/oglucolíticos (neuraminidasa y ácido peryódico). Para los controles positivos, se ensayaron otros anticuerpos que reconocen una diversidad de tipos de epítopos sobre los lisados de líneas celulares positivas al antígeno (Caov-3 y CM1; Colo205 y C242; SKMEL28 y R24). CM1 es un anticuerpo que reconoce un epítopo proteico del dominio derepetición en tándem de cantidad variable (VNTR) de Muc-1 y, por tanto, proporciona un control para un epítopoproteico. C242 se une a un nuevo glucótopo dependiente de ácido siálico específico de cáncer colorrectal en Muc-1(CanAg) que proporciona un control para un glucótopo en una proteína. R24 se une al gangliósido GD3 que es específico de melanoma y por tanto proporciona un control para un glucótopo en una estructura no proteica.
[00205] Se sembraron células Caov-3, Colo205, y SKMEL28 en placas de cultivo tisular de 15 cm. El medio decultivo (30 ml/placa) se renovó el día antes de la lisis. Un tampón RIPA modificado (Tris-HCl 50 mM pH 7,6, NaCl150 mM, EDTA 5 mM, NP40 al 1%, desoxicolato sódico al 0,25%), inhibidores de proteasa (PMSF, Pepstatina A, Leupeptina, y Aprotinina), y PBS se pre-enfriaron en hielo. Después de aspirar el medio e cultivo de las placas, lascélulas se lavaron dos veces con 10 ml de PBS enfriado. Todas las etapas posteriores se realizaron en hielo y/o enun sala fría a 4ºC. Después aspirar el último lavado de PBS, las células se lisaron en 1-2 ml de tampón de lisis(tampón RIPA con inhibidores de proteasa recién añadidos a una concentración final de PMSF 1 mM, Pepstatina A 1 µM, 10 µg/ml de Leupeptina, y 2 µg/ml de Aprotinina). Los lisados se rasparon de las placas usando un raspador celular y se trituraron pipeteando las suspensiones arriba y abajo (5-10 veces) con una aguja 18G. Los liados serotaron durante 10 min. y después se centrifugaron en un microcentrífuga al máximo (13K rpm) durante 10 min. Lossedimentos se desecharon y los sobrenadantes se ensayaron después usando un kit de ensayo de proteínas deBradford (Biorad).
[00206] Los lisados (2 µl) se pipetearon directamente sobre membranas de nitrocelulosa de 0,2 mm secas. Lasmanchas de transferencia se dejaron secar al aire durante aproximadamente 30 min. La membrana se seccionó entrozos que contenían cada uno una única mancha. Las machas de transferencia se incubaron en presencia depronasa (1 mg/ml de enzima, Tris 50 mM pH 7,5, CaCl2 5 mM), proteinasa K (1 mg/ml de enzima, Tris 50 mM pH 7,5, CaCl2 5 mM), neuraminidasa (20 mU/ml de enzima, acetato sódico 50 mM pH 5, CaCl2 5 mM, 100 µg/ml deBSA) o ácido peryódico (20 mM, acetato sódico 0,5 M pH 5) durante 1 h a 37ºC. Los reactivos se adquirieron deRoche (enzimas) y VWR (ácido peryódico). Las membranas se lavaron (5 min.) en tampón de lavado T-TBS (Tween 20 al 0,1%, 1XTBS), se bloquearon en tampón de bloqueo (BSA al 3%, T-TBS) durante 2 h a temperatura ambiente,y se incubaron durante una noche con 2 µg/ml de anticuerpo primario (es decir DS6, CM1, C242, R24) en tampón debloqueo a 4ºC. Las membranas se lavaron tres veces durante 5 min. en T-TBS y después se incubaron en anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de ratón (o humana) conjugado con (Jackson Immunoresearch; dilución1:2000 en tampón de bloqueo) durante 1 h a temperatura ambiente. Las inmunotransferencias se lavaron tres vecesy se revelaron usando un sistema ECL (Amersham).
[00207] Las inmunotransferencias (Figura 2) de los lisados de control digeridos mostraron que la señal de CM1 se destruía por los tratamientos proteolíticos mientras que las señales de las digestiones glucolíticas no estaban afectadas como se esperaría para un anticuerpo que reconoce un epítopo proteico. La señal de C242 se destruyópor cualquiera de los tratamientos, proteolítico o glucolítico, como se esperaría para un anticuerpo que reconoce un glucótopo hallado en una proteína. La señal de R24, no afectada por los tratamientos proteolíticos, se suprimía conlos tratamientos con neuraminidasa o peryodato como se esperaba para un anticuerpo que reconoce un gangliósido. La inmunotransferencia de DS6 de los dot blot del lisado Caov-3 digerido mostró pérdida de señal después deltratamiento con cualquiera de los compuestos, proteolíticos y glucolíticos. Por tanto, como C242, DS6 se une a unepítopo de carbohidrato sobre un núcleo proteico. Además, la señal de la inmunotransferencia de DS6 era sensibleal tratamiento con neuraminidasa. Por lo tanto, CA6, como CanAg, es un glucótopo dependiente de ácido siálico.
[00208] Para confirmar la naturaleza de carbohidrato de CA6, el lisado Caov-3 se transfirió en manchas sobre una membrana PVDF y se trató con el agente químico desglucosilante, ácido trifluorometanosulfónico (TFMSA), enatmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente durante 5 minutos. La transferencia se lavó con T-TBS y seinmunotransfirió con CM1 o DS6 (Figura 3). La señal de DS6 se destruyó después del tratamiento ácido lo queproporciona evidencias adicionales de que CA6 es un glucótopo. La potenciación de la señal de CM1 después del tratamiento con TFSMA indica que el tratamiento ácido no afectaba a la proteína en el filtro y sugiere que eltratamiento glucolítico exponía el epítopo proteico reconocido por CM1.
[00209] Para dilucidar adicionalmente la estructura del carbohidrato sobre el que reside CA6, los dot blot sedigirieron con N-glucanasa, O-glucanasa, y/o sialidasa (Figura 4). Se incubaron lisados de células Caov-3 (100 µg,30 µl) a 100ºC durante 5 min. con 2,5 µl de tampón de desnaturalización (Glyko) que contiene SDS y βmercaptoetanol. Los lisados desnaturalizados después se digirieron con 1 µl de N-glucanasa, O-glucanasa, y/osialidasa A (Glyko) a 37ºC durante 1 h. Los lisados digeridos después se transfirieron en manchas (2 µl) sobre nitrocelulosa y se inmunotransfirieron como se ha descrito anteriormente.
[00210] La N-glucanasa no tenía efecto aparente sobre las señales de inmunotransferencia de DS6. Sin embargo,las muestras digeridas con sialidasa no producían señal. Como la O-glucanasa no puede digerir carbohidratos O-unidos sialilados sin pretratamiento con sialidasa, la señal de DS6 de las muestras procesadas con O-glucanasasola no estaría afectada. La N-glucanasa, en contraste, no requiere pretratamiento con ninguna enzima glucosídica para su actividad. El hecho de que el tratamiento con N-glucanasa no afecte a la señal de DS6 sugiere que el epítopo CA6 muy probablemente está presente en cadenas de carbohidrato O-unidas sialiladas.
Ejemplo 3: Esclarecimiento del antígeno sobre el que se encuentra el epítopo CA6
[00211] Para identificar el antígeno sobre que se encuentra el sialoglucótopo CA6, se analizaron inmunoprecipitados de DS6 por SDS-PAGE y transferencia de Western. Los sobrenadantes del lisado celular (1
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
ml/muestra; 3-5 mg de proteína) se pre-aclararon con perlas de Proteína G (30 µl), se equilibraron con 1 ml detampón RIPA, durante 1-2 h, con rotación, a 4ºC. Todas las etapas posteriores se realizaron en hielo y/o en una salafría a 4ºC. Las perlas pre-aclaradas se agitaron brevemente (2-3 s) en una microcentrífuga. Los sobrenadantes preaclarados se transfirieron a tubos nuevos y se incubaron durante una noche con 2 µg de DS6, con rotación. Se añadieron perlas de Proteína G nuevas y equilibradas (30 µl) a los lisados y se incubaron durante 1 h, con rotación. Las suspensiones de perlas-lisado se agitaron brevemente en una microcentrífuga y las muestras de los lisadospost-inmunoprecipitación se cogieron opcionalmente. Las perlas se lavaron 5-10 veces con 1 ml de tampón RIPA.
[00212] Las muestras de inmunoprecipitadas DS6 después se digirieron con 30 µl de neuraminidasa (20mU de neuraminidasa (Roche), acetato sódico 50 mM pH 5, CaCl2 5 mM, 100 µg/ml de BSA) o 30 µl de ácido peryódico (ácido peryódico 20 mM (VWR), acetato sódico 0,5 M pH 5) durante 1 h a 37ºC. Después se resuspendieron en 30 µl de tampón de carga de muestra 2X (que contenía β-mercaptoetanol). Las perlas se hirvieron durante 5 min. y lossobrenadantes de tampón de carga se cargaron en geles de Tris-Glicina al 4-12% o 4-20% (Invitrogen). Los geles seprocesaron en tampón de procesamiento de electroforesis de Laemmli a 125 V durante 1,5 h. Las muestras del gelse transfirieron, durante una noche a 20 mA, sobre membranas de nitrocelulosa de 0,2 µm (Invitrogen) usando un aparato de transferencia Mini Trans-blot (Biorad). Las membranas se inmunotransfirieron con DS6 como se hadescrito anteriormente en el Ejemplo 2.
[00213] Como alternativa, las perlas inmunoprecipitadas se desnaturalizaron primero y después se digirieronenzimáticamente con N-glucanasa, O-glucanasa y/o sialidasa A (Glyko). Las perlas se resuspendieron en 27 µl de tampón de incubación y 2 µl de solución de desnaturalización (Glyko) y se incubaron a 100ºC durante 5 minutos. Después de enfriar a temperatura ambiente, se añadió solución detergente (2 µl) y las muestras se incubaron con 1 µl de N-glucanasa, O-glucanasa, y/o sialidasa A a 37ºC durante 4 h. Después de añadir tampón de carga de muestra5X (7 µl), las muestras se hirvieron durante 5 min. Las muestras se sometieron a SDS-PAGE y se inmunotransfirieron como se ha descrito anteriormente.
[00214] DS6 inmunoprecipita una banda de proteína de >250 kDa que puede observarse en lisados celularespositivos al antígeno (Figura 5A, B, y C). En algunas líneas celulares (es decir, T-47D), se observa un doblete. Labanda de >250 kDa se suprimía en inmunoprecipitados de Caov-3 que se trataron con neuraminidasa o ácidoperyódico (Figura 5 A y B) lo que sugiere que el epítopo CA6 reside en la banda de >250 kDa. También se ha demostrado que la banda de >250 kDa es insensible al tratamiento con N-glucanasa de los inmunoprecipitados,coherente con que CA6 reside en un carbohidrato O-unido (Figura 5F). El hecho de que DS6 no inmunoprecipite dicha banda de células negativas al antígeno de DS6 (Figura 5D y E) apoya adicionalmente que la banda de 250kDa es el antígeno CA6.
