ES2356127T3 - Promotores mutantes de aox 1. - Google Patents
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Abstract
Un promotor mutante de alcohol oxidasa 1 (AOX1) de Pichia pastoris del promotor de AOX1 de Pichia pastoris de tipo silvestre (SEC ID. Nº: 1) que comprende al menos una mutación dentro de los nucleótidos 170 a 235 (-784 a -719) de la Sec. ID N:º: 1 para una expresión elevada en condiciones inducidas por metanol.
Description
Promotores mutantes de AOX1.
La presente invención se refiere a promotores
mutantes de AOX1 de Pichia pastoris.
S. cerevisiae ha dominado (y aún domina)
el uso científico y biotecnológico como organismo modelo eucariota y
sistema de producción. En el siglo pasado otra levadura ganó gran
atracción: la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe.
Debido a su cualidad de reproducirse únicamente mediante fisión,
S. pombe recibió excelente atención como organismo modelo y
actualmente, junto con S. cerevisiae, es la especie de
levadura más intensamente estudiada, en cuanto a genética molecular
y biología celular. Entre más de 700 especies de levaduras
diferentes conocidas hasta la fecha, las dos levaduras mencionadas
anteriormente pueden proporcionar solamente una serie limitada de
cualidades interesantes para aplicaciones tecnológicas y
científicas. Desde los años 1970 ó 1980 se investigaron cada vez más
especies de levaduras con características sobresalientes para
biotecnología e investigación. Estas levaduras, denominadas
no-convencionales (NCY) o levaduras
no-Saccharomyces (en este caso el término
Saccharomyces incluye a la levadura Schizosaccharomyces
pombe) se desarrollan por varias razones: poseen importancia
médica, como Candida albicans, o relevancia tecnológica, como
Yarrowia lipolytica y Kluyveromyces lactis, pueden
crecer sobre sustratos particulares (por ejemplo,
n-alcanos, lactosa). Por ejemplo, el patógeno
fúngico de seres humanos más común, C. albicans se ha
estudiado ampliamente ya que revela la naturaleza de los factores de
virulencia implicados en la patogenia, convirtiéndose, por tanto, en
el organismo modelo para levaduras patógenas. Otro grupo bien
establecido de NCY son las levaduras metilotróficas Pichia
pastoris y Hansenula polymorpha (Pichia angusta)
que son superiores a S. cerevisiae en cuanto a producción de
proteínas recombinantes y estudios de biogénesis de peroxisomas.
Estos son sólo los miembros más destacados de levaduras
no-convencionales que siguen teniendo atracción
académica o tecnológica. Hasta la fecha otras muchas especies
también tienen particular interés y este grupo crecerá rápidamente
en los próximos años.
Todas las levaduras conocidas utilizan azúcares,
la clase más abundante de moléculas en la naturaleza. Aunque existen
grandes diferencias en cuanto a la aceptación del sustrato de una
especie a otra (véase la Tabla 1), la transformación de glucosa
6-fosfato o fructosa 6-fosfato a
piruvato es un tema común en su metabolismo. De todos modos, el
equipo enzimático de la ruta glucolítica varía significativamente
entre las diferentes levaduras. Mientras que en S.
cerevisiae, la mayoría de las enzimas se conocen y se
caracterizan, al menos parcialmente, sólo unas pocas enzimas se
describen en las NCY. Algunas de las funciones necesarias para la
glucólisis están mediadas por varios genes/enzimas en algunas
levaduras, especialmente aquellas que desempeñan un papel adicional
en el control o en la regulación del metabolismo y/o que son un
punto de ramificación como glucoquinasa/hexoquinasa,
fosfofructoquinasa y gliceraldehído 3-fosfato
deshidrogenasa. Normalmente, las isoenzimas se regulan
diferencialmente lo que indica diversas funciones en requisitos
previos ambientales cambiantes. Algunos de los genes que codifican
enzimas glucolíticas son constitutivos y están sumamente expresados,
por ejemplo, el gen de PGK1 (fosfoglicerato quinasa) de S.
cerevisiae o el gen de GAP (gliceraldehído
3-fosfato deshidrogenasa) de P. pastoris,
mientras que otras enzimas se regulan rigurosamente como el gen de
ENO1 (enolasa) de S. cerevisiae.
En el metabolismo, el destino del piruvato varía
significativamente entre especies de levaduras y condiciones de
cultivo. En S. cerevisiae y otras levaduras denominadas
Crabtree positivas, la respiración se inhibe por glucosa y azúcares
relacionados. Esto conduce a la transformación del piruvato,
mediante la piruvato descarboxilasa, en etanol y en CO_{2},
incluso con grandes cantidades de oxígeno, lo que también se conoce
como fermentación. En las levaduras Crabtree negativas, a las que
pertenecen la mayoría de las NCY, la transformación del piruvato en
etanol se produce sólo en condiciones anaerobias. En condiciones
aerobias, el piruvato se oxida a CO_{2} mediante la piruvato
deshidrogenasa y el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA). El ciclo
del TCA es de interés excepcional para el metabolismo celular debido
al hecho de que es el único modo de realizar la oxidación de los
azúcares a CO_{2}. La oxidación a CO_{2} da como resultado la
producción de NADH, que se usa para la producción de energía. Además
los productos intermedios del ciclo del TCA son las principales
fuentes de metabolitos para fines biosintéticos. Debido a la
eliminación de los productos intermedios, el ciclo del TCA debe
reponerse para mantenerlo en funcionamiento. Las principales
reacciones anapleróticas en levaduras son el ciclo de la piruvato
carboxilasa y el del glioxilato. El primero es la ruta principal
cuando se cultivan en amonio como única fuente de nitrógeno mientras
que el segundo es necesario cuando se cultivan en fuentes de carbono
con menos de 3 átomos de carbono. A diferencia de este notable
interés, se sabe muy poco sobre los genes o las enzimas que
participan en el ciclo del TCA en las NCY. El NADH generado por las
reacciones catabólicas, tanto en el citosol como en las
mitocondrias, tiene que re-oxidarse a NAD^{+} para
mantener en funcionamiento a las reacciones. En levaduras Crabtree
negativas (por ejemplo, Pichia pastoris) en condiciones
aerobias, el NADH se re-oxida, principalmente, a
través de la cadena respiratoria. La situación es significativamente
diferente en levaduras Crabtree positivas, como S.
cerevisiae, en las que existe conjuntamente la respiración y la
fermentación. Cuando se cultivan en glucosa en condiciones aerobias,
la glucosa reprime la respiración y se produce la fermentación. En
estas condiciones el NAD^{+} se regenera por la formación de
etanol (el NADH producido por glucólisis) o glicerol. La respiración
en levaduras difiere del paradigma de esta ruta en animales, como se
describe en cada libro de texto de bioquímica. En primer lugar,
algunas levaduras, como S. cerevisiae y Kluyveromyces
lactis, carecen de complejo I de la cadena respiratoria. En
estas levaduras la regeneración del NAD^{+} se realiza sin bombeo
de protones a través de la membrana mitocondrial interna por NADH
deshidrogenasas externas e internas. La segunda diferencia
principal, observada en las levaduras Crabtree negativas, hongos y
plantas, es una ruta de respiración alternativa en paralelo al
complejo III y IV de la cadena del citocromo. Esta respiración
alternativa está mediada por una oxidasa denominada alternativa que
transfiere electrones directamente desde la reserva de ubiquinona al
oxígeno sin bombeo de protones a través de la membrana mitocondrial
interna.
EL NADPH se produce, con fines biosintéticos, en
la parte oxidativa de la ruta de la pentosa fosfato (PPP). Otros
metabolitos muy importantes proporcionados por esta ruta son, ribosa
5-fosfato y eritrosa 4-fosfato,
necesarios para la síntesis de ácidos nucleicos y cofactores de
nucleótidos y para la síntesis de aminoácidos aromáticos,
respectivamente. Todavía quedan muchas lagunas en cuanto a la
información sobre los genes y sus correspondientes enzimas
implicadas en la PPP en levaduras no convencionales. Se aislaron
algunas enzimas de Candida utilis, S. pombe y K.
lactis. La caracterización en cuanto a composición y cinética
reveló varias diferencias entre estas enzimas. Debido a la falta de
información no puede calcularse la influencia sobre la PPP en estas
levaduras, pero se ha observado que, por ejemplo, mutantes de
fosfoglucosa isomerasa de K. lactis, que carecen de
glucólisis, pueden cultivarse en medios con glucosa, a diferencia de
S. cerevisiae. Esta observación indica que la capacidad de la
ruta de la pentosa fosfato en K. lactis es suficiente para el
cultivo en glucosa como fuente de carbono. En levaduras
metilotróficas, pudo encontrarse una transquetolasa adicional
(dihidroxiacetona sintasa). Esta enzima se localiza en los
peroxisomas y confiere la asimilación de formaldehído en el
metabolismo celular por condensación con xilulosa
5-fosfato con formación de dihidroxiacetona y
gliceraldehído 3-fosfato.
Las levaduras, como organismos eucariotas
unicelulares, proporcionan sistemas de expresión atractivos para la
producción de proteínas recombinantes. Combinan los pros de
las bacterias, como técnicas de manipulación genética bien
desarrolladas, técnicas de cultivo sencillas, seguras y por lo tanto
asequibles (a gran escala), con el beneficio principal de los
sistemas de expresión eucariotas, concretamente el procesamiento de
proteínas eucariotas. Debido a las razones mencionadas
anteriormente, S. cerevisiae ha dominado este campo durante
muchos años, dando lugar a un gran número de proteínas (por ejemplo,
insulina, HBsAg, HSA) producidas en este organismo. S.
cerevisiae muestra algunas limitaciones debido a la
hiperglucosilación, retención de proteínas secretadas en el espacio
periplásmico, inestabilidad plasmídica y productos de bajo
rendimiento. Para superar las limitaciones de este sencillo
organismo, se desarrolló un pequeño conjunto de levaduras no
convencionales como hospedadoras para la expresión de genes
heterólogos. Entre otras, se usaron K. lactis, Y. lipolytica
y las levaduras metilotróficas Candida boidinii, H.
polymorpha y P. pastoris, pero sólo las 2 últimas
especies obtuvieron destacado interés comercial.
Schizosaccharomyces pombe presenta algunas características
muy próximas a las de eucariotas superiores lo que hace que esta
levadura sea un hospedador muy atractivo para la producción de
proteínas heterólogas: (1) el mecanismo de iniciación de la
transcripción es más parecido al de eucariotas superiores, (2)
algunos promotores de mamíferos son funcionales en S. pombe,
(3) la capacidad de corte y empalme del ARN, destacando en una
similitud de componentes del espliceosoma con los de mamíferos, (4)
puede reconocerse la señal de retención del retículo endoplásmico
KDEL de mamíferos, (5) la existencia de restos de galactosa en
glicoproteínas y (6) algunas otras modificaciones postraduccionales,
como acetilación e isoprenilación de proteínas se realizan de un
modo más parecido a las de las células de mamíferos que a las de
levaduras. Varias de las características mencionadas anteriormente
podrían aumentar la importancia de S. pombe en la producción
de proteínas recombinantes en el futuro próximo en lo que respecta a
la producción de proteínas heterólogas auténticas y aplicaciones de
alto rendimiento de las mismas, como genómica estructural y
funcional.
Todos los microorganismos poseen mecanismos para
adaptar su metabolismo a la utilización óptima de los nutrientes
disponibles en el entorno. La adaptación rápida y correcta a estas
limitaciones del entorno son los principales factores en el control
del crecimiento y otros parámetros fisiológicos de todos los
organismos. Para las levaduras, así como para la mayoría de
microorganismos, la glucosa es la fuente de carbono y de energía
preferida. Por lo tanto, no resulta sorprendente que la glucosa, el
monosacárido más abundante en la naturaleza, sea un mensajero
principal para las células que influyen en el crecimiento y
desarrollo de estos organismos por regulación de la expresión
génica, principalmente, pero no exclusivamente, a nivel del control
transcripcional. Mediante análisis de transcripción genómica se
reveló que, una considerable cantidad de genes se regulan por el
nivel de glucosa determinado por el entorno. Los genes con función
metabólica conocida en cuanto a la utilización de glucosa, como
transportadores de glucosa de baja afinidad y enzimas glucolíticas
así como genes que codifican proteínas ribosomales, se inducen por
glucosa. Por otro lado, la glucosa reprime una amplia serie de
genes, incluidos genes implicados en la utilización de fuentes
alternativas de carbono, gluconeogénesis, el ciclo del glioxilato,
funciones peroxisomales y respiración. La represión de la
respiración (efecto Crabtree) se produce sólo en unas pocas especies
de levaduras (levaduras fermentativas, Crabtree positivas) como
Saccharomyces cerevisiae mientras que en la mayoría de las
especies de levadura la glucosa no reprime la respiración (Crabtree
negativas). Aunque en los últimos 20 años se consiguió un amplio
conocimiento sobre la maquinaria de represión de la glucosa, basada
principalmente en la levadura Saccharomyces cerevisiae, su
mecanismo real, especialmente las partes aguas arriba de detección y
señalización de la glucosa, no se comprende completamente. Sin
embargo, para obtener una mejor comprensión del presente documento,
a continuación se describen brevemente algunos de los principales
actores de la represión por el catabolito de carbono como se
describe para S. cerevisiae.
El gen de SNF1 que codifica una Ser/Tre
proteína quinasa puede encontrarse en complejos de elevada masa
molecular en células de levaduras. Este gen se regula por cambios
conformacionales dentro del complejo producidos por fosforilación en
la subunidad reguladora de Snf1p. Hasta ahora, se han identificado 3
quinasas aguas arriba (Pak1p, Elm1p y Tos3p) para fosforilar y, por
lo tanto, activar la Snf1p. Su actividad es absolutamente necesaria
para la desrepresión de una amplia diversidad de genes reprimidos
por glucosa. Por lo tanto no es sorprendente que el Snf1p u
homólogos estén ampliamente conservados en eucariotas.
La proteína de dedo de cinc Mig1p puede unirse a
regiones promotoras de una amplia diversidad de genes reprimidos por
glucosa. Esta actúa, más probablemente, reclutando al complejo
represor general Ssn6(Cyc8)-Tup1p. La
proteína quinasa Snf1, controla la función de Mig1p, sin embargo, no
hay una prueba clara de una fosforilación directa. Mig1p se localiza
en el núcleo en su forma no fosforilada. El agotamiento de glucosa
produce la fosforilación de Mig1p seguido de translocación al
citoplasma. Cuando se añade glucosa a las células, Mig1p retrocede
rápidamente al núcleo y reprime la transcripción.
La Adr1p también pertenece a la familia de
proteínas de dedo de cinc y resultó ser un efector positivo de
proteínas peroxisomales y del gen ADH2, que codifica la
alcohol deshidrogenasa II reprimida por glucosa. La glucosa regula
negativamente la expresión de ADR1 mediante la proteína quinasa
dependiente del AMP cíclico (AMPc) a niveles elevados de AMPc. El
principal efecto regulador aparece a nivel de la traducción del
ARNm, pero también se observaron efectos reguladores en la
transcripción, así como estabilidad del ARNm, dependiendo de la cepa
de S. cerevisiae analizada.
Para un gran número de genes, incluyendo muchos
de los genes implicados en el metabolismo respiratorio, la
transcripción se activa sobre fuentes de carbono no fermentables
mediante el complejo Hap2/3/4/5. Para algunos genes implicados en la
respiración como CYC1 (que codifica el citocromo
c-iso-1) y COX6 (subunidad VI
del citocromo c oxidasa) se ha establecido que Snf1 es necesario
para la desrepresión después del crecimiento sobre glucosa. La
transcripción de HAP4 se reprime cuando la glucosa está
presente, no obstante, no puede demostrarse una participación
directa de Hap4p o Snf1p en la desrepresión.
La Gcr1p es una proteína principal activadora de
la transcripción de genes glucolíticos (por ejemplo, enolasa,
gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa). La Gcr1p,
junto con el factor general de la transcripción Rap1p, es el
elemento principal de la expresión de genes glucolíticos, con
respecto a la coordinación de la transcripción y es absolutamente
necesaria para la expresión a alto nivel. El patrón de expresión
genómica del mutante gcr1 de S. cerevisiae y de tipo
silvestre, que crecen en diversas fuentes de carbono, reveló 53
fases de lectura abiertas (ORF), incluyendo genes de la glucólisis,
como dependientes de Gcr1p.
Esta descripción de algunos factores de
transcripción y de la ruta de Snf1p y Mig1p debe proporcionar una
breve visión de conjunto de algunos participantes en el circuito de
represión de la glucosa. Debe tenerse en cuenta que existen más
ciclos reguladores que la ruta de Snf1p para la represión de la
glucosa. Aunque en los últimos 20 años se la logrado un amplio
conocimiento sobre la detección y señalización de glucosa,
importantes cuestiones continúan sin respuestas: cuál es la
naturaleza de la señal de la glucosa y cómo se regulan e integran
las rutas de señalización conocidas.
Un número limitado de especies de levadura puede
crecer en metanol como única fuente de carbono y energía. Estas
pertenecen a uno de los cuatro géneros de Pichia, Hansenula,
Candida y Torulopsis y comparten una ruta general de
utilización del metanol que se expresa después de la desrepresión o
inducción con metanol (véase 1.3.1). Dado que las reacciones
iniciales de esta ruta se encuentran compartimentalizadas en el
interior de los peroxisomas, estos orgánulos también están
inducidos. Debido a la fuerte inducción de los peroxisomas, las
levaduras Candida boidinii, Pichia methanolica, Pichia
pastoris y Hansenula polymorpha se usaron frecuentemente
en biología celular para estudiar la biogénesis y función de los
peroxisomas.
Como se ha mencionado anteriormente, las
levaduras metilotróficas comparten una ruta común de utilización de
metanol. La primera etapa es la oxidación del metanol a formaldehído
y a peróxido de hidrógeno, catalizada por alcohol oxidasas (AOX, CE
1.1.3.13). El H_{2}O_{2} tóxico se descompone en oxígeno y agua
por la acción de catalasa. Ambas enzimas están secuestradas en el
interior de los peroxisomas. El formaldehído se oxida mediante dos
reacciones de deshidrogenasa posteriores o se asimila en el
metabolismo celular por la condensación con xilulosa
5-fosfato (Xu5P). El formaldehído se oxida a
formiato y adicionalmente a dióxido de carbono mediante una
formaldehído deshidrogenada dependiente de glutatión (GSH) y una
formiato deshidrogenasa, ambas localizadas en el citosol. El NADH,
generado en ambas reacciones, se usa para producir energía para el
crecimiento en metanol. La reacción de condensación tiene lugar en
el interior de los peroxisomas y se cataliza mediante la
transcetolasa dihidroxiacetona sintasa mencionada anteriormente. Los
compuestos de C3 resultantes, la dihidroxiacetona (DHA) y el
gliceraldehído 3-fosfato (GAP) se metabolizan
adicionalmente en el citosol. Después de una fosforilación de la
DHA, se forma la fructosa 1, 6-bifosfato (FBP) por
una reacción aldolasa de dihidroxiacetona fosfato (DHAP) y GAP. La
FBP se transforma en
fructosa-6-fosfato por una fosfatasa
y la xilulosa 5-fosfato (Xu5P) se regenera en la
ruta de la pentosa fosfato. Un
tercio del GAP generado entra en la ruta de la gluconeogénesis para la síntesis de los constituyentes celulares.
tercio del GAP generado entra en la ruta de la gluconeogénesis para la síntesis de los constituyentes celulares.
