ES2301239T3 - Procedimientos y composiciones para la expresion de transgenes en plantas. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de prevención de la silenciación del gen dependiente de la homología del promotor en una planta monocotiledónea tal como arroz, trigo, cebada, centeno, avena, sorgo y maíz pero diferente de Coix, el procedimiento comprende las etapas de: (a) proporcionar un promotor de la coixina gamma que comprende 80 a 894 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 8; (b) preparar una construcción que comprende dicho promotor de la coixina gamma unido de manera operativa a un gen seleccionado, en el que dicho gen que se puede seleccionar es preferiblemente un gen de resistencia a insectos, un gen de resistencia a enfermedad fúngica, un gen de resistencia a enfermedad viral, un gen de resistencia a enfermedad bacteriana, un gen de resistencia a herbicidas, un gen que afecta a la composición o calidad del grano, un gen de utilización de nutrientes, un gen de reducción de micotoxina, un gen de esterilidad masculina, un gen marcador que se puede seleccionar, un gen marcador que se puede rastrear, un gen marcador negativo que se puede seleccionar, un gen que afecta a las características agronómicas de las plantas, o un gen de resistencia al ambiente o estrés . (c) transformar una célula receptora a partir de una planta monocotiledónea distinta de de Coix con dicha construcción, en la que dicha etapa de transformación preferiblemente comprende bombardeo de microproyectiles, electroporación, transformación mediada por filtro de carburo de silicio, o transformación mediada por Agrobacterium, y (d) regenerar una planta que expresa dicho gen a partir de dicha célula receptora, mediante el cual dicha planta no exhibe la silenciación del gen.
Description
Procedimientos y composiciones para la expresión
de transgenes en plantas.
La presente invención se refiere en general a la
expresión de transgenes en plantas. Más específicamente, se refiere
a un procedimiento para prevenir la silenciación de genes
dependientes de la homología del promotor en plantas.
Los avances recientes en biología molecular han
potenciado de manera notable la capacidad de los científicos de
manipular el plasma germinal de animales y plantas. Los genes que
controlan fenotipos específicos, por ejemplo, polipéptidos
particulares que prestan resistencia a insectos antibióticos e
insectos, se han localizado dentro de cierto plasma germinal y
aislado a partir de él. Incluso más importante ha sido la capacidad
de coger los genes que se han aislado a partir de un organismo e
introducirlos en otro organismo. Esta transformación se puede
llevar a cabo incluso cuando el organismo receptor es de diferente
filum, género o especie de la que dona el gen (transformación
heteróloga).
heteróloga).
Se han realizado intentos para modificar
genéticamente los caracteres en los genomas de plantas mediante la
introducción de genes exógenos usando numerosas técnicas de
ingeniería genética. La incorporación de ADN nuevo por las células
vegetales receptoras se han llevado a cabo mediante la inclusión de
infección por Agrobacterium (Nester et al., 1984),
incorporación de ADN mediada por polietilen glicol (PEG) (Lorz et
al., 1985) electroporación de protoplastos (Fromm et
al., 1986) y bombardeo de microproyectiles (Klein et al.,
1987).
Aunque alguna de las técnicas anteriormente
mencionadas han hecho transformaciones de plantas casi
rutinariamente, la expresión de ADN exógeno ha sido más
dificultosa. Uno de los problemas más graves que se ha encontrado
es un fenómeno conocido como "co-supresión".
Este término se inventó para describir la inhibición de la
expresión de genes de un gen endógeno después de la introducción de
un transgen homólogo (Jorgensen, 1990), y se describió primero para
el gen de la chalcona sintasa (CHS) en Petunia (Napoli et
al., 1990; Van der Krol et al., 1990). Sin embargo, la
co-supresión no es única para la CHS, y parece que
es un fenómeno general que afecta a las plantas transgénicas. El
grado de co-supresión varía para los transformantes
individuales, pero en algunas plantas, pueden tener lugar hasta tal
grado que un fenotipo se produce para los loci implicados.
Numerosos sistemas de plantas transgénicas han
mostrado el fenómeno "silenciación de genes" dependiente de
homología que puede implicar o bien múltiples copias de al menos
transgenes parcialmente homólogos o un transgen y una secuencia
endógena homóloga (Jorgensen, 1995; Matzke y Matzke, 1995; Meyer,
1995). La característica del mecanismo más fundamental que
distingue diversos casos de silenciación es si la inactivación
observada se produce a nivel de la transcripción o después de la
transcripción, y esto se determina a su vez por la región de
homología entre la secuencia de interacción. La silenciación de la
transcripción se produce en gran medida como resultado de homología
del promotor (Neuhuber et al., 1994).
La silenciación del gen dependiente de la
homología del promotor interfiere con la transcripción, y algunas
veces provoca paramutaciones, que conduce a los cambios que se
pueden heredar en la expresión génica y/o modificaciones de ADN que
persisten después de la segregación del transgen (Lindbo et
al., 1993; Jorgensen, 1995; Matzke y Matzke, 1995; Park et
al., 1996). La causa de tales cambios en la expresión génica se
entienden de manera escasa pero se sabe que esta silenciación está
influenciada por la longitud de la homología y por la posición de
las secuencias que interactúan.
En el caso del promotor de la nopalina sintasa,
se encontró que una región de 300 pares de bases de homología era
suficiente para mediar la co-supresión en tabaco
Matzke et al., 1993). Se ha encontrado que una secuencia
endógena conocida como H2, que tiene homología con el
promotor de la nopalina sintasa, es un potente silenciador de genes
dirigidos por el promotor de la nopalina sintasa (Matzke el al.,
1995; Matzke el al., 1994. esto se cree que implica el apareamiento
de las copias del promotor de la nopalina sintasa en los loci de
silenciación y dianas, seguido la imposición de la mutilación sobre
la copia diana hasta un grado similar al adquirido de manera
autónoma por el silenciador (Matzke el al., 1994). El ejemplo más
eficaz de la co-supresión es una línea de tabaco
que lleva una inserción de transgen con dos genes dirigidos por el
promotor 19S y 35S del CaMV, respectivamente. Ambos genes, unidos a
los dos parámetros están suprimidos, y este locus
trans-inactiva las construcciones introducidas recientemente
que proporciona al menos 90 pares de bases de la homología común
(Vaucheret, 1993).
La silenciación de la transcripción es
particularmente dificultosa para los biotecnólogos de agricultura
porque muchos de los promotores más útiles para la expresión de un
transgen particular y nativos para el genoma del huésped. Esto es
especialmente verdad para una de los más importantes cultivos de la
agricultura, el maíz. Los ejemplos de varios promotores de maíz
con los perfiles de expresión deseables incluyen promotores de maíz
constitutivos afines tales como los genes de de Adh y sacarosa
sintasa (Walker et al.,1987; Yang y Russell, 1990),
promotores específicos de tejidos tales como los promotores del
complejo que recogen el maíz zein y ligero (Conking et al.,
1990; Simpson, 1986), y los parámetros inducibles tales como de la
proteína de choque térmico de maíz (Odell et al., 1985).
Por lo tanto, existe, una gran necesidad en la
técnica de procedimientos mejorados para la expresión de genes
endógenos en plantas, y particularmente en plantas monocotiledóneas
importantes desde el punto de vista agronómico tal como maíz.
Particularmente, son necesarios procedimientos que permitan a los
científicos beneficiarse de las características deseables de los
promotores de monocotiledóneas, que incluso evitan los problemas
asociados a la co- supresión de secuencias homólogas. La tecnología
actual está limitada a este respecto por la pérdida de alternativas
suficientes a los promotores que son nativos a las especies
monocotiledóneas importantes desde el punto de vista
agronómico.
Por lo tanto, un aspecto de la presente
invención proporciona un procedimiento de prevención de la
silenciación de los genes dependientes de homología del promotor en
una planta monocotiledónea, comprendiendo el procedimiento las
etapas de (a) proporcionar un promotor de la coixina gamma que
comprende 80 a 894 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 8; (b)
preparar una construcción que comprende dicho promotor de la coixina
gamma unido de manera operativa a un gen seleccionado; (c)
transformar una célula receptora a partir de una planta
monocotiledónea distinta de de Coix con dicha construcción; y (d)
regenerar una planta que expresa dicho gen a partir de dicha célula
receptora, mediante el cual dicha planta no exhibe la silenciación
del gen. En particular las realizaciones de la invención la planta
monocotiledónea es una planta seleccionada entre el grupo
constituido por arroz, trigo, cebada, centeno, sorgo y maíz. La
etapa de transformación puede comprender: cualquier procedimiento
capaz de transformar de manera estable una planta que incluye, por
ejemplo, bombardeo de microproyectiles, transformación mediada por
PEG de protoplastos, electroporación, transformación mediada por
fibras de carburo de silicio, transformación mediada por
Agrobacterium. En una realización preferida de la invención
la etapa de transformación comprende bombardeo de microproyectiles
mediante revestimiento de microproyectiles con ADN que comprende la
construcción y poner en contacto las células receptoras con los
microproyectiles.
El gen puede ser potencialmente cualquier gen
que se desea que se exprese en una planta transgénica que incluye
un gen de resistencia a insectos, un gen de resistencia a
enfermedades, un gen de resistencia a herbicidas, un gen que afecta
a la composición o calidad de los granos, un gen de utilización de
nutrientes, un gen de reducción de micotoxina, un gen de
esterilidad masculina, un gen marcador que se puede seleccionar, un
gen marcador que se puede rastrear, un gen marcador que se puede
seleccionar negativo, un gen que afecta a las características
agronómicas de las plantas, y un gen de resistencia al ambiente o
estrés. El promotor Coix es un promotor de la coixina gamma
es un promotor de la coixina gamma.
En otro aspecto, la invención proporciona un
procedimiento de producción de la progenie que comprende las etapas
de (a) preparar una planta monocotiledónea de acuerdo con los
procedimientos descritos anteriormente; y (b) cruzar la planta con
una segunda planta o consigo misma.
En todavía otro aspecto, la invención
proporciona un procedimiento de mejora de plantas que comprende las
etapas de (a) obtener una planta progenie de cualquier generación de
una planta monocotiledónea preparada de acuerdo con los
procedimientos descritos anteriormente, en los que la planta
progenie comprende dicha construcción; y (b) cruzar la planta con
ella misma o una segunda planta.
El promotor de la coixina gamma aislado, por
ejemplo el que se puede aislar a partir de la secuencia de de SEQ
ID NO: 8 y comprende entre aproximadamente 80 y 894 nucleótidos
contiguos de la SEQ IN NO 8. En otra realización la secuencia de
ácido nucleico aislada comprende entre aproximadamente 222 y
aproximadamente 894 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 8 y
puede además comprender la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ
ID NO: 18. La secuencia de ácidos nucleicos aislada también puede
comprender entre aproximadamente 412 y aproximadamente 894
nucleótidos contiguos de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ
ID NO: 8, y todavía puede comprender la secuencia de ácidos
nucleicos de la SEQ ID NO: 19.
La etapa (d) del procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 proporciona una planta transgénica fértil que
comprende un ADN seleccionado, comprendiendo dicho ADN seleccionado
un promotor de la coixina gamma. En particular el promotor de la
coixina gamma se puede aislar a partir de la secuencia de ácidos
nucleicos de la SEQ ID NO: 8. En otras realizaciones el promotor
comprende una secuencia de ácidos nucleicos que comprende entre
aproximadamente 80 y aproximadamente 894, aproximadamente 222 y
aproximadamente 894, o aproximadamente 412 y aproximadamente 894 de
nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO 8. En todavía otra
realización, el promotor comprende la secuencia de ácidos nucleicos
de la SEQ ID NO: 18; o la SEQ ID NO: 19. El promotor se puede unir
de manera operativa a cualquier gen exógeno, que incluye un gen de
resistencia a insectos, un gen de resistencia a enfermedades, un
gen de resistencia a herbicidas, un gen que afecta a la composición
o calidad de cereal, un gen de utilización de nutrientes, un gen de
reducción de micotoxinas, un gen de esterilidad masculina, un gen
marcador que se puede seleccionar, un gen marcador que se puede
rastrear, un gen que se puede seleccionar negativo, un gen que
afecta a las características agronómicas de la planta, y un gen de
resistencia al ambiente o estrés.
El procedimiento de producción de progenie
proporciona una planta progenie de cualquier generación de
cualquiera de las plantas descritas anteriormente, en la que la
planta comprende dicho ADN seleccionado. En particular, la planta
es una planta monocotiledónea seleccionada entre el grupo
constituido por arroz, trigo, cebada, centeno, sorgo y maíz. En una
realización, la planta monocotiledónea es maíz.
Todavía en otro aspecto de la invención se
proporciona un procedimiento de mejora de plantas que comprende el
cruce de una planta transgénica fértil de la invención, o una
progenie transgénica de la misma que ha heredado un ADN exógeno de
la invención, consigo misma o con una segunda planta.
Los siguientes dibujos forman parte de la
presente memoria descriptiva y están incluidos para demostrar
adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La
invención se puede entender mejor con referencia a uno más de
estos dibujos en combinación con la descripción detallada de la
realización específica presentada en este documento.
Fig. 1: Mapa del plásmido pDPG844. El
plásmido contiene un módulo de expresión que consta de un promotor
de 894 pares de bases del gen de la coixina gamma (SEQ ID NO 8), la
secuencia codificadora del gen indicador GUS y el terminador
nos.
Fig. 2: Mapa del plásmido pDPG845. La
construcción contiene un módulo de expresión que consta de un
promotor de 894 pares de bases del gen de la coixina gamma (SEQ ID
NO 8), el intrón 1 de la actina 1 de arroz, la secuencia
codificante del gen indicador GUS y el terminador nos.
Fig. 3: Mapa del plásmido pDPG846. El
plásmido contiene un módulo de expresión que consta de un promotor
de 412 pares de bases del gen de la coixina gamma (SEQ ID NO 19),
el intrón 1 de la actina 1 de arroz, la secuencia codificadora del
gen indicador de GUS, y el terminador nos.
Fig. 4: Mapa del plásmido pDPG847. El
plásmido contiene un módulo de expresión que consta de un promotor
de 412 pares de bases del gen de la coixina gamma (SEQ ID NO 19),
la secuencia codificadora del gen indicador (GUS), y el terminador
nos.
Fig. 5: Mapa del plásmido pDPG848. El
plásmido contiene un módulo de expresión que consta de un promotor
de 222 pares de bases del gen de la coixina gamma (SEQ ID NO 18),
el intrón de la actina 1 de arroz, el gen indicador GUS, y el
terminador nos.
Fig. 6: Mapa del plásmido pDPG849. El
plásmido contiene un módulo de expresión que consta de un promotor
de 222 pares de bases del gen de la coixina gamma (SEQ ID NO 18),
la secuencia codificante de un gen indicador (GUS) y el terminador
nos.
Fig. 7: Mapa del plásmido pDPG869. La
construcción contiene un módulo de expresión que consta de un
promotor de 894 pares de bases del gen de la coixina gamma (SEQ ID
NO 8), el intrón 1 de la actina 1 de maíz, la secuencia codificante
del gen de la coixina gamma (SEQ ID NO 16), y el terminador de
la coixina gamma (SEQ ID NO 11).
Fig. 8: Secuencia de comparación de las
regiones promotoras de prolamina gamma que codifica los genes de
maíz, sorgo, y Coix . Los nucleótidos idénticos en tres
secuencias están indicados por sombras. Las secuencias de
promotor de maíz, Coix y sorgo se indican como zein gamma
(SEQ ID NO 23), coixina gamma (SEQ ID NO 8) y la kafirina
gamma(SEQ ID NO 22); respectivamente.
Fig. 9: Mapa del plásmido pDPG851. La
construcción contiene un módulo de expresión que consta de un
promotor de 894 pares de bases del gen de la coixina gamma (SEQ ID
NO 8), el intrón 1 de la actina 1 de maíz, la secuencia codificante
del gen de la coixina gamma (SEQ ID NO 16), y el terminador
nos.
Fig. 10: Mapa del plásmido pDPG862. La
construcción contiene un módulo de expresión que consta de un
promotor de secuencia de 894 pares de bases del gen de la coixina
gamma (SEQ ID NO 8), el intrón 1 de la actina 1 de maíz, la
secuencia codificante del gen de la coixina gamma (SEQ ID NO 16),
y el terminador nos.
Fig. 11: Mapa del plásmido pDV108. La
construcción contiene el terminador de la coixina gamma (SEQ ID NO
11).
La invención actual supera las deficiencias en
la técnica anterior proporcionando procedimientos para la expresión
de transgenes que eliminan o disminuyen la silenciación de los
genes. La presente invención es significativa porque proporciona
promotores para la expresión de genes exógenos en plantas
monocotiledóneas que tienen perfiles de expresión similares a los
del genoma del huésped, todavía que se distinguen lo suficiente en
secuencia para limitar la silenciación de los genes. En las
realizaciones particulares de la invención, los promotores
proporcionados por r la invención son del género Coix. Los
promotores derivados de Coix serán especialmente útiles en
maíz, así como otras plantas monocotiledóneas, tales como trigo,
arroz, cebada, centeno, sorgo y caña de azúcar así como en especies
de plantas dicotiledóneas.
El fenómeno de silenciación de genes, que
también se ha mencionado anteriormente como
co-supresión, supresión de sentido positivo, y
co-supresión de sentido positivo, es la disminución
o eliminación de la expresión génica tras la introducción de las
secuencias que tienen copias homólogas nativas (Napoli et
al., 1990; Van der Krol et al., 1990). La silenciación
génica puede actuar como regiones regula Coix.doras y/o
codificantes de un transgen, y está asociada frecuentemente con la
mutilación de la región silenciada. En el campo de la biotecnología
agrícola, la silenciación de las regiones reguladoras es
especialmente problemática porque muchos promotores endógenos
tienen características particularmente útiles para la expresión
transgénica.
Se contempla específicamente por los inventores
que la utilidad de la invención actual se puede extender hasta la
creación de los vectores de expresión que comprenden elementos de
Coix además de los promotores. En particular, se contempla
que la anulación de la silenciación de los genes y otros problemas
asociados a la homología entre elementos transgénicos y secuencias
nativas se pueden evitar mediante el uso de las secuencias
Coix en transgenes expresados en plantas monocotiledóneas
distintas de Coix. Por ejemplo, las regiones codificantes
homólogas a los genes de maíz se podrían expresar de manera eficaz
en maíz, mientras que el gen de maíz nativo se silenciaría. También
se consideran especialmente útiles elementos potenciadores y
terminadores de Coix.
La invención actual abarca el uso del promotor
de la coixina gamma del género Coix para la expresión de un
gen exógeno en las plantas monocotiledóneas tal como maíz. Tal
promotor se puede aislar de novo a partir de Coix, o
de manera alternativa, se puede aislar basándose en la información
genética de promotores de plantas monocotiledóneas conocidos. Un
medio particularmente eficaz contemplado por el inventor para la
identificación del promotor de la coixina gamma comprende el uso de
cebadores o sondas derivados de genes de maíz para aislar
secuencias homólogas de Coix.
Los promotores útiles incluyen los que son
inducibles, virales, sintéticos, constitutivos como se describe en
(Poszkowski et al., 1989, Odell et al., 1985),
regulados temporalmente, regulados espacialmente, y regulados
temporalmente espacialmente (Chan et al., 1989). Un promotor
se selecciona para determinar su capacidad para dirigir la célula
vegetal transformada o actividad de transcripción de la planta a la
región codificante. Algunos ejemplos de secuencias de maíz se
consideran especialmente útiles para el aislamiento de promotores
de Coix Incluyen los de Adh (Walter et al., 1987;
Paul y FERL, 1991, Nº de acceso del banco de genes S45022),
sacarosa sintasa (Yang y Russell, 1990), cab (Sullivan et
al., 1989, Nº de Acceso del Genbank x14794), PEPCase (Hudspeth
y Grula, 1989, Yanagisawa y Izui, 1989; Números de acceso del
Genbank X14579, X14581, X14580) y genes asociados al complejo de
genes R (Chandler et al., 1989; Consonni et al., 1993,
Nº de acceso del genbank X67619; Radicella et al., 1991,
Números de acceso del Genbank X52276, S48027). Las secuencias de
otras plantas monocotiledóneas, por ejemplo, el promotor de actin de
arroz (Número de acceso del Genbank S44221, también pueden ser
útiles.
Los genes ejemplares para el aislamiento de
promotores específicos de tejidos son la sacarosa sintasa 1 de maíz
(Yang et al., 1990), alcohol deshidrogensa de maíz, (Vogel
et al., 1989, Dennos et al., 1984, Números de acceso
del Genbank X04049, X00581); el complejo que recoge el maíz ligero
(Simpson, 1986; Bansal et al., 1992. Número de acceso del
Genbank M87020;), proteína de choque por calor de maíz (Odell et
al., 1985; Rochester et al., 1986, Número de acceso del
Genbank X03714) maíz zein (reina et al., 1990, Número de
acceso del Genbank X53514; Kriz et al., 1987, Número de
acceso del Genbank X05911; Wandelt y Foix, 1989; Número de acceso
del Genbank X14334; Langride y Feix, 1983; Número de acceso del
Genbank X00543; Reina et al., 1990, Número de acceso del
Genbank X53513; globulina - 1 (Belanger y Kriz et al., 1991;
Números de acceso del Genbank L22344, L22295), y los genes de la
chalcone sintasa (Franken et al., 1991; Número de acceso del
Genbank X60204).
Otras secuencias similares de maíz conocidas
incluyen promotores de células de raíz (Conkling et al.,
1990), y potenciadores específicos de tejidos (Fromm et al.,
1989). Los ejemplos de promotores que pueden inducir incluyen los
promotores que pueden inducir ABA y turgencia y el promotor del gen
de la proteína de unión a auxina (Scwob et al., 1993; Número
de acceso del Genbank L08425). Todavía otras secuencias de maíz
conocidas que se pueden usar para aislar promotores heterólogos
incluyen el gen de la UDP glucosa glicosil transferasa (ralston
et al., 1988; Números de acceso del Genbank X07940, Y00616);
gen inhibidor de la proteinasa (Cordero et al., 1994;
Número de acceso del Genbank X78988), gen de la
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (Número de acceso del Genbank U45859; Kohler et
al., 1995, Número de acceso del Genbank L40803; Quigley et
al., 1989, Número de acceso del Genbank X115408; Martínez et
al., 1989, Número de acceso del Genbank X15596), así como los
de los genes de cloroplastos (Número de acceso del Genbank
X86563).
Los elementos genéticos ejemplares contemplados
específicamente por los inventores actuales para el aislamiento de
las secuencias de Coix para la expresión en maíz y otras
plantas monocotiledóneas se enumeran a continuación, en la Tabla 1.
Un número de estos elementos se han usado por los inventores
actuales para la preparación de los vectores de expresión, como se
indica a continuación.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ a, \+ promotor indicado que se ha usado para la transformación de maíz.\cr b, \+ potenciador de intrón indicado que se ha usado para la transformación de maíz.\cr c, \+ promotor Coix que se ha aislado y usado para la transformación de maíz.\cr d, \+ \begin{minipage}[t]{138mm} proteína Coix que codifica la secuencia (CDS) que se ha aislado y usado para la transformación de maíz. \end{minipage} \cr}
\vskip1.000000\baselineskip
Parte de la invención actual implica el
aislamiento de las proteínas reguladoras del género Coix
mediante el uso de sondas o cebadores derivados de genes de maíz o
sus secuencias flanqueantes. Las sondas o cebadores se pueden
componer o clonar directamente de ADN de maíz clonado, o como
alternativa, se puede preparar de manera sintética basándose en los
datos de las secuencias de ADN. De manera adicional, los promotores
se pueden aislar usando las secuencias que se derivan de una
especie diferente de maíz, pero que está aún relacionada con maíz y
Coix. Otras especies se consideran particularmente útiles
para la identificación de promotores heterólogos en Coix
incluyen plantas monocotiledóneas tales como centeno, trigo, cebada,
avena, sorgo, arroz, y caña de azúcar.
El término cebador como se usa en el presente
documento significa que abarca cualquier ácido nucleico que es
capaz de cebar la síntesis de un ácido nucleico naciente en un
proceso dependiente del molde. Típicamente los cebadores son
oligonucleótidos de entre diez y doce pares de bases de longitud,
pero se pueden empelar secuencias más largas. Los cebadores se
pueden proporcionar en forma de doble hebra o de una sola hebra,
aunque se prefiere la de una sola hebra. Las sondas se definen de
manera diferente, aunque pueden actuar como cebadores. Las sondas,
aunque quizás son capaces de cebar, se diseñan para unirse al ADN o
ARN diana y necesitan usarse en un proceso de amplificación.
En realizaciones preferidas, las sondas o
cebadores están marcadas con especies radiactivas (^{33}P,
^{14}C, ^{35}S, ^{3}H, u otra etiqueta), con un fluoróforo
(rodamina, fluoresceína), un antígeno (biotina, estreptavidina,
digoxigenina), o un agente quimioluminiscente (luciferasa) o
conjugación directa con enzimas (fosfatasa alcalina).
Después de la preparación de las sondas o
cebadores la primera etapa en la clonación de promotores heterólogos
típicamente implica la preparación y selección de una genoteca
apropiada de clones, tal como en el caso presente, una genoteca de
ADN genómica de Coix. La selección se puede basar en al
hibridación de sondas de oligonucleótidos, diseñados a partir de
una consideración de partes de la secuencia de promotores de maíz, o
a partir de l as secuencias de ADN del gen o genes relacionados. La
operación de tales protocolos de selección es bien conocida por los
expertos en la técnica y se describe en detalle más adelante y en la
bibliografía de síntesis, por ejemplo, en Sambrook et al.,
(1989).
Los procedimientos de amplificación dependientes
de molde, por ejemplo PCR, representan un medio eficaz para el
aislamiento de secuencias homólogas de maíz u otras de Coix.
En particular los cebadores se pueden diseñar basándose en la
información genética a partir de secuencias homólogas, que se pueden
usar para la amplificación dependiente del molde de ácidos
nucleicos que comprenden promotores Coix. Un número de
procedimientos dependiente de molde están disponibles para
amplificar las secuencias presentes en una muestra de molde dada.
Uno de los mejores procedimientos de amplificación es la reacción en
cadena de la polimerasa (llamada PCR ^{TM}) que se describe en
detalle en la patente de Estados Unidos número 4.683.195; patente de
Estados Unidos número 4.683.202 y patente de Estados Unidos número
4.800.159.
En resumen, en la PCR ^{TM}, se preparan dos
secuencias de cebadores para que sean complementarias a las
regiones en las hebras complementarias opuestas de la secuencia de
marcador. Un exceso de desoxinucleósido trifosfatos se añade a la
mezcla de reacción junto con una ADN polimerasa, por ejemplo,
Taq polimerasa. Si la secuencia de marcador está presente
en una muestra, los cebadores se unirán al marcador y la polimerasa
provocará que los cebadores se extiendan a lo largo de la secuencia
de los marcadores mediante la adición en los nucleótidos. Mediante
el aumento y disminución de la temperatura de la mezcla de reacción,
los cebadores extendidos se disociarán del marcador para formar
productos de reacción y se repite el procedimiento.
Un procedimiento de amplificación de PCR ^{TM}
de transcriptasa inversa se puede realizar con el fin de
cuantificar la cantidad de ARNm amplificado. Los procedimientos de
transcripción inversa de ARN en ADNc son bien conocidos y se
describen en Sambrook et al., (1989). Los procedimientos
alternativos para la transcripción inversa utilizan ADN polimerasas
termoestables dependientes de ARN. Estos procedimientos se describen
en el documento PCT/WO90/07641 presentado el 21 de diciembre de
1990. Las metodología de la reacción en cadena de la polimerasa son
bien conocidas en la técnica.
Otro procedimiento para la amplificación es la
reacción en cadena de la ligasa ("LCR"), descrito en el
documento EP 0 320 308. En LCR, se preparan dos pares de sondas
complementarias, y en la presencia de la secuencia diana, cada par
se unirá a hebras complementarias opuestas de la diana de manera que
están cerca. En la presencia de una ligasa, los dos pares de sondas
se unirán para formar una sola unidad. Mediante la ciclación de la
temperatura, como en PCR ^{TM}, las unidades ligadas unidas se
disocian de la diana y sirven como "secuencias diana" para el
ligamiento de pares de sonda en exceso. La patente de Estados Unidos
nº 4.883.750 describe un procedimiento similar a LCR para la unión
de pares de sondas a una secuencia diana.
Qbeta Replicasa, descrita en el documento
PCT/US87/00880, también se puede usar como aún otro procedimiento
de amplificación en la presente invención. En este procedimiento,
una secuencia replicativa de ARN que tiene una región
complementaria a la de una diana se añade a una muestra en la
presencia de una ARN polimerasa. La polimerasa copiará la secuencia
replicativa que después se puede detectar.
Un procedimiento de amplificación isotérmico, en
el que las endonuclesas de restricción y ligasas se usan para
lograr la amplificación de moléculas diana que contienen el
nucleótido
5'-[\alpha-tio]-trifosfatos en
una hebra de un sitio de restricción también puede ser útil en la
amplificación de ácidos nucleicos en la presente invención (Walter
et al., 1992).
La Amplificación de Desplazamiento de Hebra
(SDA) es otro procedimiento de llevar a cabo la amplificación
isotérmica de ácidos isotérmicas que implica múltiples rondas de
desplazamiento y síntesis de hebra, es decir, traducción nick. Un
procedimiento similar, llamado Reacción en Cadena de Reparación
(PCR), implica la hibridación de varias sondas por toda la región
dirigida para la amplificación, seguido de una reacción de
reparación en la que solamente están presentes dos de las cuatro
bases. Las otras dos bases se pueden añadir como derivados
biotinilados para la detección fácil. Se usa un planteamiento
similar en SDA. Las secuencias específicas diana también se pueden
detectar usando una reacción de sonda cíclica (CPR). En la CPR, una
sonda que tiene secuencias 3' y 5' de ADN no específico y una
secuencia intermedia de ARN específico se hibrida a ADN que está
presente en una muestra. Tras la hibridación, la reacción se trata
con ARNasa II, y los productos de la sonda identificada como
productos distintos que se liberan después de la digestión. El molde
original se hibrida a otra sonda de ciclación y la reacción se
repite.
Todavía otros procedimientos de amplificación en
el documento GB 2 202 308 y en el documento PCT/US89/01025 se
pueden usar de acuerdo con la presente invención. En la solicitud
anterior, se usan cebadores "modificados" en una síntesis de
tipo PCR ^{TM}, dependiente de molde y enzima. Los cebadores se
pueden modificar mediante el etiquetado con, un resto de captura
(por ejemplo, biotina) y/o un resto detector (por ejemplo, enzima).
En la aplicación posterior, un exceso de sondas marcadas se añade a
la muestra. En la presencia de la secuencia diana, la sonda se une
y se escinde de manera catalítica. Después de la escisión, la
secuencia diana se libera intacta para que se una por exceso de
sonda. La escisión de la sonda marcada señala la presencia de la
secuencia diana.
Otros procedimientos de amplificación de ácidos
nucleicos incluyen los sistemas de amplificación basados en la
transcripción (TAS), que incluyen la amplificación basada en la
secuencia de ácido nucleico (NSABA) y 3SR (Kwoh et al.,
Gingeras et al., documento PCT/WO88/10315. En NASBA los
ácidos nucleicos se pueden preparar para la amplificación mediante
extracción convencional por fenol/cloroformo, desnaturalización por
calor de una muestra clínica, tratamiento con tampón de lisis y
columnas de minispin para el aislamiento de ADN y ARN o extracción
por cloruro de guanidio de ARN. Estas técnicas de amplificación
implican la hibridación de un cebador que tiene secuencias
específicas de diana. Después de la polimerización, ADN/ARN se
hibrida y se digiere con la ARNasa H con moléculas de ADN de doble
hebra se desnaturalizan por calor otra vez. En cualquier caso el
ADN de una sola hebra se prepara con doble hebra mediante la adición
de un segundo cebador específico de diana, seguido de
polimerización. Las moléculas de ADN de doble cadena después se
transcriben de manera múltiple mediante una ARN polimerasa tal como
T7 o SP6. En una reacción cíclico isotérmica, los ARN se
transcriben de manera inversa en ADN de una sola hebra, que después
de convierte en ADN de doble hebra, y después se transcribe una vez
más con una ARN polimerasa tal como T7 o SP6. Los productos
resultantes, si están rotos o completos, indican secuencias diana
especificas diana.
El documento EP 329 822 describe un
procedimiento de amplificación de ácido nucleico que implica de
manera cíclica la síntesis de ARN de una sola cadena (ssADN''), el
ssADN y ADN de doble cadena (dsADN) que se puede usar de acuerdo
con la presente invención. El ssARN es un molde para un primer
oligonucleótido cebador, que se alarga mediante transcriptasa
inversa (ADN polimerasa de pendiente de ARN). Después se retira el
ARN del ADN :
ARN dúplex resultante por la acción de la ribonucleasa H (ARNasa H, una ARNasa específica de ARN en dúplex con cualquier ADN o ARN). El ssADN resultante es un molde para un segundo cebador, que también incluye las secuencias de un promotor de la ARN polimerasa (que se ejemplifica por la ARN polimerasa de T7) 5' a su homología al molde. Este cebador después se extiende mediante la ADN polimerasa (que se ejemplifica por el fragmento grande "Klenow" de ADN polimerasa I de de E. coli, que da como resultado una molécula ADN de doble hebra ("dsADN"), que tiene una secuencia idéntica al ARN original entre los cebadores y que tienen de manera adicional, en un extremo, una secuencia de promotor. Esta secuencia de promotor se puede usar mediante la ARN polimerasa apropiada para preparar muchas copias de ARN del ADN. Después estas copias pueden volver a entrar en el ciclo que conduce a una amplificación muy rápida. Con la elección apropiada de enzimas, esta amplificación se puede hacer de manera isotérmica sin la adición de enzimas en cada ciclo. Debido a la naturaleza cíclica de este procedimiento, la secuencia de partida se puede elegir para que esté en la forma de o bien ADN o
ARN.
