ES2349114T3

ES2349114T3 - Uso de hemolisina clya para la excrecion de proteinas de fusion.

Info

Publication number: ES2349114T3
Application number: ES01273749T
Authority: ES
Inventors: James E. Galen
Original assignee: University of Maryland at Baltimore
Current assignee: University of Maryland at Baltimore
Priority date: 2000-11-22
Filing date: 2001-11-23
Publication date: 2010-12-28
Anticipated expiration: 2021-11-23
Also published as: CA2430322A1; MXPA03004562A; JP2004532634A; NO20032286L; NO20032286D0; EP1412502B1; US20020146430A1; DE60142646D1; US7056700B2; AU2001297770B2; ATE474926T1; PL366122A1; US20060147461A1; HUP0303843A2; NZ525735A; WO2002083890A2; JP3976685B2; US7459161B2; WO2002083890A3; ZA200303851B

Abstract

Un método para expresar un gen en una célula bacteriana que comprende: proporcionar un vector de expresión para una población de células bacterianas sin transformar, en el que el vector de expresión comprende un casete de expresión que comprende una secuencia que codifica una proteína de exportación fusionada genéticamente a una secuencia que codifica una proteína de interés; expresar el casete de expresión tal que una proteína de fusión proteína de exportación::proteína de interés es producida y exportada en el medio de cultivo, en el que la la secuencia que codifica una proteína de exportación es seleccionada del grupo que consiste en gen (clyA) citolisina A de Salmonella serovar entérica Typhi (S. Typhi), gen clyA (S. paratyphi) de Salmonella paratyphi o el gen hemolisina E (hlyE) de Eschericia coli (E. coli).

Description

Apoyo gubernamental

El sistema de exportación de proteínas aquí definido fue desarrollado a través del apoyo de los proyectos 5 RO1 A129471, RO1 A140297, y Research Contract NO1 A145251 (M. M. Levine, investigador principal), del Instituto Nacional de Salud estadounidense (NIH). Aplicaciones relacionadas

Esta aplicación reivindica prioridad a la solicitud de patente provisional No. 60/252,51B, presentada el 22 de Noviembre del 2000. Antecedentes del invento

La descripción a continuación se refiere al uso de un sistema de exportación de proteínas. El sistema descrito proporciona métodos eficaces y composiciones útiles para la producción de proteínas recombinantes. Descripción de la técnica relacionada

Los sistemas de expresión de proteinas han usado durante mucho tiempo plásmidos de expresión o vectores de expresión de alto número de copia en un intento de aumentar los rendimientos de proteinas recombinantes de interés. Los plásmidos de expresión de alto número de copia y las proteínas de interés que codifican pueden ejercer un efecto negativo en la idoneidad de un hospedante que contiene un plásmido de expresión. La carga notable colocada en las células hospedantes procariotas que llevan plásmidos multicopia es el resultado acumulativo de una cascada metabólica desencadenada por dos procesos: 1) la replicación y el mantenimiento de los plásmidos de expresión y 2) transcripción y traducción de las diversas funciones codificadas por los plámidos incluyendo el gen de interés. Tales mecanismos podrían explicar la observación de que las bacterias que llevan plásmidos crecen más lento que las bacterias sin plásmidos. Esta carga puede también explicar la observación de que la tasa de crecimiento disminuye según el número de copia aumenta.

Según se expresa el gen de interés, la tasa de crecimiento de las células hospedantes recombinantes disminuye. La disminución de la tasa de crecimiento puede desencadenar la inducción de diversas proteasas celulares que pueden degradar la proteína producida de modo recombinante presente en el citoplasma de la célula hospedante. La tasa de recimiento reducida es por tanto la inevitable consecuencia de una carga metabólica, que a su vez el el resultado acumulativo de un número de perturbaciones fisiológicas. Debido a que esta reducción en la tasa de crecimiento crea una presión selectiva para la pérdida de los plásmidos residentes en ausencia de selección, la pérdida significativa de los plásmidos de expresión a partir de la célua hospedante que lleva un vector de expresión puede tener lugar tras la transformación de la célula hospedante.

Lás células hospedantes con tasa de crecmiento reducidas pueden despojarse de modo espontáneo de un plásmido de expresión para eliminar de la célula hospedante una carga metabólica innecesaria y permitir a las células hospedantes sin plásmido crecer más rápidamente que la población de células hospedantes que llevan plásmido. Tal cambio en la expresión de proteínas dentro de una población de células hospedantes se esperaría que redujera la producción proteica.

Por consiguiente, sería deseable preparar un sistema de expresión de proteínas que optimizaría la expresión de proteínas a partir del vector de expresión mientras que minimiza la carga metabólica en la célula hospedante generada por el vector de expresión. Sumario del invento

El material descrito se refiere al uso de una proteína de exportación para facilitar la exportación de una proteína de fusión fuera de la célula hospedante. Una realización descrita proporciona un método para expresar un gen en una célula bacteriana que comprende proporcionar un vector de expresión en una poblacicón de células hospedantes bacterianas, en la que el vector de expresión comprende un casete de expresión que comprende una secuencia que codifica una proteína de exporación genéticamente fusionada a una secuencia codificante para una proteína de interés, que expresa el casete de expresión tal que una proteína de fusión proteína de exportación–proteína de interés es producida y exportada o transportada al medio de cultivo, en el que la secuencia codificante para la proteína de exportación es seleccionada a partir del grupo que consiste en Salmonella enterica serovar Typhi (S. Typhi), el gen cytolisina A (clyA), gen de Salmonella paratyphi (S. paratyphi) clyA o el gen de hemolisina (hly E) de Escherichia coli (E. coli).

Otra realización descrita se refiere al uso de una población de células hospedantes bacterianas transformadas con un vecto de expresión que comprende un casete de expresión que comprende una secuencia codificante de proteína de exportación genéticamente fusionada a una secuencia que codifica una proteína de interés en la fabricación de un medicamento para obtener una respuesta inmune de un animal en el que la secuencia codificante de una proteína de exportación es seleccionada del grupo que consiste en el gen de citolisina A (clyA) de Salmonella enterica serovar Typhi (S. Thypi), el gen cly A de salmonella paratyphi (S. paratyphi)o el gen de hemolisina E (hly E) de Escherichia coli (E. coli).

Otra realización descrita se refiere a un sistema para expresar una proteína de interés que comprende: un vector de expresión que comprende un casete de expresión, en el que el casete de expersión comprende una secuencia codificante de la proteína de exportación genéticamente fusionada a una secuencia codificante de una proteína de interés, una célula hospedante transformada con el vector de expresión, y un medio de cultivo para la célula hospedante transformada, en el que el casete de expresión expresa una proteína de fusión proteína de expresión-proteína de interés, que es exportada hacia fuera de la célula hospedante transformada en el que la secuencia codificante de una proteína de exportación es seleccionada del grupo que consiste en el gen de citolisina A (clyA) de Salmonella enterica serovar Typhi (S. Thypi), el gen cly A de Salmonella paratyphi (S. paratyphi) o el gen de hemolisina E (hly E) de Escherichia coli (E. coli). Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 proporciona ejemplos del vector de expresión de este invento. La Figura 1A ilustra el vector de expresión pSEC84. La Figura 1B ilustra el vector de expresión pSEC84bla . La figura 1C ilustra pSEC84sacB (SEQ. ID Nº: 18). La Figura 1D ilustra pSEC84gfpuv.

La Figura 2 ilustra la exportación de la proteína de fusión Cly-SacB que da como resultado la metabolisis de la sacarosa en medio de crecimiento sólido. Las cepas fueron hechas crecer en medio que contiene bien 8% de sacarosa (2A y 2B), 16% de sacarosa (2C y 2D), u 8% de sacarosa + 8% L-arabinosa (2E y 2F). Las Figuras 2A, 2C y 2E demuestran el crecimiento de CVD 908-htrA que expresa ClgA-SacB.

La Figura 3 ilustra el ceciminento de DVD 908-htrA que expresa bien ClgA (pSEC84) o ClgA-SacB (pSEC84sacB), hecho crecer en caldo de cultivo 2XLB50 suplementado con DHB y bien 10% de sacarosa ó 10% de glucosa.

La Figura 4 ilustra análisis de inmunotransferencia Western de fracciones celulares bacterianas de bien CVD 908-htrA (carriles 1-3) o CVD 908-htrA (pSEC84gfpuv) (carriles 4-8). Las fracciones celulares son cargadas como sigue: sobrenadantes, carriles 1 y 4; citoplásmicas, carriles 2 y 6; periplásmicas, carril 5; insoluble, carril 7: lisado celular total, carriles 3 y 8; y 50 ng GFPuv, carril 9. Las membranas con muestras idénticas fueron incubadas con anticuerpos específicos para GFPuv (panel A) o E. coli GroEL (panel B). Descrición detallada de la realización preferida

La descripción a continuación proporciona un sistema de exportación proteica para producir eficientemente proteínas recombinantes a partir de un hospedante bacteriano. En una realización preferida, el sistema de exportación proteica utiliza la maquinaria endógena de exportación proteica a la bacteria hospedante en la que el vector del sistema de exportación proteica es introducido.

El sistema de exportación de proteínas tiene un número de aplicaciones útiles. El sistema puede ser usado para producir de modo eficiente proteínas recombinantes de interés dentro de una célula hospedante bacteriana y exportar la proteína reocmbinante de interés de la célula hospedante bacteriana. Por ejemplo, el sistema descrito puede ser usado para producir de modo eficiente proteínas recombinantes de interés en un bioreactor.

El sistema de exportación de proteínas puede también ser usado para proporcionar a un animal material antigénico frente al cual una respuesta inmune puede ser montada. Por ejemplo en una realización una bacteria atenuada, tal como Salmonella, es transformada con los componentes del sistema de exportación de proteínas. La salmonela recombinante puede entonces ser usada como una composición inmunogénica de vector vivo capaz de facilitar la generación de una respuesta inmune en un animal. El sistema de exportación de proteínas puede ser usado con una variead de antígenos de interés. Las composiciones inmunogénicas dirigidas frente a la fiebre tifoidea y otras enfermedades puede ser producida. Las composiciones inmunogénicas que expresan antígenos que son exportados de la bacteria recombinantes con un mínmimo de lisis bacteriana son también descritas.

A. Sistemas de exportación de familias de proteínas HlyE

La descripción a continuación se refiere al uso de los miembros de la familia HlyE en un sistema de exportación de proteínas para facilitar la expresión de proteínas. Los miembros de la familia HlyE pueden ser usados para facilitar la exportación de proteínas producidas de modo recombinante a partir de los hospedantes bacterianos. Los sistemas de expresión que exportan proteínas producidas de modo recombinantes se cree que facilitan la producción aumentada de proteínas. El sistema de exportación de proteínas descrito puede también ser usado para preparar las composiciones inmunogénicas con las cuales vacunar a los animales.

Se ha observado que las tasas de crecimiento de los organismos recombinantes que contiene vectores de expresión disminuyen según el nivel de expresión de un gen de interés aumenta. La disminución en el crecimiento puede desen-cadenar la inducción de diversas proteasas celulares que pueden degradar la proteína recombinante expresada. La tasa de crecimiento reducida es por lo tanto la consecuencia inevitable de la carga metabólica, que a su vez, es el resultado acumulativo de un número de perturbaciones fisiológicas. Por ejemplo, las perturbaciones fisiológicas son el resultado de la expresión y acumulación de la proteína de interés dentro de la bacteria hospedante. Esta acumulación puede ser dañina para la viabilidad de la bacteria hospedante y así una presión de selección negativa.