Las enzimas clave de la ruta de utilización del
metanol, alcohol oxidasa y formiato deshidrogenasa, se producen a
niveles muy elevados después de inducción con metanol. La alcohol
oxidasa puede representar más del 30% de la proteína soluble total,
la dihidroxiacetona sintasa y la formiato deshidrogenada hasta un
20%. Los peroxisomas, que también están inducidos, pueden
representar aproximadamente el 80% del volumen celular. Para la
producción de proteínas recombinantes, se desarrollaron secuencias
promotoras de varios genes de utilización de metanol. Entre otras,
estos promotores fuertes y inducibles son una razón principal para
el amplio uso de Pichia pastoris y Hansenula
polymorpha como hospedadoras para la producción de
proteínas.
En H. polymorpha y en C. boidinii
un gen codifica una alcohol oxidasa: MOX (metanol oxidasa,
H. polymorpha) y AOD1 (alcohol oxidasa, C.
boidinii). Se encontraron 2 genes en las dos especies de
Pichia, P. pastoris (AOX1 y AOX2) y P.
methanolica (AUG1 y AUG2, genes que utilizan
alcohol, o MOD1 y MOD2), siendo Aox1p y Aug1p las
alcohol oxidasa principales. La comparación de regiones codificantes
reveló una similitud del 73-85% a nivel de
aminoácidos entre las levaduras metilotróficas [1]. La homología
entre las ORF (fases de lectura abiertas) de AOX1 y de
AOX2 de P. pastoris es del 92% y del 97% a nivel de
las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos, respectivamente [2,
3]. La alcohol oxidasa es una flavoproteína octamérica que contiene
FAD unido no covalentemente o un análogo modificado (FADm) por
subunidad. La traducción de AOX se produce en los ribosomas libres,
seguido de una importación postraduccional dentro de los
peroxisomas. La translocación dentro de los peroxisomas está
dirigida por una secuencia PTS1 (señal de dirección peroxisomal de
tipo 1) en su extremo C-terminal. Los oligómeros de
Aox se forman sólo después de la importación en la matriz
peroxisomal.
Ni en C. boidinii ni en P.
pastoris pudieron encontrarse oligómeros de Aox en el citosol a
diferencia de la dihidroxiacetona sintasa, que forma un dímero en el
citosol antes de su translocación dentro de la matriz peroxisomal.
La secuencia promotora de la alcohol oxidasa 1 de Pichia
pastoris, no solo tiene interés biotecnológico, sino también la
enzima debido a una amplia variedad de sustratos (alcoholes
primarios insaturados y saturados con longitud de cadena de corta a
moderada) y a una alta estabilidad en diversas condiciones de
reacción. La regulación de todos los genes de alcohol oxidasa se
produce a nivel de la transcripción y, más probablemente, en la fase
del inicio de la transcripción. Aunque AOX1 y AOX2 se
regulan de manera similar (ARNm no detectable en glicerol o glucosa,
detectable en la fase de privación de carbono, elevadas cantidades
en metanol), sus 5 regiones flanqueantes no comparten homología
significativa [2, 4].
Cada locus de AOX presenta un supuesto sitio de
unión a la ARN polimerasa (TATAAA; caja de
Goldberg-Hogness o TATA) en la posición -43 en
relación con el sitio de inicio de la transcripción primario. Las
dos secuencias líder de ARNm de AOX de P. pastoris, son
extremadamente ricas en restos A e inusualmente largas para
levaduras (115 nucleótidos (nt) para AOX1 y 160 nt para AOX2). Las
regiones de inicio de la traducción alrededor del codón de inicio
ATG (secuencia de Kozak; AOX1: CGAAACG ATG GCT, AOX2:
GAGAAAA ATG GCC) concuerdan con las secuencias consenso descritas
anteriormente para S. cerevisiae y eucariotas superiores. Aún
no se conoce la función fisiológica del segundo gen de la alcohol
oxidasa en P. pastoris y en P. methanolica. La
alteración de AOX1 o AUG1 produce graves defectos en
el crecimiento en estas cepas (el denominado fenotipo de utilización
lenta de metanol (Mut^{s})) mientras que las cepas aox2 y aug2
muestran tasas de crecimiento comparables con respecto a la cepa de
tipo silvestre. Se observaron 9 formas múltiples de la alcohol
oxidasa en P. methanolica, representando una oligomerización
aleatoria de los 2 productos génicos Aug1p y Aug2p. AUG1 y
AUG2 se regulan de un modo diferente: Aug1p solo puede
detectarse con privación de carbono y a concentración baja de
metanol y con el aumento de la concentración de metanol la
proporción de Aug2p con respecto a Aug1p aumenta. El desplazamiento
a octámeros con elevado contenido de Aug2p es debido a un aumento en
la expresión de AUG2, regulado a nivel de la transcripción.
Los valores de Km para el metanol de los dos homo octámeros de Aug1p
y Aug2p son aproximadamente de 0,56 y 5,6 mM, respectivamente. Junto
con el hallazgo, esta alteración de AUG1 produce un defecto en el
crecimiento a concentraciones bajas de metanol [5], estos resultados
implican que AUG2 es una ventaja para P. methanolica cuando
crece con elevadas concentraciones de metanol. En Pichia
pastoris ni se analizó la función del gen AOX2 con más
detalle, ni se encontraron condiciones favorables para poseer un
segundo gen de alcohol oxidasa. Dado que las condiciones de
laboratorio representan sólo una fracción muy pequeña de las
condiciones no parasíticas a las que se enfrentan los
microorganismos,
debería haber situaciones en la naturaleza en las que el gen AOX2 fuera de importancia selectiva para P. pastoris.
debería haber situaciones en la naturaleza en las que el gen AOX2 fuera de importancia selectiva para P. pastoris.
La expresión de AOD1 en C.
boidinii y de MOX en H. polymorpha se reprime
rigurosamente durante el crecimiento en glucosa o en etanol como
única fuente de carbono, se desreprime en glicerol y se induce
fuertemente en metanol. La expresión de estas dos enzimas también se
reprime cuando en el medio están presentes la glucosa y el metanol.
Si el glicerol está presente el metanol puede inducir la expresión
génica. La transcripción de AOD1 y MOX también se
desreprime con privación de carbono y se reprime cuando el etanol
está presente [6-9]. Dos mecanismos reguladores
distintos son los responsables de la represión del metabolismo de
utilización de metanol por etanol o glucosa [10, 11]. En Pichia
pastoris la situación es significativamente diferente:
AOX1 se reprime cuando la glucosa, el etanol o el glicerol
están presentes en los medios (en concentraciones limitantes sin
crecimiento). La desrepresión con privación de carbono e inducción
por metanol es similar para AOD1 y MOX. Las fuentes de
carbono con las que se desreprime la expresión de AOX1, son,
por ejemplo, sorbitol, manitol, trehalosa y alanina [12].
Después del cambio de metanol a una fuente de
carbono de represión como la glucosa o el etanol, los peroxisomas se
degradan en horas durante la adaptación a la nueva fuente de
carbono. La degradación proteolítica en la vacuola de la levadura
sigue, de nuevo, dos mecanismos distintos cuando se adapta a la
glucosa o al etanol, denominados micro- y
macro-autofagia, respectivamente.
Como se ha mencionado anteriormente, las
levaduras metilotróficas Pichia pastoris y Hansenula
polymorpha se usan ampliamente para la producción de proteínas
recombinantes. Hasta ahora, se han producido más de 500 proteínas en
P. pastoris. Su desarrollo fue impulsado por algunas
características, que las aporta ventajas entre los hospedadores de
expresión recombinante: 1) comparten las ventajas generales de las
levaduras en cuanto a manipulación genética y a tecnología de
cultivo y (en el laboratorio y a gran escala); 2) la capacidad de
crecer a densidades celulares extremadamente altas; y 3) el alto
nivel de producción de proteína recombinante (secretada o
intracelular). Para la producción de proteínas recombinantes, se
desarrollaron fuertes promotores inducibles de genes que codifican
las reacciones de la ruta de utilización del metanol. Las más
ampliamente usadas son las regiones promotoras de los genes de
alcohol oxidasa AOX1 y MOX de P. pastoris y
H. polymorpha, respectivamente. Pero también se usaron otras
regiones promotoras de los genes de la ruta de utilización de
metanol para impulsar la producción de proteínas recombinantes:
promotores de FMD (formiato deshidrogenasa) y DAS1
(dihidroxiacetona sintasa) en H. polymorpha y en C.
boidinii y el promotor FLD1 (formaldehído deshidrogenasa)
en P. pastoris. Este último también puede inducirse con
metilamina como única fuente de nitrógeno con la glucosa como una
fuente de carbono. También están disponibles promotores para la
expresión constitutiva de genes extraños: el elemento promotor de
GAP (gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa) en
P. pastoris y el promotor de PMA1 (que codifica la H+ ATPasa
de la membrana plasmática) en H. polymorpha. Se desarrollaron
varias combinaciones de cepa hospedadora auxotrófica/gen marcador
para P. pastoris (por ejemplo, HIS4) y H.
polymorpha (por ejemplo, LEU2 y URA3). También se
encuentran disponibles marcadores de selección dominantes (por
ejemplo, Zeocin^{TM}, resistencia a G418). La integración de genes
en levaduras metilotróficas se realiza principalmente (si no
exclusivamente) por integración de homólogos. También se encuentran
disponibles vectores que llevan una región ARS (secuencia
autónomamente replicante), pero por lo general son bastante
inestables si se libera presión de selección lo que provoca su
aplicación tecnológica limitada. En P. pastoris, el gen
extraño está integrado específicamente en el sitio en el locus de
AOX1 o en el de HIS4. Otros posibles sitios de
integración son, por ejemplo, el locus de GAP (para la expresión de
GAP) o cualquier otro locus marcador de selección (por ejemplo,
ADE1, URA3, ARG4 y LEU2). En H. polymorpha, los
casetes de expresión se integran al azar en una disposición de
cabeza a cola, dando lugar a integrantes mitóticamente estables con
un elevado número de copias (hasta 100). Sin embargo, a menudo un
elevado número de copias no da como resultado una expresión de alto
nivel. Son factores adicionales de gran influencia: la estructura
del casete de integración, la naturaleza y la estructura de la
proteína a expresar y el sitio de integración. Especialmente la
estructura del casete de integración es de gran influencia sobre el
efecto de dosificación de genes. En [13, 14] se proporciona una
exposición adicional de cómo optimizar el casete de expresión y la
dosificación de genes. Las levaduras metilotróficas pertenecen al
grupo de levaduras Crabtree negativas, de manera que la producción
de etanol se produce a un nivel muy bajo, cuando crecen en
condiciones aerobias. Debido a esto, estas levaduras pueden crecer a
densidades celulares muy altas en cultivos de fermentación, dando
como resultado productos alto rendimiento. La producción de
proteínas impulsada por AOX1 puede aumentarse
3-5 veces más cuando la concentración de metanol en
el biorreactor está en esferas de crecimiento limitado. El hecho de
que P. pastoris secrete, en condiciones convencionales, sólo
bajas cantidades de proteínas endógenas, hace que cada proteína
recombinante secretada en el medio sea más abundante. La secreción
puede servir como una primera etapa sustancial en el proceso de
purificación aguas abajo. Para la secreción de proteínas, en P.
pastoris y H. polymorpha, se usa ampliamente la secuencia
prepro líder MF\alpha1 (factor de apareamiento \alpha) de S.
cerevisiae y las secuencias derivadas de la fosfatasa ácida
(PHO1). En algunos casos se obtuvo secreción suficiente con
proteínas de plantas, hongos y mamíferos que llevan sus señales de
secreción naturales. Como se ha mencionado anteriormente, las
levaduras pueden realizar modificaciones postraduccionales como la
formación de enlaces disulfuro, procesamiento de secuencias de señal
(por ejemplo, la secuencia prepro líder de MF\alpha1), adición de
lípidos y glucosilación asociada a N- y O-. Mientras que en células
de mamíferos, se producen estructuras de oligosacáridos asociadas a
N- y O- altamente complejas, compuestas por una diversidad de
azúcares (por ejemplo, N-acetilglucosamina,
galactosa y ácido siálico), la mayoría de las levaduras generan
estructuras de tipo manosa superior que carecen de algunas entidades
de azúcar como galactosa o ácido siálico. Estas estructuras de tipo
no-mamífero pueden causar graves problemas de
aplicación terapéutica debido principalmente a su alto potencial de
inmunogenicidad. En H. polymorpha y P. pastoris, a
diferencia de S. cerevisiae, la hipermanosilación es menos
abundante y no se incorporan manosas asociadas a terminales
hiper-inmunogénicas \alpha-1, 3 en
oligosacáridos asociados a N. Para superar los problemas de
inmunogenicidad (y algunos otros como baja estabilidad en el flujo
sanguíneo) se han realizado esfuerzos sobre como humanizar
estructuras de oligosacáridos derivadas de levaduras y
especialmente, como pone de manifiesto la bibliografía reciente, en
P. pastoris. Hasta ahora, la inmensa mayoría de artículos de
investigación y procesos comerciales se basan en la famosa levadura
S. cerevisiae. Debido al mayor conocimiento sobre las
levaduras no convencionales, junto con las apreciables ventajas en
cuanto a fermentación a gran escala y elementos de glucosilación,
H. polymorpha y P. pastoris se están convirtiendo
rápidamente en las levaduras
de elección. Esto se destaca por el hecho de que varios de los procesos de producción se aplicaron en la industria.
de elección. Esto se destaca por el hecho de que varios de los procesos de producción se aplicaron en la industria.
En el documento WO 02/081650 se describe la
identificación de las regiones promotoras de AOX1, que pueden
usarse para la construcción de promotores mutantes de AOX1.
Dado que las regiones de secuencias delecionadas del promotor de
AOX1 descritas en el mismo son muy largas, pudo observarse el efecto
acumulado y no los efectos individuales de las distintas secuencias
reguladoras del promotor. Sin embargo, dicha estrategia no permitirá
el desarrollo de promotores fuertemente mejorados. Especialmente,
cuando se construyen nuevos promotores, con características
mejoradas, delecionando o duplicando partes del promotor original,
es necesario conocer el intervalo exacto de la secuencia
reguladora.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un promotor de AOX1 mejorado, con propiedades
potenciadas, con el fin de facilitar el procesamiento, aguas abajo,
en la producción de proteínas, aumentar los rendimientos de
espacio-tiempo y ayudar a enriquecer la calidad de
los productos.
Otro objeto es proporcionar un fuerte promotor
de AOX1 en un vector o en una cepa hospedadora que anticipe
parcial o totalmente la represión de glucosa. Tener un promotor que
impulse una fuerte expresión en presencia de elevadas
concentraciones de glucosa, es una ventaja.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar un promotor de AOX1 que permita la producción de
una proteína sin metanol o empleando una cantidad de metanol
reducida. Dichos promotores tendrían un impacto significativo en los
procesos de producción industrial. Por cuestiones de seguridad se
necesitan equipos especiales para las plantas de producción que
emplean metanol como un inductor. Esto contradice las aplicaciones
de Pichia pastoris en muchas plantas de producción menos
especializadas. Además la estabilidad de las proteínas en presencia
de metanol puede obstaculizar la inducción de la expresión de las
proteínas basada en metanol. Esto es menos crítico para la
producción de proteínas industriales fuertes, pero se convierte en
una cuestión importante para, por ejemplo, proteínas terapéuticas
secretadas.
La construcción de dichos promotores requiere el
conocimiento de partes específicas (por ejemplo, elementos
reguladores, sitios de unión a factores de transcripción) del
promotor de AOX1 de tipo silvestre de Pichia pastoris
que -cuando muta de alguna manera- presentan un efecto en el
comportamiento de la expresión. Por lo tanto, es un objeto de la
presente invención identificar estas partes y proporcionar, por
tanto, los medios para crear promotores de AOX1 con
características mejoradas.
Por lo tanto, la presente invención refiere a un
promotor mutante de la alcohol oxidasa 1 (AOX1) de Pichia
pastoris del promotor de AOX1 de Pichia pastoris
de tipo silvestre (SEC ID Nº 1) como se define en las
reivindicaciones. Adicionalmente, dicho promotor mutante puede
comprender al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste
en:
- a)
- un sitio de unión a factores de transcripción (TFBS),
- b)
- los nucleótidos 170 a 191 (-784 a -763), los nucleótidos 192 a 213 (-762 a -741), los nucleótidos 192 a 210 (-762 a -744), los nucleótidos 207 a 209 (-747 a -745),los nucleótidos 214 a 235 (-740 a -719), los nucleótidos 304 a 350 (-650 a -604), los nucleótidos 364 a 393 (-590 a -561), los nucleótidos 434 a 508 (-520 a -446), los nucleótidos 509 a 551 (-445 a -403), los nucleótidos 552 a 560 (-402 a -394), los nucleótidos 585 a 617 (-369 a -337), los nucleótidos 621 a 660 (-333 a -294), los nucleótidos 625 a 683 (-329 a -271), los nucleótidos 736 a 741 (-218 a -213), los nucleótidos 737 a 738 (-217 a -216), los nucleótidos 726 a 755 (-228 a -199), los nucleótidos 784 a 800 (-170 a -154) o los nucleótidos 823 a 861 (-131 a -93) de la Sec ID Nº: 1, y combinaciones de los mismos. Los números entre paréntesis (negativos) a lo largo de la descripción, reflejan las posiciones correspondientes del promotor en relación con el codón de inicio de la traducción (por ejemplo, ATG). Por ejemplo, la "A" de "ATG" en una secuencia de ácido nucleico que comprende N_{x}GACTATGN_{y} corresponde a la posición de + 1, mientras que la "T" antes de la "A" de "ATG" corresponde a la posición de -1.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con la presente invención, el
promotor mutante de AOX1 comprende al menos una mutación,
dentro de un sitio de unión a factores de transcripción y/o de uno
de los intervalos de las secuencias de ácido nucleico indicadas
anteriormente. Resultó que, especialmente, estas regiones del
promotor de AOX1 son adecuadas para modificar a dicho
promotor con el fin de modificar sus características. Por supuesto,
también puede introducirse una combinación de las mutaciones
indicadas anteriormente para mejorar las características de un
promotor de AOX1 (por ejemplo, dos mutaciones en TFBS
seleccionadas de a), una mutación de TFBS, seleccionada de a) y una
mutación seleccionada de b), una mutación seleccionada de a) y dos
mutaciones seleccionadas de b)). Por ejemplo, una mutación de un
TFBS puede combinarse con una mutación dentro de los nucleótidos 737
a 738 (-217 a -216) y/o en los nucleótidos 207 a 209 (-747 a -745)
de la Sec ID Nº: 1. La expresión de una proteína bajo el control de
un promotor de AOX1 en Pichia pastoris se induce
generalmente por la adición de metanol y se inhibe por la presencia
de glucosa en el medio. Con el fin de potenciar o de reducir el
efecto de dichos aditivos en el medio sobre la expresión de
proteínas, el promotor muta preferentemente en las regiones
promotoras indicadas anteriormente. La eficacia de los promotores
mutados de AOX1 para producir una proteína de interés varía
dependiendo de la cantidad (es decir, copias) del vector integrado
en el cromosoma del hospedador. Especialmente, cepas multicopia
resultaron mostrar efectos potenciados del promotor. Dado que la
resistencia a antibióticos de las cepas de Pichia depende del
número de casetes de resistencia a antibióticos (los vectores
introducidos en un hospedador comprenden, preferiblemente, un casete
de resistencia a antibióticos, lo que permite al hospedador crecer
sobre/en un medio que comprende un antibiótico como marcador
selectivo) integrados en el cromosoma de dicho hospedador, pueden
producirse cepas multicopia aplicando concentraciones en aumento del
antibiótico (dentro del intervalo de 10 \mug/ml a 10 mg/ml,
preferiblemente de 50 \mug/ml a 1000 \mug/ml; dependiendo del
antibiótico usado; por ejemplo, geneticina: de 0,1 a 10 mg/ml,
preferiblemente de 0,2 a 5 mg/ml, particularmente de 0,25 a 4 mg/ml,
zeocina: de 10 a 5000 \mug/ml, preferiblemente de 50 a 3000
\mug/ml, particularmente de 100 a 2000 \mug/ml) sobre las placas
de agar selectivas para aumentar la presión de selección (por
ejemplo, [14]; Scorer, C. A. et al (1994) Bio/Technology
12:181-184). Sin embargo, se observó que el
crecimiento de células que contienen una multiplicidad de casetes de
resistencia a antibióticos no sólo depende de la concentración del
antibiótico, sino que también depende del tiempo. Por lo tanto, para
proporcionar una colonia detectable, las cepas multicopia pueden
crecer, en un medio que contiene la misma concentración de
antibiótico, en un período de tiempo más corto que las cepas
unicopia. Este comportamiento permite al experto en la materia
detectar y aislar cepas multicopia antes de que las cepas unicopia
comiencen a crecer. Por ejemplo, una cepa que contiene una sola
copia de un casete de resistencia a antibióticos crece en una placa
de agar para proporcionar un tamaño de colonia detectable en 72
horas, mientras que la misma cepa, que contiene más de una copia de
dicho casete, crece en 24 a 48 h para proporcionar el mismo
tamaño.