ARN dúplex resultante por la acción de la ribonucleasa H (ARNasa H, una ARNasa específica de ARN en dúplex con cualquier ADN o ARN). El ssADN resultante es un molde para un segundo cebador, que también incluye las secuencias de un promotor de la ARN polimerasa (que se ejemplifica por la ARN polimerasa de T7) 5' a su homología al molde. Este cebador después se extiende mediante la ADN polimerasa (que se ejemplifica por el fragmento grande "Klenow" de ADN polimerasa I de de E. coli, que da como resultado una molécula ADN de doble hebra ("dsADN"), que tiene una secuencia idéntica al ARN original entre los cebadores y que tienen de manera adicional, en un extremo, una secuencia de promotor. Esta secuencia de promotor se puede usar mediante la ARN polimerasa apropiada para preparar muchas copias de ARN del ADN. Después estas copias pueden volver a entrar en el ciclo que conduce a una amplificación muy rápida. Con la elección apropiada de enzimas, esta amplificación se puede hacer de manera isotérmica sin la adición de enzimas en cada ciclo. Debido a la naturaleza cíclica de este procedimiento, la secuencia de partida se puede elegir para que esté en la forma de o bien ADN o
ARN.
El documento PCT/WO89/06700 describe un esquema
de amplificación de la secuencia de ácidos nucleicos basándose en
la hibridación de una secuencia de promotor/cebador a una ADN de una
sola cadena diana ("ssADN") seguido de la transcripción de
muchas copias de ARN de la secuencia. Este esquema no es cíclico, es
decir no se producen nuevos moldes a partir de las transcripciones
de ARN resultantes. Otros procedimientos de amplificación incluyen
"RACE" y "PERT ^{TM} unilateral" (Forman, 1990; Ohara
et al., 1989).
Los procedimientos basados en el ligamiento de
dos (o más) oligonucleótidos en la presencia de ácido nucleico que
tiene la secuencia del "di-oligonucleótido"
resultante, amplificando por lo tanto el
di-oligonucleótido, también se puede usar en la
etapa de amplificación de la presente invención (Wu et al.,
1989).
Después de la amplificación, normalmente es
deseable en una fase u otra, separar el producto de amplificación
del molde y el exceso de cebador con el propósito de determinar si
se ha producido la amplificación específica. En una realización,
los productos de amplificación se separan mediante gel de
electroforesis de agarosa, agarosa - acrilamida o gel de
poliacrilamida usando procedimientos convencionales (Sambrook, et
al., 1989).
Como alternativa se pueden emplear técnicas
cromatográficas para efectuar la separación. Existen muchos tipos
de cromatografía que se pueden empelar en la presente invención:
adsorbió, partición, intercambio iónico y tamices moleculares, y
muchas técnicas especializadas para su uso que incluyen, columna,
columna, papel, capa fina y cromatografía de gas (Freifelder,
1982).
Se pueden visualizar los productos con el fin de
confirmar la amplificación de las secuencias de marcador. Un
procedimiento de visualización típica implica la tinción de un gel
con bromuro de etidio y visualización bajo luz UV. De manera
alternativa, si los productos de amplificación están marcados de
manera integral con nucleótidos marcados con radio o de manera
fluorométrica, los productos de amplificación se pueden exponer
después a película de rayos X o visualizarse en los espectros de
estimulación apropiados, después de la preparación.
En una realización, la visualización se logra de
manera indirecta. Después de la separación de los productos de
amplificación se pone en contacto una sonda de ácido nucleico
marcada con la secuencia de marcador amplificada. La sonda
preferiblemente se conjuga a un cromóforo pero puede estar marcada
radiactivamente. En otra realización la sonda se conjuga a una
pareja de unión tal como un anticuerpo de biotina y el otro miembro
de la pareja de unión lleva un resto detectable.
En otra realización, la detección es mediante
una sonda marcada. Las técnicas implicadas son bien conocidas por
los expertos en la técnica y se pueden encontrar en muchos libros
convencionales sobre protocolos moleculares Sambrook et al.,
1989). Por ejemplo, cromóforos o sondas o cebadores marcados
radiactivamente identifican la diana durante o después de la
amplificación.
Un ejemplo de lo anterior se describe en la
patente de Estados Unidos Nº 5.279.721 que describe un aparato y
procedimiento para la electroforesis automática y transferencia de
ácidos nucleicos. El aparato permite electroforesis y transferencia
sin la manipulación extrema del gel y es ideal para de manera
adecuada llevar a cabo procedimientos de acuerdo con la presente
invención.
Además, los productos de amplificación descritos
anteriormente se pueden someter a análisis de secuencia para
identificar tipos específicos de variaciones que usan técnicas de
análisis de secuencias convencionales. Dentro de ciertos
procedimientos, el análisis exhaustivo de genes se lleva a cabo
mediante análisis se secuencia que usan conjuntos de cebadores
diseñados para la secuenciación óptima (Pignon et al., 1994).
La presente invención proporciona procedimientos mediante los
cuales se pueden usar cualesquiera de estos tipos de análisis.
Las técnicas de transferencia representan otros
procedimientos que con bien conocidos por los expertos en la
técnica y se pueden emplear para la identificación de ácidos
nucleicos de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, la
transferencia de Southern se puede usar para aislar un segmento de
ADN que contiene un promotor candidato de Coix útil en la
expresión de genes de maíz. En particular, mediante la hibridación
de una sonda de ADNc de maíz a clones de ADN genómico de una planta
Coix se pueden aislar clones que incluyen la región de los
promotores del gen correspondiente. Como alternativa, la secuencia
del mismo promotor se puede usar como una sonda para identificar de
manera directa promotores de Coix homeólogos.
La transferencia de Southern implica el uso de
ADN como una diana. Cada uno proporciona tipos diferentes de
información, aunque la transferencia de ADNc es análoga, en muchos
aspectos, a la transferencia o especies de ARN. En resumen, se usa
una sonda para dirigir una especie de ADN o ARN que se ha
inmovilizado sobre una matriz adecuada, a menudo un filtro de
nitrocelulosa. Las diferentes especies se deben separar de manera
espacial para facilitar el análisis. Esto a menudo se lleva a cabo
mediante electroforesis en gel de especies de ácidos nucleicos
seguido de "transferencia" sobre el filtro.
Posteriormente, la diana transferida se incuba
con una sonda (usualmente marcada) en condiciones que promueven la
desnaturalización y rehibridación. Ya que la sonda se diseña al par
de bases con la diana, la sonda unirá una parte de la secuencia
diana en condiciones de renaturalización. La sonda no unida después
se retira y la detección se lleva a cabo como se ha descrito
anteriormente.
Se han contemplado de manera especial por el
presente inventor las tecnologías de ADN basadas en chip tales como
las descritas por Hacia et al., (1996) y Shoemaker et
al., (1996). En resumen, estas técnicas implican procedimientos
cuantitativos para analizar grandes cantidades de genes de manera
rápida y precisa. Por genes de etiquetado con los oligonucleótidos
o uso de disposiciones de sondas fijas, se puede emplear tecnología
de chip para segregar moléculas diana como disposiciones de alta
densidad y selección de estas moléculas en la base de hibridación
(Pease et al., 1994; Fader et al., 1991).
La presente invención contempla el uso de la
coixina gamma que se ha aislado sin el uso de sondas o cebadores
derivados de promotores de otras especies. Los medios para la
clonación de promotores y su construcción en vectores adecuados
para la transformación y expresión de genes exógenos en maíz se
conoce en la técnica y se describen en, por ejemplo, Sambrook
et al., 1989). Los tipos de promotores de Coix se
consideran que son especialmente útiles para la expresión
transgénica en maíz son aquellos que se expresan a altos niveles
de una manera constitutiva o no constitutiva. Los promotores
deseables no constitutivos incluyen aquellos que se expresan en
un tejido y/o de manera específica temporal, o que se pueden
inducir. Por de manera temporal específica, significa un promotor
que dirige la expresión en uno o más períodos de desarrollo
específicos.
Una primera etapa típica en la clonación de un
promotor comprende la identificación de un gen diana que se
expresa de la manera deseada, es decir, de manera constitutiva o
específica de manera temporal del tejido. Un medio eficaz para esto
comprenderá la preparación de una genoteca de ADNc a partir de uno
o más tejidos diana identificados, y la identificación de altos
clones de copia allí. Serán particularmente ventajosos los clones
de ADNc que se representan en gran medida, incluso para los cuales
el número de copias de genes es bajo. El clon de ADNc se usa
después para aislar ADN genómico que comprende las regiones que
flanquean 5' la secuencia de codificación, que incluye la región
del promotor, usando técnicas de selección de genotecas
convencionales conocidas por los expertos en la técnica (véase
Sambrook et al., 1989).
Un procedimiento preferido para la clonación de
los promotores es el uso de la técnica "PCR de supresión"
descrita por ejemplo, en Siebert et al., 1995. Este
procedimiento permite la amplificación de PCR de las secuencias no
clonadas y desconocidas mientras que se conoce una secuencia de
anclaje específica gen. Usando esta técnica una secuencia conocida
tal como una secuencia de ADNc homóloga u homeóloga, se puede usar
para clonar elementos reguladores de flanqueo que incluyen
promotores, potenciadores o terminadores.
La transcripción inversa (RT) de ARN a ADNc
seguido de la PCR ^{TM} cuantitativa (RT - PCR ^{TM}) se puede
usar para determinar las concentraciones relativas de especies de
ARNm específico aislado a partir de las plantas. Determinando que
la concentración de una especie de ARNm específico varía, se muestra
que el gen que codifica la especie de ARNm específico se expresa de
manera diferencial. De esta forma, los promotores candidatos se
pueden identificar y seleccionar de manera rápida a partir de
Coix para uso en la construcción de los vectores de
expresión para la transformación de maíz.
En la PCR ^{TM}, el número de moléculas del
DNA objetivo amplificado se incrementa en un factor que se acerca a
dos con cada ciclo de reacción hasta que algunos agentes llegan a
ser limitantes. Después de esto, la velocidad de amplificación
llega a disminuir de manera creciente hasta que no hay incremento en
la diana amplificada entre ciclos. Si se representa un gráfico en
el que el número de ciclos en el que el número de ciclos está sobre
el eje X y el log de la concentración del ADN diana amplificado está
sobre el eje Y, se forma una línea curva con forma característica
conectando los puntos representados gráficamente. Comenzando con el
primer ciclo, la pendiente de la línea es positiva y constante.
Esto se dice que es una parte lineal de la curva. Después de que un
reactivo se hace limitante, la pendiente de la curva comienza a
disminuir y eventualmente llega a cero. En este momento la
concentración del ADN diana amplificado se hace asintótico para
algún valor fijo. Esto se dice que es la parte plana de la
curva.
La concentración del ADN diana en la parte
lineal de la amplificación de PCR ^{TM} es directamente
proporcional a la concentración de partida de la diana antes de
que comience la reacción. Determinando la concentración de los
productos amplificados del ADN diana en las reacciones de PCR
^{TM} que han contemplado el mismo número de ciclos y están en
sus intervalos lineales, es posible determinar la concentración
relativa de la secuencia específica diana en la mezcla de ADN
original. Si las mezclas de ADN son los ADNc sintetizados a partir
de los ARN de los diferentes tejidos o células, las abundancias
relativas del ARNm específico para las que la secuencia diana se
derivó se pueden determinar por los respectivos tejidos o células.
La proporcionalidad directa entre la concentración de los
productos de PCR ^{TM} y las abundancias
\hbox{de ARNm relativas es solamente verdad en el intervalo lineal de la reacción de la PCR ^{TM} :}
La concentración final del ADN lineal en la
parte plana de la curva se determina por la capacidad de los
reactivos en la mezcla de reacción y es independiente de la
concentración original del ADN diana. Por lo tanto, la primera
condición que se debe reunir antes de que las abundancias relativas
de una especie de ARNm se puedan determinar por RT - PCR ^{TM}
para una colección de poblaciones de ARN es que las concentraciones
de los productos amplificados por PCR ^{TM} se pueden muestrear
cuando las reacciones de PCR ^{TM} están en la parte lineal de
sus curvas.
La segunda condición que se debe reunir para un
estudio de RT - PCR ^{TM} para determinar con éxito las
abundancias relativas de una especie de ARNm particular es que las
concentraciones relativas de los ADN c que se pueden amplificar se
deben normalizar hasta algún estándar independiente. El objetivo de
un estudio de RT - PCR ^{TM} es determinar la abundancia de una
especie de ARNm particular para el promedio de abundancia de todas
las especies de ARNm en la muestra.
La mayoría de los protocolos para la PCR ^{TM}
competitiva utilizan patrones de PCR ^{TM} que son
aproximadamente tan abundantes como la diana. Estas estrategias son
eficaces si los productos de de las amplificaciones de PCR ^{TM}
se muestrean durante sus fases lineales. Si los productos se
muestrean cuando las reacciones se aproximan a la fase plana,
entonces el producto menos abundante se llega a representar en
exceso de manera relativa. Las comparaciones de las abundancias
relativas hechas para diferentes muestras de ARN diferentes, tales
como es el caso cuando se examinan las muestras de ARN para
determinar la expresión diferencial, se llega a distorsionar de tal
forma que se hacen diferencias en las abundancias relativas de los
ARN parecen menos lo son en realidad. Éste no es un problema
significativo si el patrón interno es mucho más abundante que la
diana. Si el patrón interno es más abundante que la diana, entonces
las comparaciones directas lineales se pueden realizar entre las
muestras de ARN.
La anterior descripción describe consideraciones
teóricas para un ensayo de RT - PCR ^{TM} para tejidos de
plantas. Los problemas inherentes en las muestras de los tejidos de
plantas son las que son de cantidad variable (que hacen una
problemática de normalización), y que son de calidad variable
(necesitando la coamplificación de un control interno fiable,
preferiblemente de mayor tamaño que la diana). Ambos problemas se
superan si la RT - PCR ^{TM} se realiza como una RT - PCR ^{TM}
cuantitativa relativa con un patrón interno en el que el patrón
interno es un fragmento de ADNc amplificable que es mayor que el
fragmento de ADNc diana y en el que abundancia de la ARNm que
codifica el patrón interno es aproximadamente 5 - 100 veces mayor
que el ARNm que codifica la diana. Este ensayo mide la abundancia
relativa no la abundancia absoluta de las especies de ARNm
respectivas.
Se pueden realizar otros estudios usando un
ensayo de RT - PCR ^{TM} cuantitativa relativa con un protocolo
estándar externo. Estos ensayos muestrean los productos PCR ^{TM}
en la parte lineal de las curvas de amplificación. El número de
ciclos de la PCR ^{TM} que son óptimos para muestreo se pueden
determinar empíricamente para cada fragmento de ADNc diana. Además,
los productos de transcriptasa inversa para cada población de ARN
aislado de las diversas muestras se deben normalizar cuidadosamente
para concentraciones iguales de los ADN que se pueden amplificar.
Esta consideración es muy importante ya que el ensayo mide la
abundancia absoluta de ARNm. La abundancia absoluta de ARNm se
puede usar como una medida de la expresión génica diferencial
solamente en las muestras normalizadas. Aunque las determinaciones
empíricas para el intervalo lineal de la curva de amplificación y
normalización de de las preparaciones de ADNc son procedimientos
tediosos y requieren tiempo largo, los ensayos de RT - PCR ^{TM}
resultantes pueden ser superiores a los derivados del ensayo de RT
- PCR ^{TM} cuantitativa relativa con un patrón interno.
Una razón para esta ventaja es que sin el
patrón/competidor interno, todos los reactivos se pueden convertir
en un solo producto de PCR ^{TM} en el intervalo lineal de la
curva de amplificación, incrementando de esta manera la
sensibilidad del ensayo. Otra razón es que con solamente un producto
de la PCR ^{TM}, la exposición del producto sobre un gel de
electroforesis u otro procedimiento de exposición se hace menos
complejo, tienen menos fondo y es más fácil de interpretar.
Igual que los promotores de clonación en una
diana, la manera específica mediante la identificación primera de
un gen con un perfil de expresión deseado, se pueden clonar los
promotores de Coix utilizando una estrategia de selección
"a ciegas". Por ejemplo, se puede generar un gran número de
vectores que comprenden un gen marcador que se puede seleccionar o
rastrear unido a segmentos al azar de ADN de Coix. Tales
vectores se pueden preparar mezclando y ligando partes del ADN del
gen marcador digerido por restricción y ADN genómico total de
Coix, y la clonación del ADN en un vector adecuado. Como
alternativa, se puede usar una construcción de "jinete sin
cabeza" en la que un sitio de clonación precede directamente a
un gen marcador que por otra parte carece de un promotor. En este
caso, el gen marcador se expresará solamente cuando un promotor se
clona en el sitio de clonación. Una vez construidos, los vectores se
pueden usar para transformar un gran número de células de maíz.
Mediante la selección de transformantes que expresan el gen
marcador se pueden identificar promotores de Coix novedosas
capaces de dirigir la expresión en maíz.
Una vez clonado, la identidad y/o utilidad del
promotor se puede confirmar mediante la secuenciación y/ o ensayos
de expresión. Para las plantas, el ensayo de expresión puede
comprender un sistema que utiliza células embrionarias o no
embrionarias, o como alternativa, plantas enteras. Una ventaja de
uso de ensayos celulares es que no se requiere la regeneración de
grandes números de plantas, sin embargo, los sistemas se limitan
porque la actividad del promotor en las células no regeneradas
pueden no correlacionarse directamente con la expresión en una
planta. De manera adicional, en general no son factibles los ensayos
de tejido o promotores específicos de desarrollo.
La muestra biológica a ensayar puede comprender
ácidos nucleicos aislados de las células o cualquier material
vegetal de acuerdo con las metodologías convencionales (Sambrook
et al., 1989). El ácido nucleico puede ser ADN genómico o
ARN fraccionado o de células enteras. Cuando se usa el ARN, se puede
desear convertir el ARN en un ADN complementario. En una
realización, el ARN es ARN de células enteras. En otro es un ARN
poli-A. Normalmente, se amplifica el ácido
nucleico.
Dependiendo del formato, el ácido nucleico
específico de interés se identifica en la muestra directamente
usando la amplificación con un segundo ácido nucleico conocido
después de la amplificación. A continuación, el producto
identificado se detecta. En ciertas aplicaciones, la detección se
puede realizar por medios visuales (por ejemplo, tinción con
bromuro de etidio de un gel). Como alternativa, la detección puede
implicar la identificación indirecta del producto mediante
quimioluminiscencia, centelleo grafía radiactiva de etiqueta marcada
radiactivamente o fluorescente o incluso mediante un sistema que
usa señales de impulso eléctricas o térmicas (Affymax Technology;
Bellus, 1994).
Después de la detección, se pueden comparar los
resultados observados en una planta dada con un grupo de referencia
estadísticamente significativa de plantas de control no
transformadas. Típicamente, las plantas de control no transformadas
serán de un fondo genético similar a las plantas transformadas. De
este forma, es posible detectar diferencias en la cantidad o tipo
de la proteína detectada en diversas plantas transformadas. Como
alternativa, los cultivos o células clonados, por ejemplo, callo o
un embrión inmaduro, se puede comparar con otras muestras de
células.
Como se ha indicado, la variedad de ensayos
diferentes se contemplan en la selección de células o plantas de la
presente invención y promotores asociados. Estas técnicas se pueden
usar en casos para detectar tanto la presencia como la expresión de
los genes particulares así como trasposiciones que se pueden
producir en la construcción de genes. Las técnicas incluyen pero no
se limitan a, hibridación fluorescente in situ (FISH),
secuenciación de ADN directa, análisis de electroforesis en gel de
campo por pulsos (PFGE), transferencia de Southern o Northern,
análisis de conformación de una sola cadena (SSCA), ensayo de
protección de ARNasa, oligonucleótido específico de alelo, (ASO),
análisis de transferencia por puntos, electroforesis en gel de
gradiente desnaturalizante, RFLP y PCR ^{TM} SSCP.
Cuando se ha aislado un clon que comprende un
promotor de acuerdo con la presente invención se contempla que se
puede desear delimitar las regiones promotoras esenciales dentro del
clon. Un medio eficaz para esto comprende el análisis de supresión.
En el análisis de supresión, se preparan una serie de
construcciones, conteniendo cada una de ellas una parte diferente
del clon (un subclon), y estas construcciones después se rastrean
para detectar la actividad del promotor. Un medio adecuado para
detectar la actividad es unir las construcciones del promotor
suprimido a un marcador que se puede seleccionar o rastrear, y para
aislar solamente aquellas células que expresan el gen marcador. De
esta manera, se identifican numerosas construcciones de promotor
suprimido que todavía retienen la actividad del promotor. El
segmento más pequeño que se requiere para la actividad del promotor
se identifica por medio de esto mediante la comparación de las
construcciones seleccionadas. Este segmento se puede después usar
para la construcción de vectores para la expresión de genes
exógenos.
Se contempla específicamente por el inventor que
se puede someter a mutagénesis un promotor de la coixina gamma para
mejorar de manera potencial la utilidad del promotor para la
expresión de transgenes en maíz. La mutagénesis de promotores de
Coixin se puede llevar a cabo al azar y los promotores
sometidos a mutagénesis seleccionados para la utilidad en un
procedimiento de ensayo por error. Como alternativa, secuencias
particulares que proporcionan un promotor Coix con
características de expresión deseables se pueden identificar y estas
secuencias o similares introducidas en promotores de maíz mediante
mutación. Además del maíz, se pueden someter a mutagénesis para que
se proporcionen con las características deseables de un promotor
Coix. Por ejemplo, se puede someter a mutagénesis un
promotor de arroz, avena, sorgo, cebada, o trigo para proporcionar
el promotor sometido a mutagénesis con la utilidad potenciada para
la expresión de transgenes en maíz.
Los medios para la mutagénesis de un segmento de
ADN que codifica un promotor de la presente invención son bien
conocidos por los expertos en la técnica. Las modificaciones a tales
regiones del promotor se pueden realizar mediante procedimientos
de mutagénesis al azar, o específica del sitio. La región del
promotor se puede modificar alterando su estructura mediante la
adición o supresión, de uno o más nucleótidos de la secuencia que
codifica la región del promotor no modificada correspondiente.
La mutagénesis se puede realizar de acuerdo con
cualquiera de las técnicas conocidas en la técnica tal como y no se
limitan a la síntesis de un oligonucleótido que tiene una o más
mutaciones dentro de al secuencia de una región particular del
promotor. En particular, la mutagénesis específica del sitio es una
técnica útil en la preparación de mutantes de promotores mediante
la mutagénesis específica del ADN subyacente. La técnica además
proporciona una habilidad capaz de preparar y ensayar variantes de
secuencia, por ejemplo, la incorporación de una o más de las
consideraciones anteriores, mediante la introducción de uno o más
cambios en la secuencia de nucleótidos en el ADN. La mutagénesis
específica del sitio permite la producción de mutantes mediante el
uso de secuencias de oligonucleótidos específicas que codifican la
secuencia de ADN de las mutaciones deseadas, así como, un número
suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una
secuencia del promotor de tamaño suficiente y complejidad de
secuencia para formar un dúplex estable en ambos lados de la unión
de supresión que está alterada.
En general, la técnica de la mutagénesis
específica de sitio se conoce bien en la técnica, como se
ejemplifica mediante diversas publicaciones. Como se apreciará, la
técnica típicamente emplea un vector de fago que existe tanto en la
forma de una sola hebra como de doble hebra. Los vectores típicos
útiles en la mutagénesis dirigida al sitio incluyen vectores tales
como el fago M13. Estos fagos están fácilmente disponibles
comercialmente y su uso en general se conoce bien por los expertos
en la técnica. Los plásmidos de doble hebra también se emplean de
manera rutinaria en la mutagénesis dirigida al sitio que elimina la
etapa de transferencia del gen de interés de un plásmido a un
fago.
En general, la mutagénesis dirigida al sitio de
acuerdo con el presente documento se realiza obteniendo primero un
vector de una sola cadena o fusión aparte de dos hebras de un vector
de dos cadenas que incluye dentro de su secuencia una secuencia de
ADN que codifica la región promotora deseada o péptido. Un cebador
de de oligonucleótidos que lleva la secuencia mutada deseada se
prepara, en general de manera sintética. Este cebador después se
hibrida con el vector de una sola cadena, y se sometió a las
enzimas de polimerización de ADN tal como el fragmento Klenow de la
polimerasa I de E. coli con el fin de completar la síntesis
de la hebra que lleva la mutación. De este modo, se forma un dúplex
heterogéneo en el que una hebra codifica la secuencia no mutada
original y la segunda hebra lleva la mutación deseada. Este vector
dúplex heterogéneo después se usa para transformar o transfectar
células apropiadas, tales como células de maíz, y las células se
seleccionan para que incluyan vectores recombinantes que llevan la
disposición de secuencias mutadas. Se concibe un esquema de
selección genética por Kunkel et al, (1987) para enriquecer
los clones que incorporan el oligonucleótido mutagénico. Como
alternativa, el uso de PCR ^{TM} con enzimas termoestables
comercialmente disponibles tales como la Tag polimerasa se
pueden usar para incorporar un cebador de oligonucleótido
mutagénico en un fragmento de ADN amplificado que después se puede
clonar en un vector de clonación o expresión apropiados. Los
procedimientos de mutagénesis mediados por PCR ^{TM} de Tomic
et al., (1990) y Upender et al., (1995) proporcionan
dos ejemplos de tales protocolos. Una PCR ^{TM} que emplea una
ligasa termoestable además de una polimerasa termoestable también
se puede usar para incorporar un oligonucleótido mutagénico
fosforilado en un fragmento de ADN amplificado que después se puede
clonar en un vector de clonación o expresión apropiado. El
procedimiento de mutagénesis descrito por Michael (1994) proporciona
un ejemplo de tal
protocolo.
protocolo.
La preparación de las variantes de secuencias de
los segmentos de ADN que codifican el promotor seleccionado que usa
mutagénesis dirigida al sitio se proporciona como un medio de
producción de especies potencialmente útiles y no significa que sea
limitante ya que existen otras formas en las que se pueden obtener
las variantes de secuencia de las secuencias de ADN. Por ejemplo,
los vectores recombinantes que codifican la secuencia de promotor
deseada se puede tratar con agentes mutagénicos, tales como
hidoxilamina, para obtener las variantes de secuencias.
Como se usa en el presente documento, el término
"procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio" se refiere a
procedimientos dependientes del molde y propagación mediada por el
vector que da como resultado un incremento de la concentración de
una molécula de ácido nucleico específica con relación a su
concentración inicial, o un incremento en la concentración de una
señal detectable, tal como amplificación. Como se usa en el presente
documento el término "procedimiento de mutagénesis dirigida al
oligonucleótido" también se pretende que se refiera a un
procedimiento que implica la extensión dependiente del molde de una
molécula de cebador. El término procedimiento dependiente del molde
se refiere la síntesis de ácido nucleico de una molécula de ARN o
ADN en la que la secuencia de la hebra sintetizada recientemente
del ácido nucleico se dicta mediante las reglas bien conocidas del
apareamiento de bases complementarias (véase, por ejemplo, Watson y
Ramstad, 1987). Típicamente, las metodologías mediadas por vector
implican la introducción del fragmento de ácido nucleico en un
vector de ADN o ARN, la amplificación clonal del vector, y la
recuperación del fragmento de ácido nucleico amplificado. Los
ejemplos de tales metodologías se proporcionan por la patente de
Estados Unidos Nº 4.237.224. Están disponibles numerosas
procedimientos dependientes del molde para amplificar las secuencias
diana de interés presentes en una muestra, tales procedimientos se
conocen bien en la técnica y se describen en el presente documento
a continuación más adelante.
Existen muchos procedimientos para
transformación de segmentos de ADN en células, pero no todas son
adecuadas para la distribución de ADN a las células de plantas. Los
procedimientos adecuados para uso en la presente invención se cree
que incluyen de manera virtual cualquier procedimiento mediante el
que el ADN se puede introducir en una célula, tal como mediante la
distribución directa de ADN tal como mediante la transformación
mediada por PEG de protoplastos (Omirurulleh et al., 1993),
mediante la captación de ADN mediada por desecación/inhibición
(Potrykus et al., 1985), mediante electroporación (patente de
Estados Unidos nº 5.384.253), mediante agitación con fibras de
carburo de silicio (Kaeppler et al., 1990, patente de Estados
Unidos Nº 5.307.523, y la patente de Estados Unidos Nº 5.464.765,
mediante la transformación mediada por Agrobacterium (patente
de Estados Unidos Nº 5.591.616 y la patente de Estados Unidos Nº
5.562.055, y mediante la aceleración de partículas revestidas de
ADN (patente de Estados Unidos Nº 5.550.318; patente de Estados
Unidos Nº 5.538.877; y la patente de Estados Unidos Nº 5.538.880,
etc. Por medio la aplicación de las técnicas tales como éstas, las
células de maíz así como las de virtualmente cualquier especie
vegetal se puede transformar de manera estable, y estas células
desarrolladas en plantas transgénicas. En ciertas realizaciones, los
procedimientos de aceleración se prefieren e incluyen, por ejemplo,
bombardeo de microproyectiles y similares.
Cuando se desea introducir ADN por medio de
electroporación, se contempla que el procedimiento de Kryzek et
al., (patente de Estados Unidos Nº 5.384.253) será
particularmente ventajoso. En este procedimiento, ciertas enzimas
que degradan las paredes, tales como enzimas que degradan pectina,
se emplean para hacer las células receptoras más susceptibles a la
transformación mediante la electroporación que las células no
tratadas. Como alternativa, las células receptoras son más
susceptibles a la transformación por golpes mecánicos.
Para efectuar la transformación mediante
electroporación, se puede emplear o bien tejidos que pueden
desintegrar, tales como cultivo en suspensión de células o callo
embrionario o como alternativa se pueden transformar embriones
inmaduros u otro tejido organizado directamente. En esta técnica, se
pueden degradar parcialmente las paredes celulares de las células
mediante su exposición a las enzimas que degradan pectinas
(pectoliasas) o por golpeo mecánico de una manera controlada. Los
ejemplos de algunas especies que se han transformado por
electroporación de células intactas incluyen maíz (patente de
Estados Unidos Nº 5.384.253; D'Halluin et al., 1992; Rhodes
et al., 1995), trigo (Zhoun et al., 1993), tomate (Hou
y Lin, 1996), soja (Christou et al., 1987), y tabaco (Lee
et al., 1989).
También se pueden empelar protoplastos para la
transformación por electroporación de planta (Bates, 1994; Lazzeri,
1995). Por ejemplo, la generación de plantas de soja transgénicas de
protoplastos derivados de cotiledón está descrita por Dhir y
Widholm en la publicación de solicitud de patente internacional nº
WO 9217598. Otros ejemplos de especies para los que se han descrito
transformación de protoplastos que se han descrito incluyen, cebada
(Lazzerri, 1995), sorgo (Battraw et al., 1991), maíz
(Bhattacharjee et al., 1997), trigo (He et al.,
1994), tomate (Tsukada, 1998), y soja (Dhir et al.,
1992).
Un procedimiento preferido para la distribución
de los segmentos de ADN de transformación a las células vegetales
de acuerdo con la invención es bombardeo de microproyectiles
(patente de Estados Unidos Nº 5.550.318; patente de Estados Unidos
Nº 5.538.880; patente de Estados Unidos Nº 5.610.042, y solicitud
PCT WO 94/09699). En este procedimiento, se pueden revestir las
partículas con ácidos nucleicos y distribuirse en las células
mediante una fuerza de propulsión. Las partículas ejemplares
incluyen las que comprenden tungsteno, platino, y preferiblemente,
oro. Se contempla que en algunos casos la precipitación de ADN en
las partículas metálicas no serían necesarias para la distribución
de ADN a una célula receptora que usa bombardeo de
microproyectiles. Sin embargo, se contempla que las partículas
pueden contener ADN en lugar de estar revestidas con ADN. Por lo
tanto, se propone que las partículas revestidas con ADN pueden
incrementar el nivel de distribución de ADN mediante bombardeo de
partículas pero no son necesarios por ellos mismos.
Una realización ilustrativa de un procedimiento
para la distribución de ADN en células de maíz mediante aceleración
en el Sistema de Distribución de Partículas Biolistic, que se puede
usar para la propulsión de partículas revestidas con ADN o células
a través de un filtro, tal como un filtro de acero inoxidable o
Nytex en una superficie de filtro cubierta con células de plantas
monocotiledóneas cultivadas en suspensión. Este filtro dispersa las
partículas de manera que no se distribuyen a las células receptoras
en grandes agregados. Se cree que un filtro que interviene entre el
aparato proyectil y las células que se van a bombardear reduce el
tamaño de los agregados de proyectiles y puede contribuir a una
mayor frecuencia de transformación reduciendo el daño infringido a
las células receptoras mediante los proyectiles que no son demasiado
grandes.
Las técnicas de bombardeo de microproyectiles se
pueden aplicar de manera amplia, y se pueden usar para transformar
de manera virtual cualquier especie vegetal. Los ejemplos de
especies para los que se han transformado por bombardeo de
microproyectiles incluyen las especies de plantas monocotiledóneas
tales como maíz (Solicitud PCT WO 95/06128), cebada (Ritala et
al., Hensgens et al., 1993), trigo (patente de Estados
Unidos Nº 5.563.055, arroz (Hensgens et al., 1993), avena
(Torber et al.,1995; Torber et al.,1998), arroz
(Hensgens et al., 1993), azúcar de caña (Bower et
al., 1992), y sorgo (Casa et al, 1993; Hagio et
al., 1991), así como un número de plantas dicotiledóneas que
incluyen tabaco (Tomes et al., 1990; Buising y Benbow,
1994), soja (patente de Estados Unidos Nº 5.322.783), girasol
(Knittel et al., 1994), cacahuete (Singsit et al.,
1997), algodón (McCabe y Martinell, 1993), tomate (VanEck et
al., 1995), y legumbres en general (patente de Estados Unidos Nº
5.563.055).
Para el bombardeo, las células en suspensión se
concentran sobre filtros o medio de cultivo sólido. Como
alternativa, embriones inmaduros u otras células diana se pueden
disponer sobre medio de cultivo sólido. Las células a bombardear se
posicionan a una distancia apropiada debajo de la placa de parada de
macroproyectiles. Si se desea, uno o más de los filtros se pueden
posicionar entre el dispositivo de aceleración y las células, a
bombardear.
La transferencia mediada por
Agrobacterium es un sistema aplicable de manera amplia para
introducir genes en células vegetales debido a que el ADN se puede
introducir en tejidos de plantas enteros, por lo tanto derivando la
necesidad de regeneración de una planta intacta de un protoplasto.
El uso de vectores de integración de plantas mediado por
Agrobacterium para introducir ADN en las células vegetales se
conoce bien en la técnica. Véase, por ejemplo, los procedimientos
descritos por Fraley et al, (1985), Roger et al.,
(1987)y la patente de Estados Unidos nº 5.563.055).