Debido a que las cargas metabólicas tales como las descritas anteriormente crean una presión selectiva para la pérdida del vector de expresión residente en ausencia de selección, una pérdida significativa del vector de expresión a partir de la bacteria hospedante puede tener lugar una vez que la bacteria hospedante ha sido transformada con el vector de expresión que contiene el gen de interés. La pérdida espontánea del plásmido elimina cualquier carga metabólica de la bacteria hospedante y permite a las bacterias sin plásmido crecer más rápidamente que la población de bacterias que llevan plásmido. El sobrecrecimiento de células bacterianas que no contienen el vector de expresión y por tanto no expresan la proteína de interés reduce los niveles generales de producción de proteína. Por lo tanto, las bacterias hospedantes que no están obligadas genéticamente a mantener los vectores de expresión que dirigen la síntesis de altos niveles de una proteína de interés dada pueden producir significativamente menos proteína.

Una realización preferida para exportar la proteína de interés expresada de modo recombinante comprende hacer uso de un sistema de exportación endógeno en la bacteria hospedante que contiene el vector de expresión. El uso de un sistema de exporaación endógeno es ventajoso en parte debido a que evita la necesidad de grandes cantidades de ADN heterólogo que codifica proteínas exóticas para suplir un sistema de exportación exógeno. Sin embargo, los sistemas de exportación de proteínas que utilizan los sistemas de exportación exógenos están también abarcados por la presente descripción.

Un sistema candidato atractivo de exportación endógena es la hemolisina críptica codificada por Cytolisina A (clyA) dentro del cromosoma de la Salmonella enterica serovar Typhy (de aquí en adelante “S. Typhi”), un miembro de la famila de proteínas HlyE. La familia de HlyE consiste en una proteína única, HlyE, y sus homólogo cercano de E. coli, Shigella flexneri y S. Typhi, y otras bacterias. La proteína de E. coli es una proteína funcionalmente bien caracterizada, que forma poros, hemolisina codificada en el cromosoma también llamada ClyA, HlyE, y hemolisina A silenciosa (SheA). Consiste en 303 residuos de aminoácidos (34 Kda). Su transcripción está positivamente controlada por SlyA, un regulador encontrado en varias bacterias entéricas. HlyE forma poros transmembrana estables, moderadamente selectivos de cationes con un diámetro de 2,5-3,0 nm en bicapas lipídicas. La proteína se une al colesterol, y la formación de poros en una membrana es estimulada si la membrana contiene colesterol. La estructura cristalina de E. coli HlyE ha sido resuelta a una resolución de 2,0 Å, y la visualización de la forma asociada a lípidos de la toxina a baja resolución ha sido lograda mediante microscopía electrónica. La estructura exhibe un huso de hélice elaborado de unos 100 Å de largo. Oligomeriza en presencia de lípidos para formar poros transmembrana.

B. Sistema de exportación de proteínas de Cytolisina A (ClyA)

Una realización preferida de la presente descripción se refiere al uo de la proteína ClyA, un miembro de la familia HlyE, en un sistema de exportación de proteínas. Un gen clyA de aproximadamente 1 kb fue clonado a partir de CVD 908htrA de S. Typhi para su uso en un sistema de exportación de proteínas. La proteína ClyA es exportada tanto de E. coli como de S. Typhi y es capaz de exportar proteínas pasajeras que han sido genéticamente fusionadas al extremo 3’ terminal del marco de lectura abierto de clyA. La proteína pasajera a la que se hace referencia aquí es también referida como proteína de interés. Se demuestra que el plegamiento apropiado de estas proteínas de fusión tiene lugar de tal modo que la actividad biológica inherente de los dominios implicados es observada.

Citolisina A (ClyA) de S. Typhi fue primero descrita por Wallace y otros, que también documentaron la estructura cristalina para la hemolisina homóloga de E. coli (Wallace, A.J., T. J. Stillman, A. Atkins, S.J. Jamieson, P. A. Bullough, J. Green, y P. J. Artymiuk. 2000. E. coli hemolysine E (HlyE, Clga, SheA): X-ray crystal structure of the toxin and observation of membrane pores by electron microscopy. Cell 100: 265-276). Esta hemolisina ha sido descrita previamente y referida de modo variado como ClyA, HlyE, o SheA. Para evitar confusiones, la hemolisina de E. coli es hecha aquí referencia como HlyE y es codificada por hlyE. También por claridad, la hemolisina de

S. Typhi es referida aquí como ClyA, que está codificada por clyA.

A modo ilustrativo, la estructura proteica de los miembros de la familia HlyE es tratada mediante referencia a la proteína HlyE de E. coli. Hly es una molécula en forma de bastón curvo con una región transmembrana de 27 residuos hidrofóbicos. Esta región comprende un extremo terminal de la molécula plegada y se propone que forma un poro dentro de la membrana diana. La formación del poro lleva finalmente a la lisis de la célula diana. En estudios de microscopía electronica elegantes, Wallace y otros, mostraron que HlyE se inserta en vesículas lipídicas para formar poros comprendedidos de 8 monómeros de HlyE.

Aunque la formación de poros facilitada por HlyE ha sido elucidada, el mecanismo por el cual HlyE y homólogos de HlyE son exportados fuera de una bacteria aún están poco claros. Por otro lado, la manera por la cual la hemolisina se inserta en membranas diana para su ensamblaje en poros tampoco está bien comprendida. Del Castillo y otros, describieron la secreción dependiente de la fase de crecimiento de la actividad hemolítica que tiene su máximo durante la fase medialogarítmica y se desvanece durante el inicio de la fase estacionaria. (del Castillo, F. J.,

S. C. Leal. F. Moreno, e I. del Castillo. 1997. The Escherichia coli K-12 sheA gene encodes a 34-kDa secreted hemolysin. Mol. Microbiol. 25: 107-115). Ludwig y colegas han documentado que la secreción de esta hemolisina críptica está acompañada por la fuga de proteínas confinadas en el periplasma, pero no está acompañada por la pérdida de proteínas citoplasmáticas, argumentando de modo indiscutible en contra de que la lisis celular libere HlyE (Ludwig. A., S. Bauer, R. Benz, B. Bergmann, y W. Goebel. 1999. Analysis of the sklyA-controlled expression, subcellular localization and pore-forming activitiy of a 34 kDa Haemolysin (ClyA) de Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol. 31:557-567).

Además, cuando se compara con la secuencia codificada por hlyE, la secuenciación del extremo N-terminal de la HlyE secretada reveló que HlyE no está procesada en el extremo N-terminal durante el transporte. Oscarsson y otros, documentaron que HlyE se une al colesterol y que la presencia del colesterol en membranas diana estimula la formación de poros y la lisis. (Oscarsson. J., Y. Mizunoe,

L. Li, X. Lai, A. Wieslander, y B. E. Uhlin. 1999. Molecular analysis of the cytolytic protein ClyA (SheA) from Escherichia coli. Mol. Microbiol. 32:1226-1238.) Se estima que � 103 moléculas de HlyE son requeridas para la lisis de un eritrocito diana sugiriendo una acumulación significativa de HlyE previamente a la detección de la lisis celular. HlyE es notablmente estable dentro de un intervalo de valores de pH entre 3,0 y 9,0 y es resistente al corte por proteasas incluyendo tripsina y pepsina. (Atkins, A., N.

R. Wyborn, A. J. Wallace, T. J. Stillman. L.K. Black, A. B. Fielding, M. Hisakado, P. J. Artymiuk, y J. Green. 2000. Structure-funcion relationships of a novel bacterial toxin, Hemolysin E. The role of aG J. Biol. Chem. 275:41150-41155).

El nucleótido y la secuencia aminoacídica para el gen clyA aislado y la proteína ClyA usada en el trabajo descrito son proporcionados como los nucleótidos 516-1436 de la SEQ ID Nº. 1 y SEQ ID Nº 2, respectivamente. Otros miembros de la familia HlyE están también disponibles y son conocidos por aquellos con conocimiento común en la técnica. Por ejemplo, otro gen clyA de S. Typhi para la citolisina A está disponible con el número de acceso al GENBANK Nº AJ313034; la secuencia del gen clyA de Salmonella paratyphi para la citolisina A está disponible con el número de acceso del GENBANK Nº AJ313033; la secuencia codificante del gen completo (hlyE) de la proteína HlyE truncada de Shigella fexneri está disponible con el número de acceso del GENBANK Nº AF200955; y la secuencia del gen hlyE de Escherichia coli está disponible con el número de acceso del GENBANK nº AJ001829.

La familia de proteínas HlyE típicamente causa hemolisis en células diana. Los miembros de la famila HlyE hemolíticamente activa o inactiva pueden ambos ser usados con las enseñanzas descritas. Por ejemplo, se conoce que la mutación del gen hlyE puede reducir o eliminar la actividad hemolítica. Por ejemplo, la pérdida de acividad hemolítica ha sido documentada cuando hlyE es mutuada tal que las susticiones aminoacídicas tienen lugar en las posiciones 180, 185, 187, y 193. Específicamente, G180V, V185S, A187S,e I193S tienen como resultado una pérdida de actividad homolítica de la proteína HlyE expresada a partir del gen hlyE mutado.

La presente descripción utiliza las características de exportación de la familia HlyE de proteínas para producir un sistema de exportación de proteínas. Por ejemplo, la fusión de proteínas que comprende cualquier miembro de la familia HlyE y una proteína de interés están descritas. Más específicamente, las proteínas de fusión que comprenden ClyA y una proteína de interés están descritas. Como se describe a continuación, las proteínas de fusión que contienen ClyA son exportadas de la célula hospedante bacteriana y en el medio circundante. Esta característica del sistema de expresión que comprende un componente de una proteína de fusión proteína de exportación:proteína de interés que facilita la producción de la proteína de interés y la exportación de la proteína de fusión proteína de exportación:proteína de interés. Vectores de expresión de la proteína de exportación

El sistema de exportación de proteínas decrito aquí puede ser usado para expresar y exportar una amplia variedad de proteínas de fusión que comprenden una proteína de expresión y una proteína de interés. La proteína de exportación es seleccionada de la familia de proteínas HlyE. En una realización, la proteína de interés es codificada por un gen de interés. El gen de interés puede ser extraño a la bacteria que contiene el sistema de exportación de proteínas o puede ser un gen que es endógeno para la bacteria. Típicamente, una construcción de una proteína de fusión proteína de exportación:proteína de interés está presente en un casete de expresión, que a su vez está presente en un vector de expresión. Cada una de estas unidades son tratadas a continuación. Los vectores de expresión.

