ES2351456B1 - Metodo in vitro para el pronostico o prediccion de la respuesta por parte de pacientes con artritis reumatoide al tratamiento con agentes que reconocen el receptor de membrana cd20 de los linfocitos b - Google Patents

Abstract

Método in vitro para el pronóstico o predicción de la respuesta por parte de pacientes con artritis reumatoide al tratamiento con agentes que reconocen el receptor de membrana CD20 de los linfocitos B. El método de la invención comprende la determinación en una muestra de sangre de dichos pacientes y mediante la cuantificación del nivel de expresión transcripcional (ARNm), antes de iniciar el tratamiento, de al menos uno de los genes seleccionado del grupo: ARG1, CPD, TRAF1, C1QA, LRRN3, HLA-DQA1, NLK, TLR4, LOC89944, TOM1L1, BACH, NCALD, EIF2C2, NFIC, PCDHB7, FLJ32770, ARID3A, C14ORF9, CSNK1E, BCAS1, TEAD2, C6orf145 y SNTA1; y la comparación de dicho nivel de expresión con respecto a los valores de expresión previamente obtenidos de pacientes que demostraron ser respondedores al tratamiento o no respondedores al mismo.

Description

Método in vitro parael pronósticooprediccióndela respuesta por partede pacientes conartritis reumatoideal tratamiento con agentes que reconocen el receptor de membrana CD20 de los linfocitos B.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método in vitro (en adelante método de la invención) para el pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento con agentes que reconocen el receptor de membrana CD20 de los linfocitos B, como por ejemplo rituximab,por parte de pacientes con Artritis Reumatoide (AR). Así, la presente invención puede englobarse dentro del campo de la medicina personalizada, de la reumatología o de la genética humana como campo que estudia las enfermedades de base genética.

Estado de la técnica

La AR es una de las enfermedades autoinmunes más frecuentes en el mundo (prevalencia mundial ∼ 1%). La AR conduceala inflamación crónicadelas articulacionessinovialesyaldesarrollodedañoarticular progresivoquepuede darlugara una marcada incapacidad funcional. Además,laARes una enfermedadmuy heterogéneaycomplejaen todos sus aspectos, incluyendo tanto sus manifestaciones clínicas como la variabilidad en su respuesta a las diferentes terapias.

Fruto de la intensa investigación llevada a cabo durante los últimos años, se han identificado varios tratamientos para el control de la AR. Rituximab es un anticuerpo monoclonal que reconoce el receptor de membrana CD20, específicode linfocitosB.La uniónde rituximab con CD20provoca una depleción transitoriadelos linfocitosB.En principio,el fármacose diseñóparael tratamientodelos linfomasBdetipoNoHodgkin. Recientemente,sehapodido comprobarque tambiénesun tratamiento eficazpara controlarlaAR[Edwards,J.C.etal.Efficacyof B-cell-targeted therapy with rituximabinpatients with rheumatoid arthritis.NEnglJMed 350, 2572-81 (2004)].

Sin embargo, existe un porcentaje de pacientes que no responden al tratamiento con agentes que reconocen el receptor de membrana CD20 de los linfocitosBydeben ser redirigidos hacia terapias alternativas. Por lo tanto,los métodosparael pronósticoo prediccióndelos pacientesquesepueden beneficiarde este tratamientoysu diferenciación de los pacientes no respondedores a dicho tratamiento que serán focalizados hacia terapias alternativas, son una necesidad creciente dirigida hacia el reto que supone la medicina individualizada.

El artículo[Dass,S.etal.Highly sensitiveBcellanalysispredictsresponseto rituximabtherapyin rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 58, 2993-9 (2008)]divulga la asociación entre el nivel de depleción de linfocitosBy la respuesta clínica al cabo de varias semanas. En particular, los individuos en los que la depleción es incompleta, la respuestaa rituximab espeor.La asociación es estadísticamente significativa pero no muy fuerte(P= 0.01). Además, la predicción en este estudio se realiza después de realizar el tratamiento.

En el documento[Teng, Y. K. et al. Immunohistochemical analysis as a means to predict responsiveness to rituximab treatment. Arthritis Rheum 56, 3909-18 (2007)]se divulga la positividad para los anticuerpos anti-péptidos citrulinados (anti_CCPs)en sueroen aquellos pacientescon una alta infiltraciónde linfocitosBCD79a+enla membranasinovial.Elproblemadeestemétodoesquesólopermite predecirunsubgrupode pacientesy,además,requiere la obtención de una biopsia sinovial. Comparado con la extracción de sangre, la extracción de biopsias sinoviales es un métodoaltamenteinvasivo parael pacienteymuy poco práctico (pocos centros clínicos cuentan conel personal entrenadoyla tecnología para realizarlo).