La transformación mediada por
Agrobacterium es más eficaz en las plantas dicotiledóneas el
procedimiento preferible para la transformación de plantas
dicotiledóneas, que incluyen Arabidopsis, tabaco, tomate, y
patata. De hecho, aunque la transformación mediada por
Agrobacterium se ha usado de manera rutinaria con plantas
dicotiledóneas durante numerosos años, solamente ha llegado a ser
recientemente aplicable a plantas monocotiledóneas. Ahora se han
preparado las técnicas de transformación mediada por
Agrobacterium que son aplicables en casi todas las plantas
monocotiledóneas. Por ejemplo, las técnicas de transformación
mediada por Agrobacterium se aplica ahora a arroz (Hiei
et al., 1997; Zhang et al., 1997; patente de Estados
Unidos Nº 5.591.616), trigo (McCormac et al., 1998), cebada
(Tingay et al., 1997; McCormac et al., 1998), y maíz
(Ishidia et al., 1996).
Los vectores de transformación de
Agrobacterium son capaces de replicación en E. coli
así como en Agrobacterium, permitiendo las manipulaciones
convenientes como se describe en (Klee et al., 1985). Además
los recientes avances en tecnología en vectores para la
transferencia de genes mediadas por Agrobacterium han
mejorado la disposición de genes y sistios de restricción en los
vectores para facilitar la construcción de vectores capaces de
expresar diversos genes que codifican polipéptidos. Los vectores
descritos (Rogers et al., 1987) tienen regiones de múltiples
engarces convenientes flanqueados por un promotor y un sitio de
poliadenilación para la expresión directa de genes que codifican
polipéptidos insertados y son adecuados para los presentes
propósitos. Además, el Agrobacterium que contiene genes Ti
tanto armados como desarmados se pueden usar para las
transformaciones. En aquellas cepas de plantas donde es eficaz la
transformación mediada por Agrobacterium, es el
procedimiento de elección debido a la naturaleza fácil y definida de
la transferencia del gen.
La transformación de los protoplastos vegetales
se puede logar usando procedimientos basados en la precipitación
con fosfato de calcio, tratamiento con polietilen glicol,
electroporación, y las combinaciones de estos tratamientos (véase
por ejemplo, Portrikus et al., 1985; Lorz et al.,
1985; Omirulleh et al., 1993; Fromm et al., 1986,
Uchimiya et al., 1986; Callis et al., 1987, Marcotte
et al., 1988).
La aplicación de estos sistemas a diferentes
cepas de plantas depende de la capacidad de regenerar la cepa de
planta particular de los protoplastos. Se han descrito los
procedimientos ilustrativos para la regeneración de cereales a
partir de protoplastos (Fujimara et al., 1985; Toriyama et
al., 1986; Yamada et al., 1986; Abdullah et al.,
1986; Omirulleh et al., 1993 y la patente de Estados Unidos
Nº 5.508.184). Los ejemplos del uso de de la transformación de la
captación directa de protoplastos de cereales incluyen la
transformación de arroz (Ghost - Biswas et al., 1994), sorgo
(Battraw y Hall, 1991), cebada (Lazerri, 1995), avena (Zheng y
Edwards, 1990) y maíz (Omirulleh et al., 1993).
Para transformar las cepas de plantas que no se
pueden regenerar de manera exitosa a partir de protoplastos, se
pueden utilizar otras formas de introducir ADN en las células o
tejidos intactos. Por ejemplo, se puede efectuar la regeneración
de cereales a partir de embriones inmaduros o explantes como se
describe en (Vasil, 1989). También, se puede usar transformación
mediada por fibra de carburo de silicio con o sin protoplastina
(Kaeppler, 1990; Kaeppler et al., 1992; patente de Estados
Unidos nº 5.563.055). La transformación con esta técnica se lleva a
cabo mediante la agitación de las fibras de carburo de silicio
conjuntamente con las células en una solución de ADN. El ADN de
manera pasiva entra a medida que la célula se perfora. Esta técnica
se ha usado de manera exitosa con, por ejemplo, el maíz de los
cereales de plantas monocotiledóneas)Solicitud PCT WO
95/06128; Thompson, 1995) y arroz (Nagatani, 1997).
Para la transformación por bombardeo por
microproyectiles de acuerdo con la presente invención se pueden
optimizar tanto los parámetros físicos como biológicos. Los
factores físicos son aquellos que implican la manipulación del
precipitado de ADN/microproyectil o los que afectan la trayectoria y
velocidad de tanto los macro- o microproyectiles. Los factores
biológicos incluyen todas las etapas implicados en la manipulación
de las células antes e inmediatamente antes después del bombardeo,
tal como el ajuste osmótico de las células diana para ayudar a
aliviar el trauma asociado a bombardeo, la orientación de un embrión
inmadura u otro tejido diana con relación a la trayectoria de las
partículas, y también la naturaleza del ADN de transformación, tal
como ADN linealizado o plásmidos superenrollados intactos. Se cree
que las manipulaciones antes del bombardeo son especialmente
importantes para la transformación exitosa de los embriones
inmaduros.
De acuerdo con lo anterior se contempla que se
puede desear ajustar diversos parámetros de bombardeo a pequeña
escala para optimizar completamente las condiciones. Se puede desear
particularmente ajustar los parámetros físicos tales como
concentración de ADN, distancia de hueco, distancia de trayectoria,
distancia de tejido, y presión de helio. Si además se contempla que
la calidad de helio puede efectuar la transformación eficaz. Por
ejemplo diferencias en eficiencias de transformación pueden mostrar
entre los bombardeos que usan helio de calidad industrial (99,99%
puro) o helio ultra puro (99,999%), aunque no está actualmente claro
que sea más ventajoso para uso en bombardeos. También se pueden
optimizar los factores de reducción de trauma (TRF) modificando
las condiciones que influencian el estado fisiológico de las células
receptoras y que por lo tanto pueden influir en las eficacias de
transformación e integración. Por ejemplo, el estado somático,
hidratación de tejido y la fase de subcultivo o ciclo celular de
las células receptoras se puede ajustar para una transformación
óptima.
Tanto los parámetros físicos como biológicos se
pueden dirigir para la optimización adicional de la transformación
balística. Los factores físicos son aquellos que implican la
manipulación del precipitado de ADN/microproyectil o aquellos que
afectan las trayectorias y velocidad de o bien los macro- o
microproyectiles. Los factores biológicos incluyen todas las etapas
implicadas en la manipulación de células inmediatamente antes y
después del bombardeo. Las condiciones de cultivo del bombardeo
previo, tales como ambiente osmótico, parámetros de bombardeo, y la
configuración de plásmido se han ajustado para producir los números
máximos de los transformantes estables.
El encaje variable (macro soporte) se pude
ajustar para variar la distancia entre el disco de ruptura y el
macroproyectil, es decir, la distancia de hueco. Esta distancia se
puede variar entre 0 y 2 cm. Los efectos predichos de un hueco más
corto son un incremento de velocidad de tanto los macro- como
microproyectiles, una incremento de onda de choque (que conduce a la
interferencia de tejidos e incremento del trauma en tejidos), y una
penetración más profunda de microproyectiles. Las distancias de
hueco más largas tendrían efectos opuestos pero pueden incrementar
la viabilidad y por lo tanto el número total de transformantes
estables recuperados
El encaje fijado (contenido dentro del encaje
variable) se puede variar entre 0,5 y 2,25 cm en incrementos de 0,5
cm mediante la colocación de anillos espaciadores para ajustar la
ruta de la trayectoria que atraviesa el macroproyectil. Las rutas
de trayectoria corta permiten una mayor estabilidad del
microproyectil en la trayectoria pero reduce la velocidad global de
los microproyectiles. El incremento de estabilidad en la
trayectoria incrementa, por ejemplo, el número de focos GUS
centrados. Las mayores distancias de trayectoria (hasta algún
punto) incrementan la velocidad pero también se incrementa la
inestabilidad en la trayectoria. Basándose en la observaciones, se
recomienda que los bombardeos típicamente se hacen con una longitud
de la ruta en la trayectoria de aproximadamente 1,0 cm y 1,5 cm.
La colocación de tejidos dentro de la cámara del
disparo pueden tener efectos significativos en la penetración de
microproyectiles. El incremento de la ruta de trayectoria de los
microproyectiles disminuirán la velocidad y trauma asociado con la
onda de choque. Una disminución en la velocidad también dará como
resultado la penetración menos profunda de los
microproyectiles.
Mediante la manipulación del tipo y número de
los discos de ruptura, la presión se puede variar entre 400 psi
(2757,9 kPa) y 2000 psi (13790 kPa) dentro del tubo de aceleración
de gas. La presión óptima para la transformación estable se ha
determinado que está entre 1000 psi (6894,8 kPa) y 1200 psi (8273,7
kPa).
Para el bombardeo de microproyectiles, se podrá
unir (por ejemplo "revestimiento") ADN a los microproyectiles
de manera que se distribuye a células receptoras en una forma
adecuada para su transformación. A este respecto, al menos alguno
de los ADN de transformación debe estar disponible para la célula
diana para que se produzca la transformación, mientras que al mismo
tiempo durante la distribución del ADN se debe unir al
microproyectil. Por lo tanto, la disponibilidad del ADN de
transformación del microproyectil puede comprender la inversión
física de enlaces entre el ADN de transformación y el microproyectil
después de la distribución del microproyectil a la célula diana.
Esto no es necesario que sea el caso, como disponibilidad para que
una célula diana se pueda producir como resultado de la ruptura de
segmentos no unidos de ADN o de otras moléculas que comprenden la
unión física al microproyectil. La disponibilidad se puede además
producir como resultado de enlaces entre el ADN de transformación
y otras moléculas, que están o bien unidas directamente o
indirectamente al microproyectil. Además se contempla que la
transformación de una célula diana se puede producir mediante la
recombinación directa entre el ADN de transformación y el ADN
genómico de la célula receptora. Por lo tanto como se usa en el
presente documento, un microproyectil "revestido" será uno que
sea capaz de usarse para transformar una célula diana, en la que el
ADN de transformación se distribuirá a la célula diana, incluso
será accesible para la célula diana de manera que se puede producir
la transformación.
Se puede usar cualquier técnica para crear
microproyectiles que permiten la distribución de ADN de
transformación a las células diana. Los procedimientos para el
revestimiento de microproyectiles que se han demostrado que
funcionan bien con la invención actual se han descrito
específicamente en el presente documento. El ADN se puede unir a
partículas de microproyectiles que usan técnicas alternativas, sin
embargo. Por ejemplo, las partículas se pueden revestir con
estreptavidina y ADN y con cadenas de nucleótidos biotinilados que
se pueden escindir con tiol de larga cadena. El ADN se adhiere a
las partículas debido a la interacción de estreptavidina -
biotina, pero se libera en la célula mediante la reducción del
enlace tiol mediante la reducción de los agentes presentes en la
célula.
Como alternativa, las partículas se pueden
preparar en la funcionalización de la superficie de una partícula
de óxido de oro, que proporcionan grupos amina libres. El ADN, una
carga fuerte negativa, se une a las partículas funcionarizadas.
Además, las partículas cargadas se pueden depositar en las
disposiciones controladas sobre la superficie de discos de
trayectoria mylar usados en el dispositivo PDS- 1000 Biolistics,
facilitando por lo tanto la distribución controlada de las
partículas distribuidas al tejido diana.
Como se ha descrito anteriormente, además se
proporciona que la concentración de ADN usada para revestir
microproyectiles pueden influir en la recuperación de los
transformantes que contienen una sola copia del transgen. Por
ejemplo, una menor concentración de ADN puede no necesariamente
cambiar la eficacia de la transformación, pero en su lugar puede
incrementar la proporción de episodios de inserción de una sola
copia. A este respecto, aproximadamente entre 1 ng y 2000 de ADN de
transformación se puede usar por cada 1,8 mg de microproyectiles de
partida. En otras realizaciones de la invención, aproximadamente
entre 2,5 ng y 1000 ng, entre 2,5 ng y 750 ng, entre 2,5 ng y 500
ng, entre 2,5 ng y 2750 ng, entre 2,5 ng y 100 ng, o entre 2,5 ng
y 50 ng de ADN de transformación se puede usar por cada 1,8 mg de
los microproyectiles de partida.
También se pueden usar diversos procedimientos
para incrementar la eficacia de transformación y/o incremento de la
proporción relativa de los episodios de transformación de baja
copia. Por ejemplo, los inventores contemplan el ADN de
transformación de modificación final con la fosfatasa alcalina o un
agente que terminará el ADN romo antes de la transformación.
Incluso además un ADN vehículo inerte se puede incluir con el ADN de
transformación, por lo tanto reduciendo la concentración de ADN
de transformación sin la reducción de la cantidad global usada.
Estas técnicas se describen además en solicitud de la patente de
Estados Unidos Nº de serie 08/995.451, presentad el 22 de diciembre
de 1997.
Las condiciones de cultivo y otros factores
puede influir en el estado fisiológico de las células diana y
pueden tener profundos efectos en las eficacias de transformación e
integración. Primero, el acto de bombardeo puede estimular la
producción de etileno que podría conducir al envejecimiento del
tejido. La adición de compuestos antietileno pueden incrementar las
eficacias de transformación. Segundo, se propone que ciertos puntos
en el ciclo celular pueden ser más apropiados para la integración
del ADN introducido. Por lo tanto, la sincronización de los
productos celulares pueden potenciar la frecuencia de producción de
transformantes. Por ejemplo, se puede lograr la sincronización
usando tratamiento por frío, reducción del alimento de aminoácidos,
u otros agentes que detienen el ciclo celular. Tercero, el grado de
hidratación de tejidos también puede contribuir a la cantidad de
trauma asociado al bombardeo así como la capacidad de los
microproyectiles para penetrar las paredes celulares.
La posición y orientación de un embrión u otro
tejido diana con relación a la trayectoria de la partícula también
puede ser importante. Por ejemplo el dispositivo biolistics
PDS-1000 no produce una difusión uniforme de las
partículas sobre la superficie de una placa petri diana. La
velocidad las partículas en el centro de la placa es mayor que la
velocidad de las partículas a distancias más lejanas del centro de
la placa petri. Por lo tanto, es ventajoso estimular el tejido
diana en la placa petri de manera que se evite el centro de la
placa, denominada por algunos como la "zona de muerte".
Además, la orientación del tejido diana con relación a la
trayectoria de las dianas también puede ser importante. Se contempla
que es deseable orientar el tejido lo más probablemente para
regenerar una planta hacia la corriente de las partículas. Por
ejemplo el escutelo de un embrión inmaduro comprende las células
del mayor potencial embriogénico y por lo tanto se debe orientar
hacia la corriente de las partículas.
También se ha reseñado que las células de
levaduras ligeramente lisadas el plasma permiten incrementar las
eficacias de transformación (Armaleo et al., 1990). Se ha
propuesto la hipótesis que el estado osmótico alterado de las
células ayudaba a reducir el trauma asociado a la penetración de los
microproyectiles. De manera adicional, la fase del crecimiento y
ciclo celular puede ser importante con relación a la
transformación.
Se ha sugerido que el tratamiento previo
osmótico puede reducir de manera potencial la lesión asociada a
bombardeo como resultado de la reducción de la presión de turgencia
de la célula lisada el plasma. En un estudio previo, el número de
células que expresa de manera transitoria GUS se incrementó después
del subcultivo tanto en medio reciente como en medio ajustado de
manera osmótica (solicitud PCT WO 95/06128. Los tiempos de
tratamiento de 90 minu mostraron mayores números de focos que
expresan GUS que los tiempos más cortos. Las células incubadas en
medio 500 mOSM/Kg durante 90 minutos mostró un incremento de
aproximadamente 3,5 veces más en focos transitorios GUS que el
control. Preferiblemente, los embriones inmaduros se cultivan
previamente durante 4 - 5 horas antes del bombardeo en medio de
cultivo que contiene sacarosa al 12%. Un segundo cultivo en
sacarosa al 12% se realiza durante 16 - 24 horas después del
bombardeo. Como alternativa, las células de tipo II se tratan
previamente sobre manitol 0,2 M durante 3 - 4 horas antes del
bombardeo. Se contempla que el tratamiento previo de clas células
con otros solutos activos de manera osmótica durante un período de
1 - 6 horas también puede ser deseable.
En algunos casos, será deseable administrar ADN
a células de maíz que no contienen secuencias de ADN necesarias
para el mantenimiento en el vector plásmido en el huésped
bacteriano, por ejemplo, E. coli; tales como genes
resistentes a antibióticos, que incluye, pero no se limita a
resistencia a amplicilina, kanamicina, y tetraciclina, los orígenes
procarióticos de la replicación de ADN. En tales casos, un fragmento
de ADN que contiene el ADN de transformación se puede purificar
antes de la transformación. Un procedimiento ejemplar de
purificación es la electroforesis en gel sobre un gel de agarosa de
temperatura de fusión por debajo de 1,2%, seguido de la
recuperación a partir del gel de agarosa mediante la fusión de
sílices de gel en un exceso de 6 - 10 veces de tampón Tris - EDTA
(Tris - HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM, 70ºC - 72ºC), congelación y
descongelación (37ºC); sedimentar la agarosa por centrifugación.
Después se puede usar una columna Quiagen Q-100
para la purificación del ADN. Para la recuperación eficaz del ADN se
puede ajustar el flujo de la columna a 40 ml/hora.
Los fragmentos de ADN aislados de ADN se pueden
recuperar a partir de los ges de agarosa usando una diversidad de
técnicas de electroelución, digestión por enzimas de la agarosa o
unión de ADN a cabeceras de vidrio (por ejemplo, Gene Clean. Además
también se puede usar HPLC y/o uso de partículas magnéticas para
aislar los fragmentos de ADN. Como alternativa para el aislamiento
de los fragmentos de ADN, se puede digerir un vector plásmido con
una enzima de restricción y este fragmento de ADN se distribuye a
células de maíz sin purificación previa del fragmento del módulo de
expresión.
El cultivo de tejido requiere medios y ambientes
controlados. "Medios" se refiere a las numerosas mezclas de
nutrientes que se usan para desarrollar células in vitro,
que está, fuera del organismo vivo intacto. El medio usualmente es
una suspensión de diversas categorías de ingredientes (sales,
aminoácidos, reguladores de crecimiento, azúcares, tampones) que se
requieren para el desarrollo de la mayoría de los tipos de células.
Sin embargo, cada tipo de célula específico requiere un intervalo
específico de proporciones de ingredientes para el desarrollo, e
incluso un intervalo más específico de fórmulas para el desarrollo
óptimo. La velocidad del desarrollo celular también variará entre
cultivos iniciados con la disposición de medios que permiten el
desarrollo de ese tipo de células.
Los medios nutrientes se preparan en forma de un
líquido, pero se puede solidificar mediante la adición líquido a
materiales capaces de proporcionar un soporte sólido. El agar es el
más comúnmente usado para este propósito. Bactoagar, agar Hazelton,
Gelrite, y Gelgro son tipos específicos de soporte sólido que son
adecuados para el desarrollo de células vegetales en el cultivo de
tejidos.
Algunos tipos de células se desarrollarán y
dividirán o bien en suspensión líquida o en medios sólidos. Como se
ha descrito en el presente documento, las células de maíz se
desarrollarán en suspensión o sobre un medio sólido, mediante la
regeneración de plantas a partir de los cultivos en suspensión
requiere la transferencia de medios líquidos a sólidos en algún
momento del desarrollo. El tipo y grado de la diferenciación de las
células en cultivo estará afectada no solamente por el tipo de medio
usado y por el ambiente, por ejemplo, pH, pero también si el medio
es sólido o líquido. La Tabla 2 ilustra la composición de diversos
medios útiles para la creación de células receptoras y para la
regeneración vegetal.
Las dianas de las células receptoras incluyen,
pero no se limitan a, células de meristemo, que incluye en ápice de
la raíz (patente de Estados Unidos Nº 5.736.369), callo de Tipo I,
Tipo II y Tipo III, embriones inmaduros, y células de gametos tales
como microesporas, polen, esperma y células de huevos. Se contempla
que cualquier célula a partir de las cuales se puede regenerar una
planta fértil es útil como una célula receptora. El callo de Tipo
I, Tipo II y Tipo III se puede iniciar a partir fuentes de tejidos
que incluyen, pero no se limitan a, embriones inmaduros, meristemos
aplicales de plantas de semillero, microesporas y similares.
Aquellas células que son capaces de proliferar como callo son
también células receptoras para la transformación genética. La
presente invención proporciona técnicas para la transformación de
embriones inmaduros y la regeneración posterior de plantas
transgénicas fértiles. La transformación de embriones inmaduros
obvia la necesidad del desarrollo a largo plazo de los cultivos de
células receptoras. Polen, así como sus células precursoras,
microesporas, pueden ser capaces de de funcionar como células
receptoras para la transformación genética, o como vectores que
llevan el ADN foráneo para la incorporación durante la
fertilización. La transformación del polen directa obvia la
necesidad de cultivo de células. Las células de meristemo (es decir,
células vegetales capaces de la división celular continuada y se
caracteriza por la aparición citológica no diferenciada, que
normalmente se encuentra en los puntos de crecimiento o tejidos en
las plantas tales como puntas de raíz, ápices del tallo, brotes
laterales, etc) pueden representar otro tipo de célula vegetal
receptora. Debido a su crecimiento no diferenciado y capacidad de
diferenciación y totipotencia de órganos, se puede recuperar una
sola célula de meristemo transformada como una planta total
transformada. De hecho, se propone que los cultivos embriogénicos
en suspensión pueden estar en un sistema de células de meristemos
in vitro, que retienen una capacidad para la división
celular continuada en un estado no diferenciado, controlado por el
ambiente del medio.
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Las células vegetales cultivadas que pueden
servir como células receptoras para la transformación con los
segmentos de ADN deseados pueden ser cualesquiera células vegetales
que incluyen células de maíz, y más específicamente, células de
Zea mays L. Las células somáticas son de diversos tipos. Las
células embriogénicas son un ejemplo de células somáticas que se
pueden inducir para regenerar una planta a través de la formación de
embrión. Las células no embriogénicas son las que típicamente son
ciertas células de maíz Dulce Mejicano Negro (BMS).
El desarrollo de los callos de maíz
embriogénicos y cultivos de suspensión útiles en el contexto de la
presente invención, por ejemplo, como células receptoras para la
transformación, de ha descrito en la patente de Estados Unidos nº
5.134.074; y la patente de Estados Unidos nº 5.489.520.
Se pueden usar ciertas técnicas que enriquecen
células receptoras dentro de una población de células. Por ejemplo,
el desarrollo de callo del Tipo II, seguido de la selección manual y
cultivo de tejido, friable, embriogénico, en general da como
resultado un enriquecimiento de las células receptoras para uso en,
la transformación de microproyectiles. Los cultivos en suspensión,
que usan de manera particular los medios descritos en el presente
documento, puede mejorar la relación de células receptoras a no
receptoras en cualquier población dada. Las técnicas de selección
manuales que se pueden emplear para seleccionar las células
receptoras pueden incluir por ejemplo, determinación de la
morfología y diferenciación de células, o se pueden usar medios
físicos o biológicos. La crioconservación también es un
procedimiento de selección de células receptoras.
La selección manual de las células receptoras,
por ejemplo, mediante las células embriogénicas a partir de la
superficie de un callo de Tipo II, es un medio que se puede usar en
un intento de enriquecer las células receptoras antes del cultivo
(si se cultivan sobre un medio sólido o en suspensión). Las células
preferidas pueden ser aquellas localizadas en la superficie de un
grupo celular, y se puede además poder identificar por su carencia
de diferenciación, su tamaño y citoplasma denso. Las células
preferidas en general serán aquellas que están menos diferenciadas,
o todavía no están destinadas a la diferenciación. De este modo, se
puede desear identificar y seleccionar aquellas células que son
densas desde el punto de vista citoplásmico, relativamente no
vacuolazas con una relación alta de núcleo a citoplasma (por
ejemplo, determinada por las observaciones citológicas), pequeñas
en tamaño (por ejemplo, 10 - 20 \mum), y capaz de la división
sostenida y formación proembionaria somática.
Se propone que también se puedan emplear otros
medios para identificar tales células. Por ejemplo, mediante el uso
de tintes, tal como azul de Evans, que son expulsados por las
células con las membranas relativamente no permeables, tales como
células embriogénicas, y se toman por las células relativamente
diferenciadas tales como las células de tipo raíz y células de
serpiente (así llamadas debido a la apariencia de tipo
serpiente).
Otro medio posible de identificación de las
células incluyen el uso de marcadores de isozima de células
embriogénicas, tales como glutamato deshidrogenasa que se puede
detectar mediante cepas histoquímicas (Fransz et al., 1989).
Sin embargo, se debe advertir que el uso de marcadores de isozima
que incluyen la glutamato deshidrogenasa puede conducir en algún
grado de positivos falsos de células no embriogénicas tales como
células de raíz que no obstante tienen una actividad relativamente
alta metabólica.
La capacidad de preparar y criopreservar los
cultivos de células de maíz es importante para ciertos aspectos de
la presente invención, porque proporciona un medio para preparar de
manera reproducible y exitosa células para la transformación. Se
han desarrollado previamente una diversidad de tipos diferentes de
medios y se pueden emplear para llevar a cabo diversos aspectos de
la invención.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Se ha desarrollado un número de cultivos de maíz
ejemplares que se puede emplear para la transformación y se
describen en la solicitud PCT WO 95/06128.
En ciertas realizaciones de la presente
invención, se pueden seleccionar células receptoras después del
crecimiento en cultivo. Cuando se emplea, las células cultivadas se
pueden desarrollar o bien sobre soportes sólidos o en la forma de
suspensiones líquidas. En cualquier otro caso, se pueden
proporcionar nutrientes a las células en la forma de medio, y
condiciones ambientales controladas. Existen muchos tipos de medios
de cultivo que comprenden diversos aminoácidos, sales, azúcares,
reguladores de crecimiento y vitaminas. La mayoría de los medios
empleados en la práctica de la invención tendrán algunos componentes
similares (véase la tabla 2), pero pueden diferir en la composición
y proporciones de sus ingredientes dependiendo de la aplicación
particular contemplada. Por ejemplo, diverso tipos de células que
usualmente crecen en más de un tipo de medios, mostrarán diferentes
velocidades de crecimiento y diferentes morfologías, dependiendo de
los medios de crecimiento. En algunos medios, las células
sobreviven pero no se dividen.
Diversos tipos de medios adecuados para el
cultivo de células vegetales se han descrito previamente. Los
ejemplos de estos medios incluyen, pero no se limitan a, el medio N6
descrito por Chu et al (1975) y medio MS (Murashige y
Skoog, 1962). Se ha descubierto que el medio tal como MS que tiene
una alta relación de amoníaco /nitrato con contraproductivas para
la generación de las plantas receptoras ya que promueven la pérdida
de de la capacidad morfogenética. El medio N6, por otra parte
tienen una relación algo inferior de amoníaco /nitrato, y se
contempla que promueve la generación de las células receptoras
manteniendo las células en un estado proembriónico capaz de las
divisiones mantenidas.
El procedimiento de mantenimiento de los
cultivos de células puede contribuir a su utilidad como fuentes de
células receptoras para la transformación. La selección manual de
las células para la transferencia a medio de cultivo reciente, la
frecuencia de transferencia a medio de cultivo reciente, composición
de medio de cultivo, y factores ambientales que incluyen, pero no
se limitan a, calidad y cantidad de luz y temperatura son todos
factores importantes para mantener el callo y/o cultivos en
suspensión que son útiles como fuentes de células receptoras. Se
contempla la alternativa de callo entre las condiciones de cultivo
diferentes puede ser beneficioso en el enriquecimiento de las
célula receptoras en un cultivo. Por ejemplo, se propone que las
células se pueden cultivar en cultivos en suspensión, pero que se
transfieren al medio sólido a intervalos regulares. Después de un
período de crecimiento sobre medio sólido las células se pueden
seleccionar manualmente para regresar al medio de cultivo. Se
propone que mediante la repetición de esta secuencia de
transferencias al medio de cultivo reciente es posible enriquecer
células receptoras. También se contempla que el paso de los
cultivos de células a través de un tamiz de 1,9 mm es útil en el
mantenimiento de la friabilidad de de un callo o cultivo en
suspensión y puede ser beneficioso en el enriquecimiento de las
células que se pueden transformar.
La criopreservación es importante debido a que
permite que se mantenga y preserve un cultivo de células que se
puede transformar para uso futuro, mientras que se elimina los
efectos acumulativos perjudiciales asociados a los períodos de
cultivo extendidos.
Las suspensiones de células y callos se
conservan por criogenización usando modificaciones de los
procedimientos, reseñados anteriormente (Frinkle, 1985; Withers y
King, 1979). El protocolo de la conservación por criogenización
comprende la adición de una mezcla enfriada previamente (0ºC)
concentrada por etapas durante un período de una a dos horas a las
células enfriadas previamente (0ºC). El volumen de los protectores
de criogenización añadidos era igual al volumen inicial de la
suspensión celular (adición 1:1), y la concentración final de los
aditivos protegidos por criogenización era sulfóxido de dimetilo
al 10%; polietilen glicol al 10% (6000 de PM), prolina 0,23 M y
glucosa 0,23 M y glucosa 0,23 M. la mezcla se dejó que se
equilibrara a 0ºC durante 30 minutos, tiempo durante el que la
suspensión de células/protegida por criogenización se dividió en
alícuota de 1,5 ml (volumen de células empaquetadas 0,5 ml) en crio
viales de polietileno de 2 ml. Los tubos se enfriaron a
0,5ºC/minuto hasta -8ºC y se mantuvieron a esta temperatura para la
nucleación en hielo.
Una vez que se ha confirmado visualmente la
formación de hielo extracelular los tubos se enfriaron A
0,5ºC/minuto entre -8ºC y -35ºC. Se mantuvieron a esta temperatura
durante 45 minutos (para asegurar la deshidratación uniforme
inducida por congelación mediante los grupos de células).
En este punto, las células habían perdido la
mayoría de su volumen osmótico (es decir, existe poco agua libre
que quede en el interior de las células), y se podrían sumergir en
nitrógeno líquido para almacenamiento. La escasez del agua libre
remanente en las células junto con las altas velocidades de
enfriamiento rápidas desde -35ºC a -196ºC evitaban que se formaran
en las células grandes cristales de hielo organizados. Las células
se almacenan en nitrógeno líquido, que inmoviliza de manera eficaz
las células y ralentiza los procesos metabólicos hasta el punto en
el que el almacenamiento a largo plazo no fuera perjudicial.
La descongelación de la solución extracelular se
llevó a cabo retirando el tubo de criogenización del nitrógeno
líquido y agitándolo en agua estéril a 42ºC durante aproximadamente
2 minutos. El tubo se retiró del calor inmediatamente después de
que los últimos cristales de hielo se hayan fundido para evitar el
calentamiento del tejido. La suspensión de células todavía en la
mezcla protectora de criogenización) se pipeteó sobre un filtró,
quedando una capa de células BMS (la capa de alimento que
proporcionó un efecto de alimentación durante la recuperación). La
solución protectora de criogenización se retira mediante pipeteo. El
medio de cultivo comprendía un medio de proliferación de callo con
un incremento de resistencia osmótica. La dilución del protector de
criogenización se produjo lentamente a medid que los solutos se
difundían hacia fuera a través del filtró y los nutrientes se
difundían de manera ascendente hacia las células recuperadas. Una
vez que se apreció el posterior crecimiento de las células
descongeladas, se transfirió el tejido que se desarrolla al medio
de cultivo reciente. Si se deseaba el inicio de un cultivo de
suspensión, los grupos de células se volvían transferir al medio de
suspensión líquido tan pronto como se haya recuperado la suficiente
masa celular (usualmente entre 1 y 2 semanas). Como alternativa, se
cultivaron las células sobre medio de proliferación de callo sólido.
Después de que se reestableció el cultivo en líquido (entre 1 y 2
semanas adicionales), se usó para experimentos de transformación.
Cuando se desee, los cultivos conservado por criogenización
previamente se pueden congelar de nuevo para almacenamiento.
Después de efectuar la administración de ADN
exógeno a las células receptoras, las siguientes etapas en general
se refieren a la identificación de las células transformadas para el
cultivo adicional y regeneración de la planta. Como se ha
mencionado en el presente documento, con el fin de mejorar la
capacidad de identificar los transformantes, se puede desear
emplear un gen marcador que se pueda seleccionar y rastrear como, o
además de, el gen que se puede expresar de interés. En este caso,
se ensayaría en general la población de células transformada
potencialmente mediante la exposición de las célula a un agente o
agentes selectivos, o se podrían seleccionar las células para el
carácter del gen marcador deseado.
Se cree que al ADN se introduce solamente en un
pequeño porcentaje de células diana en cualquier experimento. Con
el fin de proporcionar un sistema eficaz para la identificación de
las células que reciben ADN e integrarlo en sus genomas se puede
emplear un medio para seleccionar aquellas células que se
transformen de manera estable. Una realización ejemplar de tal
procedimiento es introducir en la célula huésped, un gen marcador
que confiera resistencia a algún agente normalmente inhibidor, tal
como un antibiótico o herbicida. Los ejemplos de antibióticos que
se pueden usar incluyen los antibióticos aminoglicósidos neomicina,
kanamicina y paromomicina, o el antibiótico higromicina. Se
confiere resistencia a los antibióticos aminoglicósidos mediante
las enzimas aminoglicósitos fosfotransferasas tales como la neomicin
fosfofosfotransferasa II (NPT II) o NPT I, mientras que la
resistencia a higromicina se confiere mediante la higromicin
fosfotransferasa.
Las células potencialmente trasformadas se
exponen al agente selectivo. En la población de las células
supervivientes estarán aquellas en las que, en general, el gen que
confiere resistencia se ha integrado y expresado a niveles
suficientes para permitir la supervivencia de la célula. Las células
se pueden ensayar además para confirmar la integración estable del
ADN exógeno. Usando las técnicas descritas en el presente documento,
mayor que 40% de embriones bombardeados pueden producir
transformantes.
Un herbicida que se ha sugerido como un agente
reselección deseable es el herbicida de amplio espectro bialafos.
El bialafos es un antibiótico tripeptídico producido por
Streptomyces hygroscopicus y está compuesto por
fosfinotricin (PPT) un análogo del ácido
L-glutámico, y dos restos de
L-alanina. Tras la retirada de la
L-alanina. Tras la retirada de los restos de
L-alanina mediante las peptidasas intracelulares la
PPT se libera y es un potente inhibidor de la glutamina sintasa
(GS), una enzima central implicada en la asimilación de amoníaco y
metabolismo de nitrógeno (Ogawa et al., 1973). La PFT
sintética, el ingrediente activo en el herbicida Liberty ^{TM} es
también eficaz como un agente de selección. La inhibición de GS en
plantas por la PPT provoca la acumulación rápida de amoníaco y la
muerte de las células vegetales.
