ES2345785T3 - Genes de deshidrina y promotores procedentes del cafe. - Google Patents

Abstract

Molécula de ácido nucleico aislada de la planta del café (Coffea spp.), que presenta una secuencia codificante que codifica una deshidrina, en la que la deshidrina presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre las secuencias SEC ID nº 7 ó 8.

Description

Genes de deshidrina y promotores procedentes del café.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biotecnología agrícola. En particular, la invención proporciona polinucleótidos codificantes de deshidrina procedentes de plantas del café, secuencias promotoras procedentes de genes deshidrina del café, y métodos para utilizar dichos polinucleótidos y promotores para la regulación génica y la manipulación del sabor, aroma y otras características de los granos del café.

Antecedentes de la invención

Se citan diversas publicaciones, incluyendo patentes, solicitudes publicadas y artículos especializados, durante toda la memoria. Cada una de estas publicaciones se incorpora como referencia en su totalidad en la presente memoria. Las citaciones no indicadas por completo en la memoria pueden encontrarse al final de la misma.

El aroma y sabor del café son componentes clave en la preferencia del consumidor para variedades y marcas de café. El aroma y sabor característicos del café se originan en una compleja serie de reacciones químicas que implican precursores del sabor (reacciones de Maillard) que se producen durante el tueste del grano. Entre los precursores del sabor se incluyen compuestos químicos y moléculas biológicas presentes en el grano verde del café. Hasta hoy, se han identificado más de 800 compuestos químicos y moléculas biológicas como contributivas al sabor y aroma del café (Montavon et al., J. Agric. Food Chem. 51:2328-34, 2003).

Debido a que los consumidores del café son crecientemente sofisticados, resulta deseable producir café con aroma y sabor mejorados para satisfacer las preferencias del consumidor. Tanto aroma como sabor pueden proporcionarse artificialmente a los productos del café por medios químicos (ver, por ejemplo, la patente US nº 4.072.761 (aroma) y la patente US nº 3.962.321 (sabor)). Sin embargo, hasta hoy, existen pocos datos sobre la influencia de los componentes naturales del grano del café, tales como polisacáridos, proteínas y lípidos sobre el aroma y sabor del café. Un enfoque es seleccionar variedades de entre el plasma germinal existente que presenten características de sabor superiores. Una desventaja de este enfoque es que, frecuentemente, las variedades de calidad más alta también presentan características agronómicas negativas significativas, tales como un rendimiento pobre y una baja resistencia a enfermedades y a fuentes de estrés ambiental. También resulta posible seleccionar nuevas variedades de ensayos de cultivo cruzando variedades con diferentes características industriales y agronómicas, cribando la progenie para tanto alta calidad como buen rendimiento agronómico. Sin embargo, este último enfoque resulta muy laborioso, debido a que un experimento de cruzamiento y selección a lo largo de tres estaciones de crecimiento requiere un mínimo de 7 a 8 años. De esta manera, un enfoque alternativo para incrementar la calidad del café sería utilizar técnicas de biología molecular para potenciar aquellos elementos responsables del sabor y el aroma presentes naturalmente en el grano del café, o añadir elementos potenciadores del aroma y el sabor que no se encuentran naturalmente en los granos del café. La manipulación genética resulta particularmente adecuada para conseguir estos objetivos. Por ejemplo, pueden intercambiarse proteínas del café de diferentes especies de café. Alternativamente, puede potenciarse la expresión de genes codificantes de proteínas naturales del café que contribuyen positivamente al sabor del café. A la inversa, puede suprimirse la expresión de genes codificantes de proteínas naturales del café que contribuyen negativamente al sabor del café. Otra aplicación de las técnicas modernas es la utilización de información molecular referente a la asociación entre calidad elevada y alelos específicos para el cribado de nuevas variedades para la presencia o ausencia de los mismos, realizando cruces asistidos por marcadores.

Los cafés de diferentes variedades y orígenes muestran variaciones significativas de calidad del sabor y aroma tras tostar y procesar las muestras de grano verde de la misma manera. Las diferencias de calidad son una manifestación de las variaciones químicas y físicas en las muestras de grano que resultan principalmente de diferencias en las condiciones de crecimiento y procesamiento, y también de diferencias en el fondo genético tanto de la planta madre como del grano. Al nivel de la composición química, por lo menos parte de la calidad del sabor puede asociarse a variaciones de los niveles de metabolitos de tamaño reducido, tales como azúcares, ácidos, fenólicos y cafeína, que se han encontrado asociados al grano de diferentes variedades. Se acepta que existen otras moléculas del sabor y de precursores del sabor no tan bien caracterizadas. Además, es probable que variaciones estructurales en el grano también contribuyan a las diferencias de calidad del café. Un enfoque para encontrar nuevos componentes en el grano del café ligados a la calidad del mismo es estudiar los genes y proteínas expresadas diferencialmente durante la maduración de muestras de grano de diferentes variedades que presentan diferentes características de calidad.

Se ha demostrado que un grupo de proteínas denominadas proteínas abundantes en la embriogénesis tardía (LEA) se acumulan de manera coordinada durante las últimas etapas del desarrollo de la semilla del algodón (Dure L. et al., Biochemistry 20:4162-4178, 1981). Las proteínas de la deshidrina (DHN) son un subgrupo de proteínas LEA que también se han denominado "familia de LEA D-11" o proteínas LEA de tipo 2 (Close T., Physiol. Plant 97:795-803, 1996; Ingram J., Annu. Rev. Plant Physiology Plant Mol. Biol. 47:377-403, 1996). La expresión de las proteínas DHN se ha asociado a la protección de diversos tipos de células vegetales frente a tensiones osmóticas, tales como las causadas por la desecación, las sales y las temperaturas bajas (Skriver K. et al., Plant Cell 2:503-512, 1990; Allagulova C.R. et al., Biochemistry-Moscow 68:945-951, 2003).

En los últimos años, los datos experimentales directos han relacionado la expresión incrementada de las deshidrinas con la protección frente al estrés osmótico. Por ejemplo, se ha encontrado que las plantas de Arabidopsis manipuladas para sobreexpresar una proteína de fusión de deshidrina presentan una supervivencia mejorada al exponerlas a bajas temperaturas (Puhakainen T. et al., Plant Molecular Bology 54:743-753, 2004). De manera similar, la expresión de una proteína deshidrina de citrus en tabaco transgénico se ha demostrado que proporciona una tolerancia incrementada frente a las temperaturas bajas (Hara M. et al., Planta 217:290-298, 2003). Otros datos que corroboran la relación entre las deshidrinas y la tolerancia al estrés inducido por temperaturas bajas se refieren a observaciones de que los loci QTL para la tolerancia a la congelación y la resistencia invernal se localizan en sitios muy próximos a las deshidrinas (Close T., 1996; Zhu B. et al., Molecular and General Genetics 264:145-153, 2000). Los genes DHN también se expresan robustamente en las semillas hacia el final de la maduración, un periodo en el que la semilla experimenta una reducción del contenido de agua programada dentro del desarrollo (Nylander M. et al., Plant Molecular Biology 45:263-279, 2001; Choi D.W. et al., Theoretical and Applied Genetics 100:1274-1278, 2000). Las proteínas LEA/deshidrina se ha estimado que comprenden hasta 4% de las proteínas totales de la semilla, y se cree que se encuentran implicadas en la protección del embrión y/o de otros tejidos de la semilla frente a fuentes de estrés osmótico asociadas a un bajo contenido de agua de la semilla madura (Roberts J. et al., Plant Cell 5:769-780, 1993; Wise M. et al., Trends Plant Sci. 9:13-17, 2004).

Es una percepción generalizada que las deshidrinas participan, además de otras proteínas LEA, en el proceso de deshidratación que se produce durante las últimas etapas de la maduración de la semilla, al ayudar a la aclimatación de los tejidos de la semilla al menor contenido de agua presente en las semillas maduras (Close T.M., 1996; Nylander M., 2001). Además, se cree que las deshidrinas sintetizadas por semillas durante la maduración también continúan estabilizando las estructuras celulares asociadas durante la quiescencia de la semilla. En este último contexto, recientemente se ha propuesto que las deshidrinas también podrían presentar una capacidad de secuestro de radicales (Hara M., 2003) y propiedades ligantes de metales (Alsheikh M.K. et al., J. Biol. Chem. 278:40882-40889, 2003), ambas características que probablemente resultarán útiles para periodos largos de almacenamiento de las
semillas.

Se ha aislado y estudiado un número considerable de proteínas deshidrina, y se están investigando los mecanismos fisicoquímicos y/o estructurales por los que funcionan estas proteínas en la protección de las células frente al estrés osmótico in vivo. Las deshidrinas son proteínas muy hidrofílicas y muestran un nivel inesperadamente bajo de estructuras reconocibles (Close T., 1996; Soulages J.L. et al., Plant Physiology 131:963-975, 2003). Se cree que un elemento clave de las deshidrinas es la presencia de uno o más segmentos de 15 aminoácidos ricos en lisina denominados "motivos K", que se predice que forman alfa-hélices anfipáticas de clase A (Close T., 1996; Close T., J. Physiol. Plant 100:29-296, 1997). Las deshidrinas también pueden contener dos otros motivos, un "segmento Y" N-terminal (consenso V/TDE/QYGNP) y un "segmento S" rico en serinas, pudiendo encontrarse éste último fosforilado y que se cree que participa en la localización nuclear (Close T.J., 1997; Godoy, J.A. et al., Plant Mol. Biol. 1921-1934, 1994). Se ha propuesto que los segmentos K anfipáticos cortos de los polipéptidos deshidrina interactúan funcionalmente con las zonas hidrofóbicas expuestas a solventes de las proteínas sometidas a desnaturalización parcial, y de esta manera bloquean la formación de agregados de proteínas (Close T., 1996). Las hélices K anfipáticas también podrían encontrarse implicadas en la unión de los lípidos membranales, y de esta manera podrían desempeñar un papel más específico en la protección de las lipoproteínas, que son proteínas situadas en membranas y/o en la estructura misma de la membrana (Close T., 1996; Koag M.C. et al., Plant Physiology 131:309-316, 2003). Una propuesta alternativa para por lo menos parte del efecto protector de las deshidrinas es la capacidad de estas proteínas, que son muy estables aunque relativamente no estructuradas, de unirse y organizar fuertemente las moléculas de agua (Soulages J.L., 2003). Este último efecto podría conducir a la pérdida de agua de las células, y también podría mejorar la estabilidad de determinadas macromoléculas mediante el desarrollo de una región basada en deshidrina de agua "organizada" que se encontraría más fuertemente unida y circundando a estas moléculas.

A pesar de la implicación de las proteínas de deshidrina en la resistencia de la planta a las fuentes de estrés osmótico, tales como los periodos de escasez de agua y el estrés salino, y la probable importancia de las deshidrinas durante el desarrollo del grano, se dispone de poca información sobre estos genes en el café. En el café, se conoce poco sobre el número de deshidrinas, su estructura proteica, sus niveles de expresión y distribución en los diferentes tejidos de la planta del café y entre especies del café, así como durante la maduración del grano y el pericarpio del café, y sobre la regulación de su expresión a nivel molecular. De esta manera, existe una necesidad de identificar, aislar y caracterizar proteínas deshidrina del café, y los genes y elementos genéticos reguladores. Esta información permitiría manipular genéticamente las proteínas deshidrinas del café con el fin de mejorar el aroma y sabor del mismo, así como para proporcionar otras ventajas fenotípicas asociadas a una resistencia mejorada al estrés osmótico.

Las deshidrinas, que se expresan a niveles relativamente altos al final de la maduración del grano, resultan de interés debido a sus funciones potencialmente importantes en la organización de las moléculas de agua en el grano del café y en la estabilización de las macromoléculas y orgánulos en el interior del grano deshidratado maduro. Por lo menos parte de este efecto protector se cree que se debe a la capacidad de las deshidrinas y de otras proteínas LEA de estabilizar diferentes interfases agua/proteína/lípido. Debido a que los niveles del agua pueden influir sobre el espectro de productos formados en la reacción de Maillard (Turner J. et al., J. Agric. Food Chem. 50:5400-5404, 2002), la disponibilidad y organización de las moléculas de agua en el grano del café podrían influir sobre la reacción de Maillard generadora de sabor que se produce durante el tueste del café.

Descripción resumida de la invención

La invención descrita en la presente memoria proporciona polinucleótidos codificantes de deshidrina procedentes de las plantas del café, sus polipéptidos codificados, secuencias promotoras de genes de deshidrinas del café, y métodos para utilizar dichos polinucleótidos, polipéptidos y promotores para la regulación génica y la manipulación el sabor, aroma y otras características de los granos del café.

Se exponen aspectos de la invención en las reivindicaciones adjuntas. Un aspecto de la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada del café (Coffea spp.) que presenta una secuencia codificante de una deshi-
drina.

En determinadas realizaciones, la molécula de ácido nucleico es un gen que presenta un marco de lectura abierto que comprende la secuencia codificante. Alternativamente, puede comprender una molécula de ARNm producida mediante transcripción de ese gen, o una molécula de ADNc producida mediante transcripción inversa de la molécula de ARNm.

Otro aspecto de la invención proporciona un vector que comprende la molécula de ácido nucleico codificante de deshidrina anteriormente indicada. En determinadas realizaciones, el vector es un vector de expresión seleccionado de entre el grupo de vectores que consiste de plásmido, fagémido, cósmido, baculovirus, bácmido, vectores bacterianos, levaduras y víricos. En determinadas realizaciones, el vector contiene la secuencia codificante de la molécula de ácido nucleico operablemente ligada a un promotor constitutivo. En otras realizaciones, la secuencia codificante se encentra operablemente ligada a un promotor inducible. En otras realizaciones, la secuencia codificante de la molécula de ácido nucleico se encuentra operablemente ligada a un promotor inducible. En otras realizaciones, la secuencia codificante de la molécula de ácido nucleico se encuentra operablemente ligada a un promotor específico de tejido, tal como un promotor específico de la semilla, preferentemente un promotor específico de la semilla del café. En realizaciones específicas, el promotor específico de la semilla es un promotor del gen deshidrina del café, tal como el promotor contenido en la secuencia SEC ID nº 13.

Según otro aspecto de la invención, se proporciona una célula huésped transformada con el vector anteriormente indicado. La célula huésped puede ser una célula vegetal, bacteriana, fúngica, de insecto o de mamífero. En determinadas realizaciones, la célula huésped es una célula vegetal seleccionada de entre el café, tabaco, Arabidopsis, maíz, trigo, arroz, soja, cebada, centeno, avena, sorgo, alfalfa, trébol, canol, azafrán, girasol, cacahuete, cacao, tomate, tomatillo, patata, pimiento, berenjena, remolacha azucarera, zanahoria, pepino, lechuga, guisante, áster, begonia, crisantemo, delfinio, zinia y hierbas de césped. La invención también proporciona una planta transgénica fértil producida mediante regeneración de la célula vegetal transformada. En una realización específica, la planta transgénica fértil es una especie de Coffea.

Otro aspecto de la invención proporciona un método para modular el sabor o el aroma de los granos del café. El método comprende modular la producción de una o más deshidrinas dentro de las semillas del café. En algunas realizaciones, el método comprende incrementar la producción de una o más deshidrinas, por ejemplo mediante el incremento de la expresión de uno o más genes endógenos codificantes de deshidrina dentro de las semillas del café, o mediante la introducción de un transgén codificante de deshidrina en la planta. En otras realizaciones, el método comprende reducir la producción de una o más deshidrinas, por ejemplo mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico en el café que inhiba la expresión de uno o más genes codificantes de deshidrina.

Otro aspecto de la invención proporciona un método para incrementar la resistencia a la tensión osmótica en una planta. Este método comprende incrementar la producción de una o más proteínas deshidrinas en la planta, por ejemplo mediante la introducción de un transgén codificante de deshidrina en la planta.

Según otro aspecto de la invención, se proporciona un promotor aislado de un gen de la planta del café codificante de deshidrina. En determinadas realizaciones, el gen del café codificante de deshidrina codifica una proteína deshidrina que presenta una o más de las características indicadas anteriormente. En determinadas realizaciones, el promotor comprende una o más secuencias reguladoras seleccionadas de entre el grupo que consiste de una caja TATA, un elemento sensible al ácido abscísico, una repetición RY (CATGCA(T/a)(A/g)) o una caja leguminina para regular la expresión de las proteínas de tipo leugiminina, por lo menos un motivo de secuencia de acción en cis de elemento sensible a la deshidratación/repetición de C (G/ACCGAC y por lo menos un motivo de caja-E (CANNTG)). En una realización específica, el promotor comprende la secuencia SEC ID nº 13.

La invención también proporciona un gen quimérico que comprende un promotor de un gen codificante de deshidrina del café, operablemente ligado a una o más secuencias codificantes. También se proporciona un vector para transformar una célula, que comprende el gen quimérico, así como células transformadas con el vector y plantas transgénicas fértiles producidas mediante regeneración de una célula vegetal transformadas con el vector.

Otras características y ventajas de la presente invención se entenderán a partir de los dibujos, descripción detallada y ejemplos a continuación.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Alineación óptima de deshidrinas de tipo Y3SK2 de Coffea canephora con varios homólogos vegetales estrechos. La alineación se generó utilizando el programa Clustal W en el software MegAlign (DNASTAR) y después se optimizó adicionalmente de manera manual. Los aminoácidos idénticos se encuentran incluidos en cajas. Las barras negras señalan los segmentos Y, los rectángulos oscuros individuales señalan los segmentos S, y los rectángulos con líneas discontinuas señalan los segmentos K. El círculo negro representa la diferencia de aminoácido entre CcDH2a y CcDH21b. Números de acceso: deshidrina TAS14 de Lycopersicon esculentum (AAC49618) (SEC ID nº 14), deshidrina DhnI de Solanum commersonii (CAA75798) (SEC ID nº 15), deshidrina RAB18 de Arabidopsis thaliana (NP_201441) (SEC ID nº 16).