El sistema de exportación de proteínas utiliza un vector de expresión para facilitar la producción recombinante de la proteína de interés. Típicamente, el vector de expresión comprenderá un origén de replicación y otras características estructurales que controlan y regulan el mantenimiento del vector de expresión en la célula hospedante. Por definición, el término “vector de expresión” se refiere a un plásmido, virus y otros vehículos conocidos en la técnica que ha sido manipulado por la inserción

o incorporación del casete de expresión que comprende el casete de expresión de la proteína de fusión proteína de exportación:proteína de interés. Un ejemplo de un sistema vector de expresión que muestra los vectores de expresión que confieren estabilidad plasmídica a dos niveles independientes como se describen en Galen, y otros, Immun. 67:6424-6433 (1999) y en las solicitudes de patentes norteamericanas Nºs 09/204,117, presentada el 2 de Diciembre de 1998 y 09/453.313, presentada el 2 de Diciembre de 1999. Casetes de expresión de proteína de fusión-proteína de exportación

El sistema de exportación de proteínas descrito aquí puede ser usado par expresar y exportar una amplia variedad de proteínas de fusión que comprenden una proteína de exportación y una proteína de interés. La proteína de interés está codificada por la secuencia que codifica la proteína de interés que es tambien el gen de interés. El gen de interés puede ser extraño a la bacteria que contiene el sistema de exportación de proteína o puede ser un gen que es endógeno de la bacteria. La proteína de interés puede oscilar desde un aminoácido único a proteínas varias veces el tamaño de la molécula de proteína de exportación. Más preferiblemente, la proteína de interés puede oscilar desde diez aminoácidos hasta dos veces el tamaño de la proteína de exportación. Es preferible que el tamaño de la proteína de interés sea tal que no interfiera con la capacidad de la proteína de exportación a ser exportada completamente fuera de la bacteria. De modo ejemplar las proteínas de interés van desde 0 KDa hasta al menos 50 kDa en masa. Masas mayores, y por lo tanto proteínas más largas pueden también ser usadas como proteínas de interés. Por ejemplo, las proteínas de interés pueden tener una masa de 55 KDa, 60 KDa, 65 KDa, 70 KDa, 75 KDa, 80 KDa, 85 KDa, 90 KDa, 95 KDa, 100 KDa, o más largas.

Alternativamente, la proteína de interés puede consistir en 1 a 1000 aminoácidos o más. Por ejemplo, la proteína de interés puede tener 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 aminoácidos, o más.

Típicamente, el gen de interés a ser expresado está presente en un casete de expresión. Un casete de expresión contendrá típicamente caacterísticas estructurales adecuadas, tal como un promotor, terminador, etc., para permitir la transcripción del gen de interés.

Las secuencias polinucleotídicas que codifican una proteína de fusión proteína de exportación:proteína de interés (también conocida como “secuencias codificante de proteínas de fusión proteína de exportación:proteína de interés”) pueden estar operativamente unidas a las secuencias de expresión testigo para formar un casete de expresión. El término “operativamente unido” se refiere a la yuxtaposición en la que los compoenentes así descritos están en una relación que les permite funcionar en la manera intencionada. Una secuencia testigo de expresión unida operativamente a una secuencia codificante es ligada de tal modo que la expresión de la secuencia codificante es lograda en condiciones compatibles con las secuencias testigo de expresión. Como se usa aquí, el término “secuencias testigo de expresión” se refiere a secuencias de ácidos nucleidos que regulan la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos a la cual está operativamente unida. Las secuencias de expresión testigo están operativamente unidas a la secuencia de ácidos nucleicos cuando las secuencias de expresión testigo controlan y regulan la transcripción y, según es apropiado, la traducción de la secuencia de ácidos nucléicos. Así, las secuencias de expresión testigo pueden incluir promotores apropiados, terminadores de transcrpción, secuencias de unión a ribosomas optimizadas, un codon de inicio (es decir, ATG) enfrente del gen que codifica la proteína, el marco de lectura abierto correcto del gen que permitirá la traducción apropiada de mARN, y códones stop. El término “secuencias testigo” pretenden incluir, un mínimo de componentes cuya presencia puede influenciar la expresión, y puede también incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líderes. Las secuencias de expresión testigo pueden incluir un promotor.

Un “promotor” es la secuencia mínima suficiente para la transcripción directa. También incluidos en el invento están los elementos promotores que son suficientes para hacer que la expresión génica dependiente de promotor sea controlable por señales específicas de célula, específica de tejido, o inducible por señales o agentes externos: tales elementos pueden estar situados en las regiones 5’ o 3’ de la secuencia codificante para la proteína de fusión proteína de exportación:proteína de interés. Ambos promotores constitutivos e inducibles son útiles en los método descritos. La expresión de las secuencias codificantes de la proteina de fusión proteína de exportación:proteína de interés puede ser conducida por un número de promotores. Aunque el promotor endógeno de una proteína de exportación puede ser utilizado para la regulación de la transcripción del caseste de expresión, preferiblemente, el promotor es una secuancia reguladora extraña. Un ejemplo del promotor endógeno inducible es el promotor ompC que puede ser usado para dirigir la transcripción del casete de expresión.

Los promotores útiles en el invento incluyen tanto promotores constitutivos como inducibles naturales así como promotores diseñados mediante ingeniería genética. Un promotor indubible preferido debería 1) proporcionar una expresión baja en ausencia del inductor, 2) proporcionar elevada expresión en presencia del inductor; 3) usar un esquema de inducción que no interfiera con la fisiología normal de la célula hospedante; y 4) que tenga poco o ningún efecto en la expresión de otros genes. Ejemplos de promotores inducibles incluyen aquellos inducidos por medios químicos. Aquellos con experiencia en la técnica conocerán otros promotores, tanto constitutivos como inducibles.

El promotor particular seleccionadao debería ser capaz de causar una expresión suficiente para resultar en la producción de una cantidad eficaz de la proteína de fusión proteína de exportación:proteína de interés. La cantidad eficaz de la proteína de fusión proteína de exportación:proteína de interés puede variar dependiendo del objetivo de la expresión. Los promotores usados en las construcciones vectores de la presente descripción pueden ser modificadas, si se desea, para afectar sus caracteríaticas de control.

La proteína de fusión proteína de exportación:proteína de interés que conmprende la proteína de exportación y la proteína de interés puede comprender además los marcajes de purificación insertados mediante ingeniería en casetes de expresión para ser expresadas como una parte de la proteína de fusíon proteína de exportación:proteína de interés. El marcaje es elegido para facilitar la purificación de la proteína de fusión proteína de exportacion:proteína de interés y/o la proteína de interés producida por los métodos descritos. Por ejemplo, una pluralidad de residuos de histidina pueden ser incorporados mediante ingeniería en la porción C terminal o porción N-terminal de la proteína de interés par facilidar la purificación de proteínas. Es preferible que la introducción del marcaje minimice el plegamiento inadecuado de la proteína de interés.

Además de el marcaje de polihistidina, hay un número de otros marcajes proteícos que pueden ser usados para facilitar la purificación proteica. Por ejemplo, los marcajes antigénicos tales como el marcaje de proteína de unión a maltosa, un marcaje del epítopo c-myc, un marcaje de proteína verde fluorescente, un marcaje de luciferasa, un marcaje de beta galactosidasa, un marcaje de polihistidina, o cualquier otra marca de proteína de expresión que puede ser usada con el sistema descrito.

La proteína de fusión proteína de exportación:proteína de interés que comprende la proteína de exportación y la proteína de interés puede comprender además características adicionales para facilitar el uso de la proteína expresada y exportada. Por ejemplo, los sitios de reconocimiento de proteasas pueden ser hechos mediante ingeniería entre diversos componentes de la proteína de fusión proteína de exportación: proteína de interés, incluyendo, si es aplicable, los marcajes descritos anteriormente, para promover la separación de los componentes de la proteína de fusión proteína de exportación:proteína de interés. Por ejemplo un sitio de reconocimiento de proteasas puede ser introducido entre las secuencias de proteína de exportación y la proteína de interés en el casete de expresión. Estos sitios de reconocimiento de proteasas facilitan la separación de la proteína de exportación a partir de la proteína de interés.

Opcionalmente, un marcador seleccionable puede ser asociado con el casete de expresión. Como se usa aquí, el término “marcador” se refiere a un gen que codifica un rasgo o un fenotipo que permite la selección de, o el cribado para, una célula hospedante que contiene el marcador. El gen marcador puede ser un gen de resistencia a antibiótico mediante el cual el antibiótico apropiado puede ser usado para seleccionar células hospedantes transformadas de entre células que no están transformadas o el gen marcador puede ser cualquier otro gen de resistencia a fármacos. Ejemplos de marcadores seleccionables adecuados incluyen adenosina desaminasa, dihidrofolato reductasa higromicina B-fosfotransferasa, timidina quinasa, xantina-guanina fosforibosiltransferasa, resistencia a glicofosfato y glufosinato y aminoglicósido 3’-0-fosfotransfeasa II (resistencia a kanamycina, neomycina y G418). Aquellos con experiencia en la técnica conocerán otros marcadores adecuados pueden ser empleados con las enseñanzas descritas.

Un ejemplo de un vector de expresión es mostrado en la Figura 1. En la Figura 1A, el vector de expresión pSEC84 mostrado. La secuencia nucleótidica del vector pSEC84 puede ser encontrado en la SEQ ID Nº:1. La secuencia aminoácidica de ClyA codificada por el gen clyA se encuentra en la SEQ ID Nº:2.

Cada vector mostrado en las Figuras 1A-D comprende un promotor {PampC-un promotor ompC controlado osmóticamente modificado de E. coli}, una proteína de exportación (clyA), un origen de replicación, un terminador transcripcional (T1), una función de partición pasiva (part), resistencia a kanamicina (aph), un sistema de muerte post segregacional (hok-sok), y un sistema de partición activa (parA). Debería observarse que estos componentes del vector son meramente a nivel de ejemplo de una realización única del sistema descrito.

La Figura B ilustra el vector de expresión pSEC84bla. Este vector de expresión contiene las mismas características como el vector pSEC84 y comprende además una construcción de proteína de fusión proteína de exportación:proteína de interés. Específicamente, el gen bla que codifica b-lactamasa fue clonado en el vector pSEC84 en el sitio NheI en la posición 1426 de el vector parental. Otras construcciones de fusión son mostradas en la Figura 1C (pSEC84sacB) y la Figura 1D (pSEC84gfpuv). Genes de Interés

El sistema de eportación de proteínas descrito aquí puede ser usado con una variedad de genes de interés. En una realización, el gen de interés codifica una proteína deseada. Cualquier proteína susceptible de expresión recombinante bacteriana puede ser usada con el sistema de exportación descrito. El gen de interés puede codificar cualquier polipéptido tal como, por ejemplo, un polipéptido mamífero tal como una enzima, un inhibidor de enzima, una hormona, una linfoquina, un activador de plasminógeno, o cualquier otra proteína de interés. El gen de interés puede codificar un gen eucariota, un gen procariota, un gen de planta o un gen viral de interés.

Una ventaja del sistema descrito es que proporciona un método por el cual las proteínas que fueron tóxicas para una bacteria hospedante pueden ahora expresarse. Por ejemplo, la expresión recombinante de ciertas proteínas es complicada o imposible cuando la proteína expresada no es exportada de la célula bacteriana hospedante. Con los métodos descritos aquí, un profesional con conocimientos comunes de la técnica podría expresar una proteína anteriormente inexpresable o subexpresable para producir la proteína deseada en cantidades usables.