El organismo que produce bialafos y otras
especies del género Streptomyces también sintetiza una enzima
fosfinotricin acetil transferasa (PAT) que está codificada por el
gen bar en Streptomyces hygroscopicus y el gen
par en Streptomyces viridochromogenes. El uso del gen
de resistencia a herbicida que codifica la fosfinotricin acetil
transferasa (PAT) se menciona en el documento DE 3462 829 A, en el
que el gen se aísla a partir de Streptomyces
viridochromogenes. En el organismo de la fuente bacteriana, esta
enzima acetila el grupo amino libre de PPt evitando la
autotoxicidad (Thompson et al., 1987). El gen bar se
ha clonado (Murakami et al., 1986; Thompson et al.,
1987), y expresado en tabaco transgénico, tomate, patata (De Block,
1987) Brassica (De Block, 1989) y maíz (patente de
Estados Unidos nº 5.550.318). En reseñas anteriores, algunas
plantas transgénicas que expresan el den de resistencia fueron
completamente resistentes a las formulaciones comerciales de la PPT
y bialafos en
invernadero.
invernadero.
Otro ejemplo de herbicida que es útil para la
selección de líneas celulares transformadas en la práctica de la
invención es el herbicida de amplio espectro glifosato. El glifosato
inhibe la acción de la enzima EPSPS que es activa en la ruta de
biosíntesis de aminoácidos aromáticos. La inhibición de esta enzima
conduce a la privación de los aminoácidos fenilalanina, tirosina,
y triptófano y los metabolitos secundarios derivados de los mismos.
La patente de estados unidos Nº.535.060 describe el aislamiento de
las mutaciones de la EPSPS que confiere resistencia a glifosato en
el gen de Salmonella typhimurium para EPSPS, aroA. El gen
EPSPS se clonó a partir de Zea mays y las mutaciones
similares a las encontradas en un gen aroA resistente a glifosato
se introdujeron in vitro. Los genes mutantes que codifican
las enzimas EPSPS a glifosato se describen en, por ejemplo, la
patente internacional WO 97/4103. El gen de EPSPS mutante mejor
caracterizado que confiere resistencia a glifosato comprende
cambios de aminoácidos en los restos 102 y 106, aunque se anticipa
que también serán útiles otras mutaciones (documento
PCT/WO97/41103).
Para usar el sistema selectivo
bar-bialafos o el EPSPS-glifosato, se cultiva
tejido bombardeado durante 0 - 28 días en medio no selectivo y
posteriormente se transfiere a un medio que contiene entre 1 - 3
mg/l de bialafos o glifosato 1 - 3 mM según sea apropiado. Aunque
los intervalos de 1 - 3 mg/l de bialafos o glifosato 1 - 3 mM
serán los preferidos, se propone que los intervalos de 0,1 - 50 mg/l
de bialafos o glifosato 0,1 - 50 mM serán de utilidad en al
práctica de la invención mM. El tejido se pueden colocar en
cualquier soporte poroso, inerte, sólido o semisólido para el
bombardeo, que incluyen pero no se limitan a filtros y medio de
cultivo sólido. Bialafos y glifosato se proporcionan como ejemplos
de agentes adecuados para la selección de transformantes, pro la
técnica de esta invención no se limita a ellos.
Además se contempla que el herbicida DALAPON,
ácido 2,2- dicloropropiónico, puede ser útil para la identificación
de células transformadas. La enzima ácido
2,2-dicloropropiónico deshalogenasa (deh)
inactiva la actividad herbicida del ácido
2,2-dicloropropiónico y por lo tanto confiere
resistencia a herbicida sobre las células o plantas que expresan un
gen que codifica la enzima deshalogenasa (Buchanan - Wollaston et
al., 1992; solicitud PCT WO 95/06128; patente de Estados Unidos
nº 5.508.468; patente de Estados Unidos 5.508.468.
Como alternativa, un gen que codifica una
antranilato sintasa gen que confiere resistencia a ciertos análogos
de de aminoácidos, por ejemplo, 5-metiltrptófano o
6-metilantranilato, puede ser útil como un gen
marcador. El uso de un gen de antranilato sintasa como un marcador
que se puede seleccionar se describió en la patente de Estados
Unidos nº 5.508.468; y la solicitud de la patente de Estados Unidos
nº 08/604.789.
Un ejemplo de un carácter marcador que se puede
rastrear es el pigmento rojo producido bajo el control del locus R
en maíz. Este pigmento se puede detectar cultivando las células en
un soporte sólido que contiene medio nutriente capaz de soportar el
crecimiento en esta fase y seleccionar las células a partir de las
colonias que están pigmentadas (agregados visibles de células).
Estas células se pueden cultivar además, o bien en suspensión o en
un medio sólido. El locus R es útil para la selección de
transformantes a partir de embriones inmaduros de bombardeo. De una
manera similar, al introducción de los genes C1 y B da como
resultado células pigmentadas y/o tejidos.
La enzima luciferasa se puede usar como un
marcador que se puede rastrear en el conetexto de la presente
invención. En la presencia del sustrato luciferina, las células que
expresan la luciferaza emiten luz que se puede detectar sobre una
película fotográfica o de rayos X, en un luminómetro (o contador de
centelleo líquido), mediante dispositivos que potencian la visión
nocturna, o mediante una cámara de vídeo altamente sensible a la
luz, tal como una cámara que cuenta fotones. Todos estos ensayos
son no destructivos y las células transformadas se pueden cultivar
además después de la identificación. La cámara que cuenta fotones es
especialmente valiosa ya que permite que se identifiquen células
específicas o grupos de células que expresan luciferasa y las
manipulan en tiempo real. Otros marcadores que se pueden rastrear
que se puede usar es el gen que codifica la proteína fluorescente
verde (Sheen et al.,
1995).
1995).
Además se contempla que las combinaciones de
marcadores que se pueden rastrear y seleccionar serán útiles para
la identificación de células transformadas. En algún tipo de célula
o tejido, un agente de selección tal como bialafos o glifosato,
puede o bien no proporcionar suficiente actividad destructora para
limpiamente reconocer las células transformadas o puede provocar
sustancial inhibición no selectiva de transformantes y no
transformantes indistintamente, provocando de esta manera que la
técnica de selección no sea eficaz. Se propone que la selección con
un compuesto de inhibición de crecimiento, tal como bialafos o
glifosato a concentraciones por debajo de las que provocan el 100%
de inhibición seguido del rastreo del tejido de crecimiento para la
expresión de un gen marcador que se puede rastrear tal como
luciferasa permitiría que se recuperaran transformantes de los
tipos de células o tejidos que no son capaces de seleccionarse
solos. Se propone que las combinaciones de selección y rastreo
puede permitir identificar transformantes en una variedad más amplia
de tipos de células y tejidos.
Las células que sobreviven a la exposición del
agente selectivo, o células que se han catalogado positivas en un
ensayo de rastreo, se puede cultivar en medio que soporta la
regeneración de las plantas. En una realización ejemplar, los
medios MS y N6 se pueden modificar (véase la Tabla 2) incluyendo
sustancias adicionales tales como reguladores de crecimiento. Un
regulador de crecimiento preferido para tales propósitos es dicamba
o 2,4- D. Sin embargo se pueden emplear otros reguladores,
incluyendo NAA, NAA + 2,4-D o quizás, incluso
picloram. La mejora de los medios de estas o formas similares se ha
encontrado que facilitan el crecimiento de las células en las fases
de desarrollo específicas. El tejido se puede mantener en un medio
básico con reguladores de crecimiento hasta que esté disponible
tejido suficiente para comenzar los esfuerzos de regeneración de
plantas, o después de rondas repetidas de selección manual, hasta
que la morfología del tejido para la regeneración, al menos 2
semanas, después se transfieren a medios que conducen a la
maduración de embrioides. Los cultivos se transfieren cada dos
semanas sobre este medio. El desarrollo de los brotes señalará el
tiempo para transferir al medio que acrece de reguladores de
crecimiento.
crecimiento.
Las células transformadas, identificadas por
selección o rastreo y cultivadas en un medio apropiado que soporta
la regeneración, se les dejará después madurar en las plantas. Las
plántulas que se desarrollan se transfieren a medio de crecimiento
de plantas sin tierra, y se endurecen, por ejemplo, en una cámara
controlada ambientalmente a aproximadamente 85% de humedad
relativa, 600 ppm de CO_{2}, 25 - 250 micoeinsteins m^{-2}
s^{-1} de luz. Las plantas preferiblemente maduran o bien en una
cámara de crecimiento o en invernadero. Las plantas se regeneran
entre aproximadamente 6 semanas y 10 meses después de que se
identifica un transformante, dependiendo del tejido inicial.
Durante la regeneración, se desarrollan las células sobre medio
sólido en recipientes de cultivo de tejidos. Las realizaciones
ilustrativas de tales recipientes son placas petri y recipientes de
plantas. Las plantas que se están regenerando preferiblemente se
desarrollan a aproximadamente 19 a 28ºC. Después de que las plantas
que se están regenerando han alcanzado la fase de desarrollo de
brote y raíz, se pueden transferir a invernadero para desarrollo
adicional y ensayo.
Sin embargo, hay que destacar, que los granos de
las plantas transformantes pueden ocasionalmente requerir rescate
de embriones debido al cese del desarrollo del grano y
envejecimiento prematuro de las plantas. Para rescatar los
embriones que se están desarrollando, se escinden de los granos
desinfectados en la superficie 10 - 20 días después de la
polinización y cultivarse. Una realización del medio usado para
cultivar en esta fase comprende sales de MS, sacarosa al 2%, y 5,5
g/l de agarosa. En el rescate de embriones, los embriones grandes
(definidos por ser mayores que 3 mm de longitud) se hacen germinar
directamente en un medio apropiado. Los embriones más pequeños que
esos se pueden cultivar durante 1 semana sobre un medio que contiene
el ingrediente anterior junto con ácido abscísico 10^{-5} M y
después transferirse a medio sin reguladores de crecimiento para la
germinación.
La progenie se puede recuperar a partir de las
plantas transformadas y ensayarse para evaluar la expresión del gen
exógeno que se puede expresar mediante la aplicación localizada de
un sustrato apropiado a las partes de plantas tales como hojas. En
el caso de las plantas transformadas bar, se encontró que las
plantas transformadas precursoras (R_{O}) y su progenie de
cualquier generación ensayada no mostraban ninguna necrosis
relacionada con bialafos después de la aplicación localizada de
herbicida Basta a las hojas, si existía actividad funcional PAT en
las plantas como se determina mediante un ensayo enzimático in
vitro. Toda la progenie positiva PAT ensayada contenía
bar, confirmando que la presencia de la enzima y la
resistencia a bialafos estaban asociadas a la transmisión a través
de la línea germinal del gen marcador.
Para confirmar la presencia del ADN exógeno o
"transgen (es)" en las plantas que se están regenerando, se
puede realizar una diversidad de ensayos. Tales ensayos incluyen,
por ejemplo, ensayos "biológicos moleculares", tales como
transferencia de Southern y Northern y al PCR ^{TM}; ensayos
"bioquímicos" tales como la detección de la presencia de un
producto proteico, por ejemplo, mediante medios inmunológicos (ELISA
y transferencias de Western) o mediante función enzimática; ensayos
de partes de plantas, tales como ensayos de hojas o raíces, y
también, analizando el fenotipo de la planta regenerada entera.
El ADN genómico se puede aislar a partir de
líneas celulares de callos o cualquier parte de planta para
determinar la presencia del gen exógeno mediante el uso de técnicas
bien conocidas por los expertos en la técnica. Hay que destacar que
las secuencias intactas no siempre estarán presentes en,
presumiblemente debido a la transposición o supresión de secuencias
en la célula.
La presencia de elementos de ADN introducidos
mediante los procedimientos de esta invención se pueden determinar
por la reacción en cadena de al polimerasa (PCR ^{TM}. Usando está
técnica se amplifican fragmentos discretos de ADN y se detectan
mediante electroforesis de gel. Este tipo de análisis permite que se
determine si un gen está presente en un transformante estable, pero
no proporciona la integración del gen introducido en el genoma de
la célula huésped. Sin embargo, es al experiencia del inventor, que
el ADN se ha integrado en el genoma de todos los transformantes que
demuestran la presencia del gen a través del análisis de la PCR
^{TM}. Además, no es posible usar las técnicas de PCR ^{TM}
para determinar si los transformantes tienen genes exógenos
introducidos en sitios diferentes en el genoma, es decir, si los
transformantes son de origen independiente. Se contempla que el uso
de las técnicas de la PCR ^{TM} haría posible clonar fragmentos
del ADN geonómico huésped adyacente a un gen introducido.
La prueba positiva de integración de ADN en el
genoma huésped y las identidades independientes de transformantes
se puede determinar usando la técnica de hibridación de Southern.
Usando esta técnica secuencias de ADN que se introdujeron en el
genoma huésped y que flanquean las secuencias de ADN huésped se
pueden identificar. Por lo tanto el patrón de hibridación de
Southern de un transformante dado sirve como un identificador
característico del transformante. Además es posible mediante la
hibridación de Southern demostrar la presencia de genes introducidos
en ADN de alto peso molecular, es decir, confirmar que el gen
introducido se ha integrado en el genoma de la célula huésped. La
técnica de la hibridación de Southern proporciona información que se
obtiene usando la PCR ^{TM}, por ejemplo, la presencia de un gen,
pero también demuestra la integración en el genoma y caracteriza
cada transformante individual.
Se contempla que el uso de las técnicas de
hibridación de transferencia de puntos y rastros son modificaciones
de las técnicas de hibridación de Southern y pueden obtener la misma
información que se deriva de la PCR ^{TM}, por ejemplo, la
presencia de un gen.
Tanto las técnicas de la PCR ^{TM} como de
hibridación de Southern se pueden usar para demostrar la transmisión
de de un transgen a la progenie. En la mayoría de los casos el
patrón característico de la hibridación de Southern para un
transformante dado se segregará en al progenie como uno o más genes
Mendelianos (Spencer et al., 1992) indicando una herencia
estable del transgen.
Mientras que las técnicas de análisis de ADN se
pueden llevar a cabo usando ADN aislado de cualquier parte de una
planta, el ARN solamente se expresará en células particulares o
tipos de tejidos y por lo tanto será necesario preparar ARN para
análisis a partir de estos tejidos También se pueden usar las
técnicas de la PCR ^{TM} para la detección y cuantificación de
ARN producido a partir de los genes introducidos. En esta aplicación
de la PCR es primero necesario transcribir de manera inversa el ARN
en el ADN, usando enzimas tales como la transcriptasa inversa, y
después mediante el uso de técnicas convencionales de la PCR ^{TM}
amplificar el ADN. En la mayoría de los casos las técnicas de la
PCR ^{TM}, aunque útiles, no demostrarán la integridad del
producto del ARN. La información adicional sobre la naturaleza del
producto del ARN se puede obtener mediante la transferencia de
Northern. Esta técnica demostrará la presencia de una especie de ARN
y proporcionará información sobre la integridad del ARN. La
presencia o ausencia de una especie de ARN también se puede
determinar usando hibridaciones de Northern de transferencia de
puntos o de rastros. Estas técnicas son modificaciones de
transferencia de Northern y solamente demostrarán la presencia o
ausencia de una especie de ARN.
Aunque la transferencia de Southern y la PCR
^{TM} se puede usar para detectar el gen (es) en cuestión, no
proporcionan información de si el gen se expresa. La expresión se
puede evaluar identificando de manera específica los productos
proteicos de los genes introducidos o evaluando los cambios de
fenotipo que se llevan a cabo por su expresión.
Los ensayos para la producción e identificación
de proteínas específicas, pueden hacer uso de las propiedades
físico - químicas, estructurales, funcionales, u otras de al
proteína. Las propiedades físico - químicas o estructurales únicas
permiten que las proteínas se separen identifiquen mediante
procedimientos electroforéticos, tales como electroforesis de gel
nativa o desnaturalizante o localización isoleléctrica, o mediante
técnicas cromatográficas tales como cromatografía de intercambio
iónico o de exclusión de gel. Las estructuras únicas de las
proteínas individuales ofrecen oportunidades para el uso de
anticuerpos específicos para detectar su presencia en formatos
tales como un ensayo de ELISA. Las combinaciones de planteamientos
se pueden emplear con incluso mayor especificidad tal como
transferencia de Western en al que los anticuerpos se usan para
localizar productos génicos individuales que se han separado
mediante técnicas electroforéticas. Se pueden emplear técnicas
adicionales para confirmar de manera absoluta la identidad del
producto de interés tal como la evaluación mediante la
secuenciación de aminoácidos después de la purificación. Aunque
éstas están entre la mayoría de las empleadas comúnmente, se pueden
usar adicionalmente otros procedimientos.
También se pueden usar procedimientos para
identificar la expresión de proteínas mediante su funcionalidad
especialmente la capacidad de las enzimas para catalizar reacciones
químicas específicas que implican sustratos y productos
específicos. A estas reacciones pueden seguir la proporción y
cuantificación de la pérdida de los sustratos o la generación de
los productos de las reacciones mediante procedimientos físicos o
químicos. Los ejemplos como varían las enzimas a analizar y pueden
incluir los ensayos para evaluar la actividad enzimática de PAT
después de la producción de fosfinotricin acetilada marcada
radiactivamente a partir de fosfinotricin y
^{14}C-acetil- CoA o para la actividad de la
antrinilato sintasa después de la pérdida de la fluorescencia de
antranilato, por nombrar dos.
Muy frecuentemente la expresión de un producto
génico se determina evaluando los resultados fenotípicos de su
expresión. Esos ensayos también pueden tomar muchas formas que
incluyen pero no se limitan a analizar los cambios en las
composiciones químicas, morfología, o propiedades fisiológicas de la
planta. Las composiciones químicas se pueden alterar mediante la
expresión de genes que codifican enzimas o proteínas de
almacenamiento que cambian la composición de aminoácidos y se
pueden detectar mediante análisis de aminoácidos, o mediante
enzimas que cambian la cantidad de almidón que se pueden analizar
mediante espectrometría de resistencia de infrarrojo próximo. Los
cambios morfológicos pueden incluir un tamaño mayor o tallos más
gruesos. Muy a menudo los cambios a las respuestas de las plantas o
partes de las plantas a imponer tratamientos se evalúan en
condiciones cuidadosamente controladas denominadas bioensayos.
Además de la transformación directa de un
genotipo particular con una construcción de acuerdo con la presente
invención, las plantas de la invención se pueden preparar mediante
cruzamiento de una planta que tiene una construcción de la
invención a una segunda, planta que carece de la construcción. Por
lo tanto la presente invención no solamente abarca una planta
directamente regenerada a partir de las células que se han
transformado de acuerdo con la presente invención, sino también la
progenie de dicha planta. Como se usa en el presente documento el
término progenie significa la descendencia de cualquier generación
de una planta precursora preparada de acuerdo con la presente
invención. "Cruzamiento" de una planta para proporcionar una
línea de plantas que tiene uno o más transgenes añadidos con
relación a una línea de plantas, como se ha descrito en el presente
documento, se define como las técnicas que dan resultado un transgen
de la invención que se introduce en una línea de plantas cruzando
una línea de partida con una línea de plantas donadora que comprende
un transgen de la invención. Para lograr esto se deberían, en
general, realizar las siguientes etapas:
- (a)
- semillas de plantas de la primera (línea de partida) y segunda (línea de plantas dadora que comprende un transgen de la invención) plantas precursoras;
- (b)
- desarrollar las semillas de la primera y segunda plantas precursoras en las plantas que llevan flores:
- (c)
- polinizar la flor hembra de la primera planta precursora con el polen de la segunda planta precursora; y
- (d)
- recoger las semillas producidas sobre la planta precursora que lleva la flor femenina.
La conversión por retrocruzamiento se define en
el presente documento como el procedimiento que incluye las etapas
de:
- (a)
- Cruzar una planta del primer genotipo que contiene un gen deseado. La secuencia de ADN o elemento con una planta de un segundo genotipo que carece de dicho gen, secuencia de ADN o elemento deseado.
- (b)
- Seleccionar uno o más plantas de la progenie que contiene el gen, secuencia de ADN o elemento deseado;
- (c)
- Cruzar la planta de la progenie con una planta del segundo genotipo; y
- (d)
- Repetir las etapas (b) y (c) para el propósito de transferir dicho ge, secuencia de ADN o elemento deseado de una planta de un primer genotipo a una planta de un segundo genotipo.
La introgresión de un elemento de ADN en un
genotipo de planta se define como el resultado del procedimiento de
la conversión por retrocruzamiento. Un genotipo de planta en el que
una secuencia de ADN se ha introgresado se puede referir a un
genotipo convertido por retrocruzamiento, línea cosanguínea, o
híbrido. De manera similar un genotipo de planta que carece de
dicha secuencia de ADN deseada también se puede referir a un
genotipo, línea, cosanguíneo, o híbrido sin convertir.
Un avance particularmente importante de la
presente invención es que se proporcionan procedimientos mejorados
para la expresión de transgenes que incluyen genes marcadores y
otros. Tales transgenes serán a menudo genes que dirigen la
expresión de una proteína particular o producto polipeptídico, pero
también pueden ser no secuencias de ADN que no se pueden expresar,
por ejemplo, transposones tales como Ds que dirigen su próxima
transposición. Como se usa en el presente documento, un "gen que
se puede expresar" es cualquier gen que es capaz de
transcribirse en ARN (por ejemplo, ARNm, ARN no codificante, etc) o
traducida en un proteína, expresada como un carácter de interés, o
similares, etc, y no se limita a genes marcadores que se pueden
seleccionar, rastrear o no seleccionar. La también contempla que,
cuando tanto un gen que se puede expresar que no es necesariamente
un gen marcador se emplea en combinación con un gen marcador, se
puede emplear los genes separados sobre cualquiera de los segmentos
de ADN iguales o diferentes para la transformación. En el último
caso, los vectores diferentes se distribuyen de manera simultánea a
células receptoras para maximizar la cotransformación.
La elección de los segmentos de de ADN
particulares a distribuir en las células receptoras a menudo
dependerán de los propósitos de la transformación. Uno de los
principales propósitos de transformación de las plantas forrajeras
es añadir algunos caracteres comercialmente deseables,
agronómicamente importantes para la planta. Tales caracteres
incluyen, pero no se limitan a, resistencia o tolerancia a
herbicida, resistencia o tolerancia a insectos, resistencia o
tolerancia a enfermedad (viral, bacteriana, fúngica, nematodos);
tolerancia y/o resistencia a estrés, como se ejemplifica mediante
la resistencia o tolerancia a la sequía, calor, frío, congelación,
humedad excesiva, estrés por sal; estrés oxidante; incremento de
producción; contenido y constitución de alimentos; apariencia
física; esterilidad masculina; rapidez de secado; capacidad de
resistencia; capacidad de proliferación; propiedades de almidón;
cantidad y calidad de aceite; y similares. Se puede desear
incorporar uno o más genes que confieren tal o tal (es) carácter
(es), tales como, por ejemplo, un gen o genes que codifican
resistencia a herbicidas.
En ciertas realizaciones, la presente invención
contempla la transformación de una célula receptora con más de un
gen ventajoso. Dos o más transgenes se pueden suministrar en un
solo caso de transformación que usa o bien vectores que codifican
transgenes distintos, o que usan un solo vector que incorpora dos o
más secuencias codificadoras de genes. De hecho, se pueden emplear
según se desee cuales quiera de dos o más transgenes de cualquier
descripción, tal como las que confieren resistencia a herbicidas,
insectos, enfermedad (viral, bacteriana, fúngica, nematodos) o
resistencia a la sequía, esterilidad masculina, rapidez de secado,
capacidad de resistencia, capacidad de proliferación, propiedades
de almidón, cantidad y calidad de aceite, o las que incrementan la
calidad de producción o
nutricional.
nutricional.
Se conoce bien en la técnica que virtualmente
cualquier composición de ADN se puede introducir con cualquier
técnica de transformación para producir de manera última plantas
transgénicas fértiles. La construcción del vector que se puede
emplear junto con la presente invención se conoce bien por los
expertos en la técnica a la vista de la presente descripción (véase
por ejemplo, Sambrook et al., 1989; Gelvin et al,
1990). Las técnicas de la presente invención no se limitan de
esta manera a cualesquiera de los ADN particulares. Por ejemplo, se
pueden emplear los segmentos de ADN en la forma de vectores y
plásmidos, o fragmentos de ADN lineales, en algunos casos que
contienen solamente el elemento de ADN a expresar en la planta, y
similares.
En ciertas realizaciones, se contempla que se
puede desear emplear vectores virales competentes de replicación en
la transformación de plantas monocotiledóneas. Tales vectores
incluyen, por ejemplo, vectores de "lanzadera" del virus del
trigo enano (WDF), tales como pW1-11 y
PW1-GUS (Ugaki et al., 1991). Estos vectores
son capaces de la replicación autónoma en células de maíz así como
en E. coli, y como tales pueden proporcionar un aumento de
sensibilidad para detectar el ADN administrado a células
transgénicas. Un vector de replicación también puede ser útil para
la administración de genes flanqueados por las secuencias de ADN a
partir de elementos que se pueden transponer tales como Ac, Ds, o
Mu. Se ha propuesto (Laufs et al., 1990) que la transposición
de estos elementos dentro del genoma de maíz requiere la
replicación de ADN. También se contempla que los elementos que se
pueden transponder serían útiles para introducir fragmentos de ADN
que carecen de los elementos necesarios para la selección y
mantenimiento del vector plásmido en bacterias, por ejemplo, genes
de resistencia a antibióticos y los orígenes de la replicación de
ADN. También se propone que el uso de un elemento que se puede
transponder tal como Ac, Ds, o Mu promovería de manera activa la
integración del ADN deseado y por lo tanto incrementaría la
frecuencia de las células transformadas de manera estable.
\newpage
Además se contempla que se puede desear
cotransformar las plantas sobre células de plantas con 2 o más
vectores. La cotransformación se puede lograr usando un vector que
contiene el gen marcador y otros genes de interés. Como
alternativa, diferentes vectores, por ejemplo, plásmidos pueden
contener los diferentes genes de interés, y los plásmidos se
pueden administrar de manera simultánea a las células receptoras.
Usando este procedimiento, se asume que un cierto porcentaje de
células en el que se ha introducido el marcador, también han (ha)
recibido el (los) otro (s) gen (es) de interés. De este modo, no
todas las células seleccionadas mediante el marcador, expresará los
otros genes de interés expresará los otros genes de interés que se
han presentado a las células de manera simultánea.
Los vectores, plásmidos, cósmicos, YAC
(cromosomas artificiales de levaduras), BAC (cromosomas artificiales
de bacterias) y otros segmentos de ADN para uso en la
transformación de células de plantas, por supuesto, en general
comprenden el ADNc, gen o genes que se desea (an) para introducir en
las células. Estas construcciones de ADN pueden además incluir las
estructuras tales como promotores, potenciadores, engarces
múltiples, o incluso genes reguladores según se desee. Los
segmentos de ADN o gen elegidos para la introducción intracelular a
menudo codificarán una proteína que se expresará en las células
recombinantes resultantes, tales como las que darán como resultado
un carácter que se puede rastrear o seleccionar y/o que impartirán
un fenotipo mejorado a la planta regenerada. Sin embargo, éste no
puede ser siempre el caso, y la presente invención también abarca
plantas transgénicas que incorporan transgenes no expresados. Los
componentes preferidos que se incluyen probablemente con vectores
usados en la presente invención son como sigue:
Las construcciones preparadas de acuerdo con la
presente invención en general incluirán un promotor que limita la
silenciación de los genes en maíz u otra planta monocotiledónea.
Como tal, este promotor se aislará a partir de una especie
diferente de la planta monocotiledónea en la que se desea la
expresión de transgen. Las construcciones preferidas en general
incluirán un promotor del género Coix. Los promotores se
pueden aislar de novo a partir de Coix, o como
alternativa, se puede aislar basándose en los datos de genes o
promotores conocidos. Los ejemplos de genes y promotores de plantas
monocotiledóneas conocidos que se considera que son útiles de
manera particular para el aislamiento de promotores a partir
Coix se han descrito de manera específica en el presente
documento
anteriormente.
anteriormente.
Además de los promotores, otros tipos de
elementos pueden regular la expresión génica. Uno de tales elementos
es la secuencia de ADN entre el sitio de inicio de la transcripción
y el comienzo de la secuencia de codificación, denominada la
secuencia guía no traducida. La secuencia guía puede influir en la
expresión génica y compilaciones de las secuencias guías se han
elaborado para predecir las secuencias óptimas y subóptimas y
generar "consenso" y secuencias guías preferidas (Joshi,
1987). Las secuencias guías preferidas están contempladas para que
incluyan las que tienen secuencias predichas para dirigir la
expresión óptima del gen unido, es decir, para incluir una
secuencia guía de consenso preefriad que puede incrementar o
mantener la estabilidad del ARNm y prevenir el inicio inapropiado
de la traducción. La elección de tales secuencias será bien conocida
por los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción.
Las secuencias que se derivan de los genes que se expresan en gran
cantidad en plantas, y en maíz en particular, serán las más
preferidas.
Los potenciadores o supresiones de la
transcripción de los potenciadores se podrían usar para incrementar
la expresión. Los potenciadores a menudo se encuentran en 5' del
inicio de la transcripción en un promotor que funciona en células
eucarióticas, pero a menudo se pueden insertar en la orientación
delantera o transversal 5' ó 3' de la secuencia codificadora. En
algunos casos, estos elementos potenciadores en 5' son intrones.
Los ejemplos de potenciadores incluyen elementos del promotor CaMV
35S, genes de octopina sintasa (Ellis, et al., 1987), el gen
de la actina 1 de arroz, el gen de la alcohol deshidrogenasa de
maíz, el gen de encogimiento del maíz y promotores de eucariotas no
vegetales (por ejemplo, levadura; Ma et al., 1988).
Específicamente contemplados para uso de acuerdo
con la presente invención son los vectores que incluyen el elemento
potenciador de ocs. Este elemento se identificará primero como un
potenciador palindrómico de 16 pares de bases del gen de la
octopino sintasa (ocs) de Agrobacterium (Ellis et al.,
1987), y está presente en la menos otros 10 promotores (Bouchez
et al., 1989). Se propone que el uso de un elemento
potenciador, tal como el elemento de ocs y particularmente copias
múltiples del elemento, se pueden usar para incrementar el nivel de
la transcripción de promotores adyacentes cuando se aplica en el
contexto de la transformación de plantas monocotiledóneas.
Se contempla que la introducción de secuencias
de ADN grandes que comprenden más de un gen puede ser deseable. La
introducción de tales secuencias se puede facilitar mediante
mediante el uso de cromosomas artificiales bacterianos o de
levaduras (BACs o YACs, respectivamente), o sobre cromosomas
artificiales de plantas. Por ejemplo, el uso de BACs para la
transcripción mediada por Agrobacterium se describió en
Hamilton et al., (1996).
Por último, los segmentos de ADN más deseables
para la introducción en un genoma de monocotiledóneas pueden ser
genes homólogos o familias de genes que codifican un carácter
deseado (por ejemplo, incremento de producción por acre (0,4047
Hectáreas)), y que se introducen bajo el control de los promotores o
potenciadores novedosos de acuerdo con la presente invención. Las
regiones reguladoras específicas de tejidos pueden ser
particularmente útiles a este respecto. De hecho, se contempla que
un uso particular de la presente invención puede ser la producción
de transformantes que comprenden un transgen que está dirigido de
una manera específica de tejidos. Por ejemplo, los genes
resistentes a insectos se pueden expresar de manera específica en el
verticilo y tejidos del cuello/vaina que son dianas para la primera
y segunda generación, respectivamente, de oruga taladradora de maíz
europeo (ECB). Del mismo modo, los genes que codifican las proteínas
con actividad particular contra el gusano de la raíz se pueden
dirigir directamente a los tejidos de la raíz. Además, la expresión
de ciertos genes que afectan a la composición nutricional del grano
se debe dirigir a la semilla, por ejemplo, embrión del
endospermo.
Los vectores para uso en la dirección específica
de tejido de la expresión de genes en plantas transgénicas
incluirán típicamente promotores específicos de tejidos y también
pueden incluir otros elementos de control específicos de tejidos
tales como secuencias de potenciadores. Los promotores que dirigen
la expresión específica o potenciada en ciertos tejidos de plantas
de acuerdo con la invención se conocerán por los expertos en la
técnica a la luz de la presente descripción.
También se contempla que la expresión específica
de tejidos se puede llevar a cabo de manera funcional introduciendo
un gen expresado de manera constitutiva (todos los tejidos) en
combinación con un gen no codificante que se expresa solamente en
aquellos tejidos en los que el producto del gen no se desea. Por
ejemplo, un gen que codifica la proteína de la toxina cristalina a
partir de B. thurigiensis (Bt) se puede introducir de manera
que se exprese en todos los tejidos usando un promotor constitutivo,
por ejemplo con un promotor de actina de Coix. Además, se
contempla que los promotores que comprenden elementos de más de un
promotor pude ser útil. Por ejemplo, la patente de Estados Unidos
nº 5.491.288 describe la combinación de un promotor del Virus de
Mosaico de Coliflor con un promotor de histona. La expresión de una
transcripción no codificante del gen de Bt en un grano de maíz, que
usa por ejemplo un promotor zein, prevendría la acumulación de la
proteína de Bt en la semilla. Por lo tanto la proteína codificada
por el gen introducido estaría presente en todos los tejidos
excepto el grano.
Como alternativa, se puede desear obtener
secuencias de promotor específicas de tejidos novedosas de
Coix para uso de acuerdo con la presente invención. Para
lograr esto, se pueden aislar clones de ADNc a partir del tejido de
referencia e identificar aquellos clones que se expresan de manera
específica en ese tejido, por ejemplo, usando transferencia de
Northern. De manera ideal, se desearía identificar un gen que no
está presente en un alto número de copias, pero dicho producto
génico es relativamente abundante en tejidos específicos. El
promotor y elementos de control de los clones genómicos
correspondientes se pueden después localizar usando las técnicas de
biología molecular conocidas por los expertos en la técnica.