Figura 2. Alineación óptima de la deshidrina de tipo SK3 de Coffea canephora con varios homólogos vegetales estrechos (Ejemplo comparativo). La alineación se generó tal como se ha descrito para la figura 1. Los aminoácidos idénticos se encuentran incluidos en cajas. Los rectángulos oscuros individuales señalan los segmentos S, y los rectángulos con líneas discontinuas señalan los segmentos K. Números de acceso: deshidrina de Nicotiana tabacum (BAD 13499) (SEC ID nº 17), homólogo de deshidrina CI7 de Solanum tuberosum (T07779) (SEC ID nº 18), deshidrina de Arabidopsis thaliana (CAA62449) (SEC ID nº 19).

Figura 3. Alineación óptima de la proteína abundante en la embriogénesis tardía CcLEA1 con varios homólogos vegetales estrechos (Ejemplo comparativo). Se generó la alineación tal como se ha descrito para la figura 1. Los aminoácidos idénticos se encuentran incluidos en cajas. Las cisteínas conservadas se marcan con un asterisco, y la posición de las dos cisteínas menos altamente conservadas se señalan con un círculo. Números de acceso: proteína de tipo abundante en la embriogénesis tardía de Arabidopsis thaliana (NP_200248) (SEC ID nº 20), la proteína abundante en la embriogénesis tardía de Picea glauca EMB7 (T09288) (SEC ID nº 21), proteína 2 de pilorriza de Zea mays (BAA75477) (SEC ID nº 22).

Figura 4. Análisis de expresión de PCR de las deshidrinas del café y transcritos de CcLEA1 en diferentes órganos de Coffea arabica y Coffea canephora. 100 pb representa la escalera de marcadores moleculares de 100 pb: SG, LG, YG, RG, representan verde pequeño, verde grande, verde amarillento y rojo para grano y pericarpio, respectivamente; R, S, L, F representan raíz, tallos, hojas y flores.

Figura 5. Análisis cuantitativo de expresión de RT-PCR de CcDH2 en diferentes órganos de Coffea canephora y Coffea arabica (Ejemplo comparativo). GSG, GLG, GYG, GRG representan granos verde pequeño, verde grande, amarillo y rojo, respectivamente; PSG, PLG, PYG, PRG representan pericarpios verde pequeño, verde grande, amarillo y rojo, respectivamente; R, S, L, F representan raíz, tallo, hojas y flores. Las desviaciones estándares informadas en el gráfico corresponden a cada reacción.

Figura 6. Análisis de transferencia southern de la deshidridina CcDH2 (Ejemplo comparativo). Se expuso el autorradiograma durante tres días.

Figura 7. Secuencia de ADN del promotor de CcDH2a y secuencia transcrita de Coffea canephora (Ejemplo comparativo). La secuencia de ácido nucleico de la inserción pVC1 se presenta, conjuntamente con la secuencia de aminoácidos correspondiente. La primera base en el ADNc (C) se marca con un círculo. La caja TATA putativa se encuentra subrayada. Las secuencias de repetición RY se marcan con un doble subrayado, los elementos sensibles ABA se encuentran incluidos en cajas, y la secuencia DRE/CRT se encuentra incluida en una caja dibujada con línea gruesa.

Figura 8. Gráficos de hidrofilicidad de Kyte-Doolittle de los polipéptidos codificados. CcDH1a (173 aminoácidos, SEC ID nº 7), CcDH1b (176 aminoácidos, SEC ID nº 8), CcDH2a (163 aminoácidos, SEC ID nº 9), CcDH2b (163 aminoácidos, SEC ID nº 10), CcDH3 (228 aminoácidos, SEC ID nº 11), CcLEA1 (358 aminoácidos, SEC ID nº 12).

Figura 9. Análisis cuantitativo de expresión de RT-PCR en tiempo real de la expresión de CcDH1 en las hojas de plantas de control y bajo estrés hídrico. Las plantas 1 a 3 son plantas de control regadas regularmente; las plantas 4 a 6 no recibieron agua desde el inicio del experimento ("0") hasta la semana 6.

Figura 10. Análisis cuantitativo de expresión de RT-PCR en tiempo real de la expresión de CcDH2 en las hojas de plantas de control y bajo estrés hídrico (Ejemplo comparativo). Las plantas 1 a 3 son plantas de control regadas regularmente; las plantas 4 a 6 no recibieron agua desde el inicio del experimento ("0") hasta la semana 6.

Descripción detallada de realizaciones ilustrativas Definiciones

Se utilizan diversos términos referentes a las moléculas biológicas y a otros aspectos de la presente invención en toda la memoria y reivindicaciones.

El término "aislado" se refiere a alterado "por la mano del hombre" respecto al estado natural. En el caso de que una composición o sustancia se encuentre presente en la naturaleza, ha sido "aislada" en el caso de que haya sido modificada o extraída de su ambiente original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presente naturalmente en una planta o animal vivo no se encuentra "aislado", aunque el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural se encuentra "aislado", tal como se utiliza el término en la presente memoria.

El término "polinucleótido", también denominado "molécula de ácidos nucleicos" se refiere de manera general a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. El término "polinucleótido" incluye, aunque sin limitación, ADN de una o dos cadenas, ADN que es una mezcla de regiones de una cadena y de doble cadena, ARN de una cadena y de doble cadena, y ARN que es una mezcla de regiones de una cadena y de doble cadena, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser de una cadena o, más típicamente, de doble cadena, o una mezcla de regiones de una cadena y de doble cadena. Además, el término "polinucleótido" se refiere a regiones de triple cadena que comprenden ARN o ADN, o tanto ARN como ADN. El término polinucleótido también incluye ADNs o ARNs que contienen una o más bases modificadas, y ADNs o ARNs con esqueletos modificados por la estabilidad o por otros motivos. Entre las bases "modificadas" se incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases no habituales, tales como la inosina. Puede realizarse una diversidad de modificaciones en el ADN y ARN; de esta manera, "polinucleótido" comprende formas química, enzimática o metabólicamente modificadas de polinucleótidos tal como se encuentran en la naturaleza, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células. El término "polinucleótido" también comprende polinucleótidos relativamente cortos, con frecuencia denominados oligonucleótidos.

El término "polipéptido" se refiere a cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, péptidos isostéricos. El término "polipéptido" se refiere a ambas cadenas cortas, comúnmente denominadas péptidos, oligopéptidos u oligómeros, y a cadenas más largas, generalmente denominadas proteínas. Los polipéptidos pueden contener aminoácidos diferentes de los 20 aminoácidos codificados por genes. Entre los "polipéptidos" se incluyen secuencias de aminoácidos modificadas mediante procesos naturales, tales como el procesamiento post-traduccional, o mediante técnicas de modificación química que son bien conocidas de la técnica. Estas modificaciones se encuentran bien descritas en textos básicos y en monografías más detalladas, así como en una voluminosa literatura de investigación. Las modificaciones pueden encontrarse presentes en cualquier sitio en n polipéptido, incluyendo el esqueleto peptídico, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino-terminal o carboxi-terminal. Se apreciará que puede encontrarse presente el mismo tipo de modificación en el mismo grado o en diversos grados en varios sitios en un polipéptido dado. Además, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden ser ramificados como resultado de la ubiquitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados pueden resultar de procesos post-traduccionales naturales o pueden construirse mediante métodos sintéticos. Entre las modificaciones se incluyen la acetilación, acilación, ribosilación de ADP, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un grupo heme, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclización, formación de enlaces disulfuros, desmetilación, formación de enlaces cruzados covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, carboxilación gamma, glucosilación, formación de anclaje GPI, hidroxilación, yodinación, metilación miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatado, adición mediada por ARN transferente de aminoácidos a proteínas, tal como la arginilación y la ubiquitinación (ver, por ejemplo, Proteins - Structure and Molecular Properties, 2a edición, T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York, 1993, y Wold F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, páginas 1 a 12 en: Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, editor, Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., "Analysis for Protein Modifications and Nonprotein Cofactors", Meth. Enzymol. 182:626-646, 1990, y Rattan et al., "Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging", Ann. NY Acad. Sci. 663:48-62, 1992.

El término "variante", tal como se utiliza en la presente memoria, es un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de referencia, respectivamente, aunque conserva propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere en su secuencia de nucleótidos de otro polinucleótido de referencia. Las modificaciones de la secuencia de nucleótidos de la variante pueden alterar o no alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios de nucleótidos pueden resultar en sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncaciones de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, tal como se comenta posteriormente. Una variante típica de un polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos respecto a otro polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias son limitadas, de manera que las secuencias del polipéptido de referencia y de la variante son estrechamente similares globalmente y, en muchas regiones, idénticas. Los polipéptidos variante y de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, adiciones o deleciones en cualquier combinación. Un residuo aminoácidos sustituido o insertado puede ser o no uno codificado en el código genético. Un variante de un polinucleótido o polipéptido pude ser natural, tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no es conocido que se encuentre presente naturalmente. Las variantes no naturales de polinucleótidos y polipéptidos pueden prepararse mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa.

En referencia a las plantas mutadas, las expresiones "mutante nulo" o "mutante de pérdida de función" se utilizan para referirse a una secuencia de ADN de organismo o genómico que presenta una mutación que provoca que un producto génico no sea funcional o se encuentre virtualmente ausente. Dichas mutaciones pueden encontrarse en las regiones codificante y/o reguladora del gen, y pueden ser cambios de residuos individuales, o inserciones o deleciones de regiones de ácidos nucleicos. Estas mutaciones pueden encontrarse presentes en las regiones codificante y/o reguladora de otros genes que pueden regular o controlar un gen y/o proteína codificada, de manera que provocan que la proteína sea no funcional o se encuentre virtualmente ausente.

La expresión "sustancialmente igual" se refiere a secuencias e ácidos nucleicos o de aminoácidos que presentan variaciones de secuencia que no afectan materialmente a la naturaleza de la proteína (es decir, la estructura, las características de estabilidad, la especificidad e sustrato y/o la actividad biológica de la proteína). Haciendo referencia particular a las secuencias de ácidos nucleicos, la expresión "sustancialmente igual" pretende referirse a la región codificante y a secuencias conservadas que gobiernan la expresión, y se refiere principalmente a codones degenerados codificantes del mismo aminoácido, o a codones alternativos codificantes de aminoácidos de sustitución conservadora en el polipéptido codificado. Con referencia a las secuencias de aminoácidos, la expresión "sustancialmente igual" se refiere de manera general a sustituciones y/o variaciones conservadoras en regiones del polipéptido no implicadas en la determinación de la estructura o función.

Las expresiones "porcentaje de identidad" y "porcentaje de similitud" también se utilizan en la presente memoria en comparaciones entre secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos. Haciendo referencia a las secuencias de aminoácidos, "identidad" o "porcentaje de identidad" se refieren al porcentaje de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la invención que presenta aminoácidos correspondientes o idénticos en la secuencia de aminoácidos comparada mediante un programa de análisis de secuencias. La expresión "porcentaje similar" se refiere al porcentaje de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la invención que se corresponden con aminoácidos idénticos o conservados. Los aminoácidos conservados son aquellos que presentan una estructura diferente pero que presentan propiedades físicas similares, de manera que el intercambio de uno por otro no modificaría apreciablemente la estructura terciaria de la proteína resultante. Las sustituciones conservadoras se definen en Talor (J. Theor. Biol. 119:205, 1986). En referencia a las moléculas de ácidos nucleicos, la expresión "porcentaje de identidad" se refiere a un porcentaje de los nucleótidos de la secuencia de ácidos nucleicos de la invención que han sido aparejados a nucleótidos idénticos por un programa de análisis de secuencias.

La "identidad" y la "similitud" pueden ser fácilmente calculadas mediante métodos conocidos. Las secuencias de ácidos nucleicos y las secuencias de aminoácidos pueden compararse utilizando programas informáticos que alinean la secuencias similares de los ácidos nucleicos o aminoácidos y de esta manera definen las diferencias. En metodologías preferentes, se utilizan los programas BLAST (NCBI) y los parámetros utilizados en los mismos, y se utiliza el sistema DNAstar (Madison, WI) para alinear fragmentos de secuencias de secuencias de ADN genómico. Sin embargo, las alineaciones equivalentes y evaluaciones de similitud/identidad pueden obtenerse mediante la utilización de cualquier programa estándar de alineación. Por ejemplo, el paquete Wisconsin del GCG versión 9.1, disponible del Genetics Computer Group en Madison, Wisconsin, y los parámetros por defecto utilizados (penalización por creación de hueco=12, penalización por extensión de hueco=4) por ese programa también pueden ser utilizados para comparar la identidad y la similitud de secuencias.

El término "anticuerpos" tal como se utiliza en la presente memoria incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos quiméricos, de una cadena y humanizados, así como fragmentos de anticuerpo (por ejemplo Fab, Fab', F(ab')_{2} y Fv), incluyendo los productos de una biblioteca de Fa o de otra biblioteca de expresión de inmunoglobulinas. Con respecto a los anticuerpos, la expresión "inmunológicamente específico", o "específico" se refiere a anticuerpos que se unen a uno o más epítopos de una proteína de interés, pero que no reconocen ni se unen sustancialmente a otras moléculas en una muestra que contiene una población mixta de moléculas biológicas antigénicas. Los ensayos de cribado para determinar la especificidad de unión de un anticuerpo son bien conocidos y se llevan a cabo rutinariamente en la técnica. Para un comentario exhaustivo de dichos ensayos, ver Harlow et al. (editores), ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988, capítulo 6.

La expresión "sustancialmente puro" se refiere a una preparación que comprende por lo menos 50% a 60% en peso del compuesto de interés (por ejemplo ácido nucleico, oligonucleótido, proteína, etc.). Más preferentemente, la preparación comprende por lo menos 75% en peso, y más preferentemente entre 90% y 99% en peso del compuesto de interés. La pureza se mide mediante métodos apropiados para el compuesto de interés (por ejemplo métodos cromatográficos, electroforesis en gel de agarosa o de poliacrilamida, análisis de HPLC, y similares).

Con respecto a las moléculas de ácidos nucleicos de una cadena, la expresión "que se hibrida específicamente" se refiere a la asociación entre dos moléculas de ácidos nucleicos de una cadena de suficiente secuencia complementaria para permitir dicha hibridación bajo condiciones predeterminadas utilizadas generalmente en la técnica (en ocasiones denominada "sustancialmente complementaria"). En particular, la expresión se refiere a la hibridación de un oligonucleótido con una secuencia sustancialmente complementaria contenida dentro de una molécula de ADN o ARN de una cadena, excluyendo sustancialmente la hibridación del oligonucleótido con ácidos nucleicos de una cadena de secuencia no complementaria.

Una "secuencia codificante" o "región codificante" se refiere a una molécula de ácidos nucleicos que presenta información de secuencia necesaria para producir un producto génico, tal como un aminoácido o polipéptido, al expresarse la secuencia. La secuencia codificante puede comprender secuencias no traducidas (por ejemplo intrones o regiones 5' ó 3' no traducidas) dentro de las regiones traducidas, o puede no presentar dichas secuencias no traducidas intermedias (por ejemplo tal como en el ADNc).

El término "intrón" se refiere a secuencias polinucleótidas en un ácido nucleico que no codifican información relacionada con la síntesis de proteínas. Dichas secuencias se transcriben en ARNm, pero se eliminan antes de la traducción del ARNm en proteína.

La expresión "operablemente ligado" u "operablemente insertado" se refiere a que las secuencias reguladoras necesarias para la expresión de la secuencia codificante se encuentran situadas en una molécula de ácidos nucleicos en las posiciones apropiadas respecto a la secuencia codificante, de manera que permiten la expresión de la misma. Las secuencias codificantes pueden ligarse operablemente a promotores o secuencias reguladoras en una orientación sentido o antisentido. La expresión "operablemente ligado" en ocasiones se aplica a la organización de otros elementos de control transcripcional (por ejemplo intensificadores) en un vector de expresión.

Las secuencias de control transcripcional y traduccional son secuencias reguladoras del ADN, tales como promotores, intensificadores, señales de poliadenilación, terminadores y similares, que permiten la expresión de una secuencia codificante en una célula huésped.

Las expresiones "promotor", "región promotora" o "secuencia promotora" se refieren de manera general a regiones reguladoras de la transcripción de un gen, que pueden encontrarse en el lado 5' ó 3' de la región codificante, o dentro del a región codificante, o dentro de intrones. Típicamente, un promotor es una región reguladora de ADN capaz de unirse a ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante situada cadena abajo (en dirección 3'). La secuencia promotora 5' típica se encuentra unida en su extremo 3' terminal con el sitio de inicio de la transcripción y se extiende cadena arriba (dirección 5') para incluir el mínimo número de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables sobre el fondo. Dentro de la secuencia promotora se encuentra un sitio de inicio de la transcripción (convenientemente definido mediante el mapado con nucleasa S1), así como dominios de unión de proteína (secuencias de consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa.

Un "vector" es un replicón, tal como un plásmido, fago, cósmido o virus en el que puede insertarse operablemente otro segmento de ácidos nucleicos de manera que se produzca la replicación o la expresión del segmento.