Especialmente, las cepas multicopia que
contienen un promotor de AOX1 con mutaciones dentro de los
nucleótidos 694 a 723 (-260 a -231) y dentro de los nucleótidos 737
a 738 (-217 a -216) mostraron tasas de expresión sorprendentemente
potenciadas.
Para aumentar la eficacia de expresión de las
proteínas de un hospedador en presencia de metanol, preferiblemente
se mutan los nucleótidos 170 a 235 (-784 a -719) del promotor de
AOX1 (SEC ID Nº: 1). Una mutación en esta región, aumenta la
expresión de las proteínas del 120 al 130%, en comparación con el
promotor de AOX1 de tipo silvestre, siempre que el plásmido, que
lleva el promotor mutante de AOX1, se integre sólo una vez en el
cromosoma/genoma del hospedador (mutante unicopia). Sin embargo, las
mutaciones dentro de las otras regiones restantes mencionadas
anteriormente, reducen o no influyen en la eficacia del metanol para
inducir la expresión de las proteínas. A diferencia de esto, las
mutaciones en las regiones promotoras del promotor de AOX1 de
tipo silvestre, (como se ha indicado anteriormente) conducen -
dependiendo de la mutación - a aumentar y a disminuir la expresión
de las proteínas en condiciones de desrepresión (véase, por ejemplo,
la Tabla 13, ejemplo 1).
Sin embargo, cepas recombinantes que contienen
más de una copia de promotores mutados de AOX1 dan como
resultado cepas que tienen una actividad potenciada en condiciones
de desrepresión e inducidas por metanol (cepas multicopia, véase,
por ejemplo, la Fig. 7, ejemplo 2). Detalladamente, cepas multicopia
que contienen mutaciones dentro de los nucleótidos 694 y 723 de la
SEC ID Nº. 1 (d6), dentro de los nucleótidos 694 y 723 (-260 y -231)
de la SEC ID Nº: 1 (d6), dentro de los nucleótidos 694 y 723 (-260 y
-231) y dentro de los nucleótidos 304 y 350 (-650 y -604) de la SEC
ID Nº: 1 (d2d6), dentro del TFBS, especialmente dentro de Rap1,
Gcr1, QA-1F, Hsf_1, Adr1, Hsf_2, Mat1MC, abaA y
Hap2345, muestran una expresión aumentada en condiciones de
desrepresión y/o bajo inducción con metanol en comparación con la
expresión de proteínas bajo el control del promotor de AOX1
de tipo silvestre. En condiciones de desrepresión, algunas de estas
cepas multicopia muestran expresiones de proteínas aumentadas
aproximadamente 10 veces en comparación con expresiones bajo el
control del promotor de tipo silvestre. En presencia de metanol como
inductor, la eficacia de la expresión se potencia más de 5 veces
cuando se emplea un promotor de acuerdo con la presente invención.
Por lo tanto, estas mutaciones, especialmente cuando están presentes
en el hospedador en una forma multicopia, se emplean preferiblemente
para la expresión de proteínas. La combinación de dos o más de las
mutaciones mencionadas anteriormente, puede potenciar adicionalmente
la fuerza del promotor (véase, por ejemplo, la Fig. 7, ejemplo
2).
Los sitios de unión a factores de transcripción
pueden identificarse experimentalmente (por ejemplo, por análisis de
cambio de movilidad o impresión) o por comparación de secuencias con
sitios de unión a factores de transcripción conocidos (por ejemplo,
por análisis informático, [15]).
El conocimiento de regiones promotoras, que
influyen en la fuerza y en las características de dicho promotor,
puede usarse para diseñar promotores con distintas propiedades
(expresión alta de proteínas en condiciones de desrepresión y/o
expresión alta de proteínas en presencia de metanol). Además, si
estos promotores mutantes se integran una o más veces en el genoma
del hospedador, estas propiedades pueden potenciarse o modificarse
(véanse, por ejemplo, los ejemplos de 1 a 3).
Sin embargo, en algunos casos la actividad del
promotor debe disminuir en lugar de aumentar. Especialmente, en
muchos casos, es necesario que la co-expresión de
proteínas reguladoras como quinasas, fosforilasas y proteínas
auxiliares, tales como, por ejemplo, proteínas acompañantes,
proteínas disulfuro isomerasas, cis-trans
isomerasas, foldasas, y proteasas, sea baja en comparación con el
producto principal, que puede producirse por la célula bajo el
promotor de tipo silvestre o bajo un promotor mejorado de acuerdo
con la presente invención. Especialmente, la expresión combinada de
dos productos diferentes (por ejemplo, una proteína auxiliar y el
producto principal) bajo el control de un promotor de AOX1 con
actividad aumentada y un promotor de AOX1 con actividad disminuida
(en comparación con la actividad de tipo silvestre),
respectivamente, resultó ser ventajosa, porque la tasa de expresión
del producto principal y secundario difiere mucho más en lugar de
usar promotores de AOX1 de tipo silvestre. La expresión reducida
puede obtenerse preferiblemente delecionando sitios de unión al
activador como HSF o HAP o insertando sitios de unión al represor en
el promotor de AOX1 de tipo silvestre. Por lo tanto, el uso del
promotor de AOX1 con actividad reducida evita la sobrecarga de la
maquinaria de expresión de proteínas de la célula, que tendría como
consecuencia, la reducción del rendimiento del producto principal.
Por ejemplo, Bessette P H et al. (PNAS USA (1999)
96:13703-13708) pudieron demostrar que la expresión
de un polipéptido activo podía aumentarse significativamente
mediante la co-expresión de una tiorredoxina.
De acuerdo con una realización preferida el
promotor comprende además una mutación dentro de los nucleótidos 694
a 723 (-260 a -231) y/o de los nucleótidos 729 a 763 (-225 a -191)
de la Sec ID Nº: 1.
Una mutación que afecta a estos nucleótidos
varía en combinación con una mutación como se ha indicado
anteriormente, dando como resultado la actividad del promotor aún
más mejorada. Por ejemplo, una mutación doble que afecte a los
nucleótidos 694 a 723 (-260 a -231) y a los nucleótidos 737 a 738
(-217 a -216) de la Sec ID Nº 1 conduce a un promotor que muestra
mayores niveles de expresión bajo desrepresión así como en
condiciones inducidas en comparación con los niveles de expresión
bajo las mismas condiciones del promotor de tipo silvestre. Cuando
el ácido nucleico, que comprende el promotor, se introduce en la
célula en más de una copia (dando como resultado un clon
multi-copia), puede mejorarse el efecto de esta
mutación doble.
La mutación es, preferiblemente, una deleción,
una sustitución, una inserción, una inversión y una
multiplicación.
Para modificar las características del promotor
de AOX1 de tipo silvestre de Pichia pastoris son
posibles varios tipos de mutaciones. Los tramos del promotor que
comprenden las regiones mencionadas anteriormente (sitios de unión a
factores de transcripción (TFBS), los nucleótidos 170 a 235 (-784 a
-719), 170 a 191 (-784 a -763), 192 a 213 (-762 a -741), 192 a 210
(-762 a -744), 207 a 209 (-747 a -745), 214 a 235 (-740 a -719), 304
a 350 (-650 a -604), 364 a 393 (-590 a -561), 434 a 508 (-520 a
-446), 509 a 551 (-445 a -403), 552 a 560 (-402 a -394), 585 a 617
(-369 a -337), 621 a 660 (-333 a -294), 625 a 683 (-329 a -271), 694
a 723 (-260 a -231), 729 a 763 (-225 a -191), 736 a 741 (-218 a
-213), 737 a 738 (-217 a -216), 726 a 755 (-228 a -199), 784 a 800
(-170 a -154) o 823 a 861 (-131 a -93) de la Sec ID Nº. 1) pueden
delecionarse o sustituirse parcial o completamente, por otros
nucleótidos o secuencias de ácido nucleico, alterarse por inserción
de nucleótidos individuales o secuencias de ácido nucleico,
invertirse parcial o completamente o multiplicarse. Todas estas
mutaciones conducen a un cambio en la actividad del promotor, porque
las características estructurales y/o los sitios de
unión/reconocimiento, por ejemplo, factores de transcripción, se ven
afectados por dichas mutaciones. Sin embargo, estos cambios pueden
conducir a una actividad aumentada o disminuida del promotor en
comparación con el promotor de tipo silvestre.
Es bien conocido en la técnica anterior que la
multiplicación/duplicación de tramos específicos de ácidos nucleicos
puede aumentar la actividad del promotor. La regulación de la
expresión génica de muchos promotores eucariotas, especialmente
promotores de levaduras, implica interacciones múltiples entre los
factores de transcripción unidos dentro de un promotor. Para el
funcionamiento de incluso los elementos más pequeños que actúan en
cis, pueden necesitarse sitios múltiples. En células de levaduras,
para la transcripción son necesarias secuencias activadoras aguas
arriba (UAS). Estas operan en cualquier orientación y a una
distancia variable con respecto a la caja TATA y al sitio de inicio
de la transcripción, pero a diferencia de los amplificadores en
eucariotas superiores, deben estar aguas arriba desde estos
elementos basales. Las UAS son dianas de varios activadores
transcripcionales.
La mayoría de los fenómenos de represión en
células de levadura producen la inactivación o la ausencia de
factores de transcripción. Sin embargo, también pueden identificarse
algunos sitios reguladores negativos (secuencias de represión aguas
arriba (URS)).
Basándose en el análisis de deleción del
promotor de AOX2 de P. pastoris se encontraron tres
regiones reguladoras, dos regiones de acción negativa (URS1 y URS2)
y un dominio de acción positiva (UAS) [3]. Para el promotor de
MOX de H. polymorpha también se describieron dos
secuencias de activación aguas arriba (UAS1 y UAS2) y un sitio de
unión al represor (URS1) [8]. También pudieron identificarse
secuencias correspondientes en promotores de AOX1 (nucleótidos 585 a
614 (-369 a -340) y 725 a 756 (-229 a -198), mostrando similitudes
con las UAS de AOX2 [3], así como nucleótidos 622 a 656 (-332
a -298) [8]). La multiplicación (2, 3, 4, 5, 6 o 7 veces de UAS) de
estos tramos de ácido nucleico pueden producir un promotor con una
fuerza mejorada conduciendo a la expresión de proteínas aún más
potente. Por lo tanto, la construcción de promotores que comprenden
UAS múltiples, que impliquen preferiblemente las regiones de las
secuencias mencionadas anteriormente similares a las UAS de
AOX2 y de MOX, u otros tramos de secuencias múltiples
(por ejemplo, los intervalos de secuencias de ácido nucleico
descritos anteriormente) también se encuentran en el ámbito de la
presente invención y se considera que es una realización preferida.
Normalmente una secuencia de activación se encuentra dentro de
algunos cientos de pares de bases de un promotor. Por ejemplo, las
secuencias de más activación se encuentran aproximadamente dentro de
200 a 400 pares de bases del promotor que se mejora. Además,
normalmente aguas arriba, el promotor contiene más amplificadores y
sitios de unión a factores de transcripción.
Al menos una mutación del promotor de
AOX1 puede introducirse por métodos convencionales conocidos
por un experto en la materia (por ejemplo, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual (tercera edición), J. Sambrook y D. Russell, 2001,
Cold Spring Harbor Laboratory Press).
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención el sitio de unión a factores de transcripción
(TFBS) se selecciona del grupo que consiste en Hap1, Hsf, Hap234,
abaA, Stre, Rap1, Adr1, Mat1MC, Gcr1 y
QA-1F.
QA-1F.
La mutación de al menos uno de estos TFBS
produce promotores mutantes con diversas características (véase el
ejemplo 2).
Preferiblemente, el sitio de unión a factores de
transcripción (TFBS) Hap1 comprende los nucleótidos 54 (-900) a 58
(-896) de la Sec ID Nº: 1, Hsf los nucleótidos 142 (-812) a 149
(-805) y 517 (-437) a 524 (-430) de la Sec ID Nº: 1, Hap234 los
nucleótidos 196 (-758) a 200 (-754), 206 (-748) a 210 (-744) y 668
(-286) a 672 (-282) de la Sec ID Nº: 1, abaA los nucleótidos 219
(-735) a 224 (-730) de la Sec ID Nº: 1, Stre los nucleótidos 281
(-673) a 285 (-669) de la Sec ID Nº: 1, Rap1 los nucleótidos 335
(-619) a 339 (-615) de la Sec ID Nº: 1, Adr1 los nucleótidos 371
(-583) a 377 (-577) de la Sec ID Nº: 1, Mat1MC los nucleótidos 683
(-217) a 687 (-267) de la Sec ID Nº: 1, Gcr1 los nucleótidos 702
(-252) a 706 (-248) de la Sec ID Nº: 1 y QA-1F los
nucleótidos 747 (-207) a 761 (-193) de la Sec ID Nº: 1.
Estos TFBS pueden identificarse
experimentalmente o por comparación con los TFBS de otros promotores
conocidos (por ejemplo, los promotores de eucariotas) con la ayuda
de programas informáticos (véase, por ejemplo, el ejemplo 1).
En la tabla 2 se proporciona un resumen de la
influencia de promotores mutantes de AOX1 en la expresión de
proteínas, péptidos o ácidos nucleicos funcionales (en comparación
con la actividad de tipo silvestre),
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a una molécula ácido nucleico que comprende un promotor mutante de
alcohol oxidasa 1 (AOX1) de Pichia pastoris de acuerdo
con la presente invención y a un ácido nucleico que codifica una
proteína, un péptido o un ácido nucleico funcional, en el que el
promotor y dicho ácido nucleico se encuentran operativamente unidos
entre sí.
El promotor mutante de AOX1 puede unirse
un gen que codifica una proteína (por ejemplo, una enzima), un
péptido (por ejemplo, una hormona) o un ácido nucleico funcional
(por ejemplo ARNsi). El fragmento del ácido nucleico resultante
puede usarse para expresar, por ejemplo, una proteína cuando se
introduce en un organismo, preferiblemente una levadura,
especialmente una cepa de Pichia pastoris. La construcción de
dicha molécula de ácido nucleico es bien conocida por un experto en
la materia y puede realizarse con métodos biológicos moleculares
convencionales (por ejemplo, Clonación Molecular: A Laboratory
Manual (tercera edición), J. Sambrook y D. Russell, 2001, Cold
Spring Harbor Laboratory Press; manual "Pichia Expression Kit",
Invitrogen Corp.).
"Unido operativamente" se refiere a una
primera secuencia (o secuencias) que se posicionan lo
suficientemente próximas a una segunda secuencia (o secuencias) de
manera que la primera secuencia (o secuencias) puede ejercer
influencia sobre la segunda secuencia (o secuencias) o una región
bajo el control de esta segunda secuencia. Por ejemplo, un promotor
puede unirse operativamente a un gen de manera que el gen se
expresará bajo el control del promotor, que típicamente estaría en
la posición 5' para el gen. Normalmente, un promotor central estará
dentro de algunos cientos de pares de bases del sitio de inicio de
la traducción. Aproximadamente 30 pb aguas abajo existe normalmente
un elemento promotor aguas abajo.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un vector que comprende un promotor mutante de alcohol oxidasa 1
(AOX1) de Pichia pastoris de acuerdo con la presente
invención o una molécula de ácido nucleico como se ha indicado
anteriormente.
Para introducir el promotor mutante,
opcionalmente unido operativamente a un ácido nucleico que codifica
una proteína, un péptido o un ácido nucleico funcional, en un
hospedador, preferiblemente en una cepa de levadura metilotrófica
(por ejemplo una cepa de Pichia pastoris), dicho promotor
tiene que proporcionarse en un vector, que puede usarse para la
transformación de dicho hospedador. Por ejemplo, dichos vectores
pueden ser plásmidos episomales de levadura (YEp), plásmidos
integradores de levadura (YIp) o cromosomas artificiales de
levadura. Dichos vectores comprenden normalmente un origen de
replicación (si fuera necesaria la amplificación en hospedadores
microbianos) y un marcador de selección para la propagación de los
vectores en E. coli, promotores y terminadores para la
expresión de las proteínas recombinantes en levaduras y marcadores
de selección para levaduras. Los vectores no integradores comprenden
adicionalmente una secuencia de replicación autónoma (ARS) que
garantiza la estabilidad del vector en la célula (por ejemplo,
Myers, A.M., et al. (1986) Gene 45:299-310).
Los vectores integradores que no contienen secuencias AR, comprenden
regiones de secuencias que son homólogas a regiones del genoma. De
manera alternativa, para la transformación puede usarse ADN lineal,
por ejemplo el que se origina a partir de una PCR.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a una célula que comprende al menos un promotor mutante de alcohol
oxidasa 1 (AOX1) de Pichia pastoris, al menos un
fragmento de ácido nucleico o al menos vector como se ha descrito en
este documento. La introducción de una molécula de ácido nucleico
que contiene un promotor mutante de AOX1 (por ejemplo un
vector, en el que el promotor está unido operativamente a un ácido
nucleico que codifica una proteína) dentro de un hospedador puede
realizarse, por ejemplo, por el electroporación. Dicha molécula de
ácido nucleico se integra en el cromosoma después de su introducción
en dicho hospedador en una sola copia o en múltiples copias o está
presente en la célula como un plásmido de replicación autónomo de
una sola copia o multicopia. Si se usan varios promotores mutantes,
todos pueden estar unidos con solo gen (que codifica una proteína o
un ácido nucleico funcional (por ejemplo, ribozima, ARN antisentido
etc.), una proteína idéntica o diferentes proteínas (por ejemplo una
variante del promotor está unida a un marcador de selección y otro
promotor mutante está unido a otra proteína que debe expresarse).
Por lo tanto dentro del alcance de la presente invención se producen
preferiblemente cepas unicopia que comprenden una copia del promotor
de AOX1 unido operativamente a un ácido nucleico que codifica una
proteína, un péptido o un ácido nucleico funcional, así como cepas
multicopia que comprenden más de una, preferiblemente al menos 2, 3,
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,15 o 20 copias del promotor de AOX1 unido
operativamente a un ácido nucleico que codifica una proteína, un
péptido o un ácido nucleico funcional.
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención dicha célula eucariota, en particular una célula
de levadura, preferiblemente una célula de levadura
metilotrófica.
Preferiblemente la célula de levadura
metilotrófica se selecciona del grupo que consiste en Candida,
Hansenula, Pichia y Toruplosis, especialmente una célula de
Pichia pastoris.