[00215] Varias líneas de evidencias sugerían que el antígeno CA6 era Muc1. A causa del alto peso molecular y lasensibilidad a enzimas glucolíticas específicas de carbohidrato O-unido, parece probable que el antígeno CA6 fuerauna mucina. La sobre-expresión de mucina está bien caracterizada en tumores particularmente de mama y ovario,coherente con las reactividades tumorales principales de DS6. Además, CA6, como CanAg (un sialoglucótopo enMucI), no es susceptible a la precipitación con ácido perclórico, lo que sugiere que el antígeno CA6 está muy Oglucosilado. La observación de que en algunas líneas celulares que expresan DS6, DS6 inmunoprecipitaba undoblete de >250 kDa sugería que CA6 era Muc1. Una característica distintiva de Muc1 en seres humanos es lapresencia de dos alelos Muc1 distintos que difieren en la cantidad de repeticiones en tándem, lo que provoca laexpresión de dos proteínas Muc1 de diferentes pesos moleculares.
[00216] Para ensayar si CA6 se halla en Muc1, los inmunoprecipitados con DS6 del lisado Caov-3 se sometierona SDS-PAGE y se inmunotransfirieron con DS6 o un anticuerpo contra la VNTR de Muc1, CM1. Como puede observarse en la Figura 6A, CM1 reacciona fuertemente con la banda de >250 kDa inmunoprecipitada por DS6. Enla Figura 6B, los inmunoprecipitados con DS6 y CM1 del lisado de células HeLa muestran el mismo doblete de >250kDa cuando se inmunotransferían con DS6 o CM1. Estos resultados indican que el epítopo CA6 está, de hecho, localizado en la proteína Muc-1. El doblete con DS6 observado en células HeLa (y T-47D) puede explicarse por elhecho de que la expresión de Muc-1 está dirigida por distintos alelos que tienen cantidades variables de repeticionesen tándem.
[00217] Aunque CM1 y DS6 se unen a la misma proteína Muc-1, son epítopos distintos. La desglucosilación química de los dot blot del liado Caov-3 por ácido trifluorometanosulfónico (TFMSA) suprimía la señal de DS6(Figura 3). Sin embargo, este mismo tratamiento potenciaba la señal de CM1. La desglucosilación puede haber puesto de manifiesto epítopos ocultos para el anticuerpo CM1. Además, una comparación de los resultados de uniónpor citometría de flujo de DS6 y CM1 (Tabla 4) demuestra que el epítopo CA6 no existe en todas las células queexpresan Muc1. Es interesente observar que el epítopo CA6 no se expresa en Colo205 (Tabla 3), una línea celular que se sabe que expresa altos niveles del sialoglucótopo CanAg de Muc1.
Tabla 4 DS6 CM1 Línea celular MMF* Kd aparenteMMF* Kd aparente
(M) (M)
BT549 71,39 1,046 x 10-09 187,90 6,056 X 10-09
DS6 positiva y CM1CaOV3 465,20 5,478 x 10-09 1031,00 7,479 x 10-09
positiva HeLa 242,50 6,938 x 10-10 334,80 2,907 x 10-09
KB 119,56 1,110 x 10-09 338,00 5,345 x 10-09
MCF7 81,41 2,890 x 10-09 1023,00 8,694 x 10-09
DS6 negativa y CM1 KLE 27,48 -561,70 8,156 x 10-09
positiva OVCAR3 21,19 -192,50 5,949 x 10-09
SKOV3 17,53 -49,41 6,246 x 10-09 *MMF = fluorescencia relativa media máxima
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Ejemplo 4: Análisis cuantitativo de epítopo CA6 circulante
[00218] Como el epítopo CA6 reside en Muc1, una molécula que se sabe que es circulante en el torrentesanguíneo en muchos pacientes con cáncer, se emprendió un enfoque cuantitativo para determinar si dichos niveles serían prohibitivos para la terapia con anticuerpo DS6. Se cree que la unión del anticuerpo en circulación al antígeno conduce a una rápida eliminación de los complejos inmunes de la sangre. Si se elimina rápidamente una parte significativa de la dosis de anticuerpo administrada de la circulación, es probable que la cantidad que alcanza eltumor esté disminuida produciendo una actividad anti-tumoral disminuida del agente terapéutico de anticuerpo. Cuando el anticuerpo se conjuga con un compuesto citotóxico muy potente la rápida eliminación del conjugado podría aumentar potencialmente la toxicidad no específica. Por tanto, en el caso de conjugados de anticuerpo-fármaco pequeño tales como DS6-DM1, podría esperarse que los altos niveles de antígeno circulante redujeran elefecto anti-tumoral y aumentaran la toxicidad limitante de la dosis.
[00219] Ensayos clínicos recientes de agentes terapéuticos de anticuerpo ha generado información en cuanto al impacto de la concentración de antígeno circulante sobre la farmacocinética. Por ejemplo, en ensayos clínicos contrastuzumab (Herceptina), un anticuerpo usado para el tratamiento de cáncer de mama metastásico que expresaher2/neu, la farmacocinética de la eliminación de trastuzumab se mostraba inalterada cuando el nivel de Her2/neucirculante era menor de 500 ng/ml (Pegram et al., J. Clin. Oncol. 16(S):2659-71 (1998)). Suponiendo un pesomolecular de Her2/neu circulante de 110.000 Dalton, una concentración molar de Her2/neu circulante por debajo de 4,5 nM parece tener poca influencia sobre la farmacocinética.
[00220] En otro ejemplo, un ensayo clínico con cantuzumab mertansina (huC242-DM1) indicó que no habíacorrelación con los niveles pretratamiento de CanAg circulante (epítopo de C242) y la farmacocinética de la eliminación del anticuerpo (Tolcher et al., J. Clin. Oncol. 21(2):211-22 (2003). El epítopo CanAg, similar al epítopo CA6 reconocido por DS6, es un sialoglucótopo O-unido específico de tumor único en Muc1. Sin embargo, lanaturaleza heterogénea del epítopo CanAg hace difícil cuantificarlo en términos molares. En la población general, losalelos Muc1 varían en longitud dependiendo de la cantidad de repeticiones en tándem en el dominio de repetición entándem de cantidad variable (VNTR). Existen varios sitios para la glucosilación O-unida en cada repetición entándem. Además de la complejidad de la expresión de CanAg está la variación entre células en la actividad glucosil transferasa inherente. Por tanto, es posible una amplia serie de epítopos CanAg por molécula Muc1 incluso en unúnico paciente. Además, la proporción de epítopo CanAg por molécula Muc1 será diferente dentro de una poblaciónde pacientes. Por esta razón, se mide el CanAg circulante en muestras séricas por ELISA tipo sándwich donde C242captura la Muc1 circulante con epítopo CanAg y se detecta por un sistema de C242 biotinilado/estreptavidina HRP.El CanAg circulante se cuantifica en unidades normalizadas (U) proporcionales a la cantidad de epítopos por ml de suero en lugar de por una concentración molar de Muc1. Por analogía, sucede una situación similar para lacuantificación de epítopos CA6 circulantes. En contraste, para trastuzumab existe solamente un epítopo pormolécula her2/neu circulante, lo que simplifica enormemente la cuantificación del antígeno circulante. [00221] Para relacionar los niveles del epítopo circulante CA6 con los encontrados en ensayos clínicos contrastuzumab y cantuzumab mertansina, se desarrolló un método para obtener las concentraciones molares de epítopos circulantes complejos tales como sialoglucótopos en Muc1. Primero, se estableció un ensayo ELISA tiposándwich simple para DS6. Se muestra una representación del ensayo en la Figura 7A. Se usó DS6 para capturar Muc1 que tiene el epítopo CA6. Como cada molécula Muc1 tiene múltiples epítopos CA6, también se usó DS6biotinilado como anticuerpo indicador. El DS6 biotinilado unido a CA6 capturado se detectó por estreptavidina-HRPusando ABTS como sustrato. El epítopo CA6 se capturó de suero de un paciente con cáncer de ovario o de patrones que provienen de un kit de ensayo de Muc1 disponible en el mercado (CA15-3) usado para controlar Muc1 circulanteen pacientes con cáncer de mama. Las unidades de DS6/ml se establecieron arbitrariamente a las unidades depatrón CA15-3/ml.
[00222] En la Figura 7B se muestran los resultados del ELISA tipo sándwich de DS6 en el que se usaron patrones CA15-3. La curva generada es muy similar a la obtenida con patrones CA15-3 en el ensayo CA15-3. Para convertirlas unidades de DS6/ml en una concentración molar de CA6, se requiere una curva patrón para DS6 biotinilado queconvierte la señal en picogramos de DS6. Suponiendo una estequiometría uno a uno entre el epítopo CA6 y elanticuerpo DS6 biotinilado y un peso molecular de 160.000 Dalton para el DS6 biotinilado, pueden computarse losmoles de CA6 capturado por volumen de muestra añadida.
[00223] En la Figura 8A y B están las representaciones de dos medios alternativos para generar una curva patrónpara DS6 biotinilado. En la Figura 8A, se usa anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG de ratón para capturar el DS6biotinilado que a su vez se detecta de un modo idéntico al usado en el ensayo ELISA tipo sándwich mostrado en laFigura 7. En el método mostrado en la Figura 8B, el DS6 biotinilado se siembra directamente en la placa ELISA y se detecta como en la Figura 8A. Como se observa en la Figura 8C, las curvas patrón de DS6 biotinilado generadas porcada método están en buena concordancia.
[00224] En la Tabla 5 se muestra el análisis de las muestras séricas de pacientes con cáncer de ovario paradiversos antígenos circulantes. El ELISA CA125 generalmente se usa para controlar el tratamiento de pacientes con cáncer de ovario midiendo las unidades de CA125 circulante/ml. El estado de CA125 se proporcionó con lasmuestras séricas. El ELISA CA15-3 generalmente se usa para controlar el tratamiento de pacientes con cáncer demama midiendo las unidades/ml de Muc1 circulante usando anticuerpos de captura y detección que reconocen epítopos distintos de los reconocidos por DS6. En la Tabla 5, se mide CA15-3 en muestras séricas de pacientes concáncer de ovario.