Otro procedimiento útil para identificar los
promotores específicos de tejidos es la representación visual
diferencial (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos nº
5.599.672. En la representación visual diferencial, los ARNm se
comparan con diferentes tipos de tejidos. Mediante la identificación
de las especies de ARNm que están presentes en solamente un tipo
particular de tejido, o conjunto de tipos de tejidos, se pueden
identificar los genes correspondientes que se expresan de una
manera específica de tejidos. Los ARN se pueden transcribir
mediante transcriptasa inversa para producir un ADNc, y el ADNc a su
vez se usa para aislar clones que contienen los genes de longitud
completa. Como se describe de manera específica en el presente
documento, el ADNc también se puede usar para aislar promotores,
potenciadores o terminadores homólogos o heterólogos del gen
respectivo usando, por ejemplo, la PCR de
supresión.
supresión.
Se contempla que la expresión de algunos genes
en plantas transgénicas se deseará solamente en condiciones
específicas. Por ejemplo, se propone que la expresión de ciertos
genes que confieren resistencia a factores de estrés ambiental
tales como sequía se desearán solamente bajo condiciones de estrés
reales. Además se contempla que la expresión de tales genes durante
todo el desarrollo de una planta puede tener efectos perjudiciales.
Se sabe que existe un gran número de genes que responden al
ambiente. Por ejemplo, la expresión de algunos genes tales como
rbcS, que codifican la subunidad pequeña de la ribulosa bisfosfato
carboxilasa, se regulan por la luz como se media a través de
fotocromo. Otros genes se inducen mediante estímulos secundarios.
Por ejemplo, síntesis de ácido abscísico (ABA) está inducida por
ciertos factores ambientales, que incluyen pero no se limitan a
estrés de agua. Se ha mostrado que un número de genes está inducido
por ABA (Skriver y Mundy, 1990). También se anticipa que al
expresión de los genes que confieren resistencia a la depredación
por insectos se desearía solamente en condiciones de la infestación
real. Por lo tanto, para algunos caracteres deseados, será deseable
la expresión inducible de los genes en plantas
transgénicas.
transgénicas.
Se propone que, en algunas realizaciones de la
presente invención, será deseable la expresión de un gen en una
planta transgénica solamente en un cierto período de tiempo durante
el desarrollo de la planta. El programa de desarrollo está
correlacionada frecuentemente con la expresión génica específica de
tejidos. Por ejemplo, la expresión de las proteínas de
almacenamiento se inicia en el endospermo aproximadamente 10 días
después de la
polinización.
polinización.
También se contempla que puede ser útil para
dirigir en ADN él mismo dentro de una célula. Por ejemplo, puede
ser útil dirigir el ADN introducido al núcleo ya que esto puede
incrementar la frecuencia de la transformación. Dentro del propio
núcleo sería útil dirigir un gen con el fin de lograr la integración
específica de sitio. Por ejemplo, sería útil tener un gen
introducido mediante el reemplazo de la transformación de un gen que
existe en la célula.
Las construcciones incluirán de manera típica el
gen de interés con una secuencia de ADN de extremo 3' que actúa
como una señal para terminar la transcripción y permiten la
poliadenilación del ARNm resultante. Los elementos en 3' más
preferidos se contemplan para que sean aquellos del gen de la
nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (números del
extremo 3') (Bevan et al., 1983), el terminador para el
tránscrito de T7 del gen de la octopino sintasa de Agrobacterium
tumefaciens, y el extremo 3' de los genes del inhibidor I o II
de la proteasa de patata o tomate. Lo elementos reguladores tales
como el intrón 1 de Adh (Callis et al., 1987), intrón de la
sacarosa sintasa (Vasil et al., 1989) o elemento omega de TMV
(Gallie et al., 1989), se pueden además incluir cuando se
desee. Como alternativa, el terminador se puede aislar de acuerdo
con la invención a partir de Coix, como se ha descrito
anteriormente para las secuencias de promotor.
Los promotores particularmente preferidos son
aquellos que se han aislado de Coix. Por ejemplo, los
terminadores de la coixina gamma y terminadores de oleosin 3 de
Coix. La clonación de estos terminadores se describe más
adelante, en el ejemplo 2 y ejemplo 3. Las secuencias de ácido
nucleico de los terminadores de la coixina gamma y oleosin 3 se
proporciona, por ejemplo, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 17,
respectivamente.
Las secuencias que se agregan a las secuencias
codificadoras del gen de resistencia, que se retiran después de la
transcripción del producto de traducción inicial y que facilitan el
transporte de la proteína en o mediante las membranas
intracelulares o extracelulares se denominan secuencias de tránsito
(usualmente en las vacuolas, vesículas, plástidos y otros orgánulos
intracelulares) t y secuencias de señalización (usualmente al
retículo endoplásmico, aparato de Golgi y fuera de la membrana
celular). Facilitando el transporte de la proteína en los
compartimentos dentro y fuera de la célula, estas secuencias pueden
incrementar la acumulación del producto génico que las protege de
la degradación proteolítica. Estas secuencias también permiten las
secuencias adicionales de ARNm a partir de los genes altamente
expresados a unirse a la secuencia codificadora de los genes. Ya
que el ARNm que se está traduciendo por los ribosomas es más estable
que el ARNm desnudo, la presencia del ARNm que se puede traducir en
frente del gen puede incrementar la estabilidad global del
tránscrito de ARNm a partir del gen y por lo tanto incrementa la
síntesis del producto génico. Ya que las señales transitorias y de
señal se retiran usualmente después de la traducción del producto de
traducción inicial, el uso de estas secuencias permite la adición
de secuencias extra traducidas que pueden no aparecer sobre el
polipéptido final. Además se contempla que al dirección de ciertas
proteínas puede ser deseable con el fin de potenciar la estabilidad
de la proteína (patente de Estados Unidos Nº
5.545.818).
5.545.818).
De manera adicional, los vectores se pueden
construir y emplear en la dirección intracelular de un producto
génico específico dentro de las células de una planta transgénica o
en la dirección de una proteína al ambiente extracelular. En
general esto se lleva a cabo uniendo una secuencia de ADN que
codifica una secuencia peptídico de tránsito o de señal a la
secuencia codificadora de un gen particular. El péptido de tránsito,
o de señal transportará la proteína a un destino intracelular o
extracelular respectivamente, y después de retirará de manera
después de la
traducción.
traducción.
Un ejemplo particular de tal uso se refiere a la
dirección de una proteína que confiere resistencia a herbicida, tal
como la proteína EPSPS mutante, a un orgánulo particular tal como el
cloroplasto en lugar de al citoplasma. Esto se ejemplifica mediante
el uso del péptido de tránsito rbcS, el péptido de tránsito de
cloroplasto descrito en la patente de Estados Unidos Nº 5.728.925,
o el péptido de tránsito optimizado descrito en la patente de
Estados Unidos Nº 5.510.471, que confiere la dirección específica de
plástico de proteínas. Además, puede ser deseable dirigir ciertos
genes responsables de la estabilidad masculina a las mitocondrias, o
para dirigir ciertos genes para la resistencia a organismos
fitopatogénicos a los espacios extracelulares, o para dirigir
proteínas a la vacuola. Un uso adicional se refiere a la dirección
de las enzimas implicadas en la biosíntesis de aminoácidos o
síntesis de aceite al plástico. Tales enzimas incluyen la síntesis
de la ácido dihidropicolínico sintasa que puede contribuir a
incrementar el contenido en lisina de un alimento.
Con el fin de mejorar la capacidad de
identificar transformante, se puede emplear un gen marcador de
interés que se puede seleccionar o rastrear como, o además de, el
gen que se puede expresar. "Genes marcadores" son genes que
imparten un fenotipo distinto a las células que expresan el gen
marcador y de este modo permiten que tales células transformadas se
distingan de las células que no tienen el marcador. Tales genes
pueden codificar o bien un marcador que se puede seleccionar o que
se puede rastrear, dependiendo de si el marcador confiere un
carácter que se puede "seleccionar" mediante medios químicos,
es decir, mediante el uso de un agente selectivo (por ejemplo, un
herbicida, antibiótico, o similares), o si es simplemente un
carácter se puede identificar mediante la observación o ensayo, es
decir, "rastreo" (por ejemplo, la proteína fluorescente
verde). Por supuesto, muchos ejemplos de genes marcadores se
conocen en la técnica y se pueden emplear en la práctica de la
invención.
Incluidos dentro de los términos genes
marcadores que se pueden seleccionar o rastrear son también genes
que codifican un "marcador que se puede secretar" cuya
secreción se puede detectar como un medio de identificación o
selección para las células transformadas. Los ejemplos incluyen
marcadores que codifican un antígeno que se puede secretar que se
puede identificar mediante la interacción de anticuerpos, o incluso
las enzimas que se pueden secretar que se pueden detectar por su
actividad catalítica. Las proteínas que se pueden secretar caen en
un número de clases, que incluyen, proteínas pequeñas, que se pueden
difundir detectables, por ejemplo, mediante ELISA; las pequeñas
enzimas activas que se pueden detectar en una solución extracelular
(por ejemplo, \alpha-amilasa,
\beta-amilasa, fosfinotricin acetiltransferasa); y
las proteínas que se insertan o están atrapadas en al pared celular
(por ejemplo, proteínas que incluyen una secuencia guía tal como la
encontrada en la unidad de expresión de extensina o tabaco
PR-S).
PR-S).
Con relación a los marcadores que se pueden
secretar y que se pueden seleccionar, el uso de un gen que codifica
una proteína que se llega a secuestrar en la pared celular, y que
dicha proteína incluye un epítope único se considera que es
particularmente ventajosa. Tal marcador de antígeno secretado
emplearía de manera ideal una secuencia de epítope que
proporcionaría un bajo fondo en el tejido de plantas, una secuencia
guía de promotor que impartiría la expresión eficaz y dirección a
través de la membrana plasmática, y produciría la proteína que está
unida en la pared celular todavía accesible a anticuerpos. Una
proteína de la pared secretada de manera normal que se modifica
para incluir un epítope único satisfacerla todos estos
requerimientos.
Un ejemplo de una proteína adecuada para la
modificación de esta manera es la glicoproteína rica en extensina,
o hidroxiprolina (PGR). Se prefiere el uso de PGR de maíz (Steifel
et al., 1990), ya que esta molécula está bien caracterizada
en términos de biología molecular, expresión y estructura de la
proteína. Sin embargo, cualquiera de la diversidad de las proteínas
de la pared ricas en extensina, y/o glicina (Séller et al.,
1989) se podrían modificar mediante la adición de un sitio
antigénico para crear un marcador que se puede rastrear.
Una realización ejemplar de un marcador que se
puede secretar y rastrear se refiere al uso de una secuencia de
maíz que codifica la proteína de la pared PGR, que está modificada
para incluir un epítope de 15 residuos de la
pro-región de la interleuquina - 1\beta murina
(IL-1-\beta). Sin embargo,
virtualmente se puede emplear cualquier epítope detectable en tales
realizaciones como se selecciona a partir de la variedad
extremadamente amplia de combinaciones de antígeno : anticuerpo
conocida por los expertos en la técnica. El epítope extracelular
único, tanto si se deriva de
IL-1-\beta o cualquier otra
proteína o sustancia epitópica, se puede después detectar de manera
sencilla usando el marcado de anticuerpos junto con los adjuntos
cromogénicos o fluorescentes.
Se pueden usar muchos genes marcadores que se
pueden seleccionar en relación con la presente invención que
incluye, pero no se limita a, un gen neo (Potrykus et
al., 1985) que codifica kanamicina, G418, paromomicina, etc.;
un gen bar que confiere resistencia a bialafos, una proteína
EPSP sintasa (Hinchee et al., 1988) que confiere la
resistencia a glifosato; un gen de nitrilasa tal como bxn de
Klebsiella ozaenae que confiere resistencia a bromoxinil
(Stalker et al., 1988); un gen de la acetolactato sintasa
mutante (ALS) que confiere resistencia a imidazolinona,
sulfonilurea u otros compuestos químicos que inhiben la las
(Solicitud de Patente Europea 154.204, 1985); un gen DHFR de
resistencia a metotrexato (Thillet et al., 1988), un gen de
la dalapon deshalogenasa que confiere resistencia al herbicida
dalapon; o un gen de antranilato sintasa mutado que confiere
resistencia a 5-metil triptófano. Donde se hémela un
gen de la EPSP sintasa, se puede conseguir un beneficio adicional
mediante la incorporación de un péptido de tránsito de cloroplasto,
CTP (patente de Estados Unidos Nº 5.188.642) u OTP (patente de
Estados Unidos Nº 5.633.448) y uso de un gen de EPSPS de maíz
modificado (solicitud PCT WO 97/04103).
Una realización ilustrativa de los genes
marcadores que se pueden seleccionar capaces de ser usados en los
sistemas para seleccionar los transformantes son los genes que
codifican la enzima fosfinotricin acetiltransferasa, tal como el
gen bar de Streptomyces hygroscopicus o el gen
pat de Streptomyces viridochromogenes. La enzima
fosfinotricin acetil transferasa (PAT) inactiva el ingrediente
activo en el herbicida bialafos, fosfinotricin (PPT). La PPT inhibe
la glutamina sintetasa, (Murakami et al., 1986; Twell et
al., 1989) que provoca la rápida acumulación de amoníaco y
muerte celular.
Cuando se desea emplear un gen de resistencia a
bialafos en la práctica de la invención, el inventor ha descubierto
que los genes particularmente útiles para este propósito son los
genes bar o pat que se pueden obtener a partir de
especies de Streptomyces (por ejemplo, ATCC Nº 21.705). La
clonación del gen bar se ha descrito en el contexto de las
plantas (De Block et al., 1987; De Block et al., 1989;
la Patente de Estados Unidos Nº 5.550.318).
Los marcadores que se pueden rastrear que se
pueden emplear incluyen un gen de
\beta-glucuronidasa o uidA (GOS) que
codifica una enzima para la que se conocen diversos sustratos
cromogénicos; un gen del locus R, que codifica un producto que
regula la producción de pigmentos de antocianina (color rojo) en
tejidos vegetales (Dellaporta et al., 1988); un gen de la
\beta-lactamasa (Sutcliffe, 1978), que codifica
una enzima para la que se conocen diversos sustratos cromogénicos
(por ejemplo, PADAC, una cefalosporina cromogénica); un gen
xylE (Zukowsky et al., 1983) que codifica una catecol
dioxigenasa que puede convertir los catecoles cromogénicos; un gen
de la \alpha-amilasa (Ikuta et al., 1990);
un gen de tirosina (Katz et al., 1983) que codifica una
enzima capaz de oxidar la tirosina a DOPA y dopaquinona que a su
vez se condensa para formar el compuesto melanina fácilmente
detectable; un gen de la \beta-galactosidasa, que
codifica una enzima para la que existen sustratos cromogénicos, un
gen de luciferasa (lux) (Ow et al., 1986), que permite
la detección de la bioluminiscencia; un gen de aecuorina (Prasher
et al., 1985) que se puede emplear en la detección de
biluminiscencia sensible a calcio; o un gen que codifica la proteína
fluorescente verde (Sheen et al., 1995; Haseloff et
al., 1997; Reaichel et al., 1996; Tian et al.,
1997; documento WO 97/41228).
\newpage
Los genes para el complejo del gen R de maíz se
contempla n para que sean particularmente útiles como marcadores
que se pueden rastrear. El complejo del gen R en maíz codifica una
proteína que actúa para regular la producción de los pigmentos de
antocianina en la mayoría de los tejidos de semilla y de plantas.
Las variedades de maíz pueden tener una, o como mucho formar alelos
R que se combinan para regular la pigmentación de una manera
específica del desarrollo y del tejido. De este modo, un gen R
introducido en tales células provocará la expresión de un pigmento
rojo y, que se incorpora de manera estable, se puede puntuar de
manera visual como un sector de color rojo. Si la línea de maíz
lleva alelos dominantes para los genes que codifican los intermedios
enzimáticos en la ruta de biosíntesis de antocianina (C2, A1, A2,
Bz1 y Bz2), pero lleva un alelo recesivo en el locus R, la
transformación de cualquier célula a partir de la línea con R dará
como resultado la formación de pigmentos rojos. Las líneas
ejemplares incluyen Wisconsin 22 que contiene el alelo
rg-Stadler y TR112, un derivado K55 que es
r-g, g, Pl. Como alternativa, cualquier genotipo de
maíz se puede utilizar si los alelos C1 y R se introducen
conjuntamente.
conjuntamente.
Además se propone que las regiones reguladoras
del gen R se pueden emplear en las construcciones quiméricas con el
fin de proporcionar mecanismos para con la expresión de genes
quiméricos. Se conoce e el locus R más diversidad de expresión
fenotípica que en cualquier otro locus (Coe et al., 1988). Se
contempla que las regiones reguladoras obtenidas a partir de las
regiones 5' al gen estructural R sería valioso en la dirección de la
expresión de los genes para, por ejemplo, resistencia a insectos,
tolerancia a herbicidas u tras regiones que codifican las
proteínas. Para los propósitos de la presente invención, se cree que
cualquiera de los miembros de la familia del gen R se pueden
emplear de manera exitosa (por ejemplo, P, S, Lc, etc). Sin embargo,
el más preferido será en general Sn (particularmente Sn:bol3). Sn
es un miembro dominante del complejo del gen R y es similar de
manera funcional a los loci R y B porque Sn controla la deposición
específica de tejido de los pigmentos antocianina en ciertas
células de plántulas y de plantas, por lo tanto, su fenotipo es
similar a R.
Un marcador que se puede rastrear adicional
contemplado para el uso en la presente invención es la luciferasa
de luciérnaga, codificada por el gen lux. La presencia del
gen lux en las células transformadas se puede detectar
usando, por ejemplo, película de rayos X, contador de centelleo,
espectrofotometría fluorescente, cámaras de vídeo de baja
luminosida, cámaras contadoras de fotones o luminometría de
múltiples pocillos. También se contempla que este sistema se puede
desarrollar para el rastreo de la población para luminescencia, tal
como sobre placas de tejidos, o incluso para el rastreo de la planta
entera. El gen que codifica la proteína fluorescente verde se
contempla como un indicador útil de manera particular (Sheen et
al., 1995; Haseloff et al., 1997; Reichel et al.,
1996; Tian et al., 1997; documento WO 97/41228). La expresión
de la proteína fluorescente verde se puede visualizar en una célula
o planta como fluorescencia después de la iluminación por las
longitudes de onda particulares de
luz.
luz.
Una ventaja particularmente importante de la
presente invención es que se proporcionan procedimientos y
composiciones para la expresión eficaz en células vegetales de
genes además de, diferentes de, los genes marcadores. Tales como
transgenes que a menudo serán genes que dirigen la expresión de una
proteína particular o producto polipeptídico, pero que también
pueden ser segmentos de ADN que no se pueden expresar, por ejemplo,
transposones tales como Ds que no dirigen su propia transposición.
Como se usa en el presente documento, un gen "que se puede
expresar" es cualquier gen que es capaz de que se transcriba en
el ARN (por ejemplo, ARNm, ARN no codificante, etc.) o se traduce
en una proteína, que se expresa como un carácter de interés, o
similares, etc., y no se limita a genes marcadores que se pueden
rastrear o no seleccionar. La invención también contempla que,
cuando un gen que se puede expresar que no es necesariamente un gen
marcador se emplea en combinación con un gen marcador, se pueden
emplear los genes separados en o bien el mismo o diferentes
segmentos de ADN para la transformación. En el último caso, los
vectores diferentes se distribuyen de manera simultánea a las
células receptoras para maximizar la
cotransformación.
cotransformación.
La elección de los segmentos de ADN particulares
a distribuir a las células receptoras a menudo dependerán del
propósito de la transformación. Uno de los principales propósitos de
transformación de las plantas forrajeras es añadir algunos
caracteres comercialmente deseables, agronómicamente importantes a
la planta. Tales caracteres incluyen, pero no se limitan a,
resistencia o tolerancia a herbicidas; resistencia o tolerancia a
insectos; resistencia o tolerancia a enfermedad (viral, bacteriana,
fúngica, nematodos); tolerancia y/o resistencia a estrés, como se
ejemplifica mediante la resistencia o tolerancia a la sequía, calor,
frío, congelación, humedad excesiva, estrés por sal; estrés
oxidante; incremento de producción; contenido y constitución de
alimentos; apariencia física; esterilidad masculina; rapidez de
secado; capacidad de resistencia; capacidad de proliferación;
cantidad y calidad de almidón; cantidad y calidad de aceite;
cantidad y calidad de proteína; composición de aminoácidos, y
similares. Se puede desear incorporar uno o más genes que confieren
tal o tal (es) carácter (es), tales como, por ejemplo, un gen o
genes que codifican resistencia a herbicidas.
En ciertas realizaciones, la presente invención
contempla la transformación de una célula receptora con más de un
gen exógeno. Como se usa en el presente documento, un gen
"exógeno" es un gen que normalmente se encuentra en el genoma
huésped en un contexto idéntico. Por eso, se considera que el gen se
puede aislar a partir de una especie diferente de la del genoma
huésped, o como alternativa, se aísla del genoma huésped pero que
se une de manera operativa a uno o más regiones reguladoras que
difieren de las encontradas en el gen nativo no alterado. Dos o más
genes exógenos también se pueden suministrar en un solo episodio de
transformación usando o bien diferentes vectores que codifican
vectores transgénicos, o usando un solo vector que incorpora dos o
más genes que codifican secuencias. Por ejemplo, los plásmidos que
llevan las unidades de expresión bar y aroA en
orientación o bien convergente, divergente, o colineal se
conseideran que son particularmente útiles. Además las
combinaciones preferidas son las de un gen de resistencia a
insectos, tales como un gen Bt, junto con un gen inhibidor de la
proteasa tal como pin II, o el uso de bar en
combinación con cualquiera de los genes anteriores. Por supuesto,
cualquiera de dos o más transgenes de cualquier descripción, tales
como los que confieren resistencia a herbicida, insectos, enfermedad
(viral, bacteriana, fúngica, nematodos) o resistencia a sequedad,
esterilidad masculina, rapidez de secado, capacidad de resistencia,
capacidad de proliferación; propiedades de almidón, cantidad y
calidad de aceite o las que incrementan la producción o calidad
nutricional se pueden emplear según se
desee.
desee.
Los genes que codifican la fosfinotricina
acetiltransferasa (bar y pat), genes de la EPSP
sintasa tolerantes a glifosato, el gen gor de la enzima que
degrada glifosfato que codifica la glifosato oxidorreductasa,
deh (que codifica una enzima deshalogenasa que inactiva
dalapon), resistencia herbicidas (por ejemplo, sulfonilurea e
imidazilinona) acetolactato sintasa, y genes bxn (que
codifican una enzima nitrilasa que degrada bromoxinilo) son buenos
ejemplos de los genes resistentes a herbicidas para uso en la
transformación. Los genes bor y par codifican una
enzima fosfinotricin acetiltransferasa (PAT), que inactiva el
herbicida fosfinotricin y evita que este compuesto inhiba las
enzimas glutamino sintetasa. La enzima
5-enolpiruvinilshikimato 3-fosfato
sintasa (EPSP sintasa), se inhibe normalmente por el herbicida
N-(fosfometil)glicina (glifosato). Sin embargo, se conocen
genes que codifican enzimas EPSP sintasa resistentes a glifosato.
Estos genes se contemplan de manera particular para uso en la
transformación de las plantas monocotiledóneas. El gen deh
codifica la enzima dalapon deshalogenasa y confiere resistencia al
herbicida dalapon. El gen bxn codifica una enzima nitrilasa
específica que convierte bromoxinil en un producto de degradación
no
herbicida.
herbicida.
Los genes de resistencia a insectos potenciales
que se pueden introducir incluyen los genes de toxina de cristal de
Bacillus thuringiensis o genes de BT (Watrud et al.,
1985). Los genes Bt pueden proporcionar resistencia a las plagas de
lepidópteros o coleópteros tales como la oruga taladradora de Maíz
Europeo (ECB). Los genes de la toxina de BT preferidos para uso en
tales realizaciones incluyen los genes Cry/A (b) y CryIA
(c). Los genes de endotoxina de otras especies de B.
thuringiensis que afectan al crecimiento o desarrollo de
insectos también se puede emplear a este respecto.
Se contempla que los genes Bt preferidos para
uso en los protocolos de transformación descritos en el presente
documento en los que la secuencia codificadora se ha modificado para
que efectúe un incremento de la expresión en las plantas, y más
particularmente, en maíz. Los medios para preparar los genes de
síntesis se conocen bien en la técnica y se describen en, por
ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 5.500.365 y la patente de
Estados Unidos Nº 5.689.052, cuyas descripciones se incorporan
específicamente en el presente documento por referencia en su
totalidad. Los ejemplos de tales genes de la toxina de Bt
modificados incluyen un gen sintético CryA(b) de Bt
(Perlak et al., 1991) y el gen sintético
CryA(c) llamado 1800 b (Solicitus PCT WO 95/06128).
Algunos ejemplos de otros genes de la toxina de Bt conocidos por los
expertos en la técnica se proporcionan en la tabla 3 más
adelante.
adelante.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- ^{a}Adaptado de:
- htp//epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.html.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los inhibidores de la proteasa también pueden
proporcionar resistencia a insectos (Jonson et al., 1989),
y de esta manera tendrán utilidad en la transformación de las
plantas. El uso de un gen inhibidor II de la proteasa, pin
II, de tomate o patata se contempla que sea particularmente
útil. Incluso más ventajoso es el uso de un gen pin II en
combinación con un gen de la toxina de Bt, cuyo efecto combinado se
ha descubierto en la actividad insecticida sinérgica. Otros genes
que codifican inhibidores del sistema digestivo de insectos, o los
que codifican enzimas o los co-factores que
facilitan la producción de inhibidores, también pueden ser útiles.
Este grupo se puede ejemplificar mediante los inhibidores de
orizacistina y amilasa tales como los de trigo y cebada.
\newpage
También, los genes que codifican lecitinas
pueden conferir propiedades adicionales o alternativas insecticidas.
Las lecitinas (originalmente denominadas fitohematoglutininas) son
proteínas de unión de carbohidratos multivalentes que tienen la
capacidad de aglutinar los glóbulos rojos de un intervalo de
especies. Las lecitinas se han identificados recientememente como
agentes insecticidas con actividad contra los gorgojos, ECB y
gusano de la raíz (Murdock et al., 1990; Czapla y Lang,
1990). Los genes de lecitina que se contemplan que son útiles
incluyen por ejemplo, aglutina de cebada y germen de trigo (WGA) y
lecitinas de arroz (Gatehouse et al., 1984), siendo
preferido
WGA.
WGA.
Los genes que controlan la producción de
polipéptidos grandes y pequeños activos contra insectos curando se
introducen en las plaga de insectos, tales como por ejemplo,
péptidos líticos, hormonas peptídicos y toxinas y venenos, forman
otro aspecto de la invención. Por ejemplo, se contempla que la
expresión de la hormona juvenil esterasa, que se dirige hacia las
partes específicas de los insectos, también puede dar como resultado
actividad insecticida, o quizás provocar el cese de la metamorfosis
(Hammock et al, 1990).
Los genes que se expresan el maíz transgénico
que codifican las enzimas que afectan a la integridad de la
cutícula de los insectos forman todavía otro aspecto de la
invención. Tales genes incluyen los que codifican, por ejemplo,
quitinasa, proteasas, lipasas y también los genes para la producción
de nikkromicina, un compuesto que inhibe la síntesis de la quitina,
la introducción de cualquiera de las cuales se contempla para
producir plantas de maíz resistente a insectos. Los genes que
codifican las actividades que afectan a la muda de los insectos,
tales como los que afectan a la producción de ecdisteroide
UDP-glucosil transferasa, también cae dentro del
alcance de los transgenes útiles de la presente invención.
Los genes que codifican las enzimas que
facilitan la producción de los compuestos que reducen la calidad
nutricional de la planta huésped a las plagas de insectos también
están abarcadas por la presente invención. Por ejemplo, puede ser
posible conferir actividad insecticida sobre una planta mediante la
alteración de su composición de esteroles. Los esteroles se
obtienen por los insectos a partir de su dieta y se usan para la
síntesis de hormonas y estabilidad de membranas. Por lo tanto las
alteraciones en la composición de esteroles en plantas por la
expresión de genes novedosos, por ejemplo los que promueven
directamente la producción de esteroles no deseables o los que
convierten los esteroles deseables en las formas no deseables,
pueden tener un efecto negativo sobre el crecimiento y/o desarrollo
de los insectos y por lo tanto dotar a la planta con actividad
insecticida. Las lipooxigenasas son enzimas vegetales de origen
natural que se ha mostrado que muestran efectos anti nutricional en
los insectos y para reducir la calidad nutricional de su dieta. Por
lo tanto, las realizaciones adicionales de la invención se refiere
a plantas transgénicas con actividad lipooxigenasa potenciada que
puede ser resistente a la alimentación de los
insectos.
insectos.
Tripsacum dactyloides es una especie de
pasto que es resistente a ciertos insectos, incluyendo el gusano de
la raíz de maíz. Se anticipa que los genes que codifican las
proteínas que son tóxicas para los insectos o están implicadas en
la biosíntesis de los compuestos tóxicos para los insectos se
aislarán de Tripsacum y que estos genes novedosos serán
útiles confiriendo resistencia a los insectos. Se sabe que la base
de la resistencia a insecto en Tripsacum es genérico,
debido a que dicha resistencia se ha transferido a Zea mays
mediante cruces sexuales (Branson y Guss, 1972). Además se anticipa
que otras especies de cereales, monocotiledóneas o dicotiledóneas
pueden tener genes que codifican proteínas que son tóxicas para los
insectos que serían útiles para producir plantas de maíz
resistentes a insectos.
Los genes adicionales que codifican las
proteínas caracterizadas por tener actividad insecticida potencial
también se pueden usar como transgenes de acuerdo con ello. Tales
genes incluyen, por ejemplo, el inhibidor de la tripsina del
garbanzo (CpTI; Hilder et al., 1987) que se puede usar como
un impedimento para el gusano de la raíz, los genes que codifican
avermectina (Avermectin y Abamectin, Campbell, W. C.,
Ed., 1989; Ikeda et al., 1987) que puede evidenciar utilidad
particular como un impedimento para el gusano de la raíz; los genes
de la proteína que inactivan los ribosomas; e incluso los genes que
regulan las estructuras de las plantas. El maíz transgénico que
incluye genes de anticuerpos contra insectos y los genes que
codifican las enzimas que pueden convertir un insecticida no tóxico
(pro-insecticida) aplicado al exterior de la planta
en un insecticida en el interior de la planta también se
contemplan.
contemplan.
La mejora de la capacidad del maíz para tolerar
diversos estrés ambientales tal como, pero no se limita a, sequía,
humedad en exceso, frío, congelación, alta temperatura, sal y estrés
oxidante, también se puede efectuar mediante la expresión de genes
novedosos. Se propone que se pueden obtener beneficios en términos
de aumento de resistencia a las temperaturas de congelación
mediante la introducción de una proteína "anticongelación" tal
como el de Winter Flounder (Cutler et al., 1989) o sus
derivados de genes sintéticos. La tolerancia al frío también se
puede conferir mediante el aumento de expresión de la
glicerol-3-fosfato acetiltransferasa
en cloroplastos (Wolter et al., 1992). La resistencia a
estrés oxidante (a menudo exacerbado por las condiciones tales como
temperatura frías en combinación con las intensidades altas de luz)
se pueden conferir mediante la expresión de la superóxido dismutasa
(Gupta et al., 1993), y s puede mejorar mediante la glutatión
reductasa (Bowler et al., 1992). Tales estrategias pueden
permitir la tolerancia a la congelación en campos recientemente
aparecidos así como la extensión de variedades de producción mayor
de maduración tardía a zonas de maduración relativa más
temprana.
Se contempla que la expresión de los genes
novedosos que afectan favorablemente al contenido en agua de las
plantas, potencial de agua total, potencial osmótico, y rigidez
potenciará la capacidad de la planta a la tolerancia a la sequía.
Como se usa en el presente documento, los términos "resistencia a
sequía" y "tolerancia a sequía" se usan para referirse a
un aumento de resistencia o tolerancia en plantas al estrés inducida
por una reducción en la disponibilidad del agua, cuando se compara
con las circunstancias normales, y la capacidad de la planta para
funcionar y sobrevivir en ambientes con bajo contenido en agua. En
este aspecto de la invención se propone, por ejemplo, que la
expresión de los genes que codifican la biosíntesis de solutos
osmóticamente activos, tales como los compuestos de poliol, pueden
impartir protección contra la sequía. Dentro de esta clase están
los genes que codifican la
manitol-L-fosfato deshidrogenasa
(Lee y Saier, 1982) y
trehalosa-6-fosfato sintasa (Kaasen
et al., 1992). Mediante la acción posterior de las fosfatasas
nativas en la célula o mediante la introducción y expresión
conjunta de una fosfatasa específica, estos genes introducidos darán
como resultado la acumulación de o bien manitol o trehalosa,
respectivamente, las cuales se han documentado bien como compuestos
protectores capaces de mitigar los efectos de estrés. La acumulación
de manitol en tabaco transgénico se ha verificado y los resultados
preliminares indican que las plantas que expresan altos niveles de
este metabolito son capaces de tolerar un estrés asmático aplicado
(Tarozynski et al., 1992,
1993).
1993).
De manera adecuada, la eficacia de otros
metabolitos en la protección de cualquier función enzimática (por
ejemplo, alanopina o ácido propiónico) o integridad de la membrana
(por ejemplo, alanopina) se ha documentado (Loomis et al.,
1989), y por lo tanto la expresión de los genes que codifican la
biosíntesis de estos compuestos podría conferir resistencia a la
sequía de una manera similar a o complementaria al manitol. Otros
ejemplos de metabolitos de origen natural que son osmóticamente
activos y/o proporciones algún efecto protector durante la sequía
y/o desecación incluyen fructosa, eritritol (Coxson et al.,
1992), sorbitol, dulcitol (Karsten et al., 1992),
glucosilglicerol (Reed et al., 1984; ErdMann et al.,
1992)sacarosa, estaquiosa (Koster y Leopold, 1988; Blackmann
et al., 1992), rafinosa (Bernal - Lugo y Leopold, 1992),
prolina (Rensburg et al., 1993), glicina, betaína, ononitol
y pinitol (Vernen y Bonhert, 1992). El crecimiento de la cubierta
continuado e incremento del ajuste reproductor durante los momentos
de estrés se aumentarán mediante la introducción y expresión de los
genes tales como los que controlan los compuestos osmóticamente
activos descritos anteriormente y otros de tales compuestos. Los
genes actualmente preferidos que promueven la síntesis de un
compuesto poliol osmóticamente activo son los genes que codifican
las enzimas manitol-1-fosfato
deshidrogenasa, trehalosa-6-fosfato
sintasa y mioinositol 0-metiltransfe-
rasa.
rasa.