En el documento[Cohen, S. B. et al. Rituximab for rheumatoid arthritis refractory to anti-tumor necrosis factor therapy: Results of a multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled, phase III trial evaluating primary efficacy and safety at twenty-four weeks. Arthritis Rheum 54, 2793-806 (2006)]se divulga uno de los primeros estudios dondeseevaluabala eficaciay seguridadde rituximabenAR. Encuentran unaleve asociacióndela respuesta conel Factor Reumatoide aunque con poca significación.

En[Roll, P., Dorner, T. & Tony, H. P. Anti-CD20 therapy in patients with rheumatoid arthritis: predictors of responseandBcell subsetregenerationafterrepeatedtreatment. ArthritisRheum58, 1566-75(2008)]se lleva a cabo un análisis de citometría de flujo pero, como en Dass et al, encuentran avocaciones débiles de subgrupos de linfocitos con la respuesta clínica después del tratamiento.

Ninguno de los documentos localizados en el estado de la técnica describe los genes, cuyo nivel de expresión es analizado en la presente invención, con el objetivo de pronosticar la respuesta al tratamiento con agentes que reconocen el receptor de membrana CD20 de los linfocitos B, como por ejemplo rituximab, por parte de pacientes con AR. Por lo tanto, no se ha localizado en el estado de la técnica ninguna evidencia relacionada con la utilización de los genes citadosenlapresenteinvención,loscuales,taly comoseexplicaenla descripción,hansido específicamente seleccionados mediante un exhaustivo proceso de cribado entre miles de genes.

Así, la presente invención soluciona los problemas planteados en el estado de la técnica presentando un método para el pronóstico o predicción de los pacientes que se pueden beneficiar del tratamiento con agentes que reconocen

el receptorde membrana CD20de los linfocitosBy su diferenciaciónde los pacientes no respondedores a dicho tratamiento que serán focalizados hacia terapias alternativas.

Descripción de la invención

Breve descripción de la invención

La presente invención se refiere a un método in vitro para el pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento con agentes que reconocen el receptor de membrana CD20 de los linfocitosB por parte de pacientes con AR, que comprendela determinaciónenuna muestrade sangrede dichospacientesymediantela cuantificacióndelnivelde expresión transcripcional(ARNm), antes de iniciar el tratamiento, de al menos unode los genes seleccionado de las Tablas1a3,particularmente del grupo: ARG1, CPD, TRAF1, C1QA, LRRN3, HLA-DQA1, NLK, TLR4, LOC89944, TOM1L1,BACH, NCALD, EIF2C2,NFIC, PCDHB7, FLJ32770, ARID3A, C14ORF9, CSNK1E, BCAS1, TEAD2, C6orñ45ySNTA1;yla comparaciónde dichoniveldeexpresión con respectoalosvaloresdeexpresiónpreviamente obtenidos de pacientes que demostraron ser respondedores al tratamiento o no respondedores al mismo.

En una realización preferida de la invención dicho pronóstico se realiza a través del valor de expresión resultante del ratio ARG1/TRAF1en sangre total.Enlos pacientesno respondedoreslaexpresióndeARG1es superioraTRAF1 (ratio positivo)y en todoslos pacientes respondedoresesalrevés (rationegativo).A suvez,laelevadaexpresiónde ARG1 está claramente asociadaalafaltade respuestaasí comolaelevadaexpresiónde TRAF1es predictivadeuna respuesta clínicaa rituximabfavorable.

TalycomoseobservaenlasTablas1a3,debe tenerseen cuentaque,deentrelosgenes particularmente preferidos, los genes sobre-expresados en pacientes respondedoreso infra-expresados en pacientes no-respondedores antesde iniciar el tratamiento son:

•

TRAF1, LRRN3yNLK en sangre total.

•

TLR4,TOM1L1, PCDHB7yFLJ32770 en células CD4+T.

•

C14ORF9, CSNK1E, BCAS1, TEAD2, C6orf145ySNTA1 en célulasB.

Además, de entre los genes particularmente preferidos, los genes infra-expresados en pacientes respondedores o sobre-expresados en pacientes no-respondedores antes de iniciar el tratamiento son:

•

ARG1, CPD, C1QAyHLA-DQA1 en sangre total.

•

LOC89944,BACH, NCALD,EIF2C2yNFIC en células CD4+T.

•

ARID3A en células B.

Así, el problema técnico resuelto por la presente invención se refiere a un método in vitro para el pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento con agentes que reconocen el receptor de membrana CD20 de los linfocitos B(comopor ejemplo rituximab)porpartede pacientes aquejadosdeAR,apartirde células sanguíneas tomadasde muestrasde sangre totalde dichos pacientes (comprendenel 100%de las poblaciones celulares en ella presentesyno sólodelas célulasPBMCs),queessencillo(sebasaenel análisisdeunpequeñonúmerodegenes)ypocoinvasivopara elpaciente(norequierela realizacióndebiopsias).Además,enlapresenteinvenciónseanalizóelpatróndeexpresión génicaen subpoblacionesdecélulas sanguíneastalescomolas célulasCD4+Tylas célulasBencontrándoseunaserie genes cuyaexpresión presenta una relación estadísticamente significativa conla respuestadelos pacientes conARal tratamiento con rituximab.