La expresión "constructo de ácidos nucleicos" o "constructo de ADN" en ocasiones se utiliza para referirse a una secuencia codificante o a secuencias operablemente ligadas a secuencias reguladoras apropiadas se insertarse en un vector para transformar una célula. Esta expresión puede utilizarse intercambiablemente con la expresión "ADN transformante" o "transgén". Dicho constructo de ácidos nucleicos puede contener una secuencia codificante para un producto génico de interés, conjuntamente con un gen marcador seleccionable y/o un gen informador.

Un "gen marcador" o "gen marcador seleccionable" es un gen cuyo producto génico codificado proporciona una característica que permite a la célula que contiene el gen que debe seleccionarse de entre células que no contienen el gen. Los vectores utilizados para la manipulación genética típicamente contienen no o más genes marcadores seleccionables. Entre los tipos de genes marcadores seleccionables se incluyen: (1) genes de resistencia a antibiótico, (2) genes de resistencia o tolerancia a herbicidas, y (3) genes marcadores metabólicos o auxotróficos que permiten que las células transformadas sinteticen un componente esencial, habitualmente un aminoácido, que las células no podrían producir de otro modo.

Un "gen informador" también es un tipo de gen marcador. Típicamente codifica un producto génico que puede someterse a ensayo o detectarse por medios estándares de laboratorio (por ejemplo actividad enzimática o fluorescencia).

El término "expresar", "expresado" o "expresión" de un gen se refieren a la biosíntesis de un producto génico. El proceso implica la transcripción del gen en ARNm y después la traducción del ARNm en uno o más polipéptidos, y comprende todas las modificaciones post-traduccionales naturales.

El término "endógeno" se refiere a cualquier constituyente, por ejemplo, un gen o ácido nucleico, o polipéptido, que puede encontrarse naturalmente dentro del organismo especificado.

Una región "heteróloga" de un constructo de ácidos nucleicos es un segmento (o segmentos) identificable de la molécula de ácidos nucleicos dentro de una molécula más larga que no se encuentra en asociación con la molécula más grande en la naturaleza. De esta manera, en el caso de que la región heteróloga comprenda un gen, el gen habitualmente se encuentra flanqueado por ADN que no flanquea el ADN genómico en el genoma del organismo fuente. En otro ejemplo, una región heteróloga es un constructo en el que la secuencia codificante misma no se encentra en la naturaleza (por ejemplo un ADNc en el que la secuencia codificante genómica contiene intrones o secuencias sintéticas que presentan codones diferentes de los del gen nativo). Las variaciones alélicas o sucesos mutacionales naturales no dan lugar a una región heteróloga de ADN tal como se define en la presente memoria. La expresión "constructo de ADN", tal como se ha definido anteriormente, también se utiliza para referirse a una región heteróloga, particularmente una construida para la utilización en la transformación de una célula.

Una célula ha sido "transformada" o "transfectada" por ADN exógeno o heterólogo en el caso de que dicho ADN haya sido introducido dentro de la célula. El ADN transformante puede integrarse o no (unirse covalentemente) al genoma de la célula. En los procariotas, levaduras y células de mamífero, por ejemplo, el ADN transformante puede mantenerse en un elemento episómico, tal como un plásmido. Con respecto a las células eucarióticas, una célula establemente transformada es una en la que el ADN transformante se ha integrado en un cromosoma de manera que se hereda en las células hija mediante replicación cromosómica. Esta estabilidad queda demostrada por la capacidad de la célula eucariótica de establecer líneas celulares o clones comprendidos de una población de células hija que contienen el ADN transformante. Un "clon" es una población de células derivada de una única célula o ancestro común mediante mitosis. Una "línea celular" es un clon de una célula primaria que es capaz de crecimiento estable in vitro durante muchas generaciones.

Los términos "grano", "semilla" o "baya" se refieren a la unidad reproductiva de la planta en floración, capaz de desarrollarse para formar otra planta igual. Tal como se utiliza en la presente memoria, especialmente con respecto a las plantas del café, los términos se utilizan sinónimamente e intercambiablemente.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "planta" incluye referencias a plantas completas, órganos de plantas (por ejemplo hojas, tallos, brotes, raíces), semillas, polen, células vegetales, orgánulos de células vegetales y progenie de los mismos. Las partes de las plantas transgénicas deben entenderse que dentro del alcance de la invención comprenden, por ejemplo, células vegetales, protoplastos, tejidos, callos, embriones, así como flores, tallos, semillas, polen, frutos, hojas o raíces originadas de plantas transgénicas o de su progenie.

La expresión "estrés osmótico" se refiere a cualquier estrés sobre la planta que altera la concentración normal de agua, azúcares o electrolitos en una célula vegetal o planta completa. El estrés osmótico puede encontrarse ambientalmente relacionado, tal como condiciones prolongadas de escasez de agua o sequía, temperaturas bajas, escarcha, temperaturas de congelación, elevado contenido salino en el suelo y similares. El estrés osmótico también puede producirse naturalmente, tal como se esperaría para el desarrollo y maduración de las semillas.

Descripción

En uno de sus aspectos, la presente invención proporciona moléculas de ácidos nucleicos del café que codifican una diversidad de proteínas deshidrina. Se identificaron moléculas de ácidos nucleicos codificantes de deshidrina y LEA (proteína abundante embriogénica tardía) a partir de bases de datos de más de 47.000 etiquetas de secuencia expresada (ESTs) de varias bibliotecas de ADNc de Coffea canephora (robusta) preparadas con ARN aislado de hojas jóvenes y de los tejidos de grano y pericarpio de bayas recolectadas en diferentes estadios del desarrollo. Se identificaron las ESTs solapantes y se "agruparon" en unigenes (contigs) que comprendían secuencias codificantes completas. Las secuencias unigén se anotaron llevan a cabo una búsqueda de BLAST de cada secuencia individual frente a la base de datos de proteínas no redundante del NCBI (National Center for Biotechnology Information). El análisis de las secuencias de ADN reveló cinco secuencias únicas que representaban tres genes deshidrina diferentes y un gen LEA. Estos ADNc se denominan en la presente memoria CcDH1a (SEC ID nº 1), CcDH1b (SEC ID nº 2), CcDH2a (SEC ID nº 3), CcDH2b (SEC ID nº 4) y CcDH3 (SEC ID nº 5). CcDH1a y CeDH1b se encontró que eran variantes alélicas una de otra, mientras que se encontró que dos unigenes diferentes codificaban el marco de lectura abierto para CcDH2. Además, el análisis de una biblioteca de ADNc construida a partir de ARN aislado de granos de café 30 semanas después de la fertilización reveló un clon de ADNc de longitud completa codificante de una proteína LEA del café. Este ADNc se denomina en la presente memoria CcLEA1 (SEC ID nº 6).

Las secuencias de aminoácidos deducidas de CcDH1a-CcDH3 se proporcionan en la presente memoria como las secuencias SEC ID nº 7 a 11. Las proteínas presentan masas moleculares de aproximadamente 17,8 kDa (CcDH1a, SEC ID nº 7), 18,1 kda (CcDH1b, SEC ID nº 8), 17,4 kDa (CcDH2a y CcDH2b, SEC ID nº 9 y 10) y 21,5 kDa (CcDH3, SEC ID nº 11). Se encontró que estas proteínas contenían motivos de aminoácidos característicos de la deshidrina, y se clasificaron según dichos motivos. CcDH1a, CcDH1b y CcDH2 (a y b) presentan la estructura Y3SK2, y CcDH3 presenta la estructura SK3. CcDH1a y CcDH1b muestran conservación absoluta en cada uno de los tres motivos, y en las dos regiones conservadas que preceden cada uno de los dos motivos K. En contraste, CcDH2 muestra diferencias puntuales en la totalidad excepto uno de los motivos Y, S y K, y diferencias más significativas fuera de estos motivos específicos de deshidrina. Los gráficos de hidrofilicidad revelaron que la totalidad de las proteínas deshidrina del café identificadas en la presente memoria eran muy hidrofílicas en toda la molécula (ver la figura 8).

La secuencia de aminoácidos deducida codificada por CcLEA1 se proporciona en la presente memoria como SEC ID nº 12. Esta proteína presenta una masa molecular de aproximadamente 39,5 kDa. Los gráficos de hidrofilicidad de esta proteína indican que esta proteína es menos hidrofílica que las moléculas de deshidrina y que existen dos pequeñas regiones hidrofóbicas, una de las cuales se sitúa en sus primeros 30 residuos N-terminales. El extremo N-terminal de CcLEA1 también se ha encontrado que contiene un inesperado segmento rico en prolinas.

Otro aspecto de la invención proporciona secuencias promotoras y elementos relacionados que controlan la expresión de los genes deshidrina en el café. Tal como se describe en mayor detalle en los ejemplos, una secuencia promotora (contenida en la secuencia SEC ID nº 13) de CcDH2a ha sido identificada mediante paseo con cebadores asistido por PCR. Se ha demostrado que el promotor CcDH2 contiene varios elementos reguladores análogos a los que anteriormente se han caracterizado en otras especies como implicados en la regulación de la expresión génica durante el desarrollo de las semillas. Estos elementos reguladores de CcDH2 se muestran en la fig. 7 y se describen en los ejemplos. Utilizando este promotor ligado al gen informador GUS, se ha determinador que el promotor es específico de semillas, silicuas, cotiledones, hipocótilos y las primeras hojas verdades de las plántulas en desarrollo. Además, tal como se describe en la sección de Ejemplos, la expresión de los genes CcDH1 y CcDH2 también se ha demostrado que está inducida por el estrés hídrico y otras condiciones de estrés.

Aunque los polinucleótidos codificantes de deshidrinas y proteína LEA de Coffea canephora se describen y ejemplifican en la presente memoria, la presente invención pretende comprender los ácidos nucleicos y proteínas codificadas de otras especies de Coffea que son suficientemente similar para que se utilicen intercambiablemente con los polinucleótidos y proteínas de C. canephora para los fines indicados posteriormente. Por consiguiente, tal como se utilizan en la presente memoria, las expresiones "deshidrina" o "proteínas abundantes en la embriogénesis tardía (LEA)" pretenden comprender todas las deshidrinas de Coffea o proteínas LEA que presentan las mismas características físicas, bioquímicas y funcionales generales indicadas en la presente memoria, así como los polinucleótidos que las codifican.

En términos de sus secuencias, entre los polinucleótidos codificantes de deshidrina y de proteína abundante en la embriogénesis tardía de la invención se incluyen variantes alélicas y mutantes naturales de secuencias SEC ID nº 1 a 6, que es probable que se encuentren en diferentes variedads de C. canephora, y homólogos de secuencias SEC ID nº 1 a 6 probablemente presentes en diferentes especies de café. Debido a que dichas variantes y homólogos se espera que presenten determinadas diferencias en las secuencia de nucleótidos y de aminoácidos, la presente invención proporciona moléculas de ácidos nucleicos codificantes de deshidrina o de proteína LEA que codifican polipéptidos respectivos que presentan por lo menos aproximadamente 40%, 45%, 50% ó 55%, preferentemente por lo menos aproximadamente 60%, 65% ó 70%, más preferentemente por lo menos aproximadamente 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% ó 80%, todavía más preferentemente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, y todavía más preferentemente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, y todavía más preferentemente 96%, 97%, 98% y 99% o más identidad respecto a cualquiera de las secuencias SEC ID nº 7 a 12, y que comprenden una secuencia de nucleótidos que presenta intervalos equivalentes de identidad respecto a cualquiera de las secuencias SEC ID nº 1 a 6. Debido a que la variación natural de las secuencias que probablemente existen entre deshidrinas y proteínas LEA, y los genes que los codifican en diferentes variedades y especies de café, el experto en la materia esperaría encontrar este nivel de variación, aunque todavía manteniendo las propiedades únicas de los polipéptidos y polipéptidos de la presente invención. Esta predicción se debe en parte a la degeneración del código genético, así como al éxito evolutivo conocido de las variaciones conservadoras de la secuencia de aminoácidos, que no alteran apreciablemente la naturaleza de la proteína codificada. Por consiguiente, dichas variantes y homólogos se consideran sustancialmente iguales entre sí y se encuentran comprendidos dentro del alcance de la presente invención.

Tal como se ha mencionado, los inventores han demostrado que la expresión de determinados genes de deshidrina o de proteína LEA es específica de semillas, silicua y plántulas en el café, además de que son inducibles por periodos de escasez de agua y otras formas de estrés. Por consiguiente, las secuencias reguladoras génicas asociadas a los genes codificantes de deshidrina y de proteína LEA resultan de utilidad práctica y se consideran comprendidas dentro del alcance de la presente invención. El promotor DH2 de C. canephora se ejemplifica en la presente memoria. La región cadena arriba de la secuencia genómica de DH2 de C. canephora se proporciona en la presente memoria como SEC ID nº 13, y contiene parte o la totalidad de un promotor ejemplar de la invención, aunque pueden encontrarse otras partes del promotor en otras localizaciones en el gen, tal como se explica en la definición de "promotor" proporcionada anteriormente en la presente memoria. Sin embargo, pueden obtenerse promotores y otras secuencias reguladoras génicas de genes de deshidrina y de proteína LEA de cualquier especie de café mediante los métodos descritos posteriormente, y pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención. Los promotores y elementos reguladores que gobiernan la especificidad de tejido y la especificidad temporal de la expresión génica de la deshidrina y de la proteína LEA pueden aprovecharse para alterar o modificar la tolerancia al estrés osmótico de diversas especies de café, entre otras utilidades.

Las secciones siguientes proporcionan los procedimientos generales implicados en la práctica de la presente invención. En la medida en que se mencionan materiales específicos, se proporcionan meramente con fines ilustrativos, y no pretenden limitar la invención. A menos que se indique lo contrario, se utilizan los procedimientos bioquímicos y biológico-moleculares generales, tales como los proporcionados en Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, o Ausubel et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 2005.

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Moléculas de ácidos nucleicos, proteínas y anticuerpos

Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención pueden prepararse mediante dos métodos generales: (1) pueden sintetizarse a partir de nucleótido trifosfato apropiados, o (2) pueden aislarse a partir de fuentes biológicas. Ambos métodos utilizan protocolos bien conocidos de la técnica.

La disponibilidad de información de secuencias de nucleótidos, tal como el ADNc que presenta las secuencias SEC ID nº 1 a 6, o la secuencia reguladora SEC ID nº 13, permite la preparación de una molécula aislada de ácidos nucleicos de la invención mediante síntesis de oligonucleótidos. Pueden prepararse oligonucleótidos sintéticos mediante el método de fosforamidita utilizado en el sintetizador de ADN 38A de Applied Biosystems o en dispositivo similares. El constructo resultante puede purificarse según métodos conocidos de la técnica, tales como la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Los polinucleótidos de doble cadena largos, tales como una molécula de ADN de la presente invención, deben sintetizarse en etapas, debido a las limitaciones de tamaño inherentes a los métodos actuales de síntesis de oligonucleótidos. De esta manera, por ejemplo, puede sintetizarse una molécula de doble cadena larga como varios segmentos más pequeños de complementariedad apropiada. Los segmentos complementarios producidos de esta manera pueden hibridarse de manera que cada segmento presente los extremos cohesivos apropiados en presencia de ADN ligasa para construir una molécula de doble cadena larga completa. Una molécula de ADN sintética construida de esta manera seguidamente puede clonarse y amplificarse en un vector apropiado.

Según la presente invención, los ácidos nucleicos que presentan el nivel de homología de secuencias apropiado con parte o la totalidad de las regiones codificantes y/o reguladoras de los polinucleótidos codificantes de deshidrina o de proteína LEA pueden identificarse mediante la utilización de condiciones de hibridación y lavado de astringencia apropiada. El experto en la materia apreciará que la estrategia anteriormente indicada, al aplicarla a secuencias genómicas, permitirá, además de aislar las secuencias codificantes de deshidrina o de proteína LEA, el aislamiento de promotores y de otras secuencias reguladoras génicas asociadas a genes de deshidrina o de proteína LEA, aunque las secuencias reguladoras mismas pueden no compartir suficiente homología para permitir la hibridación adecuada. Además, la anotación de una secuencia codificante por lo menos parcial permitirá al experto en la materia determinar la secuencia codificante restante, así como las secuencias de promotor u otras secuencias reguladoras génicas asociadas a la deshidrina o proteína LEA de interés mediante la técnica de paseo genómico cadena arriba o cadena abajo. Dichas técnicas se encuentran establecidas en la técnica (Mishra R.N. et al., 2002; Rishi A.S. et al., 2004).

A modo de ilustración típica, pueden llevarse a cabo hibridaciones, según el método de Sambrook et al., utilizando una solución de hibridación que comprende: 5X SSC, 5X reactivo de Denhardt, SDS al 1,0%, ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado 100 \mug/ml, pirofosfato sódico al 0,05% y formamida hasta al 50%. La hibridación se lleva a cabo a una temperatura de entre 37ºC y 42ºC durante por lo menos seis horas. Tras la hibridación, los filtros se lavan de la manera siguiente: (1) 5 minutos a temperatura ambiente en 2X SSC y SDS al 1%, (2) 15 minutos a temperatura ambiente en 2X SSC y SDS al 0,1%, (3) 30 minutos a 1 hora a 37ºC en 2X SSC y SDS al 0,1%, (4) 2 horas a una temperatura de entre 45ºC y 55ºC en 2X SSC y SDS al 0,1%, cambiando la solución cada 30 minutos.