En otra realización, el gen de interés es un gen que codifica antígenos inmunogénicos, y la proteína de interés es un antígeno que puede ser una proteína o un fragmento antigénico del mismo a partir de cualquier patógeno, tal como patógenos virales, patógenos bacterianos y patógenos parásitos. Alternativamente, el gen de interés puede ser un gen sintético, construido usando métodos de ADN recombinantes, que codifican antígenos o partes del mismo a partir de los patógenos parásitos, bacterianos, virales u otros antígenos de interés. Estos patógenos pueden ser infecciosos en hospedantes humanos, animales domésticos o animales salvajes.

Ejemplos de patógenos virales particulares, a partir de los cuales los antígenos virales son derivados, incluyen, pero no están limitados a, Ortomixovirus, tales como el virus influenza; Retrovirus, tales como el virus de sarcoma Rous (RSV) y virus de inmunodeficiencia de simios (SIV), virus del Herpes, tal como el virus Barr Epstein (EBV); citomegalovirus (CMV) o el virus del herpes simplex; Lentivirus, tal como un virus de inmunodeficiencia humano; Rhabdovirus, tal como las rabias; Picornovirus, tal como el virus de la polio; Poxvirus, tal como las vacunas; Rotavirus; y Parvovirus.

Ejemplos de antígenos inmunogénicos a partir de los patógenos virales incluyen los antígenos del virus de inmunodeficiencia humana Nef, p24, gp120, gp41, Tat, Rev, y Pol. Ejemplos adicionales de los antígenos incluyen epitopos del gp120 de células T y células B, el antígeno de superficie de la hepatitis B, antígenos de rotavirus, tales como VP4, VP6, y VP7, antígenos del virus influenza tal como hemaglutinina o nucleoproteína, y la timidina quinasa del virus de herpes simplex. El ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos para cada uno de estos antígenos viruales son bien conocidos en la técnica y disponibles fácilmente.

Los patógenos bacterianos, a partir de los cuales los antígenos bacterianos pueden ser derivados, incluyen, pero no están limitados a, Mycobaterium spp., Helicobacter pylori, Salmonella spp., Shigella spp., E. coli, Rickettsia spp., Listeria spp., Legionella pneumoniae, Pseudomonas spp., Vibrio spp., y Borellia burgdorferi.

Ejemplos de antígenos inmunogénicos de patógenos bacterianos incluyen, pero no están limitados a, el antígeno de forma 1 de Shigella sonnei, el antígeno O de la cepa Inaba de V. cholerae 569B, antígenos inmunogénicos de E. coli enterotoxigénicas, tal como el antígeno fimbrial CFA/l, y la subunidad B no tóxica de la toxina termolábil, pertactina de Bordetella pertussis, adenilato ciclasa-hemolisina de B. pertussis, y el fragmento C de la toxina del tétano del Clostridium tetani.

Ejemplos de antígenos inmunogénicos de los patógenos parásitos, a partir de los cuales los antígenos parásitos pueden ser derivados, incluyen, pero no están limitados a, Plasmodium spp., Trypanosome spp., Giardia spp., Boophilus spp., Babesia spp., Entamoeba spp., Eimeria spp., Leishmania spp., Schistosome spp., Brugia spp., Fascida spp., Dirofilaria spp., Wuchereria spp., y Onchocerea spp. Los ejemplos de los antígenos inmunogénicos de los patógenos parásitos incluyen, pero no están limitados a, los antígenos circunsporozoite del Plasmodium spp, tal como el antígeno circunsporozoite del P. bergeril o el antígeno circunsporozoite del P. falciparum; el antígeno de superficie merozoite del Plasmodium spp, la lectina

específica de galactosa de Entamoeba histolytica, gp63 del Leishmania spp., paramiosina de Brugia malayi, la triosafosfato isomerasa de Schistosome mansoni; la proteína de tipo globina secretada del Trichostrongylus colubriformis; la glutathione Stransferasa de Frasciola hepatica, Schistosoma bovis y S. japonicum, y KLH del Schistosoma bovis y S. japonicum.

En otra realización, el gen de interés puede codificar un agente terapéutico, tal como, pero no limitado a, uno específico de tumor, de trasplante o antígenos autoinmunes o partes del mismo. Alternativamente, el gen de interés puede codificar los genes sintéticos, los cuales codifican para específicos de tumor, de trasplante o antígenos autoinmunes o partes del mismo.

Ejemplos de los antígenos específicos de tumor incluyen antígenos específicos de la próstata, TAG-72 y CEA, MAGE-1 y tirosinasa. Recientemente se ha demostrado en ratones que la inmunización con células no malignas que expresan un antígeno de tumor proporciona un efecto de tipo vacuna, y también ayuda al animal a generar una respuesta inmune para eliminar células tumorales malignas que muestran el mismo antígeno.

Ejemplos de antígenos de transplante incluyen el receptor CD3 en las células

T. El tratamiento con un anticuerpo al receptor CD3 ha sido mostrado para eliminar rápidamente las células T que circulan e invierten la mayoría de los episodios de rechazo.

Ejemplos de antígenos autoinmunes incluyen la cadena � de IAS. La vacunación de los ratones con un péptido aminoacídico de 18 de la cadena � de IAS ha sido demostrada que proporciona protección y sirve de tratamiento en ratones con encefalomielitis autoinmune experimental.

Alternativamente, el gen de interés puede codificar moléculas inmunoreguladoras. Estas moléculas inmuno-reguladoras incluyen, pero no están limitadas a, factores de crecimiento, tales como M-CSF, GM-CSF; y citoquinas tales como IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12 o IFN gamma. Recientemente, el suministro localizado de citoquinas al tejido tumoral ha sido mostrado que estimula potentemente la inmunidad sistémica y la presentación del antígeno tumoral mejorado sin producir una toxicidad por citoquinas sistémica. Sistemas de expresión basados en plásmidos estabilizados

Los sistemas de expresión bacterianos, por diseño, utilizan típicamente vectores de expresión para aprovechar y explotar la maquinaria de síntesis de la proteína de una célula hospedante bacteriana para producir una proteína de interés. Los niveles de expresión de la proteína pueden ser frecuentemente aumentados por el uso de plásmidos de alto número de copia, o vectores de expresión de alto número de copia, con las células hospedantes. Como se discute anteriormente, la introducción de un vector de expresión de alto número de copia en una célula hospedante bacteriana, sin embargo, coloca ciertas tensiones metabólicas en la célula hospedante que puede causar que la célula hospedante expulse el vector de expresión y reducir así los niveles de expresión de proteína.

A menudo se pasa por alto en la ingeniería del vector de expresión el efecto de los vectores de expresión de alto número de copia que ejercen con frecuencia en la salud de la célula hospedante en la que el vector de expresión es introducido. La carga colocada sobre las células bacterianas hospedantes que llevan los plásmidos multicopia es el resultado acumulativo de una cascada metabólica. La cascada es provocada por la duplicación y el mantenimiento de los vectores de expresión (véase Bailey, J.E., Host-vector interactions in Escherichia coli, p. 29-77. In A. Fiechter (ed.), Advances in Biochemical Engineering. Biotechnology. Springer-Verlag, Berlin (1993), Glick, B. R., Biotechnol. Adv. 13:247-261 (1995), and Smith & Bidochka. Can. J. Microbiol. 44:351-355 (1998)). La cascada es también provocada por la transcripción y la traducción de diversas funciones que codifican al vector de expresión, incluyendo la proteína de interés. Los mecanismos, tal como esos descritos anteriormente, explican la observación de que las bacterias que portan plásmidos crecen más lentamente que las bacterias sin plásmidos. Estos mecanismos pueden explicar también la observación de que la velocidad de crecimiento disminuye cuando el número de copia aumenta.

Se ha observado que las velocidades de crecimiento de los organismos recombinantes que contienen los vectores de expresión disminuyen segun aumenta la expresión del gen de interés. La disminución en el crecimiento puede provocar la inducción de diversas proteasas celulares que pueden degradar la proteína recombinante de interés expresada. La velocidad de crecimiento reducida es por tanto la consecuencia inevitable de la carga metabólica, que a su vez es el resultado acumulativo de un número de perturbaciones fisiológicas. Por ejemplo, las perturbaciones fisiológicas resultan de la expresión y la acumulación de la proteína de interés dentro de la bacteria hospedante. Esta acumulación puede ser dañina para la viabilidad del organismo hospedante y así una presión de selección negativa.

Debido a que las cargas metabólicas tal como se discute anteriormente crean una presión selectiva para la pérdida de los vectores de expresión residentes en ausencia de selección, las pérdida significativa de los vectores de expresión de la célula hospedante pueden ocurrir después de que la célula hospedante haya sido transformada con el vector de expresión que contiene el gen de interés. La pérdida espontánea del plásmido elimina cualquier carga metabólica de la célula hospedante y permite a la célula hospedante sin plásmido disminuir rápidamente la población de célula hospedante que porta el plásmido. El sobrecrecimiento de las células hospedantes que no contienen y, por tanto, no expresan la proteína de interés reducen los niveles de producción de proteína total. Por tanto, las células hospedantes que no son obligadas genéticamente a mantener los vectores de expresión que dirigen la síntesis de niveles altos de una proteína dada de interés, pueden producir significativamente menos proteína.

Hay un número de medios por los cuales este estrés metabólico puede ser reducido. La expresión controlada de una proteína de interés de los vectores de expresión multicopia representan una solución para la síntesis de niveles altos de la proteína de interés sin células hospedantes. Esta solución es una realización con la cual practicar los métodos descritos. La utilización de promotores inducibles, por ejemplo, es un método por el que la expresión de un vector de expresión puede ser controlada. Dichos promotores inducibles son descritos en la sección de casete de expresión de esta descripción.

Otra realización de los métodos aquí descritos se refiere a un sistema de expresión basado en el plásmido construido para permitir la expresión estable de niveles altos de una o más proteínas a través del crecimiento de la población de las células. Preferentemente, un vector de expresión estable es uno que perpetua el vector de expresión según la célula hospedante se duplica. Los vectores de expresión que confieren estabilidad al plásmido en dos niveles independientes han sido descritos recientemente en Galen, y otros., Immun. 67:6424-6433 (1999) y en el documento de patente Norteamericano Nos. 09/204, 117, publicado el 2 de Diciembre de 1998 y 09/453, 313, publicado el 2 de Diciembre de 1999.

En esta realización, las funciones de partición pueden ser incorporadas en un vector de expresión para mejorar la herencia del plásmido a una bacteria dada o la célula hospedante crece y se divide subsiguientemente. En casos raros donde una célula hija no hereda al menos una copia del vector de expresión, un sistema de muerte post segregacional latente se activa y se elimina de esta bacteria o de la célula hospedante de la población de crecimiento a través de la lisis celular.

C. Células hospedantes bacterianas

Un número de especies bacterianas son adecuadas para el uso con las enseñanzas descritas aquí. Preferente-mente, una especie bacteriana adecuada será capaz de exportar una proteína tal que el gen de interés pueda ser transcrito adecuadamente tal que la proteína de interés sea traducida y exportada fuera de la bacteria. En una realización del invento, la bacteria es administrada a un animal, y así la proteína de interés debe ser exportada fuera de la bacteria en el animal. Pueden ser usadas bacterias invasivas y no invasivas. Ejemplos de algunas bacterias invasivas incluyen, Shigella spp., Listeria spp., Rickettsia spp., a la más invasiva Escherichia coli. Una realización preferida utiliza especies de Salmonella.