Es importantehacer notarquecadaunodelosgenes estudiadosenla presenteinvención, incluidosenlasTablas1 a3,tiene potencial predictivoporsí mismo.Porlo tantoenel métododelainvención podría utilizarse, con suficientes visosde efectividad, cualquieradelos genes comprendidoenlasTablas1a3, particularmente seleccionadodel grupo: ARG1, CPD,TRAF1, C1QA, LRRN3, HLA-DQA1, NLK, TLR4, LOC89944,TOM1L1,BACH, NCALD, EIF2C2, NFIC,PCDHB7, FLJ32770,ARID3A, C14ORF9, CSNK1E, BCAS1, TEAD2, C6orf145ySNTA1, así como cualquier sub-combinación de los mismos con un número de genes ≥ 2, o el conjunto de genes en su totalidad.

Ademásenla presenteinvenciónseaíslayse analizaelARNmdesangretotal,sinrealizarningún fraccionamiento previo. El perfil de expresión, por tanto, incluye todas las poblaciones celulares de la sangre. Este aspecto adquiere importanciaal teneren cuentaquecadatipoopoblacióncelularpuedentenerasociadosdiferentesperfilesdeexpresión génica.

El tipo de muestra tomada en una realización preferida de la presente invención (sangre total) hace que el método seamuypocoinvasivoparael pacientealnorequerir biopsiassinovialesparalaextraccióndelas muestras, pudiéndose aplicaratodoslos pacientesconAR.En comparaciónconla muestrasinovial,la muestra sanguíneapuedeser obtenida en cualquier centro clínico con muy poco riesgo para el paciente. En particular, los genes identificados utilizando el métodoPaxGene(verejemplo2)parapreservarelARN,sonlosquepermitenun procesamientomásrápidoyaqueno

es necesario llevara cabo ningún pasode separación celular.En cambio, los genes identificados en CD4+ylinfocitos B, requieren un procedimiento técnico más laborioso.

La predicción de la respuesta al tratamiento por parte de pacientes aquejados de AR es útil en dos sentidos principales:

1.

Predicción de pacientes no respondedores al tratamiento con agentes que reconocen el receptor de membrana CD20 de los linfocitos B: de esta forma se podría dirigir al paciente hacia tratamientos alternativos sinnecesidaddeaplicarle, comoprimer tratamiento,la terapia con agentesque reconocen el receptorde membrana CD20 de loslinfocitos B. Algunos de los posibles efectos secundarios debidos al tratamiento con agentes que reconocen el receptor de membrana CD20de los linfocitosB se citan en la referencia: [Long termtreatmentof rheumatoid arthritis with rituximab.AutoimmunityReviews,Volume8, Issue7,June2009,Pages 591-594 RobertoCaporali,MartaCaprioli,Francesca Bobbio-Pallavicini,SerenaBugatti and Carlomaurizio Montecucco]

2.

Predicción de respondedores al tratamiento con agentes que reconocen el receptor de membrana CD20 de los linfocitos B: esta herramienta es muy útil para empezar el tratamiento de forma temprana ya que en el caso particulardelaARseha demostradoqueel tratamientoenfases precocesdela enfermedadpueden ser muy efectivas evitando el avance de las erosiones articulares.

Descripción de las figuras

Figura 1. Muestra el análisis jerárquico de las mediciones del índice de mejora RelDAS28 (ver ejemplo 1) de los pacientes tratados con rituximab. Se identificaron claramente dos grupos distintosde pacientes.Apartir de estos resultadoslospacientesfueronclasificadoscomorespondedoresal tratamientoconrituximab(n=4,clusterizquierdo)o no respondedores(n=5, cluster derecho).La altura(h)del dendrograma correspondeala diferencia entrelosindividuos calculada, en este caso, mediante la distancia euclidea. En este sentido, las diferencias más grandes (grupos más diferenciadoso “clusters”) serán aquellas que se den antes enel árboly las menores corresponderána las últimas ramificaciones.Las siglasR1,R2,R3yR4 significan respectivamente: Respondedor1, Respondedor2, Respondedor 3 y Respondedor 4. Las siglas NR1, NR2, NR3, NR4 y NR5 significan respectivamente: No respondedor 1, No respondedor2,No respondedor3,No respondedor4yNo respondedor5.

Figura 2. Muestra que el ratio entre la expresión de los genes ARG1 y TRAF1 (ARG1/TRAF1) en pacientes respondedoresal tratamientocon rituximab (diamantesdel cuadrante inferiorizquierdoyno respondedores (diamantes de cuadrante superior derecho)es consistenteenel análisispor microarray(ejeX)yporRT-PCR(ejeY). Ademásse separan claramente ambos grupos de pacientes.