Los promotores de AOX1, así como
variantes mutadas de los mismos, pueden introducirse funcionalmente
en una gran cantidad de células de levadura diferentes, que incluyen
células metilotróficas (por ejemplo Pichia pastoris) y no
metilotróficas (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae). El
experto en la técnica conoce la posibilidad de transferir los
promotores a otros organismos, especialmente promotores de
AOX1 y MOX. Aunque la especificidad del sustrato y
algunas características reguladoras son diferentes en diferentes
levaduras (por ejemplo, Pichia pastoris, Hansenula polimorfa
y Saccharomyces cerevisiae) se ha demostrado un
reconocimiento de promotores extraños (por ejemplo Raschke, W.C.,
et al., Gene, 1996, 177:163-7; Pereira, G.G.
y C.P. Hollenberg, Eur J Biochem, 1996.238:181-91).
Por ejemplo el promotor de MOX de H. polymorpha se
reconoce en S. cerevisiae, reprimido en presencia de glucosa
y desrreprimido con limitación de fuente de carbono. De manera
similar el promotor de AOX1 puede emplearse en H.
polymorpha y se regula de la misma manera que el promotor de
MOX. El promotor de ZZA1, que está estrechamente
relacionado con el promotor de AOX1, también puede emplearse
satisfactoriamente en S. cerevisiae.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un kit para la expresión de una proteína seleccionada o para la
transcripción de un ARN funcional, que comprende
- i)
- un vector como se ha definido anteriormente, y
- ii)
- una célula que puede expresar dicha proteína o ARN funcional bajo el control de un promotor de acuerdo con la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector de acuerdo con la presente invención
puede usarse en un kit para la expresión o una proteína seleccionada
o para la transcripción de un ARN funcional (por ejemplo ribozima,
ARN antisentido, ARNi).
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención dicha célula es una célula de levadura,
preferiblemente una célula de levadura metilotrófica.
Preferiblemente la célula de levadura
metilotrófica se selecciona del grupo que consiste en Candida,
Hansenula, Pichia y Toruplosis, especialmente una célula
de Pichia pastoris.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un método para la expresión de una proteína, un péptido o un ácido
nucleico funcional recombinantes en una célula que comprende las
siguientes etapas:
- -
- proporcionar un vector o una molécula de ácido nucleico que comprende un promotor de AOX1 de acuerdo con la presente invención y un ácido nucleico que codifica una proteína, un péptido o un ácido nucleico funcional, estando dicho promotor unido operativamente a dicho ácido nucleico,
- -
- transformar dicha célula con dicho vector o dicha molécula de ácido nucleico,
- -
- cultivar la célula transformada en un medio de cultivo adecuado,
- -
- opcionalmente, inducir la expresión de dicha proteína, péptido o ácido nucleico funcional y
- -
- aislar dicha proteína, péptido o ácido nucleico funcional expresados.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención dicha célula es una célula de levadura,
preferiblemente una célula de levadura metilotrófica.
Preferiblemente la célula de levadura
metilotrófica se selecciona del grupo que consiste en Candida,
Hansenula, Pichia y Toruplosis, especialmente una célula
de Pichia pastoris. Otro aspecto de la presente invención se
refiere al uso de una molécula de ácido nucleico, un vector o una
célula de acuerdo con la presente invención para la expresión de una
proteína, un péptido o un ácido nucleico funcional.
Cuando se usa una molécula de ácido nucleico, un
vector o una célula, de acuerdo con la presente invención, para la
expresión de una proteína, de un péptido o de un ácido nucleico
funcional, es ventajoso seleccionar un promotor de AOX1 apropiado
que satisfaga las necesidades poseídas para la expresión (por
ejemplo expresión alta o constitutiva en condiciones de desrepresión
(= sin la adicción de glucosa al medio o en condiciones inducidas
con metanol). Los promotores de AOX1 mutantes adecuados pueden
seleccionarse con la ayuda de la tabla 2.
\newpage
Otro aspecto de la presente invención se refiere
un método para el aislamiento o la superexpresión de clones que
comprende las etapas de:
- a)
- introducir una molécula de ácido nucleico que comprende al menos un promotor mutante de alcohol oxidasa 1 (AOX1) de Pichia pastoris, de acuerdo con la presente invención, y al menos un ácido nucleico que codifica una proteína (péptido) o un ácido nucleico funcional y un gen de resistencia a un marcador, en el que dicho promotor y dicho ácido nucleico están unidos operativamente entre sí formando un casete de expresión uni- o multi-copia o un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico en una célula,
- b)
- transferir la célula de la etapa a) a un medio que comprende un marcador selectivo apropiado, una fuente de carbono no represora y metanol para el crecimiento selectivo de clones de superexpresión en condiciones de inducción,
- c)
- incubar la célula de la etapa b) en dicho medio,
- d)
- aislar una colonia de la célula obtenida de la etapa c) y
- e)
- detectar clones de superexpresión determinando la tasa de expresión de dicha célula.
\vskip1.000000\baselineskip
La construcción de clones de superexpresión o de
expresión alta que contenga un vector o un ácido nucleico que
comprenda un promotor mutado inducible por metanol, requiere métodos
que permitan al experto en la materia aislar estos clones. Dichos
métodos se proporcionan en este documento. La primera etapa de dicho
método es la introducción del promotor que comprende el ácido
nucleico (por ejemplo un vector) en una célula adecuada, que puede
regular dicho promotor. El propio promotor puede mutarse por
ingeniería genética o por mutagénesis química (por ejemplo
bisulfito, nitrito, ácido fumárico, hidracina) o física (por ejemplo
radiación, especialmente radiación UV). En una etapa adicional, la
selección de clones de superexpresión se realiza directamente
después de la regeneración de la transformación de las células.
La tasa de expresión se determina
preferiblemente por métodos como electroforesis en gel (por ejemplo
SDS-PAGE), unión a anticuerpos (por ejemplo ELISA),
PCR (por ejemplo RT-PCR en tiempo real) cuantitativa
(transcriptasa inversa), actividad enzimática (por ejemplo si la
proteína expresada es una enzima) o fluorométricamente (proteína con
un espectro de emisión característico de tipo proteína verde
fluorescente).
Los promotores (transformantes) que muestran
expresión aumentada en ausencia de fuentes represoras de C de otra
manera (en el caso del promotor de AOX1, glucosa) se seleccionan por
crecimiento selectivo de células transformadas en/sobre medios que
contienen una fuente de carbono no represora. Los promotores
(transformantes) que muestran expresión aumentada en ausencia de
fuentes represoras de C de otra manera (en el caso del promotor de
AOX1, glucosa) en presencia de un inductor (por ejemplo metanol) se
seleccionan por crecimiento selectivo de células transformadas
en/sobre medios que contienen una fuente de carbono no represora y
el inductor (por ejemplo metanol). El inductor también puede ser una
fuente de carbono no represora Los clones de superexpresión se
seleccionan por combinación de una multicopia lo que conduce a mayor
resistencia frente a antibióticos (por ejemplo Zeocina) o a mayor
productividad de un componente esencial de medios (por ejemplo Leu,
His, Arg, Ura) con la selección reguladora descrita
anteriormente.
Las composiciones de los medios a usar en el
método de acuerdo con la presente invención pueden obtenerse
directamente de los fabricantes o proveedores de kits, células y
vectores relacionados con Pichia pastoris (por ejemplo,
Invitrogen). La concentración de metanol en el medio puede ser
preferiblemente del 0,05 al 15%, más preferiblemente del 0,1 al 10%,
particularmente del 0,3 al 5%. En la bibliografía científica se
describen diferentes concentraciones de metanol para diferentes
condiciones de cultivo. Por ejemplo, matraces de agitación pueden
contener metanol al 1% o menos (Guarna MM, et al. (1997)
Biotech. Bioeng. 56: 279-286), los procesos de
fermentación pueden contener metanol al 0,5% (Damasceno LM, et
al. (2004) Protein Expr Purif 37: 18-26; Hellwig
S., et al. (2001) Biotechnol Bioeng 74:
344-352; Hellwig S., et al. (1999) Biotechnol
Appl Biochem 30: 267-275).
La expresión mejorada de clones multicopia puede
depender no solo de la presencia de más de una copia del promotor
mutado en una célula sino también debido a la ausencia de diversos
factores de transcripción, porque estos factores pueden unirse a una
gran cantidad de sitios de unión a factores de transcripción en
dicha célula. Esto podría demostrarse comparando la tasa de
expresión en condiciones que inducen metanol con la tasa de
expresión en condiciones de desrepresión en la que podría observarse
que la tasa de expresión mejorada no solo es un efecto del número de
copias del promotor de AOX1 mutado en la célula (efecto no lineal).
Por ejemplo, la cepa d6*F10 muestra dicha característica.
El medio usado para aislar clones de
superexpresión puede comprender componentes de medios adicionales
como leucina, uracilo, arginina, histidina y/o adenina y el sorbitol
puede intercambiarse por glucosa para identificar variantes de
promotores que muestren una represión reducida en presencia de
glucosa en comparación con variantes de promotores de tipo
silvestre.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Cuando se usan cepas auxotróficas, la célula
puede transferirse a un medio que comprenda sorbitol (u otras
fuentes de carbono no represoras) y que contenga componentes de
medios individuales (por ejemplo leucina, uracilo, arginina,
histidina y adenina) para el crecimiento selectivo de clones de
superexpresión en condiciones de desrepresión empleando marcadores
auxotróficos (etapa b)).
El marcador de resistencia
P(TEF)-Zeo, habitualmente usado en vectores
que comprenden el promotor de AOX1, conduce a la expresión
constitutiva de la proteína de resistencia a zeocina y por lo tanto
permite el aislamiento de clones multicopia por resistencia frente a
mayores concentraciones del antibiótico. El nuevo método descrito
permite combinar este efecto con características reguladoras para
detectar promotores y clones multicopia que conduzcan a una mayor
expresión en determinadas circunstancias reguladoras controlables
(por ejemplo expresión desrreprimida, expresión inducida etc.).
Esto hace posible detectar nuevos promotores con propiedades
reguladoras modificadas y también clones en los que los clones
multicopia conducen a la expresión mejorada en dichas condiciones
reguladoras especiales.
"Clones de superexpresión" son clones de
expresión que expresan más de una proteína o de un ácido nucleico
funcional bajo el control del promotor mutado que bajo el control
del promotor de tipo silvestre o más de una proteína o ácido
nucleico funcional que aplicando vectores que normalmente usan
combinaciones de marcador de selección-promotor
tales como P(TEF)-Zeo. La tasa de expresión
de los "clones de superexpresión", de acuerdo con la presente
invención, puede estar aumentada, al menos el 20%, preferiblemente
al menos el 50%, más preferiblemente al menos el 100%,
particularmente al menos el 500%, en comparación con la tasa de
expresión de la misma proteína o péptido o ácido nucleico funcional
bajo el control del promotor de tipo silvestre (valor medio más de
dos a tres veces la desviación típica). "Los clones de
superexpresión" pueden comprender preferiblemente más de una
copia del promotor mutado o molécula de ácido nucleico de acuerdo
con la presente invención. Como alternativa, los "clones de
superexpresión" también pueden denominarse "clones de alta
expresión".
De acuerdo con la presente invención, los
"promotores inducibles por metanol" son promotores cuya
actividad está regulada por la presencia de metanol en el medio de
cultivo. Dicho promotores son preferiblemente promotores de
AOX1 (de Pichia pastoris) o de MOX (de
Hansenula polymorpha) o cualquier otro promotor reprimido por
glucosa e inducible por metanol, derivado de levaduras
metilotróficas, tales como, por ejemplo, FMD, FLD, DAS (véase, por
ejemplo, la tabla 6, ejemplo 1).
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención el marcador selectivo es un antibiótico,
preferiblemente zeocina.
El marcador selectivo a usar en el medio depende
de que puedan usarse las características moleculares de las células
para distinguir una célula que contiene el ácido nucleico o el
vector que comprende un promotor mutado o inducible por metanol de
tipo silvestre, de una célula que no contiene dicho ácido nucleico o
vector. Por lo tanto, los marcadores selectivos pueden ser
antibióticos (los genes de resistencia a antibióticos pueden
encontrarse en el vector o en el ácido nucleico introducido en
dichas células). Para compensar la auxotrofia de determinadas cepas
el marcador selectivo en el medio puede ser una sustancia de tipo
leucina, uracilo, arginina, histidina y adenina, dependiendo del
tipo de auxotrofia.
Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico,
el vector y la célula son un ácido nucleico, un vector y una célula
de acuerdo con la presente invención.
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención la molécula de ácido nucleico o vector se
introduce en la célula por transformación por métodos convencionales
conocidos por un experto en la materia, preferiblemente por
electroporación, transformación química, fusión de protoplastos o
por bombardeo de partículas (véase, por ejemplo, Current Protocols
in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Edited by: Fred M.
Ausubel et al.; Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (tercera edición. Sambrook y D. Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Cloning: A Laboratory Manual (tercera edición. Sambrook y D. Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
La presente invención se ilustra adicionalmente
mediante las siguientes figuras y ejemplos sin limitarse
estrictamente a los mismos.
La figura 1 muestra una SDS-PAGE
de cepas de P. pastoris que expresan GFP-Zeo
a microescala antes de la inducción con metanol (A) y 24 (B) y 72
(C) horas después de la inducción. Las muestras se prepararon como
se describe en el ejemplo 1 h). El carril 1 es X-33
(control negativo), los carriles 2-4 son cepas A9,
D2 y E2 Mut^{s} de X-33 con
GFP-Zeo, el carril 5 es d6*F10 de X-33. Una banda fuerte en 42 kDa está presente en todos los clones GFP-Zeo.
GFP-Zeo, el carril 5 es d6*F10 de X-33. Una banda fuerte en 42 kDa está presente en todos los clones GFP-Zeo.
La figura 2 muestra una visión de conjunto de
deleciones de secuencia dentro de la región del promotor AOX1
y algunos de los sitios de unión a la transcripción. Las regiones
delta 1-9 se delecionaron por PCR de extensión por
solapamiento.
La figura 3 muestra un histograma de la
intensidad de fluorescencia de variantes del promotor AOX1 a
microescala después de la desrepresión (privación de carbono). Las
células crecieron en glucosa al 1% a microescala. Los datos
representan la media \pm la DT de cuatro mediciones
independientes. URF: unidades relativas de fluorescencia; WT: cepa
D2 GFP-Zeo de P. pastoris con
GFP-Zeo bajo el control del promotor AOX1 de
tipo silvestre; D1-D9; cepas de P. pastoris
con construcciones de deleción AOX1\Delta
1-\Delta9 delante del gen GFP-Zeo;
EX: longitud de onda de excitación; EM: longitud de onda de
emisión.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La figura 4 muestra un histograma de la
intensidad de fluorescencia de variantes del promotor AOX1 a
microescala después de la inducción con metanol. Las células
crecieron en glucosa el 1% a microescala. Los datos representan la
media \pm la DT de 4 mediciones independientes. URF: unidades
relativas de fluorescencia; WT: cepa D2 GFP-Zeo de
P. pastoris con GFP-Zeo bajo el control del
promotor AOX1 de tipo silvestre; D1-D9; cepas
de P. pastoris con construcciones de deleción
AOX1\Delta 1-\Delta9 delante del gen
GFP-Zeo; EX: longitud de onda de excitación; EM:
longitud de onda de emisión.
La figura 5 muestra un histograma de la
intensidad de fluorescencia de variantes del promotor AOX1
seleccionadas a microescala. Se muestran niveles de expresión en
condiciones de desrepresión así como de inducción de cepas unicopia
y cepas multicopia con variantes del promotor \Delta6 y de tipo
silvestre. Los datos representan la media \pm la DT de 4
mediciones independientes. WT: cepa GFP-Zeo
unicopia con el promotor AOX1 de tipo silvestre (D2
GFP-Zeo); D6: clon AOX1\Delta6* unicopia; WT_E2:
clon GFP-Zeo multicopia con el promotor AOX1
de tipo silvestre; D6* F10: clon AOX1\Delta6* multicopia (d6F10
X-33).
La figura 6 muestra el resultado de un ensayo
por goteo de cepas de P. pastoris en placas de agar MD y MDM
con concentraciones distintas de Zeocin^{TM}. Las células se
cultivaron en medio BMD (1%) a una DO_{595} de 1,5, diluido en
etapas de 10 a una proporción de dilución final de 10^{5} y
transferido a placas de agar usando un reproductor de 48 pin. Los
números en la parte superior del dibujo indican el factor de
dilución que es el mismo para todas las placas. El medio MD se
preparó como se ha descrito anteriormente. Las placas de
MDM-Zeo en metanol se añadieron a una concentración
final de aproximadamente el 0,5%. El Zeocin^{TM} se añadió a
concentraciones finales de 100, 200 y 500 \mug/ml,
respectivamente. X-33: X-33 de
P. pastoris, A9: A9 Mut^{s} GFP-Zeo de
P. pastoris, D2: D2 GFP-Zeo de P. pastoris,
E2: E2 GFP-Zeo de P. pastoris
La figura 7 muestra el nivel de expresión de
diversas cepas multicopia en comparación con cepas de referencia; a)
actividad en condiciones de desrepresión; b) actividad después de
inducción con metanol.
La figura 8 muestra el nivel de expresión de
cepas multicopia \Delta6* en condiciones de desrepresión y de
inducción en comparación con cepas de referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con los manuales proporcionados
(véase la Tabla 3), se usaron diversas preparaciones de ADN y kits
de purificación disponibles en el mercado.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.930000\baselineskip
La clonación TOPO® se realizó de acuerdo con los
manuales proporcionados (para la clonación en
pCR®4Blunt-TOPO® y para la clonación en pCR®-Blunt
II-TOPO®). Para la clonación se usaron siempre 4
\mul de producto PCR. De acuerdo con los protocolos mencionados
anteriormente, 2 y 4 \mul de cada reacción de clonación se
transformaron en células TOP10F' de E. coli químicamente
competentes One Shot® (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, Estados
Unidos).
\vskip1.000000\baselineskip
La transformación de reacciones de ligamiento y
plásmidos en E. coli se realizó de acuerdo con el protocolo
SEM (método simple y eficaz) [16]. Para la transformación se usaron
células TOP10F' de E. coli químicamente competentes.
\vskip1.000000\baselineskip
Preparación de células competentes de Pichia
pastoris: Se usó una sola colonia de la cepa hospedadora de
Pichia pastoris deseada para inocular 50 ml de YPD (glucosa
al 2%) en un matraz Erlenmeyer, de cuello ancho con deflectores, de
300 ml. Después de una noche de incubación a 30ºC, humedad al 60% y
a 130 rpm (Pilot Shacke® RC-2 TE) se usó un
determinado volumen de este precultivo para inocular 200 ml de YPD
(glucosa al 2%) en un matraz Erlenmeyer, de cuello ancho con
deflectores, de 2 l a una densidad óptica aproximadamente de 0,1 a
595 nm (DO595). El cultivo se cultivó con las mismas condiciones que
el precultivo a una densidad óptica de 1,0 a 1,5. Las células se
sedimentaron a 4ºC y a 4000 rpm durante 10 minutos y se
resuspendieron en 200 ml de agua estéril enfriada con hielo. Este
procedimiento se repitió 3 veces con la
re-suspensión de las células en 100 ml de agua, 10
ml de sorbitol 1 M y 0,5 ml de sorbitol 1 M respectivamente.
Se linealizaron 10 \mug del plásmido deseado
con BglII y NotI (50 u cada una) durante una noche en
un volumen final de 300 \mul. Después de la digestión por
restricción el ADN se precipitó en EtOH y acetato de sodio 0,3 M de
acuerdo con un protocolo convencional [16]. El ADN se disolvió en 11
\mul de ddH_{2}O estéril y desalinizada usando un filtro de
membrana MF-Milipore^{TM} (véase la Tabla 12)
durante aproximadamente 1-2 h. Si para la
transformación se usó un producto PCR se procesaron aproximadamente
4-5 \mug de ADN como se ha descrito anteriormente
comenzando con la precipitación en EtOH.