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Una fórmula común para calcular las condiciones de astringencia necesarias para conseguir la hibridación entre moléculas de ácidos nucleicos de una homología de secuencias especificada es (Sambrook et al., 1989):

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A modo de ilustración de la fórmula anterior, utilizando [Na^{+}]=[0,368] y formamida al 50%, con un contenido de GC de 42% y un tamaño de sonda medio de 200 bases, la Tm es de 57ºC. La T_{m} de un dúplex de ADN se reduce en 1 a 1,5ºC con cada reducción de 1% de la homología. De esta manera, las dianas con una identidad de secuencia superior a aproximadamente 75% se observarían utilizando una temperatura de hibridación de 42ºC.

En una realización, la hibridación se realiza a 37ºC y el lavado final, a 42ºC; en otra realización, la hibridación se realiza a 42ºC, y el lavado final, a 50ºC; en todavía otra realización, la hibridación se realiza a 42ºC, y el lavado final, a 65ºC, con las soluciones de hibridación y de lavado anteriormente indicadas. Entre las condiciones de alta astringencia se incluyen la hibridación a 42ºC en la solución de hibridación anteriormente indicada y un lavado final a 65ºC en 0,1X SSC y SDS al 0,1% durante 10 minutos.

Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden mantenerse en forma de ADN en cualquier vector de clonación conveniente. En una realización preferente, los clones se mantienen en un vector plásmido de clonación/expresión, tal como pGEM-T (Promega Biotech, Madison, WI), pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA), pCR4-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) o pET28a+ (Novagen, Madison, WI), la totalidad de los cuales puede propagarse en una célula huésped E. coli adecuada.

Entre las moléculas de ácidos nucleicos de la invención se incluyen ADNc, ADN genómico, ARN y fragmentos de los mismos, que pueden ser de una cadena, de doble cadena o incluso de triple cadena. De esta manera, la presente invención proporciona oligonucleótidos (cadenas sentido o antisentido de ADN o ARN) que presentan secuencias capaces de hibridarse con por lo menos una secuencia de una molécula de ácidos nucleicos de la presente invención.

Dichos oligonucleótidos resultan útiles como sondas para detectar genes codificantes de deshidrina o ARNm en muestras de ensayo de tejido vegetal, por ejemplo mediante amplificación por PCR, o par la regulación positiva o negativa de la expresión de genes codificantes de deshidrina durante la traducción del ARNm en proteínas, o antes de la misma. Entre los métodos en los que pueden utilizarse oligonucleótidos o polinucleótidos codificantes de deshidrina como sondas para dichos ensayos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos: (1) la hibridación in situ, (2) la hibridación southern, (3) la hibridación northern, y (4) diversas reacciones de amplificación, tales como las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR, incluyendo la RT-PCR) y la reacción en cadena de la ligasa (LCR).

Los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos de la invención pueden prepararse de una diversidad de maneras, según métodos conocidos. En el caso de que se produzcan in situ los polipéptidos pueden purificarse a partir de fuentes apropiadas, por ejemplo semillas, pericarpios u otras partes de planta.

Alternativamente, la disponibilidad de las moléculas de ácidos nucleicos codificantes de los polipéptidos permite la producción de las proteínas utilizando métodos de expresión in vitro conocidas de la técnica. Por ejemplo, puede clonarse un ADNc o gen en un vector e transcripción in vitro apropiado, tal como pSP64 o pSP65 para la transcripción in vitro, seguido de la traducción libre de células en un sistema de traducción libre de células adecuado, tal como germen de trigo o reticulocitos de conejo. Los sistemas in vitro de transcripción y traducción se encuentran disponibles comercialmente, por ejemplo de Promega Biotech, Madison, WI, BRL, Rockville, MD o Invitrogen, Carlsbad, CA.

Según una realización preferente, pueden producirse cantidades mayores de deshidrinas mediante la expresión en un sistema procariótico o eucariótico adecuado. Por ejemplo, parte o la totalidad de una molécula de ADN, tal como los ADNc que presentan las secuencias SEC ID nº 1 a 6 pueden insertar en un vector plásmido adaptado para la expresión en una célula bacteriana (tal como E. coli) o una célula de levadura (tal como Saccharomyces cerevisiae) o en un vector baculovirus para la expresión en una célula de insecto. Dichos vectores comprenden los elementos reguladores necesarios para la expresión del ADN en la célula huésped, posicionados de manera que permitan la expresión del ADN en la célula huésped. Entre dichos elementos reguladores necesarios para la expresión se incluyen secuencias de promotor, secuencias de inicio de transcripción y, opcionalmente, secuencias intensificadoras.

Las deshidrinas o proteínas LEA producidas mediante expresión génica en un sistema procariótico o eucariótico recombinante pueden purificarse según métodos conocidos de la técnica. En una realización preferente, puede utilizarse un sistema de expresión/secreción disponible comercialmente, en el que la proteína recombinante se expresa y después se secreta de la célula huésped, para resultar fácilmente purificada del medio circundante. En el caso de que no se utilicen vectores de expresión/secreción, un enfoque alternativo implica la purificación de la proteína recombinante mediante separación por afinidad, tal como mediante interacción inmunológica con anticuerpos que se unen específicamente a la proteína recombinante. Dichos métodos son utilizados comúnmente por el experto en la materia.

Las deshidrinas y proteínas LEA de la invención, preparadas mediante los métodos anteriormente indicados, pueden analizarse según procedimientos estándares.

Las deshidrinas y proteínas LEA purificadas a partir de café, o producidas recombinantemente, pueden utilizarse para generar anticuerpos policlonales o monoclonales, fragmentos de anticuerpos o derivados tal como se define en la presente memoria, según métodos conocidos. Los anticuerpos que reconocen y se unen a fragmentos de las deshidrinas o proteínas LEA de la invención también se encuentran contemplados, con la condición de que los anticuerpos sean específicos para deshidrinas o proteína LEA. Por ejemplo, en el caso de que los análisis de las proteínas o los análisis southern y de clonación (ver posteriormente) indiquen que los genes clonados pertenecen a una familia multigénica, pueden generarse anticuerpos específicos de un miembro preparados contra péptidos sintéticos correspondientes a regiones no conservadas de la proteína.

Los kits que comprenden un anticuerpo de la invención para cualquiera de los fines indicados en la presente memoria también se encuentran comprendidos dentro del alcance de la invención. En general, dicho kit incluye un antígeno de control para el que el anticuerpo es inmunoespecífico.

Las deshidrinas, y probablemente las proteínas LEA también, se encuentran implicadas en la protección de componentes celulares frente al estrés osmótico (deshidratación, bajas temperaturas/congelación, sales). Por consiguiente, las deshidrinas y proteínas LEA del café indicadas y ejemplificadas en la presente memoria se espera que resulten útiles en una diversidad de aplicaciones alimentarias y cosméticas. Por ejemplo, las deshidrinas o proteínas LEA pueden utilizarse para alterar la nucleación del hielo en los alimentos congelados, o para facilitar el secado de proteínas de una manera que permita la rápida rehidratación en un momento posterior. A modo de otro ejemplo, las deshidrinas o proteínas LEA pueden utilizarse para productos en crema hidratantes de la piel. Además, las recientemente descubiertas propiedades antioxidante y de unión a iones de las deshidrinas podrían demostrar ser ventajosas en productos tanto alimentarios como cosméticos. En relación a las aplicaciones alimentarias, debe indicarse que las deshidrinas son proteínas altamente solubles muy poco estructuradas y no se conoce que presenten enlaces disulfuro. Como resultado, estas proteínas probablemente muestran una muy baja antigenicidad y probablemente resultarán fácilmente digeridas por proteasas en el tracto digestivo.

Puede perseguirse una o más de las aplicaciones anteriormente indicadas para las deshidrinas o proteínas LEA mediante la explotación de la disponibilidad de los polinucleótidos codificantes de deshidrina o de proteína LEA indicados en la presente memoria para generar cantidades significativas de proteína pura utilizando organismos recombinantes (por ejemplo en la levadura Picia pastoris o en Lactobacilli compatible con alimentos, o en células vegetales) y después someter a ensayo las proteínas en ensayos ya establecidos para la formación de hielo, efectos sobre el secado, rehidratación y potencial antioxidante. En el caso de que se encontrasen particularmente útiles proteínas purificadas especificas, pueden aislarse versiones naturales de dichas proteínas a partir de granos de café, que se ha determinado que son ricos en dichas deshidrinas o proteínas LEA particulares.

Vectores, células, tejidos y plantas

También se proporcionan según la presente invención vectores y kits para producir células huésped transgénicas que contienen un polinucleótido u oligonucleótido codificante de deshidrina, u homólogo, análogo o variante del mismo en una orientación sentido o antisentido, o un gen informador y otros constructos bajo el control de promotores y otras secuencias reguladoras de genes codificantes de deshidrina o de proteína LEA. Entre las células huésped adecuadas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, células vegetales, células bacterianas, levaduras y otras células fúngicas, células de insecto y células de mamífero. Los vectores para transformar una amplia diversidad de estas células huésped son bien conocidos para el experto en la materia. Incluyen, aunque sin limitación, plásmidos, fagémidos, cósmidos, baculovirus, bácmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BACs), cromosomas artificiales de levadura (YACs), así como otros vectores bacterianos, levaduras y víricos. Típicamente, los kits para producir células huésped transgénicas contienen uno o más vectores apropiados e instrucciones para producir las células transgénicas utilizando el vector. Los kits pueden incluir además uno o más componentes adicionales, tales como medio de cultivo para cultivar las células, reactivos para llevar a cabo la transformación de las células y reactivos para someter a ensayo las células transgénicas para la expresión génica, entre otros.

La presente invención incluye plantas transgénicas que comprenden una o más copias de un gen codificante de deshidrina, o secuencias de ácidos nucleicos que inhiben la producción o función de deshidrinas o proteínas LEA endógenas de la planta. Lo anterior puede llevarse a cabo transformando células vegetales con un transgén que comprende parte o la totalidad de una secuencia codificante de deshidrinna o de proteína LEA, o un mutante, antisentido o variante del mismo, incluyendo ARN, controlado por secuencias reguladoras nativas o recombinantes, tal como se indica posteriormente. Resultan preferentes las especies de café transgénicas, incluyendo, aunque sin limitación, C. abeokutae, C. arabica, C. arnoldiana, C. aruwémiensis, C. bengalensis, C. canephora, C. congensis, C. dewevrei, C. excelsa, C. eugenioides y C. heterocalyx, C. kapakata, C. khasiana, C. liberica, C. moloundou, C. rasemosa, C. salvatrix, C. sessiflora, C. stenophylla, C. travencorensis, C. wightiana y C. zanguebariae. También se encuentran incluidas en la invención plantas de cualquier especie; entre ellas se incluyen, aunque sin limitación, el tabaco, Arabidopsis y otras especies "fácilmente utilizables en el laboratorio", especies de cultivo de cereales, tales como maíz, trigo, arroz, soja, cebada, centeno, avena, sorgo, alfalfa, trébol y similares; plantas productoras de aceites, tales como canola, azafrán, girasol, cacahuete, cacao y similares; cultivos de hortalizas, tales como tomate, tomatillo, patata, pimiento, berenjena, remolacha azucarera, zanahoria, pepino, lechuga, guisante y similares; plantas hortícolas, tales como aster, begonia, crisantemo, delfinio, petunia, zinia, y hierba de tipo decorativo y césped, y similares.

Pueden generarse plantas transgénicas utilizando métodos de transformación vegetal estándares conocidos por el experto en la materia. Entre ellos se incluyen, aunque sin limitación, vectores Agrobacterium, tratamiento con polietilenglicol de protoplastos, administración biolística de ADN, microrrayos láser de UV, vectores víricos gemini u otros vectores víricos vegetales, tratamiento con fosfato de calcio de protoplastos, electroporación de protoplastos aislados, agitación de suspensiones celulares en solución con microperlas recubiertas con el ADN transformante, agitación de la suspensión celular en solución con fibras de silicona recubiertas con ADN transformante, incorporación directa de ADN, incorporación de ADN mediada por liposomas y similares. Dichos métodos han sido publicados en la técnica (ver, por ejemplo, Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach & Weissbach, editores, 1988); Methods in Plant Molecular Biology (Sculer & Zielinski, editores, 1989); Plant Molecular Biology Manual (Gelvin, Schilperoort, Verma, editores, 1993), y Methods in Plant Molecular Biology - A Laboratory Manual (Maliga, Klessig, Cashmore, Grissem & Varner, editores, 1994).

El método de transformación depende de la planta que deba transformarse. Los vectores Agrobacterium con frecuencia se utilizan para transformar especies dicotiledóneas. Entre los vectores binarios Agrobacterium se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, BIN19 y derivados del mismo, la serie de vectores pBI, y los vectores binarios pGA482, pGA492, pLH7000 (nº de acceso GenBank AY234330) y cualquiera adecuado de los vectores pCAMBIA (derivados de los vectores pPZP construidos por Hajdukiewicz, Svab & Maliga, Plant Mol. Biol. 25:989-994, 1994, disponibles de CAMBIA, GPO Box 3200, Canberra ACT 2601, Australia o mediante la red mundial de internet en CAMBIA.org). Para la transformación de especies monocotiledóneas, el bombardeo biolístico con partículas recubiertas con ADN transformante y fibras de silicona recubiertas con ADN transformante con frecuencia resulta útil para la transformación nuclear. Alternativamente, se han utilizado con éxito vectores "superbinarios" Agrobacterium para la transformación de arroz, maíz y diversas otras especies monocotiledóneas.

Los constructos de ADN para transformar una planta seleccionada comprenden una secuencia codificante de interés operablemente ligada a secuencias 5' reguladoras apropiadas (por ejemplo promotores y secuencias reguladoras de la traducción) y secuencias 3' reguladoras (por ejemplo terminadores). En una realización preferente, se utiliza una secuencia codificante de deshidrina o de proteína LEA bajo el control de sus elementos reguladores 5' y 3' naturales. En otras realizaciones, se intercambian las secuencias codificantes y reguladoras de deshidrina o de proteína LEA (por ejemplo la secuencia codificante CcLEA1 operablemente ligada al promotor de CcDH2) para alterar el contenido de agua o de proteínas de la semilla de la planta transformada para una mejora fenotípica, por ejemplo del sabor, aroma o de otra característica.

En una realización alternativa, la región codificante del gen se sitúa bajo un promotor constitutivo potente, tal como el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) o el promotor 35S del virus mosaico de la escrofularia. Entre otros promotores constitutivos contemplados para la utilización en la presente invención se incluyen, aunque sin limitación, los promotores de ADN-T manopina sintetasa, nopalina sintasa y octopina sintasa. En otras realizaciones, se utiliza un promotor fuerte de monocotiledónea, por ejmeplo el promotor ubiquitina del maíz, el promotor actina del arroz o el promotor de la tubulina del arroz (Jeon et al., Plant Physiology 123:1005-14, 2000).

Las plantas transgénicas que expresan secuencias codificantes de deshidrina o de proteína LEA bajo un promotor inducible también se encuentra contemplado que se encuentren comprendidas dentro del alcance de la presente invención. Entre los promotores vegetales inducibles se incluyen el promotor controlado por el represor/operador de tetraciclina, los promotores del gen de choque térmico, los promotores inducidos por estrés (por ejemplo una lesión), los promotores del gen sensibles a la defensa (por ejemplo los genes de la fenilalanina amonio liasa), los promotores del gen inducido por una lesión (por ejemplo los genes de la proteína de pared celular rica en hidroxiprolina), los promotores de genes inducibles químicamente (por ejemplo genes nitrato reductasa, genes glucanasa, genes quitinasa, etc.) y los promotores de genes inducibles por la oscuridad (por ejemplo el gen de la asparagina sintetasa), entre otros.

Los promotores específicos de tejido y específicos del desarrollo también se encuentran contemplados para la utilización en la presente invención, además de los promotores específicos de la semilla de la deshidrina o de la proteína LEA de la invención. Entre los ejemplos no limitativos de otros promotores específicos de la semilla se incluyen Cim1 (mensaje inducido por citoquinina), cZ19B1 (zeína de 19 kDa del maíz), milps (mio-inositol-1-fosfato sintasa) y ceIA (celulosa sintasa) (solicitud US nº de ser. 09/377.648), faseolina beta de la alubia, napina, beta-conglicina, lectina de soja, cruciferina, zeína de 15 kDa del maíz, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, zeína-g, waxy, shrunken 1, shrunken 2 y globulina 1, legumina 11S de soja (Bäumlein et al., 1992) y proteína 11S de almacenamiento en la semilla de C. canephora (Marraccini et al., Plant Physiol. Biochem. 37:273-282, 1999). Ver también la patente WO nº 00/12733, en la que se dan a conocer los promotores preferentes para semillas de los genes end1 y end2. También pueden utilizarse otros promotores específicos de semillas de Coffea, incluyendo, aunque sin limitación, el promotor del gen oleosina indicado en la solicitud copendiente copropietaria de patente PCT nº [NO ASIGNADO TODAVÍA]. Entre los ejemplos de otros promotores específicos de tejido se incluyen, aunque sin limitación, los promotores del gen de la subunidad pequeña de la ribulosa bisfosfato carboxilasa (RuBisCo) (por ejemplo el promotor de la subunidad pequeña del café, tal como describen Marraccini et al., 2003) o promotores génicos de la proteína ligante de clorofila a/b (CAB) en tejido fotosintético, y los promotores del gen de la glutamina sintetasa específica de raíz, en el caso de que se desee la expresión en raíces.

La región codificante también se encuentra operablemente ligada a una secuencia reguladora 3' apropiada. En realizaciones en las que no se utiliza la secuencia reguladora 3' nativa, puede utilizarse la región de poliadenilación de la nopalina sintetasa. Entre otras regiones reguladoras 3' útiles se incluyen, aunque sin limitación, la región de poliadenilación de la octopina sintasa.