Figura3.MuestralaexpresióndelosgenesARG1yTRAF1ensangretotaldelospacientestratadoscon rituximab. Se puede ver claramente como en los no respondedores la expresión de ARG1 es superior a TRAF1 (ratio positivo) y en todos los pacientes respondedores es al revés (ratio negativo). A su vez, la elevada expresión de ARG1 está claramente asociadaalafaltade respuesta así comola elevadaexpresiónde TRAF1 espredictivade una respuesta clínicaa rituximabfavorable.

Descripción detallada de la invención

En la presente invención se evaluaron los perfiles de ARN en tres poblaciones diferentes de células de la sangre (sangre total, células CD4+ylinfocitosB) para identificar genes asociados conla respuestade pacientes conARal tratamiento con agentes que reconocen el receptor de membrana CD20 de los linfocitos B. Como consecuencia de dicha evaluación se identificaron marcadores capaces de predecir la respuesta de pacientes con AR al tratamiento con agentes que reconocen el receptor de membrana CD20 de los linfocitos B, de forma previa al inicio del tratamiento con dichos agentes.

Así, por ejemplo, se evidenció que un aumento de la expresión del gen ARG1 en la sangre total está significativamente asociado con un peor resultado en la terapia con agentes que reconocen el receptor de membrana CD20 de los linfocitos B. Recientemente se ha descubierto que el gen ARG1 es un importante modulador de la respuesta inflamatoria mediantela reduccióndela disponibilidadextracelulardeargininay,porlo tanto,del sustratoparala producción del Oxido Nítrico pro-inflamatorio.Paradójicamente,el segundo genmás asociado conla respuestaa terapia enla sangre total, que además se encuentra sobre-expresado en pacientes no respondedores al tratamiento con rituximab, eselCPDquecodificaparala carboxipeptidasaD.La carboxipeptidasaD esunaexopeptidasaqueaíslaresiduos de arginina de proteínas aumentando la disponibilidad de la arginina libre para la producción de Oxido Nítrico. La síntesis de Oxido Nítrico a partir de arginina produce citrulina que es el antígeno de los anticuerpos anti-CCP. Estos hallazgos sugieren que este mecanismo de acción es relevante en la AR. Durante el análisis de la sangre total, además seevidencióquela sobre-expresióndelgenTRAF1está asociadoconuna respuestapositivaal rituximabporpartede pacientes con AR.

Además, se identificó un aumento en la expresión del gen TLR4 en células CD4+T en pacientes respondedores al tratamiento con rituximab.

ARID3A codifica para unfactorde transcripción específico en las célulasB queaumentala transcripcióndela cadena pesada de las inmunoglobulinas. En la presente invención se evidenció que dicho gen se encuentra sobreexpresado en pacientes con AR no respondedores a rituximab antes de iniciar el tratamiento.

Dichos hallazgos permitieron eldiseño de un método in vitro para el pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento con agentes que reconocenel receptordemembrana CD20de los linfocitosBpor partede pacientescon AR,que comprendela determinaciónen una muestrade sangrede dichos pacientes,ymediantela cuantificacióndel nivelde mRNA, delniveldeexpresióndeal menos unode los genes comprendidos en lasTablas1 a3, particularmente enel grupo: ARG1, CPD, TRAF1, C1QA, LRRN3, HLA-DQA1, NLK, TLR4, LOC89944,TOM1L1,BACH, NCALD, EIF2C2, NFIC, PCDHB7, FLJ32770, ARID3A, C14ORF9, CSNK1E, BCAS1, TEAD2, C6orf145ySNTA1,yla comparaciónde dichoniveldeexpresión con respectoa losvaloresdeexpresión previamente obtenidos de pacientes que demostraron ser respondedores al tratamiento o no respondedores al mismo. En el caso de llevar a cabo el método de la invención en base al valor de expresión resultante del ratio ARG1/TRAF1, el pronóstico puede realizarse directamente sin comparar dicho valor con los valores obtenidos en individuos control.

Se identificó un grupo de genes significativamente asociados a la respuesta al tratamiento con rituximab en pacientes con AR usando un microarray. Se determinaron los genes estadísticamente significativos en la sangre total, célulasCD4+TycélulasB.Además,sellevóacabolavalidacióndelos candidatosmásrelevantes medianteRT-PCR. Los subgrupos de genes validados representan un nuevo grupo de marcadores para la predicción de la respuesta al tratamiento con rituximab de los pacientes con AR.

Ejemplos

Ejemplo1

Selección de pacientes

Inicialmente se seleccionaron los pacientes aquejados de AR en la Unidad de Reumatología del Hospital UniversitarioVall d’Hebron (Barcelona,España).Atodoslos pacientesseles había diagnosticadoAR siguiendolos criterios establecidos porACR “American College of Rheumatology”. Los pacientes seleccionados para el tratamiento presentaban AR activa: índiceDAS28(“Disease activity score” > 5.1). La evaluación clínica de los pacientes usando el índiceDAS28 se llevóa cabo cada tres mesesde tratamiento.Todos los procedimientos realizados cumplen conlaDeclaraciónde Helsinki.El estudio fue aprobado porel Comité Ético del HospitalUniversitarioVall d’Hebron.