Tabla 5 Suero CA1251 CA15-31 DS62 DS63 DS64 Nº (U/ml) (U/ml) (U/ml) (pM) (pM)
4
72,80 117,72 29,79 52,13 188,94
5
3651,90 98,19 567,02 654,44 >2560,00
6
930,50 87,08 504,15 667,56 2505,00
7
76,00 72,70 135,65 246,94 778,25
8
32,50 18,44 39,96 65,19 239,88
9
551,70 292,39 >975,61 1512,31 >2560,00
10
90,00 42,40 49,48 85,19 305,88
11
200,50 60,58 92,32 152,38 526,75
12
283,00 35,67 83,65 135,81 485,06
13
197,50 20,61 35,92 61,06 216,25
14
100,60 6,13 12,39 23,19 88,06
15
34,60 59,18 199,85 286,63 1228,56
17
196,40 56,75 66,53 130,44 405,88
18
16,90 30,45 34,43 60,81 223,69
19
22,00 263,93 118,98 191,69 728,94
22
110,70 21,44 16,46 29,94 111,38
1 determinado por kit ELISA comercial 2 determinado por patrones CA15-3 comerciales (1 U CA15-3 = 1 U DS6) 3 anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón y curva patrón de biotina-DS6 4 curva patrón de biotina-DS6
[00225] Para los valores de CA15-3 presentados en la Tabla 5, se usó un kit de inmunoensayo enzimático CA15-3disponible en el mercado de CanAg Diagnostics. Para las unidades de DS6/ml, se generó una curva patrón usando los patrones CA15-3 (del kit de inmunoensayo enzimático CA15-3 de CanAg Diagnostics) en el ELISA tipo sándwich
5 de DS6. Las unidades de DS6/ml se establecieron arbitrariamente igual a las unidades de CA15-3/ml. En las dos últimas columnas se calculó la concentración de CA6 circulante picomolar (pM) usando las curvas patrón de DS6biotinilado mostradas en la Figura 8C.
[00226] Para el análisis cuantitativo de los niveles de CanAg, los niveles séricos de CanAg fueron los presentados
10 para pacientes que participaban en un ensayo clínico con cantuzumab mertansina antes del tratamiento (Tolcher et al., J. Clin. Oncol. 21(2):211-22 (2003)). Se usó un ensayo ELISA análogo al descrito para DS6 para generar unacurva patrón de CanAg usando patrones CanAg. Se usó C242 para capturar los patrones CanAg. La detección deCanAg capturado se consiguió usando el indicador C242 biotinilado seguido de revelado con estreptavidina-HRPusando ABTS como sustrato. Se construyó una curva patrón de C242 biotinilado, como se hizo para DS6 biotinilado,
15 que permitía la conversión de unidades/ml a una concentración molar de epítopos CanAg circulantes. En la Tabla 6 se presentan los niveles de CanAg de pacientes del ensayo clínico con cantuzumab mertansina junto con lasconcentraciones molares calculadas correspondientes de CanAg circulante.
20 Tabla 6
CanAg1 (U/ml)
CanAg2 (pM) CanAg3 (pM)
31240
19185,7 34592,8
8687
3535 9619,3
7456
4579 8256,2
3686
2263,7 4081,6
1447
888,7 1602,3
1262
775 1397,4
718
441 795,1
547
335,9 605,7
394
242 436,3
381
234 421,9
329
202,1 364,3
322
197,8 356,6
306
187 338,8
284
174,4 314,5
247
151,7 273,5
242
148,6 268
229
140,6 253,6
227
139,4 251,4
184
113 203,7
120
73,7 132,9
107
65,7 118,5
100
61,4 110,7
81
49,7 89,7
81
49,7 89,7
67
41,1 74,2
53
32,5 58,7
45
27,6 49,8
43
26,4 47,6
39
24 43,2
36
22,1 39,9
24
14,7 26,6
18
11,1 19,9
17
10,4 18,8
<10 <10 <10 <10
6,1 6,1 6,1 6,1 11,3 11,3 11,3 11,3
1 niveles pre-tratamiento de CanAg circulante medidos por ELISA tipo sándwich 2 anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón y curva patrón de biotina-C2423 curva patrón de biotina-C242
[00227] Una comparación de los niveles pM de CA6 circulante en pacientes con cáncer de ovario con loscalculados para CanAg circulante en pacientes con cáncer CanAg-positivo muestra que, en general, los niveles deCA6 circulante son similares a los niveles de CanAg circulante. Además, solamente 2 de las 16 muestras séricas de5 pacientes con cáncer de ovario tienen potencialmente niveles de CA6 mayores de 4,5 nM (muestras séricas 5 y 9 para las que la señala estaba fuera del rango de la curva patrón), el nivel por encima del cual se observaba una farmacocinética alterada de herceptina en ensayos clínicos con pacientes con cáncer de mama Her2/neu-positivo. Se observaron niveles de CanAg por encima de 4,5 nM solamente en 3 de los 37 pacientes del ensayo clínico. Eneste ensayo clínico no hubo correlación con los niveles de CanAg circulante y la eliminación más rápida de
10 cantuzumab mertansina. Sin embargo, el paciente con el mayor nivel de CanAg (31240 U/ml) solamente se muestreó durante 8 horas después de la transfusión. Estos resultados indican que ciertos epítopos de Muc1, talescomo CA6 y CanAg, aunque son circulantes en pacientes con cáncer, no son circulantes a niveles prohibitivos para el tratamiento terapéutico con anticuerpo.
15 Ejemplos 6: Clonación de las regiones variables del anticuerpo DS6 murino
[00228] Los anticuerpos monoclonales murinos tales como DS6 tienen utilidad limitada en un entorno clínico porque se reconocen como extraños por el sistema inmune humano. Los pacientes desarrollan rápidamenteanticuerpos humanos anti-ratón (HAMA) lo que provoca que rápida eliminación de los anticuerpos murinos. Por esta
20 razón, la región variable de DS6 murino (muDS6) se revistió para producir anticuerpos DS6 humanizados (huDS6).
[00229] Se clonaron las regiones variables del anticuerpo DS6 murino por RT-PCR. El ARN total se purificó de unmatraz T175 confluyente de células de hibridoma DS6 usando el kit Qiagen RNeasy miniprep. Las concentracionesde ARN se determinaron por espectrofotometría UV y se hicieron reacciones RT con 4-5 µg de ARN total usando el
25 kit Gibco Superscript II y cebadores hexaméricos aleatorios.
[00230] Las reacciones de PCR se realizaron con cebadores degenerados basados en los descritos en Wang Z etal., J Immunol Methods. Ene 13; 233 (1-2): 167-77 (2000). La mezcla de reacción RT se usó directamente parareacciones de PCR degeneradas. Se usaron el cebador de cadena ligera 3', HindKL,
30 (TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC) (SEC ID Nº: 25)y el cebador de cadena pesada 3', BamIgG1, (GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC) (SEC ID Nº: 26), y los cebadores de PCR del extremo 5'fueron SacIMK
35 (GGGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA) (SEC ID Nº: 27) para la cadena ligera y una mezcla igual de EcoR1MH1 (CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC) (SEC ID Nº: 28) y EcoR1MH2 (CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG) (SEC ID Nº: 29) para la cadena pesada (bases mixtas: H =A+T+C, S = G+C, Y = C+T, K = G+T, M = A+C, R = A+G,W = A+T, V = A+C+G, N = A+T+G+C).
40 [00231] Las reacciones de PCR fueron convencionales excepto en que se suplementaron con DMSO al 10% (las mezclas de reacción de 50 µl contenían concentraciones finales de tampón de reacción 1X (ROCHE), 2 mM de cada dNTP, 1 mM de cada cebador, 2 µl de reacción RT, 5 µl de DMSO, y 0,5 µl de Taq (ROCHE)). Las reacciones dePCR se realizaron en un termociclador MJ Research usando un programa adaptado de Wang Z et al., (J ImmunolMethods. Ene 13; 233 (1-2): 167-77 (2000)): 1) 94ºC, 3 min.; 2) 94ºC, 15 segundos; 3) 45ºC, 1 min.; 4) 72ºC, 2 min.;
45 5) el ciclo de nuevo desde la etapa nº 2 29 veces; 6) acabado con una etapa de extensión final a 72ºC durante 10 min. Los productos de PCR se clonaron en pBluescript II SK+ (Stratagene) usando enzimas de restricción creadaspor los cebadores de PCR. Los servicios de secuenciación Seqwright secuenciaron los clones de cadena pesada y ligera.
50 [00232] Para confirmar las secuencias de ADNc del extremo 5', se realizaron PCR y clonaciones adicionales. Las secuencias de ADNc de cadena ligera y cadena pesada de DS6, determinadas a partir de los clones de PCRdegenerados, se introdujeron en el sitio web de búsqueda Blast de NCBI y se guardaron las secuencias delanticuerpo murino con la secuencia señal propuesta. Se diseñaron cebadores de PCR a partir de estos péptidosseñal usando tramos conservados entre las secuencias de ADN relacionadas. Se añadieron sitios de restricción
55 EcoRI a los cebadores de secuencia líder (Tabla 7) y estos se usaron en reacciones de RT-PCR como se ha descrito anteriormente.
Tabla 7
60 Cebadores degenerados de la secuencia señal de DS6
Nombre Secuencia
Cadena pesada - DS6HClead ttttgaattcaataactacaggtgtccact - SEC ID Nº: 30
Cadena ligera - KTILClead ttttgagctccagattttcagcttcctgct - SEC ID Nº: 31
65
[00233] Se secuenciaron varios clones de cadena ligera y pesada individuales para identificar y evitar posibles
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75
errores de secuencia generados por la polimerasa. Se obtuvo solamente una secuencia para los clones de RT-PCRtanto de cadena ligera como de cadena pesada. Estas secuencias fueron suficientes para diseñar cebadores quepudieran amplificar las secuencias de cadena ligera y pesada de DS6 murino que se extienden en la secuenciaseñal. Los clones posteriores a partir de estas reacciones de PCR de seguimiento confirmaron las secuencias delextremo 5' de la región variable que se habían alterado por los cebadores degenerados originales. Los resultados cumulativos de los diversos clones de ADNc proporcionaron las secuencias finales de cadena ligera y pesada deDS6 murino presentadas en la Figura 9. Usando las definiciones de Kabat y AbM, se identificaron las tres CDR de cadena ligera y cadena pesada (Figuras 9 y 10). Una búsqueda de la base de datos IgBlast de NCBI indica que laregión variable de cadena ligera del anticuerpo muDS6 deriva muy probablemente del gen de la línea germinal IgV? ap4 murino mientras que la región variable de cadena pesada muy probablemente deriva del gen de la línea germinal IgVh J558.41 murino (Figura 11).
Ejemplo 7: Determinación de los restos superficiales de la región variable del anticuerpo DS6
[00234] Las técnicas de revestimiento de anticuerpos descritas por Pedersen et al. (1994) y Roguska et al. (1996) empiezan prediciendo los restos superficiales de las secuencias variables den anticuerpo murino. Un restosuperficial se define como un aminoácido que tiene al menos un 30% de su área superficial total accesible a unamolécula de agua. En ausencia de una estructura resuelta para encontrar los restos superficiales para muDS6, sealinearon los diez anticuerpos con las secuencias más homólogas en la serie de 127 archivos de estructura deanticuerpos (Figura 12). La accesibilidad del disolvente para cada posición de Kabat se promedió para estas secuencias alineadas (Figuras 13A y B).