La cepa de Salmonella particular empleada con la descripción a continuación no es crítica. Ejemplos de cepas de Salmonella que pueden ser empleadas en el presente invento incluyen S. Typhi (ATCC No. 7251) y S. Typhimurium (ATCC No. 13311). Las cepas de Salmonella atenuadas son usadas preferentemente en el presente invento e incluyen S. Typhi aroAaroD (Hone y otros, Vacc., 9:810-816 (1991)) y S. Typhimurium aroA mutante (Mastroeni y otros, Micro. Pathol., 13:477-491 (1992))). Alternativamente, nuevas cepas de Salmonella atenuadas pueden ser construidas por introducir una o más mutaciones de atenuación como se describe para la Salmonella spp. anteriormente.

D. Bioreactores

El sistema de exportación de proteína aquí descrito es adecuado para el uso con bioreactores y dispositivos similares para facilitar el crecimiento de la bacteria y la recogida o el uso de un producto deseado o la proteína de interés. Tradicionalmente hay cinco niveles para la recuperación de biomoleculas de los bioreactores de la técnica anterior: pre tratamiento, separación sólido/líquido, concentración, purificación y formulación. Puede haber un intervalo amplio de operaciones disponibles en cada nivel. Estos intervalos de operaciones para cada nivel son como siguen: pretratamiento: interrupción celular, estabilización, esterilización, pasteurización y floculación; separación sólido/líquido: filtración, sedimentación y centrifugación; Concentración: membranas, precipitación, evaporación, extracción y concentraciones congeladas; Purificación: precipitación, extracción, diafiltración, adsorción, y cromatografía; y Formulación: secado, encapsulación, extrusión, granulación y formación de tabletas.

En los bioreactores en los que las bacterias no exportan el producto deseado fuera de la bacteria, hay que amplificar las bacterias, inducir a las bacterias a producir el producto deseado y después lisar la bacteria para liberar los contenidos. Típicamente esta interrupción es realizada en el mismo medio en el que las bacterias han crecido. Se puede usar un homogeneizador o un molino de microesferas para interrumpir mecánicamente a las bacterias. Para la interrupción no mecánica, se puede usar el choque de calor (que puede destruir las proteínas), los detergentes, los disolventes, los sequestrantes, y las enzimas (Krijgsman, “Releases of Intracellular Components”, pp. 27-42, in Product Recovery in Bioprocess Technology, Publisher Butterworth-Heinemann Ltd, Oxford, England 1992).

Después de que se rompen las bacterias se separan las partículas sólidas de los fluidos (separación sólido/liquido). El producto deseado está habitualmente en la fase líquida, el que se tiene que concentrar después. Después se extrae el producto deseado del líquido concentrado.

Los factores que afectan la separación del producto deseado de o bien los sólidos indeseados o de los líquidos, son el tamaño, la difusividad, la carga iónica, la solubilidad y la densidad. Para la separación dependiente del tamaño, se pueden usar microfiltros, filtros de tela y de fibra, ultra filtración, pantallas/coladores, y gel cromatográfico. Para la separación dependiente de la difusividad, se puede usar la osmosis inversa y la diálisis. El ion de intercambio cromatográfico es usado para la separación dependiente de la carga iónica. Para separar el producto deseado basado en su solubilidad, se pueden usar extracciones con disolventes. Para la separación dependiente de la densidad, se pueden usar ultracentrífugas, centrífugas y sedimentaciones de gravedad. (Krijgsman, “Downstream Processing in Biotechnology”, pp. 2-12, in Product Recovery in Bioprocess Technology, Publisher Butterworth-Heinemann Ltd, Oxford, England 1992).

Una ventaja de usar el sistema descrito es que una población de células hospedantes bacterianas recombinante puede ser transformada con un vector de expresión que comprende el sistema de exportación de la proteína descrita y esa población de las células hospedantes bacterianos puede ser mantenida en cultivo y usada para producir la proteína sin tener que recoger y lisar las células hospedantes bacterianas. El cultivo de las células hospedantes bacterianas y la recogida del medio de cultivo que contiene la proteína expresada recombinante de interés pueden ser realizados en cualquier tipo de bioreactor.

Hay diversos tipos de bioreactores pero la familia de equipos puede ser dividida en dos grandes categorías, bioreactores “de flotación libre” y “de lecho”. En los bioreactores “de flotación libre”, las bacterias están flotando libremente dentro del medio. Ejemplos de bioreactores “de flotación libre” son los bioreactores de tanque agitados convencionalmente, de columna de burbuja, bucle de columna aireada, bioreactores de torre multi propósito, bioreactores de bucle impulsado por líquido y bioreactores de bucle de torre bombeada. Un ejemplo de los bioreactores de tipo “lecho” es el bioreactor de lecho empaquetado. En un bioreactor de “lecho”, las bacterias están unidas a las cabezas, a la membrana u otros soportes sólidos. Un tipo híbrido de bioreactor puede ser producido usando un bioreactor de lecho fluidizado donde las bacterias están unidas a esferas u otros soportes pero pueden flotar en el medio. (Mijnbeek, “The Conventional Stirrer Tank Reactor” pp. 39-74; Mijnbeek, “Bubble Column, Airlift Reactors, and Other Reactor Designs” pp. 75-114; Geraats, “An Introduction to Immobilized Systems” pp 115-124; todas en “Operational Modes of Bioreactors”, publisher Butterworth-Heinemann Ltd, Oxford, England 1992).

Usando el sistema que exporta la proteína, descrito aquí, con un bioreactor “de lecho” se evita la etapa de tratamiento y la separación sólido/líquido debido a que la proteína de interés es exportada fuera de las bacterias en el medio. Sólo se tiene que eliminar el medio del lecho antes de intentar aislar el producto deseado. Para los bioreactores de “columna libre”, se puede centrifugar la mezcla líquido/bacteria para precipitar las bacterias. Después se aísla la proteína deseada de interés del medio. Un beneficio adicional del sistema descrito es que el medio contendrá menos proteínas indeseadas que las que están presentes en el medio en el que las bacterias fueron interrumpidas; todos los componentes intracelulares de las bacterias interrumpidas están ausentes del medio en el presente invento. Así pues la purificación de la proteína deseada de interés es más fácil. Así mismo, teniendo etiquetas y sitios de corte de proteasa presentes dentro de la proteína de exportación de la proteína de interés, la proteína de fusión facilita además el aislamiento y la purificación de la proteína de interés.

Un ejemplo de un bioreactor es el aparato mencionado en el documento de patente norteamericana No. 5.635.368, “Bioreactor with immobilized tactic acid bacteria and the use thereof” to Lommi y otros, 3 de Junio, 1997, que está incorporada por la presente en referencia en su totalidad. El aparato Lommi se refiere a un bioreactor con bacterias inmovilizadas, que se caracteriza por que las bacterias están fijas a la superficie de un excipiente no comprimible sustancialmente. Otro ejemplo de un bioreactor se encuentra en el documento de patente norteamericana No.4.910.139, “Method for continuously producing citric acid by dual hollow fiber membrane bioreactor” to Change y otros, 20 de Marzo, 1990.

Este invento se refiere al crecimiento de las bacterias inmovilizadas para producir ácido cítrico de modo continuo.

Un aparato bioreactor adicional está descrito en el documento de patente norteamericana No. 5.585.266, “Immobilized cell bioreactor” por Plitt y otros, 17 de Diciembre, 1996, que está incorporado por la presente en referencia a su totalidad. El dispositivo Plitt descrito se refiere a un bioreactor de células inmovilizada en el que las células son albergadas dentro o sobre una matriz de inmovilización que incluye hojas de soporte de células de un tejido textil común. Los documentos de patentes norteamericanas No. 4.665.027 y 5.512.480, describen otras realizaciones de bioreactores. Vacunas

El sistema de exportación de proteína descrito aquí tiene utilidad en la producción de vacunas. Por ejemplo, la producción de subunidad de vacunas puede ser lograda usando el sistema de exportación de la proteína ya que el sistema facilita la recogida de la proteína recombinante y reduce la presencia de las proteínas que contaminan el medio de crecimiento en el que las células hospedantes recombinantes son propagadas. Las células hospedantes recombinantes pueden ser también usadas para generar las composiciones inmunogénicas en las que la célula hospedante recombinante es proporcionada a un sujeto y el sistema inmune del sujeto genera una respuesta inmune contra las proteínas exportadas de la célula hospedante recombinante.

El sistema de exportación de proteínas descrito aquí puede ser usado con cualquier antígeno para preparar una vacuna del mismo, en el que el antígeno es la proteína de interés como se describe anteriormente. La preparación de la vacuna está descrita generalmente en New Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller y otros, University Park Press, Baltimore, Md, USA, 1978. La encapsulación dentro de los liposomas está descrita, por ejemplo, por Fullerton, en el documento de patente norteamericana No.4.235.877. La conjugación de las proteínas a macromoléculas está descrita, por ejemplo, por Likhite, en el documento de patente norteamericana No. 4.372.945 y por Armor y otros en el documento de patente norteamericana No. 4.474.757.

La cantidad de antígeno en cada dosis de vacuna es seleccionada como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin los efectos secundarios adversos significativos de las vacunas típicas. Tal cantidad variará dependiendo de que antígenos específicos sean empleados y de la tecnología de suministro usada (por medio del ejemplo solamente, proteínas purificadas o bacterias vivas). Generalmente se espera que las dosis que comprenden las proteínas purificadas comprendan 1-1000 µg del antígeno total, preferiblemente 2-200 µg. Generalmente se espera que la dosis que comprenden las bacterias vivas que suministran las proteínas de interés comprendan 1-1000 ng del antígeno total de interés. Una cantidad óptima para una vacuna particular puede ser establecida por estudios estándar que implican la observación de concentraciones de anticuerpos y otras respuestas en los sujetos. Siguiendo una vacunación inicial, los sujetos (animales o humanos) pueden recibir una

o más dosis de refuerzo, por ejemplo después de 1 y 6 meses.

El sistema de exportación de proteína puede ser usado también con una vacuna de vector bacteriana viva para aumentar la eficacia de la preparación. Por ejemplo, el documento de patente norteamericana No. 5.387.744, por Curtiss y otros, titulado “A virulent microbes and uses therefor: Salmonella typhi”, que es incorporado aquí por referencia, proporciona una vacuna de vector bacteriana viva contra S. Typhi. Más específicamente, la patente de Curtiss proporciona composiciones inmunogénicas para la inmunización de un vertebrado o invertebrado que comprende un derivado virulento de S. Typhi. Los derivados que tienen una mutación de los genes cya y/o crp y/o cdt.

Los derivados virulentos mostrados por Curtiss y otros, pueden ser transformados con el sistema de exportación de proteína descrito aquí para permitir que el organismo recombinante resultante actúe como una composición inmunogenica contra S. Typhi, así como cualquier frente a otro antígeno o antígenos que estén unidos a la proteína de exportación de proteína del sistema descrito. Utilidad adicional

En adición a las proteínas terapéuticas y los antígenos que son útiles para la industria farmacéutica, el gen de interés puede codificar las enzimas, los polipéptidos, las proteínas o los aminoácidos que pueden ser útiles para, a modo sólo de ejemplo, la industria alimenticia, la industria de suplementos nutricionales, la industria de alimentos animales, la industria biomédica, la industria de eliminación de residuos y la industria de tratamiento de residuos. Para estas industrias, la proteína de interés codificada por el gen de interés puede no necesitar ser aislada del medio de un bioreactor para que la proteína de interés sirva a sus funciones. La proteína de interés puede ser un catalizador para una reacción deseada o puede actuar como un componente precursor para una reacción deseada.