Para ocho de los pacientes tratados con rituximab se obtuvo un resultado positivo en la prueba serológica del Factor Reumatoide (FR). Además cinco de los pacientes fueron anti-CCP (anti-cyclic cytrullinated peptide) positivos. Todos los pacientes fueron mujeres sobre las que el tratamientocon agentes anti-TNF habíafallado. Después dela administración intravenosa de metilprednisona a una dosis de 100 mg, todos los pacientes recibieron una infusión de 1-gmde rituximabenlos días1y15de tratamiento.La respuesta clínicaa rituximabfue determinadaenla semana24 usando el índice RelDAS28. Con este método, la eficacia a un tratamiento particular es estimada a través de la mejora enel índice relativoDAS28. Posteriormenteseaplicaron métodos analíticos (“clustering” jerárquico)para identificar grupos de pacientes con respuestas similares al tratamiento con rituximab (Figura 1).

Ejemplo2

Recogida de sangre

Las muestrasde sangre paralaextraccióndeARNfueronextraídasdelos pacientes duranteeldíadela primera aplicación de rituximab.

En la presente invención se utilizó el sistema “PAXGene” (PreAnalytix, Suiza)para la preservación inmediata del ARN procedente de muestras de sangre total. Este sistema utiliza un agente preservante del ARN contenido en el mismotubodeextraccióndela sangrey,porlo tanto,los perfilesde sangre obtenidos son representativosdelas condiciones in vivo.Todos los tubos “PAXGene” se almacenaron congelados a -80ºC hasta el aislamiento de ARN. El ARN fue extraído por medio del kit de aislamiento total “PAXGene” (Qiagen, USA). Finalmente la calidad del ARN de todaslas muestrasseevaluó usandoel sistemadegel “BioAnalyzer” (Agilent,USA).

Ejemplo3

Análisis por citometría de flujo

Se realizó el análisis por citometría de flujo en todos los pacientes incluidos en el estudio, el mismo día de la extracción de sangre para el análisis en el microarray. A partir de la muestra de sangre total se determinaron las subpoblaciones de leucocitos, así como las células rojas de la sangre. Con el objetivode estimar el nivel de pureza celular obtenido en el paso de la selección de linfocitos, se llevó a cabo, además, la determinación por citometría de flujode las células CD4+TyCD20+B.

Ejemplo4

Análisisdeexpresiónde losgenes

El análisis de la expresión de genes de todo el genoma fue llevado a cabo utilizando el sistema “Illumina Human6 v1 Beadchip array system(Illumina)”. Mediante el uso de la tecnología “bead-based”, el microarray empleado enla presenteinvenciónevaluólaexpresiónde 47.000 transcritos (www.illumina.com). Los ARNdebuena calidad (ratio 28S/18S > 1.8, número RNAIntegrity Number >9) fueron posteriormente procesados usando dicho protocolo estándar de Illumina. Después del mareaje e hibridación de la muestra, los “arrays” fueron leídos utilizando el lector de arrays “Illumina’s BeadArrayReader”. Los datos fueronextraídos utilizandoelprograma informático “Illumina BeadStudio”.El restode pasos se realizaron utilizandoel programa informáticoR (http://cran.r-project.org/)y su extensión para el análisis de datos genómicos en el programa “Bioconductor”. En el momento del análisis de los datos,sepusoenmarchaunaversión actualizadadelarray “IlluminaHuman-6v2,Beadchiparray”.Estanuevaversión incorporaun sustancial rediseñodela secuenciadelas sondasy,porlo tanto,elanálisisdelmicroarrayfue restringidoa laporcióndelassondasquefueron consideradas “válidas”segúnlanuevaversióndel microarray(datos disponiblesen www.illumina.com).Losvaloresdelaexpresión finaldelos transcritos fueron transformadosalog2ynormalizados utilizando el método quantile normalization (Bolstad Bioinformatics ’03). Antes de llevar a cabo cualquier análisis estadístico, se realizó un “clustering” jerárquico para detectary descartar cualquier posible microarray convalores extremos (“outlier”).

Ejemplo5

Análisis mediante RT-PCR

La transcripciónreversadelas muestrasdeRNAobtenidasdelostrestiposdecélulasfuellevadoacabo usandoel “cDNAArchiveKit” de Applied Biosystems. La determinación medianteRT-PCR del conjunto de genes candidatos se realizó usando ensayosTaqMan prediseñados de Applied Biosystems.Para la sangre total se usaron los ensayos deexpresióngénica Hs00194639_mlyHs00163660_mlconelobjetivodemedirlosgenesTRAF1yARG1respectivamente,yanalizarla correlación con losdatos del microarray usandoel ratio obtenidode las dos mediciones.Para cada unode los linfocitos candidatos sebuscaron controles endógenosa partir del grupode genes que mostraron una variación mínima en los datos del microarray.