La región codificante seleccionada, bajo el control de elementos reguladores apropiados, se encuentra operablemente ligada a un marcador nuclear de resistencia a fármaco, tal como la resistencia a la canamicina. Entre otros sistemas marcadores seleccionables se incluyen genes que proporcionan resistencias a antibióticas o a herbicidas (por ejemplo, resistencia a la higromicina, sulfonilurea, fosfinotricina o glifosato) o genes que proporcionan crecimiento selectivo (por ejemplo fosfomanosa isomerasa, que permite el crecimiento de células vegetales con manosa). Entre los genes marcadores seleccionables se incluyen, aunque sin limitación, genes codificantes de resistencia a antibióticos, tales como aquellos codificantes de la neomicin-fosfotransferasa II (NEO), la dihidrofolato reductasa (DHFR) y la higromicina fosfotransferasa (HPT), así como genes que proporcionan resistencia a compuestos herbicidas, tales como EPSPS resistente a glifosato y/o la glifosato oxidorreductasa (GOX), bromoxinil nitrilasa (BXN) para resistencia al bromoxinilo, genes AHAS para resistencia a las imidazolinonas, genes de resistencia a la sulfonilurea y genes de resistencia al 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D).

En determinadas realizaciones, los promotores y otras secuencias reguladoras de la expresión comprendidas por la presente invención se encuentran operablemente ligadas a genes informadores. Entre los genes informadores contemplados para la utilización en la invención se incluyen, aunque sin limitación, genes codificantes de la proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente roja (DsRed), proteína fluorescente cian (CFP), proteína fluorescente amarilla (YFP), proteína fluorescente naranja Cerianthus (cOFP), fosfatasa alcalina (AP), \beta-lactamasa, la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), adenosina desaminasa (ADA), aminoglucósido fosfotransferasa (neo r, G418 r), dihidrofolato reductasa (DHFR), higromicina-B-fosfotransferasa (HPH), timidina quinasa (TK), lacZ (codificante de \alpha-galactosidasa) y la xantina-guanina fosforibosiltransferasa (XGPRT), beta-glucuronidasa (gus), fosfatasa alcalina placentaria (PLAP), fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) o luciferasa de luciérnaga o bacteriana (LUC). Al igual que con muchos de los procedimientos estándares asociados a la práctica de la invención, el experto en la materia conocerá secuencias adicionales que pueden presentar la función de marcador o informador.

Son conocidas de la técnica modificaciones adicionales de secuencia para incrementar la expresión génica en un huésped celular. Entre estas modificaciones se incluyen la eliminación de secuencias codificantes de señales de poliadenilación superfluas, señales de sitio de procesamiento exón-intrón, repeticiones de tipo trasposón y otras secuencias bien caracterizadas de este tipo que pueden resultar perjudiciales para la expresión génica. Alternativamente, en caso necesario, puede ajustarse el contenido G/C de la secuencia codificante a niveles medios para un huésped celular de una planta del café dada, tal como se calcula haciendo referencia a los genes conocidos expresados en una célula de planta del café. Además, si resulta posible, la secuencia codificante se modifica para evitar estructuras secundarias de horquilla de ARNm predichas. Otra alternativa para incrementar la expresión génica es utilizar secuencias líder 5'. Las secuencias líder de traducción son bien conocidas de la técnica, e incluyen el derivado de acción en cis (omega') de la secuencia líder 5' (omega) del virus del mosaico del tabaco, las secuencias líder 5' procedentes del virus del mosaico del bromo, el virus del mosaico de la alfalfa y el virus del mosaico del amarilleamiento del
nabo.

Se transforman las plantas y después se criban para una o más propiedades, incluyendo la presencia del producto del transgén, el ARNm codificante del transgén, o un fenotipo alterado asociado a la expresión del transgén. Debe reconocerse que la cantidad de la expresión, así como el patrón específico de tejido o específico de un periodo de la expresión de los transgenes en plantas transformadas puede variar dependiendo de la posición de su inserción en el genoma nuclear. Estos efectos de la posición son bien conocidos de la técnica. Por este motivo, varios transformantes nucleares deberían regenerarse y someterse a ensayo para la expresión del transgén.

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Métodos

Los ácidos nucleicos y polipéptidos de la presente invención pueden utilizarse en cualquiera de los métodos en los que pueden expresarse productos proteínas en plantas del café con el fin de que las proteínas puedan desempeñar un papel en la tolerancia al estrés de la planta, y para incrementar el sabor y/o aroma de la bebida del café o de los productos del café producidos finalmente a partir del grano de la planta del café que expresa la proteína.

Con respecto a la tolerancia al estrés, ahora está bien establecido que las proteínas deshidrina participan en la protección de las plantas frente al estrés osmótico o ambiental, tal como la deshidratación y la congelación (Allagulova et al., 2003). Por ejemplo, las deshidrinas desempeñan un papel en la retención del agua y en la regulación osmótica para proteger a la planta frente a la pérdida de agua, especialmente bajo condiciones de escasez de agua. Además, dado que las deshidrinas muestran la capacidad de interactuar con cationes, las proteínas deshidrina podrían servir para ligar el exceso de sales durante los periodos de limitación de agua y podrían presentar una función quelante. Las deshidrinas también desempeñan un papel en la integridad estructural del material nuclear, tal como la cromatina, durante la desecación celular en la semilla en desarrollo, y se ha encontrado que desempeña un papel en la protección frente a la formación de cristales de hielo y la degradación del almidón a temperaturas de congelación. La función de una proteína deshidrina dada puede relacionarse con la localización de la proteína dentro de la célula. Por ejemplo, las deshidrinas localizadas en el exterior de la membrana celular pueden servir para estabilizar los lípidos y proteínas membranales (Allagulova et al., 2003). Por lo tanto, la capacidad de manipular la producción de deshidrina o proteína LEA en una planta, o incluso de utilizar los polinucleótidos y proteínas de la invención para realizar un seguimiento de dicha expresión génica, permitirá estudiar y manipular la tolerancia a la escasez de agua, frío o sales, es decir, la tolerancia osmótica, en la planta del café. Este tipo de manipulación puede extenderse de la plántula en germinación a la planta en crecimiento y que desarrolla fruta y semillas, a la estabilidad de almacenamiento posterior a la recolección de los granos de café. Este conocimiento permite la generación de plantas del café modificadas que están mejor dotadas para el crecimiento saludable y la producción de cosecha bajo condiciones de estrés ambiental u osmótico agudo o prolongado, tal como las presentes en periodos secos, de escasez de agua, de congelación o prolongadas de congelación. De esta manera, un aspecto de la invención proporciona métodos para proteger a las plantas, preferentemente las plantas del café, mediante el incremento de la resistencia al estrés osmótico mediante la modulación de la expresión de deshidrinas o proteínas LEA en la planta.

Con respecto al sabor y aroma del grano de café tostado, se espera que las deshidrinas y proteínas LEA relacionadas ejerzan alguna influencia sobre la generación de sabores de café mediante la reacción de Maillard que se produce durante el tueste. Las proteínas, y particularmente los productos de degradación de las proteínas (péptidos y aminoácidos) representan un grupo importante de precursores del sabor (Spanier et al., 2004). Por lo tanto, puede esperarse que proteínas relativamente abundantes, tales como las deshidrinas y las proteínas LEA, presentan alguna contribución a las reacciones generadoras de sabor que se producen durante el tueste del café. En este contexto, resulta posible que estas proteínas altamente solubles y muy hidrofílicas y relativamente no estructuradas reaccionan diferentemente de otras proteínas celulares durante una reacción de Maillard, debido a su estructura poco habitual y/o debido a su interacción o interacciones no habituales con las moléculas de agua. Es bien conocido que los niveles de agua presentes durante las reacciones de cocción, tales como la etapa de tueste del café, también pueden influir fuertemente sobre la ruta o rutas de reacciones químicas inducidas por calor (Turner et al., 2002). Debido a que las deshidrinas contribuyen a la organización de las moléculas de agua en el grano, una diversidad de diferencias específicas de los niveles y distribución de las deshidrinas podrían influir sobre el desarrollo del sabor durante el procedimiento de tueste. La capacidad de realizar un seguimiento (por ejemplo mediante el cruzamiento asistido por marcadores) o de manipular los perfiles de expresión de la deshidrina y de las proteína LEA es proporcionada por los polipéptidos de la presente invención, de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria.

De esta manera, un aspecto del a presente invención proporciona métodos para alterar el perfil de la deshidrina o proteína LEA en una planta, preferentemente la planta del café, que comprende incrementar o reducir una cantidad o actividad de una o más deshidrinas o proteínas LEA en la planta. Por ejemplo, en una realización de la invención, un gen codificante de deshidrina bajo el control de sus propias secuencias de control de la expresión se utiliza para transformar una planta con el fin de incrementar la producción de dicha deshidrina en la planta. Alternativamente, una región codificante de deshidrina o proteína LEA se encuentra operablemente ligada a regiones heterólogas de control de la expresión, tales como promotores constitutivos o inducibles.

La organización de las moléculas de agua o la estabilización de macromoléculas u orgánulos en el grano de una planta también puede alterarse mediante la reducción de la producción de una o más deshidrinas o proteínas LEA en la planta, o mediante el cribado de variantes naturales para la expresión reducida de deshidrina o de proteína LEA. Por ejemplo, pueden crearse plantas mutantes de pérdida de función (nulas) o seleccionarse de poblaciones de plantas mutantes disponibles actualmente. El experto en la materia también apreciará que también pueden cribarse poblaciones de plantas mutantes para mutantes que sobreexpresen una deshidrina particular, utilizando uno o más de los métodos descritos en la presente memoria. Pueden prepararse poblaciones de mutantes mediante mutagénesis química, mutagénesis por radiación e inserciones de trasposón o de ADN-T, o con diana en lesiones locales inducidas en genomas (Tilling; ver, por ejemplo, Henikoff et al., Plant Physiol. 135(2):630-636, 2004; Gilchrist & Haughn, Curr. Opin. Plant Biol. 8(2):211-215, 2005). Los métodos para preparar poblaciones de mutantes son bien conocidos de la técnica.

Los ácidos nucleicos de la invención pueden utilizarse para identificar mutantes de deshidrina o de proteína LEA en diversas especies de plantas. En especies tales como el maíz o Arabidopsis, en las que se encuentran disponibles líneas de inserción de trasposón, pueden diseñarse cebadores oligonucleótidos para cribar líneas para inserciones en los genes de deshidrina o de proteína LEA. Mediante cruzamiento, seguidamente puede desarrollarse una línea de planta que es heterocigótica u homocigótica para el gen interrumpido.

También puede manipularse una planta para mostrar un fenotipo similar al observado en mutantes nulos creados mediante técnicas mutagénicas. Puede crearse un mutante nulo transgénico mediante la expresión de una forma mutante de una deshidrina o proteína LEA seleccionada para crear un "efecto negativo dominante". Aunque sin limitar la invención a ningún mecanismo en particular, esta proteína mutante competirá con la proteína de tipo salvaje para la interacción con proteínas u otros factores celulares. Los ejemplos de este tipo de efecto "dominante negativo" son bien conocidos para sistemas tanto de insecto como de vertebrado (Radke et al., Genetics 145:163-171, 1997; Kolch et al., Nature 349:426-428, 1991).

Otro tipo de mutante nulo transgénico puede crearse mediante la inhibición de la traducción del ARNm codificante de deshidrina o de proteína LEA mediante "silenciamiento génico post-transcripcional". El gen codificante de deshidrina o de proteína LEA de la especie prevista para la regulación negativa, o un fragmento del mismo, puede utilizarse para controlar la producción de la proteína codificada. Pueden utilizarse moléculas antisentido de longitud completa con este fin. Alternativamente, pueden utilizarse oligonucleótidos antisentido con diana en regiones específicas del ARNm que resultan críticas para la traducción. La utilización de moléculas antisentido para reducir los niveles de expresión de un gen predeterminado es conocida de la técnica. Las moléculas antisentido pueden proporcionarse in situ por células vegetales transformadas con un constructo de ADN que, tras la transcripción, produce las secuencias de ARN antisentido. Dichos constructos pueden diseñarse para producir secuencias antisentido de longitud completa o parciales. Este efecto de silenciamiento génico puede incrementarse mediante la sobreproducción transgénica de ARN tanto sentido como antisentido de la secuencia génica codificante, de manera que se produce una gran cantidad de ARNdc (por ejemplo ver Waterhouse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:13959-13964, 1998). A este respecto, las secuencias que contienen ARNdc que corresponden a parte o la totalidad de por lo menos un intrón se ha encontrado que resultan particularmente eficaces. En una realización, parte o la totalidad de la cadena antisentido de la secuencia codificante de la deshidrina o de la proteína LEA es expresada por un transgén. En otra realización, las cadenas hibridantes de sentido y antisentido de parte o la totalidad de la secuencia codificante de deshidrina o de la proteína LEA se expresan transgénicamente.

En otra realización, los genes deshidrina o LEA pueden silenciarse mediante la utilización de una diversidad de otras técnicas de silenciamiento génico post-transcripcional (silenciamiento de ARN) que se encuentran disponibles actualmente para los sistemas de plantas. El silenciamiento del ARN implica el procesamiento de ARN de doble cadena (ARNdc) en fragmentos pequeños, de 21 a 28 nucleótidos con un enzima basado en la ARNasa H ("Dicer" o "de tipo Dicer"). Los productos de corte, que son ARNsi (ARN pequeño interfiriente) o ARNmi (microARN) se incorporan en los complejos de proteína efectora que regulan la expresión génica de una manera específica de secuencia (para una revisión del silenciamiento del ARN en plantas, ver Horiguchi, Differentiation 72:65-73, 2004; Baulcombe, Nature 431:356-363, 2004; Herr, Biochem. Soc. Trans. 32:946-951, 2004).

Los ARN pequeños interfirientes pueden sintetizarse químicamente o transcribirse y amplificarse in vitro, y después administrarse en las células. La administración puede realizarse mediante microinyección (Tuschl T. et al., 2002), transfección química (Agrawal N. et al., 2003), electroporación o transfección mediada por liposomas catiónicas (Brummelkamp T.R. et al., 2002; Elbashir S.M. et al., 2002) o cualquier otro medio disponible de la técnica, que será apreciado por el experto en la materia. Alternativamente, el ARNsi puede expresarse intracelularmente mediante la inserción de moldes de ADN para el ARNsi en las células de interés, por ejemplo por medio de un plásmido (Tuschl T. et al., 2002) y puede dirigirse específicamente a células seleccionadas. Los ARN interfirientes pequeños han sido introducidos con éxito en plantas (Klahre U. et al., 2002).

Un método preferente de silenciamiento del ARN en la presente invención es la utilización de horquillas de ARNs cortos (ARNsh). Un vector que contiene una secuencia de ADN codificante de una secuencia de ARNsi deseada particular se administrar en una célula diana mediante un medio común. Tras introducirse en la célula, la secuencia de ADN se transcribe continuamente en moléculas de ARN que se doblan sobre sí mismas y forman estructuras de horquilla mediante apareamiento intramolecular de bases. Estas estructuras de horquilla, tras ser procesadas por la célula, son equivalentes a moléculas de ARNsi y son utilizadas por la célula para mediar en el silenciamiento del ARN de la proteína deseada. Diversos constructos de utilidad particular para el silenciamiento del ARN en plantas son descritos por Horiguchi, supra, 2004. Típicamente, dicho constructo comprende un promotor, una secuencia del gen diana que debe silenciarse en la orientación "sentido", un espaciador, el antisentido de la secuencia génica diana y un terminador.

Todavía otro tipo de mutante nulo sintético también puede crearse mediante la técnica de "cosupresión" (Vaucheret et al., Plant J. 16(6):651-659, 1998). Se transforman células vegetales con una copia del gen endógeno destinado a la represión. En muchos casos, esto resulta en la represión completa del gen nativo, así como del transgén. En una realización, se aísla un gen codificante de deshidrina o de proteína LEA de la especie vegetal de interés, y se utiliza para transformar células de la misma especie.

Las plantas mutantes o transgénicas producidas mediante cualquiera de los métodos anteriormente indicados también se proporcionan según la presente invención. Preferentemente, las plantas son fértiles, resultando de esta manera útiles para fines de cruzamiento. De eta manera, pueden utilizarse mutantes o plantas que muestran uno o más de los fenotipos deseables anteriormente indicados para el cruzamiento de plantas, o directamente en aplicaciones agrícolas u horticulturales. También resultan de utilidad como herramientas de investigación para la elucidación adicional de la participación del as deshidrinas y proteínas LEA en el sabor, el aroma y otras características de las semillas del café asociadas al contenido y organización del agua. Las plantas que contienen un transgén o una mutación especificada también pueden cruzarse con plantas que contienen un transgén o genotipo complementario con el fin de producir plantas con fenotipos mejorados o combinados.

La presente invención también proporciona composiciones y métodos para producir, de una manera preferente en semillas o específicamente en semillas, cualquier producto génico heterólogo seleccionado en una planta. Se coloca una secuencia codificante de interés bajo el control de un promotor de deshidrina o de proteína LEA del café específico de semilla u otro promotor específico de semilla y otras secuencias reguladoras apropiadas, para producir un gen quimérico específico de semilla. El gen quimérico se introduce en una célula vegetal mediante cualquiera de los métodos de transformación indicados en la presente memoria o conocidos de la técnica. Estos genes quiméricos y métodos pueden utilizarse para producir una diversidad de productos génicos de interés en la planta, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos: (1) productos génicos detectables, tales como GFP o GUS, tal como se ha indicado anteriormente, (2) productos génicos que proporciona un beneficio agronómico u horticultural, tal como aquellos cuyas actividades enzimáticas resultan en la producción de micronutrientes (por ejemplo provitamina A, también conocida como beta-caroteno) o antioxidantes (por ejemplo ácido ascórbico, ácidos grasos omega, licopeno, isoprenos, terpenos), o (3) productos génicos para controlar patógenos o plagas, tal como se describe en Mourgues et al., TibTech. 16:203-210, 1998, u otros que es conocido que resultan protectores de las semillas de plantas o perjudiciales para los patógenos.

