JP2022539879A - タンパク質組成物およびその消費可能な製品 - Google Patents

タンパク質組成物およびその消費可能な製品 Download PDF

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ハーシャル クシルサガー，
アレクサンドル シャポー，
ウェスリー ラザフォード－ジェンキンス，
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フランク ダグラス アイビー，
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Abstract

増強されたタンパク質含量を有する組成物、高い溶解度を有するタンパク質、タンパク質組合せ、およびそれらの調製のための方法が、本明細書で提供される。本開示のある態様は、組換えオボムコイドタンパク質（ｒＯＶＤ）を含む組成物である。ｒＯＶＤは、少なくとも１つのグリコシル化されたアスパラギン残基を含み、ｒＯＶＤは、Ｎ－結合型マンノシル化を実質的に欠く。一部の実施形態では、各グリコシル化されたアスパラギンは、単一のＮ－アセチルグルコサミンを含み得る。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１９年７月１１日出願の米国仮特許出願第６２／８７３，１５４号および２０１９年７月１１日出願の米国仮特許出願第６２／８７３，１５９号に基づく優先権を主張する。前述の特許出願の全内容は、本明細書によって参考として本明細書中に援用される。
配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出された、その全体がこれにより参考として本明細書中に援用される配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２０年７月１０日に作成され、名称は４９１６０－７１４．６０１＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズは９５，５０４バイトである。
背景
タンパク質は、重要な食餌栄養素である。これらは、燃料供給源として、または身体が合成することのできない必須アミノ酸を含むアミノ酸の供給源として機能し得る。健康な成人についてのタンパク質の１日推奨摂取量は、人間の総カロリー必要量の１０％～３５％であり、現在、ほとんどのヒトにとって、タンパク質摂取量の大部分は、動物ベースの供給源由来である。さらに、アスリートおよびボディービルダーは、筋量を増大させ、パフォーマンスを改善するために、増加したタンパク質消費に依存し得る。世界人口の増加および世界的な食品需要における同時発生的な増加に伴い、日々の食餌、食事補給およびスポーツ栄養のためのタンパク質の有用な供給源として、タンパク質の代替的で持続可能な非動物ベースの供給源を提供することが必要とされる。
要旨
本開示のある態様は、組換えオボムコイドタンパク質（ｒＯＶＤ）を含む組成物である。ｒＯＶＤは、少なくとも１つのグリコシル化されたアスパラギン残基を含み、ｒＯＶＤは、Ｎ－結合型マンノシル化を実質的に欠く。
一部の実施形態では、各グリコシル化されたアスパラギンは、単一のＮ－アセチルグルコサミンを含む。ｒＯＶＤは、少なくとも３つのグリコシル化されたアスパラギン残基を含み得る。一部の場合には、ｒＯＶＤは、ｒＯＶＤタンパク質の分泌形態である。種々の実施形態では、組成物は、粉末である。組成物は、重量／重量ベースでおよび／または組成物の総体積当たりの重量ベースで、少なくとも３０％のｒＯＶＤタンパク質、少なくとも４０％のｒＯＶＤタンパク質、少なくとも５０％のｒＯＶＤタンパク質、少なくとも６０％のｒＯＶＤタンパク質、少なくとも７０％のｒＯＶＤタンパク質、少なくとも８０％のｒＯＶＤタンパク質、少なくとも８５％のｒＯＶＤタンパク質、少なくとも９０％のｒＯＶＤタンパク質または少なくとも９５％のｒＯＶＤタンパク質のタンパク質含量を有し得る。一部の場合には、粉末は、液体中に溶解することが可能である。
本開示の別の態様は、組換えオボムコイドタンパク質（ｒＯＶＤ）を含む組成物である。組成物は、ヒトまたは動物消費のために製剤化された粉末であり、組成物は、重量／重量ベースでおよび／または組成物の総体積当たりの重量ベースで、少なくとも７０％のｒＯＶＤタンパク質、少なくとも８０％のｒＯＶＤタンパク質、少なくとも８５％のｒＯＶＤタンパク質、少なくとも９０％のｒＯＶＤタンパク質または少なくとも９５％のｒＯＶＤタンパク質のタンパク質含量を有する。
粉末は、重量／重量ベースでおよび／または組成物の総体積当たりの重量ベースで、１５％、１２％、１０％、８％、６％、５％、３％、２％または１％未満の水分を含み得る。粉末は、３０％、２７％、２５％、２２％、２０％、１７％、１５％、１２％、１０％、８％、５％、３％または１％未満の遊離炭水化物含量を含み得る。一部の実施形態では、粉末は、液体中に溶解することが可能である。
実施形態では、組成物は、香味料、着色剤、甘味料、アミノ酸、タンパク質、酸味料、防腐剤および灰分からなる群から選択される１つまたは複数のさらなる成分を含む。一部の場合には、組成物は、５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％、０．７５％、０．５％、０．２５％または０．１％未満の灰分を含む。アミノ酸は、トリプトファン、イソロイシン、ロイシンおよびバリン、またはそれらの組合せから選択され得る。
本開示のさらに別の態様は、組換えオボムコイドタンパク質（ｒＯＶＤ）を含む組成物である。組成物は、ヒトまたは動物消費のために製剤化された固体形態であり、ｒＯＶＤは、組成物へのタンパク質栄養強化、ならびに口当たり、テクスチャー、硬度、加熱処置に対する安定性、およびｐＨに対する安定性からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる特色を提供する。
種々の実施形態では、ｒＯＶＤは、Ｎ－アセチルグルコサミンに連結された少なくとも１つのアスパラギン残基を含み、ｒＯＶＤは、Ｎ－結合型マンノシル化を実質的に欠く。ｒＯＶＤの濃度は、重量／重量ベースでおよび／または組成物の総体積当たりの重量ベースでおよび／または組成物の総体積当たりの重量ベースで、約５％、約１０％、約１５％、約２０％または約２５％よりも高くてもよい。一部の場合には、ｒＯＶＤは、ｒＯＶＤを欠如する消費可能な固体組成物と比較して、消費可能な固体組成物の目に見える外観もしくは口当たりを実質的に変更しない；ｒＯＶＤは、ｒＯＶＤと同じ濃度で乳清タンパク質、ダイズタンパク質もしくはエンドウマメタンパク質を含有する消費可能な固体組成物と比較して、消費可能な固体組成物の目に見える外観もしくは口当たりを実質的に変更しない；ｒＯＶＤは、ｒＯＶＤを欠如する消費可能な固体組成物と比較して、臭気および／もしくは味についての官能評点に実質的に影響を与えない；ならびに／またはｒＯＶＤは、ｒＯＶＤと同じ濃度で乳清タンパク質、ダイズタンパク質もしくはエンドウマメタンパク質を含有する匹敵する組成物と比較して、臭気および／もしくは味についての官能評点に実質的に影響を与えない。一部の実施形態では、消費可能な固体組成物は、スナックバー、タンパク質バー、栄養バー、エネルギーバーまたはタンパク質サプリメントである。一部の場合には、消費可能な固体組成物は、香味料、着色剤、甘味料、アミノ酸、タンパク質、酸味料、防腐剤および灰分からなる群から選択される１つまたは複数のさらなる成分を含む。
ある態様では、本開示は、組換えオボムコイドタンパク質（ｒＯＶＤ）を含む組成物を提供する。組成物は、ヒトまたは動物消費のために製剤化された液体であり、ｒＯＶＤは、組成物へのタンパク質栄養強化、ならびに溶解度、口当たり、加熱処置に対する安定性、およびｐＨに対する安定性からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる特色を提供する。
一部の場合には、組成物は、重量／重量ベースでおよび／または組成物の総体積当たりの重量ベースで、少なくとも１５％のｒＯＶＤ、少なくとも２０％のｒＯＶＤタンパク質、少なくとも３０％のｒＯＶＤタンパク質または少なくとも４０％のｒＯＶＤタンパク質を含むタンパク質含量を有する。組成物は、少なくとも５％のｒＯＶＤを含むタンパク質含量を有し得、ここで、消費可能な液体組成物は、実質的に光学的に透明である。実施形態では、組成物は、ｒＯＶＤと同じ濃度で乳清タンパク質、ダイズタンパク質もしくはエンドウマメタンパク質を含有する匹敵する組成物よりも高い光学的透明度を有する。一部の場合には、ｒＯＶＤは、ｒＯＶＤを欠如する消費可能な液体組成物と比較して、消費可能な液体組成物の目に見える外観もしくは口当たりを実質的に変更しない；ｒＯＶＤは、ｒＯＶＤと同じ濃度で乳清タンパク質、ダイズタンパク質もしくはエンドウマメタンパク質を含有する匹敵する組成物と比較して、消費可能な液体組成物の目に見える外観もしくは口当たりを実質的に変更しない；ｒＯＶＤは、ｒＯＶＤを欠如する消費可能な液体組成物と比較して、臭気および／もしくは味についての官能評点に実質的に影響を与えない；ならびに／またはｒＯＶＤは、ｒＯＶＤと同じ濃度で乳清タンパク質、ダイズタンパク質もしくはエンドウマメタンパク質を含有する匹敵する組成物と比較して、臭気および／もしくは味についての官能評点に実質的に影響を与えない。ｒＯＶＤは、消費可能な液体組成物が約７２℃と約１２１℃との間の温度まで加熱された後に、実質的に可溶性のままであり得る。一部の場合には、ｒＯＶＤは、ｒＯＶＤと同じ濃度の乳清タンパク質、ダイズタンパク質またはエンドウマメタンパク質の安定性よりも、加熱処置後に、液体において、より高い溶解度、光学的透明度、または溶解度および光学的透明度の両方を有する。一部の実施形態では、加熱処置は、約７２℃と約１２１℃との間の温度への液体の曝露を含む。ｒＯＶＤは、ｒＯＶＤと同じ濃度の乳清タンパク質、ダイズタンパク質またはエンドウマメタンパク質の溶解度よりも高い、液体における溶解度を有し得る。一部の場合には、消費可能な液体組成物は、約２．０と約８．０との間のｐＨを有する。
一部の実施形態では、ヒトもしくは動物消費のために製剤化された固体形態またはヒトもしくは動物消費のために製剤化された液体は、香味料、着色剤、甘味料、アミノ酸、タンパク質、酸味料および防腐剤からなる群から選択される１つまたは複数のさらなる成分を含み得る。種々の実施形態では、アミノ酸は、トリプトファン、イソロイシン、ロイシンおよびバリン、またはそれらの組合せから選択される。一部の場合には、タンパク質は、リゾチームタンパク質、例えば、卵白リゾチーム（ＯＶＬ）である。ｒＯＶＤのＯＶＬに対する比は、約６０％のｒＯＶＤ：４０％のＯＶＬと約８２％のｒＯＶＤ：１８％のＯＶＬとの間であり得る。リゾチームは、組換えリゾチームタンパク質であり得る。一部の場合には、タンパク質および／またはアミノ酸は、固体形態または液体に、改善されたアミノ酸バランスを提供する。実施形態では、タンパク質消化吸収率補正アミノ酸スコア（ＰＤＣＡＡＳ）は、約０．７５と等しいまたはそれよりも大きい、例えば、約０．８、０．８５、０．９０、０．９５以上、またはＰＤＣＡＡＳは、約１．０であるもしくは１．０である。消費可能な液体組成物は、ｒＯＶＤおよびＯＶＬを含み得、これらのタンパク質は可溶性であり、組成物は光学的に透明である。
一部の場合には、消費可能な液体組成物は、ジュース、ブロス、スープ、ソーダ、ソフトドリンク、フレーバー付きの水、タンパク質水、栄養強化水、炭酸水、栄養ドリンク、エナジードリンク、スポーツドリンク、回復ドリンク、加熱ドリンク、コーヒーベースのドリンク、茶ベースのドリンク、植物ベースのミルク、ミルクベースのドリンク、乳成分不使用の植物ベースのマイルドドリンク、乳児用調製粉乳ドリンク、食事代替ドリンクからなる群から選択される飲料である。一部の実施形態では、飲料は、炭酸ガス飽和を含む。
消費可能な液体組成物は、重量／重量ベースでおよび／または組成物の総体積当たりの重量ベースで、２０％のｒＯＶＤタンパク質と少なくとも６０％のｒＯＶＤタンパク質との間を含むシロップであり得る。
一部の場合には、消費可能な液体組成物は、乳濁物、例えば、ソース、グレイビーまたはサラダドレッシングである。
別の態様では、本開示は、組換えオボムコイドタンパク質（ｒＯＶＤ）を含む組成物を提供する。組成物は、ヒトまたは動物消費のために製剤化された半固体形態であり、ここで、ｒＯＶＤは、口当たり、テクスチャー、硬度、加熱処置に対する安定性、およびｐＨに対する安定性からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる特色を提供する。
種々の実施形態では、消費可能な半固体組成物は、グミ、キャンディ、ゼリー、シロップ、ゲル、ゲル化調製物である。一部の場合には、ｒＯＶＤは、ｒＯＶＤを欠如する消費可能な半固体組成物と比較して、消費可能な半固体組成物の目に見える外観もしくは口当たりを実質的に変更しない；ｒＯＶＤは、ｒＯＶＤと同じ濃度で乳清タンパク質、ダイズタンパク質もしくはエンドウマメタンパク質を含有する消費可能な半固体組成物と比較して、消費可能な半固体組成物の目に見える外観もしくは口当たりを実質的に変更しない；ｒＯＶＤは、ｒＯＶＤを欠如する消費可能な半固体組成物と比較して、臭気および／もしくは味についての官能評点に実質的に影響を与えない；ならびに／またはｒＯＶＤは、ｒＯＶＤと同じ濃度で乳清タンパク質、ダイズタンパク質もしくはエンドウマメタンパク質を含有する匹敵する組成物と比較して、臭気および／もしくは味についての官能評点に実質的に影響を与えない。消費可能な半固体組成物は、ｒＯＶＤと同じ濃度で乳清タンパク質、ダイズタンパク質またはエンドウマメタンパク質を含む匹敵する組成物よりも高い光学的透明度を有し得る。
消費可能な半固体組成物は、香味料、着色剤、甘味料、アミノ酸、タンパク質、酸味料および防腐剤からなる群から選択される１つまたは複数のさらなる成分を含み得る。タンパク質および／またはアミノ酸は、消費可能な半固体組成物に、改善されたアミノ酸バランスを提供し得る。一部の場合には、アミノ酸は、トリプトファン、イソロイシン、ロイシンおよびバリン、またはそれらの組合せから選択される。一部の実施形態では、タンパク質および／またはアミノ酸は、消費可能な半固体組成物に、改善されたアミノ酸バランスを提供する。タンパク質および／またはアミノ酸は、消費可能な半固体組成物に、改善されたアミノ酸バランスを提供する。一部の場合には、アミノ酸は、トリプトファン、イソロイシン、ロイシンおよびバリン、またはそれらの組合せから選択される。実施形態では、タンパク質は、リゾチームタンパク質である、例えば、リゾチームタンパク質は、卵白リゾチーム（ＯＶＬ）である。ｒＯＶＤのＯＶＬに対する比は、約６０％のｒＯＶＤ：４０％のＯＶＬと約８２％のｒＯＶＤ：１８％のＯＶＬとの間であり得る。リゾチームは、組換えリゾチームタンパク質であり得る。種々の実施形態では、タンパク質消化吸収率補正アミノ酸スコア（ＰＤＣＡＡＳ）は、約０．７５、０．８、０．８５、０．９０、０．９５と等しいもしくはそれよりも大きい、またはＰＤＣＡＡＳは、約１．０であるもしくは１．０である。
一部の場合には、ｒＯＶＤは、酸化剤または酸素生成剤に曝露されたｒＯＶＤを含む。種々の実施形態では、酸素生成剤は、過酸化水素、過炭酸ナトリウム、気泡型酸素、活性二酸化塩素またはオゾンである。
一部の場合には、ｒＯＶＤは、鳥類種、例えば、ニワトリ、ウズラ、シチメンチョウ、ヒメコンドル、ハチドリ、アヒル、ダチョウ、ガチョウ、カモメ、ホロホロチョウ、キジまたはエミュー、およびそれらの任意の組合せにおいて天然に見出されるアミノ酸配列を含む。
ｒＯＶＤは、配列番号１～４４のうち１つのアミノ酸配列、または配列番号１～４４のうち１つと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
実施形態では、ｒＯＶＤは、実質的に全長ｒＯＶＤアミノ酸配列である。
一部の場合には、ｒＯＶＤは、組成物へのタンパク質栄養強化を提供する。
一部の実施形態では、ｒＯＶＤは、微生物宿主細胞によって産生される、例えば、一部の場合には、微生物宿主細胞は、酵母、糸状菌または細菌である。微生物宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種またはＥ．ｃｏｌｉ種であり得る。微生物宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉであり得る。
別の態様は、組換えオボムコイドタンパク質（ｒＯＶＤ）を含む消費可能な組成物である。ｒＯＶＤは、組成物へのタンパク質栄養強化を提供する；ここで、ｒＯＶＤは、ネイティブオボムコイドタンパク質と匹敵するまたはそれよりも高い溶解度を提供する。
本開示のある態様は、組換えオボムコイドタンパク質（ｒＯＶＤ）を含む消費可能な粉末タンパク質組成物である。組成物のタンパク質含量は、７０％よりも高い；ここで、組成物は、重量／重量ベースでおよび／または組成物の総体積当たりの重量ベースで、２％未満の灰分、２０％未満の炭水化物、および１％未満の、酸加水分解による脂肪を含む。
本開示の別の態様は、組換えオボムコイドタンパク質（ｒＯＶＤ）を含む消費可能な組成物である。組成物は、重量／重量ベースでおよび／または組成物の総体積当たりの重量ベースで、少なくとも１５％のｒＯＶＤタンパク質を含むタンパク質含量を有する。
ある態様では、本開示は、組換えオボムコイドタンパク質（ｒＯＶＤ）を含む消費可能な組成物を提供する。ｒＯＶＤは、組成物へのタンパク質栄養強化を提供する；ここで、ｒＯＶＤは、ネイティブオボムコイドタンパク質よりも高い水保持能力を提供する。
本開示のさらに別の態様は、組換えオボムコイドタンパク質（ｒＯＶＤ）および少なくとも１つの消費可能な液体を含む飲料組成物であり、ここで、ｒＯＶＤは、組成物中で実質的に可溶性であり、飲料組成物は、実質的に光学的に透明であり、ｒＯＶＤの濃度は、重量／重量ベースでおよび／または組成物の総体積当たりの重量ベースで、約５％よりも高い。飲料は、ジュース、ブロス、スープ、ソーダ、ソフトドリンク、フレーバー付きの水、タンパク質水、栄養強化水、炭酸水、栄養ドリンク、エナジードリンク、スポーツドリンク、回復ドリンク、加熱ドリンク、コーヒーベースのドリンク、茶ベースのドリンク、植物ベースのミルク、ミルクベースのドリンク、乳成分不使用の植物ベースのマイルドドリンク、乳児用調製粉乳ドリンク、食事代替ドリンクからなる群から選択される。飲料は、炭酸ガス飽和を含み得る。
ある態様では、本開示は、消費可能な食品調製物を調製する方法を提供する。この方法は、以下のステップを含む：微生物宿主によって産生された組換えＯＶＤ（ｒＯＶＤ）を提供するステップであって、ｒＯＶＤが、Ｎ－結合型グリコシル化を含み、ｒＯＶＤが、Ｎ－結合型マンノシル化を実質的に欠く、ステップ；ｒＯＶＤを少なくとも１つの消費可能な成分と組み合わせるまたは混合することによって調製物を産生するステップであって、ｒＯＶＤが、組成物へのタンパク質栄養強化、ならびに溶解度、光学的透明度、口当たり、テクスチャー、硬度、加熱処置に対する安定性、およびｐＨに対する安定性からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる特色を提供する、ステップ。
種々の実施形態では、ｒＯＶＤは、１つまたは複数のグリコシル化されたアスパラギン残基を含み、ここで、各グリコシル化されたアスパラギン残基は、単一のＮ－アセチルグルコサミンを含む。一部の場合には、ｒＯＶＤは、消費可能な食品調製物中に、重量／重量ベースでおよび／または調製物の総体積当たりの重量で、１％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％もしくは４０％、または約１％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％もしくは４０％で存在する。
この方法は、調製物を加熱処置するステップ、例えば、調製物を約７２℃と約１２１℃との間の温度に曝露させるステップをさらに含み得る。加熱処置するステップは、熱間充填（ｈｏｔ ｆｉｌｌ）、低温殺菌、レトルト、煮沸、オーブン焼き（ｂａｋｉｎｇ）、直火焼き（ｂｒｏｉｌｉｎｇ）またはグリル焼き（ｇｒｉｌｌｉｎｇ）を含み得る。実施形態では、調製物は、約２と約６との間のｐＨを有する。
一部の場合には、この方法は、微生物宿主、例えば、酵母、糸状菌または細菌においてｒＯＶＤタンパク質を発現させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、微生物宿主は、ｐｉｃｈｉａ種、ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種またはＥ．ｃｏｌｉ種である。一部の場合には、微生物宿主は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉである。
一部の実施形態では、この方法は、微生物宿主において、Ｎ－結合型糖タンパク質上の高マンノースおよびハイブリッドオリゴ糖のキトビオースコア内で切断することによってグリカンを除去する活性を有する酵素を発現させるステップをさらに含む。種々の実施形態では、酵素は、ＥｎｄｏＨ、ＯＣＨ１－ＥｎｄｏＨ融合物、またはＥｎｄｏＨの活性断片を含む。
一部の場合には、ｒＯＶＤは、微生物宿主から分泌され、この方法は、ｒＯＶＤを少なくとも１つの消費可能な成分と組み合わせるまたは混合する前に、分泌されたｒＯＶＤを単離するステップをさらに含む。
この方法は、分泌されたｒＯＶＤを微生物宿主から分離するステップおよびｒＯＶＤを酸化剤または酸素生成剤、例えば、過酸化水素、過炭酸ナトリウム、活性二酸化塩素、気泡型酸素またはオゾンに曝露させるステップをさらに含み得る。
一部の場合には、この方法は、ｒＯＶＤを乾燥、粉末化および／または噴霧乾燥させるステップをさらに含む。
種々の実施形態では、調製物は、ヒト消費および／または動物消費に適切である。
本開示のある態様は、本明細書で開示される方法によって産生された消費可能な組成物である。
本開示の別の態様は、Ｎ－結合型グリコシル化を含む組換えオボムコイド（ｒＯＶＤ）タンパク質であり、ここで、Ｎ－結合型グリコシル化は、Ｎ－アセチルグルコサミンを含み、マンノース残基を実質的に欠如する。
一部の場合には、ｒＯＶＤは、Ｏ－結合型グリコシル化をさらに含む。ＯＶＤの少なくとも１つのアスパラギン残基は、グリコシル化され、単一のＮ－アセチルグルコサミン残基を有する。実施形態では、ｒＯＶＤの少なくとも３つのアスパラギン残基が、単一のＮ－アセチルグルコサミン残基を有する。ｒＯＶＤタンパク質は、酸化剤または酸素生成剤、例えば、過酸化水素、過炭酸ナトリウム、気泡型酸素、活性二酸化塩素またはオゾンに曝露されたｒＯＶＤを含み得る。
さらに別の態様は、任意の本明細書で開示される態様または実施形態に従うｒＯＶＤタンパク質を含む組成物である。
一部の実施形態では、組成物は、粉末化形態であり、組成物のタンパク質含量は、重量／重量ベースでおよび／または組成物の総体積当たりの重量ベースで、約７０％またはそれよりも高い。一部の場合には、ｒＯＶＤタンパク質は、重量／重量ベースでおよび／または組成物の総体積当たりの重量ベースで、約８０％またはそれよりも高くで組成物中に存在する。
ある態様では、本開示は、ｒＯＶＤタンパク質を作製する方法を提供する。真核生物宿主細胞においてｒＯＶＤタンパク質を産生するステップであって、ｒＯＶＤタンパク質が、宿主細胞から分泌され、宿主細胞が、Ｎ－アセチルグルコサミン連結からマンノース残基を除去する活性を有する酵素を発現する、ステップ；宿主細胞からｒＯＶＤタンパク質を分離するステップ；ｒＯＶＤタンパク質を酸化剤または酸素生成剤に曝露させるステップ；および酸化剤または酸素生成剤からｒＯＶＤを分離するステップ、を含む方法。
一部の実施形態では、酵素は、ＥｎｄｏＨ、ＯＣＨ１－ＥｎｄｏＨ融合物、またはＥｎｄｏＨの活性断片を含む。一部の場合には、酸化剤または酸素生成剤は、過酸化水素、過炭酸ナトリウム、気泡型酸素、活性二酸化塩素またはオゾンを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、酵母または真菌細胞である。
一部の場合には、宿主細胞は、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．である。
本明細書で開示される方法または組成物のいずれかでは、ｒＯＶＤは、鳥類種に由来し得る。
本明細書で開示される方法または組成物のいずれかでは、ｒＯＶＤは、ニワトリＯＶＤ、ガチョウＯＶＤタンパク質、ハチドリＯＶＤまたはヒメコンドルＯＶＤのアミノ酸配列を含み得る。
本明細書で開示される方法または組成物のいずれかでは、ｒＯＶＤは、配列番号１～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列、および配列番号１～４４と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
本開示のさらなる態様および利点は、本開示の例示的な実施形態のみが示され記載される以下の詳細な説明から当業者に容易に明らかになる。理解されるように、本開示は、他のおよび異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、全て本開示から逸脱することなしに、種々の明らかな事項において改変が可能である。図面および説明は、限定ではなく、事実上例示とみなすべきである。具体的な組成物および／または方法に関する本明細書の任意の記載が、本明細書で開示される任意の他の具体的な組成物および／または方法に適用され、そのために使用され得る。さらに、本明細書で開示される任意の組成物が、本明細書で開示される任意の方法に適応可能である。言い換えると、本明細書に記載される任意の態様または実施形態は、本明細書で開示される任意の他の態様または実施形態と組み合わされ得る。
参照による組み込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が、具体的かつ個々に参照により本明細書に組み込まれると示されるのと同程度まで、これにより参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる刊行物および特許または特許出願が、本明細書中に含まれる開示と矛盾する範囲では、本明細書が、任意のかかる矛盾する資料に優先する（ｓｕｐｅｒｓｅｄｅ）および／または優先する（ｔａｋｅ ｐｒｅｃｅｄｅｎｃｅ ｏｖｅｒ）と意図される。
本発明の新規特色は、添付の特許請求の範囲において特に示される。本発明の特色および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、および添付の図面（本明細書で「図（ｆｉｇｕｒｅ）」および「図（ＦＩＧ．）」とも）を参照して得られる。
図１Ａは、ｒＯＶＤの発現のために使用したベクター構築物を示す。
図１Ｂは、ネイティブオボムコイドおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて産生され本開示に従う組換えオボムコイドのグリコシル化パターンにおける比較を示す。エンドグリコシダーゼを含むＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの株において産生された場合の、組換えオボムコイド上の複雑な分岐鎖グリコシル化の欠如（マンノース残基の欠如を含む）が示される。
図１Ｃは、エンドグリコシダーゼ処置なしでＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって産生された組換えＯＶＤのグリコシル化パターンを示す。こうして産生されたｒＯＶＤは、複雑な分岐鎖グリコシル化パターンを有する。
図１Ｄは、ネイティブＯＶＤ、エンドグリコシダーゼで処置したネイティブＯＶＤ、および組換えＯＶＤ試料の分子量を比較する。
図２は、４．２３％ ｗ／ｖのｒＯＶＤを含むｒＯＶＤ溶液の特性を示す。
図３は、６００ｎｍにおける吸光度を使用して測定した、異なる加熱処置後の、３０％ ｗ／ｖのｒＯＶＤを含むｒＯＶＤ溶液の、約ｐＨ４および約ｐＨ６における透明度を示す。
図４は、異なる加熱処置後の、脱イオン水中に３０％ ｗ／ｖのｒＯＶＤを含むｒＯＶＤ溶液の透明度を示す。
図５Ａは、異なる加熱処置条件後の、ｐＨ２．５、４および６におけるｒＯＶＤ溶液（９％ ｗ／ｖ）の外観を示す。
図５Ｂは、異なる加熱処置条件後の、ｐＨ２．５、４および６における、６００ｎｍにおけるｒＯＶＤ溶液（９％ ｗ／ｖ）の吸光度を示すグラフである。各データ対において、左の柱のデータは、ｒＯＶＤに関し、右の柱のデータは、緩衝液に関する。
図６Ａは、異なる飲料におけるｒＯＶＤの溶解度を示す。
図６Ｂは、異なる飲料における、６００ｎｍにおけるｒＯＶＤ溶液の吸光度を示すグラフである。各データ対において、左の柱のデータは、飲料に関し、右の柱のデータは、ｒＯＶＤを含む飲料に関する。
図７は、左から右に、ｐＨ２．５、４、６における、ＯＶＬ＋ＯＶＤとＯＶＤ対照との、室温における試料の比較を示す。
図８は、左から右に、ｐＨ２．５、４、６における、ＯＶＬ＋ＯＶＤとＯＶＤ対照との、低温殺菌された（７２℃）試料の比較を示す。
図９は、左から右に、ｐＨ２．５、４、６における、ＯＶＬ＋ＯＶＤとＯＶＤ対照との、熱間充填（８５℃）試料の比較を示す。
図１０は、左から右に、ｐＨ２．５、４、６における、ＯＶＬ＋ＯＶＤとＯＶＤ対照との、レトルトされた（１２１℃）試料の比較を示す。
図１１は、左から右に、ｐＨ２．５、４、６における、ＯＶＬ対照とＯＶＤ対照との、低温殺菌された（７２℃）試料の比較を示す。
図１２は、左から右に、ｐＨ２．５、４、６における、ＯＶＬ対照とＯＶＤ対照との、熱間充填（８５℃）試料の比較を示す。
図１３は、左から右に、ｐＨ２．５、４、６における、ＯＶＬ対照とＯＶＤ対照との、レトルトされた（１２１℃）試料の比較を示す。
図１４は、左から右に、ｐＨ２．５、４、６における、室温でのおよび異なる加熱処置後の、ｒＯＶＬ＋ｒＯＶＤ試料とｒＯＶＤ試料との比較を示す。
図１５Ａおよび図１５Ｂは、ｐＨ２．５、４および６における、乳清単離物（ＷＰＩ１およびＷＰＩ３、９％ ｗ／ｖ）およびｒＯＶＤ溶液（９％ ｗ／ｖ）についての透明度の比較を示す。 図１５Ａおよび図１５Ｂは、ｐＨ２．５、４および６における、乳清単離物（ＷＰＩ１およびＷＰＩ３、９％ ｗ／ｖ）およびｒＯＶＤ溶液（９％ ｗ／ｖ）についての透明度の比較を示す。