Se contempla que la expresión de proteínas
específicas también puede incrementar la tolerancia a la sequía.
Se han asignado tres clases de Proteínas Embriogénicas Tardías
basándose en las similitudes estructurales (véase Dure et
al., 1989). Las tres clases de LEA se han mostrado en la
maduración (es decir, desecación) de la semillas. Dentro de estos 3
tipos de proteínas de LEA, el Tipo II (tipo dehidrina) se han
implicado en general en la tolerancia a la sequía y/o desecación en
las partes vegetativas de las plantas (es decir, Mundy y Chua,
1988; Piatkowski et al., 1990; Yamaguchi - Shinozaki et
al., 1992). Recientemente, la expresión de una LEA de Tipo III
(HVA-1) en tabaco se encontró que influye en la
altura de la planta, madurez y tolerancia a la sequía (Fitzpatrick,
1993). En arroz al expresión del gen HVA-1 influía
en la tolerancia al déficit de agua y salinidad (Xu et al.,
1996). La expresión de los genes estructurales para los tres grupos
de LEA pueden por lo tanto conferir tolerancia a la sequía. Otros
tipos de proteínas inducidas durante el estrés de agua incluían las
tiol proteasas, aldolasas y transportadores de membranas (Guerrero
et al., 1990), que pueden conferir diversas funciones
protectoras y/o de tipo reparador durante el estrés a sequía.
También se contempla que los genes que efectúan la biosíntesis de
lípidos y por lo tanto la composición de las membranas también
podría ser útil confiriendo resistencia a la sequía en la
planta.
planta.
Muchos de estos genes para mejorar la
resistencia a la sequía tienen modos complementarios de acción. De
este modo, se contempla que las combinaciones de estos genes podría
tener efectos aditivos y/o sinérgicos en la mejora de la
resistencia a la sequía en maíz. Muchos de estos genes también
mejoran la tolerancia (o resistencia) a la congelación; el estrés
físico que se contraía durante la congelación y sequía son
similares en naturaleza y se pueden mitigar de una manera similar.
Se puede conseguir beneficio mediante la expresión constitutiva de
estos genes, pero los medios preferidos de expresión de estos genes
novedosos pueden ser mediante el uso de un promotor que induce
rigidez (tales como los promotores para los genes que inducen
rigidez descritos en Guerreo et al., 1990 y Shagan et
al., 1993 que se incorporan en el presente documento por
referencia). Los patrones de expresión espaciales y temporales de
estos genes pueden permitir al maíz que resista mejor el
estrés.
Se propone que la expresión de los genes que
están implicados con los caracteres morfológicos específicos que
permiten el incremento de las extracciones de agua del suelo seco
sería beneficioso. Por ejemplo, la introducción y expresión de los
genes que alteran las características de la raíz pueden potenciar la
captación de agua. También se contempla que la expresión de los
genes que potencian el ajuste reproductor durante los momentos de
estrés sería de valor significativo. Por ejemplo, la expresión de
los genes que mejoran la sincronía del desprendimiento y
receptividad de polen de las partes femeninas de las flores, es
decir, sedas, sería de beneficio. Además se propone que la
expresión de los genes que minimizan la absorción de grano durante
los momentos de estrés incrementaría la cantidad de grano a
cosechar y por lo tanto ser valioso.
Dado el papel global del agua en al
determinación de la producción, se contempla la posibilidad de que
el maíz utilice el agua más eficazmente, mediante la introducción y
expresión de los genes novedosos, mejorará el comportamiento global
incluso cuando la disponibilidad del agua del suelo no está
limitada. Se puede producir la introducción de los genes que
mejoran la capacidad del maíz de maximizar el uso del agua a través
de un intervalo completo de estrés con relación a la disponibilidad
del agua, estabilidad o consistencia de la producción del
comportamiento de la producción.
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Se propone que el incremento de resistencia a
las enfermedades se puede realizar mediante la introducción de los
genes en las plantas monocotiledóneas tal como maíz. Es posible
producir resistencia a las enfermedades provocadas por virus,
bacterias, hongos y nemátodos. También se contempla que el control
de los organismos que producen micotoxinas se pueden realizar
mediante la expresión de los genes introducidos.
La resistencia a los virus se puede producir
mediante la expresión de genes novedosos. Por ejemplo, se ha
demostrado, que la expresión de una proteína de revestimiento global
en una planta transgénica puede impartir resistencia a la infección
de la planta mediante ese virus y quizás otros virus relacionados
estrechamente (Cuozzo et al., 1988, Hemenway et al.,
1988, Abel et al., 1986). Se contempla que la expresión de
genes no codificantes dirigidos s la función viral esencial pueden
impartir resistencia a dichos virus. Por ejemplo, un gen no
codificante dirigido al gen responsable para la replicación de ácido
nucleico viral puede inhibir la replicación y conducir a la
resistencia al virus. Se cree que la interferencia con otras
funciones virales mediante el uso de genes no codificantes también
puede incrementar la resistencia a los virus. Además, se propone
que puede ser posible lograr la resistencia a virus mediante otros
planteamientos, que incluyen, pero no se limitan a, el uso de virus
satélites. Los ejemplos de enfermedades de virus y de tipo virus,
para las que se puede introducir resistencia en una planta
transgénica de acuerdo con la presente invención, se muestran a
continuación en la Tabla 4.
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Se propone que el incremento de la resistencia a
la enfermedad provocada por bacterias y hongos se puede realizar
mediante la introducción de genes novedosos. Se contempla que los
genes que codifican los llamados "antibióticos peptídicos",
proteínas relacionadas con la patogénesis (PR), resistencia a
toxinas, y proteínas que afectan a las interacciones de patógenos
tales como características morfológicas serán útiles. Los
antibióticos péptidicos son secuencias de polipéptidos que son
inhibidoras del crecimiento de bacterias y otros microorganismos.
Por ejemplo, las clases de péptidos se refieren a cecropinas y
magaininas que inhiben el crecimiento de muchas especies de
bacterias y hongos. Se propone que al expresión de las proteínas de
PR en plantas monocotiledóneas tales como maíz pueden ser útiles
confiriendo resistencia a la enfermedad bacteriana. Estos genes se
inducen después del ataque de patógeno en una planta huésped y se
han dividido en al menos cinco clases de proteínas (Bol, Linthorst
y Cornelissen, 1990). Se incluyen entre las proteínas de PR
\beta-1, 3-glucanasas, quitinasas,
y osmotina y otras proteínas que se cree que funcionan en la
resistencia a las plantas en los organismos enfermos. Se han
identificado otros genes que tienen propiedades antifúngicas, por
ejemplo, UDA (lecitina de ortiga picante) y en el documento
(Broakaert et al., 1989; Barkai - Golan et al., 1978).
Se sabe que ciertas enfermedades de plantas están provocadas por la
producción de de fitotoxinas. Se propone que la resistencia a estas
enfermedades se lograrían mediante la expresión de un gen novedoso
que codifica una enzima capaz de degradar o de otra manera
inactivar la fitotoxina. También se contempla que la expresión de
genes novedosos que alteran las interacciones entre la planta
huésped y patógeno puede ser útil en la reducción de la capacidad
del organismo enfermo que invaden los tejidos de las plantas
huéspedes, por ejemplo, un incremento en la característica cérea de
la cutícula de la hoja u otras características morfológicas. Los
ejemplos de enfermedades bacterianas y fúngicas, que incluyen el
oidio velloso, para las que se puede introducir resistencia a una
planta transgénica de acuerdo con la presente invención, se
enumeran a continuación, en las Tablas 5, 6
y 7.
y 7.
Los nematodos parásitos de las plantas son una
causa de enfermedad en muchas plantas, incluyendo el maíz. Se
propone que sería posible preparar las plantas de maíz resistentes a
estos organismos mediante la expresión de genes novedosos. Se
anticipa que el control de las infestaciones por nematodos se
llevaría a cabo alterando la capacidad de los nematodos de
reconocer o unirse a una planta huésped y/o permitir que la planta
produzca compuestos nematicidas, incluyendo pero sin limitación las
proteínas. Los ejemplos de enfermedades de plantas asociadas a
nematodos para las que se puede introducir resistencia en una planta
transgénica de acuerdo con la invención se proporcionan a
continuación, en la Tabla 8.
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La producción de micotoxinas, que incluyen
aflatoxina y fumoninisina, mediante hongos asociados a plantas
monocotiledóneas tal como maíz es un factor significativo haciendo
el grano no útil. Estos organismos fúngicos no provocan síntomas de
enfermedad y/o interfieren con el crecimiento de la planta, pero
producen compuestos químicos (micotoxinas) que son tóxicas para los
animales. Se contempla que la inhibición del crecimiento de estos
hongos reduciría la síntesis de estas sustancias tóxicas y por lo
tanto reducen las pérdidas de grano debido a la contaminación de
micotoxinas. También se propone que puede ser posible introducir
genes novedosos en las plantas monocotiledóneas tal como maíz que
inhibiría la síntesis de la micotoxina sin interferir con el
crecimiento fúngico. Además, se contempla que la expresión de un gen
novedoso que codifica una enzima capaz de hacer la micotoxina no
tóxica sería útil con el fin de lograr una reducción de la
contaminación con micotoxina del grano. El resultado de cualquiera
de los mecanismos anteriores sería una presencia reducida de
micotoxina en el grano.
Se pueden introducir genes en las plantas
monocotiledóneas, particularmente cereales comercialmente
importantes tal como maíz, para mejorar el grano para el que el
cereal se desarrolla principalmente. Se puede contemplar un amplio
intervalo de plantas transgénicas novedosas producidas de esta
manera dependiendo del uso final particular del
grano.
grano.
El mayor uso del grano de maíz es para pienso o
alimentación. La introducción de genes que alteran la composición
del grano puede potenciar en gran medida el valor del pienso o
alimentación. Los componentes principales del grano de maíz son
almidón, proteína, y aceite. Cada uno de estos componentes primarios
del grano de maíz se puede mejorar alterando su nivel o
composición. Se pueden mencionar varios ejemplos para propósitos
ilustrativos, pero de ninguna manera proporcionan una lista
exhaustiva de posibilidades.
La proteína de los granos de cereal que incluye
maíz es subóptima para el propósito de pienso o alimentación
especialmente cuando se alimentan a cerdos, y humanos. La proteína
es deficiente en varios aminoácidos que son esenciales en la dieta
de estas especies, requiriendo la adición de los suplementos al
grano. La limitación de los aminoácidos esenciales puede incluir
lisina, metionina, triptófano, treonina, valina, arginina, e
histidina. Algunos aminoácidos llegan a ser limitantes solamente
después de que el maíz se suplementa con otras entradas para las
formulaciones de pienso. Por ejemplo, cuando el maíz se suplementa
con harina de soja para cumplir los requerimientos de lisina la
metionina llega a ser limitante. Los niveles de los aminoácidos
esenciales en las semillas y grano puede elevarse mediante
mecanismos que incluyen, pero no se limitan a, la introducción de
genes para incrementar la biosíntesis de los aminoácidos, disminuyen
la degradación de los aminoácidos, incrementan el almacenamiento de
aminoácidos en las proteínas, o incrementan el transporte de los
aminoácidos a las semillas o grano.
Un mecanismo para incrementar la biosíntesis de
los aminoácidos es introducir genes que desregulan las rutas de
biosíntesis de aminoácidos de manera que la planta no puede
controlar más de manera adecuada los niveles que se producen. Esto
se puede hacer mediante etapas de desregulación o desvío en la ruta
biosintética de los aminoácidos que están normalmente regulados por
los niveles del producto final de los aminoácidos de la ruta. Los
ejemplos incluyen la introducción de los genes que codifican
versiones desreguladas de las enzimas aspartoquinasas o la ácido
dihidropicolínico (DHDP) - sintasa para incrementar la producción de
lisina y treonina, y la antranilato sintasa para incrementar la
producción de triptófano. La reducción del catabolismo de los
aminoácidos se puede llevar a cabo mediante la introducción de
secuencias de ADN que reducen o eliminan la expresión de los genes
que codifican las enzimas que catalizan las etapas en las rutas
catabólicas tal como la enzima lisina - cetoglutarato reductasa. Se
anticipa que puede ser deseable dirigir la expresión de los genes
con relación a la biosíntesis de aminoácidos al endospermo o embrión
de la semilla.. Más preferiblemente, el gen se dirigirá al embrión.
También será preferible para los genes que codifican las proteínas
implicadas en la biosíntesis de aminoácidos para dirigir la
proteína a un plásmido que usa una secuencia de péptidos de
tránsito de plástidos.
La composición proteica del grano se puede
alterar para mejorar el equilibrio de los aminoácidos de una
diversidad de formas que incluye la elevación de la expresión de
las proteínas nativas, disminución de la expresión de aquellas con
una pobre composición, cambiando la composición de las proteínas
nativas, o introduciendo genes que codifican de manera completa
nuevas proteínas que poseen una composición superior. Los ejemplos
pueden incluir la introducción de ADN que disminuye la expresión de
miembros de la familia zein de las proteínas de almacenamiento.
Este ADN puede codificar las ribozimas o secuencias no codificantes
dirigidas para alterar la expresión de las proteínas zein o la
expresión de reguladores de la expresión de zein tal como el
producto del gen opaco - 2. También se propone que la composición
de proteína del grano se puede modificar mediante el fenómeno de la
supresión conjunta, es decir, la inhibición de la expresión de un
gen endógeno mediante la expresión de un gen estructural idéntico o
fragmento del gen mediante la transformación (Goring et al.,
1991). De manera adicional, el ADN introducido puede codificar
enzimas que degradan zein. La disminución en la expresión de zein
que se logran puede estar acompañada de incrementos en las proteínas
con más composición de aminoácidos deseables o incrementos en otros
constituyentes de semillas principales tales como almidón. Como
alternativa, se puede introducir un gen quimérico que comprende una
secuencia codificadora de una proteína nativa o composición
adecuada de aminoácidos tal como para una de las proteínas de
globulina o zein delta de 10 kD, zein delta de 20 kD, o zein gamma
de 27 kD del maíz y un promotor u otra secuencia reguladora diseñada
para elevar la expresión de dicha proteína. La secuencia
codificadora de dicho gen puede incluir codones adicionales o de
reemplazo para los aminoácidos esenciales. Además, una secuencia
codificadora obtenida de otras especies, o, una secuencia sintética
parcial o completa que codifica una secuencia única completa de
péptidos diseñada para potenciar la composición de aminoácidos de
la semilla se puede emplear. Se anticipa que puede ser preferible
dirigir la expresión de estos transgenes que codifican las proteínas
con una composición superior al endospermo de la semilla.
Puede ser valiosa la introducción de los genes
que alteran el contenido en aceite del grano. Los incrementos de
contenido en aceite puede dar como resultado incrementos en el
contenido de energía metabolizable y densidad de las semillas para
uso en el pienso y alimentación. Los genes introducidos pueden
codificar enzimas que retiran o reducen las limitaciones de la tasa
o etapas reguladas en la biosíntesis de ácidos grasos o lípidos.
Tales genes pueden incluir, pero no se limitan a, los que codifican
acetil-CoA carboxilasa,
ACP-aciltransferasa,
\beta-cetoacil ACP sintasa, más otras actividades
biosintéticas de ácidos grasos bien conocidas. Otras posibilidades
son los genes que codifican las proteínas que no poseen actividad
enzimática tal como la proteína portadora de acilo. Se pueden
introducir genes que alteran el equilibrio de los ácidos grasos
presentes en el aceite que proporciona un forraje más sano o
nutritivo. El ADN introducido también puede codificar secuencias que
bloquean la expresión de las enzimas implicadas en la biosíntesis
de los ácidos grasos, que alteran las proporciones o ácidos grasos
presentes en el grano tal como se describe más adelante. Algunos
otros ejemplos de los genes contemplados específicamente por los
inventares para uso en la creación de plantas transgénicas con
caracteres de composición en aceite alterados incluyen
2-acetiltransferasa, oleosina, complejo de piruvato
deshidrogenasa, acetil CoA sintasa, ATP citrato liasa,
ADP-glucosa pirofosforilasa, y los genes de los
intermedios de
carnitina-CoA-acetil-CoA.
Se anticipa que la expresión de los genes relacionados con la
biosíntesis de aceite se dirigirá al plástico, usando una secuencia
de péptido de tránsito de plástido, y preferiblemente se expresa en
el embrión de la semilla.
Los genes se pueden introducir que potencian el
valor nutritivo del componente de almidón del grano, por ejemplo
incrementando el grado de bifurcación, dando como resultado la
utilización mejorada del almidón en vacas retrasando su
metabolismo. Se anticipa que la expresión de los genes relacionados
con la biosíntesis de almidón se dirigirá preferiblemente al
endospermo de la semilla.
Además de afectar a los constituyentes
principales del grano, se pueden introducir genes que afectan a una
diversidad de otros aspectos nutritivos, de procesamiento u otros de
calidad del grano usado para pienso o alimentación. Por ejemplo, la
pigmentación del grano se puede aumentar o disminuir. La
potenciación y estabilidad de la pigmentación amarilla es deseable
en algunos piensos animales y se puede lograr mediante la
introducción de los genes que dan como resultado la producción
potenciada de xantofilas y carotenos mediante la eliminación de las
etapas que limitan la tasa en su producción. Tales genes pueden
codificar formas alteradas de las enzimas fitoeno sintasa, fitoeno
desnaturasa, o licopeno sintasa. Como alternativa, el maíz blanco no
pigmentado es deseable para la producción de muchos productos de
alimentación y se puede producir mediante la introducción de ADN
que bloquea o elimina las etapas en las rutas de producción de
pigmentos.
La mayoría del contenido en fósforo del grano
está en la forma de fitato, una forma de almacenamiento de fosfato
que no se metaboliza por los animales monogástricos. Por lo tanto,
con el fin de incrementar la capacidad del fosfato de la semilla,
se anticipa que se deseará disminuir la cantidad de fitato en
semilla e incrementar la cantidad de fósforo libre. Como
alternativa, se puede expresar un gen en la semilla de maíz que se
activará, por ejemplo, mediante pH, en el sistema gástrico de un
animal monogástrico y liberará fosfato a partir de fitato, por
ejemplo fitasa.
El pienso o alimento que comprende
principalmente maíz u otros granos de cereal posee cantidades
insuficientes de vitaminas y se debe suplementar para proporcionar
un valor nutritivo adecuado. La introducción de genes que potencia
la biosíntesis de vitaminas en semillas se puede contemplar
incluyendo, por ejemplo, las vitaminas A, E, B_{12}, colina, y
similares. El grano de maíz tampoco posee suficiente contenido
mineral para el valor nutritivo óptimo. Serían valiosos los genes
que afectan a la acumulación o disponibilidad de los compuestos que
contienen fósforo, azufre, calcio, manganeso, cinc, y hierro entre
otros. Un ejemplo puede ser la introducción de un gen que reducía
la producción de ácido fítico o codificaba la enzima fitasa que
potencia la ruptura de ácido fítico. Estos genes incrementarían
los niveles de la fosfatasa disponible en la dieta, reduciendo la
necesidad de suplemento con fosfato mineral.
Se pueden describir otros numerosos ejemplos de
mejora de maíz u otros cereales para los propósitos de pienso y
alimentación. Las mejoras pueden no necesariamente incluir el grano,
pero pueden, por ejemplo, mejorar el valor del maíz para forraje.
La introducción de ADN para llevar a cabo esto podría incluir las
secuencias que alteran la producción de lignina tales como las que
dan como resultado el fenotipo "vena central marrón" asociado
al valor del pienso superior para el ganado.
Además para dirigir las mejoras en el valor del
pienso o alimento, también se pueden introducir genes que mejoran
el procesamiento de maíz y mejoran el valor de los productos que se
producen a partir del procesamiento. El procedimiento principal del
procesamiento del maíz es mediante molienda en húmedo. El maíz se
puede mejorar mediante la expresión de genes novedosas que
incrementan la eficacia y reducir el coste de procesamiento tal
como disminuyendo el tiempo de remojo.
La mejora del valor de los productos molidos en
húmedo puede incluir la alteración de la cantidad o calidad del
almidón, aceite, maíz, harina de gluten, o los componentes del
pienso de gluten de maíz. El incremento de almidón se puede lograr
mediante la identificación y eliminación de las etapas que limitan
la velocidad de la biosíntesis de almidón o disminuyendo los
niveles de los otros componentes del grano que dan como resultado
incrementos proporcionales en almidón. Un ejemplo de lo anterior
puede ser la introducción de los genes que codifican las enzimas
ADP-glucosa pirofosforilasas con la alteración de la
actividad reguladora o que se expresan a un alto nivel. Los
ejemplos de esto último pueden incluir inhibidores selectivos de,
por ejemplo, biosíntesis de proteína o aceite que se expresa durante
las fases últimas o desarrollo del grano.
Las propiedades del almidón se pueden alterar de
manera beneficiosa cambiando la relación de amilasa a amilopectina,
el tamaño de las moléculas de almidón, o su patrón de ramificación.
Mediante estos cambios se puede modificar un amplio intervalo de
propiedades que incluyen, pero no se limitan a, cambios en la
temperatura de gelatinización, calor de gelatinización, claridad de
películas y pastas, propiedades reológicas, y similares. Para llevar
a cabo estos cambios en las propiedades, los genes que codifican
la actividad de la sintasa de almidón unida a gránulo o soluble
o la actividad de la enzima de ramificación se puede introducir sola
o en combinación. El ADN tal como construcciones no codificantes
también se pueden usar para disminuir los niveles de la actividad
endógena de estas enzimas. Los genes o construcciones introducidos
pueden poseer secuencias reguladoras que regulan su expresión a
intervalos específicos en la biosíntesis de almidón y desarrollo de
gránulos de almidón. Además, puede merecer la pena introducir y
expresar genes que dan como resultado la derivación in vivo,
u otra modificación, de los restos de glucosa de la molécula de
almidón. Se puede contemplar la unión covalente de cualquier
molécula, limitado solamente por la existencia de enzimas que
catalizan las derivaciones y la accesibilidad de los sustratos
apropiados en el gránulo de almidón. Los ejemplos de las
derivaciones importantes pueden incluir la adición de grupos
funcionales tales como aminas, carboxilos, o grupos fosfato que
proporcionan sitios para las derivaciones posteriores in
vitro o afectan las propiedades de almidón mediante la
introducción de cargas iónicas. Los ejemplos de otras
modificaciones pueden incluir los cambios directos de las unidades
de glucosa tal como la pérdida de los grupos hidroxilo o su
oxidación a los grupos aldehído o carboxilo.
El aceite es otro producto de molienda en húmedo
de maíz, el valor del cual se puede mejorar mediante la introducción
y expresión de los genes. La cantidad de aceite que se extraer
mediante la molienda en húmedo se puede elevar mediante
planteamientos como se describe para pienso y alimento
anteriormente. Las propiedades de aceite también se pueden alterar
para mejorar su comportamiento en la producción y uso de aceite para
cocinar, grasa para freír, lubricantes u otros productos derivados
de aceite o su mejora, atributos de salud cuando se usa en las
aplicaciones relacionadas con los alimentos. Los ácidos grasos
novedosos también se pueden sintetizar tras la extracción pueden
servir como materiales de partida para la síntesis química. Los
cambios en las propiedades del aceite se pueden lograr mediante
alteración del tipo, o disposición de lípidos de los ácidos grasos
presentes en el aceite. A su vez se puede llevar a cabo mediante la
adición de genes que codifican enzimas que catalizan la síntesis de
los ácidos grasos novedosos, y los lípidos que los poseen o mediante
el incremento de los niveles de ácidos grasos nativos mientras
posiblemente se reducen los niveles de los precursores. Como
alternativa, se pueden introducir secuencias de ADN que ralentizan
o bloquean las etapas de la biosíntesis de ácidos grasos que dan
como resultado el incremento de los intermedios de ácidos grasos
precursores. Los genes que se podrían añadir incluyen desaturasas,
epoxidasas, hidratasas, deshidratasas, y otras enzimas que catalizan
las reacciones que implican los intermedios de ácidos grasos. Los
ejemplos representativos de las etapas catalíticas que se pueden
bloquear incluyen la desnaturalización de ácido esteárico a oleico y
ácido oleico a linolénico dando como resultado las acumulaciones
representativas de los ácidos esteáricos y oleicos. Otro ejemplo es
el bloqueo de las etapas de alargamiento que dan como resultado la
acumulación de ácidos grasos saturados de C_{8} a C_{12}.
Las mejoras en los otros productos de molienda
en húmedo de maíz principales, harina de gluten de maíz y pienso de
gluten de maíz también se pueden conseguir mediante la introducción
de genes para obtener plantas de maíz novedosas. Las posibilidades
representativas incluyen pero no se limitan a los descritos
anteriormente para la mejora del valor del alimento y pienso.
Además, se puede considerar adicionalmente que
la planta de maíz a usar para la producción o fabricación de de
los compuestos biológicos útiles que o bien no se producirán del
todo, o no se producirán al mismo nivel, en la planta de maíz
anteriormente. Las plantas de maíz novedosas que producen estos
compuestos se hace posible mediante la introducción y expresión de
genes mediante procedimientos de transformación de maíz. La vasta
disposición de posibilidades incluyen pero no se limitan a cualquier
compuesto biológico que se produce actualmente por cualquier
organismo tales como proteínas, ácidos nucleicos, metabolitos
primarios e intermedios, polímeros de carbohidratos, etc. Los
compuestos se pueden producir por la planta, extraerse tras la
recolección y/o procesamiento, y usarse para cualquier propósito
reconocido actualmente tales como compuestos farmacéuticos,
fragancias y enzimas industriales para mencionar unos pocos.
Las posibilidades adicionales para ejemplificar
el intervalo de caracteres de grano o propiedades codificadas
potencialmente por los genes introducidos en las plantas
transgénicas incluyen grano con menos susceptibilidad a la ruptura
para propósitos de exportación o tamaño de abrasivo mayor cuando se
procesa mediante molienda en seco mediante la introducción de genes
que potencian la síntesis de \gamma-zein,
palomitas de maíz con una mejora en la calidad de formación de
burbujas y volumen de expansión mediante los genes que incrementan
el espesor del pericarpio, maíz con grano más blanco para uso
alimentarios incluso la introducción de genes que bloquean de
manera eficaz la expresión de las enzimas implicadas en las rutas de
producción de pigmentos, y calidad mejorada de bebidas alcohólicas
o maíz dulce mediante la introducción de genes que afectan al sabor
tales como el gen shrunken 1 (que codifica la sacarosa sintasa) o el
gen shrunken 2 (que codifica la ADPG pirofosforilasa) para el maíz
dulce.
Dos de los factores que determinan cuando el
maíz se puede desarrollar son la temperatura diaria media durante
la estación de desarrollo y la duración del tiempo entre heladas.
Dentro de las áreas en las que es posible desarrollar maíz, existen
diversas limitaciones en el tiempo máximo que permite el
crecimiento hasta la maduración y que se recolecte. El maíz que se
desarrolla en un área particular se selecciona por su capacidad de
madurar y secar para reducir el contenido en humedad para que se
pueda recolectar dentro del período requerido de tiempo con la
producción máxima posible. Por lo tanto, el maíz de maduraciones
variables se desarrolla para las diferentes localidades de
crecimiento. Aparte de la necesidad de secar los suficientemente
para permitir la recolección es deseable que tenga lugar un secado
máximo en el campo para minimizar la cantidad de energía requerida
para el secado adicional después de la recolección. También, cuanto
más fácilmente se puede secar el grano, más tiempo hay disponible
para el desarrollo y llenado del grano. Se considera que los genes
que influyen en la maduración y/o secado se puede identificar e
introducir en las líneas de maíz que usan técnicas de
transformación para crear nuevas variedades de maíz adaptadas a los
diferentes lugares de crecimiento o el mismo lugar de crecimiento,
pero que tienen una mejora en la relación de producción a humedad en
la recolección. La expresión de los genes que se implican en la
regulación del desarrollo de la planta puede ser especialmente
útiles, por ejemplo, los genes de "liguleless" y vaina rugosa
que se han identificado en
maíz.
maíz.
Se contempla que los genes se pueden introducir
en las plantas monocotiledóneas que mejorarían las características
de soporte y otras características de crecimiento de plantas. La
expresión de los genes novedosos que confieren tallos más fuertes,
mejora en los sistemas radiculares, o que previenen o reducen de la
caída mazorca serían de gran valor para el agricultor. Se propone
que sería ventajosa la introducción y expresión de los genes que
incrementan la distribución de la luz y/o intercepción. Además, la
expresión de los genes que incrementan la eficacia de la
fotosíntesis y/o la cubierta de la hoja incrementaría además la
productividad de los granos. Se contempla que puede ser ventajoso
la expresión de un gen fitocromo en maíz. La expresión de tal gen
puede reducir la dominancia apical, conferir semi enanismo en una
planta, e incrementar la tolerancia a la sombra (Patente de Estados
Unidos Nº 5.268.526). tales planteamientos permitirían el incremento
de poblaciones de plantas en el campo.
El retraso en el envejecimiento vegetativo de la
temporada incrementaría el flujo de asimilación en el grano y de
esta manera incrementar la producción. Se propone que la sobre
expresión de los genes en el maíz que se asocian al "verde
permanente" o la expresión de cualquier gen que retrasa el
envejecimiento sería ventajosa. Por ejemplo, se ha identificado un
mutante de no amarillamiento en Festuca pratensis (Davies
et al., 1990). La expresión de este gen así como otros puede
prevenir la ruptura prematura de la clorofila y de esta manera la
función de la cubierta.
La capacidad de utilizar los nutrientes
disponibles puede ser un factor limitante en el desarrollo de las
plantas monocotiledóneas tal como maíz. Se propone que sería posible
alterar la captación de nutrientes, extremos de tolerancia a pH,
movilización a través de la planta, acumulaciones de almacenamiento,
y disponibilidad para las actividades metabólicas mediante la
introducción de genes novedosos. Estas modificaciones permitirían
que una planta tal como maíz para utilizar de una manera más eficaz
los nutrientes. Se contempla que un incremento en la actividad de,
por ejemplo, una enzima que normalmente está presente en la planta y
está implicada en la utilización de nutrientes implicaría la
disponibilidad de un nutriente. Como ejemplo de tal enzima estaría
la fitasa. Además se contempla que es deseable la potenciación del
nitrógeno utilizado por la planta de maíz. La expresión de un gen
de la glutamato deshidrogenasa en maíz, por ejemplo, los genes
gdhA de E. coli, pueden conducir al incremento de la
fijación de nitrógeno en los compuestos orgánicos. Además, la
expresión de gdhA en maíz puede conducir a la resistencia
potenciada al herbicida glufosinato mediante la incorporación de un
exceso de amoníaco en glutamato, por lo tanto destoxificación del
amoníaco. También se contempla que la expresión de un gen novedoso
puede hacer que una fuente de nutrientes sea disponible que
previamente no era accesible, por ejemplo, una enzima que libera un
componente de valor nutritivo de más de una molécula compleja,
quizás una macromolécula.
La esterilidad masculina es útil en la
producción de semilla híbrida. Se propone que la esterilidad
masculina se puede producir mediante la expresión de genes
novedosos. Por ejemplo, se ha mostrado que la expresión de las
genes que codifican las proteínas que interfieren con el desarrollo
de la inflorescencia masculina y/o gametofito da como resultado la
esterilidad masculina. Los genes de la ribonucleasa quimérica que
se expresan en las anteras del tabaco transgénico y aceite de
semilla de colza se ha demostrado que conduce a la esterilidad
masculina (Mariani et al., 1990).
Se descubrieron numerosas mutaciones en maíz que
confieren esterilidad masculina citoplásmica. En particular una
mutación, denominada citoplasma T también se relaciona con la
sensibilidad a la roya de hojas de maíz Southern. Una secuencia de
ADN, denominada TURF-13 (Levings, 1993), se
identificó que se correlaciona con el citoplasma T. Se propone que
sería posible mediante la introducción de TURF-13
mediante transformación, para separar la esterilidad masculina de
la sensibilidad a la enfermedad. Ya que es necesario ser capaz de
de restablecer la esterilidad masculina para propósitos de mejora
genética y para la producción de grano, se propone que se puedan
introducir los genes que codifican el restablecimiento de la
fertilidad masculina.
La introducción de los genes que codifican los
caracteres que se pueden seleccionar pueden ser útiles para la
eliminación de genes unidos no deseables. Se contempla que cuando
se introducen os o más genes conjuntamente mediante la
transformación conjunta de manera que los genes se unirán
conjuntamente en el cromosoma huésped. Por ejemplo, un gen que
codifica un gen de Bt que confiere resistencia a insectos en
la planta se puede introducir en una planta conjuntamente con un
gen bar que es útil como un marcador que se puede seleccionar
y confiere resistencia al herbicida Liberty ® en la planta. Sin
embargo, puede no ser deseable tener una planta resistente a
insectos que también es resistente al herbicida Liberty ®. Se
propone que también se puede introducir un gen bar no
codificante que se expresa en los tejidos en los que no se desea la
expresión del gen bar, por ejemplo en las partes de plantas
entera. Por lo tanto, aunque el gen bar se expresa y es útil
como un marcador que se puede seleccionar, no es útil para conferir
resistencia a herbicidas en la planta entera. El gen no codificante
bar es un marcador que se puede seleccionar negativo.
También se contempla que la selección negativa
es necesaria con el fin de rastrear una población de transformantes
para los recombinantes homólogos generados mediante la dirección de
los genes. Por ejemplo, un recombinante homólogo se puede
identificar mediante la inactivación de un gen que se expresó
previamente en la célula. El gen no codificante para neomicina
fosfotransferasa II (NPT II) se ha investigado como un marcador que
se puede seleccionar negativo en tabaco (Nicotiana tabacum)
y Arabidopsis thaliana (Xiang, y Guerra, 1993). En este
ejemplo, tanto los genes NPT II codificantes como no codificantes se
introducen en una planta mediante la transformación y las plantas
resultantes son sensibles al antibiótico kanamicina. Un gen
introducido que se integra en el cromosoma de la célula huésped en
el sitio del gen no codificante NPT II, e inactiva el gen no
codificante, harán la planta resistente a kanamicina y otros
antibióticos aminogicósidos. Por lo tanto, los antibióticos raros,
específicos del sitio se pueden identificar mediante rastreo para
resistencia a antibióticos. De manera similar, cualquier gen,
nativo para la planta o introducido mediante la transformación, que
cuando se inactiva confiere resistencia a un compuesto, puede ser
útil como un marcador que se puede seleccionar negativo.