Además, pueden utilizarse determinados promotores de gen deshidrina o LEA para producir proteínas recombinantes tanto en semillas como en silicuas. Además, dado que determinados genes deshidrina también resultan activados bajo condiciones de escasez de agua y otras condiciones de estrés, estos promotores deberían resultar útiles para dirigir la expresión génica en otros tejidos, tales como hojas maduras, al resultar estresados osmóticamente. Esta última característica indica que resulta viable utilizar estos promotores para expresar proteínas recombinantes específicamente en las hojas de las plantas (por ejemplo la planta del tabaco) al final de la maduración, al experimentar senescencia y empezar a secarse.

Se cree que las deshidrinas son parte de las defensas de una planta frente a la deshidratación. Por lo tanto, la inducción de los genes CcDH1 y CcDH2 puede utilizarse como medida del estrés de deshidratación existente en una planta, tanto del momento de la inducción de estrés hídrico como de la magnitud del estrés hídrico. De esta manera, la expresión de deshidrina puede utilizarse para cribar poblaciones de plantas para sus capacidades de respuesta al estrés osmótico.

Los ejemplos siguientes se proporcionan para describir la invención en mayor detalle. Los ejemplos pretenden ilustrar, no limitar, la invención.

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Ejemplo 1

Material vegetal para la extracción de ARN

Se recolectaron raíces, hojas jóvenes, tallos, flores y frutos recién recolectados en diferentes etapas del desarrollo, procedentes de Coffea arabica L. cv. Caturra T-2308 y Coffea canephora var. BP409 cultivado bajo condiciones de invernadero (25ºC, 70% de HR) y también de Coffea canephora BP-409 cultivado en el campo en Java oriental, Indonesia. Las etapas del desarrollo se definieron de la manera siguiente: frutos verdes pequeños (SG), frutos verdes grandes (LG), frutos amarillos (Y) y frutos rojos (R). Los tejidos frescos se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido, después se almacenaron a -80ºC hasta la utilización para la extracción del ARN.

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Ejemplo 2

Protocolos para la extracción del ARN total, generación de ADNc y condiciones de reacción de PCR

Las muestras de tejidos almacenadas a -80ºC se molieron para formar polvos y se extrajo el ARN total de estos polvos utilizando el método descrito anteriormente (Rogers et al., 1999). Se trataron muestras con ADNasa utilizando el kit "Qiagen RNase-Free DNase" siguiendo las instrucciones del fabricante para eliminar la contaminación del ADN. Todas las muestras de ARN se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa-formaldehido e inspección visual de las bandas de ARN ribosómico tras la tinción con bromuro de etidio. Utilizando oligo(dT20) como cebador, se preparó ADNc a partir de aproximadamente 4 \mug de ARN total siguiendo el protocolo en el kit Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para someter a ensayo la presencia de ADN genómico contaminante en las preparaciones de ADNc, se diseñó una pareja de cebadores que abarcaba un intrón conocido de un ADNc específico de expresión ubicua, la chalcona isomerasa. La ausencia del fragmento genómico en las reacciones de PCR indicaba la ausencia de contaminación detectable de ADN genómico.

Se llevaron a cabo reacciones de PCR utilizando el ADNc de Coffea arabica y de Coffea canephora preparado tal como se ha indicado anteriormente. Los cebadores específicos de gen se proporcionan en la Tabla 1.

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TABLA 1 Lista de cebadores utilizados para la PCR-RT y PCR-RT cuantitativa

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Se prepararon reacciones de PCR (50 \mul) que contenían 10 \mul de una dilución de cien veces de los ADNc, excepto CcDH2, en el que se utilizaron 10 \mul de una dilución de 1.000 veces del conjunto de ADNc. 1 \muM de cada cebador, 5 \mul de 10X de tampón ThermoPol (New England Biolabs, Beverly, MA), 1 \mul de DMSO, 200 \muM de dNTPs y 2 unidades de polimerasa Taq (New England Biolabs, Beverly, MA). Las condiciones de ciclado eran: 2 minutos a 94ºC, 35 ciclos (excepto para CdDH1, con la que se utilizaron 40ciclos) de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1,5 minutos. La etapa final de extensión duró 7 minutos a 72ºC. Los productos de RT-PCR se resolvieron en geles de agarosa al 2% (p/v) y se tiñeron con bromuro de etidio. El gen CcRL39, que codifica la proteína L39 constitutivamente expresada en el café (una proteína de subunidad grande ribosómica 60S) se utilizó como control semicuantitativo para verificar que cada muestra de ARN se transcribía en ADNc a eficiencias relativamente similares. La amplificación del gen RPL39 se utilizó como control positivo para la transcripción inversa con los cebadores mostrados en la Tabla 1.

Se llevó a cabo una PCR-TaqMan cuantitativa de CcDH2 y de CcRPL139 siguiendo el protocolo del fabricante (Applied Biosystems, Perkin-Elmer) utilizando el ADNc de Coffea arabica y de Coffea canephora y las sondas TaqMan mostradas en la Tabla 1. Reacciones de 25 \mul que contenían 12,5 \mul de TaqMan® Universal Master Mix 2X, 20 nM de sonda TaqMan®-MGB, 80 nM de cebadores específicos TaqMan® y 5 \mul de los ADNc diluidos 1.000 veces. Las condiciones de ciclado eran: 50ºC durante 2 minutos, 95ºC durante 10 minutos, después 40 ciclos a 94ºC durante 15 segundos, y 60ºC durante 1 minuto. Cada reacción se repitió 3 veces. La expresión del gen DH2 en cada muestra de ADNc se normalizó respecto a la expresión del gen RPL39 en la misma muestra.

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Ejemplo 3

Protocolo para el aislamiento de la región promotora de DH2 (Ejemplo comparativo)

Se aisló la secuencia promotora de CcDH2 utilizando el kit Genome Walker siguiendo las especificaciones del fabricante (BD Sciences-Clontech). Se aisló ADN genómico de Coffea canephora var. BP409 tal como se ha descrito (Crouzillat et al., 1996). El cebador directo Genome Walker específico de CcDH2 utilizado fue: DH2a cebador1 - 5' TGTGCTCCTGATGCTCTCTGTCCTTGTGC 3' (SEC ID nº 39). Se aisló un fragmento de aproximadamente 2,1 kb utilizando ADN genómico de Coffea canephora var. BP409 digerido con HindIII ligado a la secuencia adaptadora Genome Walker. Se llevó a cabo una amplificación por PCR en una reacción de 50 \mul utilizando el kit de PCR Clontech Advantage 2 siguiendo el protocolo del fabricante, utilizando concentraciones finales de 0,5 \muM de DH2a cebador1 y el cebador Genome Walker AP1. Se llevó a cabo una reacción de PCR con las condiciones siguientes: 94ºC durante 2 segundos y 72ºC durante 3 minutos (7 ciclos), 94ºC durante 2 segundos y 67ºC durante 3 minutos (32 ciclos), seguido de 4 minutos a 67ºC. El fragmento de PCR más importante obtenido seguidamente se clonó en el plásmido pCR4-TOPO (Invitrogen).

Se purificó un plásmido pJMc1 que contenía la inserción apropiada y esta inserción se secuenció por completo. Para verificar que las inserciones en pJMc1 y (pccccs30w8a4) procedían del miso gen, la secuencia solapante correspondiente de estos dos clones se amplificó nuevamente a partir del ADN genómico utilizando los cebadores DH2a geneup 5' ATAGTGACCTTAATAGCGATCTTGTTGC 3' (SEC ID nº 40) y DH2A genelow 5' CCAAATCAAAT
CAAACCAAGCAAATC 3' (SEC ID nº 41). Se llevó a cabo la reacción de PCR con ADN genómico de Coffea canephora var. BP409 y utilizando Taq (New England Biolabs) y 1 \muM de los cebadores específicos (DH2a geneup y DH2a genelow). Se llevó a cabo la reacción de PCR con las condiciones siguientes: 94ºC, 1 minuto, después 35 ciclos de 94ºC, 1 minuto, 58ºC, 1,5 minutos y 72ºC durante 3 minutos, seguido de 7 minutos a 72ºC. El fragmento de PCR principal producido seguidamente se clonó en pCR4-TOPO. Se purificó el plásmido pVC1 (figura 7) que contenía la inserción apropiada y su inserción se secuenció por completo. Se habían producido 5 cambios de bases entre los fragmentos genómico de pJMc1 y pVC1. Un cambio se localizaba en la región promotora, dos cambios se localizaban en el intrón, y dos cambios se localizaban en la secuencia codificante de proteína. De estos cambios en la secuencia codificante de proteína, un cambio era neutro y el otro resultó en un aminoácido diferente.

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Ejemplo 4

Protocolo de transferencia southern

Se preparó ADN genómico tal como se ha descrito anteriormente (Crouzillat et al., 1996). Se digirieron durante la noche cinco microgramos de ADN genómico de C. canephora BP409. El ADN se digirió durante la noche con los enzimas apropiados (10 U/\mug) siguiendo las recomendaciones del proveedor, y los productos se separaron en geles de agarosa al 0,8%. Se levaron a cabo transferencias southern e hibridaciones tal como se ha descrito anteriormente (Crouzillat et al., 1996). La sonda se generó en primer lugar mediante amplificación por PCR de la inserción del clon de CcDH2 cccs30w8a4 con los cebadores T3+T7. Este producto de PCR seguidamente se marcó con [^{32}P]dCTP utilizando el kit "rediprime^{TM} II random prime labeling system" (Amersham).

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Ejemplo 5

Identificación y caracterización del ADNc de deshidrina del café

Se generaron más de 47.000 secuencias EST a partir de varias bibliotecas de café preparadas con ARN aislado a partir de hojas jóvenes y de tejidos del grano y del pericarpio de bayas recolectadas en diferentes etapas del desarrollo. Las ESTs solapantes seguidamente se "agruparon" en "unigenes" (es decir, contigs) y las secuencias de unigén se anotaron mediante la realización de una búsqueda en BLAST de cada secuencia individual frente a la base de datos de proteínas no redundantes del NCBI. Los unigenes se cribaron para las secuencias de deshidrina utilizando diversos enfoques, incluyendo una búsqueda de las anotaciones de unigén con la palabra clave "deshidrina" y mediante la utilización de diversas secuencias de proteína deshidrina de Arabidopsis y del tomate en una búsqueda de tBlastn del conjunto de unigenes del café. Los diversos protocolos de búsqueda rindió varios unigenes de deshidrina candidatos, y el clon de ADNc potencialmente más largo para cada uno de estos unigenes se aisló a partir de la biblioteca y se secuenció por completo (Tabla 2).

4

El análisis de la secuencia de ADN de clones seleccionados de ADNc de longitud completa reveló cuatro secuencias únicas que representan tres genes de deshidrina diferentes. Los genes correspondientes se denominaron CcDH1, CcDH2 y CcDH3. Se identificaron dos secuencias aparentemente alélicas del gen CcDH1 mediante la secuenciación de dos de los ADNc más largos en el unigén nº 121870. Los clones de ADNc CcDH1a y CcDH1b presentaban una longitud de 836 y 896 pb, respectivamente. Las dos secuencias de ORF mostraban 5 cambios de una sola base, y CcDH1b presentaba una inserción de 9 bases. Estas diferencias se tradujeron en seis diferencias de aminoácidos. CcDH1a y CcDH1b codifican proteínas de 172 aminoácidos y 175 aminoácidos que presentan pesos moleculares predichos de aproximadamente 17,8 kDa y 18,1 kDa, respectivamente. Se encontraron que dos unigenes diferentes, nº 123406 y nº 123405, codificaban la ORF para CcDH2. El unigén nº 123405 (CcDH2b) está compuesta de 2 ESTs y difiere de la secuencia del unigén nº 123406 (CcDH2a) por la presencia de una secuencia de intrón. Al examinar en mayor detalle los límites intrón/exón del ADNc para DH2b (cccs46w30p1), se observó que la unión 3' presentaba la secuencia ttatg/TCG, mientras que otras secuencias genómicas obtenidas mediante paseo genómico (ver posteriormente) presentaban la secuencia ttatag/T(A)CGG. Globalmente, las secuencias de intrón del ADNc ccc46w30p1 y las secuencias de intrón en el AND genómico eran prácticamente idénticas. Debido a que ninguno de los cambios de una sola base aparecía en las tres secuencias de intrón genómico disponibles, aparentemente una alteración de la secuencia del sitio de procesamiento 3' de CcDH2b podría ser la causa del procesamiento aberrante de este ADNc. El ADNc de 756 pb pcccs30w8a4 (CdDH2a) codifica una proteína de 162 aminoácidos de longitud con el peso molecular predicho de 17,4 kDa. Se encontró un unigén para CcDH3 (nº 123385). La secuencia proteica codificada por CcDH3 demuestra que este ADNc de 833 pb codifica una proteína de 227 aminoácidos con el peso molecular aproximado predicho de 25,1 kDa.

Las secuencias de proteína de las deshidrinas del café se alinearon con las secuencias de proteína más homólogas encontradas en la base de datos de proteínas no redundantes y también se analizaron para la presencia de los motivos de aminoácidos específicos para deshidrina Y, S y K. Las figuras 1 y 2 muestran que las tres deshidrinas se clasifican en dos grupos, presentando CcCDH1a, CcDH1b y CcDH2a la estructura Y3SK2 y presentando CcDH3 la estructura SK3. De aquellas secuencias de proteínas con la estructura Y3SK2, CcDH1a y CcDH1b mostraban la conservación absoluta en cada uno de los tres motivos, así como en las dos regiones conservadas que preceden a cada uno de los dos motivos K. Esta observación, y el hecho de que las pequeñas diferencias de secuencia existentes se encuentran en las regiones menos conservadas de las secuencias alineadas, son consistentes con la idea de que CcDH1a y CcDH1b son alélicos. En contraste, CcDH2a es claramente diferente de CcDH1. Aunque CcDH2a presenta la estructura Y3SK2, también muestra diferencias puntuales en la totalidad excepto uno de los motivos Y, S y K, así como diferencias más significativas fuera de dichos motivos específicos de deshidrina. CcDH1 y CcDH2 codifican proteínas con pI calculado prácticamente neutro, y sus gráficos de hidrofilicidad indican que estas proteínas son muy hidrofílicas en toda la molécula. El pI calculado de la proteína codificada por CcDH3 es ligeramente ácido (5,47) y esta proteína también es muy hidrofílica, tal como muestra el gráfico de hidrofilicidad de Kyte-Doolittle en la
figura 8.

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Ejemplo 6

Caracterización de un ADNc codificante de una proteína LEA del café (Ejemplo comparativo)

Se construyó una biblioteca de ADNc a partir de ARN preparado de granos de café 30 semanas después de la fertilización. A partir de esta biblioteca, se aisló y se secuenció un clon de ADNc de longitud completa (Dav1-59) codificante de una proteína LEA. Este clon de ADNc se renombró CcLEA1. Además, se realizó una búsqueda en la base de datos de EST para "unigenes" anotados como proteínas LEA. Esta búsqueda produjo 9 secuencias de unigén, una de las cuales (unigén nº 119994) correspondía a la secuencia previamente aislada de CcLEA1 (Tabla 3). El análisis de EST indicó que CcLEA1 es fuerte y se expresa exclusivamente durante sólo un periodo del desarrollo del grano (30 semanas después de la floración).

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TABLA 3 Secuencias de unigén de Coffea canephora anotadas como proteínas LEA

5

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La proteína codificada por CcLEA1 presenta 358 aminoácidos y un peso molecular predicho de 39,5 kDa. El pI calculado para CcLEA1 es ligeramente básico (8,17) y el gráfico de hidrofilicidad muestra que, aunque esta proteína no presenta regiones significativas de hidrofobicidad, es menos hidrofílica que las tres deshidrinas del café. Los primeros 30 residuos N-terminales de CcLEA1 forman una de dos pequeñas regiones hidrofóbicas en esta proteína. La figura 3 muestra la alienación de CcLEA1 con las 3 secuencias más homólogas encontradas en la base de datos de proteínas no redundantes GenBank. Los valores globales de identidad de estas secuencias alineadas únicamente se encontraban comprendidos entre 34,7% para la secuencia de Arabidopsis y 47,9% para la secuencia de Picea (abeto blanco). Sin embargo, existen regiones cortas altamente conservadas en estas proteínas. La totalidad de las secuencias de proteína relacionadas presentaba perfiles de hidrofilicidad relativamente similares al de CcLEA1, y generalmente, la zona hidrofóbica más significativa de las proteínas podía encontrarse en los 1 a 25 aminoácidos N-terminales. También se encontró que CcLEA1 contenía un segmento rico en prolinas en la región N-terminal que se encontraba ausencia de las otras proteínas en la figura 3.