Ejemplo6

Análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos fueron llevados a cabo usando la metodología expuesta en[R: A Language and Environmentfor Statistical Computing.In:RDevelopmentCoreTeam;2006], Los genesexpresados diferencialmente entre los pacientes respondedoresal tratamientocon rituximabylos no respondedoresal mismo fueron determinados usando el test Welch implementado en el paquete multtest. Las correcciones del test fueron realizadas usando el métodode Benjamini and HochberFalse Discovery Rate.El análisis ontológicode genes se llevóa cabo usandola herramienta de análisis GOstat[BeissbarthT, SpeedTP. GOstat: find statistically overrepresented Gene Ontologies withinagroupofgenes. Bioinformatics 2004;20(9): 1464-5],Las correlaciones entreel microarrayylas medidasde laexpresión génica medianteRTPCR fueron calculadas usandoel coeficientede correlaciónde Pearson.

Resultados

Ejemplo7

Clasificación de pacientes

El análisis jerárquico de las mediciones RelDAS28 de los pacientes tratados con rituximab identificó claramente dos grupos distintos de pacientes (Figura 1).A partir de estos resultados los pacientes fueron clasificados como respondedores el tratamiento con rituximab (n=4, cluster izquierdo) o no respondedores (n=5, cluster derecho).

Ejemplo8

Determinaciónde losgenes asociadosalarespuestaa rituximab

Medianteel análisisdelaexpresióngénicaenel microarrayse identificaron7genes(ARG1,CPD,TRAF1,C1QA, LRRN3, HLA-DQA1yNLK) diferencialmenteexpresadosenlos perfilesde sangre totalde pacientes conAR tratados con rituximab (P<0,05). En el análisis de las células CD4+Tysubpoblaciones de célulasB se identificaron 33y50 diferencialmenteexpresados entre respondedoresy no respondedores.EnlasTablas1 a3 se muestra una listadelos más significativos para cada uno de los tres tipos de células.

Ejemplo9

Análisisdegenes candidatos mediante RT-PCR

Enla sangre total se identificó una gran correlación entreel microarrayylas determinacionesRT-PCR(r = 0.75). La Figura2muestrauna clara separación entre respondedoresy no respondedoresal tratamiento con rituximabque es obtenida usando losvalores del microarrayolaRT-PCRde los genes ARG1yTRAF1.Enlavalidacióndelas células CD4+T se encontró además una gran correlación entrela determinaciónde TLR4(r = 0.91).En las célulasB, sin embargo, no se replicó la expresión diferencial observada en el microarray (r = 0.47).

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA1

Listadodegenes diferencialmenteexpresados en célulasB(LinfocitosB) en pacientes conARrespondedores

ala terapia con rituximab vspacientes norespondedores. Losgenes sombreados son los que presentaron mayor significación estadística

TABLA2

Listadodegenes diferencialmenteexpresados en células CD4+T (Linfocitos T-CD4) en pacientes conARrespondedoresalaterapia con rituximabvs pacientesnorespondedores.Losgenes sombreados son los que presentaron mayor significación estadística

TABLA3

Listadodegenes diferencialmenteexpresados en célulasdela sangre total en pacientes conAR respondedores a la terapia con rituximab vs pacientes no respondedores

Los genes ARG1, TRAF1, TLR4yARID3A fueron analizados medianteRT-PCR.

Todoslos genes citadosenlasTablas1 a3 son estadísticamente significativosyporlotanto cada unode ellos puede ser eficazmente empleado en el método de la invención. Sin embargo, los genes que aparecen sombreados forman parte de un aspecto preferido de lainvención puesto que son los genes que presentaron mayor significación estadística.

Taly como muestra lasTablas1 a3, enla sangre total se identificaron un grupode siete genes diferencialmente expresados entre pacientes respondedores a la terapia con rituximab vs pacientes no respondedores. Además se presentan losgenes con mayor significación estadísticaexpresados en célulasCD4+TyB,diferencialmenteexpresados entre pacientes respondedores a la terapia con rituximab vs pacientes no respondedores (P<0.0001,n =9n =7, respectivamente).

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Método in vitro para el pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento con agentes que reconocen el receptor de membrana CD20 de los linfocitos B por parte de pacientes con artritis reumatoide, que comprende la determinaciónenuna muestrade células sanguíneasde dichospacientesdelniveldeexpresióndeal menosuno,de cualquier combinación o de la totalidad de los genes seleccionados del grupo: ARG1, CPD, TRAF1, C1QA, LRRN3, HLA-DQA1, NLK, TLR4, LOC89944,TOM1L1,BACH, NCALD, EIF2C2, NFIC,PCDHB7, FLJ32770, ARID3A, C14orf9, CSNK1E, BCAS1, TEAD2, C6orf145ySNTA1;yla comparaciónde dichoniveldeexpresión con respecto a losvaloresdeexpresión obtenidosde pacientes respondedoresal tratamientoyno respondedoresal mismo.