Se contempla que los marcadores que se pueden
seleccionar negativos también pueden ser útiles de otras formas.
Una aplicación es construir líneas transgénicas en las que se puede
seleccionar la transposición a sitios no unidos. En el proceso de
etiquetado es lo más común para el elemento que se puede transponder
que se mueva a un sitio genéticamente se una en el mismo cromosoma.
Sería útil un marcador que ser puede seleccionar para la
recuperación de las plantas raras en las que la transposición se ha
producido a un locus no unido. Por ejemplo, la enzima citosina
desaminasa puede se útil para este propósito (Stouggard, 1993). En
la presencia de esta enzima el compuesto
5-fluorocitosina se convierte
5-fluorouracilo que es tóxico para la planta y
células animales. Si un elemento que se puede transponder se une al
gen de la enzima citosina desaminasa, se puede seleccionar para la
transposición a sitios no unidos mediante la selección de episodios
de transposición en los que la planta resultante es ahora
resistente a 5-fluorocitosina. Las plantas
precursoras y plantas que contienen transposiciones a los sitios
unidos permanecerán sensibles a 5-fluorocitosina. La
resistencia a 5-fluorocitosina se debe a la pérdida
del gen de la citosina desaminasa mediante la segregación genética
del elemento que se puede transponder y el gen de la citosina
desaminasa. Otros genes que codifican las proteínas que hacen que
la planta sea sensible a un cierto compuesto también será útil en el
contexto. Por ejemplo, el gen 2 de ADN-T de
Agrobacterium tumefaciens codifica una proteína que cataliza
la conversión de \alpha-naftaleno acetamida (NAM)
en ácido \alpha-naftaleno acético (NAA) hace que
las células de las plantas sean sensibles a altas concentraciones
de NAM (Depicker et al., 1988).
También se contempla que los marcadores que se
pueden seleccionar negativos pueden ser útiles en la construcción
de líneas de etiquetado de transposones. Por ejemplo marcando un
elemento que se puede transponder autónomo tal como Ac, Master Mu,
o En/SPn con un marcador que se puede seleccionar negativo, se
pueden seleccionar transformantes en los que el elemento autónomo
no se integra de manera estable en el genoma. Se propone que sería
deseable, por ejemplo, cuando al expresión transitoria del elemento
autónomo se desea para activar en trans la transposición de un
elemento que se puede transponder defectuoso, tal como Ds, pero no
se desea la integración estable del elemento autónomo. La presencia
del elemento autónomo puede no ser deseado con el fin de
estabilizar el elemento defectuoso, es decir, prevenirlo de una
transposición posterior. Sin embargo, se propone que si se desea la
integración estable de un elemento que se puede transponder autónomo
en una planta la presencia de un marcador que se puede seleccionar
negativo puede hacerlo posible para eliminar el elemento autónomo
durante del proceso de mejora genética.
El ADN se puede introducir en maíz y otras
plantas monocotiledóneas con el fin de expresar tránscritos de ARN
que funcionan para afectar el fenotipo de las plantas todavía no
traducidos en proteína. Dos ejemplos de ARN y ARN con actividad de
ribozima. Ambos pueden servir las funciones posibles en la reducción
o eliminación de la expresión de los genes de plantas nativos o
introducidos.
Los genes se pueden construir o aislar, que
cuando se transcriben, producen ARN no codificante que es
complementario a todos (s) o parte (s) de un (os) ARN mensajero (s)
dirigido (s). El ARN no codificante reduce la producción del
producto polipeptídico del ARN mensajero. El producto polipeptídico
puede ser cualquier proteína codificada por el genoma de la planta.
Los genes anteriormente mencionados se denominarán genes no
codificantes. Un gen no codificante se puede introducir de esta
manera en una planta mediante procedimientos de transformación para
producir una planta transgénica novedosa con la expresión reducida
de una proteína seleccionada de interés. Por ejemplo la proteína
puede ser una enzima que cataliza una reacción en la planta. La
reducción de la actividad enzimática puede reducir o eliminar
productos de la reacción que incluyen cualquier compuesto
sintetizado de manera enzimática en la planta tales como ácidos
grasos, aminoácidos, carbohidratos, ácidos nucleicos y similares.
Como alternativa, la proteína puede ser una proteína de
almacenamiento, tal como una zein, o una proteína estructural, la
disminución de la expresión que puede conducir a cambios en la
composición de los aminoácidos de las semillas o cambio
morfológicos de las plantas respectivamente. Las posibilidades
citadas se proporcionan solamente a modo de ejemplo y no
representan el amplio intervalo de aplicaciones.
Los genes también se pueden construir o aislar,
cuando se transcriben producen enzimas de ARN, o ribozimas, que
pueden actuar como endorribonucleasas y catalizan la escisión de las
moléculas de ARN con secuencias seleccionadas. La escisión los ARN
mensajeros seleccionados pueden dar como resultado la producción
reducida de sus productos polipeptídicos codificados. Estos genes
se pueden usar para preparar plantas transgénicas novedosas que los
poseen. Las plantas transgénicas pueden poseer niveles reducidos de
polipéptidos que incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos
citados anteriormente que pueden estar afectados por el ARN no
codificante.
También es posible que los genes se pueden
introducir para producir las plantas transgénicas novedosas que han
reducido la expresión de un producto génico nativo mediante un
mecanismo de la supresión conjunta. Se ha demostrado en tabaco,
tomate, y petunia (Goring et al., 1991; Smith et al.,
1990; Napoli et al., 1990; van der Krol et al., 1990)
que la expresión del tránscrito codificante de un gen nativo
reducirá o eliminará la expresión del gen nativo de una manera
similar a la observada para los genes no codificantes. El gen
introducido puede codificar toda o parte de la proteína nativa
dirigida pero su traducción puede no ser requerida para la
reducción de los niveles de su proteína nativa.
Los elementos de ADN que incluyen los de los
elementos que se pueden transponder tales como Ds, Ac, o Mu, se
pueden insertar en un gen para provocar mutaciones. Estos elementos
de ADN se pueden insertar con el fin de inactivar (o activar) un
gen y por lo tanto "etiquetar" una unidad particular. En este
caso el elemento que se puede transponder no provoca la
inestabilidad de la mutación etiquetada, debido a la utilidad del
elemento no depende de su capacidad para moverse en el genoma. Una
vez que se ha etiquetado un carácter deseado, la secuencia de ADN
introducido se puede usar para clonar el gen correspondiente, por
ejemplo, usando la secuencia de ADN introducida como un cebador de
PCR conjuntamente con las técnicas de clonación del gen de PCR
(Shapire, 1983; Dellaporta et al., 1988). Una vez
identificado (s) el (los) gen (es) entero (s) para el carácter
particular, que incluye regiones de control o reguladores cuando se
desea, se pueden aislar clonar y manipular según se desee. La
utilidad de los elementos de ADN introducidos en un organismo para
los propósitos de etiquetado de genes es independiente de la
secuencia de ADN y no depende de cualquier actividad biológica de
la secuencia de ADN, es decir, la transcripción en ARN o traducción
en proteína. La única función del elemento de ADN es romper la
secuencia de ADN de un gen.
Se contempla que las secuencias de ADN no
expresado, que incluyen secuencias sintéticas novedosas, se pueden
introducir en las células como "marcas" de propiedad de sus
células y plantas y semillas. No sería necesario que un elemento de
ADN con marca rompiera la función de un gen endógeno al organismo
huésped, ya que la única función de este ADN sería identificar el
origen del organismo. Por ejemplo, se puede introducir una secuencia
de ADN única en una planta y este elemento de ADN identificaría
todas las células, plantas, y progenie de estas células que han
surgido de la fuente marcada. Se propone que la inclusión de los ADN
marcados serían capaces de distinguir el plasma germinal de
propiedad o plasma germinal derivado de ellos, a partir de plasma
germinal no marcado.
Otro posible elemento que se puede introducir es
un elemento de región unido a matriz (MAR) tal como el elemento de
la lisozima A de pollo (Stief, 1989), que se puede posicionar
alrededor de un gen que se puede expresar de interés para efectuar
un incremento en la expresión global del gen y disminuir los
efectos dependientes de la posición tras la incorporación en el
genoma de la planta (Stief et al., 1989; Phi - Van et
al., 1990).
Se contempla de manera específica por los
inventores que se pueden emplear técnicas para la integración o
escisión específica del sitio de los transgenes preparados de
acuerdo con la presente invención. Una ventaja de la integración o
escisión específica del sitio es que se puede usar para superar los
problemas asociados a las técnicas de transformación convencionales
en las que los transgenes típicamente al azar se integran en un
genoma huésped y en múltiples copias. Esta inserción al azar del ADN
introducido en el genoma de las células huéspedes puede ser letal
si el ADN foráneo se inserta en un gen esencial. Además, la
expresión de un transgen puede estar influenciada por los
"efectos de posición" provocados por el ADN genómico
circundante. Además, debido a las dificultades asociadas a la
transformación de múltiples copias transgénicas, que incluyen la
silenciación de los genes, recombinación y herencia no predecible,
es típicamente deseable para controlar el número de copias del ADN
insertado, a menudo solamente deseando la inserción de una sola
copia de la secuencia de ADN.
La integración o escisión específica del sitio
de los transgenes o partes de los transgenes se puede lograr en las
plantas mediante recombinación homóloga (véase, por ejemplo, la
patente de Estados Unidos Nº 5.527.695, que se incorpora en el
presente documento de manera específica por referencia en su
totalidad). La recombinación homóloga es una reacción entre
cualquier par de secuencias de ADN que tienen una secuencia similar
de nucleótidos, cuando las dos secuencias interactúan (se
recombinan) para formar una especie de ADN recombinante nueva. La
frecuencia de recombinación homóloga se incrementa a medida que la
longitud de las secuencias de ADN de nucleótidos compartidas
aumenta y es mayor con las moléculas de plásmidos lineales que con
las moléculas de plásmidos circulares. Se puede producir la
recombinación homóloga entre dos secuencias de ADN que son menos que
idénticas, pero la frecuencia de recombinación disminuye a medida
que la divergencia entre las dos secuencias aumenta.
Las secuencias de ADN introducidas se pueden
dirigir mediante la recombinación homóloga por la unión de una
molécula de ADN de interés a las secuencias que comparten homología
con las secuencias endógenas de la célula huésped. Una vez que el
ADN entra en la célula huésped. Una vez que el ADN entra en la
célula, las dos secuencias homólogas pueden interactuar para
insertar el ADN introducido en el sitio donde se localizan las
secuencias de ADN genómicas homólogas. Por lo tanto, la elección de
las secuencias homólogas contenidas en el ADN introducido,
determinará el sitio donde el ADN introducido se integra mediante
recombinación homóloga. Por ejemplo, si la secuencia de ADN de
interés se limita a las secuencias de ADN que comparten la homología
con una sola copia del gen de una célula vegetal huésped, la
secuencia de ADN de interés se insertará mediante la recombinación
homóloga en solamente ese sitio específico único. Sin embargo, si al
secuencia de ADN de interés sed une a las secuencias de ADN que
comparten homología con una copia múltiple del gen de la célula
eucariótica huésped, después la secuencia del ADN de interés se
puede insertar mediante la recombinación homóloga en cada uno de
los sitios específicos donde se localiza una copia del gen.
El ADN se puede insertar en el genoma huésped
mediante la reacción de recombinación homóloga que implica o bien
una sola recombinación recíproca (que da como resultado la inserción
de de la longitud entera del ADN introducido) o mediante una
recombinación recíproca doble (que da como resultado la inserción de
solamente el ADN localizado entre los dos casos de recombinación).
Por ejemplo si se desea insertar un gen foráneo en el sitio del
genoma donde se localiza un gen seleccionado, el ADN introducido
debe contener secuencias homólogas al gen seleccionado. Un solo
caso de recombinación homóloga después daría como resultado la
secuencia de ADN introducida entera que se inserta en el gen
seleccionado. Como alternativa, se puede lograr un caso de
recombinación doble flanqueando cada extremo de la secuencia de ADN
de interés (la secuencia que se propone que se inserte en el
genoma) con las secuencias de ADN homólogas a al gen seleccionado.
Un caso de recombinación homóloga que implica cada una de las
regiones flanqueantes darán como resultado la inserción del ADN
foráneo. De este modo solamente las secuencias de ADN localizadas
entre las dos regiones que comparten homología genómica se llegan a
integrar en el genoma.
Aunque las secuencias introducidas se pueden
dirigir para la inserción en un sitio genómico específico mediante
la recombinación homóloga en eucariotas superiores es un caso
relativamente raro comparado con los casos de inserción al azar. En
las células vegetales, las moléculas de ADN foráneos encuentran
secuencias homólogas en el genoma de las células y se recombinan a
aproximadamente 0,5 - 4,2 X 10 ^{-4}. De esta manera cualquier
célula transformada que contiene una secuencia de ADN introducida
integrada mediante la recombinación homóloga también probablemente
contendrá numerosas copias de las secuencias de ADN introducidas
integradas al azar. Por lo tanto, para mantener el control sobre el
número de copias y la localización del ADN insertado, estas
secuencias de ADN insertadas al azar se pueden eliminar. Una manera
de eliminar estas inserciones al azar es utilizar un sistema de
recombinasa específico del sitio. En general, un sistema de
recombinasa específico del sitio consta de tres elementos: dos
pares de secuencias de ADN (las secuencias de recombinación
específicas del sitio) y una enzima específica (la recombinasa
específica del sitio). La recombinasa específica del sitio
catalizará una reacción de recombinación solamente entre dos
secuencias de recombinación específicas del sitio.
Se puede emplear un número de sistemas de
recombinasa específica del sitio de acuerdo con la presente
invención, incluyendo, pero sin limitación, el sistema Cre/lox del
bacteriófago PI (patente de Estados Unidos Nº 5.658.772, que se
incorpora de manera específica en el presente documento por
referencia en su totalidad), el sistema FLP/FRT de levadura (Golic
y Lindquist, 1989), la Gin recombinasa del fago Mu (Maeser et
al., 1991), la Pin recombinasa de E. coli (Enomoto et
al., 1983), y el sistema R/RS del plásmido pSR1 (Araki et
al., 1992). El bacteriófago P1 Cre/lox y los sistemas de
levaduras FLP/FRT constituyen dos sistemas particularmente útiles
para la integración o escisión específica del sitio de los
transgenes. En estos sistemas una recombinasa (Cre o FLP)
interactuarán de manera específica con su secuencia de
recombinación específica del sitio (lox o FRT respectivamente) para
invertir o eliminar las secuencias que intervienen. La secuencia de
cada uno de estos dos sistemas es relativamente corta (34 pares de
bases para lox y 47 pares de bases para FRT) y por lo tanto,
conveniente para el uso con los vectores de transformación.
El sistema de la FLP/FRT recombinasa se ha
demostrado que funciona de manera eficaz en las células vegetales.
Los experimentos sobre el comportamiento del sistema FLP/FRT en
tanto los protoplastos de maíz como de arroz indican que la
estructura del sitio FRT, y cantidad de la proteína FLP presente,
afecta a la actividad de la eliminación. En general, los sitios de
FRT incompletos conducen a una acumulación mayor de los productos
de eliminación que los sitios de FRT de longitud completa. Los
sistemas pueden catalizar tanto las reacciones intra como
intermolecular en los protoplastos de maíz, lo que indica su
utilidad para la eliminación del ADN así como las reacciones de
integración. La reacción de recombinación es reversible y esta
reversibilidad puede comprometer la eficacia de la reacción en cada
dirección. La alteración de la estructura de las secuencias de
recombinación específicas del sitio es un planteamiento para
remediar esta situación. La secuencia de recombinación específica
del sitio se puede mutar de manera que el producto de la reacción
de recombinación no se reconozca más como un sustrato para la
reacción inversa, por lo tanto estabilizando el episodio de
integración o exclusión.
En el sistema Cre - lox descubierto en el
bacteriófago P1, la recombinación entre los sitios loxP se produce
en la presencia de la Cre recombinasa (véase, por ejemplo, la
patente de Estados Unidos nº 5.658.772). Este sistema se ha
utilizado para eliminar un gen localizado entre dos sitios lox que
se ha introducido en un genoma de levadura (Sauer, 1987). Cre se
expresó a partir de un promotor GAL1 de levadura que se puede
inducir y este gen Cre se localizó en un vector de levadura de
replicación de manera autónoma.
Ya que el sitio lox es una secuencia asimétrica
de nucleótidos, sitios lox en la misma molécula de ADN pueden
tener la misma u opuesta orientación con relación entre sí, la
recombinación entre los sitios lox en la misma orientación da como
resultado una supresión del segmento de ADN localizado entre los dos
sitios lox y una conexión entre los extremos resultantes de la
molécula de ADN original. El segmento de ADN suprimido forma una
molécula de ADN circular. La molécula de ADN original y la molécula
de ADN circular resultante contiene cada una un solo sitio lox. La
recombinación entre los sitios lox en orientaciones opuestas en la
misma molécula de ADN da como resultado una inversión de la
secuencia de nucleótidos del segmento de ADN localizado entre los
dos sitios lox. Además, se puede producir el intercambio recíproco
de los segmentos de ADN próximos a los sitios lox localizados en
dos moléculas de ADN diferentes. Todos estos casos de recombinación
se catalizan por es producto de la región codificadora Cre.
Pueden ser deseables en las realizaciones
particulares de la presente invención purificar las proteínas
codificadas por los transgenes de la presente invención. Como
alternativa, las proteínas nativas se pueden aislar a partir de una
planta como parte de un esfuerzo para clonar un gen que codifica la
proteína aislada, o el promotor que dirige la expresión del gen.
Una vez que una proteína está a mano, la proteína se puede
secuenciar y la secuencia codificadora del gen deducido. Se pueden
producir sondas o cebadores basándose en la secuencia de ADN
deducida, permitiendo por lo tanto la elongación pertinente del gen
correspondiente.
Las técnicas de purificación de proteínas se
conocen bien por los expertos en la técnica. Estas técnicas
implican, a un nivel, el fraccionamiento en bruto del medio celular
en las fracciones polipetídicas y no polipeptídicas. Habiendo
separado el polipéptido de las otras proteínas, el polipéptido de
interés se puede purificar además usando técnicas cromatográficas y
electroforéticas para lograr la purificación práctica o completa (o
purificación hasta la homogeneidad). Los procedimientos analíticos
adecuados particularmente para la preparación de un péptido puro
son cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión,
electroforesis en gel de poliacrilamida, y localización
isoeléctrica. Un procedimiento particularmente eficaz de la
purificación de péptidos es la cromatografía líquida de proteína
rápida. O incluso HPLG.
Son bien conocidas por los expertos en la
técnica diversas técnicas adecuadas para uso en la purificación de
proteínas. Éstas incluyen, por ejemplo, la precipitación con sulfato
de amonio, PEG, anticuerpos y similares o mediante
desnaturalización por calor, después de centrifugación; etapas de
cromatografía tales como intercambio iónico, filtración en gel,
fase inversa, hidroxiapatita u afinidad, cromatografía;
localización isoeléctrica; electroforesis en gel; y las
combinaciones de estas y otras técnicas. Como en general se sabe en
la técnica de se cree que el orden de llevar a cabo las diversas
etapas de purificación se pueden cambiar, o se pueden omitir
ciertas etapas, y todavía da como resultado un procedimiento
adecuado para la preparación de una proteína o péptido
sustancialmente purificado.
No existe ningún requerimiento general para la
que la proteína o péptido siempre se proporcionarán en su estado
más purificado. De hecho, se contempla que productos menos
purificados sustancialmente tendrán utilidad en ciertas
realizaciones. La purificación parcial se puede llevar a cabo
mediante el uso de unas pocas etapas de purificación en
combinación, o mediante la utilización de las formas diferentes del
mismo esquema de purificación general. Por ejemplo, se aprecia que
una columna de intercambio catiónico realizada utilizando un
aparato de HPLC dará como resultado una mayor purificación "de
veces" que la misma técnica que utiliza un sistema de
cromatografía de baja presión. Los procedimientos que muestran un
menor grado de purificación relativa pueden tener ventajas en la
recuperación total del producto proteico, o manteniendo la
actividad de una proteína expresada.
Se sabe que la migración de un polipéptido puede
variar, en algunos casos de manera significativa con diferentes
condiciones de SDS/PAGE (Capaldi et al, 1977). Por lo tanto
se apreciará que en condiciones diferentes de electroforesis,
pueden variar los pesos moleculares aparentes de los productos
purificados o parcialmente purificados.
La cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC) se caracteriza por la rápida separación con la resolución
extraordinaria de los máximos. Esto se logra mediante el uso de las
partículas muy finas y alta presión para mantener un caudal
adecuado. La separación se puede llevar a cabo en cuestión de
minutos o como mucho una hora. Además se necesita un volumen muy
pequeño de la muestra debido a que las partículas son tan pequeñas
y empaquetadas tan próximas que el volumen vacío es una fracción muy
pequeña del volumen del lecho. También, la concentración de la
muestra no necesita ser muy grande debido a que las bandas son tan
estrechas que es muy poca la dilución de la muestra.
La cromatografía en gel, o cromatografía por
tamices moleculares, es un tipo especial de cromatografía de
partición que se basa en el tamaño molecular. La teoría detrás de la
cromatografía en gel es que la columna, que se prepara con
partículas de una sustancia inerte que contiene poros pequeños,
separa partículas mayores de las partículas más pequeñas ya que
pasan a través de o alrededor de los poros, dependiendo de su
tamaño. Mientras que el material de las partículas que se hacen no
adsorben las moléculas, el único factor que determina el flujo es
el tamaño. Por lo tanto, las moléculas se eluyen de la columna por
la disminución de tamaño, mientras que la forma es relativamente
constante. La cromatografía en gel es inmejorable para la
separación de moléculas de tamaño diferente debido a que la
separación es independiente de todos los factores tales como pH,
resistencia iónica, temperatura, etc. Tampoco existe virtualmente
ninguna adsorción, menos distribución de zonas y el volumen de
elución se relaciona de una manera simple con el peso molecular.
Cromatografía de afinidad es un procedimiento
cromatográfico que depende de la afinidad específica entre un
sustrato a aislar y la molécula que se puede unir a ella
específicamente. Existe una interacción de tipo receptor - ligando.
El material de la columna se sintetiza mediante acoplamiento
covalente de una de las dos parejas de unión a una matriz
insoluble. El material de columna después es capaz de adsorber
específicamente la sustancia de la solución. La elución se produce
mediante cambio de las condiciones a aquellas en las que la unión no
se producirá (pH alterado, resistencia iónica, temperatura,
etc).
Un tipo particular de cromatografía de afinidad
útil en la purificación de carbohidrato que contiene compuestos es
cromatografía de afinidad de lectina. Las lectinas son una clase de
sustancias que se unen que se unen a una diversidad de
polisacáridos y glicoproteínas. Las lectinas se acoplan usualmente a
agarosa mediante bromuro de cianógeno. La conconavalina A acoplada
a Sefarosa era el primer material de este tipo a usar y se ha usado
de manera amplia en el aislamiento de polisacáridos y glicoproteínas
diferentes de las lectinas que se han incluido son lentina de
lenteja, aglutinina de germen de trigo que ha sido útil en la
purificación de restos de N-acetil glucosaminil y
lectina de Helix pomatia. Las propias lectinas se purifican
usando cromatografía de afinidad con ligandos de carbohidratos. La
lactosa se ha usado para purificar lectinas a partir de semilla de
ricino y cacahuetes; la maltosa ha sido útil en la extracción de
lectinas de lentejas o habichuela (canavalia, Canavalia
ensiformis); N-acetil-D
galactosamina se usa para purificar, lectinas;
N-acetil glucosaminil que se une e a lectinas de
germen de trigo; D-galactosamina se ha usado en la
obtención de lectinas de las almejas y L-fucosa se
unirá a las lectinas de loto.
La matriz debe ser una sustancia que ella misma
no adsorbe las moléculas en cualquier grado significativo y que
tiene un amplio intervalo de estabilidad química, física y térmica.
El ligando se debe acoplar de tal forma que no afecte a sus
propiedades de unión. El ligando también debe proporcionar una unión
relativamente estrecha. Y debe ser posible eluir la sustancia sin
destruir la muestra sobre el ligando. Una de las formas más comunes
de cromatografía de afinidad es la cromatografía de inmunoafinidad.
La generación de anticuerpos que sería adecuada para uso de acuerdo
con la presente invención se describe más adelante.
Gen exógeno: un gen que normalmente no
está presente es un genoma huésped dado en la forma presente del gen
exógeno. A este respecto, el propio gen puede ser nativo para el
genoma humano, sin embargo, el gen exógeno comprenderá el gen
nativo alterado mediante la adición o supresión de de uno o más
elementos reguladores diferentes. Un tipo de gen exógeno
contemplado por el inventor que es de utilidad particular en la
presente invención comprende un gen de maíz unido de manera
operativa a un promotor del género Coix.
Expresión: la combinación de los procesos
intracelulares, que incluyen la transcripción y traducción que se
lleva a cabo mediante la codificación de una molécula de ADN tal
como un gen estructural que produce un polipéptido.
Progenie: cualquier generación posterior,
que incluye las semillas y las plantas de la misma, que se deriva
de una planta precursora particular o conjunto de plantas
precursoras.
Promotor: un sitio de reconocimiento en
una secuencia de ADN o grupo de secuencias de ADN que proporcionan
un elemento de control de la expresión para un gel estructural y a
dicho ARN. Una polimerasa se une de manera específica e inicia la
síntesis de ARN (transcripción) del gen.
Regeneración: El proceso de crecimiento
de una planta a partir de una célula de la planta (por ejemplo,
protoplastos de la planta o explanta).
ADN seleccionado: Un segmento de ADN que
se ha introducido en un genoma huésped. Los ADN seleccionados
preferidos incluirán uno o más genes exógenos y los elementos para
expresar un gen exógeno en una célula huésped, por ejemplo, un
promotor y un terminador. El beneficio se puede conseguir incluyendo
uno o más elementos potenciadores con el ADN seleccionado.
Transformación: Un procedimiento de
introducción de una secuencia o construcción de ADN exógeno (por
ejemplo, un vector o módulo de expresión) en una célula o
protoplasto en el que ese ADN exógeno se incorpora en un cromosoma
o es capaz de de la replicación autónoma.
Célula transformada: Una célula cuyo ADN
ha sido alterado por la introducción de una molécula de ADN exógeno
en dicha célula.
Transgen: Un segmento de ADN que se
introduce en un genoma huésped. Los transgenes ejemplares
proporcionarán la célula huésped, o las plantas regeneradas de la
misma, con un fenotipo novedosos con relación a la célula o planta
correspondiente no transformada. Los transgenes pueden codificar
proteínas, ARN solamente o no transcribirse o traducirse. una
planta individual se puede proporcionar con un transgen directamente
mediante transformación o mediante la herencia de o ambos de los
precursores de la planta.
Célula transgénica: Cualquier célula
derivada o regenerada a partir de una célula transformada. Las
células transgénicas ejemplares incluyen callos de plantas
derivados de de una célula vegetal transformada y particularmente
las células tales como hoja, raíz, tallo, por ejemplo, células
somáticas, o células reproductivas (germinales) obtenidas a partir
de una planta transgénica.
Planta transgénica: Una planta o progenie
de cualquier generación posterior derivada de la misma, de una
célula o protoplasto vegetal transformado, en el que el ADN de la
planta contiene una molécula de ADN exógeno introducido que no está
originalmente presente en una planta nativa, no transgénica de la
misma cepa. La planta transgénica puede de manera adicional
contener secuencias que son nativas para planta que se está
transformando, pero donde el gen "exógeno" se ha alterado
mediante medios tecnológicos de genes con el fin de alterar el
nivel de la expresión de los genes.
Péptido de tránsito: Una secuencia de
polipéptidos que es capaz de dirigir un polipéptido a un orgánulo
particular u otra localización dentro de una célula.
Vector: Una molécula de ADN capaz de
replicación en una célula huésped y/o a la que otro segmento de ADN
se puede unir de manera operativa de manera que se lleve a cabo la
replicación del segmento unido. Un plásmido es un vector ejemplar
de una molécula de ADN usada para transportar nuevos genes al
interior de las células. Un plásmido es un vector ejemplar que es
una pieza de ADN independiente, estable, de autorreplicación.
Los siguientes ejemplos se incluyen para mostrar
las realizaciones preferidas de la invención. Se debe apreciar por
los expertos en la técnica que las técnicas descritas en los
ejemplos que siguen representan las técnicas descubiertas por el
inventor funcionan bien en la práctica de la invención, y de este
modo se pueden considerar que constituyen los modos preferidos para
su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica a la luz de la
presente descripción, aprecian que se pueden realizar muchos
cambios en las realizaciones específicas que se describen y todavía
obtienen un resultado parecido o similar sin salirse del concepto,
espíritu y alcance de la invención. Más específicamente, será
evidente que ciertos agentes que están tanto químicamente como
fisiológicamente relacionados se pueden sustituir por los agentes
descritos en el presente documento aunque se lograrían el mismo o
similares resultados. Todos estos sustitutos similares y
modificaciones evidentes para los expertos en la técnica se
consideran que están dentro del espíritu, alcance y concepto de la
invención como se define por las reivindicaciones anexas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Semillas de Coix lacryma - jobi
(documento PI 320865) se obtuvieron de la Estación de Introducción
de Plantas USDA/ARS, Ames, IA. Se hicieron germinar las semillas y
se dejó que se desarrollaran en el invernadero durante varias
semanas. Se preparó el ADN genómico a partir de material de las
hojas de de 2 - 3 semaans de edad de acuerdo con el siguiente
protocolo. Tejido de hojas congelado (2 gramos de peso de carne) se
molió en un polvo fino con una barra de vidrio en nitrógeno
líquido. El tejido pulverizado se mezcló concienzudamente con 8 ml
de de tampón de extracción (100 mM Tris, pH 8,0; 50 mM EDTA; % v/v
de SDS; 500 mM NaCl), calentado previamente hasta 60ºC, seguido de
una incubación a 45ºC a 60ºC. Después la muestra se mezcló con 2,5
ml de acetato de potasio 5 M enfriado en hielo y después se incubó
en hielo durante 20 minutos. Se eliminaron los agregados de
proteína mediante centrifugación a 3750 rpm durante 20 minutos y se
purgó el sobrenadante mediante una capa de Miraxloth seguido de la
precipitación de ADN mezclando con 5 ml de alcohol isopropílico. El
ADN precipitado se recogió mediante centrifugación a 375 rpm
durante 15 minutos. Se retiró mediante vertido el sobrenadante del
ADN sedimentado y el tubo se invirtió durante 5 minutos para
permitir que el sobrenadante residual se drenara del sedimento. El
ADN se volvió a suspender en 300 \mul de agua que contenía 50 mM
Tris, pH 8,0, 10 mM EDTA y 3 \mul de ARNasa (10 mg/ml de solución
madre). El ADN se precipitó de nuevo mezclando con 50 \mul de un
acetato de amonio 4,4 M, pH 5,2, y 350 \mul de alcohol
isopropílico, seguido de la centrifugación en una microcentrífuga a
14.000 rpm durante 10 minutos. El sedimento de ADN se lavó con 750
\mul de etanol al 80% v/v y después se dejó drenar mediante
inversión durante 10 minutos. El ADN se volvió a suspender en 200
\mul de agua que contenía 10 mM Tris, pH 8,0 y 1 mM EDTA. Las
genotecas de ADN genómico se prepararon, para uso como moldes de
PCR, con el kit de Genoma Walter PCR (Clontech, Palo Alto, CA) se
acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Un segmento de ADN localizado en 5' de la
proteína de coixina gamma que codifica la secuencia se amplificó
después por la PCR como sigue. Un conjunto encajado de cebadores de
oligonucleótidos se prepararon diseñados, gCoix5' encaje2
(SEQ ID Nº 1) y gCoix5' encaje3 (SEQ ID Nº 2), que
corresponde a las posiciones 267 - 288 y 26 - 53 respectivamente de
la secuencia de coixina gamma publicada (Nº de acceso del Genbank
X59850). Los cebadores denominados AP1 (SEQ ID Nº 3) y AP2 (SEQ ID
Nº 4), también se usaron y se proporcionan en el kit "Genoma
Walter" de (Clontech). La secuencia de los cebadores es como
sigue:
gCoix5' encaje2 =
CTGGAACTGGAACGGGCTTGGA
\vskip1.000000\baselineskip
gCoix5' encaje3 =
GCGAGGGCAACGAGCAGCACCTTCATGG
\vskip1.000000\baselineskip
AP1 = GTAATACGACTCACTATAGGGC
AP2 = ACTATAGGGCACGCGTGGT
La PCR se realizó como sigue: Primero el Sistema
de la PCR de Molde largo (Boehringer Manheim (Indianápolis, IN) se
usó de acuerdo con las instrucciones del fabricante con las
excepciones siguientes, cada reacción contenía: 350 \muM de dNTPs
500 nM de cada cebador, 50 mM Tris - HCl, pH 9,2; 14 mM
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 3,0 mM MgCl_{2} y 2 \mul
(< 25 ng) de ADN de de molde de la genoteca de Genoma Walter. Los
cebadores que se usaron primero fueron gCoix5' encaje2 y el
cebador adaptador AP1. Se llevaron a cabo las siguientes
condiciones de ciclación usando un termociclador MJ Research
PTC-100 con una tapa caliente.