図１６は、左から右に、乳清タンパク質単離物（中性）、乳清タンパク質単離物（酸性）、ｎＯＶＤ、ｒＯＶＤ、４％、エンドウマメタンパク質（酸性）およびダイズタンパク質を含む、５％タンパク質を含むタンパク質水試料を示す。
図１７Ａおよび図１７Ｂは、左から右に、それぞれ、１５％の乳清タンパク質、１５％のｎＯＶＤ、１５％のｒＯＶＤ、２０％のｒＯＶＤ、３０％のｒＯＶＤまたは（タンパク質なし）対照を含む、オレンジジュースの試料を示す。図１７Ａ：時間０時間における溶液、図１７Ｂ：４℃で４８時間の貯蔵後。
図１８Ａは、左から右に、対照（タンパク質補給なし）、２０％のｒＯＶＤを補給した、２０％のｎＯＶＤを補給した、および２０％の乳清タンパク質を補給したゼリー試料を示す。
図１８Ｂは、タンパク質なしの（対照）、２０％のｒＯＶＤを補給した、および２０％の乳清タンパク質を補給したゼリー試料の比較を示す。
図１８Ｃ～図１８Ｅは、２０％の乳清タンパク質を補給した、１６％のゼラチンを補給した、および２０％のゼラチンを補給したゼリー試料を示す。
図１９Ａおよび図１９Ｂは、種々の濃度で水中に可溶化したｒＯＶＤ－ＨおよびｒＯＶＤ－Ｔ試料を示す。
図２０は、ｒＯＶＤ試料、ニワトリ卵白由来のネイティブオボムコイド（ｎＯＶＤ）および脱グリコシル化されたネイティブオボムコイド（ｎＯＶＤ＋ＰＮＧアーゼＦ）に対する免疫反応性における比較を示す。
図２１は、過酸化水素処置なし（左）およびあり（右）のｒＯＶＤ溶液の色を示す。
図２２は、種々のタンパク質試料を使用した塗膜形成の比較を示す。
詳細な説明
本発明の種々の実施形態が本明細書に示され記載されているが、かかる実施形態が例としてのみ提供されていることは、当業者に明らかである。多数の変形形態、変化および置換が、本発明から逸脱することなしに、当業者に想起され得る。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する種々の代替法が用いられ得ることを理解すべきである。
例えば、日々の食餌、食事補給、消費者用食品および飲料、ならびに栄養のための、ヒトを含む動物による摂取のための消費可能なタンパク質の有用な供給源としてのタンパク質の非動物ベースの供給源のための組成物およびかかる組成物を作製する方法が、本明細書で提供される。
オボムコイド（ＯＶＤ）を含む消費可能な組成物が、本明細書で提供される。かかる消費可能な組成物は、食品製品、ドリンク製品、栄養補給食品、医薬品、化粧品において、または最終製品のための成分として、使用され得る。本明細書の実施形態では、消費可能な組成物は、液体形態または半固体形態である。本明細書の実施形態では、消費可能な組成物は、粉末化形態で提供される；この粉末は、消費可能な液体、固体または半固体組成物を産生するために使用され得る。好ましくは、かかる消費可能な組成物中のＯＶＤは、組換え作製され、本明細書で組換えＯＶＤ（ｒＯＶＤ）と呼ばれ得る。
他に示されない限り、ＯＶＤという用語には、ネイティブＯＶＤ（ｎＯＶＤ）およびｒＯＶＤの両方が含まれる。本明細書の消費可能な組成物中のｎＯＶＤまたはｒＯＶＤは、消費可能な組成物のタンパク質含量を増加させ、かつ１つまたは複数のさらなる特徴、例えば、高い透明度、高い溶解度、低減された濁度または実質的な官能中立性を維持する濃度で提供される。
本明細書の消費可能な組成物のいずれかにおけるｒＯＶＤの使用は、さらなる特色、例えば、溶解度、透明度、硬度、テクスチャー、口当たり、加熱処置との適合性、ｐＨ範囲との適合性を提供し、消費者が好む官能プロファイルを維持しながら、タンパク質の非動物ベースの供給源を可能にする。かかる組成物、それを作製する方法およびそれを使用する方法の種々の実施形態が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、本明細書の組成物およびかかる組成物を作製するための方法は、消費品のタンパク質含量を増加させ、また、さらなる特色、例えば、他の成分との適合性（例えば、グルテン、ビタミン、ミネラルおよび炭酸ガス飽和との適合性など）、着色、匂い、味、ならびに食品および飲料の調製および／または貯蔵条件との適合性を提供する。
ニワトリまたは他の鳥類卵から単離されたものなどのネイティブオボムコイド（ｎＯＶＤ）は、高度に複雑な分岐鎖形態のグリコシル化を有する。グリコシル化パターンは、Ｎ－結合型グリカン構造、例えば、Ｎ－アセチルグルコサミン単位およびＮ－結合型マンノース単位を含む。例えば、図１Ｂ（左側の列）を参照のこと。一部の場合には、本明細書で開示される消費可能な組成物における使用のための、本明細書に記載される方法を使用して産生されるｒＯＶＤは、ｎＯＶＤのグリコシル化パターンとは異なるグリコシル化パターンを有する。例えば、ｒＯＶＤがＰｉｃｈｉａ ｓｐ．において産生される場合、このタンパク質は、高度にグリコシル化され得る。図１Ｃは、複雑な分岐鎖グリコシル化パターンを示す、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって産生されたｒＯＶＤのグリコシル化パターンを示す。本明細書の組成物および方法の一部の実施形態では、ｒＯＶＤは、グリコシル化パターンがｎＯＶＤのグリコシル化パターンから改変され、かかる処置なしでＰｉｃｈｉａ ｓｐ．によって産生されたｒＯＶＤと比較しても改変されるように、処置される。一部の場合には、ｒＯＶＤは、グリコシル化を有さない。他の場合には、ｒＯＶＤは、低減されたグリコシル化を有する。一部の場合には、ｒＯＶＤは、タンパク質の１つまたは複数のアスパラギン残基においてＮ－アセチルグルコサミンによって改変され、Ｎ－結合型マンノシル化を欠如するまたはＮ－結合型マンノシル化を実質的に欠く。例えば、図１Ｂ（右側の列）を参照のこと。本明細書に記載されるグリコシル化における変化は、他の形態のタンパク質、例えば、乳清タンパク質、ダイズタンパク質、エンドウマメタンパク質およびｎＯＶＤと比較して、ｒＯＶＤの溶解度および透明度における増加をもたらし得る。ｒＯＶＤのグリコシル化における改変は、マンノース残基を低減させるまたはその実質的に全てを除去するような、タンパク質の窒素の炭素に対する比における変化をもたらし得、窒素の炭素に対する比は、（例えば、ｎＯＶＤ、またはグリコシル化パターンへの改変なしに産生されたｒＯＶＤと比較して）増加される。
一部の実施形態では、組成物は、消費可能な食品製品である。一部の実施形態では、消費可能な食品製品は、完成製品である。一部の実施形態では、組成物は、完成製品、例えば、ｒＯＶＤを含むまたはｒＯＶＤから本質的になる粉末の成分である。
本明細書で使用される場合、用語「消費可能な食品組成物」は、単離されたタンパク質を含み、ヒトおよび他の哺乳動物が含まれるがこれらに限定されない動物によって消費され得る組成物を指す。消費可能な食品組成物には、非限定的な例として、食品製品、飲料製品、栄養補助食品、食品添加物および栄養補給食品が含まれる。
消費可能な食品組成物には、食品もしくは飲料の成分として、または動物の食餌の一部として摂取される製品としての組成物も含まれる。
本開示のｒＯＶＤは動物供給源からは得られないので、ｒＯＶＤを含む消費可能な組成物は、ベジタリアンおよび／またはビーガンとみなされる。
本明細書で使用される場合、「完成製品」は、動物消費のための食品もしくは飲料に向けた、または動物消費のための食品もしくは飲料としてそれ自体適切な、消費可能な食品組成物を指す。本明細書で使用される場合、消費可能な食品組成物に関して、「成分」または「構成成分」は、完成製品を創出するために他の成分（複数可）または構成成分（複数可）と共に使用される組成物を指す。
ｒＯＶＤを含む組成物
組換えオボムコイドタンパク質（ｒＯＶＤ）の添加を介して消費可能な食品組成物のタンパク質含量を増加させる、消費可能な食品組成物およびかかる組成物を作製する方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、ｒＯＶＤは、例えば、添加された栄養として、タンパク質含量を増加させるために、消費可能な食品組成物に添加される。一部の実施形態では、ｒＯＶＤは、組成物の総重量当たりの重量（ｗ／ｗ）および／または総体積当たりの重量（ｗ／ｖ）ベースで、約１％と約４０％との間で、消費可能な食品組成物中に存在する。例えば、１００ｍｌの組成物中、ｒＯＶＤは、３０ｇで存在し、したがって、ｒＯＶＤは、３０％の濃度である。一部の実施形態では、ｒＯＶＤの濃度は、組成物のｗ／ｗおよび／またはｗ／ｖベースで、１％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％もしくは４０％、または約１％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％もしくは４０％である。一部の実施形態では、ｒＯＶＤは、１～５％、５～１０％、１０～１５％、１５～２０％、２０～２５％、２５～３０％の、もしくは約１～５％、５～１０％、１０～１５％、１５～２０％、２０～２５％、２５～３０％の濃度で存在し、またはｒＯＶＤは、５％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％もしくは４０％ ｗ／ｗおよび／もしくはｗ／ｖよりも高い濃度で存在する。
消費可能な製品は、１つまたは複数の他のタンパク質、例えば、非ＯＶＤタンパク質または非組換えタンパク質を含み得る。ｒＯＶＤは、消費可能な製品中のタンパク質含量の量を増加させ得、および／または１つもしくは複数の他のタンパク質の溶解度も増加させ得る。例えば、消費可能な組成物は、乳清タンパク質、エンドウマメタンパク質、ダイズタンパク質、アーモンドタンパク質、オート麦タンパク質、亜麻種子タンパク質、野菜タンパク質または卵白タンパク質を含み得る。一部の場合には、１つまたは複数の他のタンパク質は、鳥類または爬虫類において天然に見出されるアミノ酸配列を有するＯＶＤを含み得る。
一部の実施形態では、組成物およびかかる組成物を作製するための方法は、タンパク質含量を増加させ、組成物におけるタンパク質の溶解度を提供するだけでなく、組成物の透明度を維持するまたは実質的には低減させない。一部の実施形態では、組成物およびかかる組成物を作製するための方法は、組成物の安定性にも１つまたは複数の官能品質にも有害には影響を与えずに、タンパク質含量を増加させ、溶解度を提供し、透明度を維持する。
一部の実施形態では、消費可能な食品組成物およびかかる消費可能な食品組成物を作製するための方法は、ｒＯＶＤを含み、ｒＯＶＤは、消費可能な食品組成物のタンパク質含量を増加させ、ｒＯＶＤは、消費可能な食品組成物中で実質的に可溶性である。消費可能な食品組成物は、完成製品、または完成製品、例えば、粉末化されたｒＯＶＤ組成物を作製するための成分であり得る。
ｒＯＶＤタンパク質は、組成物を形成するために、それ自体で、または他の構成成分と組み合わせて使用され得る。一部の実施形態では、組成物は、総重量当たりの重量（ｗ／ｗ）および／または総体積当たりの重量（ｗ／ｖ）で、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の、または少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％のタンパク質、例えば、ｒＯＶＤを含有し得る。一部の場合には、本明細書に記載される組成物は、ｗ／ｗまたはｗ／ｖで、最大で約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のタンパク質、例えば、ｒＯＶＤを含有し得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、１００ｍＬの液体（例えば、水）当たり、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１３．２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０もしくは７５ｇの、または少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１３．２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０もしくは７５ｇの総タンパク質の濃度の総タンパク質を含有する。一部の場合には、本明細書に記載される組成物は、１００ｇの組成物（例えば、粉末）当たり、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１３．２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００ｇの、または少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１３．２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００ｇの総タンパク質の濃度の総タンパク質を含有する。
一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、１００ｍＬの液体（例えば、水）当たり、約０．１、０．２、０．３、０．５、０．７、１．０、１．２、１．５、１．７、２．０、２．２、２．５、２．７、３．０、３．２、３．５、３．７、４．０、４．２、４．５、４．７もしくは５ｇの、または少なくとも０．１、０．２、０．３、０．５、０．７、１．０、１．２、１．５、１．７、２．０、２．２、２．５、２．７、３．０、３．２、３．５、３．７、４．０、４．２、４．５、４．７もしくは５ｇの総タンパク質の濃度の総タンパク質を含有する。一部の場合には、本明細書に記載される組成物は、１００ｇの組成物（例えば、粉末）当たり、約０．１、０．２、０．３、０．５、０．７、１．０、１．２、１．５、１．７、２．０、２．２、２．５、２．７、３．０、３．２、３．５、３．７、４．０、４．２、４．５、４．７もしくは５ｇの、または少なくとも０．１、０．２、０．３、０．５、０．７、１．０、１．２、１．５、１．７、２．０、２．２、２．５、２．７、３．０、３．２、３．５、３．７、４．０、４．２、４．５、４．７もしくは５ｇの総タンパク質の濃度の総タンパク質を含有する。
一部の実施形態では、消費可能なｒＯＶＤ組成物は、液体組成物である。かかる場合には、液体組成物中のｒＯＶＤの濃度は、０．１％～４０％の間であり得る。液体組成物中のｒＯＶＤの濃度は、少なくとも０．１％であり得る。液体組成物中のｒＯＶＤの濃度は、多くても４０％であり得る。液体組成物中のｒＯＶＤの濃度は、総体積当たりの重量（ｗ／ｖ）で、０．１％～１％、０．１％～５％、０．１％～１０％、０．１％～１５％、０．１％～２０％、０．１％～２５％、０．１％～３０％、０．１％～３５％、０．１％～４０％、１％～５％、１％～１０％、１％～１５％、１％～２０％、１％～２５％、１％～３０％、１％～３５％、１％～４０％、５％～１０％、５％～１５％、５％～２０％、５％～２５％、５％～３０％、５％～３５％、５％～４０％、１０％～１５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～３０％、１０％～３５％、１０％～４０％、１５％～２０％、１５％～２５％、１５％～３０％、１５％～３５％、１５％～４０％、２０％～２５％、２０％～３０％、２０％～３５％、２０％～４０％、２５％～３０％、２５％～３５％、２５％～４０％、３０％～３５％、３０％～４０％または３５％～４０％であり得る。液体組成物中のｒＯＶＤの濃度は、約０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％または４０％ ｗ／ｖであり得る。液体組成物中のｒＯＶＤの濃度は、少なくとも０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％または３５％ ｗ／ｖであり得る。液体組成物中のｒＯＶＤの濃度は、多くても１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％または４０％ ｗ／ｖであり得る。
一部の実施形態では、消費可能なｒＯＶＤ組成物は、固体組成物である。かかる場合には、固体組成物中のｒＯＶＤの濃度は、０．１％～７０％の間であり得る。固体組成物中のｒＯＶＤの濃度は、少なくとも０．１％であり得る。固体組成物中のｒＯＶＤの濃度は、多くても７０％であり得る。固体組成物中のｒＯＶＤの濃度は、総重量当たりの重量（ｗ／ｗ）および／または総体積当たりの重量（ｗ／ｖ）で、０．１％～１％、０．１％～１０％、０．１％～２０％、０．１％～３０％、０．１％～４０％、０．１％～５０％、０．１％～６０％、０．１％～７０％、１％～１０％、１％～２０％、１％～３０％、１％～４０％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１０％～２０％、１０％～３０％、１０％～４０％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、２０％～３０％、２０％～４０％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、３０％～４０％、３０％～５０％、３０％～６０％、３０％～７０％、４０％～５０％、４０％～６０％、４０％～７０％、５０％～６０％、５０％～７０％または６０％～７０％であり得る。固体組成物中のｒＯＶＤの濃度は、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％または７０％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖであり得る。固体組成物中のｒＯＶＤの濃度は、少なくとも０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または６０％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖであり得る。固体組成物中のｒＯＶＤの濃度は、多くても１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％または７０％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖであり得る。
一部の実施形態では、消費可能なｒＯＶＤ組成物は、粉末化された組成物である。かかる場合には、粉末組成物中のｒＯＶＤの濃度は、総重量当たりの重量（ｗ／ｗ）および／または総体積当たりの重量（ｗ／ｖ）で、１５％～９９％の間であり得る。粉末組成物中のｒＯＶＤの濃度は、少なくとも１５％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖであり得る。実施形態では、粉末組成物中のｒＯＶＤの濃度は、多くても９９％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖであり得る。粉末組成物中のｒＯＶＤの濃度は、１５％～３０％、１５％～４５％、１５％～６０％、１５％～７５％、１５％～８０％、１５％～８５％、１５％～９０％、１５％～９５％、１５％～９９％、３０％～４５％、３０％～６０％、３０％～７５％、３０％～８０％、３０％～８５％、３０％～９０％、３０％～９５％、３０％～９９％、４５％～６０％、４５％～７５％、４５％～８０％、４５％～８５％、４５％～９０％、４５％～９５％、４５％～９９％、６０％～７５％、６０％～８０％、６０％～８５％、６０％～９０％、６０％～９５％、６０％～９９％、７５％～８０％、７５％～８５％、７５％～９０％、７５％～９５％、７５％～９９％、８０％～８５％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～９９％、８５％～９０％、８５％～９５％、８５％～９９％、９０％～９５％、９０％～９９％または９５％～９９％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖであり得る。粉末組成物中のｒＯＶＤの濃度は、約１５％、３０％、４５％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖであり得る。粉末組成物中のｒＯＶＤの濃度は、少なくとも１５％、３０％、４５％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖであり得る。粉末組成物中のｒＯＶＤの濃度は、多くても３０％、４５％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖであり得る。
一部の実施形態では、消費可能なｒＯＶＤ組成物は、濃縮シロップ組成物である。かかる場合には、シロップ組成物中のｒＯＶＤの濃度は、総重量当たりの重量（ｗ／ｗ）および／または総体積当たりの重量（ｗ／ｖ）で、１０％～６０％の間であり得る。シロップ中のｒＯＶＤの濃度は、少なくとも１０％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖであり得る。シロップ中のｒＯＶＤの濃度は、多くても６０％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖであり得る。シロップ中のｒＯＶＤの濃度は、１０％～２０％、１０％～３０％、１０％～４０％、１０％～５０％、１０％～６０％、２０％～３０％、２０％～４０％、２０％～５０％、２０％～６０％、３０％～４０％、３０％～５０％、３０％～６０％、４０％～５０％、４０％～６０％または５０％～６０％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖであり得る。シロップ中のｒＯＶＤの濃度は、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または６０％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖであり得る。シロップ中のｒＯＶＤの濃度は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または５０％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖであり得る。シロップ中のｒＯＶＤの濃度は、多くても２０％、３０％、４０％、５０％または６０％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖであり得る。シロップは、任意の溶媒、例えば、水およびジュースを含み得る。
溶解度および透明度
特に、ＯＶＤタンパク質が組成物中で可溶性のままである、ＯＶＤの組成物が、本明細書で提供される。本明細書に記載される任意の組成物の一部の実施形態では、タンパク質は、１００ｍＬの溶液当たり、最も低い量のｒＯＶＤ（例えば、０．１ｇまたはそれ未満）と、約３０または４０グラムまでであり約３０または４０グラムを含むｒＯＶＤタンパク質の増分量との間のタンパク質濃度で、完全に可溶性である。本明細書に記載される任意の組成物の一部の実施形態では、タンパク質は、例えば、水などの液体中で製剤化される場合、１００ｍＬの体積当たり、約１、２、５、７、１０、１２または１５ｇの総ＯＶＤタンパク質の濃度で、完全に可溶性である。本明細書に記載される任意の組成物の一部の実施形態では、タンパク質は、例えば、水などの液体中で製剤化される場合、１００ｍＬの体積当たり、約１５、約２０、約２５、約３０または約４０ｇの総ＯＶＤタンパク質の濃度で、完全に可溶性である。本明細書の組成物では、ＯＶＤは、ネイティブＯＶＤまたは組換えＯＶＤであり得る。一部の実施形態では、ＯＶＤは、単離された組換えタンパク質である。一部の実施形態では、ＯＶＤは、例えば、Ｎ－アセチルグルコサミンによって改変された１つまたは複数のアスパラギン残基を有し、Ｎ－結合型マンノシル化を実質的に欠く、改変されたグリコシル化を有するｒＯＶＤである。
ｒＯＶＤの溶解度は、視覚的検出が含まれる、６００ｎｍの波長における溶液の吸光度（ＯＤ６００）を測定する種々の技法によって、測定され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載される可溶化されたタンパク質組成物は、６００ｎｍの波長を使用して測定した場合、１未満（＜１）の吸光度を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載される可溶化されたｒＯＶＤ組成物は、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％よりも高い、６００ｎｍにおける観察された測定された透過率を有する。一部の実施形態では、組成物へのｒＯＶＤの添加は、ｒＯＶＤなしの組成物と比較して、ＯＤ６００測定値を変化させないまたは僅かにしか変化させない。
一部の実施形態では、組成物へのｒＯＶＤの添加は、ｒＯＶＤなしの組成物と比較して、ＯＤ６００測定値を増加させ得、この増加は、同じ量で組成物に添加される別のタンパク質、例えば、乳清タンパク質またはネイティブＯＶＤの添加で見られるものよりも小さい。
一部の実施形態では、組成物へのｒＯＶＤの添加は、同じタンパク質濃度で、等価な条件（例えば、ｐＨおよび温度処置）下で比較した場合、乳清タンパク質またはネイティブＯＶＤよりも良好な溶解度を有する。一部の実施形態では、組成物へのｒＯＶＤの添加は、同じタンパク質濃度で比較した場合、乳清タンパク質またはネイティブＯＶＤよりも良好な溶解度を有し、この組成物は、消費可能な食品組成物、例えば、成分または完成製品である。
「透明な」または「透明度」は、本明細書で使用される場合、濁度の欠如を指す。透明度は、タンパク質が含まれない溶液との比較によるものを含む視覚的観察によって、評価され得る。かかる比較は、機械によって、個人によって、または試験者、例えば、透明度の検出の技術分野において訓練された試験者のパネルによって、行われ得る。溶液の透明度は、（少なくとも３、５、７、１０または１２人の個人）またはかかる試験に熟練した人々のパネルによって試験され得る。好ましくは、試験者の少なくとも過半数は、タンパク質を含まない、または同じ濃度で異なるタンパク質を含む溶液から、ｒＯＶＤ組成物を目に見えて識別することができない場合がある。
一部の実施形態では、ｒＯＶＤ組成物は、等価な濃度で異なるタンパク質を有する他の組成を有する組成物、例えば、エンドウマメタンパク質、乳清単離物もしくは乳清タンパク質、ネイティブ卵白タンパク質（例えば、ｎＯＶＤ）または全卵白を含有する組成物と比較して、改善された透明度を示す。一部の実施形態では、試験者の少なくとも過半数またはそれよりも多くは、タンパク質を含まない溶液から、組成物に添加されたｒＯＶＤを目に見えて識別することができない場合がある。
透明な溶液は、着色されても無色であってもよい。一部の実施形態では、組成物中の可溶化されたｒＯＶＤタンパク質は、３５０ｎｍと８５０ｎｍとの間の波長において０．１５未満の吸光度によって測定される、色の欠如を有し得る。一部の実施形態では、組成物中の可溶化されたｒＯＶＤタンパク質は、消費可能な食品組成物に、色、例えば、黄色、緑色もしくは褐色、またはそれらの色調を提供し得る。一部の場合には、ｒＯＶＤおよび／または可溶化されたｒＯＶＤタンパク質は、溶液の色を、より明るいまたはあまり強くない色へと改変するために、酸化剤または酸素生成剤で処置され得る。
一部の実施形態では、溶液中、例えば、消費可能な液体食品組成物中のｒＯＶＤの組成物は、１００ｍＬの溶液当たり、最も低い量のｒＯＶＤ（例えば、０．１ｇ）と、約３０グラムまでであり約３０グラムを含むｒＯＶＤタンパク質の増分量との間のタンパク質濃度で、本質的に透明である。一部の実施形態では、溶液中、例えば、消費可能な液体食品組成物中のｒＯＶＤの組成物は、１００ｍＬの溶液当たり、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０グラムのｒＯＶＤタンパク質の高いタンパク質濃度で、本質的に透明である。一部の実施形態では、ｒＯＶＤ組成物は、１００ｍＬの溶液（例えば、１００ｍＬの水中など）当たり、少なくとも約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ｇの総ｒＯＶＤタンパク質で、本質的に透明である。
一部の実施形態では、ｒＯＶＤ組成物は、同じタンパク質濃度で、等価な条件（例えば、ｐＨおよび温度）下で比較した場合、乳清タンパク質、例えば、乳清タンパク質単離物または乳清タンパク質濃縮物よりも良好な透明度を有する。一部の実施形態では、ｒＯＶＤ組成物は、同じタンパク質濃度で比較した場合、乳清タンパク質よりも良好な透明度を有し、ｒＯＶＤ組成物は、完成製品などの消費可能な食品組成物の構成成分、または完成製品中の成分としての構成成分である。
一部の実施形態では、ｒＯＶＤ組成物は、同じタンパク質濃度で、等価な条件（例えば、ｐＨおよび温度）下で比較した場合、ネイティブＯＶＤ（ｎＯＶＤ）よりも良好な透明度を有する。一部の実施形態では、ｒＯＶＤ組成物は、同じタンパク質濃度で比較した場合、ｎＯＶＤ組成物よりも良好な透明度を有し、ｒＯＶＤ組成物は、完成製品などの消費可能な食品組成物の構成成分、または完成製品中の成分としての構成成分である。
本明細書の一部の実施形態では、ｒＯＶＤの組成物は、実質的な溶解度を有し、かつ１００ｍＬの溶液（例えば、１００ｍＬの水中など）当たり、少なくとも約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ｇ、または３０ｇよりも多くの総ｒＯＶＤタンパク質の濃度で、実質的に透明である。
一部の場合には、ｒＯＶＤは、組成物が、５０℃、６０℃、もしくは７０℃よりも高い温度、または約７０℃と約１２０℃との間の温度まで加熱される場合、さらには、ｒＯＶＤが、ｗ／ｖベースで少なくとも２％、４％、１０％、２０、３０％、４０％または５０％の濃度である場合、消費可能な組成物中で、可溶性かつ透明なままである。