Para cada transformación, se mezclaron 80 \mul
de las células preparadas con 10 \mug de ADN como se ha descrito
anteriormente y se incubó durante 5 minutos en hielo. La mezcla se
transfirió a cubetas de electro-transformación
enfriadas con hielo (Bio-Rad) y se impulsaron a 200
\Omega, 25 \muF y 2,5 kV. Inmediatamente, se añadió 1 ml de
sorbitol 1 M enfriado con hielo. La suspensión se transfirió a un
tubo PP estéril de 12 ml (Greiner, Frickenhausen, Alemania, nº
184261) estéril y se incubó durante 2 horas a 30ºC sin agitación.
Después de esta fase de regeneración las alícuotas se sembraron en
placas sobre placas de selección. Para la selección de
transformantes con alta expresión en condiciones de inducción, las
células se sembraron en placas sobre placas de
MSM-Zeo que contenían medio mínimo con sorbitol (o
cualquier otra fuente de carbono no represora) metanol y zeocina.
Para la selección de clones que mostraban expresión alta en
condiciones de desrepresión, las células pudieron sembrarse en
placas sobre placas con zeo en sorbitol mínimo sin metanol. La
inclusión de glucosa a placas de selección que contenían metanol
permitió la detección de clones de expresión no reprimidos por
glucosa y sus promotores.
\vskip1.000000\baselineskip
Se resuspendió una sola colonia de la cepa de
Pichia deseada en 100 \mul de ddH_{2}O en un
micro-tubo de 100 \mul y se calentó de 5 a 10
minutos a 95ºC. Después de la centrifugación a 13.200 rpm durante 1
minuto se usaron 10 \mul de sobrenadante como molde para la
relación PCR. Como molde para una segunda ronda, se usaron 5 \mul
de esta primera ronda de PCR. 5 \mul de la segunda ronda de PCR se
usaron para un gel de control. Las relaciones PCR contenían 10 pmol
de cada cebador (AOX1_col y GFPrev), 200 \muM de cada dNTP y 2,5
unidades de ADN polimerasa Hot Star Taq® (QIAGEN) o Taq ADN
polimerasa (Promega) en condiciones tamponantes, de acuerdo con los
manuales proporcionados, en un volumen final de 50 \mul. Para la
secuenciación el segundo producto PCR se purificó usando el Kit de
purificación para PCR QIAquick®.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La cepa P. Pastoris deseada se cultivó
durante una noche en 5 ml de YPD en un tubo PP estéril de 12 ml en
un barril de rotación a 30ºC a una DO 595 final de
5-10. De acuerdo con el protocolo proporcionado, se
usaron 1,5 ml del cultivo para el aislamiento del ADN usando el kit
Easy-DNA^{TM}.
\vskip1.000000\baselineskip
La medición de la concentración de proteínas en
solución se ha usado durante mucho tiempo en bioquímica. Una de sus
principales aplicaciones es para normalizar una amplia diversidad de
métodos bioquímicos con respecto a la cantidad de proteína total
como se realiza en el presente caso para las tasas de consumo de
oxígeno. Las formas más normalmente usadas para determinar las
concentraciones de proteína son los métodos de Bradford, Lowry y
BCA^{TM}. Estos métodos tienen limitaciones definidas con respecto
a sensibilidad, intervalo dinámico y compatibilidad en relación con
los reactivos específicos. Entre estos tres ensayos, el de Bradford
y Lowry son más fiables y reproducibles que el BCA^{TM}. Por otro
lado Lowry y Bradford poseen rigurosas limitaciones cuando están
presentes detergentes y/o agentes de reducción dando como resultado
elevados valores en blanco. Por lo tanto, el ensayo BCA^{TM} es el
método de elección después de lisis química. Las concentraciones de
proteínas se determinaron usando el ensayo BCA^{TM} después de la
lisis celular química con Y-Per® y BSA de acuerdo
con los manuales de instrucción convencionales (Pierce Biotechnology
Inc.) por lo tanto, a continuación, tan solo se describirán
brevemente las principales etapas. Se centrifugaron 200 \mul de
los cultivos a 4000 rpm y a 4ºC durante 5 minutos. Después de
eliminar el sobrenadante el sedimento se resuspendió en 100 \mul
de Y-Per® trasfiriendo con pipeta hacia arriba y
abajo. La suspensión se incubó en micro-tubos de 1,5
ml en una termomezcladora a temperatura ambiente y a 600 rpm durante
20 minutos. Después de que los desechos celulares se sedimentasen a
13.200 rpm y a temperatura ambiente durante 10 minutos, el
sobrenadante se transfirió a un nuevo micro-tubo y
se almacenó a 4ºC para el ensayo BCA^{TM} o
SDS-PAGE. Se mezclaron 25 \mul de la muestra en un
pocillo de una microplaca con 200 \mul de reactivo de trabajo
BCA^{TM} (reactivo A: reactivo B = 50:1), se agitó cuidadosamente
durante 30 segundos y se cubrió herméticamente con selladores de
placa (Promega). Después de la incubación durante 30 minutos a 37ºC
y enfriamiento a temperatura ambiente se determinó la absorción a
562 nm usando un lector de placa Spextramax Plus 384. Si fuera
necesario, las muestras se diluyen con ddH_{2}O antes del ensayo
BCA.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la SDS-PAGE se prepararon
muestras por lisis celular química usando como reactivo
Y-Per®, como se ha descrito en la sección anterior.
Se mezclaron 10 \mul del lisado con 10 \mul de SSB (tampón sigma
para muestras) 2x y se incubó a 95ºC durante 5-10
minutos y 15 \mul de esta mezcla se cargaron sobre el gel de
proteína. La electroforesis se realizó con 180 V durante
aproximadamente 1 hora y las bandas de las proteínas se detectaron
usando tinción azul de Coomassie^{TM}.
\vskip1.000000\baselineskip
Las concentraciones de glucosa se determinaron
usando el método glucosa-hexoquinasa UV sin
desproteinización (DIPRO med Handels GMBH, Weigelsdorf, Austria,
Prod. nº. D590522). Se transfirieron 50 \mul de cultivos de
Pichia a una microplaca de PCR y se centrifugó a 4000 rpm
durante 5 minutos. Se añadieron 10 \mul de sobrenadante a 190
\mul de reactivo hexoquinasa en una microplaca
UV-Star y se incubó a temperatura ambiente durante
15 minutos. Después de la incubación, se determinó la absorción a
350 nm usando un lector de placa Spectramax Plus 384.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron cepas de P. pastoris en BMD
(1%) a una DO595 final de 1,5 y se diluyó en etapas de 10 a una
proporción de dilución final de 10^{5}. La transferencia sobre las
placas de agar se realizó con un reproductor de 48 pin. Las placas
se incubaron a 30ºC hasta que aparecieron las colonias (normalmente
dos días en placas de MD).
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los alineamientos de secuencias se
realizaron usando MultAlin en la página principal del INRA
(Instituto Nacional de Investigaciones Agronómicas, Paris, Francia)
(prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html) [17] o con
ClustalW en el Instituto Bioinformático Europeo (EBI,
www.ebi.ac.ch/clustalw) [18]. Para la comparación de secuencias con
MultAlin siempre se usó la matriz parecida a la secuencia de ADN
para comparación.
Los genes de la ruta de utilización de metanol y
la mayoría de los genes peroxisomales se regularon de un modo
similar con respecto a la represión de glucosa, desrepresión con
privación de carbono e inducción mediante metanol. Una regulación
transcripcional similar con un conjunto definido de factores de
transcripción (represores así como inductores) debe ser responsable
de este patrón de regulación. Los sitios de unión a factores de
transcripción dentro de estas regiones promotoras deben mostrar
algunas regiones conservadas. El alineamiento de secuencias
múltiples entre las regiones promotoras de genes
co-regulados debe revelar los sitios de unión
conservados de los factores de transcripción implicados en la
regulación de los genes concordantes. Se indicó que varios genes de
las levaduras metilo-
tróficas P. pastoris, H. polymorpha y C. boidinii se co-regulaban y sus secuencias promotoras se asilaron (Tabla 6).
tróficas P. pastoris, H. polymorpha y C. boidinii se co-regulaban y sus secuencias promotoras se asilaron (Tabla 6).
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El análisis de factores de transcripción se
realizó con MatInspector Release professional 6.1, enero 2003,
dentro del paquete informático GenomatixSuite 1.6.1 de Genomatix
Software GmbH Servers [15]. Para buscar sitios de unión a factores
de transcripción, Se usó la secuencia PAOX1 de pPICZ B usando Matrix
Family Library Versión 3.1.1 abril 2003 grupo ALL fungi.lib
(www.genomatix.de).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1.1
Como un indicador para la expresión génica
conducida por variantes del promotor AOX1, se usó
GFP-Zeo. Las secuencias circundantes al codón de
inicio ATG se construyeron para cumplir con los requisitos mínimos
de las secuencias consenso de Kozak para genes altamente expresados
en levaduras. Para cambiar las regiones promotoras delante del gen
GFP-Zeo se insertó un sitio de restricción
EcoRI (Tabla 8) por PCR de extensión por solapamiento.
La producción, basada en PCR, de los componentes
del sistema indicador P(AOX1) se amplificó usando, como
molde, 10 ng de pPICZ-B con ARS1. La reacción
también contenía 10 pmol de cada cebador (P(AOX1)directo y
P(AOX1)inverso, respectivamente), 200 \muM de cada dNTP y
2,5 U de polimerasa Synergy^{TM} en condiciones de tampón
apropiadas en un volumen final de 50 \mul.
El AOX1 TT se amplificó de manera similar al
promotor AOX1. En esta reacción se usaron, como cebadores, el
AOX1TTdirecto y el AOX1TTinverso. Ambas reacciones de PCR se
realizaron en un termociclador durante 30 ciclos (95ºC, 1 minuto;
55ºC, 30 s; 68ºC, 2 minutos 30 s) con una etapa de desnaturalización
inicial de 5 minutos a 95ºC y una etapa de extensión final de 10
minutos a 68ºC. Para la amplificación en una segunda ronda, se
usaron 2 \mul de la primera ronda de PCR, en las mismas
condiciones anteriores. La única diferencia fue un aumento de la
temperatura de extensión a 72ºC.
Se amplificó GFP-Zeo [19]
usando, como molde, 25 ng del vector
pTracer^{TM}-CMV2. La reacción también contenía 10
pmol de cada cebador (GFP-Zeo directo y
GFP-Zeo inverso, respectivamente), 200 \muM de
cada dNTP y 2,5 U de polimerasa Synergy^{TM} en condiciones de
tampón apropiadas en un volumen final de 50 \mul. La PCR se
realizó en un termociclador (véase la tabla 8) durante 30 ciclos
(95ºC, 1 min; 55ºC, 30 s; 72ºC, 2 min 30 s) con una etapa de
desnaturalización inicial de 5 minutos a 95ºC y una etapa de
extensión final de 10 minutos a 72ºC.
Todos los productos de la PCR se purificaron por
electroforesis en gel de agarosa antes de la PCR de extensión por
solapamiento. La reacción contenía 10 ng de P(AOX1), 5 ng de
AOX1 TT y 50 ng de GFP-Zeo, preparados como moldes,
como se ha descrito anteriormente, 200 \muM de cada dNTP y 2,5 U
de polimerasa Sinergy^{TM} en condiciones de tampón apropiadas en
un volumen final de 50 \muL. La PCR se realizó en un termociclador
(véase la Tabla 8) durante 30 ciclos (95ºC, 1 min; 53ºC, 50 s; 68ºC,
3 min 30 s) con una etapa de desnaturalización inicial de 5 min a
95ºC y una etapa de extensión final de 10 min a 68ºC. Después de 10
ciclos, se añadieron 10 \mul de una mezcla que contenía 10 pmol de
cebadores externos P(AOX1)directo y AOX1TPinverso, de
nuevo 200 \muM de cada dNTP y 2,5 U de polimerasa Synergy^{TM}
en condiciones de tampón apropiadas. La PCR continuó como estaba
programada después de esta adición. El producto de PCR obtenido con
el tamaño deseado de aproximadamente 2,4 kb se purificó sobre un gel
de azarosa. El producto purificado se clonó en el vector
pCR®4Blunt-TOPO® y se secuenció. La secuenciación
reveló 4 mutaciones y una deleción dentro de la construcción
indicadora.
El sitio de deleción del par de bases se
encontró en la posición -15 de la secuencia promotora original. Dado
que esta posición estaba dentro del sitio de clonación múltiple de
todos los vectores pPICZ (A, B y C; dentro del sitio de restricción
SfuI) la deleción no debe ejercer influencia sobre la
actividad promotora y por lo tanto no era correcta. La primera
mutación (T\rightarrowC) se encontró en la región promotora en la
posición -828. Las otras 3 mutaciones se encontraron dentro de la
secuencia codificante de GFP-Zeo en las posiciones
+122, +507 y +1075, respectivamente.
La conversión G\rightarrowA en la posición
+122 cambia el codón GGA de Gly a un codón GAA produciendo un cambio
de aminoácido G41A. La conversión T\rightarrowC en +507 es una
mutación silenciosa que únicamente cambia un codón de R169. La
última mutación (T\rightarrowC) en la posición +1075 cambia el
codón de parada TGA al codón de arginina CGA Las mutaciones -828,
+122 y +1075 se repararon con el kit de mutagénesis
multi-dirigida QuikChange® después de construir el
vector pAOX. La mutación silenciosa en la posición +507 y la
mutación en el polienlazador no cambiaron ya que no introducen un
codón extraño.
pAOX se construyó eliminando el fragmento
P_{AOX1}-GFP-Zeo-AOX1TP
del vector pCR®4Blunt-TOPO® con KpnI y NotI e
insertándolo en el vector pBlueScript® SK entre el sitio KpnI
y NotI.
Las mutaciones observadas en el promotor AOX1 y
en la secuencia GFP-Zeo se corrigieron usando el kit
de mutagénesis multi-dirigida QuikChange®
(Stratagene, Ámsterdam, Países Bajos). La reacción PCR se realizó de
acuerdo con el manual proporcionado que contenía 100 ng de pAOX, 100
ng de cebadores mutagénicos (423directo, 1372directo y 2325directo,
respectivamente) y 1 \mul de mezcla multienzimática QuikChange® en
condiciones de tampón apropiadas en un volumen final de 25 \mul en
un termociclador de 30 ciclos (95ºC, 1 min; 55ºC, 1 min; 65ºC, 10
min 30 s) con una etapa de desnaturalización inicial de 1 min a
95ºC. La digestión con DpnI y la transformación química en células
de E. coli XL10-GOLD® (Invitrogen Corp.) se
realizó de acuerdo con el manual proporcionado. La corrección de las
tres mutaciones se verificó por secuenciación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1.2
Los brazos izquierdos del promotor AOX1
se sintetizaron usando P(AOX1)dir como cebador directo
y AOX n inv (n=1...9) como cebadores inversos. Los brazos derechos
se sintetizaron con 10 pmol de AOX n dir (n=1...9) como cebadores
directos y P(AOX1)inverso como cebador inverso. Todos
los brazos se sintetizaron usando 12 ng del vector pAOX como molde y
10 pg de cada cebador. La reacción también contenía 10 pmol de cada
cebador, 200 \muM de cada dNTP y 0,6 U de ADN polimerasa
Pwo en condiciones de tampón apropiadas en volumen final de
50 \mul. La PCR se realizó en un termociclador durante 30 ciclos
(95ºC, 1 min; 55ºC, 1 min; 68ºC, 1 min 30 s) con una etapa de
desnaturalización inicial de 5 min a 95ºC y una etapa de extensión
final de 10 min a 68ºC. Todos los brazos se purificaron con gel de
agarosa antes del uso como molde para la PCR de extensión por
solapamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
La reacción contenía 10 ng de cada brazo
preparada, como se ha descrito anteriormente, como moldes, 200
\muM de cada dNTP y 0,6 U de ADN polimerasa Pwo en
condiciones de tampón apropiadas en un volumen final de 50 \mul.
La PCR se realizó en un termociclador de 30 ciclos (95ºC, 45 s;
60ºC, 45 s; 68ºC, 2 min) con una etapa de desnaturalización inicial
de 5 minutos a 95ºC y una etapa de extensión final de 10 minutos a
68ºC. Después de 10 ciclos, se añadieron 20 \mul de una mezcla que
contenía 10 pmol de los cebadores externos P(AOX1)dir
y P(AOX1)inv, de nuevo 200 \muM de cada dNTP y 0,6 U
de ADN polimerasa Pwo en condiciones de tampón apropiadas. La
PCR continuó según programado después de la adición de la
mezcla.
Los productos PCR obtenidos con el tamaño
deseado de aproximadamente 898-947 pb se purificaron
sobre un gel de agarosa y se clonaron en el vector
pCR®4Blunt-TOPO® (\Delta2, \Delta4, \Delta5,
\Delta7 y \Delta8) o en pCR®-Blunt II-TOPO®
(\Delta1, \Delta3, \Delta6 y \Delta9) y se secuenciaron.
Los vectores pAOX\Delta se construyeron
eliminando los fragmentos P_{AOX1}\Delta de vectores TOPO® con
BglII y EcoRI e insertándolos en el vector pAOX entre
el sitio BglII y EcoRI en lugar del promotor de AOX1
de tipo silvestre. Los vectores resultantes se verificaron por
secuenciación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1.3
La transformación de Pichia pastoris se
realizó como se ha descrito anteriormente. La selección para la
integración de P_{AOX1} (o
P_{AOX1}\Delta)-GFP-Zeo-AOX1
TT se realizó dispersando las células de Pichia transformadas
y regeneradas en alícuotas sobre placas de agar de
MSM-Zeo.
Las cepas de Pichia pastoris se
cultivaron en placas de pocillos profundos que contenían 300 \mul
de BMD (al 1%) por pocillo a 28ºC, 320 rpm y humedad al 80% durante
6 horas a temperatura ambiente. Después de este tiempo, se tomaron
50 \mul para la determinación de la fluorescencia por GFP. La
inducción se realizó añadiendo 250 \mul de BMM2/pocillo seguido de
una incubación adicional de 72 h. El metanol se recargó añadiendo 50
\mul de BMM10 después de 10, 24 y 48 horas. Una vez más se midió
la fluorescencia GFP después de 72 horas de inducción con
metanol.
Análisis de la expresión de la enzima
indicadora. La expresión de GFP-Zeo en Pichia
Pastoris se analizó por detección de fluorescencia de GFP en el
lector de placa Spectramax Gemini XS con excitación a 395 nm y
emisión a 507 nm. 50 \mul de cultivos de P pastoris
cultivados en placas de pocillos profundos, como se ha descrito
anteriormente, se diluyeron 1+3 con ddH_{2}O en placas de
microtitulación FIA. Debido a la cantidad limitada de la muestra
solamente se realizaron mediciones simples. Todas las medias \pm
desviaciones típicas proporcionadas se calcularon para al menos 3
cultivos diferentes (pocillos).
Si el casete de integración está integrado en el
locus AOX, sin sustitución del gen AOX1, la cepa
recombinante de Pichia puede crecer en metanol con una tasa
de tipo silvestre, mientras que la sustitución del gen AOX1
por cruzamiento doble da como resultado una tasa de crecimiento
mucho más lenta sobre metanol. Estos dos fenotipos de crecimiento se
denominan utilización positiva de metanol (Mut^{+}) y utilización
lenta de metanol (Mut^{s}), respectivamente. Para el análisis del
fenotipo de utilización de metanol, los cultivos de Pichia
pastoris a microescala se transfirieron sobre placas de agar MM
y MD usando un reproductor de 96-pin y se incubaron
a 30ºC durante 2 días. Después de 2 días, si la cepa de
Pichia posee el fenotipo Mut^{+}, aparecen colonias en las
dos placas, mientras que las cepas de fenotipo Mut^{s} solamente
se producen en placas con MD.