[00235] Las posiciones superficiales con accesibilidades promedio entre el 25% y el 35% se sometieron a unasegunda ronda de análisis comparando una subserie de anticuerpos que contenían dos restos idénticosflanqueantes en cada lado (Figuras 13A y B). Después de la segunda ronda de análisis, los 21 restos superficiales predichos para la cadena pesada de muDS6 se aumentaron a 23, añadiendo Tyr3 y Lys23 a la lista de restos conaccesibilidad superficial predicha mayor del 30%. En la mayoría de los anticuerpos revestidos se usa la definición deKabat de la CDR1 de cadena pesada, pero para DS6 se usó inadvertidamente la definición AbM durante los cálculosde modo que el resto T28 de la cadena pesada no se definió como un resto superficial flanqueante como pudierahaber sido de otro modo. La cantidad de posiciones superficiales de cadena ligera se redujo de 16 a 15 porque la accesibilidad superficial predicha de la Ala80 se redujo del 30,5% al 27,8% en la segunda ronda de análisis. Enconjunto, las secuencias variables de cadena pesada y ligera de muDS6 tienen 38 restos flanqueantes accesibles ensuperficie predichos.
Ejemplo 8: Selección de anticuerpos humanos
[00236] Las posiciones superficiales de la región variable de DS6 murino se compararon con las posicionescorrespondientes en las secuencias del anticuerpo humano en la base de datos de Kabat (Johnson G, Wu TT. Nucleic Acids Res. Ene 1; 29(1): 205-6 (2001)). Se usó el software de gestión de bases de datos de anticuerpos SR(Searle, 1998) para extraer y alinear los restos superficiales de los pares de anticuerpos humanos de cadena pesada y ligera naturales. Se eligió la superficie de la región variable del anticuerpo humano con los restos superficiales más idénticos, dando especial consideración a las posiciones que están en 5 Å de una CDR, para remplazar los restossuperficiales de la región variable del anticuerpo DS6 murino.
Ejemplo 9: Vector de expresión para anticuerpos quiméricos y humanizados
[00237] Las secuencias apareadas de cadena ligera y pesada se clonaron en un único vector de expresión demamíferos. Los cebadores de PCR para las secuencias variables humanas crearon sitios de restricción quepermitieron añadir la secuencia señal humana en el vector de clonación pBluescriptII. Las secuencias variables después pudieron clonarse en el plásmidos de expresión de mamíferos con EcoRI y BsiWI o HindIII y ApaI para la cadena ligera o la cadena pesada respectivamente (Figura 14). Las secuencias variables de cadena ligera seclonaron en fase en la región constante de IgKappa humana y las secuencias variables de cadena pesada secloraron en la secuencia de la región constante de IgGammaI humana. En los plásmidos de expresión finales,promotores CMV humanos dirigen la expresión de las secuencias de ADNc tanto de cadena ligera como de cadenapesada.
Ejemplo 10: Identificación de restos que pueden afectar negativamente a la actividad de DS6
[00238] En la mayoría de las humanizaciones hasta la fecha, se ha construido un modelo molecular del presente anticuerpo para identificar los restos próximos a una CDR como restos problemáticos potenciales. Con una cantidad en expansión de anticuerpos revestidos a partir de los cuales trabajar, la experiencia histórica es al menos tan eficaz para predecir problemas como la construcción de un modelo, así que no se construyó un modelo molecular para DS6. En su lugar, se compararon los restos superficiales de DS6 murino con los de anticuerpos previamenterevestidos y se identificaron los restos un riesgo bajo a alto de afectar a la actividad de unión del anticuerpo.
[00239] Se identificaron repetidamente series similares de restos que están en 5Å de una CDR en las estructurasde anticuerpo resueltas disponibles y los modelos moleculares de humanizaciones previas. Usando estos datos, laTabla 1 da los restos de DS6 murino que probablemente están próximos a y posiblemente en 5Å de una CDR.Muchas de estas posiciones también se han cambiado en humanizaciones previas, pero solamente la posición 74 dela cadena pesada ha producido alguna vez una pérdida de la actividad de unión. El resto murino se retuvo en esta posición tanto en huC242 como en huB4 para conservar la actividad de unión del anticuerpo murino. Por otro lado,esta misma posición se cambió al resto humano correspondiente en 6.2G5C6 humanizado sin pérdida de actividad(6.2G5C6 es el anticuerpo anti-IGF1-R a menudo mencionado simplemente como anti-C6). Aunque cualquiera de losrestos de la Tabla 1 podría presentar un problema en el anticuerpo humanizado, el resto P73 de la cadena pesada será de particular preocupación debido a experiencias previas en esta posición.
Ejemplo 11: Selección de la superficie humana más homóloga
[00240] Las superficies del anticuerpo humano candidato para el revestimiento de muDS6 se extrajeron de labase da datos de secuencias de anticuerpos de Kabat usando el software SR. Este software proporciona una 5 interfaz para la búsqueda solamente de posiciones de restos especificados frente a la base de datos de anticuerpos. Para conservar los pares naturales, se compararon los restos superficiales de las cadenas tanto ligera como pesada.Se alinearon las superficies humanas más homólogas de la base de datos de Kabat para clasificar la identidad desecuencia. Las primeras 3 superficies alineadas por el software SR de la base de datos de Kabat se dan en la Tabla
2. Después se compararon las superficies para identificar qué superficies humanas requerirían los mínimos cambios
10 en los restos identificados en la Tabla 1. En anticuerpo anti-Rh(D), 28E4 (Boucher et al., 1997), requiere la mínima cantidad de cambios de restos superficiales (11 en total) y solamente 3 de estos restos se incluyen en la lista derestos problemáticos potenciales. Como el anticuerpo 28E4 proporciona la superficie humana más homóloga, es elmejor candidato para revestir muDS6.
15 Ejemplo 12: Construcción de las secuencias de ADN para anticuerpos DS6 humanizados
[00241] Los 11 cambios de restos superficiales para DS6 se hicieron usando mutagénesis por PCR. Lamutagénesis por PCR se realizó sobre los clones de ADNc de la región variable de DS6 murino para construir el genDS6 humano revestido. Se diseñaron series de cebadores de humanización para hacer los cambios de aminoácidos
20 necesarios para revestir DS6, mostrados a continuación en la Tabla 8.
Tabla 8
Nombre del cebador
Secuencia del cebador
DS6HCapa
cgatgggcccttggtggaggctgcagagacagtgaccaga SEC ID Nº: 32
DS6LCBsi
ttttcgtacgtttcagctccagcttggt SEC ID Nº: 33
DS6HC5end
caggtgtacactcccaggcttatctccagcagtct SEC ID Nº: 34
huC6HCApa
cgatgggcccttggtggaggcggcagagacagtgaccaga SEC ID Nº: 35
ds6Ic5et
caggtgtacactccgagattgttctcacccagtctccagcaacc atgtctgcatct SEC ID Nº: 36
ds6LCr18
ggcactgcaggttatggtgaccctctcccctggaga SEC ID Nº: 37
ds6lcs77f
caatcagcagcatggaggctgaaga SEC ID Nº: 38
ds6lcs77r
gcctccatgctgctgattgtgaga SEC ID Nº: 39
DS6HCvvkp
caggtgtacactcccaggctcagctcgtgcagtctggggctg aggtggtgaagcccggggcctcagt SEC ID Nº: 40
DS6HCt
ttgactgcagacacatcctccagcaca SEC ID Nº: 41
ds6hcQT
gtgtctgcagtcaatgtggccttgccctggaacttctgat SEC ID Nº: 42
huDS6HCapa
cgatgggcccttggtggaggcggcagagacagtgacaaga SEC ID Nº: 43
[00242] Las reacciones de PCR fueron convencionales excepto en que se suplementaron con DMSO al 10% (las
25 mezclas de reacción de 50 µl contenían concentraciones final de tampón de reacción 1X (ROCHE), 2 mM de cada dNTP, 1 mM cada cebador, 100 ng de molde, 5 µl de DMSO, y 0,5 µl de Taq (ROCHE)). Se procesaron en untermociclador MJ Research con el siguiente programa: 1) 94ºC, 1 min.; 2) 94ºC, 15 segundos; 3) 55ºC, 1 min.; 4)72ºC, 1 min.; 5) el ciclo de nuevo desde la etapa nº 2 29 veces; 6) acabado con una etapa de extensión final a 72ºCdurante 4 min. Los productos de PCR se digirieron con sus enzimas de restricción correspondientes y se clonaron en
30 los vectores de clonación pBluescript. Los clones se secuenciaron para confirmar los cambios de aminoácidos.
[00243] Como el cambio del resto P73 de la cadena pesada ha causado problemas en el pasado, se construyerondos versiones de la cadena pesada, una con el 28E4 T73 humano y una con la retención de P73 murino. Los otros10 restos superficiales se cambiaron del resto muro al resto 28E4 humano en ambas versiones de DS6 humanizado35 (Tabla 2). De acuerdo con el método de denominación habitual, la versión más humana es la versión 1.0 ya que tiene los 11 restos superficiales humanos. La versión de cadena pesada que tiene el P73 murino se llama versión
1.2 en caso de que se requieran versiones adicionales, de modo que la versión 1.1 se reserva para una versión quecontenga la cantidad máxima de restos murinos. Las secuencias de aminoácidos de las dos versiones humanizadas se muestran alineadas con la secuencia de aminoácidos de DS6 murina en la Figura 15A y B. Ambos genes del
40 anticuerpo DS6 humanizado se clonaron en el plásmido de expresión de anticuerpos (Figura 14) para transfecciones transitorias y estables. Las secuencias de ADNc y de aminoácidos de las versiones humanizadas v1.0 y v1.2 son dela región variable de cadena ligera que son iguales y se muestran en la Figura 16. Las secuencias de ADNc y deaminoácidos de cadena pesada de las versiones humanizadas v1.0 y v1.2 se muestran en la Figura 17A y B.
45 Ejemplo 13: Expresión y purificación de huDS6 en células CHO y mediciones de la afinidad
[00244] Para determinar si las versiones DS6 humanizadas retenían la afinidad de unión de muDS6, fue necesario expresar y purificar los anticuerpos. Se transfectaron células CHO con los plásmidos de expresión de anticuerposrespectivos. Como los niveles de expresión transitoria de huDS6 eran muy bajos, se seleccionaron líneas celulares
50 estables.