一例では、本明細書の消費可能な組成物の透明度は、例えば、６００ｎｍの波長における溶液の吸光度（ＯＤ６００）を測定することによって、可視光の吸光度を使用して決定される。好ましくは、本明細書の消費可能な液体または半液体組成物は、６００ｎｍにおいて可視光を使用して決定した場合、１．２、１．１、１、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５または０．０４未満の吸光度を有する。溶解度を測定するための他の方法は、遠心分離濃縮と、その後のタンパク質濃度アッセイ、例えば、クマシープラス（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ）（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）とによって、溶解度を検査することを含む。
一部の例では、消費可能な組成物の透明度は、ｒＯＶＤの添加前の溶液の透明度と実質的に異ならない透明度である。例えば、溶液（消費可能な組成物）へのｒＯＶＤの添加は、ｒＯＶＤなしの組成物と比較して、ＯＤ６００測定値を変化させないまたは実質的に変化させない（０．０３、０．０２、０．０１未満の変化）。
したがって、ｒＯＶＤを含む消費可能な組成物は、総重量当たりの重量（ｗ／ｗ）および／または総体積当たりの重量（ｗ／ｖ）で、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％もしくは３０％の、または約１０％、１５％、２０％、２５％もしくは３０％のｒＯＶＤのｒＯＶＤの濃度で、室温でＯＤ６００において測定した場合、２未満の透明度を有し得る。あるいは、１０％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖよりも高い濃度でｒＯＶＤを含む溶液は、室温でＯＤ６００において測定した場合、２、１．８、１．６、１．４、１．２、１、０．８、０．６、０．４、０．２、０．１、０．０８、０．０６、０．０４または０．０２未満の透明度を有し得る。実質的に光学的に透明な溶液は、ＯＤ６００測定値が約０．１未満またはそれと等しい溶液を指し得る。一部の場合には、実質的に光学的に透明な溶液は、０．０８、０．０６、０．０５または０．０２未満のＯＤ６００測定値を有する。
一部の実施形態では、ｒＯＶＤの添加は、ｒＯＶＤの導入前の溶液と比較して、溶液の透明度を１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖよりも大きく低減させることも、溶液の濁度を１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖよりも大きく増加させることもなしに、総重量当たりの重量（ｗ／ｗ）および／または総体積当たりの重量（ｗ／ｖ）で、タンパク質濃度を少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％増加させる。
一部の実施形態では、ｒＯＶＤタンパク質は、組成物の溶解度、または溶解度および透明度特性をなおも維持しつつ、食用製品において使用される他のタンパク質供給源、例えば、乳清タンパク質（例えば、乳清タンパク質単離物（ＷＰＩ）および乳清タンパク質濃縮物（ＷＰＣ））、エンドウマメタンパク質、ダイズタンパク質、全卵または卵白タンパク質（例えば、ネイティブＯＶＤ）の全ての実施形態が添加され得る量よりも大きい量（例えば、消費可能な食品組成物の総重量または体積によるパーセンテージ）で添加され得る。
官能中立性および改善された官能訴求力
一部の実施形態では、増加したタンパク質栄養含量に加えて、消費可能な食品組成物へのｒＯＶＤの添加は、かかる組成物中の他のタンパク質と比較して、官能中立性または改善された官能訴求力を提供する。本明細書で使用される場合、「官能中立性」は、強いまたは独特な味、臭気（匂い）、または味および匂いの組合せ、ならびにテクスチャー、口当たり、後味および色の非存在を指す。Kemp et al. 2009に記載されるものなどの官能パネルが、訓練された分析者のパネルによって使用され得る。官能中立性は、ｒＯＶＤを含有する消費可能な食品組成物を、同じ濃度で異なるタンパク質、例えば、乳清タンパク質、エンドウマメタンパク質、ダイズタンパク質、全卵または卵白タンパク質を有する別の同様の組成物と比較した場合、味見人、例えば、食品の試験者、または消費者に、改善された官能訴求力を提供し得る。
一部の実施形態では、ｒＯＶＤは、消費可能な食品組成物に添加される場合、ｒＯＶＤ含有溶液と等しい濃度で存在する異なるタンパク質構成成分を有する異なる溶液と比較して、例えば、乳清、ダイズ、コラーゲン、エンドウマメ、卵白固体単離物および／またはネイティブＯＶＤと比較して、訓練された官能パネルによって測定された場合など、実質的に無臭である。本明細書に記載されるｒＯＶＤ組成物の一部の実施形態では、かかる組成物は、総重量当たりの重量（ｗ／ｗ）および／もしくは総体積当たりの重量（ｗ／ｖ）で、約５～１０％、１０～１５％、１５～２０％、２０～２５％、２５～３０％の間の、もしくは３０％よりも高いｒＯＶＤのタンパク質濃度で、または１００ｍＬの溶液当たり（例えば、１００ｍＬの水当たり）、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ｇの、もしくは３０ｇよりも多くの総ｒＯＶＤタンパク質のタンパク質濃度で、本質的に無臭である。
一部の実施形態では、消費可能な食品組成物へのｒＯＶＤの添加は、増加したタンパク質栄養含量、溶解度、透明度および／または無臭などの特徴に加えて、中庸の味もまた提供する。中庸の味は、ｒＯＶＤと等しい濃度で存在する異なるタンパク質、例えば、乳清、ダイズ、コラーゲン、エンドウマメ、全卵および卵白固体単離物（ネイティブＯＶＤを含む）を含有する溶液と比較して、例えば、訓練された官能パネルによって測定され得る。
一部の実施形態では、ｒＯＶＤの添加は、補給に使用される別のタンパク質に関連するある特定の臭気および／または味における低減を提供する。例えば、ｒＯＶＤの添加は、消費可能な食品組成物への全卵、分割された（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ）卵または卵白の添加と比較して、「卵様」の臭気または味をそれほど有さない。一部の実施形態では、ｒＯＶＤの添加は、他のタンパク質供給源と比較して、金属性の臭気または味をそれほど有さない。
一部の実施形態では、ｒＯＶＤの添加は、他のタンパク質供給源の添加と比較して、改善された口当たりを有する。例えば、ｒＯＶＤの添加は、他のタンパク質供給源と比較して、あまり粒々でなく、または沈殿物もしくは固体をあまり有さない。
一部の実施形態では、ｒＯＶＤの添加は、例えば、他の入手可能な補足的タンパク質供給源と比較して、改善されたテクスチャーを有する。
一部の実施形態では、ｒＯＶＤの添加は、他の入手可能な補足的タンパク質供給源と比較して、改善されたもしくは訴求力のある色または視覚的訴求力を有する。例えば、ｒＯＶＤの添加は、液体（例えば、炭酸ドリンク、タンパク質水、スポーツドリンク）の透明度を維持し得、消費者に視覚的訴求力を提供する。
ｒＯＶＤを含む消費可能な組成物はまた、ｒＯＶＤを含まない組成物またはｒＯＶＤと等しい濃度で存在する異なるタンパク質を含む組成物と比較して、改善された官能訴求力を有し得る。かかる改善された官能訴求力は、味および／または匂いに関し得る。味および匂いは、例えば、訓練された官能パネルによって測定され得る。一部の例では、官能パネルは、ｒＯＶＤを含む消費可能な組成物を、ｒＯＶＤを含まない消費可能な組成物または等価な量で異なるタンパク質を含む消費可能な組成物と比較する。
本明細書に記載されるように、本明細書の消費可能な組成物は、液体形態であり得る。液体形態は、可溶性ｒＯＶＤ溶液などの中間製品であり得る。一部の場合には、液体形態は、ｒＯＶＤを含む飲料などの最終製品であり得る。本明細書で企図される異なる型の飲料の例としては、ジュース、ソーダ、ソフトドリンク、フレーバー付きの水、タンパク質水、栄養強化水、炭酸水、栄養ドリンク、エナジードリンク、スポーツドリンク、回復ドリンク、加熱ドリンク、コーヒーベースのドリンク、茶ベースのドリンク、植物ベースのミルク、ミルクベースのドリンク、乳成分不使用の植物ベースのマイルドドリンク、乳児用調製粉乳ドリンクおよび食事代替ドリンクが挙げられる。
ジュースドリンクの非限定的な例としては、Ｏｄｗａｌｌａ（登録商標）、Ｎａｋｅｄ（登録商標）およびＭｉｎｕｔｅＭａｉｄ（登録商標）が挙げられる。
ソーダドリンクの非限定的な例としては、Ｃｏｃａ－Ｃｏｌａ（登録商標）、Ｐｅｐｓｉ（登録商標）、Ｓｐｒｉｔｅ（登録商標）および７Ｕｐ（登録商標）が挙げられる。
回復ドリンクの非限定的な例としては、Ｇａｔｏｒａｄｅ（商標）、Ｐｅｄｉａｌｙｔｅ（登録商標）、Ｐｏｗｅｒａｄｅ（登録商標）およびＰｒｏｐｅｌ（登録商標）が挙げられる。
エナジードリンクの非限定的な例としては、Ｒｅｄ Ｂｕｌｌ（商標）、Ｍｏｎｓｔｅｒ（商標）、Ｆｕｌｌ Ｔｈｒｏｔｔｌｅ（登録商標）、ＡＭＰ（登録商標）、Ｒｏｃｋｓｔａｒ（登録商標）、Ｂａｎｇ（商標）、Ｒｅｉｇｎ（商標）、ＮＯＳ（登録商標）、Ｖｅｎｏｍ（登録商標）、およびエネルギーショット、例えば、５－Ｈｏｕｒ Ｅｎｅｒｇｙ（商標）が挙げられる。
液体形態最終製品の他の例としては、ブロス、スープおよび液体食品が挙げられる。
液体形態は、冷たいドリンク、熱いもしくは温かいドリンク、または室温のドリンクであり得る。
本明細書の液体形態のいずれも、炭酸ガスが飽和され得る。炭酸ガス飽和は、二酸化炭素などの任意の安全な気体を使用して達成され得る。
一実施形態では、消費可能な組成物は、発泡性の水（例えば、Ｓａｎ Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｏ（商標））であり、０．５％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖと３０％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖとの間のｒＯＶＤを有する。かかる製品は、０．２未満、好ましくは、０．１５未満のＯＤ６００を有するが、本質的に無色、無臭および無味のままである。
一実施形態では、消費可能な組成物は、ソーダドリンク（例えば、Ｄｉｅｔ Ｃｏｋｅ（商標）Ｐｅｐｓｉ（商標）、Ｃｏｋｅ（商標））であり、０．５％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖと３０％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖとの間のｒＯＶＤを有する。かかる製品は、ｒＯＶＤの添加なしの組成物と匹敵する官能プロファイル（味、臭気、匂いおよび透明度）を保持する。
一部の実施形態では、消費可能な組成物は、半固体形態である。消費可能な半固体組成物の例としては、ゼリー、キャンディ、ブロス、スープ、シロップ、ゼラチン含有製品、ゲル化製品およびグミ製品、またはそれらの組合せが挙げられる。
さらなる成分との適合性
ｒＯＶＤが、完成製品を含む消費可能な食品組成物の調製において使用される１つまたは複数のさらなる成分と適合性である、ｒＯＶＤを含む組成物が、本明細書で提供される。かかる適合性は、消費可能な食品組成物の１つまたは複数の所望の特徴を維持しつつ、消費可能な食品組成物へのタンパク質含量の栄養強化を提供する。
一部の実施形態では、ｒＯＶＤは、グルテン含有成分と適合性である。例えば、ｒＯＶＤは、タンパク質栄養強化を達成し、成分および／または完成製品のために必要なグルテン構造を維持するために、グルテン含有成分と共に添加され得る。例えば、ｒＯＶＤは、タンパク質栄養強化されたオーブン焼きされた物品、パン、クッキー、クラッカー、ビスケット、冷凍乳製品、冷凍「乳製品様」製品、加工肉、肉製品、肉を含まない製品、ハンバーガー、パティ、タンパク質サプリメント、スナックバー、タンパク質バー、栄養バー、エネルギーバー、デザート、サラダドレッシング、卵液製品または「卵様」製品、ペストリー、ケーキおよび麺類の産生のための成分として使用され得る。完成製品では、ｒＯＶＤは、グルテン構造を実質的に妨害しない、または他のタンパク質供給源と比較して、グルテン構造の実質的に低減された妨害を有する。
一部の実施形態では、ｒＯＶＤは、グルテンフリー成分と適合性である。例えば、ｒＯＶＤは、タンパク質栄養強化を達成し、構造および／またはテクスチャーを完成製品に提供するために、グルテンフリー成分ミックスと共に添加され得る。グルテンフリー成分および完成製品には、かかる穀物およびデンプン（コメ、トウモロコシ、ソルガムおよび他の穀類）、塊根、例えば、ジャガイモ、ならびにマメ科植物および豆類、例えば、ヒヨコ豆およびレンズ豆が含まれる。例えば、ｒＯＶＤは、オーブン焼きされた物品、パン、クッキー、クラッカー、ビスケット、冷凍乳製品、冷凍「乳製品様」製品、加工肉、肉製品、肉を含まない製品、ハンバーガー、パティ、タンパク質サプリメント、スナックバー、タンパク質バー、栄養バー、エネルギーバー、デザートまたは「卵様」製品、ペストリー、ケーキおよび麺類が含まれるタンパク質栄養強化されたグルテンフリー製品の産生のための成分として使用され得る。
一部の実施形態では、ｒＯＶＤは、ｒＯＶＤタンパク質が溶液から沈殿しないように、塩と適合性である。例えば、ｒＯＶＤで栄養強化された食品および飲料、例えば、タンパク質スムージー、ビーガンミルクおよびフルーツジュースにおける使用のために、タンパク質は、実質的に溶液中に残存する。ｒＯＶＤの添加は、フルーツジュースおよびジュース様製品などで存在するビタミン／ミネラル栄養強化された環境中では沈殿せず、ｒＯＶＤは、増加したタンパク質含量および栄養を提供する。
アミノ酸の第２の供給源とのｒＯＶＤの組合せ
一部の実施形態では、組合せが増加したタンパク質含量を有し、所望の量またはバランスのアミノ酸含量を提供するように、ｒＯＶＤが消費可能な食品組成物に添加され、アミノ酸の第２の供給源が添加される。一部の実施形態では、アミノ酸の第２の供給源は、第２のタンパク質（ネイティブタンパク質または組換えタンパク質のいずれか）である。一部の実施形態では、アミノ酸の第２の供給源は、１つまたは複数の遊離アミノ酸を添加することによって提供される。
一部の実施形態では、組合せが増加したタンパク質含量を有し、所望の量またはバランスのアミノ酸含量を提供するように、ｒＯＶＤが消費可能な食品組成物に添加され、第２のタンパク質が添加される。一部の実施形態では、第２のタンパク質は、組換えタンパク質である。一部の実施形態では、第２のタンパク質は、そのネイティブ供給源から単離されたものなどの、ネイティブタンパク質である。
組成物のタンパク質含量は、種々の方法、例えば、タンパク質消化吸収率補正アミノ酸スコア（ＰＤＣＡＡＳ）法によって測定され得る。ＰＤＣＡＡＳは、ヒト栄養におけるタンパク質価の測定のための方法を指す。この方法は、試験タンパク質中の第一制限必須アミノ酸の濃度と、参照（スコアリング）パターン中のそのアミノ酸の濃度との比較に基づく。この方法は、標準的なアミノ酸プロファイルに対して具体的な食品タンパク質のアミノ酸プロファイルを比較し、最も高い可能なスコアは１．０であり、かかる１．０のスコアは、その具体的な食品タンパク質が、タンパク質１単位当たり、ヒト栄養に要求される不可欠アミノ酸のうち１００％またはそれよりも多くを提供することを意味している（例えば、FAO/WHO/UNU Expert Consultation 1985を参照のこと）。
ＰＤＣＡＡＳパーセンテージを計算するための式は以下である：（１ｇの試験タンパク質中の制限アミノ酸のｍｇ／１ｇの参照タンパク質中の同じアミノ酸のｍｇ）×糞便中の真の消化性パーセンテージ。１．０を上回るＰＤＣＡＡＳスコアは、１．０へと切り捨てられる。アミノ酸スコア（補正も切り捨てもされていない）は、１．０を超え得る。
一部の実施形態では、ｒＯＶＤおよび第２のタンパク質の組合せは、タンパク質含量を増加させ、約０．７５よりも大きいＰＤＣＡＡＳを提供する。一部の実施形態では、組合せは、０．７５、０．７６、０．７７、０．７８、０．７９、０．８０、０．８１、０．８２、０．８３、０．８４、０．８５、０．８６、０．８７． ０．８８、０．８９、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９もしくは１．０の、または約０．７５、０．７６、０．７７、０．７８、０．７９、０．８０、０．８１、０．８２、０．８３、０．８４、０．８５、０．８６、０．８７． ０．８８、０．８９、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９もしくは１．０のＰＤＣＡＡＳを提供する。一部の実施形態では、組合せは、０．７５、０．７６、０．７７、０．７８、０．７９、０．８０、０．８１、０．８２、０．８３、０．８４、０．８５、０．８６、０．８７． ０．８８、０．８９、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４もしくは０．９５よりも大きい、または約０．７５、０．７６、０．７７、０．７８、０．７９、０．８０、０．８１、０．８２、０．８３、０．８４、０．８５、０．８６、０．８７． ０．８８、０．８９、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４もしくは０．９５よりも大きいＰＤＣＡＡＳを提供する。一部の実施形態では、組合せは、１．０のまたは約１．０のＰＤＣＡＡＳを提供する。
一部の実施形態では、ｒＯＶＤと第２のタンパク質との比は、少なくとも約０．７５のＰＤＣＡＡＳを提供するように選択され、ｒＯＶＤおよび第２のタンパク質の組合せは、消費可能な食品組成物中で可溶性のままである。ｒＯＶＤおよび第２のタンパク質の本明細書で開示される組合せの一部の実施形態では、ｒＯＶＤは、総重量当たりの重量（ｗ／ｗ）および／または総体積当たりの重量（ｗ／ｖ）で、９５％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％もしくは７０％で、または約９５％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％もしくは７０％で、組合せ中に存在する。ｒＯＶＤおよび第２のタンパク質の本明細書で開示される組合せの一部の実施形態では、ｒＯＶＤは、６９％、７８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、６０％、５９％、５８％、５７％、５６％、５５％、５４％、５３％、５２％、５１％もしくは５０％ ｗ／ｗもしくはｗ／ｖで、または約６９％、７８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、６０％、５９％、５８％、５７％、５６％、５５％、５４％、５３％、５２％、５１％もしくは５０％ ｗ／ｗもしくはｗ／ｖで、組合せ中に存在する。ｒＯＶＤおよび第２のタンパク質の組合せの一部の実施形態では、ｒＯＶＤは、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％もしくは８０％ ｗ／ｗもしくはｗ／ｖより大きい、または少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％もしくは８０％ ｗ／ｗもしくはｗ／ｖより大きい総タンパク質のパーセンテージで、組合せ中に存在する。ｒＯＶＤおよび第２のタンパク質の本明細書で開示される組合せの一部の実施形態では、第２のタンパク質は、上記パーセンテージで組合せ中に存在し、かかるｒＯＶＤは、第２のタンパク質よりも少ない量で提供される。
一部の実施形態では、第２のタンパク質は、そのアミノ酸組成に基づいて選択される。一部の実施形態では、第２のタンパク質は、組成物にトリプトファンを提供する。一部の実施形態では、第２のタンパク質は、ｒＯＶＤとの組合せが、１００ｇの総タンパク質当たり少なくとも約１．７ｇのトリプトファン含量を有するように、トリプトファンを提供する。
一部の実施形態では、第２のタンパク質は、リゾチームである。一部の実施形態では、第２のタンパク質は、卵白リゾチームである。一部の実施形態では、第２のタンパク質は、組換えタンパク質である。一部の実施形態では、第２のタンパク質は、組換え卵白リゾチーム（ｒＯＶＬ）である。
ｒＯＶＤおよびｒＯＶＬは、任意の他の食品成分または消費可能な食品製品と混合する前に、一緒に加工または混合され得る。あるいは、ｒＯＶＤまたはｒＯＶＬのいずれかは、個々に加工され得、または同時にもしくは別々にのいずれかで、任意の他の食品成分または消費可能な食品製品と個々に混合され得る。実施形態では、単一の形質転換された細胞が、ｒＯＶＬおよびｒＯＶＤの両方を発現する。
一部の実施形態では、第２のタンパク質は、ｒＯＶＬであり、ｒＯＶＤおよびｒＯＶＬの組合せは、組成物中で可溶性のままであり、約１．０のＰＤＣＡＡＳを提供しつつ、タンパク質栄養強化を提供する。ｒＯＶＤのｒＯＶＬに対する比は、総重量当たりの重量（ｗ／ｗ）および／または総体積当たりの重量（ｗ／ｖ）で、約６０％のｒＯＶＤ：４０％のｒＯＶＬ～約８２％のｒＯＶＤ：１８％のｒＯＶＬの間、または約７５％のｒＯＶＤ：２５％のｒＯＶＬ～約８２％のｒＯＶＤ：１８％のｒＯＶＬの間であり得る。
ネイティブＯＶＤは、およそ０．０２のＰＤＣＡＡＳを有する。ｒＯＶＤへのｒＯＶＬの添加は、組合せのアミノ酸スコアおよびＰＤＣＡＡＳを増加させる。例として、７８．３％のｒＯＶＤおよび２１．７％のｒＯＶＬのブレンドは、０．８６のアミノ酸スコアおよび０．７９のＰＤＣＡＡＳを生じる。約７８．３％のｒＯＶＤ＋２１．７％のｒＯＶＬ～約６０％のｒＯＶＤ＋４０％の、ｒＯＶＬのｒＯＶＤのｒＯＶＬに対する比を用いると、０．８６～１．０６のアミノ酸スコアの範囲が提供される。これらの例示的な範囲において、ｒＯＶＤおよびｒＯＶＬの組合せは、可溶性のままである。
一部の実施形態では、消費可能な組成物は、ｒＯＶＤおよびｒＯＶＬのタンパク質混合物を含む。一部の場合には、ｒＯＶＤおよびｒＯＶＬの混合物を含む組成物は、約２０％～９９％のｒＯＶＤおよび１～２０％のｒＯＶＬを有する。一部の例では、ｒＯＶＤおよびｒＯＶＬのタンパク質混合物中のｒＯＶＤの濃度は、少なくとも２０％であり得る。ｒＯＶＤおよびｒＯＶＬのタンパク質混合物中のｒＯＶＤの濃度は、多くても９９％であり得る。ｒＯＶＤおよびｒＯＶＬのタンパク質混合物中のｒＯＶＤの濃度は、総重量当たりの重量（ｗ／ｗ）および／または総体積当たりの重量（ｗ／ｖ）で、約２０％～３０％、２０％～４０％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９９％、３０％～４０％、３０％～５０％、３０％～６０％、３０％～７０％、３０％～８０％、３０％～９０％、３０％～９９％、４０％～５０％、４０％～６０％、４０％～７０％、４０％～８０％、４０％～９０％、４０％～９９％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９９％、６０％～７０％、６０％～８０％、６０％～９０％、６０％～９９％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９９％、８０％～９０％、８０％～９９％または９０％～９９％であり得る。ｒＯＶＤおよびｒＯＶＬのタンパク質混合物中のｒＯＶＤの濃度は、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９９％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖであり得る。ｒＯＶＤおよびｒＯＶＬのタンパク質混合物中のｒＯＶＬの濃度は、１％～２０％であり得る。ｒＯＶＤおよびｒＯＶＬのタンパク質混合物中のｒＯＶＬの濃度は、少なくとも１％であり得る。ｒＯＶＤおよびｒＯＶＬのタンパク質混合物中のｒＯＶＬの濃度は、多くても２０％であり得る。ｒＯＶＤおよびｒＯＶＬのタンパク質混合物中のｒＯＶＬの濃度は、１％～５％、１％～１０％、１％～１５％、１％～２０％、５％～１０％、５％～１５％、５％～２０％、１０％～１５％、１０％～２０％または１５％～２０％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖであり得る。ｒＯＶＤおよびｒＯＶＬのタンパク質混合物中のｒＯＶＬの濃度は、約１％、５％、１０％、１５％または２０％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖであり得る。
一部の実施形態では、ｒＯＶＤおよび第２のタンパク質は、他のタンパク質供給源、例えば、乳清タンパク質および乳清タンパク質単離物と類似のＰＤＣＡＡＳを提供し、ｒＯＶＤおよび第２のタンパク質は、溶解度、透明度、官能中立性、または味および／もしくは臭気の改善、改善された口当たり、ならびにさらなる成分との適合性を含む、他のタンパク質供給源と比較して改善された少なくとも１つの特色を提供する。一部の実施形態では、ｒＯＶＤおよび第２のタンパク質は、他のタンパク質供給源と類似のＰＤＣＡＡＳを提供し、食品の調製および加工条件、例えば、ｐＨ、加熱および炭酸ガス飽和において、改善された溶解度および透明度を提供した。
一部の実施形態では、ｒＯＶＤと共に添加されるアミノ酸の第２の供給源は、１つまたは複数の遊離アミノ酸である。一部の実施形態では、ｒＯＶＤは、ＰＤＣＡＡＳを選択的に増加させるために、遊離アミノ酸、例えば、トリプトファン、イソロイシン、ロイシンおよびバリンと組み合わされ得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の遊離アミノ酸の添加は、第２のタンパク質の添加と類似の、例えば、ｒＯＶＬの添加で達成されるＰＤＣＡＡＳと類似の、アミノ酸バランスを提供する。例えば、以下のうち１つまたは複数が、ｒＯＶＤと共に添加され得る：トリプトファン＝１．７ｇ／試料１００ｇ、イソロイシン＝２．０３ｇ／試料１００ｇ、ロイシン＝４．５５ｇ／試料１００ｇ、バリン＝４．９４ｇ／試料１００ｇ。
組成物の加熱条件およびｐＨ
一部の実施形態では、消費可能な食品組成物およびかかる組成物を作製する方法は、特定のｐＨ範囲を含み、かかる範囲では、ｒＯＶＤは、組成物中で可溶性のままである。一部の実施形態では、ｐＨは、約１．０と約８．０との間である。一部の実施形態では、ｐＨは、約２．０と約６．０、６．５または７．０との間である。一部の実施形態では、ｐＨは、約２．０～約２．５、約２．５～約３．０、約２．５～約３．５、約３．５～約４．０、約２．５～約４．５、約２．０～約４．０、約４．０～約６．０、約２．０～約６．０、約４．０～約６．５または約２．０～約６．５の間である。一部の実施形態では、ｐＨは、２．０未満である、または２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５と等しい、または４．５よりも高い。かかるｐＨまたはｐＨ範囲では、ｒＯＶＤが、完成製品の成分（例えば、完成製品における使用のための粉末化形態として）である場合、または完成製品自体の中にある場合、ｒＯＶＤは、消費可能な食品組成物中で可溶性のままである。かかるｐＨまたはｐＨ範囲では、ｒＯＶＤは、組成物のテクスチャーにも粒状性にも影響を与えることなしに、消費可能な食品組成物中で可溶性のままである。半固体および固体の食品では、ｒＯＶＤの溶解度は、食品製品の機能的特性および官能特性を危うくすることなしに、タンパク質栄養強化を可能にする。例えば、ｒＯＶＤの添加は、栄養強化を提供し、官能訴求力、例えば、良好な口当たり、および粒状性の欠如を維持する。一部の実施形態では、ｒＯＶＤの添加は、栄養強化を提供し、溶解度を維持し、そのため、他の成分と調和するｒＯＶＤの能力を提供する。
一部の実施形態では、消費可能な食品組成物およびかかる組成物を作製する方法は、加熱条件を含む。例えば、消費可能な食品組成物は、加熱された（例えば、揚げられた、煮沸されたまたはオーブン焼きされた）ものであり得、または熱い飲料、例えば、温かいもしくは熱いドリンク、スープもしくはブロスであり得る。一部の場合には、消費可能な食品組成物は、成分または完成製品を産生するための調製または無菌化プロセスの一部として、加熱ステップを有し得る。例えば、加熱ステップは、低温殺菌、熱間充填および／またはレトルトを含み得る。一部の実施形態では、加熱ステップは、約７２℃と約１２１℃との間の温度までの加熱を含む。例えば、加熱ステップは、低温殺菌であり得、この場合、組成物は、７２℃で１分間加熱され、次いで、冷却および貯蔵され、これには、室温でのまたは冷蔵された貯蔵が含まれる。熱間充填について、組成物は、８５℃～９５℃まで、例えば３０秒間加熱され得、次いで、室温に置かれる。レトルトは、圧力下での１２１℃までの加熱、例えば、１９ｐｓｉでの１５分間の加熱、および次いで、室温での貯蔵を含み得る。
消費可能な組成物の調製は、１つまたは複数の加熱ステップもまた含み得る。加熱ステップは、低温殺菌、熱間充填および／またはレトルトを含み得る。一部の実施形態では、加熱ステップは、約７０℃と約１５０℃との間の温度までの加熱を含む。
一例では、低温殺菌加熱ステップは、７０℃と１００℃との間の範囲の温度で実施される。
一例では、熱間充填加熱ステップは、約９０℃～約９７℃で実施される。
一例では、レトルトは、約１００℃～約１４０℃で実施される。レトルトは、約１２ｐｓｉまたは少なくとも１２ｐｓｉで、約１０分間またはそれよりも長い時間にわたって実施され得る。
一部の実施形態では、ｒＯＶＤを含む消費可能な食品組成物およびかかる組成物を作製する方法は、同じ濃度で異なるタンパク質、例えば、乳清タンパク質、ダイズタンパク質、エンドウマメタンパク質、全卵タンパク質（例えば、ネイティブＯＶＤ）または全卵白タンパク質を含有する組成物と比較して、ｐＨ範囲でおよび／または加熱により、より高いタンパク質溶解度またはより高いタンパク質溶解度および改善された透明度を提供する。
一部の場合には、ｒＯＶＤは、約２と約６との間のｐＨで、１００ｍＬの溶液（例えば、１００ｍＬの水中など）当たり、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ｇ、もしくは３０ｇよりも多くの総ｒＯＶＤタンパク質の濃度のｒＯＶＤ濃度で、または総組成物体積当たりの重量ベースで、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０パーセントのパーセンテージで、消費可能な食品組成物においてタンパク質溶解度を提供する。一部の場合には、ｒＯＶＤは、約２と約６との間のｐＨで、１００ｍＬの溶液（例えば、１００ｍＬの水中など）当たり、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ｇ、もしくは３０ｇよりも多くの総ｒＯＶＤタンパク質のｒＯＶＤ濃度で、または総組成物体積当たりの重量ベースで、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０パーセントのパーセンテージで、消費可能な食品組成物においてタンパク質溶解度および透明度を提供する。