Todas las cepas de Pichia pastoris que
derivan de transformaciones de pAOX o de uno de los plásmidos
pAOX\Delta se analizaron por PCR de colonias y las construcciones
de deleción también por secuenciación para asegurar la secuencia
promotora delante del gen promotor (GFP-Zeo).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1.4
Aunque la mutagénesis por PCR en las regiones
codificantes de genes está bien desarrollada y establecida no se
sabe nada acerca de la mutagénesis sobre las regiones promotoras.
Debido a la falta de conocimiento se realizaron diversas condiciones
de mutagénesis: para minimizar el sesgo en el espectro mutacional,
se usaron dos polimerasas diferentes, una ADN polimerasa Taq y una
ADN polimerasa Mutazime® (Stratagene Inc.). Debido al total
desconocimiento sobre la frecuencia de mutación para la evolución de
secuencias promotoras, se ensayaron varias frecuencias de mutación
(teóricamente de 1 a \sim14/kb).
Mutagénesis usando ADN polimerasa Hot Star Taq®:
la PCR mutagénica se realizó en la secuencia promotora en un volumen
de reacción de 100 \mul de acuerdo con [20]. La reacción contenía
12 ng de pAOX, 40 pmol de cada cebador,
(P(AOX1)directo y P(AOX1) inverso), los dNTP
(dGTP 200 \muM, dATP 200 \muM, dTTP 1 mM, dCTP 1 mM) y 5 U de
ADN polimerasa Hot Star Taq® en condiciones de tampón apropiadas. La
concentración de MgCl_{2} se aumentó a 7 mM (normalmente 3 mM)
para modificar la tasa de error de la polimerasa. La PCR se realizó
en un termociclador durante 30 ciclos (95ºC, 45 s; 55ºC, 45 s; 72ºC,
1 min 30 s) con una etapa de desnaturalización inicial de 15 minutos
a 95ºC y una etapa de extensión final de 10 minutos a 72ºC.
El kit de mutagénesis al azar GeneMorph® se
realizó en la secuencia promotora en un volumen final de 50 \mul
de acuerdo con el manual proporcionado. Como molde, se usaron
diferentes cantidades del vector pAOX (véase la Tabla 10). Se usaron
12,5 pmol de cada cebador, P(AOX1)directo y
P(AOX1)inverso. La reacción PCR se realizó en un
termociclador durante 30 ciclos (95ºC, 30 s; 55ºC, 30 s; 68ºC, 1m 30
s) con una etapa de desnaturalización inicial de 1 min a 95ºC y una
etapa de extensión final de 10 min a 68ºC.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó una primera ronda de mutagénesis con
las condiciones descritas anteriormente (Taq, 3x GeneMorph®). Para
conseguir una mayor frecuencia de mutación la reacción GeneMorph® nº
3 se usó como molde para una segunda ronda de PCR. Se usaron las
condiciones Taq y GeneMorph® nº 2 y nº 3.
Antes de la transformación en células de
Pichia pastoris X-33 GFP-Zeo
Mut^{s} A9, todas las reacciones de PCR se precipitaron y
desalinizaron como se ha descrito anteriormente. Se usó el
procedimiento de transformación y regeneración convencional. La
selección para promotores inducidos en medio de glucosa se realizó
dispersando 150 \mul de alícuotas de suspensión celular
transformada sobre placas de agar MD que contenían
100-500 \mug/ml de Zeocin^{TM} y se incubó a
30ºC durante 2 días.
\newpage
Ejemplo
1.5
Hasta ahora, se ha usado una gran diversidad de
variantes de GFP en biología molecular. Aunque difieren únicamente
en algunas mutaciones puntuales, sus características difieren
enormemente. Además de mejorar las propiedades de plegamiento su
espectro fluorescente así como sus producciones cuánticas y por lo
tanto intensidades difieren bastante. Las proteínas verdes
fluorescentes pueden dividirse en dos grupos principales, según su
máximo de excitación: variantes GFP de tipo silvestre con un máximo
de excitación a 395 nm y un máximo inferior a 470 nm, y variantes
GFP cambiadas a rojo con un máximo de excitación a
480-490 nm. De acuerdo con su secuencia de
aminoácidos, el ciclo 3-GFP pertenece al grupo de
variantes GFP de tipo silvestre con un máximo de excitación a 395
nm.
Para controlar las propiedades espectrales
cuando se expresan en Pichia pastoris se determinó el
espectro de fluorescencia. La excitación global máxima del ciclo
3-GFP en GFP-Zeo es 395 nm, mientras
que el segundo máximo a 478 nm es evanescente. El espectro de
emisión revela un máximo de emisión de 510 nm. De las dos longitudes
de onda de excitación sugeridas por el manual la de 395 nm es la
preferida y se usó para las mediciones posteriores.
La auto-absorción es un fenómeno
muy frecuente en espectroscopia fluorescente. A elevadas
concentraciones de fluoróforo, los protones emitidos en una región
solapante del espectro de absorción (excitación) pueden absorberse
(transferencia de energía radiante). Se observará menor intensidad
fluorescente si se produce auto-absorción (efecto de
filtro de emisión interno). Esto conduce a una infravaloración de
las actividades promotoras. Sin efecto de filtro interno la
intensidad fluorescente aumenta de modo lineal según aumenta el
fluoróforo. Por lo tanto, se ensayaron volúmenes en aumento de
células de P. pastoris que expresan GFP-Zeo
para determinar su actividad fluorescente.
Hasta 3.000 URF no pudo detectarse el efecto de
filtro de emisión interno sobre el nivel celular. La
auto-absorción dentro con las células, producida por
la acumulación de GFP, no pudo evaluarse. Se detectó un aumento
lineal en la fluorescencia durante las 72 horas completas de la fase
de inducción. Por esa razón, no parece probable un efecto de filtro
interno dentro de las células. Por lo tanto la acumulación de
GFP-Zeo dentro del núcleo no es un problema para su
cuantificación. No se produce ningún efecto de filtro interno dentro
del intervalo de actividades promotoras unicopia determinadas en
este estudio. Debido a la ausencia de auto-absorción
la infravaloración de las actividades promotoras no es probable que
suceda. El efecto de filtro interno observado por otros se produce
más probablemente por el uso de una variante de GFP diferente con un
cambio de Stokes mucho menor y por lo tanto un espectro de
excitación y emisión solapantes. Se ha tenido cuidado al comparar
los resultados de experimentos de expresión de GFP. El uso de
diversas variantes de GFP con propiedades espectrales distintas,
pero también con usos de codón optimizados y por lo tanto niveles de
expresión muy diferentes en diferentes hospedadores de expresión
complican la posibilidad de comparar los resultados de diferentes
laboratorios.
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Normalmente el cultivo de células microbianas
(por ejemplo levaduras, baterías) a pequeña escala, se realiza en
cultivos de matraces agitadores. La inoculación y cultivo de grandes
bibliotecas microbianas en matraces agitadores es laboriosa y
conlleva tiempo dando como resultado elevados costes. En los últimos
años los sistemas de cultivo a microescala usando placas de
microtitulación de pocillos profundos se desarrollaron como una
alternativa. Debido a la manipulación en paralelo de, por ejemplo,
96 o 384 cepas/cultivos y a menos material necesario, los sistemas
de microtitulación son superiores a los matraces agitadores en
cuanto al esfuerzo, tiempo y por lo tanto mayor coste. Debido a
varias razones, los principales inconvenientes de los sistemas de
microtitulación, volumen pequeño de la muestra y una baja eficacia
de oxigenación, son menos importantes: (1) avances técnicos en
sistemas analíticos conducen a límites de detección inferiores de
una gran cantidad de compuestos dando como resultado la necesidad de
volúmenes de muestras muy bajos; (2) los métodos y dispositivos para
el cultivo en placas de microtitulación de pocillos profundos
también mejoran. En algunos estudios se ha demostrado que las tasas
de oxigenación, y por lo tanto las condiciones de crecimiento, en
las placas de microtitulación son similares a las de los matraces
agitadores. También se ha demostrado que, estudios en tiempo real en
el promotor GAL1 en S. cerevisiae, usando el
ciclo-3-GFP como proteína
indicadora, coinciden con estudios realizados en matraces
agitadores.
El promotor AOX1 que conduce la expresión
de GFP-Zeo se estudió en placas de microtitulación
de pocillos profundos como se ha descrito anteriormente. Después del
crecimiento celular en glucosa continuó una fase de inducción con
metanol como fuente de energía y carbono. La inducción del promotor
AOX1 con metanol en células de Pichia pastoris que
poseen el casete de expresión
PAOX1-GFP-Zeo-AOX1
TT condujo a un rápido aumento de la fluorescencia de GFP. Hasta las
72 horas la fluorescencia de GFP aumentó de manera lineal. La
expresión de GFP-Zeo continuaría si se añade
metanol. Si no se añade, el metanol se agota por evaporación y
consumo a las 24 horas y la expresión de GFP-Zeo
disminuye a un nivel desrreprimido.
El aumento de la fluorescencia en
GFP-Zeo también fue coincidente con la proteína
GFP-Zeo y se observó por SDS-PAGE.
Después de la inducción con metanol apareció una banda de proteína
de aproximadamente 42 kDa que se intensificó a medida que aumentaba
la fluorescencia. La fuerte banda a 42 kDa se observó en todos los
clones GFP-Zeo mientras que en el control negativo
(X-33 de tipo silvestre) no apareció la banda.
También en la muestra de d6*F10 de X33, después de 72 horas de
inducción con metanol, se observó una banda fuerte (figura 1C,
Carril 5). Aunque de manera no normalizada puede evaluarse una clara
correlación entre las intensidades de las bandas de 42 kDa y los
niveles de fluorescencia apropiados.
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Como se ha descrito anteriormente, se conocen
secuencias consenso para sitios de unión de diferentes factores de
transcripción. El análisis de secuencia de la secuencia del promotor
AOX1 reveló varios supuestos sitios de unión a factores de
transcripción, con algunos aciertos de especial interés. Entre el
factor de choque térmico y el elemento motivo de respuesta al
estrés, se observaron sitios de unión de algunos factores de
transcripción generalmente conocidos implicados en la regulación de
la glucosa. Los sitios de unión más interesantes se resumen en la
Tabla 11 y en la Figura 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En la bibliografía se describen diversas
secuencias que están implicadas en la regulación de genes inducibles
por metanol. Basándose en el análisis de deleción del promotor de
AOX2 de P. pastoris se describieron tres regiones
reguladoras, dos regiones de activación negativa (USR1 y USR2,
secuencias de represión aguas arriba) y un dominio de activación
positivo (UAS, secuencia de activación aguas arriba) [3]. También se
describieron dos secuencias de activación aguas arriba (UAS1 y UAS2)
y un sitio de unión al represor (USR1), para el promotor MOX
de H. polymorpha [8].
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Basándose en el análisis de factores de
transcripción y en el alineamiento de secuencias múltiples, se
seleccionaron 9 regiones promotoras para la deleción por PCR de
extensión por solapamiento, como se ha descrito anteriormente. Las
construcciones de deleción del promotor AOX1 se clonaron en
el vector pAOX para sustituir el promotor 5 de "AOX1 de tipo
silvestre" con respecto al gen indicador GFP-Zeo.
Los plásmidos se linealizaron y se integraron en el genoma de
Pichia pastoris.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los integrantes se analizaron para determinar la
expresión de GFP-Zeo y para la integración de la
secuencia promotora correcta delante del gen
GFP-Zeo, como se ha descrito anteriormente. Se
analizaron integrantes unicopia con mayor detalle para determinar
sus niveles de expresión de GFP-Zeo en diferentes
fuentes de carbono a microescala. En ninguna construcción (de
deleción y de tipo silvestre) pudo detectarse fluorescencia de GFP
siempre que la glucosa o el glicerol estuvieran presentes en el
medio (con y sin metanol). Después de la privación de carbono,
representando condiciones de desrepresión, se observó un ligero
aumento de la fluorescencia de GFP. En comparación con el tipo
silvestre, las variantes del promotor mostraron diferencias notables
(Figura 3). En condiciones de desrepresión, se observó una
disminución significativa de la actividad promotora en 6
construcciones (\Delta3, \Delta4, \Delta5, \Delta7,
\Delta8 y \Delta9, véase la Figura 3). \Delta1 poseía
actividad de tipo silvestre mientras que las construcciones
\Delta2 y \Delta6* dieron como resultado una expresión
significativamente mayor de GFP-Zeo. El nivel de
expresión de la última fue notablemente mayor que el nivel del tipo
silvestre.
Tras la inducción con metanol, todas las
variantes mostraron una actividad promotora disminuida significativa
con una sola excepción: \Delta1 que dio como resultado
aproximadamente el 20% de mayor actividad en comparación con el tipo
silvestre. La disminución en cuanto a la actividad en el resto de
variantes es bastante significativa como puede observarse en la Fig
4.
En la Tabla 3 se resume la actividad promotora
de todas las variantes y construcciones de tipo silvestre
normalizadas sobre la actividad de tipo silvestre inducida por
metanol.
La deleción de la caja TATA en la construcción
\Delta8 dio como resultado una destrucción masiva de promotor con
una fuerte disminución de la actividad en condiciones de
desrepresión y de inducción de aproximadamente el 90% y el 80%
respectivamente. Eliminando el comienzo del inicio de la
transcripción, determinado experimentalmente (Ellis, S.B., et
al., Mol. Cell. Biol. (1985) 5:1111-1121)
(\Delta9), no se observó dicho efecto fuerte sobre el nivel de
expresión. Esta es una de las mejores construcciones de deleción
después de la inducción con metanol. Como se esperaba, la caja TATA
tiene un fuerte impacto sobre el nivel de la transcripción. Por el
contrario, parece que el comienzo del inicio de la transcripción no
es tan importante como la caja TATA. Otra región en la distancia
definida con respecto a la caja TATA puede actuar como un inicio de
la trascripción después de la deleción de la original. Sobre el
efecto de esta deleción, en varias fases del proceso de expresión
(por ejemplo, inicio de la transcripción, estabilidad del ARNm,
inicio de la traducción), pueden realizarse conjeturas ya que el
extremo 5' del ARNm se cambió por la deleción.
Después de la desrepresión, solo dos
construcciones, \Delta2 y \Delta6*, mostraron un nivel de
expresión significativamente mayor. En las secuencias delecionadas
se incluyen los supuestos sitios de unión a factores de
transcripción de Rap1p y Gcr1p. Además, el supuesto sitio de unión a
factores de transcripción de QA-1F está muy próximo
a las secuencias de \Delta6* delecionadas. Cabe destacar que se
sabe que los sitios de unión de Rap1p y Gcr1p actúan de manera
sinérgica cuando están presentes en las secuencias promotoras [21].
El factor de transcripción general de Rap1p tiene diversas funciones
celulares (por ejemplo, estructura del telómero, apareamiento,
traducción, glucólisis) dependientes del contexto de secuencia de
sus sitios de unión y de los factores de transcripción apropiados
[22-24]. Como se ha mencionado anteriormente, Gcr1p
es el principal elemento de regulación y coordinación de genes
glucolíticos y es absolutamente necesario para el alto nivel de
expresión en S. cerevisiae. Los sitios de unión de Rap1p y
Gcr1p se encuentran en estrecha proximidad en la región núcleo de la
secuencia de activación aguas arriba (UAS) de genes glucolíticos y
la unión de Gcr1p se mitiga plegando el ADN por Rap1p. Por otro lado
un sitio de unión adyacente a Rap1p no es un requisito indispensable
para la activación de genes dependientes de Gcr1p. Parece que Gcr1p
puede facilitar la unión a sus sitios de unión cuando existe una
mayor cantidad de cajas CT. Aunque se ha descrito una clara
interacción de Rap1p con Gcr1p así como de Ccr1p con Gcr1p, se
sugiere que algunos otros factores interaccionan con Gcr1p y/o Rap1p
modulando la actividad del complejo. Durante las 3 últimas décadas
se consiguió un amplio conocimiento sobre el mecanismo de
inducción.
En la secuencia del promotor de AOX1, no
pudo observarse la estrecha proximidad indispensable descrita de los
sitios de unión de Gcr1p y Rap1p en UAS funcionales descritas
anteriormente. Por el contrario, los dos sitios de unión están a 367
pb de distancia. Entre el supuesto sitio de unión de Gcr1p, su
secuencia núcleo CTTCC está presente dos veces en la secuencia del
promotor de AOX1, pero ninguna de ellas está inmediatamente
adyacente al sitio de unión de Rap1p u otro motivo CTTCC. Por lo
tanto parece que no es probable una acción sinérgica de estos dos
sitios de unión como se ha encontrado en muchos genes glucolíticos.
Dado que las supuestas funciones de Rap1p y Gcr1c son proteínas
represoras para AOX1 en condiciones de desrepresión, es
posible un nuevo modo de (inter-) acción de las dos proteínas para
esta supuesta nueva función celular.
Se destaca una implicación de la deleción de
\Delta6* (incluyendo el supuesto sitio de unión de Gcr1p) en la
represión, después de la privación de carbono, por la observación de
cepas multicopia con expresión muy alta de GFP-Zeo
sin inducción con metanol. En la Fig. 5 se muestra la expresión de
GFP-Zeo del mejor clon de la serie \Delta1-
\Delta9, denominado X-33 d6*F10 de P.
pastoris. Después de la desrepresión, en esta cepa multicopia
\Delta6*, la expresión de GFP-Zeo es
aproximadamente un 10% superior (60h a microescala) que en una cepa
unicopia del promotor de tipo silvestre (X-33
GFP-Zeo D2) después de la inducción con metanol. El
nivel de expresión de X-33 d6*F10 de P.
pastoris, después de la inducción con metanol, también es mucho
más alto que el de una cepa multicopia con un promotor de tipo
silvestre (X-33 GFP-Zeo E2).
Las regiones del promotor de AOX1 y
DAS1 de P. Pastoris y de MOX en H.
polymorpha promueven la expresión de la enzima indicadora
beta-galactosidasa (lacZ de E. coli) en S.
cerevisiae [9]. El modelo de regulación de estos genes en S.
cerevisiae es similar al de sus hospedadores naturales: la
glucosa reprime la expresión del gen. En condiciones de privación de
carbono la expresión se desrreprime ligeramente y el glicerol como
fuente de carbono induce la expresión. Los niveles de
beta-galactosidasa expresada bajo el control de las
regiones reguladoras de AOX1 y DAS1 en S.
cerevisiae son comparables con los obtenidos con los fuertes
promotores de S. cerevisiae CYC1 (constitutivo)
y GAL2 (inducible) [9]. Se ha demostrado que la expresión
conducida por el promotor de MOX está también inducida por
etanol, metanol y ácido oleico en S. cerevisiae. Otro
hallazgo muy importante es la implicación de Adr1p en la
desrepresión/inducción del promotor. Adr1p, un efector positivo de
ADH2 (alcohol deshidrogenasa 2) y algunas proteínas peroxisomales en
S. cerevisiae [25], también es un efector positivo del
promotor de MOX cuando no hay glucosa en el medio.