2. 2.

   Método in vitro, según la reivindicación 1, caracterizado porque la determinación del nivel de expresión de los genesARG1,CPD, TRAF1,C1QA, LRRN3, HLA-DQA1yNLKse realizaen muestrasde sangre total.

3. 3.

   Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque el pronóstico se realiza atendiendo al valor de expresión obtenidodel ratioARG1/TRAF1,sin necesidadde compararelvalordel ratio con respectoalosvaloresdeexpresión obtenidosde pacientes respondedoresal tratamientoyno respondedoresal mismo, dondeun ratio ARG1/TRAF1 positivo predice de forma directa que los pacientes no responderán al tratamientoy un ratio ARG1/TRAF1 negativo predicede forma directaquelos pacientes responderánal tratamiento.

4. 4.

   Método in vitro, según la reivindicación 1, caracterizado porque la determinación del nivel de expresión de losgenes TLR4, LOC89944,TOM1L1,BACH, NCALD, EIF2C2, NFIC, PCDHB7yFLJ32770 se realiza en células CD4+T.

5. 5.

   Método in vitro, segúnla reivindicación1, caracterizado porque la determinación del nivel de expresión de los genes ARID3A, C14ORF9, CSNK1E, BCAS1, TEAD2, C6orf145ySNTA1 se realiza en célulasB.

6. 6.

   Método in vitro,segúnlareivindicación1,que comprendela determinacióndelniveldeexpresióndel conjunto de genes: ARG1, TRAF1, TLR4yARID3A.

7. 7.

   Método in vitro, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque los genes TRAF1, LRRN3 yNLK están sobre-expresadosen sangre total,elgrupode genes TLR4,TOM1L1, PCDHB7yFLJ32770 están sobreexpresados en células CD4+Tyelgrupo de genes C14ORF9, CSNK1E, BCAS1, TEAD2, C6orf145ySNTA1 están sobre-expresados en célulasB; en pacientes respondedores antesde iniciarel tratamiento.

8. 8.

   Método in vitro, según cualquiera de las reivindicaciones1-6, caracterizado porque los genes ARG1, CPD, C1QAyHLA-DQA1 están infra-expresados en sangre total,el grupode genes LOC89944,BACH, NCALD, EIF2C2 yNFIC están infra-expresados en células CD4+Tyel gen ARID3A están infra-expresados en célulasB; en pacientes respondedores antes de iniciar el tratamiento.

9. 9.

   Método, según cualquierade las reivindicaciones1-6, caracterizado porque el nivel de expresión de los genes es determinado mediante la cuantificación del nivel de ARNm en la muestra de células sanguíneas.

10. 10.

    Método in vitro, según la reivindicación 1, caracterizado porqueel agenteque reconoceel receptorde membrana CD20de los linfocitosB es rituximab.

    11 12 13 14

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    Fecha de presentación de la solicitud: 24.06.2009

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    A

    TOONEN, E.J.M., et al. Gene expression profiling in rheumatoid arthritis: current concepts and future directions. Annals of the rheumatic diseases. Dic-2008. Vol. 67, nº 12, páginas 1663-1669. ISSN 1468-2060 (Electrónico). Ver todo el documento. 1-10

    A

    LEQUERRÉ, T., et al. Gene profiling in white blood cells predicts infliximab responsiveness in rheumatoid arthritis. Arthritis research and therapy. 03-07-2006. Vol. 8, nº 4, página R105. ISSN 1478-6354. Ver todo el documento. 1-10

    A

    SEKIGUCHI, N, et al. Messenger ribonucleic acid expression profile in peripheral blood cells from RA patients following treatment with an anti-TNF-alpha monoclonal antibody, infliximab. Rheumatology (Oxford). Jun-2008. Vol. 47, nº 6, páginas 780-788. ISSN 1462-0324. Ver todo el documento. 1-10

    A

    KOCZAN, D., et al. Molecular discrimination of responders and nonresponders to anti-TNF alpha therapy in rheumatoid arthritis by etanercept. Arthritis research and therapy. 02-05-2008. Vol. 10, nº 3, página R50. ISSN 1478-6362 (Electrónico). Ver todo el documento. 1-10

    Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

    El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones □ para las reivindicaciones nº:

    Fecha de realización del informe 11.08.2010

    Examinador B. Pérez Esteban Página 1/4

    Nº de solicitud: 200930349

    INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TÉCNICA

    CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD

    C12Q 1/68 (2006.01) C12N 15/12 (2006.01) A61P 19/02 (2006.01)

    Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)

    C12Q, C12N, A61P

    Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados)

    INVENES, EPODOC, WPI, TXTUS0, TXTUS1, TXTUS2, TXTUS3, TXTEP1, TXTGB1, TXTWO1, TXTAU1, MEDLINE, BIOSIS, NPL, EMBASE, XPESP, GEO Profiles, GenBank.