一部の場合には、ｒＯＶＤは、組成物が約７２℃と約１２１℃との間の温度まで加熱される場合、１００ｍＬの溶液（例えば、１００ｍＬの水中など）当たり、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ｇ、もしくは３０ｇよりも多くの総ｒＯＶＤタンパク質の濃度のｒＯＶＤ濃度で、または総組成物体積当たりの重量ベースで、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０パーセントのパーセンテージで、消費可能な食品組成物においてタンパク質溶解度を提供する。一部の場合には、ｒＯＶＤは、組成物が約７２℃と約１２１℃との間の温度まで加熱される場合、１００ｍＬの溶液（例えば、１００ｍＬの水中など）当たり、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ｇ、もしくは３０ｇよりも多くの総ｒＯＶＤタンパク質の濃度のｒＯＶＤ濃度で、または総組成物体積当たりの重量ベースで、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０パーセントのパーセンテージで、消費可能な食品組成物においてタンパク質溶解度および透明度を提供する。
一部の場合には、ｒＯＶＤは、組成物が約７２℃と約１２１℃との間の温度まで加熱される場合、かつ組成物が約２と約４との間のｐＨ、または約２～約６のｐＨを有する場合、１００ｍＬの溶液（例えば、１００ｍＬの水中など）当たり、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ｇ、もしくは３０ｇよりも多くの総ｒＯＶＤタンパク質の濃度のｒＯＶＤ濃度で、または総組成物体積当たりの重量ベースで、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０パーセントのパーセンテージで、消費可能な食品組成物においてタンパク質溶解度を提供する。一部の場合には、ｒＯＶＤは、組成物が約７２℃と約１２１℃との間の温度まで加熱される場合、かつ組成物が約２と約４との間のｐＨ、または約２～約６のｐＨを有する場合、１００ｍＬの溶液（例えば、１００ｍＬの水中など）当たり、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ｇ、もしくは３０ｇよりも多くの総ｒＯＶＤタンパク質の濃度のｒＯＶＤ濃度で、または総組成物体積当たりの重量ベースで、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０パーセントのパーセンテージで、消費可能な食品組成物においてタンパク質溶解度および透明度を提供する。
消費可能な食品組成物
本明細書に記載される消費可能な食品組成物には、非限定的な例として、食品製品、飲料製品、栄養補助食品、食品添加物および栄養補給食品が含まれ、食品もしくは飲料の成分としての組成物、または動物の食餌の一部として摂取される製品も含まれる。一部の実施形態では、消費可能な食品組成物は、完成製品、例えば、動物消費もしくはヒト消費のための食品もしくは飲料、栄養補助食品、または栄養補給食品製品である。
一部の実施形態では、完成製品は、ｒＯＶＤ、および必要に応じて第２のタンパク質、例えばｒＯＶＬを含有する飲料である。飲料は、透明な飲料であり得、ジュース、ソーダ、ソフトドリンク、フレーバー付きの水、フレーバーなしの水、栄養強化水、炭酸水、栄養ドリンク、エナジードリンク、スポーツドリンク、回復ドリンク、加熱ドリンク、コーヒーベースのドリンク、茶ベースのドリンク、ココアベースのドリンク、スムージー、ミルクセーキ、ココナツ水、ビール、ワイン、アルコール性飲料、ナッツミルク、ジュースベースの飲料、乳製品ベースの飲料および植物ベースのミルクから選択され得る。これらの飲料の多くは、約２と約７との間のｐＨを有し、ｒＯＶＤならびに／またはｒＯＶＤおよび第２のタンパク質組合せは、かかる飲料中で可溶性のままである。一部の実施形態では、飲料は、加熱飲料である。一部の実施形態では、飲料は、冷たい飲料、または室温で給仕もしくは貯蔵される飲料である。一部の実施形態では、飲料は、総重量当たりの重量（ｗ／ｗ）および／または総体積当たりの重量（ｗ／ｖ）で、３～４０％のアルコールを含有する。
一部の実施形態では、飲料は、炭酸ガスが飽和される。炭酸ガス飽和は、例えば、二酸化炭素、炭酸、重炭酸ナトリウムおよび重炭酸カリウムによって創出され得る。本明細書に記載される組成物は、炭酸ガスが飽和され得る。一部の場合には、本明細書に記載される組成物は、１体積の飲料当たり、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５もしくは４体積、または少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５もしくは４体積の、存在する二酸化炭素気体を有する。一部の場合には、本明細書に記載される組成物は、１体積の飲料当たり、最大で約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５または４体積の、存在する二酸化炭素気体を有する。一部の場合には、本明細書に記載される組成物は、１体積の飲料当たり、約０．１体積～約４体積または約１．５体積～約３．５体積の、存在する二酸化炭素気体を有する。
一部の実施形態では、タンパク質組成物は、二酸化炭素を含み得、可溶性タンパク質組成物に添加される二酸化炭素の量は、３５５ｍＬ中０．０１ｇと４．４ｇとの間の割合であり得る、または気体状二酸化炭素は、１体積の可溶性タンパク質組成物につき、０．０２体積と５体積との間であり得、飲料は、約２と約６との間または約２と約４との間のｐＨ範囲を有し得る。一部の実施形態では、炭酸飲料は、１．０と６．０との間または約１．０と約４との間または約１．６と約３．４との間のｐＨを有する。
一部の実施形態では、飲料調製は、加熱ステップ、例えば、熱間充填、低温殺菌またはレトルトを含み、飲料中のｒＯＶＤは、加熱ステップの間およびそれに引き続いて、可溶性のままである。一部の実施形態では、飲料へのｒＯＶＤの添加は、組成物を含有しない飲料と比較して、飲料の目に見える外観、匂い、フレーバーまたは口当たりを実質的に変更しない。一部の実施形態では、飲料へのｒＯＶＤの添加は、官能中性であり、同じ濃度で飲料に添加された場合の他のタンパク質、例えば、乳清タンパク質、ダイズタンパク質、エンドウマメタンパク質、卵白タンパク質または全卵タンパク質と比較して、改善された官能訴求力を提供する。一部の実施形態では、飲料調製物は、第２のタンパク質、例えばｒＯＶＬもまた含み、ｒＯＶＤおよび第２のタンパク質の組合せは、加熱ステップの間およびそれに引き続いて、可溶性のままである。
一部の実施形態では、完成製品は、ｒＯＶＤを含有する食品製品である。食品製品は、ゼリー、キャンディ、ブロス、スープ、ゼラチン含有製品、ゲル化製品およびグミ製品であり得る。ｒＯＶＤが添加され得る食品製品のさらなる例示的なカテゴリーには、ソース、ドレッシング、香辛料が含まれる。
ｒＯＶＤは、シーズニングミックスおよびスパイスにも添加され得る。ｒＯＶＤは、コーティングおよびパン粉付けにおいても使用され得る。ｒＯＶＤは、スナック、例えば、果物および野菜ベースのスナックのタンパク質含量を増加させるためにも使用され得る。
ｒＯＶＤは、オーブン焼きされた物品への種子もしくは穀物の付着を促進するため、および／またはオーブン焼きされた物品の視覚的外観、例えば褐色化を改善するために、卵液として使用され得る。
本明細書の一部の実施形態では、ｒＯＶＤを含有する消費可能な食品組成物は、完成製品を創出するために、他の成分（複数可）または構成成分（複数可）と共に、成分として使用される組成物である。例えば、ｒＯＶＤは、水または他の液体と混合され得、次いで、この混合物は、飲料、食品製品、栄養補助食品または栄養補給食品を創出するための成分として使用され得る。一部の場合には、ｒＯＶＤは、他の成分、例えば、他の液体（例えば、ナッツミルク、フルーツジュース、野菜抽出物または炭酸溶液）と混合される。この溶液は、末端利用者のための最終製品を作製するために、他の成分と次いで混合される成分であり得る；例えば、溶液は、濃縮されたｒＯＶＤを含有するシロップであり得る。最終または完成製品は、末端利用者の消費の準備ができた製品である。完成製品は、加工された製品、例えば、加工された食品または加工されたドリンクであり得る。一部の例では、ｒＯＶＤは、別々の容器中で提供されて、末端利用者によって最終製品へと混合される。一部の場合には、ｒＯＶＤは、キャンディ、グミ製品、ゲル化製品（例えば、Ｊｅｌｌｏ（商標））またはスポーツゲルを作製するために、ゲル化剤などの他の成分と混合される。
ｒＯＶＤを含有する消費可能な食品製品の調製の間またはその後に、液体、固体、シロップまたは粉末として製剤化され得る。組成物は、冷蔵され得、冷凍され得、温かく貯蔵され得、室温で貯蔵され得、または加熱された温度で維持され得る。食品製品の調製は、加熱ステップを含み得、または食品製品は、加熱された温度で貯蔵もしくは給仕され、ｒＯＶＤは、加熱ステップの間およびそれに引き続いて、食品製品中で可溶性のままである。一部の場合には、食品製品は、約２と約６との間のｐＨを有し得、ｒＯＶＤは、食品製品中で可溶性のままである。
消費可能な液体組成物または飲料の例としては、ソーダ、ビタミンドリンク、タンパク質シェイク、食事代替シェイク、ジュース、清涼ドリンク、ミルクベースのドリンクまたは乳成分不使用ベースのドリンク、フレーバー付きの水、炭酸ドリンク、コーヒー、カフェイン入りドリンク、茶、花ベースのドリンク、ビール、酒およびスポーツドリンクが挙げられる。
本明細書の消費可能な液体または半固体組成物のいずれもが、粉末化されたｒＯＶＤを溶液中に混合することによって創出され得る。溶液は、最終製品、または最終製品を生成するために次いでさらに改変される中間溶液であり得る。
ｒＯＶＤ溶液を調製するために使用され得る溶媒の例としては、炭酸なし水、炭酸水、アルコール、ジュース、および本明細書でより詳細に記載されるものが含まれる任意の他の市販のドリンクが挙げられる。
ｒＯＶＤを含む消費可能な組成物を生成する方法は、ｒＯＶＤを、溶媒、および必要に応じて、１つまたは複数の他の構成成分と混合することを含み得る。混合することは、すり鉢およびすりこぎ、機械的グラインダー、ブレンド、均質化プロセスまたは超音波処理プロセスが含まれる任意の慣習的に使用される混合方法によって実施され得る。
溶液に添加されるｒＯＶＤの量は、（最終製品または中間製品のいずれか中で）本明細書で導かれるｒＯＶＤ濃度を生成する量であり得る。
好ましくは、溶液へのｒＯＶＤの添加により、ほとんどまたはほぼ全てのｒＯＶＤが、室温で溶液中に可溶化されるようになる。一例では、溶解度は、透明度、または濁度の欠如の程度に基づいて決定される。
本明細書の消費可能な組成物は、加熱ステップにも供され得る。かかるステップは、ｒＯＶＤの溶解度を改変または増加させ得る。例えば、製品を作製するプロセスにおいて加熱ステップ、例えば、レトルト、熱間充填または低温殺菌を実施することは、本明細書のｒＯＶＤ溶液の溶解度を増加させ得、したがって、その透明度を増加させ得ることが見出された。
ｒＯＶＤを含有する消費可能な食品製品の調製は、加工ステップ、例えば、凍結、チル、加熱、オーブン焼き、ロースト、直火焼き、煮沸、湯通し、包装、缶詰め、漂白、栄養補強（ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ）、乾燥、圧搾、すりつぶし（ｇｒｉｎｄｉｎｇ）、混合、半調理済み調理、加熱調理、プルーフィング（ｐｒｏｏｆｉｎｇ）、マリネ、カット、スライス、賽の目切り、粉砕、細切り（ｓｈｒｅｄｄｉｎｇ）、みじん切り（ｃｈｏｐｐｉｎｇ）、振盪（ｓｈａｋｉｎｇ）、芯抜き、らせん状カット（ｓｐｉｒａｌｉｚｉｎｇ）、ロール（ｒｏｌｌｉｎｇ）、ジュース絞り、裏ごし、濾過、こね（ｋｎｅａｄｉｎｇ）、泡立て（ｗｈｉｓｋｉｎｇ）、かき混ぜ（ｂｅａｔｉｎｇ）、泡立て（ｗｈｉｐｐｉｎｇ）、すりおろし（ｇｒａｔｉｎｇ）、詰め物、皮むき、種抜き、燻製、保存処理（ｃｕｒｉｎｇ）、塩漬け、保存（ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ）、漬物、発酵（ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ）、均質化、低温殺菌、無菌化、照射、コールドプラズマ加工、高圧加工、パルス電場加工、マイクロ波アシスト熱殺菌、安定化、ブレンド、ピューレ化、栄養強化、純化、水素添加、熟成、保存可能期間の延長、または酵素の添加を含み得る。
ｒＯＶＤを含有する消費可能な食品製品の調製は、乾燥および／または濃縮を含み得る。一部の場合には、乾燥は、乾燥した、脱水された、濃縮されたおよび／または固体のタンパク質または組成物を形成する。乾燥方法の一部の非限定的な例としては、熱乾燥、蒸発（例えば、真空または空気による）、蒸留、煮沸、オーブン中での加熱、真空乾燥、噴霧乾燥、フリーズドライおよび凍結乾燥、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。
ｒＯＶＤを含有する消費可能な食品製品の調製は、希釈および／または補水を含み得る。一部の場合には、希釈は、水または別の液体形態であり得る液体の添加を含み得る。例えば、組成物は、希釈され得る（例えば、２０％の水から９９．９％の水まで）。別の例では、乾燥組成物は、補水され得る（例えば、乾燥固体から９９．９％の水まで）。
一部の実施形態では、ｒＯＶＤを含有する消費可能な食品組成物は、粉末形態であり、粉末化された組成物が溶液へと製剤化される場合、ｒＯＶＤは、実質的に完全に可溶性である。一部の実施形態では、粉末化された組成物が溶液へと製剤化される場合、ｒＯＶＤは実質的に完全に可溶性であり、溶液は実質的に透明である。一部の実施形態では、粉末化された組成物が溶液へと製剤化される場合、ｒＯＶＤは実質的に完全に可溶性であり、溶液は実質的に透明であり、溶液は本質的に官能中性であり、または他の粉末化されたタンパク質、例えば、乳清タンパク質、ダイズタンパク質、エンドウマメタンパク質、卵白タンパク質または全卵タンパク質で作製された溶液と比較して、改善された官能訴求力を有する。一部の実施形態では、粉末化された組成物は、水中で可溶化され、ｒＯＶＤの濃度は、総重量当たりの重量（ｗ／ｗ）および／または総体積当たりの重量（ｗ／ｖ）で、組成物の１％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％もしくは４０％、または約１％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％もしくは４０％である。
本明細書に記載される消費可能な食品組成物の一部の実施形態では、組成物は、動物由来の構成成分、乳清タンパク質、カゼイネート、脂肪、ラクトース、加水分解されたラクトース、ダイズタンパク質、コラーゲン、加水分解されたコラーゲン、もしくはゼラチン、またはそれらの任意の組合せを本質的に含まない。本明細書に記載される組成物は、コレステロール、グルコース、脂肪、飽和脂肪、トランス脂肪、またはそれらの任意の組合せを本質的に含まなくてもよい。一部の場合には、本明細書に記載される組成物は、乾燥重量で、１０％、５％、４％、３％、２％、１％または０．５％未満の脂肪を含む。一部の実施形態では、組成物は、脂肪含有（例えば、マヨネーズなど）であり得、かかる組成物には、最大で約６０％の脂肪または低脂肪の組成物（例えば、低脂肪マヨネーズ）が含まれ得、かかる組成物は、より低いパーセンテージの脂肪を含み得る。動物由来の構成成分を含まない組成物は、ベジタリアンおよび／またはビーガンとみなされ得る。
一部の実施形態では、ｒＯＶＤ粉末組成物は、５％未満の灰分を含む。用語「灰分」は、当該技術分野で公知の用語であり、無機物、例えば、１つまたは複数のイオン、元素、ミネラルおよび／または化合物を示す。一部の場合には、ｒＯＶＤ粉末組成物は、総重量当たりの重量（ｗ／ｗ）および／または総体積当たりの重量（ｗ／ｖ）で、５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％、０．７５％、０．５％、０．２５％または０．１％未満の灰分を含む。
一部の実施形態では、ｒＯＶＤ粉末組成物の水分含量は、１５％未満であり得る。ｒＯＶＤ粉末組成物は、総重量当たりの重量（ｗ／ｗ）および／または総体積当たりの重量（ｗ／ｖ）で、１５％、１２％、１０％、８％、６％、５％、３％、２％または１％未満の水分を有し得る。一部の実施形態では、ｒＯＶＤ粉末組成物の炭水化物含量は、３０％未満であり得る。ｒＯＶＤ粉末組成物は、３０％、２７％、２５％、２２％、２０％、１７％、１５％、１２％、１０％、８％、５％、３％または１％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖ未満の炭水化物含量を有し得る。
一部の場合には、ｒＯＶＤ粉末組成物のタンパク質含量は、総重量当たりの重量（ｗ／ｗ）および／または総体積当たりの重量（ｗ／ｖ）で、３０％～９９％であり得る。一部の場合には、ｒＯＶＤ粉末組成物のタンパク質含量は、少なくとも３０％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖであり得る。一部の場合には、ｒＯＶＤ粉末組成物のタンパク質含量は、多くても９９％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖであり得る。一部の場合には、ｒＯＶＤ粉末組成物のタンパク質含量は、３０％～４０％、３０％～５０％、３０％～６０％、３０％～７０％、３０％～７５％、３０％～８０％、３０％～８５％、３０％～９０％、３０％～９５％、３０％～９９％、４０％～５０％、４０％～６０％、４０％～７０％、４０％～７５％、４０％～８０％、４０％～８５％、４０％～９０％、４０％～９５％、４０％～９９％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～７５％、５０％～８０％、５０％～８５％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～９９％、６０％～７０％、６０％～７５％、６０％～８０％、６０％～８５％、６０％～９０％、６０％～９５％、６０％～９９％、７０％～７５％、７０％～８０％、７０％～８５％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～９９％、７５％～８０％、７５％～８５％、７５％～９０％、７５％～９５％、７５％～９９％、８０％～８５％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～９９％、８５％～９０％、８５％～９５％、８５％～９９％、９０％～９５％、９０％～９９％または９５％～９９％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖであり得る。一部の場合には、ｒＯＶＤ粉末組成物のタンパク質含量は、約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖであり得る。一部の場合には、ｒＯＶＤ粉末組成物のタンパク質含量は、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖであり得る。一部の場合には、ｒＯＶＤ粉末組成物のタンパク質含量は、多くても４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖであり得る。
組成物のさらなる構成成分
本明細書で開示されるｒＯＶＤを含有する消費可能な食品組成物およびかかる組成物を作製する方法は、ｒＯＶＤを１つもしくは複数の成分と共に添加すること、またはｒＯＶＤを１つもしくは複数の成分と混合することを含み得る。例えば、食品添加物は、組成物中に添加され得る、または組成物と混合され得る。食品添加物は、組成物に体積および／または質量を付加し得る。食品添加物は、機能的性能および／または物理的特徴を改善し得る。例えば、食品添加物は、凍結－解凍サイクルにおけるリポタンパク質の脂質部分に起因するゲル化または増加した粘度を防止し得る。アンチケーキング剤が、自由流動性組成物を作製するために添加され得る。炭水化物は、加熱損傷に対する耐性を増加させるため、例えば、乾燥の間のタンパク質変性を減らし、乾燥した組成物の安定性および流動性を改善するために添加され得る。食品添加物には、これらに限定されないが、食品着色料、ｐＨ調整剤、天然香味料、人工香味料、フレーバー増強剤、バッチマーカー、食品酸、充填剤、アンチケーキング剤（例えば、ケイアルミン酸ナトリウム）、アンチグリーン剤（ａｎｔｉｇｒｅｅｎｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（例えば、クエン酸）、食品安定剤、泡安定剤もしくは結合剤、抗酸化剤、酸性度調節、増量剤、色保持剤、泡立て剤（例えば、エステル型泡立て剤、クエン酸トリエチル、ラウリル硫酸ナトリウム）、乳化剤（例えば、レシチン）、保湿剤、増粘剤、賦形剤、固体希釈剤、塩、栄養素、甘味料、艶出し剤、防腐剤、ビタミン、食餌元素、炭水化物、ポリオール、ガム、デンプン、小麦粉、油またはふすまが含まれる。
食品着色料には、これらに限定されないが、ＦＤ＆Ｃ Ｙｅｌｌｏｗ ＃５、ＦＤ＆Ｃ Ｙｅｌｌｏｗ ＃６、ＦＤ＆Ｃ Ｒｅｄ ＃４０、ＦＤ＆Ｃ Ｒｅｄ ＃３、ＦＤ＆Ｃ Ｂｌｕｅ Ｎｏ．１、ＦＤ＆Ｃ Ｂｌｕｅ Ｎｏ．２、ＦＤ＆Ｃ Ｇｒｅｅｎ Ｎｏ．３、カロテノイド（例えば、サフラン、β－カロテン）、アントシアニン、アナトー、ベタニン、チョウマメ、カラメル着色料、クロロフィリン、エルダーベリージュース、リコピン、カーマイン、パンダン、パプリカ、ターメリック、クルクミノイド、キノリンイエロー、カルモイシン（ｃａｒｍｏｉｓｉｎｅ）、Ｐｏｎｃｅａｕ ４Ｒ、Ｐａｔｅｎｔ Ｂｌｕｅ ＶおよびＧｒｅｅｎ Ｓが含まれる。
ｐＨ調整のための成分には、これらに限定されないが、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムおよび塩酸が含まれる。
塩には、これらに限定されないが、酸性塩、アルカリ塩、有機塩、無機塩、リン酸塩、塩化物塩、ナトリウム塩、塩化ナトリウム、カリウム塩、塩化カリウム、マグネシウム塩、塩化マグネシウム、過塩素酸マグネシウム、カルシウム塩、塩化カルシウム、塩化アンモニウム、鉄塩、塩化鉄、亜鉛塩および塩化亜鉛が含まれる。
栄養素には、これらに限定されないが、主要栄養素、微量栄養素、必須栄養素、非必須栄養素、食物繊維、アミノ酸、必須脂肪酸、オメガ－３脂肪酸および共役リノール酸が含まれる。
甘味料には、これらに限定されないが、糖代用品、人工甘味料、アセスルファムカリウム、アドバンテーム、アリテーム、アスパルテーム、サイクラミン酸ナトリウム、ズルチン、グルチン（ｇｌｕｃｉｎ）、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン、ネオテーム、Ｐ－４０００、サッカリン、アスパルテーム－アセスルファム塩、スクラロース、ブラゼイン（ｂｒａｚｚｅｉｎ）、クルクリン（ｃｕｒｃｕｌｉｎ）、グリチルリチン、グリセロール、イヌリン、モグロシド、マビンリン（ｍａｂｉｎｌｉｎ）、マルトオリゴ糖、マンニトール、ミラクリン、モナチン（ｍｏｎａｔｉｎ）、モネリン（ｍｏｎｅｌｌｉｎ）、オスラジン（ｏｓｌａｄｉｎ）、ペンタジン（ｐｅｎｔａｄｉｎ）、ステビア、トリロバチン（ｔｒｉｌｏｂａｔｉｎ）およびタウマチンが含まれる。
炭水化物には、これらに限定されないが、糖、スクロース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、マンノース、アルロース、タガトース、キシロース、アラビノース、高フルクトースコーンシロップ、高マルトースコーンシロップ、コーンシロップ（例えば、グルコースフリーのコーンシロップ）、シアル酸、単糖、二糖および多糖（例えば、ポリデキストロース、マルトデキストリン）が含まれる。
ポリオールには、これらに限定されないが、キシリトール、マルチトール、エリスリトール、ソルビトール、トレイトール、アラビトール、水素添加デンプン加水分解物、イソマルト、ラクチトール、マンニトールおよびガラクチトール（ズルシトール）が含まれる。
ガムには、これらに限定されないが、アラビアゴム、ジェランガム、グアーガム、ローカストビーンガム、アカシアガム、セルロースガムおよびキサンタンガムが含まれる。
ビタミンには、これらに限定されないが、ナイアシン、リボフラビン、パントテン酸、チアミン、葉酸、ビタミンＡ、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ルテイン、ゼアキサンチン、コリン、イノシトールおよびビオチンが含まれる。
食餌元素には、これらに限定されないが、カルシウム、鉄、マグネシウム、リン、カリウム、ナトリウム、亜鉛、銅、マンガン、セレン、塩素、ヨウ素、硫黄、コバルト、モリブデン、ニッケルおよび臭素が含まれる。
包装
本明細書で開示される消費可能な組成物の利益の１つは、それらがより簡素な包装を可能にすることである。一例では、本明細書で開示される消費可能な液体組成物は、透明な容器中に包装され得るが、それは、組成物における濁度の欠如が、より消費者訴求力のある製品を生じるからである。
消費可能な組成物は、冷蔵され得、冷凍され得、温かく貯蔵され得、室温で貯蔵され得、または加熱された温度で維持され得る。
ｒＯＶＤ組成物は、粉末、濃縮されたシロップ、消費可能な食品製品、飲料、すぐに食べられる食料品、成分、または完成製品として包装され得る。
組換えＯＶＤおよびＯＶＬ
本明細書に記載される任意の組成物では、タンパク質は、宿主細胞において組換え発現され得る。組換えタンパク質は、ＯＶＤ、第１の非組換えタンパク質（例えば、ＯＶＤ）および第２の組換えタンパク質、例えば、リゾチーム（例えば、ｒＯＶＬ）であり得、またはＯＶＤおよび少なくとも１種の第２のタンパク質が共に、組換え産生され得る（例えば、ｒＯＶＤおよびｒＯＶＬ）。
ｒＯＶＤまたはｒＯＶＬは、任意の種由来のアミノ酸配列を有し得る。例えば、ｒＯＶＤは、鳥（鳥類）または爬虫類またはカモノハシにとってネイティブなＯＶＤのアミノ酸配列を有し得、ｒＯＶＬは、鳥または爬虫類またはカモノハシにとってネイティブなＯＶＬのアミノ酸配列を有し得る。鳥類ＯＶＤおよび／またはＯＶＬ由来のアミノ酸配列を有するｒＯＶＤおよび／またはｒＯＶＬは、家禽（ｐｏｕｌｔｒｙ）、家禽（ｆｏｗｌ）、水鳥、狩猟鳥、ニワトリ、ウズラ、シチメンチョウ、ヒメコンドル、ハチドリ、アヒル、ダチョウ、ガチョウ、カモメ、ホロホロチョウ、キジ、エミュー、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。ｒＯＶＤおよび／またはｒＯＶＬは、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓなどの単一の種にとってネイティブなアミノ酸配列を有し得る。あるいは、ｒＯＶＤおよび／またはｒＯＶＬは、２つまたはそれよりも多くの種にとってネイティブなアミノ酸配列を有し得、したがって、ハイブリッドであり得る。
本明細書で企図される例示的なＯＶＤおよびＯＶＬのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１～４４および４５～５１として、以下の表１に提供される。
表1:配列
Figure 2022539879000002
Figure 2022539879000003
Figure 2022539879000004
Figure 2022539879000005
Figure 2022539879000006
ｒＯＶＤまたはｒＯＶＬは、さらなる配列を含み得る。宿主細胞、例えば、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種におけるｒＯＶＤおよびｒＯＶＬの発現は、転写後または翻訳後改変の一部として、ＯＶＤまたはＯＶＬ配列へのペプチドの付加をもたらし得る。かかるペプチドは、ネイティブＯＶＤまたはＯＶＬ配列の一部でなくてもよい。例えば、Ｐｉｃｈｉａ種、例えば、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉおよびＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおいてＯＶＤ配列を発現させることは、Ｎ末端またはＣ末端におけるペプチドの付加をもたらし得る。一部の場合には、テトラペプチドＥＡＥＡ（配列番号５３）が、宿主細胞における発現の際に、ＯＶＤ配列のＮ末端に付加される。一部の実施形態では、ｒＯＶＤもしくはｒＯＶＬまたはそれら両方が、Ｎ末端においてアミノ酸ＥＡＥＡを含む。ＯＶＤまたはＯＶＬタンパク質配列は、宿主細胞からの分泌を指示するためなどのシグナル配列を含み得る。一部の場合には、シグナル配列は、ネイティブシグナル配列であり得る。一部の場合には、シグナル配列は、異種シグナル配列であり得る。例えば、アルファ接合因子シグナル配列が、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．などの酵母細胞における発現および分泌のために、ＯＶＤまたはＯＶＬ配列に融合され得る。一部の場合には、シグナル配列は、タンパク質、例えば、ｒＯＶＤまたはｒＯＶＬが宿主細胞から分泌されると、全体的にまたは部分的に除去される。
ｒＯＶＤおよび／またはｒＯＶＬは、ＯＶＤおよび／またはＯＶＬの天然に存在しないバリアントであり得る。かかるバリアントは、ネイティブＯＶＤまたはネイティブＯＶＬ配列と比較して、１つまたは複数のアミノ酸挿入、欠失または置換を含み得る。