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Ejemplo 7

Expresión mediante RT-PCR de los genes CcDH1, CcDH2, CcDH3 y CcLEA-1 en diferentes tejidos de la planta del café y durante el desarrollo del grano del café

Debido a que las bibliotecas de EST no se habían normalizado, y se muestrearon intensivamente, el número de ESTs encontrado en cada unigén proporciona una estimación aproximada del nivel de expresión de ese gen en cada tejido muestreado. La Tabla 2 (anteriormente) muestra que CcDH1 y CcDH2 se expresan fuertemente en el grano a 30 y 46 semana después de la fertilización, pero no se detectaron en la biblioteca de pericarpio, ni se detectaron en bayas completas (grano en desarrollo+pericarpio) 22 semanas después de la fertilización. Tanto CcDH1 como CcDH2 se expresan en la hoja, aunque CcDH1 puede expresarse en hojas jóvenes a un nivel más alto que CcDH2. No se detectó la expresión de CcDH3 en el grano 46 semanas después de la fertilización, y en las hojas jóvenes, aunque también se observaron dos ESTs en las muestras de bayas completas de 22 semanas.

Para extender los datos de expresión, se llevó a cabo un análisis de RT-PCR para cada uno de los tres genes de deshidrina del café. Los resultados de esta análisis se muestran en la figura 4. CcDH1 se expresaba significativamente en granos de arabica en todas las etapas examinadas, y en las tres últimas etapas examinadas para robusta. La expresión de CcDH1 también pudo detectarse en otros tejidos sometidos a ensayo, aunque no se detectó señal para arabica en las muestras de pericarpio verde pequeño ni de pericarpio amarillo, o para robusta en las muestras de raíz o de hoja. Entre los tejidos que presentaban expresión de CcDH1, la muestra de flores de arabica aparentemente presentan el nivel más alto de transcritos.

Se detectó un nivel relativamente alto de transcritos de CcDH2 en todas las etapas de desarrollo del grano de arabica y en las últimas tres etapas del grano de robusta (figura 4). En contraste con CcDH1, no se detectaron transcritos de CcDH2 mediante RT-PCR en los demás tejidos estudiados. La ausencia de niveles significativos de transcritos de CcDH2 en tejidos diferentes de los del grano, así como la inducción más tardía de este gen en robusta, fue confirmada mediante RT-PCR TaqMan cuantitativa (figura 5). Se comparó la expresión de CcDH2 con el transcrito constitutivamente expresado del gen CcRPL39 (RPL39 codifica la proteína nº 39 de la subunidad ribosómica grande). La comparación demostró que la expresión de CcDH2 se incrementaba gradualmente en robusta, partiendo desde la etapa de verde grande hasta la etapa de rojo maduro. En contraste, los datos de RT-PCR cuantitativos para arabica mostraron que el nivel más alto de transcritos de CcDH2 se detectaba en la etapa de verde grande y que los niveles de transcritos caían algo a medida que progresaba la maduración.

El análisis de RT-PCR de la expresión del gen CcDH3 demostró que también se detectaban niveles significativos de estos transcritos en todas las muestras de grano arabica, así como en las tres últimas etapas del desarrollo del grano robusta (figura 4). Los niveles de transcrito de CcDH3 en algunos de los demás tejidos, tales como el pericarpio rojo, tallo y flores, eran prácticamente tan elevados como en el grano. El examen de los datos originales demostró que los transcritos de CcDH3 podían detectarse en todos los demás tejidos de arabica y robusta examinados. Sin embargo, se observó una diferencia significativa entre los niveles de transcrito para las tres primeras etapas de pericarpio de robusta y arabica.

También se evaluó la expresión de CcLEA1 mediante RT-PCR. Los datos obtenidos confirman que este gen presenta un patrón de expresión muy peculiar, detectándose transcritos únicamente en la etapa de verde pequeño de Arabica y de verde grande del grano Robusta (figura 4). No se detectó expresión en ninguno de los demás tejidos de arabica o robusta muestreados. Estos datos son consistentes con el patrón de distribución de los ESTs para este gen indicados en la Tabla 3, que indica que este gen se expresa en el grano robusta a 30 WAF pero no en ninguna otra biblioteca de EST de grano, baya, pericarpio u hoja.

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Ejemplo 8

Análisis de secuencias del promotor de CcDH2 (Ejemplo comparativo)

CcDH2 es un gen específico del grano de expresión moderada. Se llevó a cabo transferencia southern para determinar si el nivel de expresión se obtenía de un gen con un número de copia único/reducido o con un gen multicopia. Tal como se muestra en la figura 6, cada digestión produjo únicamente una banda, sugiriendo que CcDH2 probablemente se encentra codificado por un único gen en el genoma de C. canephora.

Se utilizó la técnica de paseo con cebadores para asilar un fragmento genómico que incorporase el promotor de CcDH2. Se llevó a cabo la amplificación por PCR del ADN utilizando un cebador Genome Walker específico de CcDH2 diseñado desde el centro del ADNc cccs30w8a4 (DH2a cebador 1) y el cebador de AP1 del kit Genome Walker. Se generó un fragmento genómico de 2,1 kb que se extendía 1,43 kb cadena arriba de la secuencia de ADNc cccs30w8a4 (C. canephora) y se clonó. El análisis de la secuencia de la secuencia compuesta obtenida de los plásmidos solapantes que contenía secuencias tanto genómicas como de ADNc demostró que el gen CcDH2 contenía un único intrón (231 pb) situado dentro de la región ORF (figura 7). El análisis adicional de la región promotora de este gen indica la presencia de una secuencia TATA putativa 30 pb cadena arriba del extremo 5' de la secuencia de ADNc.

También se identificaron varios elementos reguladores potenciales que previamente se había demostrado que estaban implicados en la regulación de la expresión génica durante el desarrollo de las semillas en la región 5' cadena arriba del gen CcDH2. Por ejemplo, se encontraron tres regiones con similitud al elemento sensible a ABA de Arabidopsis RYACGTGGYR (SEC ID nº 42). Se encontraron dos elementos que compartían similitud significativa con la repetición RY (CATGCA(T/a)(A/g)) de la región nuclear en la caja "legumina" que se encuentra implicada en la regulación de la expresión de las proteínas de almacenamiento de tipo legumina.

También se identificó la presencia de dos motivos de secuencia de acción en cis de elemento sensible a la deshidratación/repetición de C (DRE/CRT) (G/ACCGAC). Los motivos DRE/CRT se ha demostrado anteriormente que interactúan con factores de transcripción DREBs/CBF en el control de la respuesta de genes ligados frente a la deshidratación y otras fuentes de estrés en Arabidopsis y en el arroz (Dubouzet J.G., Plant J. 33:751-763, 2003). Además, se identificaron en la región promotora de CcDH2 varios motivos de caja-E (CANNTG), que son componentes bien definidos en promotores de proteínas de reserva, tales como la proteína 2S (Chatthai M., Plant Physiol. Biochem. 42:417-423, 2004).

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Ejemplo 9

Análisis funcional del promotor de CcDH2 de deshidrina del café en Arabidopsis thaliana (Ejemplo comparativo)

Se examinó la expresión en Arabidopsis thaliana de un gen informador codificante de beta-glucuronidasa (GUS) bajo el control del promotor de CcDH2.

Materiales y métodos

Se amplificó la secuencia promotora de la deshidrina DH2 procedente de pVC1 utilizando la polimerasa PfuI bajo las condiciones indicadas por el proveedor (Stratagene) y los cebadores:

TG-TG698	ttgaagcttGTGGACATGACGGAAGAGGT	(SEC ID nº 43) y
TG-TG743	gcagatctaccatggAGGACTCCTGTTATTAGAAAA	(SEC ID nº 44).

El fragmento de PCR obtenido de esta manera seguidamente se cortó con HindIII y BgIII y se clonó en los sitios HindIII/BgIII del vector de transformación vegetal pCAMBIA1301. Lo anterior sitúa el fragmento de aproximadamente 1,3 kb que contiene la secuencia promotora de deshidrina y la región 5' no traducida completa del ADNc de la deshidrina (aproximadamente 80 pb) a 2 pb o menos de la ATG de GUS (primer exón de GUS). La localización correcta del promotor se verificó mediante secuenciación. El nuevo vector que contiene el promotor de CcDH2 de la deshidrina se denominó pCAMBIA1301UCD2.4.

Transformación de la planta. A continuación, se transformó el vector de transformación pCAMBIA1301UCD2.4 en Agrobacterium tumefaciens cepa EHA105 utilizando procedimientos estándares. El gen de resistencia a la higromicina, controlado por un promotor 2 x 35S, fue el marcador seleccionable de la planta en pCAMBIA1301. Se llevó a cabo la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens de Arabidopsis (con el plásmido pCAMBIA1301UCD2.4) mediante el método de inmersión floral (Clough y Bent, 1998).

Se identificaron las plantas transformadas mediante siembra en placa de las semillas en agar al 0,8% que contenía nitrato sódico 1 mM y 50 \mug de higromicina por ml. Las plántulas transformadas se identificaron 7 días después de la siembra como plantas con una raíz primaria extendida. Se transfirieron las plántulas a agar al 0,8% que contenía 0,5X sales M&S. A continuación, las plantas se transfirieron a tierra al desarrollarse el segundo par de hojas, y se dejó que madurase y formase las semillas (T1). En algunos casos, se hicieron germinar las semillas T1 y después se dejaron crecer y formar semilla (T2).

Tinción GUS. Las plántulas y silicuas examinadas para la tinción GUS procedían de las semillas T o T2, y se encontraban en diferentes etapas del desarrollo. La solución de tinción GUS se preparó mediante la disolución de 5 mg de X-Gluc en 50 \mul de dimetilformamida, y después añadiendo lo anterior a 10 ml de NaPO_{4} 50 mM, pH 7,0. Con unas pinzas delgadas, se transfirieron las semillas desde las placas de germinación a un tubo de micrófuga de 1,5 ml que contenía 1,0 ml de tinción GUS. Los tubos se transfirieron a un desecador y se sometieron a un vacío durante 10 minutos y se incubaron a 37ºC (en la oscuridad) durante 24 ó 48 horas. Se retiró la tinción y se sustituyó por la solución desteñidora (EtOH al 70%). Se aceleró la eliminación sometiendo los tubos a 37ºC. Dependiendo del a cantidad de pigmento en el tejido, resultaron necesarios varios cambios de EtOH al 70%. Las semillas y otros tejidos teñidos se visualizaron bajo un microscopio de disección y se registraron digitalmente las imágenes. En el caso de las silicuas, éstas se extrajeron de las plantas y se abrieron con un escalpelo para permitir la penetración de la tinción. La tinción GUS utilizada en el procedimiento se modificó para incluir Triton X100 al 0,5%. Tras la tinción, las silicuas se destiñeron mediante incubación en EtOH:ácido acético (2:1) y después incubando en medio ligero de Hoyer (100 g de hidrato cloral en 60 ml de agua). Las silicuas con semillas más jóvenes se preincubaron en la solución de etanol:ácido acético durante 4 horas y en el caso de las semillas de más edad, durante 8 horas. Las silicuas se aclararon en medio ligero de Hoyer durante 24 horas a varios días.

Resultados

Se observó la expresión de GUS en Arabidopsis thaliana transformada con pCam1301UCD2-4. Se encontró que la expresión de GUS era abundante en los cotiledones y en el hipocótilo en las plántulas de 1 semana de edad. En las plántulas de dos semanas, la tinción GUS todavía era abundante en los primeros dos cotiledones, y de nivel más bajo en las primeras hojas verdaderas. No se detectó actividad GUS significativa en la raíz ni en el segundo par de hojas en desarrollo. No se detectó expresión en hojas maduras. También se detectó expresión de GUS en la pared de las silicuas y en las semillas en desarrollo. A las 48 horas, la tinción GUS de las semillas de una línea T1 resultó en que algunas semillas fuesen positivas para actividad de GUS y otras, negativas.

En resumen, los datos presentados en el presente ejemplo confirman que el promotor de CcDH2 de la deshidrina del café controla la expresión del gen ligado (en este caso GUS) fuertemente en semillas, silicuas y en los primeros cotiledones e hipocótilos de las semillas germinantes. Este resultado demuestra que la secuencia promotora de CcDH2 indicada en la presente memoria contiene la totalidad de los elementos funcionales necesarios para controlar la expresión de genes en tejidos inmaduros, tales como los primeros dos cotiledones derivados del embrión de las plántulas. Además, los datos indican que el promotor de CcDH2 se encuentra activado en otros tejidos destinados a experimentar desecación, tales como las silicuas. Finalmente, dada la distancia evolutiva relativamente grande entre Arabidopsis y Coffea, los datos presentados en la presente memoria que muestran que el promotor de CcDH2 del café funciona en Arabidopsis, implican que este promotor debería encontrarse activo en una diversidad relativamente amplia de plantas.

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Ejemplo 10

Expresión inducida por estrés osmótico de genes codificantes de las deshidrinas CcDH1 y CcDH2 del café

Es conocido que los genes de la deshidrina son inducidos por diferentes formas de estrés osmótico.

Por lo tanto, se llevó a cabo una evaluación para determinar si los genes de CcDH1 y CcDH2 del café resultaban inducidos por diferentes fuentes de estrés osmótico.

Materiales y métodos

Se llevaron a cabo experimentos de deshidratación utilizando árboles variedad Catimor de Coffea arabica pequeños propagados clonalmente cultivados en un invernadero. Los árboles eran de aproximadamente 3 años de edad y crecían en tierra. Varias semanas antes de los experimentos, se cultivaron los árboles juntos en el invernadero, a una temperatura de aproximadamente 25ºC, con una humedad relativa de aproximadamente 70%, y se regaron diariamente utilizando irrigación automática. Al inicio del experimento, tres árboles actuaron de controles y se regaron diariamente. Los otros tres árboles no fueron regados y de esta manera experimentaron una deshidratación progresiva. El muestreo de dos hojas jóvenes (5 a 8 cm de tamaño y obtenidas del crecimiento emergente en la parte superior de la planta) se llevó a cabo cada semana para cada árbol y las muestras se congelaron directamente en nitrógeno líquido.

Extracción de ARN y síntesis de ADNc. La extracción de muestras de tejido sometidas a los diversos tratamientos de estrés y los controles se realizó utilizando el minikit para plantas RNEASY® de Qiagen GmbH (Hilden, Alemania). Las muestras de tejido congeladas se molieron inicialmente en un mortero utilizando nitrógeno líquido con el fin de obtener unos polvos. El ARN en estos polvos congelados seguidamente se extrajo según el protocolo del minikit para plantas RNEASY®. Brevemente, se mezcló un máximo de 100 mg de polvos congelados con el tampón de lisis celular y beta-mercaptoetanol. Para los tejidos que mostraban necrosis significativa, también se añadió PMSF 2 \muM. Con el fin de eliminar los niveles reducidos de ADN genómico contaminante, se utilizó un tratamiento de ARNasa libre de ADNasa en el minikit para plantas RNEASY® (tal como describe el fabricante), es decir, un tratamiento de 15 minutos a temperatura ambiente en la columna. Al final, se eluyó el ARN de la columna en 50 \mul de agua libre de ARNasa. Se determinó la cantidad de ARN mediante medición espectrofotométrica a 260 nm y se estimó la calidad del ARN mediante el cálculo de la proporción de absorbancias 260 nm/280 nm. También se verificó la calidad de los ARNs mediante electroforesis en geles de agarosa al 1%. Se llevaron a cabo las reacciones de transcripción inversa de estas muestras de ARN de la manera siguiente: aproximadamente 1 \mug de ARN total y 12,4 \muM de oligo-dT [2,3 \mul de 70 \muM oligo-dT (Proligo)] con agua libre de ARNasa hasta un volumen final de 13 \mul. Esta mezcla se incubó a 65ºC durante 5 minutos. A continuación, se añadieron 7 \mul de una mezcla de tampón 5X (tampón TRANSCRIPTOR® de reacción RT), 20 U de inhibidor de ARNasa, 1 mM de los cuatro dNTPs (250 \mug cada uno) y se añadieron 10 U de transcriptasa inversa TRANSCRIPTOR® (Roche, Nutley, NJ). Esta mezcla se incubó a 55ºC durante 40 minutos. Finalmente, se añadieron 0,5 \mul de ARNasaH (Invitrogen, Carlsbad, CA) a los 20 \mul de mezcla y la reacción se incubó adicionalmente durante 30 minutos a 37ºC. Los ADNc generados se purificaron utilizando el kit de purificación de gel SNAP TM de Invitrogen (Carlsbad, CA) siguiendo el protocolo proporcionado por el proveedor.

Cebadores y diseño de la sonda MGB. Los cebadores y los conjuntos de sonda MGB se diseñaron utilizando el programa PRIMER EXPRESS TM (Applied Biosystems, Foster City, CA). La temperatura de hibridación de los cebadores era aproximadamente 60ºC, mientras que la de la sonda MGB era de aproximadamente 70ºC. El tamaño de los amplicones era aproximadamente 80 pb. Los cebadores se sintetizaron mediante PROLIGO y las sondas MGB se sintetizaron siguiendo las instrucciones del proveedor (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las secuencias de los cebadores y las sondas para CcDH2 y CcrpI39 se han presentado anteriormente, en la Tabla 1. Los cebadores para CcDH1 eran: 5' CACTGGCACTACTGGAGCCTATG 3' (SEC ID nº 45) y 5' GCTGGGTGGCGTATGCA 3'. La sonda MGB para CcDH1 era 5' CTGGAGCACATGGGA 3' (SEC ID nº 46).