Como se ha mencionado anteriormente el modelo de
regulación de los genes de AOX1 y de MOX es
significativamente diferente en sus hospedadores naturales debido a
la desrepresión de MOX cuando el glicerol está presente. El uso de
la región promotora de AOX1 en H. polymorpha reveló
que el promotor de AOX1 no estaba reprimido por glicerol en
el hospedador heterólogo [26]. Por lo tanto, el promotor heterólogo
de AOX1 parece regularse como el promotor homólogo de
MOX. Estos resultados sugieren que las diferencias
significativas en cuanto al modelo de regulación entre P.
pastoris y H. polymorpha se deben a la respuesta
transcripcional global con respecto a diferentes fuentes de carbono
en estas dos levaduras. Es decir, aunque las maquinarias de
represión del glicerol y la glucosa sean (parcialmente) idénticas en
P. pastoris, en H. polymorpha (como en S.
cerevisiae) la situación es diferente y el glicerol no usa la
maquinaria de represión de la glucosa.
Dos de los tres supuestos sitios de unión a
HAP2/3/4/5 encontrados en la secuencia promotora de AOX1 se
encuentran dentro de la construcción de deleción \Delta1 y el
tercero en \Delta5. La deleción de secuencia de \Delta1 da como
resultado un aumento en la actividad promotora después de la
inducción con metanol aunque no se observaron efectos sobre el nivel
de desrepresión del promotor. Por el contrario, la deleción de
\Delta5 da como resultado una fuerte disminución en la actividad
promotora en condiciones de desrepresión así como de inducción. En
la deleción de \Delta1 se encontró un supuesto sitio de unión a
abaA en Aspergilus nidulans. El producto del gen abaA es un
activador transcripcional que está implicado en el desarrollo de
conidióforos (aparato reproductor asexual) en A. nidulans
[27]. Dado que todos los supuestos sitios de unión son posibles
secuencias activadoras [27], su deleción debe tener un efecto
negativo sobre el nivel de expresión como se observa en la
construcción \Delta5. Debido a que las dos deleciones son muy
largas, otro sitio de unión podría ser el responsable del efecto
observado. De hecho esta deleción de \Delta1, que tiene el efecto
opuesto sobre el nivel de expresión, indica que uno de los supuestos
sitios de unión es un motivo represor o que otro sitio de unión está
presente, lo cual supera el efecto de deleción de los supuestos
sitios de unión HAP y abaA, aumentando, por tanto, el nivel de
expresión.
Sin embargo, se sabe que el complejo HAP es
responsable de la regulación positiva de los genes implicados en el
metabolismo respiratorio y energético S. cerevisiae. La
regulación de la respiración está controlada por el nivel de oxígeno
así como por la fuente de carbono presente en el medio, ambos
mediados por el complejo Hap. En la levadura fermentativa S.
cerevisiae, varios genes y por lo tanto funciones de la cadena
respiratoria así como el ciclo del ácido cítrico, están reprimidos
por la glucosa. La represión de la respiración por la glucosa está
parcialmente mediada por el complejo Hap, en concreto por la
ausencia de Hap4p siempre que la glucosa esté presente. Por otro
lado, la regulación dependiente de oxígeno parece que está regulada
por Hap1p [28]. Se aislaron homólogos de los genes del complejo Hap
en las levaduras respiratorias K. lactis. Los genes
implicados en la respiración se han expresado constitutivamente en
levaduras respiratorias, incluso en presencia de glucosa. Hasta
ahora, casi todos los genes de la cadena respiratoria han demostrado
regularse independientemente del complejo Hap [29]. El papel del
complejo Hap parece coordinarse con la asimilación de carbono y
nitrógeno, como también se ha observado en S. cerevisiae [30]
y Aspergilus nidulans [29].
La primera etapa en la ruta de utilización del
metanol, principalmente catalizada por el producto génico de
AOX1 en P. pastoris, es el consumo de oxígeno. La
mayoría de los genes implicados en el metabolismo energético y casi
todos los genes que codifican enzimas que consumen oxígeno, se
regulan por oxígeno, principalmente por Hap1p y/o Hap2/3/4/5p [28].
Cuando crecen en metanol, como única fuente de energía y carbono, la
ruta de utilización del metanol da como resultado la asimilación de
carbono y producción de energía. Una implicación del motivo de
reconocimiento del complejo Hap TTCCAA en la regulación del promotor
de AOX1 realiza un sentido intuitivo.
La construcción \Delta4, que incluye un
segundo supuesto sitio de unión a HSF, da como resultado un 30% de
disminución de la actividad promotora después de desrepresión y de
inducción. Por lo tanto, HSF es un agente intensificador general de
la expresión génica de AOX1 en condiciones de desrepresión
así como de inducción. En S. cerevisiae, diversas condiciones
de estrés como choque térmico, estrés oxidativo y privación de
glucosa conducen a la activación de HSF. También se ha demostrado
que la proteína quinasa Snf1p, uno de los "principales
interruptores metabólicos", está implicada en la fosfoliración y
por lo tanto la activación de HSF después de la privación de carbono
[31]. Por lo tanto se produce una implicación de HSF en la
activación completa de AOX1 después de la privación de
glucosa (con o sin inducción).
En la técnica anterior, se describen estudios de
expresión sobre el promotor de AOX, usando versiones
truncadas, así como variantes con secuencias delecionadas [32,
33].
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La construcción Inan_BCDEF, que comienza en 153
(-801) (Tabla 14) reveló un sitio de unión de al menos una proteína
activadora aguas arriba de 153 (-801). Los candidatos para este
sitio de unión al activador son los sitios de unión de Hap1p (52 a
66, -902 a -888) y HSF (135 a 155, -819 a -799) en la cadena
complementaria encontrada con MatInspector. El truncamiento en el
sitio de restricción SacI (210-215 (-744 a -739))
dio como resultado un promotor que apenas conseguía la actividad del
promotor de tipo silvestre (Geoff Lin Cereghino, Poster, Sixth
Meeting on "Current Topics in Gene expression and Proteomics",
San Diego, octubre 19-22, 2003). Para conseguir el
nivel del promotor de tipo silvestre con la construcción del
promotor truncado con SacI (pHWG0, Geoff Lin Cereghino, poster),
puede estar presente un segundo sitio de unión para una proteína
represora aguas arriba de 210 (-744) cuya deleción tiene el mismo
impacto, pero en dirección opuesta, sobre la actividad del promotor.
La situación de la proteína represora está entre 169 (-784) y 210
(-744) porque la construcción \Delta1 (\Delta 169 (-784) a 234
(-719)) contiene un sitio unión al represor. La deleción de
\Delta1 da como resultado un aumento del 20% de la actividad
promotora (Tabla 14) que está en el intervalo de la disminución por
deleción del sitio de unión de la proteína activadora.
Por comparación con \Delta4 (\Delta 508
(-445) a 550 (-403)) la situación del sitio de unión al represor
puede refinarse adicionalmente con respecto a una secuencia entre
433 (-520) y 508 (-445) porque la deleción \Delta4 incluye un
factor de transcripción de acción positiva, HSF en 516 a 536 (-438 a
-418). Si el HSF de acción positiva (si se trata de HSF) se localiza
dentro de la región propuesta, puede sugerirse un efecto más fuerte
del sitio de unión al represor entre 433 y 508 (-520 y -445). Si el
sitio de unión para HSF se localiza en la región entre 508 y 536
(-445 y -418) otro sitio de unión al activador se localiza entre 536
y 560 (-418 y -393) si esto no es así, es probable que sea el mismo
sitio de unión. Al igual que la variante InanABCD_F (\Delta 560 a
709 (-393 a -245)) con una actividad de tipo silvestre solo del 16%,
también la construcción \Delta5 (624 a 682 (-329 a -271)) da como
resultado una disminución de aproximadamente el 70% del nivel de
tipo silvestre. Como era de esperar, la deleción del fragmento Inan
B a partir del promotor de longitud completa (que da como resultado
InanA_CDEF) así como a partir de Inan_BCDEF (que da como resultado
Inan_CDEF) da como resultado una disminución del 63 al 64% del
fragmento más largo, respectivamente. En cambio, mientras que la
deleción del fragmento C, a partir del promotor de longitud
completa, da como resultado un aumento de aproximadamente el 10% de
la actividad promotora, la deleción del fragmento Inan_CDEF truncado
conduce a una disminución del 49 al 14% (Tabla 14). La explicación
es una unión sinérgica de factores de transcripción dependientes del
contexto de sus sitios de unión. Entre 713 y 760 (-241 a -194) se
localiza un último sitio de unión a proteína activadora (Geoff Lin
Cereghino, Poster San Diego). De nuevo, mediante la construcción
\Delta7 (\Delta 729 a 763, -225 a -191) la localización del
activador podría afinarse aguas abajo hasta 729 (-225).
Concluyendo, se observaron varias regiones que
tenían un fuerte impacto sobre el nivel de expresión del promotor de
AOX1. Combinando todos los sitios reguladores conocidos a
partir del ejemplo proporcionado en este documento y a partir de
otros autores, excluyendo las regiones que contienen la caja TATA y
el sitio de inicio de la transcripción, en la secuencia promotora de
P_{AOX1}.al menos existen 10 sitios reguladores.
Los datos proporcionados revelan la regulación
orquestada del promotor de AOX1, se necesitan diversos
factores para unirse al ADN para un nivel de expresión máximo. En
condiciones de inducción varios factores de la transcripción de
acción positiva (activadores) se unen al ADN mientras que la mayoría
de las proteínas represoras no se unen dando como resultado un alto
nivel de expresión. En condiciones de desrepresión, la actividad del
promotor alcanza solo un pequeño porcentaje (\sim 3%) del nivel
inducido. Probablemente esto se debe a proteínas menos activadoras y
más represoras que se unen a la región promotora. En condiciones de
represión puede suponerse que ni activadores ni diversos represores
se unen al ADN con un aumento adicional de la proporción
represor/activador en condiciones de represión.
Para el promotor de ADH2 (alcohol deshidrogenasa
2) de S. cerevisiae, reprimido por glucosa, se ha demostrado
que la unión de proteínas activadoras (por ejemplo Adr1p),
inmediatamente adyacentes a los nucleosomas, conduce a
desestabilización y por lo tanto la reorganización de la cromatina
después de la desrepresión. La reorganización tiene lugar en la
región de la caja TATA y el sitio de inicio de la transcripción
aumentando por tanto su accesibilidad. Por lo tanto, debido a la
formación de un complejo de pre-iniciación estable
de mayor accesibilidad, se produce un aumento de la actividad
promotora con respecto a un nivel basal. Entre la unión de diversos
factores de transcripción para potenciar la expresión dirigida por
P_{AOX1}, puede suponerse un mecanismo similar, al menos para la
desrepresión. Considerando todos los datos y supuestos en conjunto,
la regulación del promotor de AOX1 es muy compleja y los
supuestos sitios de unión de diversos factores de transcripción (de
acción positiva y negativa) revelan una maquinaria muy coordinada
que es capaz de integrar una amplia diversidad de señales para la
regulación del promotor de AOX1.
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En este documento se ha demostrado que
mutaciones específicas dentro de secuencias núcleo de los sitios de
unión a factores de transcripción dan como resultado modificaciones
significativas de su fuerza efectora. Supuestamente, algunas
proteínas activadoras y represoras actúan sobre el promotor de
AOX1 para dar como resultado su muy fuerte regulación (casi
sin actividad con glucosa, actividad muy alta con metanol). Por lo
tanto la mutagénesis aleatoria del promotor de AOX1 debe dar
como resultado varias variantes del promotor con actividades de los
sitios de unión a represor destruidas o reducidas. Se realizó una
serie de reacciones PCR con diferentes tasas de mutación. Las
variantes promotoras resultantes se transformaron dentro de la cepa
GFP-Zeo Mut^{S} A9 de P. pastoris en la que
el gen AOX1 se sustituyó por la cepa GFP-Zeo.
La sustitución del promotor de AOX1 de tipo silvestre por
variantes promotoras mutagenizadas debe ocurrir a una tasa
particular. La selección de variantes promotoras con mayor tasa de
expresión, cuando está presente la glucosa en el medio, se realizó
sobre placas de agar MD-Zeo.
La dispersión sobre placas de agar MD que
contenían 100 \mug/ml de Zeocin^{TM} dio como resultado placas
cubiertas con células de Pichia pastoris y sin colonias
individuales evidentes. Parece que la presión de selección no fue
suficiente para reprimir el crecimiento de la cepa de tipo
silvestre. Aunque no pudo detectarse fluorescencia en la cepa
GFP-Zeo Mut^{S} A9 de P. pastoris, cuando
la glucosa estaba presente, algunas proteínas
GFP-Zeo pudieron expresarse en la célula confiriendo
resistencia a Zeocin^{TM}. Para ensayar mayores concentraciones de
Zeocin^{TM} para la inhibición del crecimiento de la cepa
GFP-Zeo Mut^{S} A9 se realizaron ensayos por goteo
como se ha descrito anteriormente.
Como puede observarse claramente en la Fig. 6 el
aumento a 200 \mug/ml no disminuyó la viabilidad celular (en
comparación con 100 \mug/ml) de las cepas de P. pastoris
que contenían un gen GFP-Zeo bajo el control del
promotor de AOX1, pero el aumento a 500 \mug/ml si lo hizo.
Era de esperar que la mutagénesis del promotor diera como resultado
únicamente niveles de expresión ligeramente aumentados por lo tanto
una presión de selección de 500 \mug/ml de Zeocin^{TM} parece
ser demasiado alta. Por último, para todas las exploraciones
posteriores de variantes promotoras por mutagénesis, se
seleccionaron 350 \mug/ml.
Debido a la regulación transcripcional muy
compleja con muchas regiones promotoras involucradas, una estrategia
de mutagénesis aleatoria usando una tasa alta de mutagénesis, es
ventajosa.
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Basándose en los resultados del ejemplo 1 se
generó una segunda generación de variantes por deleción. A
diferencia de la primera serie, en estas nuevas construcciones de
deleción, solo se delecionaron tramos de secuencias pequeños y
específicos de los supuestos sitios de unión a factores de
transcripción (5-15 pb) (Tabla 15).
Todas las deleciones se introdujeron usando el
protocolo de mutagénesis dirigida en dos etapas de acuerdo con Wang
et al. [34]. En una primera etapa se evaluaron dos reacciones
individuales (una para un cebador directo y una para un cebador
inverso) (100 ng de molde de pAOX, 15 pmol de cebador, 200 pM de
cada dATP, dTTP, dCTP y dGTP, 2,5 U de polimerasa
PfuUl-tra^{TM} en un volumen de 50 \mul
en condiciones de tampón apropiadas). Se combinaron 25 \mul de
estas 2 reacciones de PCR y se realizó una segunda etapa de reacción
PCR.
Se añadió 1 \mul de la enzima de restricción
DpnI (10 u/pl) a 30 \mul de la segunda etapa de reacción
PCR y se incubó durante 1 h a 37ºC. Se transformaron
1-5 \mul de la reacción PCR, digerida con
DpnI, en células de E. coli electrocompetentes [16] y
se sembraron en placa sobre placas de LB-Amp después
de un tiempo de regeneración de 1 h en medio SOC.
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Los plásmidos construidos, como se ha descrito
anteriormente, se prepararon y se transformaron en Pichia
pastoris como se describe el ejemplo 1.
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Se observó un fuerte efecto sobre el nivel de
expresión con las mutaciones más cortas del ejemplo 2 como ya se ha
descrito para las deleciones más largas del ejemplo 1, en el que
todas las mutaciones tienen un efecto significativo positivo o
negativo sobre la actividad promotora. Las deleciones cortas de
sitios de unión a factores de transcripción específicos tienen
fuertes efectos sobre la actividad promotora y proporcionan una
información más precisa sobre las propiedades reguladoras de los
sitios reguladores individuales (por ejemplo sitios de unión a
factores de transcripción). Gcr1 es de especial interés ya que su
sitio de unión está incluido en la deleción \Delta6. La
secuenciación de la región promotora de un mutante de deleción
pAOX\Delta6 y un producto PCR de colonia del ADN genómico de
clones de Pichia pastoris reveló una deleción adicional en la
región promotora (deleción de los nucleótidos 737 a 738 (-217 a
-216) de la SEC ID Nº 1). Debido al hecho de que esta variante
promotora conduce a una actividad promotora aumentada, dando como
resultado, en consecuencia, una mayor tasa de expresión, en
condiciones de desrepresión, la mutación adicional puede
introducirse en un promotor, de acuerdo con la presente invención,
para aumentar la expresión de proteínas en estas condiciones.
La actividad promotora de clones
QA-1F con una deleción adicional (deleción de
nucleótidos 736 a 741 (-218 a -213) de la SEC ID Nº 1) es
significativamente diferente en comparación con el promotor
AQA-1F sin esta deleción adicional: La actividad
cambia de \sim 30% (desrepresión) y \sim 100% (inducción) de la
actividad de tipo silvestre (AOX1\DeltaQA-1F,
véase la tabla 15) a \sim 140% y \sim 70%, respectivamente
(AOX1\DeltaQA-1Fzus, véase la tabla 15). La
deleción adicional de estos 6 nucleótidos parece tener una notable
influencia sobre la actividad promotora. Por lo tanto, se introdujo
una nueva variante promotora que lleva esta mutación (\Delta
736-741) mediante el protocolo de mutagénesis
dirigida, como se ha descrito anteriormente. Ambas mutaciones, que
aparecieron dos veces accidental e independientemente en esa región,
dieron como resultado un aumento de la actividad promotora en
condiciones de desrepresión. Es notable que exista un aumento en la
actividad promotora aunque exista una segunda mutación y más
probablemente de influencia negativa en ambas construcciones.
Se generó una combinación de \Delta2 y
\Delta6 (\Delta2\Delta6) similar a las deleciones individuales
por PCR de expresión solapante. En la tabla 17 se muestra claramente
que una deleción de ambos fragmentos da como resultado una fuerte
disminución de la actividad promotora en condiciones de desrepresión
así como en condiciones de inducción. Dado que en esta construcción
no existe una deleción adicional de TA, en comparación con la
construcción \Delta6*, como también se ha mencionado
anteriormente, esto resulta compatible con la hipótesis de que la
mutación adicional producida accidentalmente
(\Delta737-38) es responsable del aumento de la
actividad promotora después de la privación de carbono.
Diversas deleciones dan como resultado una
disminución notable de la actividad promotora (por ejemplo Hsf, pero
también Hap1 y Hap2345_1). Estos supuestos sitios de unión son
brillantes dianas para una duplicación de secuencias que deben dar
como resultado un aumento de la actividad promotora.
De manera interesante, en 2 de 4 clones de la
variante \Delta736-741 generados por mutagénesis
dirigida, se observó una nueva deleción de 9 nucleótidos (TTGGTATTG)
en la posición 552 a 560 (-402 a -394). El efecto de las deleciones
se observó en regiones distintas pero también se observó en
construcciones AHsf_2. Se esperaba que dicho efecto se debiera a una
homología de secuencia local. Por lo tanto dichas regiones
adicionalmente delecionadas (\Delta552-560,
\Delta737-38 y \Delta736-41) y
las secuencias en estrecha proximidad (5pb aguas arriba y abajo)
también son supuestos sitios de unión a factores de transcripción y
por lo tanto dianas sumamente interesantes para realizar deleciones
y duplicados. La variante de deleción \Delta736-41
da como resultado una reducción mejorada del nivel de expresión en
condiciones de inducción con metanol.