Los ejemplos siguientes son proporcionados para propósitos ilustrativos solamente, y no se pretende de ninguna manera limitar el alcance del presente invento.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Clonaje y mutagenesis de S. Typhi clyA

La identificación del clyA fue completada por el análisis BLASTN de la secuencia del genoma S. Typhi completada recientemente disponible del Sanger Centre (Welcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge, CB10 1SA, UK)(Véase http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_typhilblast_server.shtml) usando la secuencia de ADN del E. coli hlyE (GenBank número de acceso U57430).

El marco de lectura abierto clyA fue identificado como una secuencia de 912 pb predicha que codifica una proteína residuo 304 con una masa molecular de 33,8 kDa que es 89,4% idéntica al HlyE de E. coli. Aunque el clyA es 85,3% idéntica al marco de lectura abierto hlyE de 915 pb de E.coli, la región transcripcional testigo aguas arriba está poco relacionada con sólo 33,6% de bases idénticas dentro de una región 250 pb.

Basado en este análisis, los cebadores fueron diseñados para la amplificación por PCR de un casete genético sin promotor que codifica el ClyA en el que un sitio de unión ribosomal optimizado fue fabricado 5’ próximo al codón de inicio ATG.

Las secuencias del cebador se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1 Cebadores usados en la construcción y el análisis de secuencias de los casetes plasmídicos

imagen1

Los sitios de restricción relevantes están marcados en negrita, subrayados; los sitios de unión al ribosoma y los codones de inicio están marcados en cursiva.

Para facilitar la recuperación, las técnicas de PCR de solapamiento fueron usadas para crear un casete génico sin promotor clyA-tetA de 2252 pares de bases sintetizado por PCR de solapamiento como se describe anteriormente usando los cebadores 1 y 2 con el ADN de plantilla cromosómica del CVD 908-htrA, y los cebadores 3 y 4 con la plantilla derivada del pBR322 y recuperada en pGEM-T (Promega, Madison W) transformada en E. coli DH5�.

Los clones recombinantes fueron seleccionados en un medio agar sólido que contenía glóbulos rojos de oveja. Específicamente, la selección para la actividad hemolítica fue realizada en un medio agar 1XLB preparado en fresco que contenía una selección de antibióticos apropiada y 5% de sangre de oveja. Las placas fueron incubadas después a 37°C durante 24 horas para detectar zonas de hemolisis de glóbulos rojos (RBC). Varias colonias fueron identificadas inmediatamente con halos claros producidos de la hemolisis. Esta observación sugirió que si el clyA necesita proteínas auxiliares para la traslocación fuera de la bacteria, estas proteínas son aparentemente comunes a ambos S. Typhi y E. coli. Un aislamiento positivo marcado como pGEM-TclyA, fue elegido para usos adicionales.

Los roles funcionales de diversas regiones del ClyA fueron examinados para proporcionar información para la correcta ingeniería de las proteínas de fusión recombinante que codifican un antígeno fusionado con ClyA. Específicamente, fue examinado el rol jugado por el amino terminal, el carboxilo terminal, o ambos, en la exportación de la hemolisina fuera de a bacteria.

Para conseguir esto, el clyA fue mutagenizado ocasionalmente usando el transposón TnghoA. El “phoA” del “TnphoA” codifica la fosfatasa alcalina (Véase Manoil y Bechwith, PNAS Vol 82, pp 8129-8133, 1985). La transposición del TnphoA permite la formación ocasional de fusiones en marco del terminal N del PhoA en una proteína diana dada. La mutagenesis TnphoA fue llevada a cabo después de la electroporacion del pGEM-TclyA, que expresa la hemolisina S. Typhi ClyA funcional en DH5� para producir DH5� (pGEM-TclyA). Una unión entrecrozada de cepas “crossstreak” fue realizada después entre DH5� (pGEM-TclyA) y la cepa del donante TnphoA SM10 (pRT733) y se seleccionaron los transconjugantes en el 2XLB50 complementado con tetraciclina, carbenicilina y canamicina a 10 µg/ml, 50 µg/ml, y 10 µg/ml respectivamente (2XLB50 + T10C50K10). Las bacterias fueron reunidas después y hechas crecidas en caldos de cultivo para la purificación del plásmido y los plásmidos purificados retransformados en la cepa CC118 de E. coli mutante phoA�20 para la selección de los transformantes Pho+ en 2XLB50 + T10C50K10 complementado con 200 µg/ml del sustrato fosfatasa alcalino 5 Bromo-4-Cloro-3indolil-Fosfato (BCIP; Sigma, St. Louis, MO). Las fusiones de la proteína diana que son secretadas por su extremo N terminal al periplasma, la superficie expuesta o exportada completamente fuera de la bacteria, pueden ser mostradas fácilmente usando el sustrato cromogénico BCIP para detectar los halos azul profundo de la hidrólisis; las proteínas que son segregadas por su extremo C terminal no serán detectadas usando este método.

Usando la mutagenesis TnphoA, 4 a 621 PhoA+ colonias fueron identificadas que ya no mostraban actividad hemolítica. Secuenciando un aislamiento se confirmó la inserción en marco del PhoA después del residuo 179 (Ala) de ClyA. Esta inserción truncó la ClyA en la región hidrofóbica transmembrana propuesta y elimina los 125 residuos carboxilo terminal restantes. Se concluyó por tanto que el extremo carboxilo terminal del S. Typhi ClyA no es necesario para transportar el citoplasma del E. coli (y se supone también del S. Typhi), y que la fusión genética de los genes heterólogos que codifican potencialmente las fusiones de las proteínas exportadas deberían llevarse a cabo en el extremo 3’ terminal del clyA. Ejemplo 2 Construcción de las fusiones carboxilo terminal de los antígenos de ensayo al ClyA.

Para ensayar la capacidad para exportar las proteínas pasajeras fusionadas al extremo carboxilo terminal de ClyA, el gen bla que codifica la proteína �–lactamasa RTEM-1 que confiere resistencia a ambas ampicilina y carbenicilina, fue elegido para la experimentación.

Esta fusión de proteína fue fabricada como una fusión genética de un casete Spel insertado en marco en el sitio Nhel adyacente a los codones tándem stop en el extremo 3’ terminal de clyA del pSEC84. Inicialmente, un fragmento Spel-Nhel de 807pb que codifica la �–lactamasa madura de 268 aminoácidos sin la secuencia señal de 23 residuos, fue sintetizado a partir del pBR322 derivado mediante PCR. El fragmento purificado fue insertado después en marco en el sitio Nhel carboxilo terminal fabricado del clyA para crear una fusión genética clyA-bla de 1742 pb que codifica una proteína de fusión de 62,9 kDa predicha. La construcción del plásmido deseada fue recuperada fácilmente en colonias aisladas de los cultivos crecidos en presencia de 5 µg/ml de carbenicilina, pero los plásmidos recuperados después de la selección con 50 µg/ml de carbenicilina parecieron ser inestables y reordenados genéticamente. Fusión bla-tetA

Debido al problema con la estabilidad del plásmido y al reordenamiento genético de la construcción clyA-bla descrita anteriormente, la fusión bla-tetA fue sintetizada como un casete Spel de 2111 pb por PCR de solapamiento usando los cebadores 5 y 6 con la plantilla pGEM-T y los cebadores 7 y 4 con la plantilla derivada del pBR322; la inserción de este casete en el pSEC84 cortado con Nhel generó el pSEC84bla (Véase la Figura 1B).

Después de la introducción en el CVD 908-htrA, las colonias fueron cribadas para detectar la retención de la actividad hemolítica, y cribadas después para determinar la actividad �–lactamasa usando el sustrato cromogénico nitrocelin a una concentración de 100 µg/ml en 2XLA50+DHB+T10; las placas fueron incubadas a 30°C durante al menos 16 horas y examinadas en lo que se resfiere a la presencia de halos rojos alrededor de las colonias que indican el corte del nitrocelin. Los halos rojos fueron observados alrededor del CVD 908-htrA (pSEC84bla), indicando el corte del nitrocelin, confirmando la presencia de �–lactamasa enzimáticamente activa. Se concluyó que una duplicación aproximada de la masa molecular del ClyA de 34 kDa a 63 kDa dió como resultado una proteína de fusión de 2 dominios en el que ambos dominios aparentemente plegados correctamente mantenían la actividad biológica esperada de cada dominio. Fusión sacB-tetA

Para investigar la versatilidad del ClyA como un compañero de fusión para exportar antígenos heterólogos fuera del S.Typhi, se examinadó la eficacia del ClyA para exportar la levasacarosa potencialmente letal codificada por sacB del Bacillus subtilis. La expresión del gen sacB es letal cuando se expresa dentro del citoplasma de las bacterias enteras, incluyendo S. Typhi, que crece en presencia de sacarosa. La construcción de una fusión de proteína ClyA-SacB con una masa molecular predicha de 83,9 kDa, por introducción en el CVD 908-htrA, fue intentada. Esta fusión fue fabricada como un casete sacB-tetA Spel que codifica la levasacarosa madura de 445 residuo de 50,0 kDa, sin la secuencia señal de 29 aminoácidos e insertada en marco en el sitio Nhel carboxilo terminal fabricado del ClyA en pSEC84. El CVD 908-htrA que transporta la construcción deseada fue seleccionada usando tetraciclina y cribado en presencia de sacarosa para sobrevivir. Si el ClyA-SacB falla en ser exportado del citoplasma, ningún aislado será recuperado, pero para las fusiones o bien expresadas en superficie o exportadas completamente de la bacteria en el medio circundante, un resto SacB enzimáticamente activo se espera que corte la sacarosa para liberar glucosa, que será transportada inmediatamente en la bacteria y metabolizada.

El casete sacB-tetA fue sintetizado usando los cebadores 8 y 9 con la plantilla pIB279 y los cebadores 10 y 4 como antes para crear un casete Spet de 2653 pb insertado en pSEC84 generando la fusión clyA:sacB del pSEC84sacB (véase la Figura 1C). Después de la introducción en el CVD 908-htrA, las colonias fueron cribadas otra vez para determinar la retención de la actividad hemolítica y examinadas después para determinar la actividad levasacarosa por cultivo en placas en un medio base agar MacConkey (Difco) complementada con DHB y o bien sacarosa (8% ó 16% w/v) u 8% de sacarosa + 8% de arabinosa como fuente única de carbohidrato. Las placas fueron incubadas a 30°C durante 16-24 horas para recuperar el unidades formadoras de colonias (cfus) aisladas y se determinó la fermentación del carbohidrato; la incubación adicional a temperatura ambiente durante varios días más fue requerida para observar la formación de montículos de tipo polisacárido, sobre las colonias.