    OPINIÓN ESCRITA

    Nº de solicitud: 200930349

    Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 11.08.2010

    Declaración

    Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

    Reivindicaciones 1-10 SÍ

    Reivindicaciones _____________________________________

    NO

    Actividad inventiva

    Reivindicaciones 1-10 SÍ

    (Art. 8.1 LP11/1986)

    Reivindicaciones _____________________________________ NO

    Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

    Base de la Opinión.-

    La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como ha sido publicada.

    OPINIÓN ESCRITA

    Nº de solicitud: 200930349

    1. Documentos considerados.-

    A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

    Documento

    Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

    D01

    TOONEN, E.J.M., et al. Dic-2008

    D02

    LEQUERRÉ, T., et al. 03.07.2006

    D03

    SEKIGUCHI, N, et al. Jun-2008

    D04

    KOCZAN, D., et al. 02.05.2008

11. 2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

    La presente solicitud de patente describe un método para pronosticar o predecir, in vitro, la respuesta de pacientes con artritis reumatoide al tratamiento con agentes que reconocen el receptor de membrana CD20 de los linfocitos B, concretamente, al tratamiento con rituximab. El método consiste en la determinación en muestras de sangre total, de células CD4+T, o de células B, de la expresión uno o varios de los genes del grupo de ARG1, CPD, TRAF1, C1QA, LRRN3, HLA-DQA1, NLK, TLR4, LOC89944, TOM1L1, BACH, NCALD, EIF2C2, NFIC, PCDHB7, FLJ32770, ARID3A, C14orf9, CSNK1E, BCAS1, TEAD2, C6orf145 y SNTA1. En la solicitud se establece una clara relación entre el aumento o disminución de la expresión de cada uno de estos genes y la respuesta positiva o negativa al tratamiento.

    No se ha encontrado en el estado de la técnica ningún documento que divulgue un método de pronóstico de la respuesta terapéutica de pacientes con artritis reumatoide que esté basado en las medidas de los niveles de expresión de estos genes, por lo que la solicitud cumple el requisito de novedad según el artículo 6 de la Ley de Patentes.

    Los documentos del estado de la técnica que se consideran más cercanos a la solicitud divulgan métodos para predecir la respuesta de pacientes con artritis reumatoide a diversos tratamientos. Igual que la solicitud, los métodos encontrados utilizan los valores de la expresión de determinados genes para determinar si el paciente responderá o no al tratamiento. En ningún caso se estudia la respuesta a rituximab ni a otros agentes que reconocen el receptor de membrana CD20, y ninguno de los genes reivindicados en la solicitud se emplea en los métodos divulgados en los documentos del estado de la técnica, por lo que la presente solicitud tiene actividad inventiva según el artículo 8 de la Ley de Patentes.

    Los documentos que se comentan a continuación son los que se consideran más cercanos a la solicitud, aunque ninguno de ellos afecta la novedad ni la actividad inventiva de la misma.

    Así, el documento D01 es una revisión de varios estudios realizados en pacientes con artritis reumatoide, que se basan en el análisis de los perfiles de expresión génica obtenidos por la técnica de microarrays, y cuyos resultados se emplean para diagnosticar o predecir la capacidad de respuesta al tratamiento de la enfermedad con distintos fármacos. En este documento se cita, entre otros, el trabajo descrito en el documento D02, que consiste en el estudio de la expresión génica en muestras de sangre de los pacientes antes de iniciar el tratamiento con infliximab, un agente bloqueante del factor de necrosis tumoral (TNF) que se emplea en el tratamiento de la artritis reumatoide. El método permite predecir la eficacia del fármaco en cada paciente mediante el estudio de un pequeño número de tránscritos y, de este modo determinar si se debe emplear ese tratamiento o uno alternativo.

    El documento D03 es un estudio semejante al realizado en D02, pero más actual, en el que también se determina un grupo de genes que presentan expresión diferencial entre los pacientes que responden a infliximab y los que no lo hacen. De nuevo, se sugiere el análisis personalizado de la expresión génica en pacientes con artritis reumatoide como herramienta para determinar la capacidad de respuesta al tratamiento.

    Finalmente, en el documento D04 el estudio de la expresión génica diferencial se emplea para predecir la respuesta al tratamiento con etanercept, otro bloqueante de TNF, en pacientes con artritis reumatoide. En este caso, los autores determinan grupos de 2 y 3 genes cuyo nivel de expresión varía entre pacientes respondedores y no-respondedores, y que, por tanto, son útiles para determinar la utilidad del tratamiento de la enfermedad con etanercept.

    Informe sobre el Estado de la Técnica (Opinión escrita) Página 4/4