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En la mayoría de los casos, la generación de
cepas multicopia da como resultado cepas de superexpresión de
GFP-Zeo. En muchos casos estas cepas tienen mayores
niveles de expresión que las cepas d6*F10, principalmente en
condiciones de inducción con metanol. La generación de cepas
multicopia puede conseguirse con diversas construcciones,
especialmente con la construcción \Delta6*, las construcciones de
doble deleción d2d6, que incluyen las deleciones \Delta1,
\Delta2 y \Delta6* así como, por ejemplo, Gcr1, Rap1, abaA,
Hap2345_1, pero también, por ejemplo, QA-1F, Adr1,
Hsf_2_MatlMC y Hsf_2_Hap2345_1 (véase la figura 7). En estas cepas
se observó una mayor tasa de expresión en condiciones de inducción
en comparación con la cepa d6*F10. En cambio, la cepa d6*F10 puede
producir más GFP-Zeo que cualquier otra cepa
generada hasta ahora conocida en condiciones de desrepresión. La
transformación repetida de construcciones \Delta6* en Pichia
pastoris da como resultado un elevado número de cepas multicopia
con actividad comparable a la de la cepa d6*F10, especialmente en
condiciones de desrepresión (figura 8).
Usando construcciones promotoras de tipo
silvestre, se observó una frecuencia mucho más baja de cepas
multicopia (por ejemplo, la cepa E2) que usando variantes
promotoras. Aunque se analizaron de 2-4 veces más
transformantes, el nivel de expresión de los mejores transformantes
de E2 es solamente el doble de elevado que las copias de
transformantes unicopia. Concluyendo, la transformación de variantes
promotoras dan como resultado una mayor frecuencia de cepas
multicopia y estas cepas múltiples son más productivas que las cepas
multicopia promotoras de tipo silvestre.
\vskip1.000000\baselineskip
Para ensayar la viabilidad de todos los
resultados de GFP-Zeo para otras proteínas
básicamente bien expresadas e industrialmente relevantes (por
ejemplo enzimas) se clonaron algunas variantes promotoras delante de
dichas enzimas indicadoras (por ejemplo, PaHNL5\alpha y
HRP).
\vskip1.000000\baselineskip
Se clonaron variantes promotoras dentro de los
vectores pPICZ\alpha\beta-HRP-WT
[35] y pGAPZ A-PaHNL5\alpha. Para el intercambio del
promotor en
pPICZ\alpha\beta-HRP-WT, se
insertó un sitio de restricción NdeI en el extremo 5' del
promotor por mutagénesis dirigida (100 ng del vector como molde,
cebador PICZdir NdeI y PICZinv NdeI - véase la tabla
18). El vector resultante se denominó
pPICZ\alphaB-NdeI-HRP-WT.
\vskip1.000000\baselineskip
Para el clon de expresión pGAPZ
A-PaHNL5\alpha se clonó en primer lugar el gen
PaHNL5\alpha a partir de un vector pHIL-D2
(Glieder, A., et al. Angew. Chemie Int. Ed. 2003) en un
vector pGAPZ A, dando como resultado un plásmido
pGAPZA-PaHNL5\alpha. La clonación de variantes
promotoras en pGAPZ A-PaHNL5\alpha podría
realizarse directamente después de la digestión de plásmidos pGAPZ
A-PaHNL5\alpha y pAOX\Delta con
EcoRI/BglII. Para un intercambio en
pPICZ\alphaB-NdeI-HRP-WT
las variantes promotoras se amplificaron por PCR usando cebadores
AOX1NDE1 y AOX1inv (véase la tabla 18, 10 ng de pAOX\Delta, 10
pmol de cebadores AOX1NDE1 y AOX1inv, 200 \muM de cada dNTP, 0,6 u
de polimerasa Phusion^{TM} polimerasa en condiciones de tampón
apropiadas y un volumen total de 50 \mul). Los productos de PCR y
el plásmido
pPICZ\alphaB-NdeI-HRP-WT se
clonaron empleando sitios de restricción NdeI/HindIII.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la transformación de Pichia pastoris
todos los vectores HRP se linealizaron por NdeI y todos los
plásmidos PaHNL5\alpha por BglII. La transformación
se realizó como se ha descrito en el ejemplo 1. El cultivo de cepas
de P. pastoris también se realizó como se ha descrito en el
ejemplo 1, solo con algunas excepciones. La cantidad de BDM inicial
(1%) se aumentó a 350 \mul y después de 60 horas se tomaron 100
\mul de cultivo para centrifugación (4000 rpm, 4ºC, 10 min). La
inducción con metanol se realizó exactamente como se ha descrito en
el ejemplo 1.
Para el ensayo de HNL, se tomaron 50 \mul
(desrepresión) o 10 \mul (inducción) de sobrenadante de
centrifugación y para el ensayo de HRP se tomaron 15 \mul, para
ambas condiciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 15 \mul de sobrenadante a 150
\mul de ABTS 1 mM/H_{2}O_{2} 2,9 mM en tampón NaOAc 50 mM, ph
4,5 en placas de microtitulación PS. La absorción prosiguió durante
5 minutos a 405 nm en un lector de placa Spectramax Plus384
(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 50 \mul o 10 \mul de
sobrenadante a 100 o 140 \mul de tampón
citrato-fosfato 0,05 M, pH 5,0 en una placa de
microtitulación UV-Star. La reacción comenzó
añadiendo 50 \mul de solución de mandelonitrilo 0,06 M (en tampón
citrato-fosfato 0,003 M, pH 3,5) y prosiguió durante
5 minutos a 280 nm en un lector de placa Spectramax Plus384
(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados usando las proteínas indicadoras
alternativas PaHNL5\alpha y HRP muestran claramente la
posibilidad de transferencia de la actividad del promotor usando
GFP-Zeo (Tabla 17).
Debido a la menor sensibilidad del ensayo HRP el
nivel de expresión en condiciones de desrepresión estuvo por debajo
del límite de detección. Por lo tanto la expresión de HRP no pudo
determinarse en condiciones de desrepresión.
Para transferir la selección multicopia a los
sistemas indicadores alternativos, se clonaron variantes del
promotor de AOX1 en los plásmidos HRP y PaHNL5\alpha
apropiados delante del gen de resistencia a Zeocina sustituyendo por
lo tanto el promotor TEF1.
\vskip1.000000\baselineskip
Para ensayar las variantes promotoras con GFP,
las variantes promotoras descritas en los ejemplos 1 y 2 se clonaron
delante de un gen del ciclo-3 GFP.
\vskip1.000000\baselineskip
Los sitios de restricción internos BamHI
y XhoI en el ciclo-3 GFP en el vector pAOX se
delecionaron por mutagénesis dirigida empleando cebadores
Bam-del-d y
Xho-del-i (Tabla 19) y 100 ng del
vector como molde. El fragmento de GFP se amplificó por PCR a partir
del plásmido resultante (10 ng) empleando cebadores
GFP-Zeo dir (Sec. ID Nº 4, Tabla 7, 10 pmol) y
wtGFP-XhoI-i (Tabla 19, 10 pmol) y
polimerasa Phusion^{TM} en condiciones apropiadas. El producto
resultante de la PCR pudo clonarse dentro del vector pPICZ B
empleando cortes de restricción con EcoRI/XhoI y
ligamiento usando ADN ligasa de T4. El plásmido resultante se
denominó pPICZ-GFP.
La clonación de todas las variantes promotoras
en pPICZ-GFP pudo realizarse directamente después de
la digestión con BglII/EcoRI de los plásmidos
pPICZ-GFP y plásmidos pAOX.
Para la transformación de Pichia pastoris
todos los plásmidos se linealizaron por BglII. La
transformación se realizó como se ha descrito en el ejemplo 1.
Después de la transformación y de una fase de regeneración de unas 2
horas las células se sembraron en placa sobre placas de agar
YPD-Zeo que contenía 100 \mug/ml de Zeocina.
El cultivo de Pichia pastoris, la
inducción con metanol y la medición de la fluorescencia de GFP se
realizó exactamente como se ha descrito en el ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando GFP como sistema indicador, de nuevo los
resultados muestran la capacidad de transferencia de la actividad
promotora detectada usando GFP-Zeo (Tabla 20).
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha descrito el ejemplo 1 y 2, la
aparición de cepas multicopia usando Zeocina como marcador de
selección es muy común. La frecuencia de cepas multicopia podría
aumentarse enormemente aumentando la concentración de Zeocina, en
las placas de selección, a 500 y 1000 \mug/ml,
respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Para ensayar pequeñas partes del promotor de
AOX1 en un sistema libre de casi todos los sitios de unión a
factores de transcripción, el promotor de AOX1 se cortó en algunos
pares de bases delante de la caja TATA en las posiciones -176 y -194
dando como resultado elementos promotores basales AOX176 y AOX194
(Tabla 21). Para permitir la clonación posterior de elementos
promotores delante de los fragmentos promotores basales así como la
clonación de promotor basal se insertó un sitio de restricción
BspTI y EcoRI en el extremo 5' y 3',
respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se amplificaron elementos de AOX1 basales a
partir de pAOX (10 ng) usando cebadores AOX1basalinv (Tabla 21,10
pmol) y AOXbasaldir (10 pmol, AOX194) y AOX176dir (10 pmol, AOX176),
respectivamente. La PCR se realizó usando polimerasa Phusion^{TM}
(0,6 u) en condiciones apropiadas en un volumen total de 50
\mul.
La variante del promotor
AOX176-737 se amplificó por PCR usando cebadores
AOX1basalinv y 737-38AOX176 como se ha descrito
anteriormente. La variante del promotor
AOX176-201-214 se amplificó por PCR
usando cebadores AOX1basalinv y 201-214AOX176 como
se ha descrito anteriormente.
Los productos resultantes de la PCR pudieron
clonarse dentro del vector pPICZ-GFP empleando
cortes de restricción con BglII/EcoRI y ligamiento
usando ADN ligasa de T4 sustituyendo, por tanto, el promotor de
AOX1 de tipo silvestre.
Los 4 oligonucleótidos Leu2basal1d, Leu2basal2d,
Leu2basal1i y Leu2basal2i (25 pmol cada uno) se mezclaron en un
volumen total de 20 \mul, se calentó a 95ºC durante 2 minutos y se
enfrió a temperatura ambiente lentamente. Se realizó el ligamiento
de 3 \mul de la mezcla con 159 ng de un fragmento
pPICZ-GFP con BglII/EcoRI durante 6
horas a 16ºC. Después de la transformación en E. coli el
vector resultante se denominó pLeu2basal-GFP.
La variante promotora Leu2-737
se amplificó por PCR usando cebadores Leu2basalinv y
737-38Leu2 y
pLeu2basal-GFP como molde, como se ha descrito anteriormente. El producto resultante de la PCR pudo clonarse en el vector pPICZ-GFP empleando cortes de restricción con BglII/EcoRI y ligamiento usando ADN ligasa de T4 sustituyendo, por tanto, el promotor de AOX1 de tipo silvestre. El plásmido resultante se denominó pLeu2-GFP-737.
pLeu2basal-GFP como molde, como se ha descrito anteriormente. El producto resultante de la PCR pudo clonarse en el vector pPICZ-GFP empleando cortes de restricción con BglII/EcoRI y ligamiento usando ADN ligasa de T4 sustituyendo, por tanto, el promotor de AOX1 de tipo silvestre. El plásmido resultante se denominó pLeu2-GFP-737.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para la transformación de Pichia pastoris
todos los plásmidos se linealizaron por BamHI. La
transformación se realizó como se ha descrito en el ejemplo 1.
Después de la transformación y de una fase de regeneración de 2 h,
las células se sembraron en placa en placas de agar
YPD-Zeo que contenían 100 \mug/ml de Zeocina.
El cultivo de Pichia pastoris, la
inducción de metanol y las mediciones de fluorescencia de GFP se
realizaron exactamente como se ha descrito en el ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Este experimento demuestra que la adicción de
pequeños elementos, identificados en los ejemplos 1 y 2, podría
usarse para aumentar la fuerza promotora de elementos promotores
basales derivados del promotor de AOX1 o derivados del
promotor de LEU2 de Saccharomyces cerevisiae.
\vskip1.000000\baselineskip
La aparición y la frecuencia de cepas multicopia
observadas después de la transformación es exactamente la misma a la
descrita en el Ejemplo 4. El sitio de linearización diferente dentro
del plásmido no ejerció ninguna influencia sobre la generación de
cepas multicopia.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
Sec ID Nº 1: Promotor de AOX1 de Pichia
pastoris
Claims (19)
1. Un promotor mutante de alcohol oxidasa 1
(AOX1) de Pichia pastoris del promotor de AOX1 de Pichia
pastoris de tipo silvestre (SEC ID. Nº: 1) que comprende al
menos una mutación dentro de los nucleótidos 170 a 235 (-784 a -719)
de la Sec. ID N:º: 1 para una expresión elevada en condiciones
inducidas por metanol.
2. El promotor de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizado por que el promotor comprende adicionalmente
una mutación de los nucleótidos 694 a 723 (-260 a - 231) y/o de los
nucleótidos 729 a 763 (-225 a -191) de la Sec ID Nº1 y/o de un sitio
de unión a factores de transcripción (TFBS) y/o al menos una
mutación seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 170
a 191 (-784 a -763), los nucleótidos 192 a 213 (-762 a -741), los
nucleótidos 192 a 210 (-762 a -744), los nucleótidos 207 a 209 (-747
a -745), los nucleótidos 214 a 235 (-740 a -719), los nucleótidos
304 a 350 (-650 a -604), los nucleótidos 364 a 393 (-590 a -561),
los nucleótidos 434 a 508 (-520 a -446), los nucleótidos 509 a 551
(-445 a -403), los nucleótidos 552 a 560 (-402 a -394), los
nucleótidos 585 a 617 (-369 a -337), los nucleótidos 621 a 660 (-333
a -294), los nucleótidos 625 a 683 (-329 a -271), los nucleótidos
736 a 741 (-218 a -213), los nucleótidos 737 a 738 (-217 a -216),
los nucleótidos 726 a 755 (-228 a -199), los nucleótidos 784 a 800
(-170 a -154) o los nucleótidos 823 a 861 (-131 a -93).
3. El promotor de acuerdo con la reivindicación
1 ó 2, caracterizado por que la mutación es una deleción, una
sustitución, una inserción o una inversión.
4. El promotor de acuerdo con la reivindicación
2 ó 3, caracterizado por que el sitio de unión a factores de
transcripción (TFBS) se selecciona del grupo que consiste en Hap1,
Hsf, Hap234, abaA, Stre, Rap1, Adr1, Mat1MC, Gcr1 y
QA-1F, en el que el sitio de unión a factores de
transcripción (TFBS) Hap1 comprende preferiblemente los nucleótidos
54 a 58 de la Sec ID Nº. 1, Hsf los nucleótidos 142 a 149 y 517 a
524 de la Sec ID Nº.1, Hap234 los nucleótidos 196 a 200, 206 a 210 y
668 a 672 de la Sec ID Nº.1, abaA los nucleótidos 219 a 224 de la
Sec ID Nº: 1, Stre los nucleótidos 281 a 285 de la Sec ID Nº: 1,
Rap1 los nucleótidos 335 a 339 de la Sec ID Nº: 1, Adr1 los
nucleótidos 371 a 377 de la Sec ID Nº: 1, Mat1MC los nucleótidos 683
a 687 de la Sec ID Nº: 1, Grc1 los nucleótidos 702 a 706 de la Sec
ID Nº: 1 y QA-1F los nucleótidos 747 a 761 de la Sec
ID Nº: 1.
5. Una molécula de ácido nucleico que comprende
al menos un promotor mutante de alcohol oxidasa 1 (AOX1) de
Pichia pastoris de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 y al menos un ácido nucleico que codifica una
proteína (péptido) o un ácido nucleico funcional,
caracterizado por que dicho promotor y dicho ácido nucleico
están unidos operativamente entre sí formando un casete de expresión
unicopia o multicopia.
6. Un vector que comprende un promotor mutante
de alcohol oxidasa 1 (AOX1) de Pichia pastoris de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4, o una molécula de
ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5.
7. Una célula que comprende al menos un promotor
mutante de alcohol oxidasa 1 (AOX1) de Pichia pastoris de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, al menos
un fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5 o
al menos un vector de acuerdo con la reivindicación 6.
8. Una célula de acuerdo con la reivindicación
7, caracterizada por que dicha célula es una célula
eucariota, en particular una célula de levadura, preferiblemente una
célula de levadura metilotrófica, preferiblemente seleccionada del
grupo que consiste en Candida, Hansenula, Pichia y
Toruplosis, en particular una célula de Pichia
pastoris.
9. Un kit para la expresión de una proteína
seleccionada que comprende
- i)
- un vector de acuerdo con la reivindicación 6, y
- ii)
- una célula que puede expresar dicha proteína bajo el control de un promotor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Un kit de acuerdo con la reivindicación 9,
caracterizado por que dicha célula es una célula de levadura,
preferiblemente una célula de levadura metilotrófica,
preferiblemente seleccionada en el grupo que consiste de Candida,
Hansenula, Pichia y Toruplosis, en particular una célula
de Pichia pastoris.
11. Un método para la expresión de una proteína,
un péptido o un ácido nucleico funcional recombinantes en una célula
que comprende las siguientes etapas:
- -
- proporcionar una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5 o un vector de acuerdo con la reivindicación 6 que comprende un promotor de AOX1 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un ácido nucleico que codifica una proteína, un péptido o un ácido nucleico funcional, estando dicho promotor unido operativamente a dicho ácido nucleico,
- -
- transformar dicha célula con dicho vector o dicha molécula de ácido nucleico,
- -
- cultivar la célula transformada en un medio de cultivo adecuado,
- -
- opcionalmente inducir la expresión de dicha proteína, péptido o ácido nucleico funcional y
- -
- aislar dicha proteína, péptido o ácido nucleico funcional expresados.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Método de acuerdo con la reivindicación 11,
caracterizado por que dicha célula es una célula de levadura,
preferiblemente una célula de levadura metilotrófica,
preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en Candida,
Hansenula, Pichia y Toruplosis, en particular a una
célula Pichia pastoris.
13. El uso de una molécula de ácido nucleico de
acuerdo con la reivindicación 5, de un vector de acuerdo con la
reivindicación 6, o de una célula de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 7 u 8 para la expresión de una proteína, un
péptido o un ácido nucleico funcional.
14. Un método para el aislamiento de clones de
superexpresión que comprende las etapas:
- a)
- introducir una molécula de ácido nucleico que comprende al menos un promotor mutante de alcohol oxidasa 1 (AOX1) de Pichia pastoris de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y al menos un ácido nucleico que codifica una proteína (péptido) o un ácido nucleico funcional y un gen de resistencia a un marcador, en el que dicho promotor y dicho ácido nucleico están unidos operativamente entre sí formando un casete de expresión unicopia o multicopia o un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico en una célula,
- b)
- transferir la célula de la etapa a) a un medio que comprende un marcador selectivo apropiado, una fuente de carbono no represora y metanol para el crecimiento selectivo de clones de superexpresión en condiciones de inducción
- c)
- incubar la célula de la etapa b) en dicho medio,
- d)
- aislar una colonia de la célula obtenida en la etapa c) y
- e)
- detectar clones de superexpresión determinando la tasa de expresión de dicha célula.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Método de acuerdo con la reivindicación 14,
caracterizado por que el marcador selectivo es un
antibiótico, preferiblemente zeocina o geneticina.
16. Método de acuerdo con la reivindicación 14 o
15, caracterizado por que el marcador selectivo es zeocina y
el gen de resistencia al marcador es el gen sh ble.
17. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 14 al 16, caracterizado por que la célula es
una célula de levadura, preferiblemente una célula de levadura
metilotrófica, preferiblemente seleccionada del grupo que consiste
en Candida, Hansenula, Pichia y Toruplosis, en
particular una célula de Pichia pastoris.
18. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 11 al 17, caracterizado por que la fuente de
carbono no represora se selecciona del grupo que consiste en
alanina, manitol, sorbitol, trehalosa, lactosa y combinaciones de
los mismos.
19. Método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 11 al 18, caracterizado por que la molécula
ácido nucleico o el vector se introduce en la célula por
transformación, preferiblemente por electroporación o transformación
química, o por fusión de protoplastos o por bombardeo de
partículas.
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