Como se muestra en las Figuras 2B y 2D, el crecimiento del CVD 908-htrA (pSEC84sacB) fue excelente cuando creció en un medio indicador que contenía 8% de sacarosa ó 16% de sacarosa como fuente única de carbohidrato (cuando creció en un medio base agar MacConkey). Ciertamente, en un polímero como el polisacárido se observó que se formaban colonias por encima del CVD 908htrA (pSEC84sacB) aislado, que no fue observado por CVD 908-htrA (Figuras 2A y 2C), e intensificado con un aumento de la concentración de sacarosa. Planteando la hipótesis de que el material semejante al polisacárido era levan, formado por la polimeracion de levansacarosa catalizado de la fructosa liberada de la hidrólisis de la sacarosa, se intentó bloquear esta polimerización por la introducción de 8% de L-arabinosa que e conoce que inhibe la levansacarasa. Como se muestra en la Figura 2F, los montículos no se observaron por más tiempo, pareciendo ahora las colonias CVD 908-htrA y CVD 908htrA (pSEC84sacB) similares.

Si las fusiones de la proteína ClyA-SacB son ciertemente exportadas fuera del CVD 908-htrA (pSEC84sacB), entonces el corte de sacarosa por el dominio SacB para liberar glucosa libre debería proporcionar una ventaja metabólica comparada con CVD 908-htrA cuando estas cepas crecen como cultivo en caldos en presencia de sacarosa. Para ensayar esta hipótesis, 100 ml de caldos de cultivo de o bien CVD 908htrA (pSEC84) o CVD 908-htrA (pSEC84sacB) fueron metidos en 1 litro de frascos indentados que contienen 2XLB50+DHB+K10 mas 10% de sacarosa y el crecimiento fue comparado con los cultivos CVD 908-htrA (pSEC84) que crecen en presencia del 10% de glucosa como un testigo positivo. Como se muestra en la Figura 3, se observó que el CVD 908-htrA (pSEC84sacB) crece más rápido en presencia de la sacarosa que o bien el CVD 908-htrA (pSEC84) creciendo con glucosa o sacarosa, una observación confirmada con recuentos de células viables. Cuando se toman juntos con resultados observados anteriormente para el ClyA-Bla, los datos sugieren totalmente que el ClyA es un compañero de fusión versátil para exportar fuera de las bacterias las proteínas de fusión plegadas correctamente en las que la actividad biológica de los dominios fusionados está conservada. La fusión clyA:gfpuv

Para definir adicionalmente las propiedades de exportación del ClyA y verificar específicamente la presencia de los productos de fusión ClyA en el sobrenadante del CVD 908-htrA creciendo exponencialmente, fue construida una fusión genética del clyA donde el clyA fue fusionado a la proteína fluorescente verde del indicador fluorescente (GFPuv) creando el casete clyA:gfpuv del pSEC84gfpuv (véase la Figura 10), e isogenico para ambos pSEC84bla y pSEC84sacB. De nuevo, el CVD 908-htrA (pSEC84gfpuv) permaneció hemolítico pero con fluorescencia reducida cuando se comparó con el GFPuv expresado citoplásmicamente. Usando el anticuerpo policlonal GFP (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), la exportación del ClyA-GFPuv en el sobrenadante de cultivo fue examinada usando el análisis de inmunotransferencia Western, como se muestra en la Figura 4. La Figura 4 ilustra un set de inmunotransferencias Western que analizan las fracciones de célula bacteriana de o bien CVD 908-htrA (carriles 1-3) o CVD 908-htrA (pSEC84gfpuv) (carriles 4-8). Las fracciones de célula se cargan como sigue: los sobrenadantes, carriles 1 y 4; citoplasma, carriles 2 y 6; periplasma, carril 5; insoluble, carril 7; célula entera, carriles 3 y 8; y GFPuv 50 ng, carril 9. Las membranas con muestras idénticas fueron probadas con los anticuerpos específicos para el GFPuv (panel A) o el E. coli GroEL (panel B). Como se puede ver en esta figura, una cantidad significativa de la fusión de proteína 61 kDa esperada es detectada en 0,5 ml del sobrenadante TCA precipitado del CVD 908-htrA (pSEC84gfpuv) (carril 4); una especie con reacción entrecruzada irrelevante de aproximadamente 45 kDa es detectada también en el citoplasma del CVD 908-htrA (carril 2) y en las fracciones citoplasma, insoluble y de célula entera del CVD 908-htrA (pSEC84gfpuv); de modo interesante, el carril 5 sugiere que muy poco Cly-GFPuv es recuperado del espacio periplásmico. Conclusión

Los resultados de este trabajo apoyan claramente la conclusión de que la hemolisina críptica ClyA del S. Typhi puede ser usada para facilitar la exportación de los dominios del antígeno heterólogos fuera de la cepa vacuna atenuada CVD 908htrA y al medio circundante. Además, este trabajo demuestra que el ClyA puede ser usado para facilitar la exportación de una proteína de fusión fuera de las bacterias en el medio circundante. Como se ilustra anteriormente, la capacidad de exportar las proteínas de interés plegadas correctamente fusionadas con el extremo carboxilo del ClyA fue mostrada usando el gen bla que codifica la proteína de �–lactamasa RTEM-1 que confiere resistencia a ambos ampicilina y carbenicilina. El gen bla del pBR322 es de 861 pb de largo y codifica una proteína de 31,5 kDa con una secuencia de señal de 23 aminoácidos que dirige la secreción del extremo N terminal de la �–lactamasa al espacio periplásmico. El trabajo anterior indica la fabricación exitosa de una fusión génica que codifica una fusión de proteína �–lactamasa ClyA funcional que retiene tanto la actividad hemolítica como la capacidad para cortar el sustrato cromogénico de la �–lactamasa nitrocefin para producir halos rojos frente a un fondo amarillo de nitrocefin sin cortar.

De modo interesante, los intentos para seleccionar tales vectores de expresión, cuando crecen los transformantes en un medio rico complementado con 50 µg/ml de o bien carbenicilina o ampicilina, fueron exitosos y sólo los plásmidos reordenados extensamente fueron recuperados como se juzga por el cribado de restricción. Se ha demostrado de forma definitiva que la �–lactamasa expresada citoplásmicamente confiere resistencia a ~5 µg/ml de ampicilina, mientras que la beta-lactamasa periplásmica expresada apropiadamente confiere resistencia > 4000 µg/ml a ampicilina. Sin embargo, la muestra de superficie de las fusiones de proteína �– lactamasa se ha demostrado que confiere resistencia a ~100 µg/ml de ampicilina. Ciertamente, Chervaux y otros han informado que la secreción mediada por HlyA de las fusiones beta-lactamasa fuera del E. coli confieren de nuevo resistencia a nivel bajo a ~ 5 µg/ml de ampicilina. Demostraron que aunque la actividad específica del dominio de �–lactamasa intacto de la fusión de superficie permanece similar al de la beta-lactamasa sin modificar, no se observó resistencia a niveles altos de ampicilina, y se concluyó que la resistencia bacteriana a los antibióticos beta-lactámicos requieren concentraciones significantes de beta-lactamasa dentro del espacio periplásmico cerca de las dianas de muerte. Basado en tales observaciones, se concluyó que las fusiones de proteína ClyA-beta-lactamasa plegadas correctamente fueron sintetizadas dentro del CVD 908-htrA (pSEC84bla) y se exportaron para conferir un fenotipo hemolítico, así como hidrólisis mediada por beta-lactamasa del nitrocefin cefalosporin cromogénico, sin conferir resistencia a la ampicilina o la carbenicilina.

Para definir más claramente la naturaleza de la exportación del ClyA mediado de los dominios del antígeno heterólogo fuera del CVD 908-htrA, y tal vez excluir el desarrollo de los intermediarios periplásmicos, fueron estudiadas las fusiones del sacB, que codifican la levansacarasa potencialmente letal del B. subtilis. La levansacarasa es una exoenzima polipeptídica única de 50 kDa que cataliza la hidrólisis de la sacarosa para rendir glucosa libre y fructosa, y a su vez cataliza la polimerización de la fructosa en polímeros largos llamados levan. La secreción de la levansacarosa del B. subtilis que crece en un medio que contiene sacarosa da como resultado el crecimiento de colonias aisladas cubiertas por un montículo impresionante de polímero de levan viscoso después de una incubación ampliada a temperatura ambiente.

Está bien establecido que la expresión citoplasmática y periplasmática de levansacarasa codificada por sacB es letal para una variedad de bacterias que crece en presencia de la sacarosa. Se ha demostrado recientemente que usando mutaciones del péptido de señal la levansacarasa se vuelve letal dentro del citoplasma de B. subtilis que crece en presencia de sacarosa, y que la inactivación de la actividad polimerasa de fructosa fue esencial para eliminar la letalidad inducida por sacarosa.

Se argumentó, por tanto, que el fallo de las fusiones ClyA-SacB para ser exportadas fuera de ambos espacios citoplasmático y el periplasmático del CVD 908-htrA debería dar como resultado una acumulación intracelular significativa de la proteína de fusión que resulta en la letalidad para el CVD 908-htrA (pSEC84sacB) que crece en presencia de la sacarosa.

Como se muestra en la Figura 2B, sin embargo, el CVD 908-htrA (pSEC84sacB) fue observado no solamente que crecía en presencia de 8% de sacarosa sino que fermentaba el azúcar, un fenotipo no observado para el CVD 908htrA (pSEC84) crecido en idénticas condiciones. Como la concentración de sacarosa aumentó del 8% al 16% de sacarosa, la fermentación de sacarosa también aumentó con la acumulación impresionante de polímeros del material semejante al levan que desaparecieron en presencia del inhibidor de levansacarasa arabinosa. Observaciones similares de la actividad levansacarasa fueron documentadas por Jung y otros para un dominio levansacarasa expresado en superficie fusionado al extremo carboxilo de la proteína de nucleacion de hielo de Pseudomonas syringee y expresado dentro del E. coli. En vista de estos resultados, se concluyó que el CVD 908-htrA (pSEC84sacB) fabricado tuvo la capacidad de utilizar sacarosa como una fuente de carbono en experimentos de caldo de cultivo en el que el CVD 908-htrA (pSEC84sacB) se observó que crecía más rápido que el CVD 908-htrA (pSEC84) que crece en presencia o bien de la sacarosa o bien en glucosa pura. Se concluyó de nuevo que, como con las fusiones de proteína ClyA-beta-lactamasa descritas anteriormente, que las fusiones de proteína ClyA-SacB correctamente plegadas fueron sintetizadas dentro del CVD 908htrA, y exportadas para conferir ambos el fenotipo hemolítico esperado, así como la actividad levansacarasa que permite el catabolismo extracelular de una fuente carbohidrato alternativo no utilizado por la cepa hospedante sin plásmido. Ejemplo 3 Expresión de proteína en bioreactor de una fusión ClyA-SacB

Un bioreactor es preparado según las enseñanzas del documento de patente norteamericana No. 5.635.368, que es incorporado por la presente mediante referencia en su totalidad. En resumen, la celulosa derivatizada granular es fabricada según el documento de patente norteamericano No. 4.355.117 como sigue: 25 partes de celulosa fibrosa es mezclada con 25 partes de dióxido de titanio y la mezcla es compuesta con 50 partes de polietileno de alto impacto usando una extrusora de doble tornillo. La extrusora es enfriada en agua, y tamizada con un tamaño de partícula de 0,35-0,85 mm. Las partículas de celulosa aglomerada granular tamizadas fueron derivadas para formar celulosa DEAE como se describe en el documento de patente norteamericana anterior.