かかるｒＯＶＤバリアントは、配列番号１～４４と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し得る。ｒＯＶＬバリアントは、配列番号４５～５１と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し得る。用語「配列同一性」は、アミノ酸配列の文脈で本明細書で使用される場合、配列をアラインさせ、最大のパーセント配列同一性を達成するために必要に応じてギャップを導入した後の、いずれの保存的置換も配列同一性の一部とみなさない、選択された配列中のアミノ酸残基と同一な候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定することを目的としたアラインメントは、例えば、公に利用可能なコンピューターソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して、当業者の技術範囲内の種々の方法で達成され得る。当業者は、比較されている配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含め、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。
一部の実施形態では、バリアントは、さらなる特色、例えば、低減されたアレルゲン性を付与するものである。例えば、ｒＯＶＤは、配列番号２の野生型ＯＶＤ配列と比較して、Ｇ１６２Ｍおよび／またはＦ１６７Ａを含み得（例えば、配列番号３）、野生型ＯＶＤ配列と比較して、低減されたアレルゲン性を有する。
ｒＯＶＤおよび／またはｒＯＶＬを発現させるために使用される宿主生物に依存して、ｒＯＶＤおよび／またはｒＯＶＬは、野生型ＯＶＤ（例えば、ネイティブＯＶＤ）または野生型ＯＶＬ（例えば、ネイティブＯＶＬ）とは異なるグリコシル化、アセチル化またはリン酸化パターンを有し得る。例えば、本明細書のｒＯＶＤおよび／またはｒＯＶＬは、グリコシル化、アセチル化またはリン酸化されていてもいなくてもよい。ｒＯＶＤおよび／またはｒＯＶＬは、鳥類、非鳥類、微生物、非微生物、哺乳動物または非哺乳動物のグリコシル化、アセチル化またはリン酸化パターンを有し得る。
ｒＯＶＤおよび／またはｒＯＶＬは、宿主細胞において組換え発現される。本明細書で使用される場合、「宿主」または「宿主細胞」は、本明細書で、所望の産物を産生するために選択または遺伝子改変された任意のタンパク質産生宿主を示す。例示的な宿主には、真菌、例えば、糸状菌、ならびに細菌、酵母、植物、昆虫および哺乳動物細胞が含まれる。宿主細胞は、Ａｒｘｕｌａ ｓｐｐ．、Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ．、Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｓｐｐ．、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｇａｒｉｃｕｓ ｓｐｐ．、Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐｐ．、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｄｅｓ、Ｅｎｄｏｔｈｉａ ｓｐｐ．、Ｅｎｄｏｔｈｉａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ、Ｍｕｃｏｒ ｓｐｐ．、Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ、Ｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｐ．、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｎｅｓｃｅｎｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ （Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ） ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏ ｓｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｓｐｐ．、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｓｐｐ．、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐ．、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｌｔｒｏｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉまたはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｅｕｓであり得る。宿主細胞は、米国食品医薬品局によって概して安全とみなされて承認された生物であり得る。
組換えタンパク質は、酵母、糸状菌または細菌において組換え発現され得る。一部の実施形態では、組換えタンパク質は、Ｐｉｃｈｉａ種（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉおよびＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種またはＥ．ｃｏｌｉ種において組換え発現される。
宿主細胞は、１つまたは複数の発現カセットを含むように形質転換され得る。例として、宿主細胞は、１つの発現カセット、２つの発現カセット、３つの発現カセットまたはそれよりも多くの発現カセットを発現するように形質転換され得る。
一部の場合には、ｒＯＶＤおよび／またはｒＯＶＬは、脱グリコシル化され得もしくはそのグリコシル化において改変され得（例えば、化学的に、エンドグルカナーゼ（例えば、ＥｎｄｏＨ）、エンドグリコシダーゼ、マンノシダーゼ（例えば、アルファ－１，２マンノシダーゼ）、ＰＮＧアーゼＦ、Ｏ－グリコシダーゼ、ＯＣＨ１、ノイラミニダーゼ、β，１－４ガラクトシダーゼ、β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼなどを介して酵素的に）、脱アセチル化され得（例えば、タンパク質デアセチラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、サーチュイン）、または脱リン酸化され得る（例えば、酸性ホスファターゼ、ラムダタンパク質ホスファターゼ、仔ウシ腸ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ）。脱グリコシル化、脱アセチル化または脱リン酸化は、より均一なタンパク質を産生し得、または変形形態が少ない組成物を産生することが可能である。
本開示は、タンパク質の１つもしくは複数の機能的特徴および／またはその産生を変更または増強するために、組換えＯＶＤのグリコシル化を改変することを企図する。宿主細胞は、オボムコイドのグリコシル化パターンを改変する異種酵素を含み得る。一部の場合には、１つまたは複数の酵素が、ｒＯＶＤタンパク質のグリコシル化を改変するために使用され得る。ｒＯＶＤのグリコシル化を改変するために使用される酵素は、酵素、または酵素を含む融合タンパク質、または酵素の活性断片であり得、例えば、ＥｎｄｏＨ、またはＯＣＨ１のＥｎｄｏＨへの融合物（例えば、ＥｎｄｏＨ酵素のゴルジ保持を提供するため）が、宿主細胞において提供され得る。
ニワトリまたは他の鳥類卵から単離されたものなどのネイティブオボムコイド（ｎＯＶＤ）は、高度に複雑な分岐鎖形態のグリコシル化を有する。グリコシル化パターンは、Ｎ－結合型グリカン構造、例えば、Ｎ－アセチルグルコサミン単位およびＮ－結合型マンノース単位を含む。例えば、図１Ｂ（左側の列）を参照のこと。一部の場合には、本明細書で開示される消費可能な組成物における使用のための、本明細書に記載される方法を使用して産生されるｒＯＶＤは、ｎＯＶＤのグリコシル化パターンとは異なるグリコシル化パターンを有する。例えば、ｒＯＶＤがＰｉｃｈｉａ ｓｐ．において産生される場合、このタンパク質は、高度にグリコシル化され得る。図１Ｃは、複雑な分岐鎖グリコシル化パターンを示す、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって産生されたｒＯＶＤのグリコシル化パターンを示す。本明細書の組成物および方法の一部の実施形態では、ｒＯＶＤは、グリコシル化パターンがｎＯＶＤのグリコシル化パターンから改変され、かかる処置なしでＰｉｃｈｉａ ｓｐ．によって産生されたｒＯＶＤと比較しても改変されるように、処置される。一部の場合には、ｒＯＶＤは、グリコシル化を有さない。他の場合には、ｒＯＶＤは、低減されたグリコシル化を有する。一部の場合には、ｒＯＶＤは、タンパク質の１つまたは複数のアスパラギン残基においてＮ－アセチルグルコサミンによって改変され、Ｎ－結合型マンノシル化を欠如するまたはＮ－結合型マンノシル化を実質的に欠く。例えば、図１Ｂ（右側の列）を参照のこと。本明細書に記載されるグリコシル化における変化は、他の形態のタンパク質、例えば、乳清タンパク質、ダイズタンパク質、エンドウマメタンパク質およびｎＯＶＤと比較して、ｒＯＶＤの溶解度および透明度における増加をもたらし得る。
一部の場合には、グリコシル化を改変するために使用される酵素は、宿主細胞中に形質転換され得る。一部の場合には、グリコシル化を改変するために使用される酵素は、ｒＯＶＤを産生する同じ宿主細胞中に形質転換され得る。一部の場合には、酵素は、例えば、誘導性発現系によって、宿主細胞に一過的に提供され得る。一部の場合には、宿主細胞がグリコシル化を改変するために使用される酵素を発現する場合、組換えタンパク質（例えば、ｒＯＶＤおよびｒＯＶＬ）は、改変状態で宿主細胞から分泌される。
一例では、ＯＶＤを産生する宿主細胞は、ＥｎｄｏＨ酵素およびＯＣＨ１酵素の融合物を含む。例示的なＯＣＨ１－ＥｎｄｏＨタンパク質配列は、配列番号５２として提供される。かかる場合には、宿主細胞から産生されたｒＯＶＤは、かかる酵素なしの細胞において産生されたｒＯＶＤとは実質的に異なるグリコシル化パターンを含む。かかる場合に産生されたｒＯＶＤは、ネイティブＯＶＤ（例えば、ニワトリまたは他の鳥類卵によって産生されたもの）と比較しても、実質的に異なる。図１Ｂは、ｎＯＶＤ（マンノース残基あり）とｒＯＶＤグリコシル化パターンとの比較を示し、ここで、ｒＯＶＤは、ＥｎｄｏＨで処置されており、アスパラギンにおいてＮ－アセチルグルコサミン残基を含むが、マンノース残基は含まない。図１Ｃは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓなどの宿主細胞において産生されたｒＯＶＤのグリコシル化パターンを示し、ここで、ｒＯＶＤは、ＥｎｄｏＨで処置されておらず、Ｎ－アセチルグルコサミン残基ならびにＮ－結合型マンノース残基の鎖の両方を有する。ｒＯＶＤのグリコシル化の改変は、ｒＯＶＤに、栄養的利益、例えば、より高い窒素の炭素に対する比を提供し得、タンパク質の透明度および溶解度を改善し得る。一部の場合には、ｒＯＶＤのグリコシル化の改変は、ｒＯＶＤが宿主細胞から分泌される前および／またはｒＯＶＤを単離する前に、ｒＯＶＤを産生する宿主細胞内で実施される。一部の場合には、ｒＯＶＤのグリコシル化の改変は、その分泌後および／または宿主細胞からｒＯＶＤを単離した後に実施される。
分子量またはｒＯＶＤは、ｎＯＶＤと比較して異なり得る。このタンパク質の分子量は、ｎＯＶＤの分子量よりも小さい、またはｒＯＶＤのグリコシル化が改変されない宿主細胞によって産生されたｒＯＶＤよりも小さい場合がある。実施形態では、ｒＯＶＤの分子量は、２０ｋＤａと４０ｋＤａとの間であり得る。一部の場合には、改変されたグリコシル化を有するｒＯＶＤは、例えば、ネイティブＯＶＤ（鳥類宿主種によって産生されたもの）と比較して、またはｒＯＶＤがＮ－結合型マンノシル化を含む場合など、ｒＯＶＤをグリコシル化する宿主細胞と比較して、異なる分子量を有する。一部の場合には、ｒＯＶＤの分子量は、翻訳後改変を完全に欠くｒＯＶＤ、または全ての形態のＮ－結合型グリコシル化を欠如するｒＯＶＤの分子量よりも大きい。
ｒＯＶＤまたはｒＯＶＬの発現は、発現ベクター、プラスミド、宿主ゲノム中に組み込まれた核酸、または他の手段によって提供され得る。例えば、発現のためのベクターは、（ａ）プロモーターエレメント、（ｂ）シグナルペプチド、（ｃ）異種ＯＶＤまたはＯＶＬ配列、および（ｄ）ターミネーターエレメントを含み得る。
ＯＶＤおよびＯＶＬの発現のために使用され得る発現ベクターには、エレメント（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を有する発現カセットを含有する発現ベクターが含まれる。一部の実施形態では、シグナルペプチド（ｃ）は、ベクター中に必ずしも含まれない。一般に、発現カセットは、同族宿主微生物のゲノム中に組み込まれた場合に、導入遺伝子の転写を媒介するように設計される。
宿主微生物中への形質転換前のベクターの増幅を助けるために、複製起点（ｅ）がベクター中に含有され得る（例えば、ＰＵＣ＿ＯＲＩＣおよびＰＵＣ（ＤＮＡ２．０））。発現ベクターで安定に形質転換された微生物の選択を助けるために、ベクターは、選択マーカー（ｆ）、例えば、ＵＲＡ３遺伝子およびＺｅｏｃｉｎ耐性遺伝子（ＺｅｏＲ）もまた含み得る。発現ベクターは、宿主ゲノム中への発現ベクターの安定な組み込みを促進するために、宿主微生物中への形質転換前に発現ベクターの線状化を可能にする制限酵素部位（ｇ）もまた含有し得る。一部の実施形態では、発現ベクターは、エレメント（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）のいずれもない場合を含む、エレメント（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）の任意のサブセットを含有し得る。当業者に公知の他の発現エレメントおよびベクターエレメントは、本明細書に記載されるエレメントと組み合わせて使用され得る、またはかかるエレメントを置換し得る。
例示的なプロモーターエレメント（ａ）には、これらに限定されないが、構成的プロモーター、誘導性プロモーターおよびハイブリッドプロモーターが含まれ得る。プロモーターには、これらに限定されないが、ａｃｕ－５、ａｄｈ１＋、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＡＤＨ４）、ＡＨＳＢ４ｍ、ＡＩＮＶ、ａｌｃＡ、α－アミラーゼ、代替オキシダーゼ（ＡＯＤ）、アルコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸ１）、アルコールオキシダーゼ２（ＡＯＸ２）、ＡＸＤＨ、Ｂ２、ＣａＭＶ、セロビオヒドロラーゼＩ（ｃｂｈ１）、ｃｃｇ－１、ｃＤＮＡ１、細胞性線維ポリペプチド（ｃｆｐ）、ｃｐｃ－２、ｃｔｒ４＋、ＣＵＰ１、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＡＳ）、エノラーゼ（ＥＮＯ、ＥＮＯ１）、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦＬＤ１）、ＦＭＤ、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＭＤＨ）、Ｇ１、Ｇ６、ＧＡＡ、ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ３、ＧＡＬ４、ＧＡＬ５、ＧＡＬ６、ＧＡＬ７、ＧＡＬ８、ＧＡＬ９、ＧＡＬ１０、ＧＣＷ１４、ｇｄｈＡ、ｇｌａ－１、α－グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄＡ、ＧＡＰ、ＧＡＰＤＨ）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＧＰＭ１）、グリセロールキナーゼ（ＧＵＴ１）、ＨＳＰ８２、ｉｎｖｌ＋、イソクエン酸リアーゼ（ＩＣＬ１）、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ｉｓｏｍｅｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）（ＩＬＶ５）、ＫＡＲ２、ＫＥＸ２、β－ガラクトシダーゼ（ｌａｃ４）、ＬＥＵ２、ｍｅｌＯ、ＭＥＴ３、メタノールオキシダーゼ（ＭＯＸ）、ｎｍｔ１、ＮＳＰ、ｐｃｂＣ、ＰＥＴ９、ペルオキシン（ｐｅｒｏｘｉｎ）８（ＰＥＸ８）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ、ＰＧＫ１）、ｐｈｏ１、ＰＨＯ５、ＰＨＯ８９、ホスファチジルイノシトールシンターゼ（ＰＩＳ１）、ＰＹＫ１、ピルビン酸キナーゼ（ｐｋｉ１）、ＲＰＳ７、ソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）、３－ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ＳＥＲ１）、ＳＳＡ４、ＳＶ４０、ＴＥＦ、翻訳伸長因子１アルファ（ＴＥＦ１）、ＴＨＩ１１、ホモセリンキナーゼ（ＴＨＲ１）、ｔｐｉ、ＴＰＳ１、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ１）、ＸＲＰ２、ＹＰＴ１、配列番号１２１～１３２から選択される配列またはサブ配列、およびそれらの任意の組合せが含まれる。例示的な誘導性プロモーターには、メタノール誘導性プロモーター、例えば、ＤＡＳ１およびｐＰＥＸ１１が含まれる。
シグナル配列、標的化シグナル、局在化シグナル、局在化配列、シグナルペプチド、輸送ペプチド、リーダー配列またはリーダーペプチドとしても公知のシグナルペプチド（ｂ）は、タンパク質またはポリヌクレオチドの分泌を支持し得る。組換えタンパク質または宿主細胞から異種発現されたタンパク質の細胞外分泌は、タンパク質精製を促進し得る。シグナルペプチドは、タンパク質の前駆体（例えば、プレプロペプチド、プレタンパク質）に由来し得る。シグナルペプチドは、ネイティブＯＶＤおよび／またはＯＶＬ中のシグナルペプチド以外のタンパク質の前駆体に由来し得る。
ＯＶＤおよび／またはＯＶＬをコードする任意の核酸配列が、（ｃ）として使用され得る。好ましくは、かかる配列は、宿主細胞のためにコドン最適化される。
例示的な転写ターミネーターエレメントには、これらに限定されないが、ａｃｕ－５、ａｄｈ１＋、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＡＤＨ４）、ＡＨＳＢ４ｍ、ＡＩＮＶ、ａｌｃＡ、α－アミラーゼ、代替オキシダーゼ（ＡＯＤ）、アルコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸ１）、アルコールオキシダーゼ２（ＡＯＸ２）、ＡＸＤＨ、Ｂ２、ＣａＭＶ、セロビオヒドロラーゼＩ（ｃｂｈ１）、ｃｃｇ－１、ｃＤＮＡ１、細胞性線維ポリペプチド（ｃｆｐ）、ｃｐｃ－２、ｃｔｒ４＋、ＣＵＰ１、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＡＳ）、エノラーゼ（ＥＮＯ、ＥＮＯ１）、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦＬＤ１）、ＦＭＤ、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＭＤＨ）、Ｇ１、Ｇ６、ＧＡＡ、ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ３、ＧＡＬ４、ＧＡＬ５、ＧＡＬ６、ＧＡＬ７、ＧＡＬ８、ＧＡＬ９、ＧＡＬ１０、ＧＣＷ１４、ｇｄｈＡ、ｇｌａ－１、α－グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄＡ、ＧＡＰ、ＧＡＰＤＨ）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＧＰＭ１）、グリセロールキナーゼ（ＧＵＴ１）、ＨＳＰ８２、ｉｎｖｌ＋、イソクエン酸リアーゼ（ＩＣＬ１）、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ＩＬＶ５）、ＫＡＲ２、ＫＥＸ２、β－ガラクトシダーゼ（ｌａｃ４）、ＬＥＵ２、ｍｅｌＯ、ＭＥＴ３、メタノールオキシダーゼ（ＭＯＸ）、ｎｍｔ１、ＮＳＰ、ｐｃｂＣ、ＰＥＴ９、ペルオキシン８（ＰＥＸ８）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ、ＰＧＫ１）、ｐｈｏ１、ＰＨＯ５、ＰＨＯ８９、ホスファチジルイノシトールシンターゼ（ＰＩＳ１）、ＰＹＫ１、ピルビン酸キナーゼ（ｐｋｉ１）、ＲＰＳ７、ソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）、３－ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ＳＥＲ１）、ＳＳＡ４、ＳＶ４０、ＴＥＦ、翻訳伸長因子１アルファ（ＴＥＦ１）、ＴＨＩ１１、ホモセリンキナーゼ（ＴＨＲ１）、ｔｐｉ、ＴＰＳ１、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ１）、ＸＲＰ２、ＹＰＴ１、およびそれらの任意の組合せが含まれる。
例示的な選択可能なマーカー（ｆ）には、これらに限定されないが、抗生物質耐性遺伝子（例えば、ｚｅｏｃｉｎ、アンピシリン、ブラストサイジン、カナマイシン、ノーセオスリシン（nurseothricin）、クロラムフェニコール（chloroamphenicol）、テトラサイクリン、トリクロサン、ガンシクロビル、およびそれらの任意の組合せ）、栄養要求性マーカー（例えば、ａｄｅ１、ａｒｇ４、ｈｉｓ４、ｕｒａ３、ｍｅｔ２、およびそれらの任意の組合せ）が含まれ得る。
一例では、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．における発現のためのベクターは、ＯＶＤおよび／またはＯＶＬをコードする核酸配列とインフレームで融合させたシグナルペプチド（アルファ接合因子）に作動可能に連結したＡＯＸ１プロモーター、ならびにＯＶＤおよび／またはＯＶＬをコードする核酸配列のすぐ下流のターミネーターエレメント（ＡＯＸ１ターミネーター）を含み得る。
別の例では、ＤＡＳ１プロモーターを含むベクターは、ＯＶＤおよび／またはＯＶＬをコードする核酸配列とインフレームで融合させたシグナルペプチド（アルファ接合因子）、ならびにＯＶＤおよび／またはＯＶＬのすぐ下流のターミネーターエレメント（ＡＯＸ１ターミネーター）に作動可能に連結される。
本明細書に記載される組換えタンパク質は、１つまたは複数の宿主細胞から分泌され得る。一部の実施形態では、ｒＯＶＤおよび／またはｒＯＶＬタンパク質は、宿主細胞から分泌される。分泌されたｒＯＶＤおよび／またはｒＯＶＬは、遠心分離、分画、濾過、親和性精製などの方法、ならびに細胞、液体および固体培地構成成分ならびに他の細胞性産物および副産物からタンパク質を分離するための他の方法によって、単離および精製され得る。一部の実施形態では、ｒＯＶＤおよび／またはｒＯＶＬは、Ｐｉｃｈｉａ Ｓｐ．において産生され、宿主細胞から培養培地中に分泌される。次いで、分泌されたｒＯＶＤおよび／またはｒＯＶＬは、さらなる使用のために、他の培地構成成分から分離される。
一部の場合には、ＯＶＤを含む複数のベクターが、１つまたは複数の宿主細胞中にトランスフェクトされ得る。宿主細胞は、１つよりも多くのコピーのＯＶＤを含み得る。単一の宿主細胞は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０コピーのＯＶＤを含み得る。単一の宿主細胞は、ＯＶＤの発現のための１つまたは複数のベクターを含み得る。単一の宿主細胞は、ＯＶＤ発現のための２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のベクターを含み得る。宿主細胞中の各ベクターは、同じプロモーターを使用してＯＶＤの発現を駆動し得る。あるいは、異なるプロモーターが、ＯＶＤ発現のために異なるベクターにおいて使用され得る。
本明細書の消費可能な製品ならびにｒＯＶＤおよび／またはｒＯＶＬ組成物は、いずれの微生物細胞も微生物細胞夾雑物も本質的に含まないことができる。例えば、ｒＯＶＤおよび／またはｒＯＶＬは、成長した微生物を含む培養物から単離され得る。
ｒＯＶＤは、消費可能な組成物における使用のために精製される前に、化学的または酵素的に処置され得る。かかる処置は、ｒＯＶＤタンパク質組成物中の不純物を低減させるために実施され得る。かかる処置は、ｒＯＶＤタンパク質組成物の官能性状を改善するために実施され得る。処置には、これらに限定されないが、精製ステップ、濾過、化学的処置および酵素的処置が含まれ得る。
一部の場合には、改変されたグリコシル化を有するｒＯＶＤの形態（例えば、Ｎ－アセチルグルコサミンを有するが、Ｎ－結合型マンノース残基を欠如するような形態）が含まれるｒＯＶＤタンパク質およびｒＯＶＤタンパク質を含む組成物は、ｒＯＶＤ組成物の構成成分、例えば不純物を改変するために、酸化剤または酸素生成剤で処置され得る。酸化剤または酸素生成剤は、過酸化水素、過炭酸ナトリウム、活性二酸化塩素、気泡型酸素またはオゾンを含み得る。処置は、ｒＯＶＤ組成物の溶解度および透明度を改善し得る。処置は、ｒＯＶＤ組成物の臭気を低減させ得る。処置は、ｒＯＶＤ組成物の色を中和し得る；例えば、ｒＯＶＤ組成物は、例えば、あまり強くない／より明るい着色へと、処置後に色を失い得る。実施形態では、色は、緑色がかった色から黄色がかった色へと、および／または黄色がかった色から本質的に無色へと、変化し得る。
一部の例では、ｒＯＶＤは、消費可能な組成物における使用のために精製される前に、酸化剤または酸素生成剤、例えば、過酸化水素または過炭酸ナトリウムで処置され得る。分泌または単離されたｒＯＶＤを含む培養培地は、酸素生成剤、例えば、過酸化水素または過炭酸ナトリウムで処置され得る。例として過酸化水素を使用する場合、過酸化水素処置の後には、得られたｒＯＶＤ組成物から過酸化水素を除去するための、１つまたは複数の洗浄ステップおよび／または濾過ステップが続き得る。かかるステップは、他の酸素生成剤、例えば、過炭酸ナトリウムによる処置後に実施され得る。
一部の場合には、ｒＯＶＤを処置するために使用される過酸化水素の濃度は、１％～２０％であり得る。ｒＯＶＤを処置するために使用される過酸化水素の濃度は、少なくとも１％であり得る。ｒＯＶＤを処置するために使用される過酸化水素の濃度は、多くても２０％であり得る。ｒＯＶＤを処置するために使用される過酸化水素の濃度は、総重量当たりの重量（ｗ／ｗ）および／または総体積当たりの重量（ｗ／ｖ）で、１％～２％、１％～５％、１％～７％、１％～１０％、１％～１２％、１％～１５％、１％～１７％、１％～２０％、２％～５％、２％～７％、２％～１０％、２％～１２％、２％～１５％、２％～１７％、２％～２０％、５％～７％、５％～１０％、５％～１２％、５％～１５％、５％～１７％、５％～２０％、７％～１０％、７％～１２％、７％～１５％、７％～１７％、７％～２０％、１０％～１２％、１０％～１５％、１０％～１７％、１０％～２０％、１２％～１５％、１２％～１７％、１２％～２０％、１５％～１７％、１５％～２０％または１７％～２０％であり得る。ｒＯＶＤを処置するために使用される過酸化水素の濃度は、約１％、２％、５％、７％、１０％、１２％、１５％、１７％または２０％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖであり得る。ｒＯＶＤを処置するために使用される過酸化水素の濃度は、少なくとも１％、２％、５％、７％、１０％、１２％、１５％または１７％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖであり得る。ｒＯＶＤを処置するために使用される過酸化水素の濃度は、多くても２％、５％、７％、１０％、１２％、１５％、１７％または２０％ ｗ／ｗまたはｗ／ｖであり得る。
ｒＯＶＤは、限定された持続時間にわたって、過酸化水素で処置され得る。例えば、ｒＯＶＤは、少なくとも１時間、２時間、３時間、５時間、７時間、１０時間、１２時間、１５時間、１７時間、２０時間、２２時間、２４時間、２６時間、２８時間、３０時間、３４時間、３６時間、４０時間、４４時間または４８時間にわたって、過酸化水素に曝露され得る。過酸化水素は、培養プロセスを通じて、ｒＯＶＤ培養培地に添加され得る。
ｒＯＶＤは、約３～６のｐＨで、過酸化水素で処置され得る。ｒＯＶＤは、約３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．１、４．２、４．４、４．６、４．８、５、５．２、５．４、５．６、５．８または６のｐＨで、過酸化水素で処置され得る。ｒＯＶＤは、少なくとも３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．１、４．２、４．４、４．６、４．８、５、５．２、５．４、５．６または５．８のｐＨで、過酸化水素で処置され得る。ｒＯＶＤは、多くても３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．１、４．２、４．４、４．６、４．８、５、５．２、５．４、５．６、５．８または６のｐＨで、過酸化水素で処置され得る。
ｒＯＶＤは、酸素生成剤による処置の前に濾過され得る。一部の場合には、ｒＯＶＤは、酸素生成剤による処置の前および後に濾過され得る。
定義
本明細書で使用される用語法は、特定の例を記載することのみを目的としているのであって、限定は意図しない。
本明細書で使用される場合、他に示されない限り、用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に他を示さない限り、複数形ならびに単数形を含む意図である。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」、またはそれらの異形は、本開示および／または特許請求の範囲のいずれにおいて使用される場合にも、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と類似の様式で、包含的であることを意図する。