[00245] Se sembraron células CHODG44 (4,32 x 106 células/placa) en placas de 15 cm en medio no selectivo (Alfa MEM + nucleótidos (Gibco), suplementado con L-glutamina 4 mM, 50 U/ml de penicilina, 50 µg/ml deestreptomicina, y FBS al 10% v/v) y se colocaron en un incubador humidificado a 37ºC, de CO2 al 5%. El siguiente 55 día, las células se transfectaron con los plásmidos de expresión de huDS6 v1.0 y v1.2 usando una versión modificada del protocolo recomendado de Qiagen para transfección Polyfect. El medio no selectivo se aspiró de lascélulas. Las placas se lavaron con 7 ml de PBS pre-calentado (37ºC) y se recargaron con 20 ml de medio noselectivo. El ADN plasmídico (11 µg) se diluyó en 800 µl de Hybridoma SFM (Gibco). Después, se añadieron 70 µl de Polyfect (Qiagen) a la mezcla de ADN/SFM. La mezcla Polyfect después se agitó con vórtice suavemente durante
60 varios segundos y se incubó durante 10 min. a temperatura ambiente. Se añadió medio no selectivo (2,7 ml) a la mezcla. Esta mezcla final se incubó con las células sembradas durante 24 h.
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[00246] La mezcla de transfección/medio se retiró de las placas y después las células se trataron con tripsina y secontaron. Las células después se sembraron en medio selectivo (Alfa MEM -nucleótidos, suplementado con Lglutamina 4 mM, 50 U/ml de penicilina, 50 µg/ml de estreptomicina, FBS al 10% v/v, 1,25 mg/ml de G418) en placas de 96 pocillos (250 µl/pocillos) a diversas densidades (1800, 600, 200, y 67 células/pocillo). Las células después seincubaron durante 2-3 semanas, suplementado el medio si fuera necesario. Los pocillos se exploraron para los niveles de producción de anticuerpos usando un ELISA cuantitativo. Se recubrió una placa Immulon 2HB de 96pocillos con anticuerpo F(ab)2 de cabra anti-IgG humana (Jackson Immunoresearch; 1 µg/pocillo en 100 µl de tampón carbonato sódico 50 mM pH 9,6) y se incubó durante 1,5 h a temperatura ambiente, con balanceo. Todas lasetapas posteriores se realizaron a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron dos veces con T-TBS (Tween-20 al0,1%, TBS) y se bloquearon con 200 µl de tampón de bloqueo (BSA al 1%, T-TBS) durante 1 h. Los pocillos se lavaron dos veces con T-TBS. En una placa diferente, se diluyeron en serie el patrón de anticuerpo, EM164 (100 ng/ml), y los sobrenadantes de cultivo (1:2 o 1:3) en tampón de bloqueo. Estas diluciones (100 µl) se transfirieron a laplaca ELISA y se incubaron durante 1 h. Los pocillos se lavaron 3 veces con T-TBS y se incubaron con 100 µl de Fc-AP de cabra anti-IgG humana (Jackson ImmunoResearch) diluido 1:3000 en tampón de bloqueo durante 45 min.Después de 5 lavados con T-TBS, los pocillos se revelaron usando 100 µl de reactivo de revelado PNPP (10 mg/ml de PNPP (fosfato de p-nitrofenilo, sal disódica; Pierce), tampón dietanolamina 0:1 M pH 10,3) durante 25 min. Se midió la absorbancia a 405 nm en un lector de placa ELISA. Las lecturas de absorbancia (del sobrenadante decultivo) en la parte lineal de la curva patrón se usaron para determinar los niveles de anticuerpos.
[00247] Los clones de mayor producción, identificados por el ELISA, se expandieron después y se prepararon soluciones mare celulares congeladas. Para producir una cantidad suficiente de anticuerpo para purificar, las célulasse expandieron en placas de 15 cm (~ 1 x 106 células/placa) con 30 ml de medio selectivo y se incubaron durante 1semana. Los sobrenadantes de cultivo se recogieron en tubos cónicos de 250 ml, se agitaron en una centrífuga desobremesa (2000 rpm, 5 min., 4ºC), y después se filtraron a esterilidad a través de una aparato de filtro de 0,2 µm.
[00248] Para la purificación de DS6, se añadieron gránulos de NaOH a los sobrenadantes de cultivo filtradoshasta un pH final de 8,0. Se equilibró una columna Hi Trap rProtein A (Amersham) con 20-50 volúmenes de columnade tampón de unión. El sobrenadante se cargó en la columna usando una bomba peristáltica. Después, la columnase lavó con 50 volúmenes de columna de tampón de unión. El anticuerpo unido se eluyó de la columna usandotampón de elución (ácido acético 100 mM, NaCl 50 mM, pH 3) en tubos situados en un colector de fracciones. El anticuerpo eluido después se neutralizó usando tampón de neutralización (K2HPO4 2 M, pH 10,0) y después sedializó durante una noche en PBS. El anticuerpo dializado se filtró a través de un filtro de jeringa 0,2 µm. Se midió la absorbancia a 280 nm para determinar la concentración final de proteína.
[00249] La afinidad de la huIgG purificada se comparó con muDS6 por citometría de flujo. En la primera serie de experimentos se midió la unión directa de una línea celular que expresaba CA6, WISH. Como se muestra en la Figura 18A, el DS6 quimérico, huDS6 v1.0, y huDS6 v1.2 muestran afinidades muy similares con KD aparentes de3,15 nM, 3,71 nM, y 4,2 nM, respectivamente, lo que sugiere que el revestimiento no ha alterado las CDR. Estasafinidades son sólo ligeramente inferiores que para muDS6 (Kd = 1,93 nM) mostrado en la Figura 18B. Para confirmar que las versiones huDS6 retienen la afinidad de muDS6, se realizaron experimentos de unión competitiva. La ventaja de este formato es que se usa el mismo sistema de detección para anticuerpos tanto murinos como humanos; que es biotina-muDS6/estreptavidina-DTAF. En algunos casos, la Kd aparente experimentalmentemedida puede variar simplemente a causa del reactivo secundario usado para detectar indirectamente la unión. Estose ilustra por una comparación de la Kd aparente de biotina-DS6 con cuando se usa anticuerpo de cabra anti-ratón-FITC (Kd = 2,80 nM; Figura 18B) o cuando se usa estreptavidina-DTAF (Kd = 6,76 nM; Figura 19A). Los resultados del ensayo de unión competitiva que compara la capacidad de muDS6, huDS6 v1.0, y huDS6 v1.2 de competir conbiotina-DS6 se muestran en la Figura 19B. Las EC50 aparentes son 12,18 nM, 37,07 nM, y 22,64 nM para muDS6,huDS6 v1.0, y huDS6 v1.2, respectivamente. Estos resultados indican que el revestimiento de muDS6 para producirun DS6 humanizado causa poca reducción en la afinidad de unión.
Ejemplo 14: Preparación de conjugado citotóxico DS6-DM1
[00250] El anticuerpo DS6 (8 mg/ml) se modificó usando un exceso molar de factor 8 de N-succinimidil-4-(2piridilditio) pentanoato (SPP) para introducir grupos ditiopiridilo. La reacción se realizó en tampón A al 95% v/v (KPi50 mM, NaCl 50 mM, EDTA 2 mM, pH 6,5) y DMA al 5% v/v durante 2 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción ligeramente hinchada se filtró en gel a través de una columna NAP o Sephadex G25 (equilibrada entampón A). El grado de modificación se determinó midiendo la absorbancia del anticuerpo a 280 nm y la 2mercaptopiridina (Spy) liberada por el DTT a 280 y 343 nm. Después se conjugó el DS6 modificado a 2,5 mg deAb/ml usando un exceso molar de factor 1,7 de N2'-desacetil-N-2'(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina (L-DM1) sobre SPy. La reacción se realizó en tampón A (97% v/v) con DMA (3% v/v). La reacción se incubó a temperatura ambiente durante una noche durante ~20 h. La mezcla de reacción opaca se centrifugó (1162 x g, 10 min.) y el sobrenadante después se filtró en gel a través de un columna NAP-25 o S300 (Tandem 3, columnas de desalado 3x26/10, medio G25) equilibrada en tampón B (1X PBS pH 6,5). El sedimento se desechó. El conjugado se filtró aesterilidad usando un filtro Millex-GV de 0,22 µm y se dializó en tampón B con un Slide-A-Lyzer. La cantidad demoléculas DM1 unidas por molécula de DS6 se determinó midiendo la absorbancia tanto a 252 nm como a 280 nm del material filtrado. Se descubrió que la proporción DM1/Ab era 4,36 y el rendimiento de la etapa de DS6 conjugado era del 55%. La concentración de anticuerpo conjugado era de 1,32 mg/ml. El conjugado purificado se caracterizóbioquímicamente por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) y se descubrió que era del 92% de monómero. Elanálisis de DM1 en forma conjugada purificada indicó que el 99% estaba covalentemente unido al anticuerpo. En laFigura 20, la unión por citometría de flujo del conjugado DS6-DM1 y el DS6 no modificado a células Caov-3 muestra que la conjugación de DS6 provoca solamente una ligera pérdida de la afinidad.
Ejemplo 15: Citotoxicidad in vitro de DS6-DM1
[00251] Como anticuerpo desnudo, DS6 ha mostrado ausencia de actividad proliferativa o inhibidora del crecimiento en cultivos celulares (Figura 21) Sin embargo, cuando se incuba el DS6 con células en presencia de un
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conjugado de DM1 con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón de cadena pesada y ligera, DS6 es muy eficazdirigiendo y suministrando este conjugado a la célula, provocando citotoxicidad indirecta (Figura 21). Para ensataradicionalmente la actividad inherente del DS6 desnudo, se realizó un ensato de citotoxicidad dependiente delcomplemento (CDC) usando DS6 murino y humanizado. Se sembraron células HPAC y ZR-75-1 (25000 células/pocillo) en placas de 96 pocillos, en presencia de suero humano y de conejo al 5% y diversas diluciones de DS6 murino o humanizado, en 200 µl de medio RHBP (RPMI-1640, BSA al 0,1%, HEPES 20 mM (pH 7,2-7,4), 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina). Las células se incubaron durante 2 h a 37ºC. Después se añadióreactivo azul Alamar (10% de la concentración final) (Biosource) al sobrenadante. Las células se incubaron durante5-24 h antes de medir la fluorescencia. El DS6 tanto murino como humanizado no tenía efecto en un ensayo decitotoxicidad dependiente del complemento (CDC) (Figura 22). Esto sugiere que la aplicación terapéutica de DS6 requeriría la conjugación de una molécula efectora tóxica.