A continuación, diez (10) gramos de la celulosa DEAE granular son reducidos en una suspensión en agua destilada y remojados durante 5 horas con agitación ocasional. El excipiente hidratado es decantado después con el agua destilada y transferido a una columna de vidrio con un diámetro interno de 15 mm donde forma un lecho con un peso de 145 mm.

Las bacterias transformadas con pSEC84sacB (véase el Ejemplo 2) son cultivados durante 48 horas a 30°C. Cincuenta (50) mililitros de la suspensión celular son bombeados a través del lecho del excipiente a una velocidad de flujo de 25 ml/hora. Subsiguientemente, cantidades adicionales del medio de cultivo son bombeados a través del lecho del excipiente. El flujo de la columna es recogido y la proteína de fusión ClyA-SacB expresada recombinantemente (codificada por SEQ ID No: 19) es aislada y purificada del flujo. El corte del SacB proporcionará cantidades comerciales amplias de levansacarosa para la generación del levan. Ejemplo 4 Purificación de proteína His-tag en condiciones des-naturalizantes

Un cultivo bacteriano es transformado con un vector de expresión que contiene un casete de expresión que comprende la secuencia de codificación para una proteína ClyA atenuada fusionada al gen sacB, que es fusionada a una secuencia de codificación que codifica un sitio de reconocimiento de proteasa, que es fusionado a una secuencia que codifica la etiqueta polihistidina. El cultivo bacteriano es introducido en un bioreactor tal como el descrito en el Ejemplo 3.

El cultivo es colocado en condiciones que promueven la expresión de la proteína de fusión recombinante, que es exportada al medio de cultivo. El medio de cultivo es recogido y aplicado a una columna Ni (HISTRAP; Pharmacia) equilibrada con un tampón que contiene urea a una concentración suficientemente alta para desnaturalizar la proteína. La columna es lavada después y eluida. El eluido es analizado mediante gel de electroforesis para determinar la presencia de la proteína purificada.

Las fracciones que contienen proteínas purificadas son dializadas frente a un tampón de digestión de enzimas. Las muestras dializadas son reunidas después y sometidas a catálisis proteolítica por la enzima apropiada. La muestra proteolizada es purificada para eliminar el marcaje de polihistidina eliminada dejando la proteína aislada, purificada. Ejemplo 5 Construcción de CVD 908-htrA atenuado que expresa Frag C y genera una respuesta inmune frente al mismo.

Una proteína de fusión ClyA-FragC es generada en CVD 908-htrA según las etapas tratadas en el Ejemplo 1. La propuesta de los autores es expresar un codón toxC optimizado de marco de lectura abierto que codifica el fragmento C de la toxina del tétanos insertado en el ClyA expresado a partir del vector de expresión descrito aquí. La exportación del fragmento C es completada a través de una fusión genética en marco del toxC al extremo 3’ del clyA y portado en el replicón oriE1 pSEC84 como un casete P�opC-clyA EcoRI-Nhel de 1426 pb. El toxC que codifica el fragmento C es refabricado a partir de las construcciones de la técnica anterior usando el cebador directo 5’-GCGCACTAGTAAAAACCTTGATTGTTGGGTCGACAACGAAGAAGACATCGATGTTATCCTGAAAAAGTCTACCATTCTGAACTTGGACATCAAC-3’ (SEQ ID No: 15) y el cebador inverso 5’–AACTACCGCATTAAAGCTTATCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGCTAGCCTAGGTCATTAGTCGTTGGTCCAACCTTCATCGGTCGGAACGAAGTA-3’ (SEQ ID No: 16) para generar el producto PCR deseado (1424 pb). El casete toxC es subclonado después en el pSEC84 digerido con Nhel para construir pSEC84toxC. La secuencia de ADN de la unión de fusión clyA –toxC pretendida es confirmada usando el secuenciamiento del cebador 5’ – CGATGCGGCAAAATTGAAATTAGCCACTGA-3’ (SEQ ID No: 17) que hibrida 172 bases aguas arriba del sitio Nhel fabricado en el extremo 3’ del clyA. Las construcciones son cribadas para la retención de la actividad hemolítica y confirmada para exportar el ClyA-Frag C en el sobrenadante por su análisis por inmunotransferencia Western.

Grupos de diez ratones Balb/c de 6 semanas de edad son inmunizados intranasalmente con 1,0x1010 cfu de la cepa CVD 908-htrA que expresa la proteína de fusión ClyA-Frag C. Los ratones son sangrados antes y 30 días después de su inmunización, y su suero es almacenado a -20°C hasta su uso. Los anticuerpos presentes en el suero frente a los antígenos ClyA y Frag C son determinados por ELISA. Los resultados indican que la inmunización con la cepa CVD 908-htrA que expresa la proteína de fusión ClyA-Frag C provoca niveles de anticuerpos frente al antígeno Frag C que son significativamente altos que esos obtenidos con la cepa 908htrA que no expresa la proteína de fusión ClyA-Frag C. Los resultados demuestran que la expresión del antígeno Frag C como una proteína de fusión con ClyA mejora la respuesta inmune frente a este antígeno. La inmunidad protectora frente a la toxina del tétano es confirmada mediante la inoculación de los ratones inmunizados con dosis que serían letales de la toxina del tétano natural.

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Wu, K. y T. K. Wood. 1994. Evaluation of the hoklsot killer locus for enhanced plasmid stability. Biotechnol. Bioeng. 44:912-921.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> James E. Galen

Universidad de Maryland 5 <120> USO DE HEMOLISINA CLYA PARA LA EXCRECIÓN DE PROTEÍNAS

<130> UOFMD.007VPC

<150> 60/252.516

<151> 2000-11-22

<160> 19 10 <170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

<210> 1

<211> 6271

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 15 <220>

<223> Plásmido de expresión pSEC84

<400> 1

imagen1

<210> 2

<211> 305

<212> PRT

<213> Salmonella Typhi

<400> 2

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<210> 3

<211> 102

<212> ADN

<213> Secuencia Artifical

<220>

<223> Cebador de clonación

<400> 3

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<210> 4

<211> 101

<212> ADN

<213> Secuencia Aritificial

<220>

<223> Cebador de clonación

<400> 4

imagen1

<210> 5

<211> 97

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador de clonación

<400> 5

imagen1

<210> 6

<211> 69 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de clonación

10

<400> 6

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<210> 7

<211> 60

15: <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de clonación

20

<400> 7

actagtcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga: 60

<210> 8

<211> 101

25: <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador de clonación

30

<400> 8

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<210> 9

<211> 101

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<400> 9

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<210> 10

<211> 71

<212> ADN 10 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador de clonación

<400> 10

imagen2

<210> 11

<211> 103

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador de clonación

<400> 11

imagen3

<210> 12

<211> 46

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador de clonación

<400> 12 tcatgtttga cagcttatca tcgataagct ttaatgcggt agttta 46

<210> 13

<211> 80

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador de clonación

<400> 13

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<210> 14

<211> 110

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador de clonación

<400> 14

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<210> 15

<211> 94

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador de clonación

<400> 15

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<210> 16

<211> 97

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador de clonación

<400> 16

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10: <210> 17 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

15: <220> <223> Cebador de clonación

20 25: <400> 17 cgatgcggca aaattgaaat tagccactga <210> 18 <211> 8908 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> vector pSEC84sacB 30

<400> 18

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<210> 19

<211> 2253

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

5

<220>

<223> gen de fusión ClyA::SacB

<221> CDS 10 <222> (0)...(2253)

<400> 19

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Claims

Reinvindicaciones

1. Un método para expresar un gen en una célula bacteriana que comprende: proporcionar un vector de expresión para una población de células bacterianas

sin transformar, en el que el vector de expresión comprende un casete de expresión que comprende una secuencia que codifica una proteína de exportación fusionada genéticamente a una secuencia que codifica una proteína de interés;

expresar el casete de expresión tal que una proteína de fusión proteína de exportación::proteína de interés es producida y exportada en el medio de cultivo, en el que la la secuencia que codifica una proteína de exportación es seleccionada del grupo que consiste en gen (clyA) citolisina A de Salmonella serovar entérica Typhi (S. Typhi), gen clyA (S. paratyphi) de Salmonella paratyphi o el gen hemolisina E (hlyE) de Eschericia coli (E. coli).
2.

El método de la reivindicación 1, en el que dicha secuencia que codifica la proteína de exportación es seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos 516-1436 de la SEQ ID No. 1 que codifica la proteína clyA de S. Typhi y la secuencia que codifica la secuencia aminoácida de la SEQ ID No:2.
3.

El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha célula bacteriana es una célula S. Typhi o una célula E. coli.
4.

El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la secuencia que codifica la proteína de exportación es la secuencia de nucleótidos 5161436 de la SEQ ID No. 1 que codifica la proteína clyA de S. Typhi.
5.

El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la secuencia que codifica la proteína de exportación es a) la secuencia de nucleótidos 516-1436 de la SEQ ID No. 1 que codifica la proteína clyA de S. Typhi o b) codifica la secuencia aminoácida de SEQ ID No: 2, con una o más mutaciones que dan como resultado sustituciones de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en sustituciones aminoácidos en las posiciones 180, 185, 187 y 193, que atenúan la actividad hemolítica de la proteína de exportación.
6.

El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la proteína de interés es un antígeno.
7.

Un método como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, en el que dicha proteína de fusión exportada es aislada.
8.

El uso de una población de células bacterianas transformadas con un vector de expresión que comprende un casete de expresión que comprende una secuencia que codifica la proteína de exportación fusionada genéticamente a una secuencia que codifica una proteína de interés en la fabricación de un medicamento para obtener una respuesta inmune de un hospedante, en el que la secuencia que codifica la proteína de exportación es seleccionada del grupo que consiste en gen citolisina A (clyA) de Salmonella serovar entérica Typhi (S. Typhi), gen clyA de Salmonella paratyphi (S. paratyphi) o el gen hemolisina E (hlyE) de (E. coli) Escherichia coli.
9.

Un uso como se reivindica en la reivindicación 8, en el que dicha célula bacteriana, la secuencia que codifica la proteína de exportación y/o la proteína de interés es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6.
10. Un sistema para expresar una proteína de interés que comprende:

un vector de expresión que comprende un casete de expresión, en el que el casete de expresión comprende una secuencia que codifica la proteína de exportación fusionada genéticamente a una secuencia que codifica una proteína de interés;

una célula hospedante transformada con el vector de expresión; y

un entorno de cultivo para la célula hospedante transformada, en el que el casete de expresión cuando se expresa da como resultado una proteína de fusión proteína de exportación::proteína de interés, que es exportada fuera de la célula hospedante transformada, en el que la proteína de exportación que codifica la secuencia es seleccionada del grupo que consiste en gen citolisina A(clyA) de Salmonella serovar entérica Typhi (S. Typhi), gen clyA de Salmonella paratyphi (S. paratyphi) o el gen hemolisina E (hlyE) de Escherichia coli (E. coli).
11. Un sistema como se reivindica en la reivindicación 10, en el que dicha célula bacteriana, la secuencia que codifica la proteína de exportación y/o la proteína de interés es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6.