用語「約」または「およそ」は、その値がどのように測定または決定されるか、例えば、測定システムの限界に一部依存する、当業者によって決定される特定の値についての許容誤差範囲内であることを意味する。例えば、「約」は、述べられた値よりも１０％大きいまたは小さいことを意味し得る。別の例では、「約」は、所与の値における慣行に従って、１標準偏差以内であること、または１標準偏差よりも大きいことを意味し得る。特定の値が本出願および特許請求の範囲において記載される場合、他に述べられない限り、用語「約」は、特定の値についての許容誤差範囲を意味するとみなすべきである。
用語「実質的に」は、大部分は、かなりの程度であること；または本質的に、を意味する。言い換えると、実質的に、という用語は、所望の性状とほとんど同じであること、または正確な性状とは僅かに異なることを意味し得る。実質的に、は、所望の性状から区別できなくてもよい。実質的に、は、所望の性状から区別できてもよいが、その差異は、重要でないかまたは無視できる。
本明細書に記載される任意の態様または実施形態は、本明細書で開示される任意の他の態様または実施形態と組み合わされ得る。
以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を例示することを目的として与えられるのであって、本発明をいずれの様式でも限定しない意味である。本明細書の実施例は、本明細書に記載される方法と共に、好ましい実施形態を本明細書で代表し、例示的であり、本発明の範囲に対する限定を意図しない。特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に包含されるその中の変化および他の使用は、当業者に明らかである。
（実施例１）
発現構築物、形質転換、タンパク質精製および処理
２つの発現構築物を、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＯＶＤ（配列番号１）の発現のために創出した。第１の構築物は、アルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモーターを含んだ。ＯＶＤコード配列を、プロモーター配列の下流でアルファ接合因子シグナル配列とインフレームで融合させた。ＡＯＸ１遺伝子由来の転写ターミネーターを、ＯＶＤ配列の下流に配置した。発現構築物を、Ｋｐａｓ－ＵＲＡ ３ベクター中に配置した。
第１の発現構築物中と同じＯＶＤタンパク質配列をコードする核酸配列とインフレームで融合させたアルファ接合因子シグナル配列の上流のメタノール誘導性ＤＡＳ１プロモーター（ＡＴＣＣ番号２８４８５）を含有する第２の発現構築物を創出した。ＡＯＸ１遺伝子由来の転写ターミネーターを、ＯＶＤ配列の下流に配置した。
両方の発現構築物において、ＯＶＤ配列は、配列番号１のアミノ酸配列を有する、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）のものであった。
両方の発現構築物を、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ中に形質転換した。２つの構築物の首尾よい組み込みを、ゲノム配列決定によって確認した。
発酵：各発現構築物からの組換えＯＶＤ（ｒＯＶＤ）を、周囲条件において生物反応器中で産生した。発酵プロセスのためのシードトレイン（ｓｅｅｄ ｔｒａｉｎ）を、液体成長ブロスによる振盪フラスコの接種で開始した。接種された振盪フラスコを、シェイカー中で維持し、その後、成長したＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓを産生規模の反応器に移した。
培養物を、設定されたｐＨおよび溶存酸素（ＤＯ）において、３０℃で成長させた。培養物に炭素供給源を供給した。
分泌されたｒＯＶＤを、液体成長ブロスから細胞を分離し、複数回の濾過ステップを実施し、クロマトグラフィーを実施し、最終タンパク質産物を乾燥させて純粋なｒＯＶＤ粉末を産生することによって精製した。
（実施例２）
発現構築物、形質転換、タンパク質精製および処理
３つの発現構築物を、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおける成熟形態のＯＶＤ（配列番号１）の発現のために創出した。第１の構築物は、ＡＯＸ１プロモーターを含んだ。ＯＶＤコード配列を、プロモーター配列（配列番号３９）の下流でアルファ接合因子シグナル配列とインフレームで融合させた。ＡＯＸ１遺伝子由来の転写ターミネーターを、ＯＶＤ配列の下流に配置した。宿主細胞は、１１コピーのＯＶＤを有し、そのうち１０コピーは、ハイブリッドプロモーター系中にあり、５つは短縮されたｐＡＯＸ１によって駆動された。１１番目のコピーは、フルサイズのｐＡＯＸ１プロモーターによって駆動された。
強いメタノール誘導性プロモーターの制御下にＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ転写因子ＨＡＣ１をコードする核酸を含有する第２の発現構築物を創出した。ＡＯＸ１遺伝子由来の転写ターミネーターを、ＨＡＣ１配列の下流に配置した。
融合タンパク質をコードする第３の発現構築物を創出した。この構築物は、強いメタノール誘導性プロモーターｐＰＥＸ１１の下の、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｆｌａｖｕｓ ＥｎｄｏＨの触媒的に活性なバージョン（配列番号５２）に融合されたＰｉｃｈｉａ ＯＣＨ１タンパク質の最初の４８残基をコードする核酸を含む。ＡＯＸ１遺伝子由来の転写ターミネーターを、ＥｎｄｏＨ－ＯＣＨ１融合タンパク質配列の下流に配置した。
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を改変して、細胞質キラープラスミドを除去し、次いで、ＡＯＸ１遺伝子中に欠失を有するようにさらに改変した。この欠失は、メタノールを消費するその株の能力を低減させるメタノール利用緩慢（ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｌｏｗ）（ｍｕｔＳ）表現型を生じた。この基準株を、３つの発現構築物で形質転換した。
メタノール誘導性プロモーター：ＳｃＰｒｅＰｒｏ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓプレプロ配列）：：オボムコイド：：ＡＯＸ１ｔｅｒｍの線状カセット；メタノール誘導性プロモーター：：ＨＡＣ１：：ＡＯＸ１ｔｅｒｍの線状カセット；およびメタノール誘導性プロモーター：：ＥｎｄｏＨ－ＯＣＨ１：：ＡＯＸ１ｔｅｒｍの線状カセットを、標準的な電気穿孔法を使用して、基準Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株中に導入した。図１Ａは、ｒＯＶＤの発現のために使用したベクター構築物を示す。
発酵：各発現構築物からの組換えＯＶＤを、周囲条件において生物反応器中で産生した。発酵プロセスのためのシードトレインを、液体成長ブロスによる振盪フラスコの接種で開始した。接種された振盪フラスコを、シェイカー中で維持し、その後、成長したＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓを産生規模の反応器に移した。
培養物を、設定されたｐＨおよび溶存酸素（ＤＯ）において、３０℃で成長させた。培養物に炭素供給源を供給した。
産生を拡大するために、ｒＯＶＤ Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ種株を、冷凍貯蔵から取り出し、室温に解凍する。解凍した種バイアルの内容物を使用して、バッフル付きフラスコ中の液体種培養培地に接種し、これを、振盪インキュベーター中で３０℃で成長させた。次いで、これらの種フラスコを、基礎塩培地、微量金属およびグルコースを含有する一連のだんだん大きくなる種発酵槽（数は規模に依存して変動する）に移し、そこで成長させる。種反応器中の温度を、３０℃、ｐＨ５および３０％のＤＯで制御する。ｐＨを、窒素供給源としても作用する水酸化アンモニウム（ammonia hydroxide）を供給することによって維持する。十分な細胞質量に達したところで、成長したｒＯＶＤ Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓを、基礎塩培地、微量金属およびグルコースを含有する産生規模の反応器中に接種する。種タンク中と同様、培養物をまた、プロセスを通じて、３０℃、ｐＨ５および３０％ＤＯで制御する。ｐＨを、水酸化アンモニウムを供給することによって再度維持する。初期バッチグルコース相の間に、培養物に、全てのグルコースおよび引き続いて産生されたエタノールを消費させる。標的細胞密度が達成され、グルコースおよびエタノール濃度がゼロであることが確認されたところで、グルコース流加成長相を開始する。この相では、培養物が標的細胞密度に達するまで、グルコースが供給される。グルコースは、ゼロでないグルコース濃度の存在下でエタノールが増大するのを防止するために、限定的な速度で供給される。最終誘導相では、培養物に、グルコース、およびｒＯＶＤを産生するように培養物を誘導するメタノールを共供給する。グルコースは、所望の成長速度を生じるような量で供給されるが、メタノールは、発現が一貫して誘導されることを確実にするために、１％のメタノール濃度を維持するように供給される。定期的な試料を、具体的なプロセスパラメーター（例えば、細胞密度、グルコース／メタノール濃度、産物力価および品質）の分析のために、発酵プロセスを通じて採取する。指定された量の発酵時間の後に、分泌されたｒＯＶＤを収集し、下流の処理のために移す。
ｒＯＶＤ産物を、液体成長ブロスから細胞を分離し、複数回の濾過ステップを実施し、クロマトグラフィーを実施し、および／または最終タンパク質産物を乾燥させて純粋なｒＯＶＤ粉末を産生することによって精製した。
ＯＣＨ１－ＥｎｄｏＨ融合タンパク質からの翻訳後改変は、アルファ因子プレプロ配列の除去を生じた。Ｎ末端配列決定の結果は、成熟ＯＶＤのアミノ酸配列（配列番号１）と比較して、産生されたｒＯＶＤのＮ末端にさらなる４つのアミノ酸残基（メジャー）（配列番号３７）または６つのアミノ酸残基（マイナー）（配列番号３８）を融合させる、Ｐｉｃｈｉａ宿主転写後機構によるＮ末端プロ配列の不正確な切断を示した。
Ｐｉｃｈｉａ由来のｒＯＶＤの分子量を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して、ネイティブニワトリオボムコイド（ｎＯＶＤ）に対して比較した。ｒＯＶＤは、移動における差異を示した。ゲル移動における差異が差次的な翻訳後グリコシル化に起因したかどうかを確認するために、脱グリコシル化されたネイティブオボムコイドを、タンパク質を特異的に脱グリコシル化する酵素であるＰＮＧアーゼＦ（ＢｉｏＬａｂｓ ２０２０）で処置し、ｒＯＶＤ試料と比較した。脱グリコシル化されたネイティブオボムコイド（ｎＯＶＤ＋ＰＮＧアーゼＦ）は、試験した３つのｒＯＶＤ試料と同じバンドパターンおよび分子量を示した（図１Ｄ）。グリコシル化における差異は、Ｐｉｃｈｉａ株におけるＯＣＨ１－ＥｎｄｏＨの作用に帰せられ、その結果、ｒＯＶＤは、ニワトリ卵白由来のｎＯＶＤの複雑な分岐鎖グリコシル化（マンノースを含む）ではなく、Ａｓｎ残基に結合したコアＮ－アセチルグルコサミン単位のみを有する（図１Ｂおよび図１Ｃ）。
ＥｎｄｏＨなしでＰｉｃｈｉａにおいて発現されたｒＯＶＤの質量分析解析は、８つの異なるＮ－グリカン構造を有することが示されている（図１Ｃ）。構造には、Ｍａｎ９ ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ９ ＧｌｃＮＡｃ２ Ｈｅｘ、Ｍａｎ９ ＧｌｃＮＡｃ２Ｈｅｘ２、Ｍａｎ９ ＧｌｃＮＡｃ２Ｈｅｘ３、Ｍａｎ９ ＧｌｃＮＡｃ２Ｈｅｘ４、Ｍａｎ９ ＧｌｃＮＡｃ２ Ｈｅｘ５、ｖ Ｍａｎ９ ＧｌｃＮＡｃ２Ｈｅｘ６およびＭａｎ９ ＧｌｃＮＡｃ２ Ｈｅｘ７が含まれる。以下の表２は、エンドグリコシダーゼ処置なしで産生されたｒＯＶＤ試料上のＮ－結合型グリカンのパーセンテージを示す。
Figure 2022539879000007
 （実施例３）
変動するｒＯＶＤ濃度における溶解度および透明度試験
凍結乾燥させたｒＯＶＤ（実施例２から）を、異なる濃度およびｐＨで水溶液（蒸留水）中にブレンドした。次いで、ｒＯＶＤ溶液の透明度および溶解度を、視覚的に（例えば、濁度、沈殿物、粘度および色について）、および６００ｎｍにおける吸光度を測定することによって、評価した。
図２は、脱イオン水中に４．２３％ ｗ／ｖのタンパク質濃度でｒＯＶＤを含む溶液の６００ｎｍにおける吸光度と比較した、脱イオン水の６００ｎｍにおける吸光度を示す。ｒＯＶＤ溶液は、４．１１のｐＨを有した。脱イオン水は、０．０３７の吸光度（ＯＤ６００）を有した。４．２３％ ｗ／ｖのｒＯＶＤを含む溶液は、０．０４７の吸光度、２７％の増加を有した。図２中のｒＯＶＤ溶液の写真は、沈殿物がなく、液体の外観および視覚的流動における明らかな粘度変化もない、透明な無色溶液を明らかにしている。
（実施例４）
変動する温度における溶解度および透明度試験
ｐＨ４．０６またはｐＨ６．３の、実施例３の水性３０％ｒＯＶＤ（ｗ／ｖ）試料を、室温でインキュベートし、３種の加熱処置：低温殺菌、熱間充填およびレトルトに供した。次いで、ｒＯＶＤの透明度および溶解度を、視覚的に（例えば、濁度、沈殿物、粘度および色について）、および６００ｎｍにおける吸光度を測定することによって、評価した。
各試料に対する加熱処置を、以下のように実施した：
低温殺菌について、試料を、７２℃に１分間加熱し、次いで、氷浴中に１０分間置いた。氷浴の後に、試料を室温に置き、次いで、溶解度および透明度について評価した。
熱間充填について、試料を、８５℃に３０秒間加熱し、次いで、溶解度および透明度の評価のために室温に置いた。
レトルトについて、試料を、１２１℃に１９ｐｓｉで１５分間加熱し、次いで、溶解度および透明度の評価のために室温で維持した。
図３は、脱イオン水中に３０％のｒＯＶＤを含むｒＯＶＤ溶液のｐＨ、吸光度および透明度についての結果を示す。ｒＯＶＤは、驚くべきことに、ｐＨ４．０６またはｐＨ６．３のいずれにおいても、３０％（タンパク質量に基づいてｗ／ｖ）で脱イオン水中で可溶性であった。ｐＨ４．０６およびｐＨ６．３の両方におけるｒＯＶＤ溶液の写真は、透明で、淡緑色かつ粘性に見えるが、加熱処置の前である「処理前」条件下ではそれほどではない。図３から、ｒＯＶＤは、３０％ ｗ／ｖのｒＯＶＤの濃度で、酸性（ｐＨ約４．０）溶液および僅かに酸性（ｐＨ約６）の溶液の両方において可溶性のままであり得ることが結論付けられ得る。より具体的には、ｐＨ４．０６における３０％のｒＯＶＤ溶液は、低温殺菌後には０．１０１のＯＤ６００を有し、熱間充填後には０．１０４のＯＤ６００を有した。あまり酸性でないｐＨ６．３では、低温殺菌後の３０％のｒＯＶＤ溶液のＯＤ６００は、０．０８９であり、熱間充填後には、０．０９４であった。このように、より高いｐＨ値では、ｒＯＶＤの透明度および溶解度はより高いようである。
図４は、図３のｐＨ４．０６実験からの写真を示す。図４から、ｒＯＶＤが、驚くべきことに、加熱適用後に、３０％ ｗ／ｖの溶液中に残存し得ることが結論付けられ得る。
（実施例５）
変動する温度およびｐＨにおける溶解度および透明度試験
凍結乾燥させたｒＯＶＤ（実施例２から）を、９％（ｗ／ｖ）の濃度で水溶液（蒸留水）中にブレンドした。クエン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ）を使用して、以下の表３に示されるように、溶液のｐＨを、２．５、４または６のｐＨに調整した。
Figure 2022539879000008
 表3: pH2.5、4または6におけるクエン酸緩衝液の組成
ｐＨ調整後、各ｐＨでの別々の水性ｒＯＶＤ試料を、室温でインキュベートし、３つの型の加熱処置：低温殺菌、熱間充填およびレトルトに供した（以下に記載される通り）。次いで、ｒＯＶＤの透明度および溶解度を、視覚的に（例えば、濁度、沈殿物、粘度および色について）、および６００ｎｍにおける吸光度を測定することによって、評価した。
各試料に対する加熱処置を、以下のように実施した：
低温殺菌について、試料を、７２℃に１分間加熱し、次いで、氷浴中に１０分間置いた。氷浴の後に、試料を室温に置き、次いで、溶解度および透明度について評価した。
熱間充填について、試料を、８５℃に３０秒間加熱し、次いで、溶解度および透明度の評価のために室温に置いた。
レトルトについて、試料を、１２１℃に１９ｐｓｉで１５分間加熱し、次いで、溶解度および透明度の評価のために室温で維持した。
試料の視覚的検査およびＯＤ６００測定の結果は、図５Ａおよび図５Ｂに提供される。
試料の写真は、図５Ａに示される。ｒＯＶＤ溶液および緩衝液の吸光度（６００ｎｍ）に対する、異なる加熱処置の影響。
ｒＯＶＤの添加は、緩衝溶液の吸光度を増加させることが見出された。ｒＯＶＤ溶液の吸光度は、低温殺菌および熱間充填の後に、同じままであった（ｐＨ２．５とｐＨ４との間で有意な差異なし）。吸光度は、レトルト後に低減された。異なるｐＨにおいて、ｒＯＶＤ溶液が、低温殺菌および熱間充填の加熱処置の後であっても透明なままであったのは、驚くべきことであった。例外は、ｐＨ４またはｐＨ６でのレトルト条件において、ｒＯＶＤ溶液が凝固したことであった。これらの結果は、本開示のｒＯＶＤが、加熱の適用の前および後に、異なる酸性ｐＨで溶液中で可溶性のままであることを示している。
（実施例６）
市販の飲料におけるｒＯＶＤの溶解度および透明度
文献中に公開された炭酸ガス飽和レベル（以下の表４）に基づいて、Ｓａｎ Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｏ（登録商標）を、低炭酸飲料を代表するものとして選択し、Ｄｉｅｔ Ｃｏｋｅ（商標）を、より高い炭酸ガス飽和レベルを有する飲料として選択した。Ｇａｔｏｒａｄｅ（商標）およびＲｅｄ Ｂｕｌｌ（商標）は、（炭酸ガスが飽和されていない）エナジードリンクのカテゴリーを代表した。Ｐｅｄｉａｌｙｔｅ（登録商標）を、ｒＯＶＤ溶解度に対する飲料中の電解質の影響を研究するために選択した。
Figure 2022539879000009
Figure 2022539879000010
 表4: 種々の市販の飲料についての炭酸ガス飽和レベル
凍結乾燥させたｒＯＶＤを、３０～５０％（タンパク質重量／体積として表される％）の濃度の範囲で、種々のドリンク溶液中にブレンドした。驚くべきことに、本開示のｒＯＶＤは、Ｐｅｄｉａｌｙｔｅ（登録商標）、Ｓａｎ Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｏ（登録商標）、Ｄｉｅｔ Ｃｏｋｅ（商標）およびＧａｔｏｒａｄｅ（商標）中で、３０％ ｗ／ｖにおいて可溶性であった。Ｒｅｄ Ｂｕｌｌ（商標）は、２６％ ｗ／ｖのタンパク質において、溶解度であった。より高い濃度（例えば、＞３０％）では、ｒＯＶＤは、一部の濃度において溶解度を示したが、透明度における減少および粘度における増加が伴った。さらにより高い濃度（例えば、５０％ ｗ／ｖに近づく）では、ｒＯＶＤは、もはや可溶性ではなく、一部の試料では、ドリンク溶液中に置いた場合に濡れなかった。３０％およびそれよりも高い濃度（Ｒｅｄｂｕｌｌ（商標）については２６％）について、結果が以下の表に示される。際立った色変化が、無色の飲料についてｒＯＶＤを添加した場合に見られたが、着色飲料（例えば、Ｄｉｅｔ Ｃｏｋｅ（商標））については、ｒＯＶＤ添加による色変化は、ほとんど～全く観察されなかった。
Figure 2022539879000011
 表5: San Pellegrino(登録商標)におけるrOVDの溶解度研究
Figure 2022539879000012
 表6: Diet Coke(登録商標)におけるrOVDの溶解度研究
Figure 2022539879000013
 表7: Gatorade(商標)(Thirst Quencher lemon-lime)におけるrOVDの溶解度研究
Figure 2022539879000014
 表8: Red Bull(商標)におけるrOVDの溶解度研究
Figure 2022539879000015
 表9: Pedialyte(登録商標)におけるrOVDの溶解度研究
出発ドリンク（ｒＯＶＤなし）および３０％のｒＯＶＤ溶液（ＲｅｄＢｕｌｌ（商標）については２６％）の写真は、図６Ａに示される。ｒＯＶＤ溶液についての吸光度結果は、図６Ｂのグラフに示される。３０％ ｗ／ｖ（ＲｅｄＢｕｌｌ（商標）については２６％ ｗ／ｖ）におけるｒＯＶＤ溶液を、６００ｎｍにおける吸光度を使用して評価した。ｒＯＶＤ添加の際のｐＨにおける変化は、飲料組成物および初期基剤のｐＨに依存した。
（実施例７）
Ｐｉｃｈｉａにおける組換えＯＶＬタンパク質の産生
組換えリゾチーム（ｒＯＶＬ）株を、メタノール誘導性プロモーターの制御下で発現される配列番号４５のＯＶＬを含有する発現カセットでＰｉｃｈｉａ種Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉを形質転換することによって作製した。ＯＶＬコード配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のアルファ因子プレプロ分泌シグナルのコード配列に融合された成熟ＯＶＬタンパク質をコードした。ｒＯＶＬ株は、メタノール含有培地中で成長させた場合、ｒＯＶＬを分泌した。ｒＯＶＬ組換えタンパク質を含有するブロスを遠心分離して細胞を除去し、得られた上清を、上記のように、ｒＯＶＤのものと同様に処理した。
（実施例８）
ＯＶＤおよびＯＶＬの組合せ
この実施例では、２．５％（ｗ／ｖ）のｒＯＶＬおよび９％（ｗ／ｖ）のｎＯＶＤを含有する溶液を作製した。得られたタンパク質ブレンドは、２１．７％のｒＯＶＬおよび７８．３％およびを含んだ。
次いで、ｒＯＶＬ＋ＯＶＤブレンドを、以下の条件下で加熱処置した：
低温殺菌：７２℃で１分間、その後、氷浴中で１０分間。
熱間充填：８５℃で３０秒間。
レトルト：１２１℃で１９ｐｓｉで１５分間。
室温で維持した対照ＯＶＤ試料を使用して、無菌的処理条件を模倣した。クエン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ）を使用して、表１０に記載されるように、試験溶液のｐＨを調整した。
Figure 2022539879000016
 表10: pH2.5、4および6におけるクエン酸緩衝液の組成
図７～図１０および表１１に示されるように、ｒＯＶＬ＋ＯＶＤブレンドを、低温殺菌、熱間充填またはレトルトによって加熱処置した。６００ｎｍにおける吸光度によって測定した場合、ｒＯＶＬ＋ＯＶＤブレンドの透明度／溶解度は、室温に置いたＯＶＤ対照試料と比較して、ｐＨ２．５では影響なしのままであった。ｐＨ４では、ｒＯＶＬ＋ＯＶＤブレンドは、低温殺菌または熱間充填された場合、その透明度／溶解度を保持した。レトルト条件は、増加した光学密度によって測定した場合、濁度を生じた（表１１）。ｐＨ６での加熱処置は、全ての試料について、透明度の喪失を生じた。
Figure 2022539879000017
 *同じ文字を共有する各副表内の試料は、統計的に類似である(p>0.05)
表11: 600nmにおける、rOVLおよびネイティブOVDを含有する試料の吸光度
図１１～図１３および表１２に示されるように、ネイティブＯＶＬ（ｎＯＶＬ）試料は、組換えＯＶＬ（ｒＯＶＬ）で見られたものと類似の、ＯＶＤに対する影響を有した。ｐＨ２．５では、ｎＯＶＬ＋ＯＶＤ溶液の透明度／溶解度は、３つ全ての条件（低温殺菌、熱間充填またはレトルト）において加熱処置した場合、維持された。ｎＯＶＬ＋ＯＶＤ溶液は、ｐＨ４においてそれらの透明度を維持し、濁度は、レトルト条件下でのみ生じた。ｐＨ６は、加熱処置後に透明度を維持するためには適切でなかった。
Figure 2022539879000018
Figure 2022539879000019
*同じ文字を共有する各副表内の試料は、統計的に類似である(p>0.05)
表12:600nmにおける、市販のネイティブOVL(nOVL)およびネイティブOVD(nOVD)を含有する試料の吸光度
室温のまたは加熱処理された試料中のＯＶＤへのｒＯＶＬの添加は、試料の透明度にも溶解度にも影響を与えることなしに、試料のタンパク質含量を増加させた。したがって、飲料へのＯＶＤへのｒＯＶＬの添加は、室温において、または加熱処理後のいずれかで、透明度にも溶解度にも、官能品質（外観、匂い、フレーバーおよび口当たり）にも影響を与えることなしに、飲料のタンパク質含量を増加させる。
９％（ｗ／ｖ）の本開示の組換えＯＶＤ（ｒＯＶＤ）および２．５％（ｗ／ｖ）のｒＯＶＬを含有する試料を作製した。得られたタンパク質ブレンドは、７８．３％のｒＯＶＤおよび２１．７％のｒＯＶＬを含有した。図１４は、ｐＨ２．５、４、６における、室温でのおよび異なる加熱処置後の溶液を、ｒＯＶＬ＋ｒＯＶＤとｒＯＶＤ対照とで比較する。
Figure 2022539879000020
 *同じ文字を共有する各副表内の試料は、統計的に類似である(p>0.05)
表13: 600nmにおける、rOVLおよびrOVDを含有する試料の吸光度
（実施例９）
乳清タンパク質溶液との比較
ｒＯＶＤからの結果を代替のタンパク質（乳清）と比較するために、ｒＯＶＤまたは乳清タンパク質を、９％（ｗ／ｖ）の濃度で水中に可溶化した。４つの市販の乳清タンパク質単離物（ＷＰ１、ＷＰ２、ＷＰ３およびＷＰ４）を、本開示のｒＯＶＤと比較した。ｐＨを、各試料についてＨａｎｎａ Ｌａｂ ｐＨプローブによって測定し、吸光度を、６００ｎｍの波長においてＳｐｅｃｔｒｏＭａｘによって測定した。結果は表１４に提供される。外観は視覚的検査によって評価した；臭気はにおい嗅ぎ試験によって評価した；フレーバーは、３人の訓練された人員のパネルを使用して、味によって評価した。
Figure 2022539879000021
表14: rOVD溶液と比較した乳清タンパク質溶液(WPI)の溶液特徴
乳清タンパク質単離物（ＷＰＩ１およびＷＰＩ３）は、ｐＨ２、４または６に調整した、１００ｍｌの蒸留水当たり９ｇの濃度であった。ｐＨ２、４および６における、乳清タンパク質溶液（ＷＰＩ１およびＷＰＩ３）とｒＯＶＤ溶液との間の比較結果は、図１５Ａおよび図１５Ｂに示される。ｒＯＶＤ溶液は、同じ濃度の乳清タンパク質溶液と比較して、かなりより高い溶液透明度を示す。
（実施例１０）
種々のタンパク質水溶液の透明度の比較
この実施例では、本開示の組換えオボムコイド（ｒＯＶＤ）タンパク質の溶解度を、他のタンパク質と比較した。
適切な量の酸性乳清タンパク質単離物（９０％ ｗ／ｗのタンパク質を有するＷＰ１および９２．７％ ｗ／ｗのタンパク質を有するＷＰ２）、ｎＯＶＤ － ８５％のタンパク質含量、ｒＯＶＤ － ８５．６％のタンパク質含量、エンドウマメタンパク質 － ９０％のタンパク質含量；およびダイズタンパク質 － ９０％のタンパク質含量を、（ボルテックスを使用して）水とブレンドして、５％のタンパク質溶液を形成した。
Figure 2022539879000022
表15: 成分およびそれらの割合のリスト
図１６は、種々のタンパク質溶液の例を示す。
１００μｌの各タンパク質溶液を、平底透明９６ウェルプレート中に三連でアリコート化した（表１５に示される通り）。各試料の吸光度を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ上でプレートアダプターを用いて、６００ｎｍで測定した。結果は表１６に提供される。
Figure 2022539879000023
 表16. 種々のタンパク質溶液の吸光度結果
（実施例１１）
タンパク質栄養強化された溶液の懸濁安定性の比較
この実施例では、オレンジジュース（カルシウムおよびビタミンＤが添加されている）をｒＯＶＤで栄養強化することの実現可能性を決定した。
オレンジジュース（果肉なし；８液量オンスの１人前の標準分量当たり、３５０ｍｇのカルシウムおよび２．５ｍｃｇのビタミンＤを含む）を、ｎＯＶＤ、乳清タンパク質またはｒＯＶＤ（８６％のタンパク質含量）を使用してタンパク質栄養強化した。試料を、以下のように処置した。目的のタンパク質を、種々の量で１０ｇのオレンジジュースに添加し、完全に溶解するまで混合して、栄養強化されたオレンジジュースを産生した。タンパク質栄養強化なしの元のオレンジジュース（対照試料として）のｐＨを測定し、標的ｐＨとみなした。栄養強化されたオレンジジュース試料のｐＨを、１Ｍクエン酸および／またはベーキングソーダを使用して調整して、標的ｐＨに近づけた。タンパク質溶解度および／または沈殿が、加熱処置前の全ての試料において視覚的に観察された。７０℃で１分間の加熱処置を適用して、オレンジジュースにおける微生物負荷を十分に低減させた。次いで、試料を、４℃で１０分間即座に冷却した。
試料の物理的安定性および懸濁安定性を、加熱プロセスの直後（図１７Ａ）および４℃での４８時間の貯蔵後（図１７Ｂ）に、評価した。
１５％のｎＯＶＤまたは１５％のｒＯＶＤで栄養強化されたオレンジジュースの懸濁安定性は、タンパク質栄養強化を含まない対照と類似であることが見出された。４８時間後、１５％の乳清タンパク質で栄養強化されたオレンジジュースは、ゲルを僅かに形成しており、したがって、分離はこの試料では観察されなかった。高濃度（３０％）ではｒＯＶＤは沈殿せず、０．２５ｍｃｇのビタミンＤおよび３５ｍｇのカルシウムの存在下であっても、オレンジジュース中で完全に可溶性であった。
ｒＯＶＤは、加熱安定であることも見出され、低温殺菌の間にゲルを形成しなかった。外観に関して、対照と、１５％のｎＯＶＤまたは２つのレベル：１５％もしくは２０％のｒＯＶＤで栄養強化されたオレンジジュースとの間で、有意な差異は観察されなかった。
（実施例１２）
タンパク質栄養強化されたゼリーの懸濁安定性の比較
この実施例では、ゼリーをｒＯＶＤで栄養強化することの実現可能性を評価した。