[00252] Se examinó la citotoxicidad del anticuerpo DS6 conjugado con maitansinoide usando 2 formatos deensayo diferentes en diversas líneas celulares positivas a DS6. Se realizaron ensayos clonogénicos done las células(1000-2500 células/pocillo) se sembraron en placas de 6 pocillos en 2 ml de conjugado diluido en medio de cultivo. Las células se expusieron de forma continua al conjugado a varias concentraciones, generalmente entre 3 x 10-11 M a 3 x 10-9 M, y se incubaron en una cámara humidificada a 37ºC, de CO2 al 6% durante 5-9 días. Los pocillos selavaron con PBS y las colonias se tiñeron con una solución de violeta cristal al 1% p/v/formaldehído al 10% v/v/PBS.El colorante no unido después se lavó minuciosamente de los pocillos con agua destilada, y se dejó que las placasse secaran. Las colonias se contaron usando un microscopio de disección Leica StereoZoom 4.
[00253] La eficacia de siembra (PE) se calculó como la cantidad de colonias/cantidad de células sembradas. Lafracción superviviente se calculó como la PE de células tratadas/PE de células no tratadas. La concentración IC50 se determinó haciendo un gráfico de la fracción superviviente de células frente a la concentración molar del conjugado. En un ensayo clonogénico (Figura 23), DS6-DM1 era eficaz eliminando células Caov-3 con una IC50 estimada de 800 pM. Las células negativas al antígeno, A375, estaban sólo ligeramente afectadas por el conjugado a unaconcentración de 3 x 10-9 M, la mayor concentración de DS6-DM I ensayada, lo que demuestra que la actividad de eliminación celular del conjugado está específicamente dirigida hacia células que expresan el antígeno. Sinembargo, a pesar de la sensibilidad aparente a maitansina, muchas de las otras líneas celulares positivas a DS6 noeran particularmente sensibles al inmunoconjugado. Todas las líneas celulares cervicales (HeLa, KB, y WISH) eran sensibles al conjugado mientras que solamente una cantidad selecta de las líneas celulares de ovario y mamamostró algún efecto citotóxico. Ninguna de las líneas celulares pancreáticas pareció verse afectada.
[00254] En el ensayo de MTT, las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1000-5000células/pocillo. Las células se sembraron con diluciones en serie de DS6 desnudo o inmunoconjugado DS6-DM1 en 200 µl de medio de cultivo. Las muestras se procesaron por triplicado. Las células y las mezclas de anticuerpo/conjugado después se incubaron durante 2-7 d, momento en el cual se evaluó la viabilidad celular por un ensayo de MTT (bromuro de [3(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio)]. Se añadió MTT (50 µg/pocillo) alsobrenadante de cultivo y se dejó incubar durante 3-4 h a 37ºC. El medio se retiró y el MTT formazán se solubilizóen DMSO (175 µl/pocillo). Se midió la absorbancia a 540-545 nm. En un ensayo de viabilidad celular de MTT (Figura 24C), el inmunoconjugado era capaz de eliminar de forma eficaz células Caov-3 con una IC50 estimada de 1,61 nM. Los pocillos con las mayores concentraciones de conjugado no contenían células viables en comparación con elanticuerpo desnudo que no tenía ningún efecto (Figuras 21 y 24).
[00255] Los resultados de los ensayos de MTT sobre las otras líneas celulares fueron ligeramente diferentes (Figura 24A, B, y D-I). En muchos casos, aunque se observó algo de citotoxicidad, el conjugado fue incapaz deeliminar completamente la población completa de células (con la excepción de las células WISH). Las células BT-20,OVCAR5, y HPAC fueron particularmente resistentes: en los pocillos de mayor concentración de conjugado (32 nM), más del 50% de las células era aún viable.
Ejemplo 16: Actividad anti-tumoral del conjugado in vivo
[00256] Para demostrar la actividad in vivo del conjugado DS6-DM1, se establecieron xenoinjertos de tumor humano en ratones SCID. Se desarrolló un modelo subcutáneo de la línea celular de carcinoma cervical humano, KB. Las células KB se cultivaron in vitro, se recogieron, y se inyectaron 5 x 106 células en 100 µl de medio sin suero bajo la paletilla derecha de cada ratón y se dejaron crecer durante 6 días hasta un volumen de tumor promedio de144 ± 125 mm3, momento en el cual se inició el tratamiento con fármaco. Se administró a los ratones PBS, conjugado a 150 µg/kg de DM1, o conjugado a 225 µg/kg de DM1 (2 ratones por grupo) por vía intravenosa cada día durante 5 días. Las respuestas tóxicas se controlaron diariamente durante el tratamiento. Los volúmenes de lostumores (Figura 25A) y los pesos corporales correspondientes (Figura 25B) se controlaron durante todo el estudio.
[00257] Los tumores KB tratados con PBS de control crecieron rápidamente con un tiempo de duplicación deaproximadamente 4 días. En contraste, los dos grupos de ratones tratados con conjugado mostraron una regresióncompleta del tumor 14 días y 18 días después del inicio del tratamiento para los grupos de dosis de 225 µg/kg y 150 µg/kg, respectivamente. A la dosis de 150 µg/kg el reatado del tumor era de aproximadamente 70 días. El tratamiento a 225 µg/kg produjo curación ya que no hubo evidencias de reincidencia del tumor al final del estudio enel día 120. Como se observa en la Figura 25B, los ratones en el grupo de 150 µg/kg no mostraron pérdida de peso,lo que indica que la dosis se toleraba bien. A la dosis más alta, los ratones experimentan una reducción del 3%solamente temporal en el peso corporal. Durante el ciclo de tratamiento de 5 días, los ratones no mostraron signos visibles de toxicidad. Tomado en conjunto, este estudio demuestra que el tratamiento con DS6-DM1 puede curar a los ratones de tumores de xenoinjerto KB a una dosis no tóxica.
[00258] La actividad de DS6-DM1 se ensayó adicionalmente en un panel de modelos de xenoinjerto subcutáneo (véase la Figura 26). Las líneas celulares tumorales usadas para hacer los xenoinjertos presentaban un intervalo desensibilidades in vitro a maitansina y de densidades del epítopo CA6 (siguiente Tabla 9). Las células OVCAR5 y TOV-21G son líneas celulares de tumor de ovario; HPAC es una línea celular de tumor pancreático; HeLa es una línea celular de tumor cervical. Las células OVCAR5 y TOV-21G tienen baja expresión superficial de CA6; las célulasHeLa tienen un nivel intermedio de expresión superficial de CA6; las células HPAC tienen una alta densidad de CA6de expresión superficial. Las células TOV-21G y HPAC son sensibles a maitansina; las células OVCAR5 y HeLa son 2-7 veces menos sensibles a maitansina.
Tabla 9
Línea celular
MMF* Kd aparente (M) Ensayoclonogénico IC50 maitansina (M) Ensayoclonogénico IC50 conjugado (M) Ensayo MTT EC50 conjugado (M)
BT-20
232,20 9,14 x 10-10 3,50 x 10-10 > 3,00 x 10-09 1,44 x 10-08
BT-483
1911,00 1,37 x 10-08 1,50 x 10-10 1,00 x 10-10 N/A
Caov-3
465,20 5,48 x 10-09 3,20 x 10-11 8,00 x 10-10 1,61 x 10-09
Caov-4
149,00 4,04 x 10-09 6,00 x 10-10 > 3,00 x 10-09 N/A
HeLa
242,50 6,94 x 10-10 1,00 x 10-10 1,80 x 10-09 N/A
HPAC
2228,00 2,35 x 10-08 5,50 x 10-11 1,80 x 10-09 1,84 x 10-09
HPAF-II
266,50 2,81 x 10-09 6,00 x 10-10 > 3,00 x 10-09 1,00 x 10-08
Hs766T
182,90 2,32 x 10-09 > 3,00 x 10-09 > 3,00 x 10-09 > 3,20 x 10-08
KB
119,56 1,11 x 10-10 3,00 x 10-11 1,40 x 10-09 3,01 x 10-09
OVCAR5
97,10 1,47 x 10-09 3,20 x 10-10 > 3,00 x 10-09 8,46 x 10-07
T-47D
559,58 3,42 x 10-09 1,20 x 10-10 > 3,00 x 10-09 N/A
TOV-21G
87,79 3,07 x 10-10 4,80 x 10-11 2,00 x 10-09 6,88 x 10-09
WISH
1133,55 2,38 x 10-09 9,00 x 10-11 4,60 x 10-10 6,69 x 10-10
ZR-75-1
811,67 4,30 x 10-09 1,00 x 10-10 N/A 9,45 x 10-10
* fluorescencia media relativa máxima promedio
[00259] Las 4 líneas celulares se cultivaron in vitro, se recogieron, y se inyectaron 1 x 107 células en 100 µl de medio sin suero bajo la peltilla derecha de cada ratón (6 ratones por modelo) y se dejaron crecer durante 6 díashasta un volumen de tumor promedio de 57,6 ± 6,7 y 90,2 ± 13,4 mm3 para los grupos de ensayo y de control 10 respectivamente de OVCARS, 147,1 ± 29,6 y 176,2 ± 18,9 mm3 para los grupos de ensayo y de control respectivamente de HPAC, 194,3 ± 37,2 y 201,7 ± 71,7 mm3 para los grupos de ensayo y de control respectivamente de HeLa, y 96,6 ± 22,8 y 155,6 ± 13,4 mm3 para los grupos de ensato y de control respectivamente de TOV-21G, momento en el cual se inició el tratamiento con fármaco. Para cada modelo, se trataron tres ratones de control con dos dosis semanales de PBS y se trataron tres ratones de ensayo con dos dosis semanales de conjugado (600 15 µg/kg de DM1) por vía intravenosa. Las respuestas tóxicas se controlaron diariamente durante el tratamiento y se controlaron los volúmenes de los tumores y los pesos corporales en todo el estudio. La eficacia del conjugado paralos diversos modelos se muestra gráficamente en la Figura 26A, C, E, y G y los pesos corporales correspondientesse representan en la Figura 26B, D, F, y H. Las líneas celulares OVCAR5, TOV-21G, y HPAC forman tumoresagresivos como puede observarse en los controles de PBS para cada modelo. El modelo HeLa tenía 20 aproximadamente un periodo de retardo de 3 semanas antes del empezar el crecimiento exponencial. En todos los modelos, el tratamiento con el conjugado DS6-DM1 provocó una regresión tumoral completa en todos los ratones.Para los modelos TOV-21G, HPAC, y HeLa los ratones permanecen sin tumor en el día 61. En el modelo OVCAR5los tumores reaparecían en aproximadamente el día 45 después de la inoculación del tumor. Por tanto, el tratamiento con DS6-DM1 en este modelo provoca un retardo en el crecimiento del tumor de aproximadamente 3425 días. El retardo del crecimiento es significativo ya que las células OVCAR5 son menos sensibles a maitansina y tienen una baja expresión del epítopo CA6. En modelos en los que la densidad del epítopo CA6 es mayor o elmodelo tiene mayor sensibilidad a maitansina, la regresión del tumor es más contundente. Es importante observarque se administraron solamente 2 dosis. Claramente, el programa de dosificación usado en este estudio era notóxico para los ratones ya que no se observó pérdida de peso. Es probable que pudiera conseguirse la curación con
30 dosis de conjugado adicionales o mayores. [00260] El cáncer de ovario humano es en gran medida una enfermedad del peritoneo. Las células OVCAR5 crecen de forma agresiva como un modelo intraperitoneal (IP) en ratones SCID que forman nódulos tumorales yproducen fluido ascítico de un modo similar a la enfermedad humana. Para demostrar la actividad en un modelo IP, se usó DS6-DM1 para tratar a ratones que albergaban tumores IP OVCAR5 (Figura 27). Las células OVCAR5 se
35 cultivaron in vitro, se recogieron y se inyectaron 1 x 107 células en 100 µl de medio sin suero por vía intraperitoneal. Se dejó que los tumores crecieran durante 6 días, momento en el cual se inició el tratamiento. Los ratones setrataron semanalmente durante 2 semanas con PBS o conjugado DS6-DM1 a una dosis de 600 µg/kg de DM1 y secontrolaron para la pérdida de peso resultante de la enfermedad peritoneal. En el día 28, el grupo de ratones de PBS había perdido más del 20% del peso corporal y se sacrificaron por eutanasia. El grupo tratado se sacrificó en el día
40 45 después de exceder una pérdida de peso corporal del 20%. Este estudio demuestra que DS6-DM1 es capaz de retardar el crecimiento tumoral en el modelo IP OVCAR5 agresivo a pesar del hecho de que las células OVCAR5son menos sensibles a maitansina y tienen menos epítopos CA6 por célula. Como el programa de dosificaciónusado no provocaba signos visibles de toxicidad, es probable que pudieran usarse dosis adicionales y mayores paraconseguir un retardo adicional del crecimiento tumoral o su curación.