RT-PCR cuantitativa en tiempo real. El ADNc utilizado para estos experimentos se preparó tal como se ha descrito anteriormente. SE llevó a cabo PCR-TaqMan tal como recomienda el fabricante (Applied Biosystems, Perkin-Elmer) y tal como se ha descrito anteriormente en la presente memoria. Brevemente, todas las reacciones presentaban un volumen de 25 \mul y contenía 5 \mul de ADNc, tampón 1x TaqMan (Applied Biosystems), MgCl_{2} 5 mM, 200 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dUTP y 0,625 unidades de ADN polimerasa AmpliTaq Gold. El tampón de reacción de Applied Biosystems contenía AmpErase® UNG (uracil-N-glucosilasa) y pigmento de referencia pasivo (ROX^{TM}) y componentes del tampón optimizados. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo utilizando 800 nM de los cebadores específicos de gen, directos e inversos, y con 200 nM de la sonda TaqMan y 5 \mul de dilución de 100 veces de ADNc, que corresponde a aproximadamente 0,01 \mug de ARN total. Las reacciones se incubaron durante 2 minutos a 50ºC, después durante 10 minutos a 95ºC, seguido de 40 ciclos de amplificación de 15 segundos a 95ºC/1 minuto a 60ºC. Se llevaron a cabo las reacciones y se analizaron utilizando un sistema de detección de secuencias GeneAmp 7500 (Applied Biosystems). Cada muestra se corrió 3 veces y se calculó el valor medio. La cuantificación se llevó a cabo utilizando el método de cuantificación relativa, con el ARNm expresado constitutivamente para la proteína ribosómica rpI39 como referencia interna para cada muestra. Con el fin de utilizar el método de cuantificación relativa, resultó necesario demostrar que la eficiencia de amplificación para las diferentes secuencias génicas de ensayo era aproximadamente equivalente a la eficiencia de amplificación de la secuencia de referencia (secuencia de ADNc de rpI39) utilizando los conjuntos de cebadores y sondas definidos específicamente. Para determinar esta equivalencia relativa, se diluyó ADN de plásmido que contenía las secuencias de ADNc apropiadas 1/1.000, 1/10.000, 1/100.000 y 1/1.000.000 veces, y utilizando las condiciones de Q-PCR indicadas anteriormente, se calculó la pendiente de la curva: Ct=f(Log(cantidad de ADN)) para cada conjunto de plásmido/cebador/sonda TaqMan. Los conjuntos de plásmido/cebador/sonda TaqMan que proporcionan curvas con pendientes próximas a 3,32, que representa una eficiencia de 100%, se consideraron aceptables. Los conjuntos de plásmido/cebador/sonda TaqMan proporcionaron valores aceptables para Ct=f(log(cantidad de ADN)).

La ausencia de ningún nivel significativo de ADN genómico residual en las preparaciones de ADNc se verificó midiendo el nivel de la señal de amplificación cuantitativa de la PCR para un conjunto genómico específico de cebador/sonda para el gen GOS frente a la señal para una sonda de ADNc del gen GOS.

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Resultados

La figura 9 muestra la inducción de la expresión génica de CcDH1 en las hojas de árboles pequeños cultivados en invernadero al detener el riego (condiciones de escasez de agua). Tras dos semanas, se indujo significativamente la expresión de DH1 en una de las plantas sometidas a estrés hídrico (planta nº 4). Tras tres semanas, la expresión de CcDH1 había sido inducida en las tres plantas con estrés hídrico (plantas nº 4 a 6). La inducción era muy significativa, alcanzando un RQ de más de 50 para la planta nº 4. Considerando que el gen de control rpI39 presenta un nivel relativamente elevado de expresión, una RQ de 50 representa un nivel muy elevado de inducción de la expresión génica, y sugiere fuertemente que CcDH1 desempeña un papel importante en la respuesta al estrés hídrico de las hojas del café. La figura 10 muestra la inducción de la expresión génica de CcDH2 en el mismo conjunto de muestras. La inducción de CcDH2 muestra varias diferencias con la respuesta de CcDH1. La primera diferencia es que CcDH2 resulta inducida claramente después que CcDH1, con la planta aparentemente más estresada (planta nº 4) mostrando la inducción en la semana 3, una semana después que para CcDH1. En la semana 4, CcDH2 había sido inducido en las tres plantas con estrés hídrico. La segunda diferencia entre la inducción de CcDH2 frente a la de CcDH1 es que el nivel de inducción de CcDH2 es significativamente menor que el observado para CcDH1. Globalmente, estos resultados indican que CcDH1 y CcDH2 no son inducidos de exactamente el mismo modo, aunque las señales probablemente son solapantes, es decir, la señal o señales necesarias para la inducción de CcDH1 resultan necesarias para la inducción de CcDH2, pero CcDH2 podría necesitar una o más señales adicionales que únicamente aparecen a medida que se incrementa el estrés hídrico. Apoyando el argumento de que CcDH2 es inducido por condiciones que se aproximan a la pérdida extrema de agua, la expresión en las plantas nº 5 y nº 6 continuó incrementándose a medida que se incrementaba el estrés hídrico al transcurrir tiempo sin agua. Alternativamente, podría ser que CcDH2 se expresa más significativamente que lo indicado en la figura 10, pero esta inducción se localiza en tejidos específicos. Resulta importante indicar que las tres plantas de control que se regaron regularmente no mostraron inducción de CcDH1 ni de CcDH2 (figuras 9 y 10; plantas nº 1 a 3).

Los resultados presentados anteriormente indican que los promotores asociados a CcDH1 y CcDH2 pueden resultar útiles para inducir y controlar la expresión génica en tejidos osmóticamente estresados. Por ejemplo, estos promotores pueden utilizarse para controlar la expresión de genes que son capaces de proporcionar cierta protección frente al estrés osmótico en el periodo exacto en el que se produce el estrés, pero no en la mayoría de tejidos bajo condiciones normales. También resulta evidente de los resultados anteriores que, en el caso de que el objetivo sea inducir un gen a un estrés hídrico reducido, óptimamente se utilizaría el promotor de CcDH1, mientras que para la inducción génica a un nivel elevado de estrés hídrico, resultaría más idónea la utilización de CcDH2 en el caso de que el objetivo sea inducir un gen recombinante únicamente bajo condiciones de estrés hídrico relativamente elevado.

Con el fin de examinar adicionalmente el efecto de las diferentes condiciones de estrés osmótico, los presentes inventores examinaron el efecto de las bajas temperaturas y los niveles elevados de NaCl sobre la expresión de CcDH1 y CcDH2. También se sometió a ensayo el efecto de una hormona asociada a la señalización de estrés osmótico (ácido abscísico - ABA). Para estos experimentos, se utilizaron microesquejes de café cultivados en medio sólido in vitro (medio sólido B0.3 en placas de Petri). Para el experimento con frío y ABA, se generaron microesquejes para la variedad robusta ThB4 en placas B0.3 (fotoperiodo de 16 horas). En el caso de que dichos microesquejes fueran suficientemente grandes, se transfirieron a nuevos medios/placas y se incubaron 7 días más a 24ºC (fotoperiodo de 16 horas). En T=0, se transfirió un conjunto de placas a 5ºC durante 7 días (fotoperiodo de 16 horas). Otro conjunto de estos microesquejes se introdujo en medio con ABA (medio B0.3 + ABA 100 \muM) durante 7 días a 24ºC (fotoperiodo de 16 horas). Las muestras obtenidas en T=0 y en T=7 días (5ºC y ABA) se congelaron a -80ºC y después se extrajo el ARN para el análisis de QRT-PCR tal como se ha descrito anteriormente. Los resultados de expresión obtenidos para la muestra de T=0 del material de partida indican que CcDH1 presentaba un RQ=1,17. Otros experimentos han demostrado que los niveles basales de CcDH1 pueden variar entre RQ=0,05 y aproximadamente RQ=1 en microesquejes. Este rango relativamente amplio sugiere que el nivel más alto representa la detección de un ligero estrés osmótico en el material de partida de estos experimentos (posiblemente relacionado con el nivel de fijación del material al medio sólido y/o el sellado de las placas, afectando a la humedad relativa, y la edad exacta del material de partida). Sin embargo, las muestras mantenidas a 5ºC durante 7 días no mostraron inducción de CcDH1 y, de hecho, los niveles de CcDH1 cayeron hasta un RQ=0,16, un nivel más próximo al nivel de expresión observado con frecuencia en microesquejes no estresados).

En contraste con los datos presentados anteriormente para CcDH1, no se detectó expresión de CcDH2 en T=0. Sin embargo, tras 7 días a 5ºC, se detectó un RQ=0,022 para CcDH2. Esta última observación sugiere que CcDH2 resulta inducido muy ligeramente por condiciones de frío. Se indica que 5ºC es una temperatura muy baja para el café, y de esta manera resulta posible que, en el caso de que la temperatura de estrés por frío fuera ligeramente más alta (8 a 15ºC), la inducción de CcDH2 podría ser más significativa. Finalmente, los microesquejes tratados con ABA 100 \muM durante 7 días mostraron un incremento significativo de la expresión de CcDH1 (RQ=6,99). Este último resultado demuestra que ABA se encuentra implicada en la señalización de la inducción de CcDH1. En contraste, ABA no produjo ninguna expresión detectable de CcDH2, indicando que esta hormona por sí solo no resulta suficiente para inducir CcDH2 en ningún grado detectable.

Para someter a ensayo el efecto de las condiciones salinas, los presentes inventores añadieron NaCl 250 mM al medio sólido B0.3. En T=0, se introdujo un conjunto de microesquejes de Robusta FRT 35 en medio B0.3 o medio B0.3 con NaCl 250 mM y se sometieron a 24ºC (fotoperiodo de 16 horas). En T=0 y en los días 4 y 7, se obtuvieron las muestras y se congelaron a -80ºC para el análisis posterior de QRT-PCR tal como se ha descrito anteriormente. Los resultados obtenidos demuestran que, en los controles, los niveles de CcDH1 eran bastante bajos al inicio y permanecieron en niveles bajos durante todo el experimento (control - T=0, RQ=0,2; T=4, RQ=0,07; T=7, RQ=0,38). En el tratamiento experimental, el nivel de CcDH1 se incrementó significativamente los días 4 y 7 de tratamiento (NaCl 250 mM - T=4 días, RQ=3,31; T=7 días, RQ=4,46). Este experimento demuestra que la elevación de la concentración de sal puede inducir la expresión de DH1 hasta niveles significativos, aunque no tan altos como los observados en las hojas de plantas bajo estrés hídrico. No se observó inducción significativa para la expresión de CcDH2 en presencia de NaCl 250 mM en las muestras de T=4 ni de T=7 días.

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Secuencias de los ácidos nucleicos y polipéptidos reivindicados

ADNc de CcDH1a (ver SEC ID nº 1) y proteína codificada (ver SEC ID nº 7)

7

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ADNc de CcDH1b (ver SEC ID nº 2) y proteína codificada (ver SEC ID nº 8)

9

CcDH2a (ver SEC ID nº 3) y proteína codificada (ver SEC ID nº 9) (Ejemplo comparativo)

10

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ADNc de CcDH2b (ver SEC ID nº 4) y proteína codificada (ver SEC ID nº 10) (Ejemplo comparativo)

11

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ADNC de CcDH3 (ver SEC ID nº 5) y proteína codificada (ver SEC ID nº 11) (Ejemplo comparativo)

120

13

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ADNc de CcLEA1 (ver SEC ID nº 6) y proteína codificada (ver SEC ID nº 12) (Ejemplo comparativo)

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15

16

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Secuencia completa de CcDH2a, incluyendo el promotor (bases 1 a 1.324; ver SEC ID nº 13), secuencia codificante (ver SEC ID nº 3) y proteína codificada (ver SEC ID nº 9). Intrón I (1.642)..(1.866) (Ejemplo comparativo)

17

18

La presente invención no se encuentra limitada a las realizaciones descritas y ejemplificadas anteriormente, sino que es capaz de variación y modificación dentro del alcance según las reivindicaciones adjuntas.

<110> Nestec S.A.

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Cornell Research Foundation

\hskip1cm

BEN AMOR, Mohamed

\hskip1cm

MCCARTHY, James Gérard

\hskip1cm

PETIARD, Vincent

\hskip1cm

TANKSLEY, Steven D.

\hskip1cm

LIN, Chenwei

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<120> Genes de deshidrina y promotores procedentes del café

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<130> NO 7972/WO

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<150> U.S. 60/696890

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<151> 2005-07-06

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<160> 46

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<170> PatentIn versión 3.3

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<210> 1

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<211> 880

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<212> ADN

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<213> Coffea canephora

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<400> 1

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20

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<210> 2

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<211> 901

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<212> ADN

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<213> Coffea canephora

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<400> 2

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21

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<210> 3

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<211> 761

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<212> ADN

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<213> Coffea canephora

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<400> 3

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22

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<210> 4

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<211> 959

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<212> ADN

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<213> Coffea canephora

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<400> 4

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23

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<210> 5

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<211> 835

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<212> ADN

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<213> Coffea canephora

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<400> 5

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24

25

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<210> 6

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<211> 1232

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<212> ADN

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<213> Coffea canephora

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<400> 6

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26

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<210> 7

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<211> 172

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<212> PRT

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<213> Coffea canephora

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<400> 7

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27

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<210> 8

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<211> 175

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<212> PRT

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<213> Coffea canephora

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 162

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Coffea canephora

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 162

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Coffea canephora

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 227

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Coffea canephora

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 357

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Coffea canephora

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

33

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2288

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Coffea canephora

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Promotor

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1324)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Promotor de CcDH2a

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1414)..(1641)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Exón I de CcDH2a

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1642)..(1866)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1867)..(2121)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Exón II de CcDH2a

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

35

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Lycopersicon esculentum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 157

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Solanum commersonii

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 186

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 208

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nicotiana tabacum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 209

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Solanum tuberosum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 265

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

42

420

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 337

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

43

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 320

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Picea glauca

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

45

46

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 349

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

47

48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador directo RPL39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggcgaagaa gcagaggcag a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador inverso RPL39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgaggggga gggtaaaaag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador directo DH1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaagaagggg atgaaggag

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador inverso DH1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tacggacaaa cacactacag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador directo DH2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctccaacaa ccaccactg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador inverso DH2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcaagcgcac aacaaggtc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador directo DH3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggtggtggt cagaagaaga c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador inverso DH3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacacactgg aaagctgcta

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador directo LEA1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaataacag ctcaagaatc a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador inverso LEA1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttcccttcca tcccactct

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> rpl39-F1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaacaggccc atcccttatt g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> rpl39-R1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggcgcttgg cattgta

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> rpl39-MPG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgcgcactg acaaca

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> DH2a-F1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaggcacaa ggacagaga

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> DH2a-R1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctgtgcgcg tgctgat

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> DH2a-MGB

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caggagcaca tcgat

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador 1 DH2a

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtgctcctg atgctctctg tccttgtgc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> genup DH2a

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atagtgacct taatagcgat cttgttgc

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> genelow DH2a

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaaatcaaa tcaaaccaag caaatc

\hfill

26

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

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<211> 10

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ryacgtggyr

\hfill

10

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

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<212> ADN

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> TG-TG698

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgaagcttg tggacatgac ggaagaggt

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TG-TG743

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcagatctac catggacgac tcctgttatt agaaaa

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador 1 CcDH1

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cactggcact actggagcct atg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador 2 CcDH1

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctggagcaca tggga

\hfill

15

Claims (13)

1. Molécula de ácido nucleico aislada de la planta del café (Coffea spp.), que presenta una secuencia codificante que codifica una deshidrina, en la que la deshidrina presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre las secuencias SEC ID nº 7 ó 8.

2. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que la secuencia codificante es 90% o más idéntica a cualquiera de las secuencias codificantes proporcionadas en las secuencias SEC ID nº 1 y 2.

3. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2, en la que la secuencia codificante comprende cualquiera de las secuencias SEC ID nº 1 y 2.

4. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, que es un gen que presenta un marco de lectura abierto que comprende la secuencia codificante.

5. Molécula de ARNm producida mediante transcripción del gen según la reivindicación 4.

6. Molécula de ADNc producida mediante transcripción inversa de la molécula de ARNm según la reivindicación 5.

7. Vector que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, preferentemente un vector de expresión seleccionado de entre el grupo de vectores que consiste de plásmido, fagémido, cósmido, baculovirus, bácmido, y vectores bacteriano, levadura y vírico.

8. Vector según la reivindicación 7, en el que la secuencia codificante de la molécula de ácido nucleico se encuentra operablemente ligada a un promotor seleccionado de entre: un promotor constitutivo, un promotor inducible, un promotor específico de tejido y un promotor específico de las semillas.

9. Vector según la reivindicación 8, en el que el promotor específico de las semillas es un promotor específico de las semillas del café, preferentemente un promotor del gen de la deshidrina, todavía más preferentemente en el que el promotor del gen de la deshidrina comprende la secuencia SEC ID nº 13.

10. Célula huésped transformada con el vector según la reivindicación 7, preferentemente seleccionada de entre el grupo que consiste de células vegetales, células bacterianas, células fúngicas, células de insecto y células de mamífero.

11. Célula huésped según la reivindicación 10, que es una célula vegetal seleccionada de entre el grupo de plantas que consiste de las plantas del café, tabaco, Arabidopsis, maíz, trigo, arroz, soja, cebada, centeno, avena, sorgo, alfalfa, trébol, canola, azafrán, girasol, cacahuete, cacao, tomate, tomatillo, patata, pimiento, berenjena, remolacha azucarera, pepino, lechuga, guisante, aster, begonia, crisantemo, delfinio, zinia y hierbas de césped.

12. Planta transgénica fértil producida mediante regeneración de la célula huésped según la reivindicación 11.

13. Planta transgénica fértil según la reivindicación 12, que es Coffea spp.