Ｊｅｌｌｏ（商標）ゼリーを、ｎＯＶＤ（８０％のタンパク質）、ｒＯＶＤ（８６～９３％のタンパク質）、フレーバーなしの乳清単離物タンパク質（８７．５～９２．７％のタンパク質）、フレーバーなしのゼラチン（９２％のタンパク質）を使用するタンパク質栄養強化のために使用した。試料を、以下のように調製した：
対照ゼリー法：熱湯を、ゼリーミックス粉末に添加し、完全に溶解するまで、２分間撹拌した。次いで、冷水を添加して、２ｃｍの１オンスカップを満たし、ふたを被せ、次いで冷蔵した。
栄養強化されたゼリー法：熱湯を、ゼリーミックス粉末に添加し、完全に溶解するまで、２分間撹拌した。冷水を、タンパク質粉末に徐々に添加し、緩徐に撹拌して溶解させた。溶解したゼリー溶液を、タンパク質混合物中に移し、完全に混合した。２ｃｍの１オンスカップを満たし、ふたを被せ、次いで冷蔵した。
タンパク質ゼリー製剤：目的の特定のタンパク質と共に、対照および他の実験的ゼリー試料において使用した成分およびそれらの割合のリストは、以下の表１７に示される。
Figure 2022539879000024
 表17: 成分のリスト
（＊％タンパク質ｗ／ｗ含量に基づいて調整した成分の量）ゼリー試料のテクスチャーを、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ ＣＴ３テクスチャー分析器を使用して測定した（表１８）。各ゼリー試料から、３回の読み取りを取得した。ゼリーを、試験プローブの下に中心に設置し、以下の試験設定に従って、５ｍｍの距離に圧縮した。接着性（粘着性としても公知）は、ゼリーの表面とプローブの表面との間の引力（舌、歯および／または口蓋上での粘着性に近似する）を分離するために要求されるエネルギーを測定した。硬度は、所与の変形に達するようにゼリーを圧縮するために要求される力である。
Figure 2022539879000025
 表18:テクスチャー分析器試験設定
接着性に関して、２０％のｎＯＶＤで栄養強化されたゼリーと対照との間で、統計的に有意な差異は観察されなかった。他方、２０％の乳清およびｒＯＶＤタンパク質を含むゼリーについての接着性値は、有意に低かった（表１９）。
Figure 2022539879000026
 表19: テクスチャー分析結果。*平均±標準偏差;所与の定量的パラメーター(例えば、硬度)について異なる文字を含有するゼリー試料は、p<0.05において互いに統計的に異なる。
２０％の乳清、ｎＯＶＤまたはｒＯＶＤで栄養強化されたゼリーは、対照ゼリーよりも、有意に硬度が低かった。
対照ゼリーと２０％のｒＯＶＤで栄養強化されたゼリーとの間で、透明度に有意な差異は観察されなかった（ｐ＜０．０５）。乳清単離物タンパク質で栄養強化されたゼリーは、不透明（ｏｐａｑｕｅ）かつ不透明（ｕｎｃｌｅａｒ）であった（図１８Ａおよび図１８Ｂ）。
２０％の乳清タンパク質で栄養強化されたＪｅｌｌｏ（商標）のテクスチャーは、非常に柔らかく、対照とは比べ物にならなかった（図１８Ｃ）。
１６％または２０％のいずれかの加水分解されたゼラチンを含むＪｅｌｌｏ（商標）のテクスチャーは、強い跳ね返り、および変形に対する耐性を有して、弾力があった。ゼリーは室温で非常に迅速に固まるので、この実験では、試料のアリコート化は不可能であった（図１８Ｄおよび図１８Ｅ）。
（実施例１３）
種々の種由来の組換えＯＶＤを試験する
この実施例では、非ニワトリ鳥類種のアミノ酸配列を有するｒＯＶＤの特性を評価した。
２つの発現構築物を、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおける２つの非ニワトリｒＯＶＤ（本明細書で以後、ｒＯＶＤ－Ｔ（ヒメコンドル）と呼ばれる配列番号４０およびｒＯＶＤ－Ｈ（ハチドリ）と呼ばれる配列番号４３）の発現のために創出し、実施例２と同様に、発現、精製および処理した。凍結乾燥させたｒＯＶＤ試料を、異なる濃度およびｐＨで水溶液（蒸留水）中にブレンドした。次いで、ｒＯＶＤ溶液の透明度および溶解度を、視覚的に（例えば、濁度、沈殿物、粘度および色について）、および６００ｎｍにおける吸光度を測定することによって、評価した。
図１９Ａは、脱イオン水中に４．２３％、１０％、２０％または３０％ ｗ／ｖのタンパク質濃度でｒＯＶＤ－Ｈを含むタンパク質－水試料を示す。溶液は、４．１５のｐＨを有した。上述の実施例のニワトリｒＯＶＤと同様、図１９Ａは、最大で２０％のｒＯＶＤ－Ｈを含む溶液について、沈殿物がなく、液体の外観および視覚的流動における明らかな粘度変化もない、透明な無色溶液を明らかにしている。
図１９Ｂは、脱イオン水中に４．２３％、１０％または２０％ ｗ／ｖのタンパク質濃度でｒＯＶＤ－Ｔを含むタンパク質－水試料を示す。溶液は、３．６９のｐＨを有した。上述の実施例のニワトリｒＯＶＤと同様、図１９Ｂは、最大で１０％のｒＯＶＤ－Ｔを含む溶液について、沈殿物がなく、液体の外観および視覚的流動における明らかな粘度変化もない、透明な溶液を明らかにしている。２０％では、タンパク質は完全には溶解しなかった。
試料を、室温でインキュベートし、実施例４または実施例５と同様に、３つの型の加熱処置：低温殺菌、熱間充填またはレトルトに供した。次いで、種々のｒＯＶＤの透明度および溶解度を、視覚的に（例えば、濁度、沈殿物、粘度および色について）、および６００ｎｍにおける吸光度を測定することによって、評価した。表２０は、緩衝液または水中に４．２３％のｒＯＶＤ－ＨまたはｒＯＶＤ－Ｔ溶液を含むｒＯＶＤ溶液のｐＨ、吸光度および透明度についての結果を示す。「処理前」の列のデータは、任意の加熱処置の前に測定されたものである。異なるｐＨにおいて、ｒＯＶＤ溶液が、低温殺菌、熱間充填またはレトルトなどの極端な加熱の後であっても透明なままであったのは、驚くべきことであった。これらの結果は、ｒＯＶＤ試料が、加熱の適用の前および後に、異なる酸性ｐＨで溶液中で可溶性のままであることを示している。
これらのデータは、組換えニワトリＯＶＤについて上に開示された好ましい特性（実施例２を参照のこと）が、他の組換えＯＶＤを用いても得られ得ることを示している。
Figure 2022539879000027
 表20: rOVD-HおよびrOVD-Tの溶解度および透明度研究
（実施例１４）
ウシトリプシン阻害活性の比較
実施例２において産生したｒＯＶＤを、この実施例で利用した。トリプシン阻害活性を、ウシトリプシンを使用する標準的なアッセイ（ＡＡＣＣ＃２２－４０．０１）において、ネイティブＯＶＤ（ｎＯＶＤ）と組換えＯＶＤ（ｒＯＶＤ）との間で比較した。ｒＯＶＤとｎＯＶＤとの比較は、表２１に示される。１トリプシン単位は、アッセイの条件下での、１０ｍｌの反応混合物当たりの、４１０ｎｍにおける０．０１吸光度単位の増加として、任意に定義される。トリプシン阻害剤活性は、トリプシン阻害剤単位（ＴＩＵ）を単位として表される。ｒＯＶＤの３つの異なるバッチ（試料１～３）を、ネイティブニワトリオボムコイドと比較した。
Figure 2022539879000028
 表21:トリプシン阻害活性の比較
（実施例１５）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ消化性の比較
ｒＯＶＤ試料のｉｎ ｖｉｔｒｏ消化性を、タンパク質消化性アッセイ手順（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、Ｍｅｄａｌｌｉｏｎ Ｌａｂｓ）を使用して測定した。ｒＯＶＤ試料とｎＯＶＤとの比較は、表２２に示される。このデータは、ネイティブオボムコイドとｒＯＶＤとの間での、等価なｉｎ ｖｉｔｒｏ消化性を実証している。
Figure 2022539879000029
 表22: in vitro消化性の比較
（実施例１６）
オボムコイド明細
産生されたｒＯＶＤ組成物の特徴付けおよびネイティブニワトリオボムコイドの特性に基づいて、産物明細（表２３）および品質制御明細（表２４）を、本開示のｒＯＶＤについて構築した。
タンパク質パーセンテージを、AOAC 2006を使用して測定した。Protein(crude) in animal feed, combustion method, 990.03. In: Official methods ofanalysis of AOAC International. 18th ed. Gaithersburg: ASA-SSA Inc.およびAOAC2006. Proximate Analysis and Calculations Crude Protein Meat and Meat Products IncludingPet Foods - item 80. In: Official methods of analysis Association of AnalyticalCommunities, Gaithersburg, MD, 17th edition, Reference data: Method 992.15(39.1.16); NFNAP; NITR; NTを参照のこと。
水分パーセンテージを、Association of OfficialAnalytical Chemists. 1995. In Official Methods of Analysisを使用して測定した。
炭水化物パーセンテージを、J AOAC Int. 2012Sep-Oct;95(5):1392-7に記載される方法を使用して測定した。
酸加水分解による脂肪を、AOAC International. 2012.Official Method Fat (crude) or ether extraction in pet food. Gravimetricmethod, 954.02. In: Official Methods of Analysis of AOAC International, 19thed., AOAC International, Gaithersburg, MD, USA, 2012を使用して測定した。
標準プレート計数を、AOAC International. 2005.Aerobic plate count in foods, dry rehydratable film, method 990.12. AOACInternational, 17th ed. Gaithersburg, MDを使用して測定した。酵母およびカビ計数を、AOAC OfficialMethod 997.02. Yeast and Mold Counts in Foods Dry Rehydratable Film Method(PetrifilmTM Method) First Action 1997 Final Action 2000を使用して測定した。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａを、AOACInternational. 2005. Salmonella in selected foods, BAX automated system, method2003.09. In Official methods of analysis of AOAC International, 17th ed., AOACInternational, Gaithersburg, MDを使用して測定した。総大腸菌群を、AOAC International. 2005. E.coli count in foods, dry rehydratable film, method 991.14. In: Official methodsof analysis of AOAC International, 17th ed. AOAC International, Gaithersburg,MDを使用して測定した。
Figure 2022539879000030
 表23: P.pastoris DFB-003によって産生されたオボムコイドについての明細
Figure 2022539879000031
Figure 2022539879000032
 *供給源生物についての検出限界=11CFU/mg試料
**コードDNAについての検出限界=10フェムトグラム
表24: P.pastoris DFB-003によって産生されたオボムコイドの3つのロットについての品質制御結果
（実施例１７）
ｒＯＶＤ調製物における産生生物およびＤＮＡの非存在
ｒＯＶＤ粉末を、ＰＧＡプレート上にプレーティングし、試料がコロニーを生じた場合、これらを、再ストリークし、Ｐｉｃｈｉａ生物の存在についてＰＣＲによって分析した。この手順を、組換え株から産生されたｒＯＶＤ粉末の３つのロットに適用した。製造生物は、ロットのいずれにおいても検出されなかった（表２４）。
ＰＣＲ分析を使用して、ｒＯＶＤカセットに対するプライマーを使用して、組換えＤＮＡのコード断片がｒＯＶＤ調製物中に存在しなかったことを確認した。ＯＶＤ ＰＣＲ産物に対応する５７０ｂｐのバンドを産生するＯＶＤプラスミドＤＮＡを、陽性対照として使用した。このバンドは、試験した３つ全てのｒＯＶＤ粉末ロットにおいて存在しなかった。
（実施例１８）
比較免疫反応性
ウエスタンブロット比較を、ウサギ由来の一次抗オボムコイド抗体（ＮＢＰ１－７４６７６ Ｎｏｖｕｓ）を１：２５００希釈で使用して、３つのｒＯＶＤロットに対して実施した。使用した二次抗体は、アルカリホスファターゼにコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＡＰ ａｂ９７０４８ Ａｂｃａｍ）であった。使用した分子量マーカー調製物は、Ｂｉｏ Ｒａｄからであった（１６１－０３９４）。比較は、ｒＯＶＤ試料、ニワトリ卵白由来のネイティブオボムコイド（ｎＯＶＤ）および脱グリコシル化されたネイティブオボムコイド（ｎＯＶＤ＋ＰＮＧアーゼＦ）について、同じ免疫反応性を示した（図２０）。
（実施例１９）
ｒＯＶＤの発酵および精製
ｒＯＶＤ Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ種株を、冷凍貯蔵から取り出し、室温に解凍した。解凍した種バイアルの内容物を使用して、一次発酵槽中の液体培養培地に接種し、標的細胞密度に達するまで、プロセス温度で成長させた。次いで、成長したｒＯＶＤ Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓを産生規模の反応器に移した。培養物を、標的発酵条件で産生生物反応器中で成長させ、一連の基質を供給した。発酵を、プロセスの間、複数の時点で、培養物の純度について分析した。
組換えＯＶＤを、遠心分離とその後の精密濾過とによって液体培地から細胞を分離することによって精製した。発酵ブロスを、最初にｐＨ３にし、ＤＩ水で希釈した。細胞を、バケット式遠心分離を使用して除去した。収集した上清を、水酸化ナトリウムを使用してｐＨ７にし、０．２μｍ濾過を実施し、その後、５体積の脱イオン水を用いた透析濾過を行った。０．２μｍの透過物を、ｐＨ５に調整し、次いで、５ｋＤａ ＴＦＦメンブレンを介して濃縮した。５ｋＤａの残留物を、６５％飽和硫酸アンモニウムを使用して沈殿させた。塩添加後、ｐＨを、リン酸を用いてｐＨ４～４．１に調整した。混合物を、室温で一晩、かき混ぜながらインキュベートした。次の日、沈殿物を、バケット式遠心分離を使用してスピンダウンした。ｒＯＶＤ沈殿物を、ＤＩ水中に溶解させ、ｐＨを、水酸化ナトリウムを使用して５に調整した。次いで、ｒＯＶＤ溶液を透析濾過し、次いで、残留物を、０．２μｍボトルフィルターを介して通過させた。
噴霧乾燥機を使用してｒＯＶＤ溶液を脱水して、ｒＯＶＤ粉末にした。
（実施例２０）
ｒＯＶＤ精製の間の過酸化水素処置
液体ｒＯＶＤを、５ｋＤａ ＴＦＦメンブレンを使用して、５０～６０ｇ／Ｌに濃縮した。ｒＯＶＤ溶液を、０．２μｍフィルターを介して通過させて、微生物を除去した。溶液の１０％体積と等しい量の酸素生成剤である過酸化水素を、撹拌しながらｒＯＶＤ溶液に緩徐に添加した。混合物を、かき混ぜながらインキュベートし、モニタリングして、処置前の暗緑色～褐色の色から処置後の淡黄色の色への色変化を保証した。１．５時間後、透析濾過を、５体積のＤＩ水を用いて５ｋＤａ ＴＦＦメンブレンを介して実施した。５ｋＤａ透析濾過残留物中のｒＯＶＤを、室温で６５％の塩飽和で硫酸アンモニウムを使用して沈殿させた。塩の添加後、ｐＨを、リン酸を用いてｐＨ４～４．１に調整した。混合物を、一晩かき混ぜながらインキュベートして、沈殿物を形成した。次の日、沈殿物を、バケット式遠心分離を使用してスピンダウンした。沈殿物を取り出し、脱イオン水中に溶解させ、ｐＨを、水酸化ナトリウムを使用して５に調整した。５ｋＤａ ＴＦＦメンブレンをきれいにし、２．０ｍＳ未満の残留物伝導率が達成されるまで、透析濾過を、数体積のＤＩ水を使用して実施した。残留物を、０．２μｍボトルフィルターを介して通過させた。次いで、濾過されたｒＯＶＤ溶液を噴霧乾燥し、貯蔵した。
（実施例２１）
過酸化水素で処置された再処理されたｒＯＶＤ
ＯＶＤ粉末を、脱イオン水中に溶解させて５０～６０ｇ／Ｌにし、ホローファイバー０．２μｍ接線流フィルターを介して、次いで、０．２μｍボトルフィルターを介して濾過した。１０％溶液を提供する量の過酸化水素を、ｒＯＶＤ溶液中に緩徐に撹拌し、３０分間インキュベートした。処置した溶液を、５体積のＤＩ水を使用して、５ｋＤａメンブレンを介して洗浄した。
硫酸アンモニウムを、残留物溶液に緩徐に添加し、ｐＨを、リン酸を使用して、４～４．１の間に変化させた。培地をかき混ぜながらの一晩のインキュベーション後、溶液を遠心分離し、上清を廃棄した。沈殿物を収集し、ＤＩ水中に溶解させ、水酸化ナトリウムを使用してｐＨ５にした。タンパク質溶液を、５ｋＤａメンブレンで脱塩し、０．２μｍボトルフィルターを介して濾過した。次いで、タンパク質溶液を噴霧乾燥して、ｒＯＶＤ粉末を産生した。
（実施例２２）
官能試験および結果
ｒＯＶＤ試料と、ＲＥ－ＲＣと呼ばれるＨ２Ｏ２再処理された試料とを、それらの官能特徴について分析して、過酸化水素処置の影響を決定した。
各乾燥試料の溶液を、４．２３％ ｗ／ｖ濃度で、脱イオン水を用いて調製した。両方の試料を、同じセッションにおいてモナディックに、パネリストに提示した。訓練されたパネリスト（ｎ＝６）が、それらの外観、匂い、味、口当たりおよび後味に関して、両方の試料を評価した。各カテゴリーについて、パネリストは、知覚された性状を記述し、次いで、強度評価スケールを使用して、各性状の強度（Kemp et al. 2009）を評点した（表２５）。
表２６は、過酸化水素処置した試料が、対照試料と比較して、より少ない官能性状で、色がより明るく、より欠点のない官能プロファイルを有したことを示す。
Figure 2022539879000033
 表25:性状強度評点スケール
Figure 2022539879000034
 表26:官能評価結果
（実施例２３）
溶解度および透明度について試験した、Ｈ２Ｏ２処置されたｒＯＶＤ
対照および過酸化水素処置された試料溶液（４．２３％ ｗ／ｖ）の溶解度および透明度を、分光光度計を使用して、光学密度（Ａ６００）を単位として測定した。より低い吸光度値（６００ｎｍの波長における）は、試料溶液のより高い透明度および溶解度を示す。
過酸化水素処置された試料は、対照と比較して、より低い吸光度（表２７）およびより淡い色を有した。これは、この処置が、あまり強くない色および透明な溶液から見て、改善された外観を生じたことを示した。これらの特色は、図２１に示される。
Figure 2022539879000035
 表27:試料溶液(4.23% w/v)の吸光度(600nmにおける)
（実施例２４）
タンパク質バー調製ならびに硬度および官能好ましさについての試験
表２８に示されるような、みじん切りしたナツメヤシ、みじん切りしたナッツ（アーモンドおよびクルミ）およびココアの均一な混合物を、目的のタンパク質粉末と組み合わせた。ナツメヤシおよびナッツの量は、表２９で見られるように、タンパク質粉末を含む製剤では低減された。ナツメヤシ：ナッツ比を、一定の４．６レベルで維持した。卵白タンパク質粉末およびｎＯＶＤは、２、８、１６または２３％の含有レベルで調製し、ｒＯＶＤは、２、４、８、１２または１６％の含有レベルで調製した（表２８～表３１）。
各混合物の半分を、３５０°Ｆのオーブン中で１０分間オーブン焼きした。各混合物の残り半分を、オーブン焼きされていない混合物として試験した。
Figure 2022539879000036
 表28:対照製剤において使用した成分およびそれらの割合のリスト
Figure 2022539879000037
表29:卵白タンパク質製剤において使用した成分およびそれらの割合のリスト
Figure 2022539879000038
表30: nOVD製剤において使用した成分およびそれらの割合のリスト
Figure 2022539879000039
表31: rOVD製剤において使用した成分およびそれらの割合のリスト:
（実施例２５）
タンパク質バーの硬度／テクスチャー試験
実施例２５で調製したオーブン焼きされたおよびオーブン焼きされていないタンパク質バーのテクスチャー特性を、ＣＴ３ Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄテクスチャー分析器（１５００ｇロードセル）を使用して測定した。３点曲げ試験を使用して、タンパク質バーを折り、曲げ、その硬度を測定した。各タンパク質含有レベルについて１つの試料を分析した。使用した試験パラメーターは、表３２に示される。
オーブン焼きされたタンパク質バーについての硬度結果は、オーブン焼きされていないバージョンにおける硬度結果よりも、かなり高かった。オーブン焼きされていないタンパク質バー内での、全てのタンパク質粉末について８％の含有が、類似の硬度値を生じた。全てのオーブン焼きされていないタンパク質バーについての硬度プロファイルは、タンパク質含有率が増加するにつれ、徐々に増加した。１６％および２３％のタンパク質含有における硬度値もまた、卵白タンパク質、ネイティブＯＶＤおよびｒＯＶＤについて匹敵した。表３３および表３４を参照のこと。
卵白タンパク質は、最大で３２％のタンパク質レベルを含むことができた。タンパク質バーにおける最大２３％のタンパク質含有レベルが、ネイティブおよびｒＯＶＤについて観察された。より高いタンパク質濃度は、タンパク質バー形態では取り込むことができなかった。
８％の含有レベルにおけるｎＯＶＤについての硬度値は、卵白タンパク質およびｒＯＶＤよりもかなり低かった。しかし、類似の硬度値が、１６％および２３％の含有レベルで、全てのタンパク質バー試料について観察された。ネイティブおよびｒＯＶＤを含むオーブン焼きされたタンパク質バーは、１６％および２３％のより高い含有レベルについて、多孔性の中身（ｃｒｕｍｂ）および硬い外殻を示した。全体として、８％のタンパク質粉末含有レベルが、全てのタンパク質粉末にわたって、最も望ましかった（より高いおいしさおよびテクスチャー性状）。
Figure 2022539879000040
表32: CT3 Brookfieldテクスチャー分析器を使用して硬度を測定するための、3点曲げ試験に使用した試験パラメーター
Figure 2022539879000041
表33:オーブン焼きされていないタンパク質バー試料についての試験結果
Figure 2022539879000042
表34:オーブン焼きされたタンパク質バー試料についての試験結果
（実施例２６）
タンパク質バー官能試験
実施例２６に記載したように調製した試料を、訓練された社内パネリストが品質記述子について評価した。
試験した品質性状は、以下の９ポイントスケールでの、外観、匂い、味／フレーバー、口当たり／テクスチャーおよび全体的嗜好を含んだ：１：極端に嫌い、２：非常に嫌い、３：中程度に嫌い、４：僅かに嫌い、５：好きでも嫌いでもない、６：僅かに好き、７：中程度に好き、８：非常に好き、および９：極端に好き。
Figure 2022539879000043
表35: 8%タンパク質バー試料についての官能好ましさ結果
オーブン焼きされていない対照試料について、パネリストは、それが良好な外観、僅かに柔らかいテクスチャー／噛み心地（ｂｉｔｅ）を有したが、全体的に良好な味を有し、不快な後味を有さなかったことに注目した。オーブン焼きされたバージョンについて、パネリストは、試料の全ての性状を最も高いスコアまで気に入り、満点のスコアをそれに与えた。
オーブン焼きされていない（８％）タンパク質バーについて、パネリストは、以下のコメントを提供した：卵白タンパク質バーは、トゥーシーロール（ｔｏｏｔｓｉｅ ｒｏｌｌ）のような味であった、これは、甘く、粘着力があったが、乾燥した口当たりを有した；ネイティブＯＶＤバーは、対照と比較してあまり粘着性がなかったが、強いＯＶＤ様の金属性の酸性味を有し、乾燥した口当たりを有した；ｒＯＶＤバーは、酸性度を有さず、僅かに甘さが低かったが、粘着力があり、心地よい後味を有した。
オーブン焼きされた（８％）タンパク質バーについて、パネリストは、以下のコメントを提供した：卵白タンパク質バーは、僅かに酸性であり、クラッカー／トーストしたシリアル様の味および後味を有した；ネイティブＯＶＤバーは、対照と比較して、より硬く、ねばつき、よりおいしかった；ｒＯＶＤバーは、酸性度を欠如し、噛み応えがあり、ねばつき、パネリストはこれを気に入った。
Figure 2022539879000044
表36: 16%タンパク質バー試料についての官能好ましさ結果
オーブン焼きされた（１６％）タンパク質バーについて、パネリストは、以下のコメントを提供した：卵白タンパク質バーは、トーストされた、パンのような味であり、白っぽく、粉末状の口当たりを有した；ｎＯＶＤバーは、非常に硬く、噛むのが困難であり、堅パンのように見え、強い酸っぱい味を有し、それが灼熱感を残した；ｒＯＶＤバーは、弱められた甘味、ぱさぱさとしてトーストのようなフレーバーを有し、酸味も後味もなく、ねばつくが硬かった。
全体として、ｒＯＶＤバーは、実施例２５～実施例２７に記載される試験において、ｎＯＶＤバーよりも良好な、卵白タンパク質試料と匹敵する性能を示した。ｎＯＶＤおよびｒＯＶＤについて、最大２３％のタンパク質含有が可能のようであったが、卵白タンパク質試料は、３２％の高い含有レベルにすることができた。８パーセントのバーは、全てのタンパク質バーについて、最良の含有レベルとみなされた。
１２パーセントのｒＯＶＤバーは、オーブン焼きされていないバーにおいて僅かな酸味を有したが、オーブン焼きされたバーでは、酸味は知覚されなかった。オーブン焼きされたバーは、噛み応えがあり、ねばつき、硬かった。
（実施例２７）
ｒＯＶＤサラダドレッシング
サラダドレッシングを、周囲温度でＬ５Ｍ－Ａホモジナイザー（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ）を使用して調製した。乳濁物を、タンパク質粉末および塩を水相（水および酢）中に分散させ、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｕｒｐｏｓｅ Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ Ｈｅａｄを使用して、２０００ｒｐｍで５分間撹拌することによって調製した。混合した後、キャノーラ油を、制御された様式で添加し、Ｓｑｕａｒｅ Ｈｏｌｅ Ｈｉｇｈ Ｓｈｅａｒ Ｓｃｒｅｅｎを使用して６０００ｒｐｍで１５分間均質化して、安定な水中油乳濁物を作製した。
全ての乳濁物試料を、ガラス管中に移し、プラスチックキャップで密封し、４℃で７日間貯蔵した。試料の安定性を、貯蔵時間に伴う、下相での目に見える漿液分離の高さを視覚的にモニタリングすることによって評価した。物理的安定性を、視覚的相分離が起こらなくなるまでモニタリングした。乳濁物の安定性を、以下のように表した：％漿液＝（Ｈｔ／Ｈ０）＊１００。Ｈ０は、初期乳濁物高さを示し、目に見える漿液分離層の高さ（Ｈｔ）を示す。
目的の具体的なタンパク質と共に、対照および他のサラダドレッシング試料において使用した成分およびそれらの割合のリストを示した（表３７）。
Figure 2022539879000045
表37:成分のリスト
表３８は、貯蔵時間に伴う、ドレッシングの乳濁物安定性を示す。ｎＯＶＤ試料およびｒＯＶＤ試料は共に、４℃での貯蔵の初日の間に相分離を経験した対照試料と比較して、より良好な乳濁物安定性を示した。２日目の後に、ｎＯＶＤを含有する試料およびｒＯＶＤを含有する試料は、乳濁物相分離において、それほど変化を示さなかった。より高い値は、より低い乳濁物安定性を示す。
Figure 2022539879000046
 表38. 乳濁物安定性の結果
（実施例２８）
ｒＯＶＤ卵液形成
ｒＯＶＤの塗膜形成および光沢形成の機能性を、パン適用において評価した。オーブン焼きの指示：
ａ．小さい容器中で、酵母および糖を一緒に混合し、湯（８５～９５Ｆ）を添加する。これを５分間おく。
ｂ．混合ボウル中に水を添加する。
ｃ．小麦粉を緩徐に混ぜ込み（３０秒間）、しっかりした生地が形成されるまで混合する（スピード３で２分間混合する）。
ｄ．必要な場合にのみ少量の小麦粉を振りかけることを追加しながら、軽く打ち粉をした台上で３０秒間生地を練る（７回折り畳む）。
ｅ．油を塗ったボウル中に生地を置く。生地の上部にも軽く油が塗られるように、生地をボウルの内側でひっくり返す。覆いをかけ、８０Ｆの発酵温度で４５分間ねかせる（１次発酵）。
ｆ．打ち粉をした台上に生地をあけ、こねて空気を抜く（７回折り畳む）。
ｇ．ミニローフへと成形し、油を塗ったミニパン中に置く。
ｈ．覆いをかけ、室温で３０分間ねかせる（２次発酵）。
ｉ．３％のレベルで、生地ボールの上部に適切な液を塗布する（ゴマ種子適用の場合には、各生地ボールに、液の上に１０粒のゴマ種子を適用する）。
ｊ．８分間にわたってまたは黄金色になるまで３５０Ｆでオーブン焼きする（全ての試料で均等なオーブン焼きを達成するために、４分の時点でパンの位置を切り替える）。
ｋ．総パン生地重量の３％の液を、上部に追加する。２５ｇの試料を各々使用した（総卵液＝０．７５ｇ）。
ｌ．全卵および市販の卵液代用品を有する試料について、０．７５ｇの各試料を生地表面に塗布した。
目的のタンパク質に使用した製剤は、表３９に示される：
Figure 2022539879000047
 表39:卵液製剤において使用した成分およびそれらの割合のリスト:
ゴマ種子の保持：ケーキ、パン、ベーグルまたは他のオーブン焼きされた物品上の任意のトッピングの保持は、卵液にとって重要な因子である。ゴマ種子を使用して、オーブン焼き後の各塗膜形成剤の結合機能を評価した。１０粒のゴマ種子を、液の塗布後かつオーブン焼きの前に、各生地ボールに適用した。これらのゴマ種子の保持を、オーブン焼き後のパンに粘着した種子の量に基づいて計算した。