45
Ejemplo 17: Síntesis y caracterización del conjugado citotóxico DS6-SPP-taxoide MM1-202
[00261] El DS6 se modificó con el enlazador 4-nitro-2-piridil-pentanoato de N-sulfosuccinimidilo (SSNPP). A 50 mg de Ab DS6 en tampón A al 90%, DMA al 10% se añadieron 10 equivalentes de SSNPP en DMA. La concentración50 final de Ab fue 8 mg/ml. La reacción se agitó durante 4 horas a temperatura ambiente, después se purificó por cromatografía G25. El grado de modificación del anticuerpo se midió espectofotométricamente usando laabsorbancia a 280 nm (anticuerpo) y 325 (enlazador) y se descubrió que tenía 3,82 enlazadores/anticuerpo. Larecuperación del anticuerpo fue de 43,3 mg dando un rendimiento del 87%. La conjugación de DS6-nitroSPP se hizocon taxoide MM1-202 (1812 P.16). La conjugación se realizó a una escala de 42 mg en tampón A al 90%, DM1 al 55 10%. El taxoide se añadió en 4 alícuotas de 0,43 equiv./enlazador (cada alícuota) durante un periodo de aproximadamente 20 horas. En este momento la reacción se había vuelto notablemente turbia. Después de la
5 10 15 20 25 30
35 40
45
50 55
60
purificación con G25, el conjugado resultante, recuperado en aproximadamente un 64% de rendimiento tenía aproximadamente 4,3 taxoides/Ab y aproximadamente 1 equivalente de enlazador sin reaccionar sobrante. Parainactivar el enlazador sin reaccionar, se añadió 1 equivalente de cisteína/enlazador sin reaccionar al conjugado conagitación durante una noche. Fue apreciable un matiz amarillento definido después de la adición de cisteína, lo queindica liberación de tiopiridina. La solución de reacción después se dializó en tampón B/Tween 20 al 0,01% seguido de diálisis adicional en tampón B solo durante varios días. El conjugado final tenía 2,86 fármacos/anticuerpo. Larecuperación del anticuerpo fue de 14,7 mg, dando un rendimiento global del 35%. El conjugado además secaracterizó bioquímicamente por SEC y se descubrió que tenía un 89% de monómeros, un 10,5% de dímeros y un0,5% de agregado de mayor peso molecular.
[00262] Se muestran los resultados de un análisis de citometría de flujo que compara la unión de DS6-SPPtaxoide MM1-202 frente al anticuerpo DS6 en células HeLa en la Figura 28. Los resultados indican que DS6 retienela actividad de unión cuando se conjuga a un taxano.
LISTA DE SECUENCIAS
[00263]
<110> ImmunoGen, Inc. PAYNE, Gillian CHUN, Philip TAVARES, Daniel
<120> CONJUGADO CITOTÓXICO ESPECÍFICO PARA EL ANTÍGENO CA6 Y MÉTODOS PARA USAR EL MISMO
<130> F179122
<150> 60/488.447
<151> 21-07-2003
<160> 63
<170> PatentIn versión 3.2
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 1
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<210> 2
<211> 17
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<213> Mus musculus
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Gly
<210> 3
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<213> Mus musculus
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<213> Mus musculus
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5
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cttccggaat tcsargtnma gctgsagsag tcwgg
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural
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REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN
Esta lista de referencias citadas por el solicitante es sólo para la comodidad del lector. No forma parte del documentode patente europea. Aunque se ha tomado especial cuidado en la compilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad a este respecto.
Documentos de patentes citados en la descripción
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Claims (53)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo humanizado o fragmento de unión a epítopo del mismo que comprende al menos una regiónvariable de cadena pesada al menos un 98% idéntica a una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 10 ó5 11 y al menos una región variable de cadena ligera al menos un 98% idéntica a una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 8, en el que dicha al menos una región variable de cadena pesada ofragmento de la misma comprende tres regiones determinantes de complementariedad secuenciales quetienen secuencias de aminoácidos representadas por las SEC ID Nº: 1, 21 y 3, respectivamente y en el quedicha al menos una región variable de cadena ligera o fragmento de la misma comprende tres regiones
    10 determinantes de complementariedad secuenciales que tienen secuencias de aminoácidos representadas por las SEC ID Nº: 4, 5 y 6 respectivamente.
  2. 2.
    El anticuerpo o fragmento de unión a epítopo del mismo de la reivindicación 1, en el que dicha regiónvariable de cadena ligera o fragmento de la misma tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 8.
  3. 3.
    El anticuerpo o fragmento de unión a epítopo del mismo de la reivindicación 1, en el que dicha regiónvariable de cadena pesada o fragmento de la misma tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:10 ola SEC ID Nº:11.
    15
    20 4. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo o un fragmento de unión a epítopo del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.
  4. 5.
    Un polinucleótido que codifica una cadena ligera o pesada de un anticuerpo o un fragmento de unión aepítopo del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.
  5. 6.
    Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 4.
  6. 7.
    Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 5.
    30 8. El vector de la reivindicación 6, siendo dicho vector un vector de expresión que expresa dicho anticuerpo o fragmento de unión a epítopo.
    25
  7. 9. El vector de la reivindicación 7, siendo dicho vector un vector de expresión que expresa dicho anticuerpo ofragmento de unión a epítopo.
    35
  8. 10. Un conjugado citotóxico que comprende un agente de unión celular y un agente citotóxico, en el que dicho agente de unión celular comprende el anticuerpo humanizado o fragmento de unión a epítopo del mismo delas reivindicaciones 1-3.
    40 11. El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho agente de unión celular y dicho agente citotóxico están unidos covalentemente.
  9. 12. El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho agente de unión celular y dichoagente citotóxico están unidos covalentemente a través de un grupo enlazador de PEG.
    45
  10. 13. El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho agente de unión celular y dichoagente citotóxico están unidos covalentemente a través de una funcionalidad tiol o disulfuro de dicho agentecitotóxico.
    50 14. El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho fragmento de un anticuerpo se selecciona entre el grupo compuesto por un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, unfragmento Fd, un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv), un anticuerpo de cadena sencilla, un fragmento Fvunido por disulfuro (sdFv) y un fragmento que comprende un dominio VL o VH.
    55 15. El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho agente citotóxico es un miembro seleccionado entre el grupo compuesto por un compuesto maitansinoide, un compuesto taxoide, un compuesto CC-1065, un compuesto de dolastatina, un compuesto de daunorrubicina, y un compuesto dedoxorrubicina.
    60 16. El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dicho agente citotóxico es la maitansina DM1 de fórmula (I):
    imagen1
  11. 17.
    El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dicho agente citotóxico es la maitansina DM4 de fórmula (II):
  12. 18.
    El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dicho agente citotóxico es unamaitansina de fórmula (III):
    en la que: Y' representa (CR7CR8)l(CR9=CR10)pC=CqAr(CR5CR6)mDu(CR11=CR12)rC=C)sBt(CR3CR4)nCR1R2SZ, donde:
    15 R1 y R2 son cada uno independientemente CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilosustituido o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo, y además R2 puede ser H; A, B, D son cicloalquilo o cicloalquenilo que tiene 3-10 átomos de carbono, arilo simple o sustituido o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo;
    20 R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R11, y R12 son cada uno independientemente H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo; l, m, n, o, p, q, r, s, y t son cada uno independientemente 0 o un número entero de 1 a 5, con la condición deque al menos dos de l, m, n, o, p, q, r, s y t no sean cero en cualquier momento dado; y Z es H, SR o -COR, donde R es alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo oalquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, o arilo simple o sustituido o un radicalheterocíclico aromático o heterocicloalquilo.
    imagen2
    imagen3
  13. 19.
    El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 18, en el que R1 es H, R2 es metilo y Z es H.
  14. 20.
    El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 18, en el que R1 y R2 son metilo y Z es H.
  15. 21.
    El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 18, en el que R1 es H, R2 es metilo, y Z es -SCH3.
  16. 22.
    El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 18, en el que R1 y R2 son metilo, y Z es -SCH3.
    15 23. El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dicho agente citotóxico es una maitansina seleccionada entre el grupo compuesto por las fórmulas (IV-L), (IV-D), y (IV-D,L):
    R1 y R2 son cada uno independientemente CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 0 átomosde carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilosustituido, o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo, y además R2 puede ser H; R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son cada uno independientemente H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de
    25 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo; l, m y n son cada uno independientemente un número entero de 1 a 5, y además n puede ser 0; Z es H, SR o -COR donde R es alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, o arilo simple o sustituido o un radicalheterocíclico aromático o heterocicloalquilo; y May representa un maitansinoide que alberga la cadena lateral en C-3, C-14 hidroximetilo, C-15 hidroxi o C20 desmetilo.
  17. 24. El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 23, en el que R1 es H, R2 es metilo, R5, R6, R7, y R835 son cada uno H, l y m son cada uno 1, n es 0, y Z es H.
  18. 25.
    El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 23, en el que R1 y R2 son metilo, R5, R6, R7, R8 son cada uno H, l y m son 1, n es 0, y Z es H.
  19. 26.
    El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 23, en el que R1 es H, R2 es metilo, R5, R6, R7, y R8 son cada uno H, l y m son cada uno 1, n es 0, y Z es -SCH3.
  20. 27.
    El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 23, en el que R1 y R2 son metilo, R5, R6, R7, R8 son cada uno H, l y m son 1, n es 0, y Z es -SCH3.
    45
  21. 28.
    El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 23, en el que el agente citotóxico está representadopor la fórmula (IV-L).
  22. 29.
    El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dicho agente citotóxico es unamaitansina de fórmula (V):
    imagen4
    imagen1
    en la que: Y representa (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ, donde:
    5 R1 y R2 son cada uno independientemente CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilosustituido o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo, y además R2 puede ser II;R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son cada uno independientemente H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono,
    10 fenilo, fenilo sustituido, o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo; l, m y n son cada uno independientemente un número entero de 1 a 5, y además n puede ser 0; yZ es H, SR o -COR, donde R es alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo oalquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, o arilo simple o sustituido o un radicalheterocíclico aromático o heterocicloalquilo.
    15
  23. 30. El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 29, en el que R1 es H, R2 es metilo, R5, R6, R7, y R8 son cada uno H; l y m son cada uno 1; n es 0; y Z es H.
  24. 31. El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 29, en el que R1 y R2 son metilo; R5, R6, R7, R8 son20 cada uno H, l y m son 1; n es 0; y Z es H.
  25. 32. El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 29, en el que R1 es H, R2 es metilo, R5, R6, R7, y R8 son cada uno H, l y m son cada uno 1, n es 0, y 7, es -SCH3.
    25 33. El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 29, en el que R1 y R2 son metilo, R5, R6, R7, R8 son cada uno H, l y m son 1, n es 0, y Z es -SCH3.
    imagen5
    R1 y R2 son cada uno independientemente CH3, C2H2, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos
    35 de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo, y además R2 puede ser H; R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son cada uno independientemente H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos decarbono, fenilo, fenilo sustituido o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo;
    40 l, m y n son cada uno independientemente un número entero de 1 a 5, y además n puede ser 0; Z2 es SR o COR, donde R es alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, o arilo simple o sustituido o un radicalheterocíclico aromático o heterocicloalquilo; y May es un maitansinoide.
    imagen6
    R1 y R2 son cada uno independientemente CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene de 1 a10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilosustituido o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo, y además R2 puede ser H;
    15 A, B, y D cada uno independientemente es cicloalquilo o cicloalquenilo que tiene 3 a 10 átomos de carbono, arilo simple o sustituido, o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo; R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R11, y R12 son cada uno independientemente H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilolineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo;
    20 l, m, n, o, p, q, r, s, y t son cada uno independientemente 0 o un número entero de 1 a 5, con la condición de que al menos dos de l, m, n, o, p, q, r, s y t no sean cero en cualquier momento dado; y Z2 es SR o -COR, donde R es alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo oalquenilo ramificado o cíclico que tiene 3-10 átomos de carbono, o arilo simple o sustituido o un radicalheterocíclico aromático o heterocicloalquilo.
    25
  26. 36.
    El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 35, en el que R1 es H y R2 es metilo.
  27. 37.
    El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dicho agente citotóxico es unamaitansina de fórmula (VIII):
    30
    imagen7
    en la que: Y1' representa (CR7CR8)l(CR9=CR10)p(C≡C)qAr(CR5CR6)mDu(CR11=CR12)r(C≡C)sBt(CR3CR4)nCR1R2S-, donde:
    5 A, B, y D, cada uno independientemente es cicloalquilo o cicloalquenilo que tiene 3-10 átomos de carbono, arilo simple o sustituido, o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo; R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R11, y R12 son cada uno independientemente H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilolineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo; y
    10 l, m, n, o, p, q, r, s, y t son cada uno independientemente 0 o un número entero de 1 a 5, con la condición de que al menos dos de l, m, n, o, p, q, r, s y t no sean cero en cualquier momento dado.
  28. 38. El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 37, en el que R1 es H y R2 es metilo.
    15 39. El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 37, en el que R1 y R2 son metilo.
    imagen8
    de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo
    25 sustituido, un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo, y además R2 puede ser H; R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son cada uno independientemente H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono,fenilo, fenilo sustituido o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo; l, m y n son cada uno independientemente un número entero de 1 a 5, y además n puede ser 0; y
    30 May representa un maitansinol que alberga la cadena lateral en C-3, C-14 hidroximetilo, C-15 hidroxi o C-20 desmetilo.
  29. 41.
    El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 40, en el que R1 es H y R2 es metilo o R1 y R2 son metilo.
  30. 42.
    El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 40, en el que R1 es H, R2 es metilo, R5, R6, R7 y R8 son cada uno H; l y m son cada uno 1; n es 0.
    35
  31. 43. El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 40, en el que R1 y R2 son metilo; R5, R6, R7 y R8 son40 cada uno H; l y m son 1; n es 0.
  32. 44. El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 41, en el que el maitansinoide está representado porla fórmula (IX-L).
    45 45. El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 42, en el que el maitansinoide está representado por la fórmula (IX-L).
  33. 46. El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 43, en el que el maitansinoide está representado porla fórmula (IX-L).
    50
  34. 47. El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 15, en que dicho agente citotóxico es una maitansina de fórmula (X):
    imagen1
    en la que: Y1 representa (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2S-, donde:
    5 R1 y R2 son cada uno independientemente CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilosustituido, un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo, y además R2 puede ser H; R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son cada uno independientemente H, CH3, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono,
    10 fenilo, fenilo sustituido o un radical heterocíclico aromático o heterocicloalquilo; l, m y n son cada uno independientemente un número entero de 1 a 5, y además n puede ser 0; yMay representa un maitansinol que alberga la cadena lateral en C-3, C-14 hidroximetilo, C-15 hidroxi o C-20 desmetilo.
    15 48. El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 47, en el que R1 es H, R2 es metilo, R5, R6, R7 y R8 son cada uno H, l y m son cada uno 1, y n es 0.
  35. 49.
    El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 47, en el que R1 y R2 son metilo; R5, R6, R7 y R8 son cada uno H; l y m son 1; y n es 0.
  36. 50.
    El conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho agente citotóxico es DM1 o DM4.
    20
    imagen9
  37. 52.
    Un método in vitro para inhibir el crecimiento de una célula que expresa el glucótopo CA6, que comprende poner en contacto una célula que expresa el glucótopo CA6 con el conjugado citotóxico de acuerdo con lareivindicación 10.
  38. 53.
    El método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa el glucótopo CA6 de acuerdo con lareivindicación 52, en el que el conjugado citotóxico comprende una versión humanizada del anticuerpomurino DS6 o un fragmento de unión a epítopo del mismo como agente de unión celular y DM1 o DM4 comoagente citotóxico.
  39. 54.
    El método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa el glucótopo CA6 de acuerdo con lareivindicación 52, en el que el conjugado citotóxico comprende una versión humanizada del anticuerpo
    30
    35
    murino DS6 o un fragmento de unión a epítopo del mismo como agente de unión celular y un taxano comoagente citotóxico.
  40. 55. El método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa el glucótopo CA6 de acuerdo con la5 reivindicación 52, en el que dicha inhibición del crecimiento provoca la muerte de la célula.
  41. 56. El método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa el glucótopo CA6 de acuerdo con lareivindicación 52, en el que dicho método se realiza ex vivo.
    10 57. Una composición terapéutica, que comprende un conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 10 y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
  42. 58. La composición terapéutica de acuerdo con la reivindicación 57, en la que el conjugado citotóxico comprende
    una versión humanizada del anticuerpo murino DS6 o un fragmento de unión a epítopo del mismo como15 agente de unión celular y DM1 o DM4 como agente citotóxico.
  43. 59.
    La composición terapéutica de acuerdo con la reivindicación 57, en la que el conjugado citotóxico comprendeuna versión humanizada del anticuerpo murino DS6 o un fragmento de unión a epítopo del mismo comoagente de unión celular y un taxano como agente citotóxico.
  44. 60.
    Uso de la composición terapéutica de acuerdo con la reivindicación 57, en la preparación de un medicamentopara tratar el cáncer.
  45. 61.
    La composición terapéutica de la reivindicación 57, para su uso en el tratamiento del cáncer.
  46. 62.
    El uso o composición de las reivindicaciones 60 y 61, en el que el conjugado citotóxico comprende unaversión humanizada del anticuerpo murino DS6 o un fragmento de unión a epítopo del mismo como agentede unión celular y DM1 o DM4 como agente citotóxico.
    20
    25
    30 63. El uso o composición de las reivindicaciones 60 y 61, en el que el conjugado citotóxico comprende una versión humanizada del anticuerpo murino DS6 o un fragmento de unión a epítopo del mismo como agentede unión celular y un taxano como agente citotóxico.
  47. 64. El uso o composición de las reivindicaciones 60 y 61, en el que el cáncer es uno en el que se expresa o 35 sobre-expresa el glucótopo CA6.
  48. 65. El uso o composición de las reivindicaciones 60 y 61, en el que el cáncer se selecciona entre el grupocompuesto por carcinoma de ovario seroso, carcinoma de ovario endometrioide, neoplasma del cuello delútero, neoplasma del endometrio, neoplasma de la vulva, carcinoma de mama, tumor pancreático, y tumor
    40 del urotelio.
  49. 66. Un kit que comprende un conjugado citotóxico de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende adicionalmente: a) un compartimiento que comprende el conjugado citotóxico.
    45
  50. 67. El kit de acuerdo con la reivindicación 66, en el que dicho conjugado citotóxico comprende una versiónhumanizada del anticuerpo murino DS6 o un fragmento de unión a epítopo del mismo como agente de unión celular y DM1 o DM4 como agente citotóxico.
    50 68. El kit de acuerdo con la reivindicación 66, en el que dicho conjugado citotóxico comprende una versión humanizada del anticuerpo murino DS6 o un fragmento de unión a epítopo del mismo como agente de unión celular y un taxano como agente citotóxico.
  51. 69. Un kit que comprende una composición terapéutica de acuerdo con la reivindicación 57, que comprende
    55 adicionalmente: a) un compartimiento que comprende la composición terapéutica.
  52. 70. El kit de acuerdo con la reivindicación 69, en el que el conjugado citotóxico de la composición terapéutica
    comprende una versión humanizada del anticuerpo murino DS6 o un fragmento de unión a epítopo del60 mismo como agente de unión celular y DM1 o DM4 como agente citotóxico.
  53. 71. El kit de acuerdo con la reivindicación 69, en el que el conjugado citotóxico de la composición terapéutica comprende una versión humanizada del anticuerpo murino DS6 o un fragmento de unión a epítopo delmismo como agente de unión celular y un taxano como agente citotóxico.
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