以下の結果が得られた：
Figure 2022539879000048
 表40:ゴマ種子の保持レベル
卵液なしの対照試料は、ゴマ種子を結合する能力を有さず、０粒のゴマ種子が、オーブン焼き後に表面上に保持された。しかし、全ての他の塗膜形成剤は、オーブン焼き後に１０粒全ての種子を保持することができ、これは、トッピングについての１００％の保持率を示唆している。
比色分析アッセイ：個々の試料写真を、Ｃｏｌｏｒｇｒａｂアプリケーション（Ｌｏｏｍａｔｉｘ）を使用して、ＲＧＢスペクトルで色データについて分析した。試料値を、パン表面の中心から採取した２×２ｃｍの断面を使用して生成した。次いで、ＲＧＢデータを、オンラインソフトウェアｗｗｗ．ｃｏｌｏｒｍｉｎｅ．ｏｒｇを使用して、ＣＩＥＬＡＢ系に変換した。ＣＩＥＬＡＢモデルは、色を３つの値で表す色空間系である：黒色（０）から白色（１００）までの明度についてのＬ＊、緑色（－）から赤色（＋）までのａ＊、青色（－）から黄色（＋）までのｂ＊。
Figure 2022539879000049
 表42:オーブン焼き後のパンについてのCIELAB結果
ｒＯＶＤおよび卵白タンパク質試料は、より高いＬ＊値を有し、これは、より高いブライトネス（ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ）または輝度（ｌｕｍｉｎａｎｃｅ）を示唆している。対照（卵液なし）、市販の卵液代用品および卵白タンパク質試料は、低いａ＊値を有し、これは、全卵およびｒＯＶＤ試料と比較してより低い赤みまたは褐色みを示唆している。
全卵液およびｒＯＶＤ試料は、類似のｂ＊値もまた有し、これは、他の試料と比較して類似の黄色の色相を示唆している。
視覚的検査：対照試料は、色が淡く見え、皴が多く、輝きを有さなかった。卵液を有する試料は、良好な褐色化、優れた光沢および滑らかな表面を有した。オーブン焼きされた光沢試料は、僅かな目立つ光沢を有する滑らかな表面を有した。卵白タンパク質粉末試料は、ｒＯＶＤ試料と共に、良好な光沢および褐色化を有した。
ｒＯＶＤは、塗膜形成剤および光沢形成剤として良好に機能した。全てのゴマ種子が、褐色化後に表面上に残留し、これは、良好な塗膜形成能力および結合能力を示唆している。視覚的検査および色値は、他の試料と比較して良好な光沢形成および褐色化を示唆した（図２２）。

Claims (117)

  1. 組換えオボムコイドタンパク質（ｒＯＶＤ）を含む組成物であって、前記ｒＯＶＤが、少なくとも１つのグリコシル化されたアスパラギン残基を含み、前記ｒＯＶＤが、Ｎ－結合型マンノシル化を実質的に欠く、組成物。
  2. 各グリコシル化されたアスパラギンが、単一のＮ－アセチルグルコサミンを含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ｒＯＶＤが、少なくとも３つのグリコシル化されたアスパラギン残基を含む、請求項１または請求項２に記載の組成物。
  4. 前記ｒＯＶＤが、ｒＯＶＤタンパク質の分泌形態である、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 粉末である、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 重量／重量ベースでおよび／または組成物の総体積当たりの重量ベースで、少なくとも３０％のｒＯＶＤタンパク質、少なくとも４０％のｒＯＶＤタンパク質、少なくとも５０％のｒＯＶＤタンパク質、少なくとも６０％のｒＯＶＤタンパク質、少なくとも７０％のｒＯＶＤタンパク質、少なくとも８０％のｒＯＶＤタンパク質、少なくとも８５％のｒＯＶＤタンパク質、少なくとも９０％のｒＯＶＤタンパク質または少なくとも９５％のｒＯＶＤタンパク質のタンパク質含量を有する、請求項５に記載の組成物。
  7. 組換えオボムコイドタンパク質（ｒＯＶＤ）を含む組成物であって、ヒトまたは動物消費のために製剤化された粉末であり、重量／重量ベースでおよび／または組成物の総体積当たりの重量ベースで、少なくとも７０％のｒＯＶＤタンパク質、少なくとも８０％のｒＯＶＤタンパク質、少なくとも８５％のｒＯＶＤタンパク質、少なくとも９０％のｒＯＶＤタンパク質または少なくとも９５％のｒＯＶＤタンパク質のタンパク質含量を有する、組成物。
  8. 前記粉末が、重量／重量ベースでおよび／または組成物の総体積当たりの重量ベースで、１５％、１２％、１０％、８％、６％、５％、３％、２％または１％未満の水分を含む、請求項５から７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 前記粉末が、３０％、２７％、２５％、２２％、２０％、１７％、１５％、１２％、１０％、８％、５％、３％または１％未満の遊離炭水化物含量を含む、請求項５から８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 香味料、着色剤、甘味料、アミノ酸、タンパク質、酸味料、防腐剤および灰分からなる群から選択される１つまたは複数のさらなる成分を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. ５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％、０．７５％、０．５％、０．２５％または０．１％未満の灰分を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記アミノ酸が、トリプトファン、イソロイシン、ロイシンおよびバリン、またはそれらの組合せから選択される、請求項１０または請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記粉末が、液体中に溶解することが可能である、請求項５から１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 組換えオボムコイドタンパク質（ｒＯＶＤ）を含む組成物であって、ヒトまたは動物消費のために製剤化された固体形態であり、前記ｒＯＶＤが、組成物へのタンパク質栄養強化、ならびに口当たり、テクスチャー、硬度、加熱処置に対する安定性、およびｐＨに対する安定性からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる特色を提供する、組成物。
  15. 前記ｒＯＶＤが、Ｎ－アセチルグルコサミンに連結された少なくとも１つのアスパラギン残基を含み、前記ｒＯＶＤが、Ｎ－結合型マンノシル化を実質的に欠く、請求項１４に記載の組成物。
  16. ｒＯＶＤの濃度が、重量／重量ベースでおよび／または組成物の総体積当たりの重量ベースでおよび／または組成物の総体積当たりの重量ベースで、約５％、約１０％、約１５％、約２０％または約２５％よりも高い、請求項１４または請求項１５に記載の組成物。
  17. 前記ｒＯＶＤが、ｒＯＶＤを欠如する消費可能な固体組成物と比較して、前記消費可能な固体組成物の目に見える外観または口当たりを実質的に変更しない、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 前記ｒＯＶＤが、前記ｒＯＶＤと同じ濃度で乳清タンパク質、ダイズタンパク質またはエンドウマメタンパク質を含有する消費可能な固体組成物と比較して、前記消費可能な固体組成物の目に見える外観または口当たりを実質的に変更しない、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 前記ｒＯＶＤが、ｒＯＶＤを欠如する消費可能な固体組成物と比較して、臭気および／または味についての官能評点に実質的に影響を与えない、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の組成物。
  20. 前記ｒＯＶＤが、前記ｒＯＶＤと同じ濃度で乳清タンパク質、ダイズタンパク質またはエンドウマメタンパク質を含有する匹敵する組成物と比較して、臭気および／または味についての官能評点に実質的に影響を与えない、請求項１４から１９のいずれか一項に記載の組成物。
  21. 前記消費可能な固体組成物が、スナックバー、タンパク質バー、栄養バー、エネルギーバーまたはタンパク質サプリメントである、請求項１４から２０のいずれか一項に記載の組成物。
  22. 前記消費可能な固体組成物が、香味料、着色剤、甘味料、アミノ酸、タンパク質、酸味料、防腐剤および灰分からなる群から選択される１つまたは複数のさらなる成分を含む、請求項１４から２１のいずれか一項に記載の組成物。
  23. 組換えオボムコイドタンパク質（ｒＯＶＤ）を含む組成物であって、ヒトまたは動物消費のために製剤化された液体であり、前記ｒＯＶＤが、前記組成物へのタンパク質栄養強化、ならびに溶解度、口当たり、加熱処置に対する安定性、およびｐＨに対する安定性からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる特色を提供する、組成物。
  24. 重量／重量ベースでおよび／または組成物の総体積当たりの重量ベースで、少なくとも１５％のｒＯＶＤ、少なくとも２０％のｒＯＶＤタンパク質、少なくとも３０％のｒＯＶＤタンパク質または少なくとも４０％のｒＯＶＤタンパク質を含むタンパク質含量を有する、請求項２３に記載の組成物。
  25. 前記組成物が、少なくとも５％のｒＯＶＤを含むタンパク質含量を有し、前記消費可能な液体組成物が、実質的に光学的に透明である、請求項２３または請求項２４に記載の組成物。
  26. 前記ｒＯＶＤと同じ濃度で乳清タンパク質、ダイズタンパク質またはエンドウマメタンパク質を含有する匹敵する組成物よりも高い光学的透明度を有する、請求項２３から２５のいずれか一項に記載の組成物。
  27. 前記ｒＯＶＤが、ｒＯＶＤを欠如する消費可能な液体組成物と比較して、前記消費可能な液体組成物の目に見える外観または口当たりを実質的に変更しない、請求項２３から２６のいずれか一項に記載の組成物。
  28. 前記ｒＯＶＤが、前記ｒＯＶＤと同じ濃度で乳清タンパク質、ダイズタンパク質またはエンドウマメタンパク質を含有する匹敵する組成物と比較して、前記消費可能な液体組成物の目に見える外観または口当たりを実質的に変更しない、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の組成物。
  29. 前記ｒＯＶＤが、ｒＯＶＤを欠如する消費可能な液体組成物と比較して、臭気および／または味についての官能評点に実質的に影響を与えない、請求項２３から２８のいずれか一項に記載の組成物。
  30. 前記ｒＯＶＤが、前記ｒＯＶＤと同じ濃度で乳清タンパク質、ダイズタンパク質またはエンドウマメタンパク質を含有する匹敵する組成物と比較して、臭気および／または味についての官能評点に実質的に影響を与えない、請求項２３から２９のいずれか一項に記載の組成物。
  31. 前記ｒＯＶＤが、前記消費可能な液体組成物が約７２℃と約１２１℃との間の温度まで加熱された後に、実質的に可溶性のままである、請求項２３から３０のいずれか一項に記載の組成物。
  32. 前記ｒＯＶＤが、前記ｒＯＶＤと同じ濃度の乳清タンパク質、ダイズタンパク質またはエンドウマメタンパク質の安定性よりも、加熱処置後に、前記液体において、より高い溶解度、光学的透明度、または溶解度および光学的透明度の両方を有する、請求項２３から３１のいずれか一項に記載の組成物。
  33. 前記加熱処置が、約７２℃と約１２１℃との間の温度への前記液体の曝露を含む、請求項２３から３２のいずれか一項に記載の組成物。
  34. 前記ｒＯＶＤが、前記ｒＯＶＤと同じ濃度の乳清タンパク質、ダイズタンパク質またはエンドウマメタンパク質の溶解度よりも高い、前記液体における溶解度を有する、請求項２３から３３のいずれか一項に記載の組成物。
  35. 前記消費可能な液体組成物が、約２．０と約８．０との間のｐＨを有する、請求項２３から３４のいずれか一項に記載の組成物。
  36. ヒトもしくは動物消費のために製剤化された前記固体形態またはヒトもしくは動物消費のために製剤化された前記液体が、香味料、着色剤、甘味料、アミノ酸、タンパク質、酸味料および防腐剤からなる群から選択される１つまたは複数のさらなる成分を含む、請求項１４から３５のいずれか一項に記載の組成物。
  37. 前記アミノ酸が、トリプトファン、イソロイシン、ロイシンおよびバリン、またはそれらの組合せから選択される、請求項３６に記載の組成物。
  38. 前記タンパク質がリゾチームタンパク質である、請求項３６に記載の組成物。
  39. 前記リゾチームタンパク質が卵白リゾチーム（ＯＶＬ）である、請求項３８に記載の組成物。
  40. ｒＯＶＤのＯＶＬに対する比が、約６０％のｒＯＶＤ：４０％のＯＶＬと約８２％のｒＯＶＤ：１８％のＯＶＬとの間である、請求項３９に記載の組成物。
  41. 前記リゾチームが組換えリゾチームタンパク質である、請求項３８から４０のいずれか一項に記載の組成物。
  42. 前記タンパク質および／または前記アミノ酸が、前記固体形態または前記液体に、改善されたアミノ酸バランスを提供する、請求項３６から４１のいずれか一項に記載の組成物。
  43. タンパク質消化吸収率補正アミノ酸スコア（ＰＤＣＡＡＳ）が、約０．７５と等しいまたはそれよりも大きい、請求項３６から４２のいずれか一項に記載の組成物。
  44. 前記ＰＤＣＡＳＳが、約０．８、０．８５、０．９０、０．９５以上、または前記ＰＤＣＡＡＳが、約１．０であるもしくは１．０である、請求項４３に記載の組成物。
  45. 前記液体が、ｒＯＶＤおよびＯＶＬを含み、前記タンパク質が可溶性であり、組成物が光学的に透明である、請求項３９から４４のいずれか一項に記載の組成物。
  46. 前記消費可能な液体組成物が、ジュース、ブロス、スープ、ソーダ、ソフトドリンク、フレーバー付きの水、タンパク質水、栄養強化水、炭酸水、栄養ドリンク、エナジードリンク、スポーツドリンク、回復ドリンク、加熱ドリンク、コーヒーベースのドリンク、茶ベースのドリンク、植物ベースのミルク、ミルクベースのドリンク、乳成分不使用の植物ベースのマイルドドリンク、乳児用調製粉乳ドリンク、食事代替ドリンクからなる群から選択される飲料である、請求項２３から４５のいずれか一項に記載の組成物。
  47. 前記飲料が、炭酸ガス飽和を含む、請求項４６に記載の組成物。
  48. 前記消費可能な液体組成物が、重量／重量ベースでおよび／または組成物の総体積当たりの重量ベースで、２０％のｒＯＶＤタンパク質と少なくとも６０％のｒＯＶＤタンパク質との間を含むシロップである、請求項２３から４７のいずれか一項に記載の組成物。
  49. 前記液体が乳濁物である、請求項２３から４８のいずれか一項に記載の組成物。
  50. 前記乳濁物が、ソース、グレイビーまたはサラダドレッシングである、請求項４９に記載の組成物。
  51. 組換えオボムコイドタンパク質（ｒＯＶＤ）を含む組成物であって、前記組成物が、ヒトまたは動物消費のために製剤化された半固体形態であり、前記ｒＯＶＤが、口当たり、テクスチャー、硬度、加熱処置に対する安定性、およびｐＨに対する安定性からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる特色を提供する、組成物。
  52. 前記消費可能な半固体組成物が、グミ、キャンディ、ゼリー、シロップ、ゲル、ゲル化調製物である、請求項５１に記載の組成物。
  53. 前記ｒＯＶＤが、ｒＯＶＤを欠如する消費可能な半固体組成物と比較して、前記消費可能な半固体組成物の目に見える外観または口当たりを実質的に変更しない、請求項５１または請求項５２に記載の組成物。
  54. 前記ｒＯＶＤが、前記ｒＯＶＤと同じ濃度で乳清タンパク質、ダイズタンパク質またはエンドウマメタンパク質を含有する消費可能な半固体組成物と比較して、前記消費可能な半固体組成物の目に見える外観または口当たりを実質的に変更しない、請求項５１から５３のいずれか一項に記載の組成物。
  55. 前記消費可能な半固体組成物が、前記ｒＯＶＤと同じ濃度で乳清タンパク質、ダイズタンパク質またはエンドウマメタンパク質を含有する匹敵する組成物よりも高い光学的透明度を有する、請求項５１から５４のいずれか一項に記載の組成物。
  56. 前記ｒＯＶＤが、ｒＯＶＤを欠如する消費可能な半固体組成物と比較して、臭気および／または味についての官能評点に実質的に影響を与えない、請求項５１から５５のいずれか一項に記載の組成物。
  57. 前記ｒＯＶＤが、前記ｒＯＶＤと同じ濃度で乳清タンパク質、ダイズタンパク質またはエンドウマメタンパク質を含有する匹敵する組成物と比較して、臭気および／または味についての官能評点に実質的に影響を与えない、請求項５１から５６のいずれか一項に記載の組成物。
  58. 前記消費可能な半固体組成物が、香味料、着色剤、甘味料、アミノ酸、タンパク質、酸味料および防腐剤からなる群から選択される１つまたは複数のさらなる成分を含む、請求項５１から５７のいずれか一項に記載の組成物。
  59. 前記タンパク質および／または前記アミノ酸が、前記消費可能な半固体組成物に、改善されたアミノ酸バランスを提供する、請求項５８に記載の組成物。
  60. 前記アミノ酸が、トリプトファン、イソロイシン、ロイシンおよびバリン、またはそれらの組合せから選択される、請求項５９に記載の組成物。
  61. 前記タンパク質がリゾチームタンパク質である、請求項５９に記載の組成物。
  62. 前記リゾチームタンパク質が卵白リゾチーム（ＯＶＬ）である、請求項６１に記載の組成物。
  63. ｒＯＶＤのＯＶＬに対する比が、約６０％のｒＯＶＤ：４０％のＯＶＬと約８２％のｒＯＶＤ：１８％のＯＶＬとの間である、請求項６２に記載の組成物。
  64. 前記リゾチームが組換えリゾチームタンパク質である、請求項６１から６３のいずれか一項に記載の組成物。
  65. タンパク質消化吸収率補正アミノ酸スコア（ＰＤＣＡＡＳ）が、約０．７５、０．８、０．８５、０．９０、０．９５と等しいもしくはそれよりも大きい、または前記ＰＤＣＡＡＳが、約１．０であるもしくは１．０である、請求項６１から６４のいずれか一項に記載の組成物。
  66. 前記ｒＯＶＤが、酸化剤または酸素生成剤に曝露されたｒＯＶＤを含む、請求項１から６５のいずれか一項に記載の組成物。
  67. 前記酸素生成剤が、過酸化水素、過炭酸ナトリウム、気泡型酸素、活性二酸化塩素またはオゾンである、請求項６６に記載の組成物。
  68. 前記ｒＯＶＤが、鳥類種において天然に見出されるアミノ酸配列を含む、請求項１から６７のいずれか一項に記載の組成物。
  69. 前記鳥類種が、ニワトリ、ウズラ、シチメンチョウ、ヒメコンドル、ハチドリ、アヒル、ダチョウ、ガチョウ、カモメ、ホロホロチョウ、キジまたはエミュー、およびそれらの任意の組合せである、請求項６８に記載の組成物。
  70. ｒＯＶＤが、配列番号１～４４のうち１つのアミノ酸配列、または配列番号１～４４のうち１つと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から６９のいずれか一項に記載の組成物。
  71. 前記ｒＯＶＤが、実質的に全長ｒＯＶＤアミノ酸配列である、請求項１から７０のいずれか一項に記載の組成物。
  72. 前記ｒＯＶＤが、前記組成物へのタンパク質栄養強化を提供する、請求項１から７１のいずれか一項に記載の組成物。
  73. 前記ｒＯＶＤが、微生物宿主細胞によって産生される、請求項１から７２のいずれか一項に記載の組成物。
  74. 前記微生物宿主細胞が、酵母、糸状菌または細菌である、請求項７３に記載の組成物。
  75. 前記微生物宿主細胞が、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種またはＥ．ｃｏｌｉ種である、請求項７３または請求項７４に記載の組成物。
  76. 前記微生物宿主細胞が、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉである、請求項７３から７５のいずれか一項に記載の組成物。
  77. 組換えオボムコイドタンパク質（ｒＯＶＤ）を含む消費可能な粉末タンパク質組成物であって、前記組成物のタンパク質含量が、７０％よりも高く、前記組成物が、重量／重量ベースでおよび／または組成物の総体積当たりの重量ベースで、２％未満の灰分、２０％未満の炭水化物、および１％未満の、酸加水分解による脂肪を含む、組成物。
  78. 組換えオボムコイドタンパク質（ｒＯＶＤ）を含む消費可能な組成物であって、重量／重量ベースでおよび／または組成物の総体積当たりの重量ベースで、少なくとも１５％のｒＯＶＤタンパク質を含むタンパク質含量を有する、組成物。
  79. 組換えオボムコイドタンパク質（ｒＯＶＤ）および少なくとも１つの消費可能な液体を含む飲料組成物であって、前記ｒＯＶＤが、前記組成物中で実質的に可溶性であり、前記飲料組成物が、実質的に光学的に透明であり、ｒＯＶＤの濃度が、重量／重量ベースでおよび／または組成物の総体積当たりの重量ベースで、約５％よりも高い、飲料組成物。
  80. 飲料が、ジュース、ブロス、スープ、ソーダ、ソフトドリンク、フレーバー付きの水、タンパク質水、栄養強化水、炭酸水、栄養ドリンク、エナジードリンク、スポーツドリンク、回復ドリンク、加熱ドリンク、コーヒーベースのドリンク、茶ベースのドリンク、植物ベースのミルク、ミルクベースのドリンク、乳成分不使用の植物ベースのマイルドドリンク、乳児用調製粉乳ドリンク、食事代替ドリンクからなる群から選択される、請求項７９に記載の飲料組成物。
  81. 前記飲料が、炭酸ガス飽和を含む、請求項７９または請求項８０に記載の飲料組成物。
  82. 消費可能な食品調製物を調製する方法であって、
    微生物宿主によって産生された組換えＯＶＤ（ｒＯＶＤ）を提供するステップであって、
    前記ｒＯＶＤが、Ｎ－結合型グリコシル化を含み、ｒＯＶＤが、Ｎ－結合型マンノシル化を実質的に欠く、ステップ；
    前記ｒＯＶＤを少なくとも１つの消費可能な成分と組み合わせるまたは混合することによって調製物を産生するステップであって、
    前記ｒＯＶＤが、前記組成物へのタンパク質栄養強化、ならびに溶解度、光学的透明度、口当たり、テクスチャー、硬度、加熱処置に対する安定性、およびｐＨに対する安定性からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる特色を提供する、ステップ
    を含む、方法。
  83. 前記ｒＯＶＤが、１つまたは複数のグリコシル化されたアスパラギン残基を含み、各グリコシル化されたアスパラギン残基が、単一のＮ－アセチルグルコサミンを含む、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記ｒＯＶＤが、前記消費可能な食品調製物中に、重量／重量ベースでおよび／または前記調製物の総体積当たりの重量で、１％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％もしくは４０％、または約１％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％もしくは４０％で存在する、請求項８２または請求項８３に記載の方法。
  85. 前記調製物を加熱処置するステップをさらに含む、請求項８２から８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. 加熱処置するステップが、約７２℃と約１２１℃との間の温度への曝露を含む、請求項８５に記載の方法。
  87. 加熱処置するステップが、熱間充填、低温殺菌、レトルト、煮沸、オーブン焼き、直火焼きまたはグリル焼きを含む、請求項８５または請求項８６に記載の方法。
  88. 前記調製物が、約２と約６との間のｐＨを有する、請求項８２から８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記微生物宿主においてｒＯＶＤタンパク質を発現させるステップをさらに含む、請求項８２から８８の一項に記載の方法。
  90. 前記微生物宿主が、酵母、糸状菌または細菌である、請求項８９に記載の方法。
  91. 前記微生物宿主が、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種またはＥ．ｃｏｌｉ種である、請求項８９または請求項９０に記載の方法。
  92. 前記微生物宿主が、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉである、請求項８９から９１の一項に記載の方法。
  93. 前記微生物宿主において、Ｎ－結合型糖タンパク質上の高マンノースおよびハイブリッドオリゴ糖のキトビオースコア内で切断することによってグリカンを除去する活性を有する酵素を発現させるステップをさらに含む、請求項８９から９２の一項に記載の方法。
  94. 前記酵素が、ＥｎｄｏＨ、ＯＣＨ１－ＥｎｄｏＨ融合物、またはＥｎｄｏＨの活性断片を含む、請求項９３に記載の方法。
  95. 前記ｒＯＶＤが、前記微生物宿主から分泌され、前記方法が、前記ｒＯＶＤを少なくとも１つの消費可能な成分と組み合わせるまたは混合する前に、分泌された前記ｒＯＶＤを単離するステップをさらに含む、請求項８９から９４の一項に記載の方法。
  96. 前記分泌されたｒＯＶＤを前記微生物宿主から分離するステップおよび前記ｒＯＶＤを酸化剤または酸素生成剤に曝露させるステップをさらに含む、請求項９５に記載の方法。
  97. 前記酸化剤または酸素生成剤が、過酸化水素、過炭酸ナトリウム、活性二酸化塩素、気泡型酸素またはオゾンを含む、請求項９７に記載の方法。
  98. 前記ｒＯＶＤを乾燥、粉末化および／または噴霧乾燥させるステップをさらに含む、請求項８２から９７のいずれか一項に記載の方法。
  99. 調製物が、ヒト消費に適切である、請求項８２から９８のいずれか一項に記載の方法。
  100. 調製物が、動物消費に適切である、請求項８２から９８のいずれか一項に記載の方法。
  101. 請求項８２から１００のいずれか一項に記載の方法によって産生された消費可能な組成物。
  102. Ｎ－結合型グリコシル化を含む組換えオボムコイド（ｒＯＶＤ）タンパク質であって、前記Ｎ－結合型グリコシル化が、Ｎ－アセチルグルコサミンを含み、マンノース残基を実質的に欠如する、ｒＯＶＤタンパク質。
  103. 前記ｒＯＶＤが、Ｏ－結合型グリコシル化をさらに含む、請求項１０２に記載のｒＯＶＤタンパク質。
  104. グリコシル化され、単一のＮ－アセチルグルコサミン残基を有する、少なくとも１つのアスパラギン残基を含む、請求項１０２または請求項１０３に記載のｒＯＶＤタンパク質。
  105. ｒＯＶＤの少なくとも３つのアスパラギン残基が、単一のＮ－アセチルグルコサミン残基を有する、請求項１０４に記載のｒＯＶＤタンパク質。
  106. 酸化剤または酸素生成剤に曝露されたｒＯＶＤを含む、請求項１０２から１０５のいずれか一項に記載のｒＯＶＤタンパク質。
  107. 前記酸化剤または前記酸素生成剤が、過酸化水素、過炭酸ナトリウム、気泡型酸素、活性二酸化塩素またはオゾンを含む、請求項１０６に記載のｒＯＶＤタンパク質。
  108. 請求項１０２から１０７のいずれか一項に記載のｒＯＶＤタンパク質を含む組成物であって、前記組成物が、粉末化形態であり、前記組成物のタンパク質含量が、重量／重量ベースでおよび／または組成物の総体積当たりの重量ベースで、約７０％またはそれよりも高い、組成物。
  109. 前記ｒＯＶＤタンパク質が、重量／重量ベースでおよび／または組成物の総体積当たりの重量ベースで、約８０％またはそれよりも高くで前記組成物中に存在する、請求項１０８に記載の組成物。
  110. ｒＯＶＤタンパク質を作製する方法であって、
    真核生物宿主細胞においてｒＯＶＤタンパク質を産生するステップであって、前記ｒＯＶＤタンパク質が、前記宿主細胞から分泌され、前記宿主細胞が、Ｎ－アセチルグルコサミン連結からマンノース残基を除去する活性を有する酵素を発現する、ステップ；
    前記宿主細胞から前記ｒＯＶＤタンパク質を分離するステップ；
    前記ｒＯＶＤタンパク質を酸化剤または酸素生成剤に曝露させるステップ；および
    前記酸化剤または酸素生成剤からｒＯＶＤを分離するステップ
    を含む、方法。
  111. 前記酵素が、ＥｎｄｏＨ、ＯＣＨ１－ＥｎｄｏＨ融合物、またはＥｎｄｏＨの活性断片を含む、請求項１１０に記載の方法。
  112. 前記酸化剤または酸素生成剤が、過酸化水素、過炭酸ナトリウム、気泡型酸素、活性二酸化塩素またはオゾンを含む、請求項１１０または請求項１１１に記載の方法。
  113. 前記宿主細胞が、酵母または真菌細胞である、請求項１１０から１１２のいずれか一項に記載の方法。
  114. 前記宿主細胞がＰｉｃｈｉａ ｓｐ．である、請求項１１０から１１３のいずれか一項に記載の方法。
  115. 前記ｒＯＶＤが、鳥類種に由来する、請求項８２から１００もしくは請求項１１０から１１４のいずれか一項に記載の方法、請求項１０２から１０７のいずれか一項に記載のｒＯＶＤタンパク質または請求項７７から８１、１０１、１０８もしくは１０９のいずれか一項に記載の組成物。
  116. 前記ｒＯＶＤが、ニワトリＯＶＤ、ガチョウＯＶＤタンパク質、ハチドリＯＶＤまたはヒメコンドルＯＶＤのアミノ酸配列を含む、請求項８２から１００もしくは請求項１１０から１１４のいずれか一項に記載の方法、請求項１０２から１０７のいずれか一項に記載のｒＯＶＤタンパク質または請求項７７から８１、１０１、１０８もしくは１０９のいずれか一項に記載の組成物。
  117. 前記ｒＯＶＤが、配列番号１～４４からなる群から選択されるアミノ酸配列、および配列番号１～４４と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８２から１００もしくは請求項１１０から１１４のいずれか一項に記載の方法、請求項１０２から１０７のいずれか一項に記載のｒＯＶＤタンパク質または請求項７７から８１、１０１、１０８もしくは１０９のいずれか一項に記載の組成物。
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