95º - 1 minuto. 1 ciclo
94º - 30 segundos
72º - 3 minutos. 7 ciclos
94º - 30 segundos
67º - 3 minutos. 32 ciclos
67º - 4 minutos. 1 ciclo
4º - mantenido
Los productos de esta reacción se diluyó después
1 : 25 con agua y se usaron 2 \mul como molde para una segunda
ronda de amplificación. Los cebadores se cambiaron al conjunto
encajado de gCoix5' encaje3 y el cebador adaptador AP2. Los
únicos otros cambios estaban en el propia ciclación, que era como
sigue:
95º - 1 minuto. 1 ciclo
94º - 30 segundos
72º - 3 minutos. 5 ciclos
94º - 30 segundos
67º - 3 minutos. 20 ciclos
67º - 4 minutos. 1 ciclo
4º - mantenido
Se aislaron las bandas de tamaño apropiado (500
pares de bases o mayores) mediante electroforesis en gel y escisión
de bandas y se clonaron en el vector de plásmido pCR2.1, de acuerdo
las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Carsbad, CA). La
secuenciación de ADN se realizó usando los oligonucleótidos de
costumbre o los cebadores localizados en el vector y el kit de
secuenciación desoxi de tinte ABI (Perkin - Elmer, Applyed
Biosystems, Norwalk, CT) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Se analizaron las reacciones de secuenciación usando un
secuenciador de ADN ABI Prism 373 (Perkin - Elmer, Applyed
Biosystems). Después de obtener la secuencia de los extremos 3' y
5' del producto de la PCR, se diseñaron los cebadores con los
caracteres de la conveniente enzima de restricción convenientes
para permitir la amplificación y posterior clonación del promotor
de la coixina gamma directamente del ADN genómico. Se sintetizaron
los cebadores gcs-1000 seq5'xho (SEQ ID Nº 5),
gcs-1pcr3'xba (SEQ ID Nº 6) y
gcs-1pcr3' neo (SEQ ID Nº 7). Las secuencias de los
cebadores fueron como sigue:
La amplificación del promotor de la coixina
gamma se llevó a cabo después con los cebadores
gcs-1pcr3' neo y gcs-1pcr3'xba
usando el kit de la PCR High Fidelity (Boehringer Mannheim). La
mezcla de reacción contenía 200 ng de molde de ADN genómico de
Coix, 200 \muM dNTPs, 500 nM de cada cebador, y 5 \mul de
10X tampón nº 2. Las condiciones de ciclación llevadas a cabo con
un termociclador MJ Research PCT-100 con una tapa
caliente, fueron como sigue:
95º - 2 minutos. 1 ciclo
94º - 1 minuto.
56º - 1 minuto.
72º - 1 minuto. 32 ciclos
72º - 4 minutos.
4º - mantenido
Después de la amplificación, el amplicón se
digirió con NcoI y XhoI para la clonación direccional en el vector
de expresión de GUS pDGP827 (mcs/GUS/nos en la estructura central de
pSP72; Promega Corp., Madison, WI). La inserción del promotor
entero así como las uniones de inserción, se secuenciaron y el
vector se designó pDPG844 (Fig. 1). Después se realizó la
secuenciación del ADN usando los oligonucleótidos de costumbre o
cebadores localizados ene l vector y el kit de secuenciación desoxi
de tinte ABI (Perkin - Elmer, Applyed Biosystems, Norwalk, CT) de
acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se analizaron las
reacciones de secuenciación usando un secuenciador de ADN ABI Prism
373 (Perkin - Elmer, Applyed Biosystems). La secuencia de la
inserción del promotor se proporciona en la SEQ ID Nº 8.
Se realizó una amplificación paralela del
fragmento del promotor de la coixina gamma usando los cebadores
gcs-1pcr3'xba y gcs-1000 seq5'xho.
El producto de amplificación se digirió con XbaI y XhoI y se ligó en
el vector de expresión pDPG828 de GUS (mcs/rice Actin
IntrónI/GUS/nos en la estructura central de pSP72). Las uniones de
inserción así como la inserción entera se secuenciaron y se designó
el vector pDPG845 (Fig. 2).
Para la construcción de los plásmidos pDPG846
(Fig. 3) y pDPG847 (Fig. 4), se realizó la amplificación del
promotor de la coixina gamma usando el kit de la PCR High Fidelity
(Boehringer Mannheim) (Boheringer Mannheim) y los cebadores
gcx-1per3'xba (SEQ ID Nº 6) y
gcx-(400)pcr5'xbo (SEQ ID Nº 24). El producto de
amplificación se digirió con XbaI y XhoI y se ligó en el vector de
expresión pDPG827 de GUS (mcs/GUS/nos en la estructura central de
pSP72) y pDPG828 (mcs/rice Actin IntrónI/GUS/nos en la estructura
central de pSP72 para crear los vectores pDPG847 y pDPG846,
respectivamente. Las uniones de la inserción y la inserción del
promotor entero se secuenciaron para confirmar la construcción
apropiada de los vectores. La secuencia de la inserción del
promotor se proporciona en la SEQ ID Nº 19.
Los plásmidos pDPG848 (Fig. 5) y pDPG849 (Fig.
6) se construyeron en paralelo a la construcción de pDPG846 y
pDPG847. El fragmento del promotor de la coixina gamma se amplificó
por PCR usando el kit de la PCR High Fidelity (Boehringer
Mannheim). Y los cebadores gcs-1pcr3'xba (SEQ ID Nº
6) y gcs-(220)pcr5'xho (SEC ID Nº 25). El producto de
amplificación se digirió con XbaI y XhoI y se ligó en los vectores
de expresión de GUS pDPG827 (mcs/GUS/nos en la estructura central
de pSP72) y pDPG828 (mcs/rice Actin IntrónI/GUS/nos en la estructura
central de pSP72 para crear los vectores pDPG849 y pDPG848,
respectivamente. Las uniones de la inserción y la inserción del
promotor entero se secuenciaron para confirmar la construcción
apropiada de los vectores. La secuencia de la inserción del
promotor se proporciona en la SEQ ID Nº 18. Las secuencias de gcs-
(400)pcr5'xho y gcs-(220)pcr5'xho se proporcionan más
adelante en la SEQ ID nº 21 y la SEC ID Nº 25.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El kit del Genoma de Walter y las genotecas de
ADN genómico usados para aislar el promotor de la coixina gamma se
usaron de manera adicional para el aislamiento de las secuencias
del terminador de la coixina gamma. Todas las concentraciones de la
PCR y condiciones de ciclación permanecían idénticas a las usadas
para el aislamiento del promotor, (Ejemplo 1) para todas las
rondas. Los únicos cambios estaban en los cebadores específicos de
la coixina usados. La primera ronda de la PCR se realizó usando los
cebadores gcx-5'pcr (SEQ ID Nº 9) y API, y la
segunda ronda con los cebadores gCoix3' encaje2 (SEQ ID Nº
10) y AP2. La secuencia de los cebadores fue como
sigue:
sigue:
El producto de amplificación se separó mediante
electroforesis de gel, seguido de la escisión de una banda de
tamaño apropiado, elución de la banda y clonación del ADN en el
vector pCR2.1 (Invitrogen, Carsbad, CA), de acuerdo con las
instrucciones del fabricante y se secuenció. Este clon que contenía
el terminador de la coixina gamma, se designó DV108 (Fig 11). La
secuencia del terminador se proporciona en la SEQ ID Nº 11.
Para obtener la secuencia de codificación de la
proteína de de la coixina gamma, se usó la amplificación de la PCR
para el aislamiento de un producto de amplificación que contenía
tanto la secuencia de codificación como el promotor del gen de la
coixina gamma. La amplificación se llevó a cabo usando los cebadores
gcx-1000seq5'xho (SEQ ID 12) y gCoix3'
pcrSEQ ID Nº 12) se proporcionan a continuación
El kit "Master Amp" (Epicentre
Technologies, Madison, WI) se usó para optimizar la amplificación.
La secuencia del producto de amplificación del
promotor/codificación se obtuvo usando el tampón D y el siguiente
programa En un Robocycler (Stratagene).
94º - 2 minutos. 1 ciclo
94º - 1 minuto.
73º - 1 minuto.
72º - 1 minuto. 32 ciclos
72º - 4 minutos. 1 ciclo
6º - mantenido
Después el amplicón se clonó en pCR2.1. Usando
esta construcción como un molde, se diseñó para obtener la
secuencia de codificación y el promotor como productos de reacción
separados. Se diseñaron los siguientes cebadores, gCoix 5'
pcr+4 (SEQ ID Nº 14) y gCoix 3'pcr+ sac (SEQ ID Nº 15) para
la amplificación de la secuencia de codificación sola:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Estos cebadores corresponden a las bases 31 - 51
y 607 - 627 respectivamente de la secuencia del Genbank
anteriormente indicada. El uso del cebador gCoix 5' pcr+4 da
como resultado un producto de amplificación que acrece del codón de
inicio para la proteína de la coixina gamma. Se usó el kit de la PCR
High Fidelity de Boehringer Mannheim con una mezcla de reacción de
100 pg del molde del plásmido, 500 nM de cada cebador 1X Tampón I
y 200 \muM dNTP en una concentración final de MgCl_{2}. Las
condiciones de ciclación, usando un termociclador MI Research
PTC-100 con una tapa caliente, fueron como
sigue:
94º - 2 minutos. 1 ciclo
94º - 1 minuto.
62º - 1 minuto.
72º - 1 minuto. 32 ciclos
72º - 4 minutos. 1 ciclo
4º - mantenido
Este producto de reacción después se purificó
mediante electroforesis en gel y escisión de banda y se digirió con
SacI para la clonación en pDPG845. El plásmido pDPG845 se preparó
mediante digestión con NcoI y posterior llenado de la protuberancia
en 5' con Klenow o mediante la adición de 2 unidades de la enzima
Klenow y dNTPs hasta una concentración final de 0,2 mM cada una.
Esto permitió la ligación directa del codón de partida ATG al
extremo 5' se la secuencia de codificación de la proteína de la
coixina gamma, restableciendo de esta manera el marco abierto de
lectura completo de la coixina gamma. El vector después se digirió
con SacI y se retiró la secuencia de codificación de GUS para dejar
un sitio compatible para el extremo 3' de la secuencia de
codificación de la coixina gamma. El vector pDPG845 preparado y la
secuencia de codificación de la proteína de la coixina gamma se
ligaron después conjuntamente para formar el nuevo vector denominado
pDPG851 (Fig.
9).
9).
Para facilitar el reemplazo del terminador
nos en pDPG851 con el terminador de la coixina gamma, el
módulo de expresión se movió a un vector más adecuado, por ejemplo
pBK-CMV (Stratagene, la Jolla, CA). Esto se realizó
digiriendo pBK-CMV con ScaI (romo) y pDPG851 con
XhoI y ClaI con un relleno posterior de Klenow de las
protuberancias en 5' (2 unidades de Klenow y 0,2 mM de cada dNTP).
El módulo de pDPG851 y la estructura central de
pBK-CMV se purificaron en gel. Después los dos
plásmidos se ligaron para generar pDPG862 (Fig.
10).
10).
El terminador de la coixina gamma se clonó en el
extremo 3' de la secuencia de codificación de la coixina gamma en
pDPG862. Esto se llevó a cabo primero retirando el terminador nos y
después clonación de el terminador de la coixina purificada en su
lugar realizando las etapa como se indica más adelante, la secuencia
de codificación de la coixina gamma posee un sitio ScaI en
la posición 620 - 625 de la secuencia del GenBank reseñada. Este
sitio de restricción, que está presente en pDPG862 y DV108 como
resultado de la porción de la secuencia de codificación obtenida
por el procedimiento del Genoma Walter, se cortó con ScaI, así como
con NotI. La secuencia del terminador de la coixina gamma se
purificó después en gel así como la estructura central de pDPG862.
Estos dos fragmentos se ligaron para generar pDPG869 (Fig. 7). La
secuencia de la secuencia de codificación de la coixina gamma se
proporciona en la SEQ ID Nº 16. Cada uno de estas construcciones de
genes se introdujeron mediante bombardeo particular en las células
que se pueden regenerar de maíz como se describe en el ejemplo 5 y
6 más
adelante.
adelante.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
El kit del Genoma de Walter y las genotecas de
ADN genómico usados para aislar las secuencias del promotor y
terminador en los ejemplos 1 y 2 también se usaron para el
aislamiento del terminador de la Oleosina 3 de Coix. Todas las
concentraciones de la PCR y condiciones de ciclación permanecían
idénticas a las usadas en los ejemplos, para todas las rondas. Los
únicos cambios estaban en los cebadores específicos de la Coix que
se usaron. La primera ronda de la PCR se realizó usando los
cebadores cx-L3 3' encaje1 (SEQ ID Nº 26) y AP1
(SEQ ID Nº 3) y API, y la segunda ronda con los cebadores
cx-L3 3' encaje2 (SEQ ID Nº 27),
cx-L3 3' encaje3, SEQ ID Nº 28) y AP2. Las
secuencias de los cebadores eran como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos de amplificación se separaron
mediante electroforesis de gel, seguido de la escisión de una banda
de tamaño apropiado (> 500 pares de bases), elución de la banda y
clonación del ADN en el vector pCR2.1 (Invitrogen) se llevó a cabo
de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se secuenció como
se ha descrito anteriormente. Este clon que contenía el terminador
de la oleosina Coix, se designó DV12. La secuencia del
terminador de oleosina se proporciona en la SEQ ID Nº 17.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Las prolaminas gamma son una clase de proteínas
de almacenamiento de la semilla presentes en el endospermo de
Coix, sorgo y maíz. Se llevó a cabo para determinar las
secuencias de manera similar entre el promotor de prolamina gamma
de Coix Coixina gamma, SEQ ID Nº 8), clonadas por los
inventores como se describe en el ejemplo 1 y las regiones del
promotor de prolamina de las secuencias correspondientes de sorgo
(kafirina gamma, SEQ ID Nº 22, Nº de acceso del GenBank X62480), y
maíz (zein gamma, SEQ ID Nº 23º de acceso del GenBank X56117). Se
hicieron las alineaciones 894 nucleótidos cadena abajo del codón de
inicio de la traducción usando el software de análisis de ADN
GeneWorks (Intelligenetics, Inc., Mountainview, CA). Se introdujeron
huecos para facilitar la alineación. El extremo más 3' de cada
secuencia corresponde al codón de inicio ATG. Los resultados de la
comparación se proporcionan en la Fig 8 y Tabla 9. Los análisis
indican un 65% de identidad de secuencia entre la coixina gamma y
la kafirina gamma y un 63% de identidad de secuencia entre la
coixina gamma y la zein gamma. Estos resultados indicaban
diferencias significativas entre las regiones promotoras en cada
una de estas
especies.
especies.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se prepararon los microproyectiles como sigue:
se prepararon partículas de oro mediante la adición de 60 mg de
partículas de oro de 0,6 \mum (BioRad, nº de catálogo 165 - 2262)
a 1000 \mul de etanol absoluto e incubando durante al menos 3
horas a temperatura ambiente seguido de almacenamiento a -20ºC. Se
centrifugaron en una microcentrífuga veinte a treinta y cinco
\mul de las partículas de oro estériles y más preferiblemente 30
a 35 \mul de partículas de oro (30 \mul contienen 1,8 mg de
partículas) durante hasta 1 min. Los sobrenadantes se retiraron y
se añadió un mililitro de agua estéril al tubo, seguido de la
centrifugación a 1800 - 2000 rpm durante 2,5 minutos. Las
partículas de microproyectiles se volvieron a suspender en 25 - 30
\mul de solución de ADN que contenían aproximadamente 250 \mul
de ADN vector.
Se añadieron después doscientos veinte
mililitros de agua estéril, 250 \mul de CaCl_{2} 2,5 M y 50
\mul de solución madre de espermidina en 986 \mul de agua) a la
solución que contenía la partícula. Después la solución se mezcló
concienzudamente y se colocó en hielo, seguido de agitación en un
aparato vortex a 4ºC durante 10 minutos y centrifugación a 500 rpm
durante 3 minutos. Se retiró el sobrenadante y se volvió a
suspender en sedimento en 600 \mul de etanol absoluto. Después de
la centrifugación a 500 rpm durante 5 minutos, el sedimento se
volvió a suspender en 36 - 38 \mul de etanol absoluto, se agitó
en un aparato vortex durante aproximadamente 20 segundos, y se
sonicó durante 20 - 30 segundos. En esta fase las partículas se
dejaron de manera típica sedimentar durante 2 - 5 minutos, después
de lo cual se añadieron 5 - 10 \mul del sobrenadante y se
dispensaron sobre la superficie de un disco con aletas y el etanol
se dejó secar hasta sequedad completamente. Como alternativa, las
partículas se retiraron directamente después de que se hayan vuelto
a suspender y se agitaron en un aparato vortex durante 20 a 30
segundos en 36 \mul - 38 \mul de etanol, colocados en el disco
con aletas y se dejó secar hasta sequedad como se ha hecho para el
tratamiento de sedimentación. La cámara de bombardeo se evacuó
después hasta aproximadamente 28 pulgadas de Hg (94,819 kPa) antes
del bombardeo. Después las partículas se usaron para el bombardeo
mediante un chorro de hielo de aproximadamente 1100 psi (7584,2
kPa) usando el dispositivo de bombardeo de partículas DuPont
Bilistics PDS1000He.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se escindieron embriones inmaduros (1,2 - 3,0 mm
de longitud) del genotipo Hi-II de maíz a partir de
espigas crecidas en invernadero, esterilizadas en la superficie de
Hi-II 10 - 12 días después de la polinización. El
genotipo Hi-II se desarrolló a partir de un cruce
A188 x B73 (Armstrong et al., 1991). Aproximadamente 30
embriones por placa petri se sembraron mediante el eje hacia abajo
sobre un medio N6 modificado que contenía 1 mg/ml de 2,4 D, 100
mg/l de hidrolizado de caseína, 6 mM L-prolina, 0,5
g/l ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico (MES),
0,75 g/l de MgCl_{2}, y sacarosa al 2% solidificado con 2 g/l de
Gelgro, pH 5,8 (medio nº 735). Los embriones se cultivaron en la
oscuridad durante dos a cuatro días a 24ºC.
Aproximadamente 3 - 4 horas antes del bombardeo,
los embriones se transfirieron al medio de cultivo anterior con un
incremento de la concentración de sacarosa de 3% a 12%. Cuando los
embriones se transfirieron al medio osmótico alto se dispusieron en
círculos concéntricos sobre la placa, comenzando a 1 cm del centro
de la placa posicionada de tal manera que su extremo de coleorriza
se orientó hacia el centro de la placa. Usualmente dos círculos
concéntricos se formaron con 25 - 35 embriones por placa.
Las placas que contienen embriones se colocaron
al nivel de un tercio a partir del fondo, 5 cm por debajo del
filtro de parada. Las placas de ruptura a 1110 psi (7584,2 kPa) se
usaron para bombardeo. Cada placa de embriones se bombardeó una
vez con la pistola de partículas DuPont Biolistics PDS1000He.
Después del bombardeo, a los embriones se les dejó recuperar en el
medio osmótico alto (735, sacarosa al 12%) durante toda una noche
(16 - 24 horas) y después se transfirieron al medio de selección que
contenían 1 mg/ml de bialafos (nº 739, 735 más 1 mg/ml de bialafos
o nº 750, 735 más 0,2 M manitol y 1 mg/ml de bialafos). Los
embriones se mantuvieron en la oscuridad a 24ºC. Después de tres a
cuatro semanas de la selección inicial aproximadamente 90% de los
embriones típicamente formaban el callo de Tipo II y se
transfirieron al medio selectivo que contenía 3 mg/ml de bialafos
(nº 758). El análisis de Southern se puede usar para el análisis de
transformantes y se pueden llevar a cabo ensayos de expresión
génica. Las construcciones usadas para la
\hbox{transformación y número de transformantes se proporcionan más adelante, en la tabla 10.}
Ejemplo
7
La identificación de los elementos reguladores
putativos dentro de cada secuencia del promotor se inicia mediante
la comparación con las secuencias del promotor conocidas para
expresarse de una manera específica del tejido o de manera
progresiva única. Las secuencias que son compartidas entre los
promotores con patrones de expresión similares son probablemente
candidatos para la unión de los factores de transcripción y de esta
manera son probablemente elementos que confieren patrones de
expresión. La confirmación de estos elementos reguladores putativos
se logra mediante análisis de supresión de cada promotor seguido del
análisis funcional de cada construcción de supresión mediante
ensayo de un gen indicador que está unido de manera funcional a cada
construcción.
Tal análisis se llevaron a cabo sobre el
promotor de la coixina gamma clonado. La alineación de la secuencia
de ADN del promotor de la coixina gamma de Coix con los
promotores de los genes de zein gamma de maíz y kafirina gamma de
sorgo, llevada a cabo como se ha descrito en el ejemplo 4, revelaron
varias regiones cortas de homología que representan los sitios de
unión al factor de transcripción potencial. Varios de estos sitios
también se han identificado de manera previa como regiones
reguladoras putativas de promotores de la proteína de
almacenamiento de sorgo (Ottoboni et al., 1993; de Freitas
et al., 1994). Se identificaron cuatro regiones reguladoras
putativas. Se predicen dos regiones que confieren la actividad del
promotor general, potencialmente en respuesta al estatus del
nitrógeno, y estas regiones se denominan regiones de tipo GCN4. Se
predicen dos regiones adicionales para conferir la expresión
específica de tejidos y se denominan regiones de unión de la
casilla de prolamina. Los elementos se disponen entre 180 y 700
pares de bases a partir del sitio de partida de la traducción,
siendo una casilla GCN4 la más próxima al codón de metionina de
inicio (-190 pares de bases), seguido de una casilla de prolamina
(- 395 pares de bases), una segunda casilla de GCN4 (- 525 pares de
bases) y finalmente, una segunda casilla de prolamina (- 650 pares
de bases).
Las secuencias de promotor truncadas se
diseñaron para retirar de manera específica los elementos
reguladores específicos de tejidos putativos mediante la generación
de los fragmentos del promotor de 412 (SEQ ID Nº 19) y 222 pares de
bases (SEQ ID Nº 18) (distancias entre el sitio de inicio de la
traducción). El fragmento del promotor de 412 pares de bases
incluye solamente los motivos de las casilla GCN4 y prolamina
proximales, mientras que el fragmento de 222 pares de bases incluye
solamente el motivo GCN4 proximal, con ambas regiones de las
casillas de prolamina retiradas. De este modo los fragmentos del
promotor, además del promotor de la coixina gamma de longitud
completa, se clonaron en vectores que contenían el gen indicador de
GDS, con y sin el intrón de la actina 1 de arroz que potencia la
expresión. Estos vectores se han denominado pDPG844, 845, 846, 847,
848 y 849, y su construcción se ha descrito anteriormente. Cada
construcción se bombardeó en los embriones de maíz inmaduros (como
se ha descrito en el ejemplo 6) y se regeneraron las plantas que
contenían cada una de las construcciones del promotor : GUS como
transgenes.
Las plantas que contenían estos transgenes se
analizaron para la expresión del gen indicador de GUS en todos los
tejidos de plantas en muchas fases de desarrollo diferentes. Se
predice que las construcciones más cortas del promotor (221 pares
de bases, pDPG848 y pDPG849) no mostrarán los patrones de expresión
específicos de tejidos ya que este promotor acrece de las regiones
reguladoras de la casilla de prolamina. Se predice además que las
construcciones del promotor de de 412 pares de bases pDPG846 y
pDPG847) retendrán la especificidad del tejido, dirigirán los
niveles inferiores de expresión cuando se comparan con las
construcciones del promotor de longitud completa (pDPG844 y
pDPG845).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
La expresión de un módulo de expresión de zein
codificante en maíz se ha mostrado que induce la supresión de la
supresión de zein exógena si el gen de zein se controla mediante un
promotor de maíz. Con el fin de demostrar que ninguna supresión se
produciría si se usa un promotor de Coix, se pueden llevar a
cabo estudios de transformación y realizar comparaciones entre las
construcciones expresadas por maíz o promotores de Coix.
Tales estudios se llevan a cabo como sigue.
Se transformaron células de maíz con el vector
del plásmido pDPG531, que comprende un promotor Z27 unido de manera
operativa a una secuencia que codifica ZA codificante de maíz y la
región 3' de la nopalina sintasa, como se ha descrito en la patente
de Estados Unidos Nº de serie 08/763.704, presentada el 9 de
diciembre de 1996, cuya descripción se incorpora de manera
específica en el presente documento por referencia en su totalidad.
pDPG521 se preparó cortando un fragmento de aproximadamente 960
pares de bases del vector SPZ4Ent y llenando en los extremos
(patente de Estados Unidos Nº de serie 08/763.704, presentada el 9
de diciembre de 1996). Esencialmente la unidad de transcripción Z4
entera está contenida en SPZ4Ent, con un tamaño de inserción total
de 960 nucleótidos. El gen Z4 se volvió a construir a partir de los
subclones Z4, pSPZ4R3' y pSPZ45. El vector precursor era pSPZ4R3',
que contenía 713 nucleótidos de una secuencia de nucleótidos en 3'
de repetición en el medio a partir del nucleótido 630 al nucleótido
1341 de la secuencia ZA. El extremo 5' de la secuencia ZA se liberó
mediante digestión con SacI (que escinde la secuencia de poliengarce
fuera del gen insertado) y BamIII, y la inserción que contiene la
secuencia en 5' de pSPZ45', obtenida mediante ScacI (que también
escinde la secuencia de poliengarce) y la digestión por BamHI, se
ligó al vector pSPZ4R3' linelizado, que da como resultado la
reconstitución de la unidad de transcripción Z4 intacta. El vector
resultante comprendía una construcción de la región del promotor
Z27::Nos 3' en Pbs. (-) que contenía un único sitio de NcoI entre
el promotor y terminador. Tanto el vector como la inserción eran de
terminación roma y se ligaron. Los clones se identificaron con la
orientación codificante de la secuencia de ADN de ZA (pDPG531).
pDPG531 es capaz d transcribirse y traducirse en la proteína de
zein de 22 kD (\alpha-zein). El plásmido pDPG531 y
pDPG165 se introdujeron en las células de maíz mediante bombardeo
conjunto como sigue.
Se regeneraron los transformantes como se
describe en la publicación PCT WO 95/6128 y la patente de Estados
Unidos Nº de serie 08/763.704, 9 de diciembre de 1996, cuyas
descripciones se incorporan específicamente en el presente
documento por referencia en su totalidad. El procedimiento era como
sigue: plantas de maíz del genotipo A188 x B73 se cruzaron con
plantas de maíz HI-II (Armstrong et al.,
1991). Los embriones inmaduros (1,2 - 2,0 mm de longitud) se
escindieron a partir de espigas crecidas en invernadero,
esterilizadas en la superficie de Hi-II 11 - 12
días después de la polinización. El genotipo Hi-II
se desarrolló a partir de un cruce A188 x B73 para el desarrollo de
alta frecuencia del callo de tipo II de los embriones inmaduros
(Armstrong et al., 1991). Aproximadamente 30 embriones por
placa petri se sembraron mediante el eje hacia abajo sobre un medio
N6 modificado que contenía 1 mg/ml de 2,4 D, 100 mg/l de hidrolizado
de caseína, 6 mM L-prolina, 0,5 g/l ácido
2-((N-morfolino) etanosulfónico (MES), 0,75 g/l de
MgCl_{2}, y sacarosa al 2% solidificado con 2 g/l de Gelgro, pH
5,8 (medio nº 735). Los embriones se cultivaron en la oscuridad
durante dos a cuatro días a 24ºC.
Aproximadamente 4 horas antes del bombardeo, los
embriones se transfirieron al medio de cultivo anterior con el
incremento de la concentración de sacarosa de 3% a 12%. Cuando los
embriones se transfirieron al medio osmótico alto se dispusieron en
círculos concéntricos sobre la placa, comenzando a 2 cm del centro
de la placa posicionada de tal manera que su extremo de coleorriza
se orientó hacia el centro de la placa. Usualmente dos círculos
concéntricos se formaron con 25 - 35 embriones por placa. Las placas
que contienen embriones se colocaron al nivel de un tercio a partir
del fondo, 5 cm por debajo del filtro de parada en la cámara de
bombardeo. Se usaron las placas de ruptura a 1100 psi (7584,2 kPa).
Cada placa de embriones se bombardeó una vez más. A los embriones
se les dejó recuperar durante toda una noche sobre medio de alta
resistencia osmótica antes del inicio de la selección.
Después de la recuperación sobre el medio
osmótico alto (735, sacarosa al 12%) durante toda una noche (16 -
24 horas) después los embriones se transfirieron al medio de
selección que contenían 1 mg/ml de bialafos (nº 739, 735 más 1
mg/ml de bialafos o nº 750, 735 más 0,2 M manitol y 1 mg/ml de
bialafos). Los embriones se mantuvieron en la oscuridad a 24ºC.
Después de tres a cuatro semanas de la selección inicial
aproximadamente 90% de los embriones habían formado el callo de
Tipo II y se transfirieron al medio selectivo que contenía 3 mg/ml
de bialafos (nº 758). El tejido resistente a bialafos se subcultivó
aproximadamente cada dos semanas en medio de selección reciente (nº
758). El callo embriogénico transformado se transfirió a medio de
cultivo de regeneración (Murashige y Skoog, 1962), que contiene
0,91 mg/l de L-asparagina, 1,4 g/l de
L-prolina, 20 g/l de D-sorbitol,
0,4 mg/l de ácido naftaleno acético (NAA) y 3 mg/l de
6-bencilaminopurina). Se desarrollaron las células
durante aproximadamente cuatro semanas en este medio de cultivo con
una transferencia al medio reciente a aproximadamente 2 semanas.
Los transformantes se transfirieron posteriormente a medio de
cultivo MSO (medio MS sin añadir fitohormonas). Las plantas
regeneradas se transfirieron al suelo. Las plantas se cruzaron con
las líneas de maíz reproducidas designadas AW, CV, y DI. La semilla
que contenía el módulo de expresión codificante de Z27 era opaco en
el fenotipo similar a los granos de los granos mutantes a
opaco-2. Las plantas se regeneraron a partir
de tres módulos de expresión Z27-ZA y se cruzaron a
las líneas endogámicas AW, CV, y CN.
La cantidad de las proteínas
\alpha-zein presentes en plantas de maíz no
transformadas y transformantes codificantes Z27-Z4
se compararon sobre geles de poliacrilamida teñidas con azul de
Comassie como se describe más adelante. Cincuenta miligramos de
grano molido se suspendieron en 0,5 ml de de etanol al 70%,
\beta-mercaptoetanol al 1% y se extrajeron a
temperatura ambiente durante 30 minutos durante toda una noche. La
muestra se agitó con un aparato vortex y se centrifugó a 10.00 rpm
durante 5 minutos. Cincuenta microlitros del sobrenadante que
contenía las proteínas zein se retiraron y se secaron. Se volvieron
a suspender las proteínas zein en tampón de carga de gel de
poliacrilamida 50:1 SDS que contenía
\beta-mercaptoetanol al 1%. Se separó la proteína
sobre geles de poliacrilamida SDS y se tiñeron con azul de
Comassie.
Los resultados demostraron una sorprendente
reducción en los niveles de las proteínas
\alpha-zein presentes en los transformantes
codificantes Z27-Z4. la reducción era comparable con
la observada en los transformantes no codificantes. Además a la
reducción no esperada en la congregación de la proteína zein en los
transformantes codificantes, semillas con una reducción en el
contenido de zein también mostraron en general el fenotipo opaco, y
una reducción de 727 niveles de zein.
Las concentraciones de lisina y leucina se
analizaron también en la semilla derivadas de granos individuales.
Los aminoácidos se extrajeron a partir de granos maduros derivados
de tres líneas transformadas independientes como sigue. Cincuenta
miligramos de maíz de la harina de maíz molido se hidrolizó en 1 ml
de HCl 6 N en gas de argón durante 24 horas a 110ºC. Las muestras
se diluyeron hasta 50 ml y se filtraron a través de un filtro de
0,46 micrones. Se añadió norvalina a cada muestra como un patrón
interno antes del análisis de HPLC. Se separaron los aminoácidos
sobre una columna de HPLC Supercosil LC-8 (Jarret
et al., 1986; Jones et al., 1983; AACC, 1995). Los
resultados de los análisis de los granos individuales revelaron
diferencias entre granos transformados y no transformados que eran
significativas al nivel de pH de p < 0,05 de significación. En
un transformante, denominado KQ018, los niveles de lisina y leucina
eran estadísticamente los mismos en la semilla isogénica
transformada y no transformada. Sin embargo, un transformante
denominado KQ012, niveles de lisina se incrementaron de manera
estadística en los niveles de transformante y leucina disminuyeron
de manera estadística en el transformante. Por lo tanto se indica
que los transformante codificantes del promotor Z27 - Z4 producían
una morfología de la semilla, proteína, y fenotipo de la composición
de aminoácidos similares a los observados en los transformante no
codificantes. Esto se cree que se produce como resultado de la
silenciación de genes dependiente de la homología.
Con el fin de demostrar que la homología basada
en al silenciación de genes no se produce cuando el promotor Z27 de
maíz se reemplaza con un promotor de Coix a partir del gen
Coix homólogo, un vector de plásmido se construye de manera
que comprenda un promotor aislado del homólogo del gen Coix
al gen Z27, y este promotor está unido de manera operativa a la
secuencia de codificación de Z4 de Zea Mays. La secuencia
del promotor se aísla usando la estrategia descrita en el ejemplo 1.
El vector de la secuencia de codificación de Z4 del promotor de
Coix se transforma después en maíz como se ha descrito
anteriormente. Las plantas transgénicas que contenían el vector se
regeneran como se ha descrito anteriormente y se cruzaron con líneas
endogámicas no transformadas. La cantidad de las
\alpha-zeinas se miden después para demostrar una
carencia de la reducción de la expresión de transgenes en los
transformantes que comprenden el módulo de la expresión del gen
estructural de Z4 del promotor derivado de Coix. Además, el
incremento de la expresión del módulo de expresión del gen
estructural de Z4 del promotor derivado de Coix con relación
al promotor nativo que contiene los transformantes se demuestra
mediante la carencia de un fenotipo opaco en la planta que tiene un
módulo de expresión del gen estructural de Z4 del promotor derivado
de Coix. El análisis de las concentraciones de lisina y
leucina en los transformante del módulo de expresión del gen
estructural de Z4 del promotor derivado de Coix también se
lleva a cabo para demostrar que los niveles de lisina no se
incrementan, indicando por lo tanto que la supresión conjunta
codificante no se observa en los transformantes de maíz que
comprenden un promotor derivado de Coix, como se observó
usando el promotor Z27 de maíz.
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Ejemplo
9
Los embriones inmaduros de maíz (1,2 - 3,0 mm,
10 - 14 días después de la polinización) se aíslan a partir de
plantas H99 desarrolladas en invernadero que se han auto polinizados
o polinizado por cruzamiento.
Se cultivan embriones inmaduros sobre el medio
735 en la oscuridad a aproximadamente 27ºC. Los embriones inmaduras
o bien se bombardean 1 - 6 días después del aislamiento o se
cultivan para producir callo embriónico que se uso para el
bombardeo. Se expande el callo y se mantiene mediante subcultivo a
intervalos de 2 - 3 semanas en medio reciente 735. Antes del
bombardeo, los embriones cultivados o callo embriónico (subdividido
en grupos de 2 - 4 mm) se transfieren a medio que contiene sacarosa
al 12% durante 3 - 6 horas. Después del bombardeo, llevado a cabo
como se ha descrito en el ejemplo 6, los cultivos de tejidos se
incuban durante toda una noche y se transfieren a medio 735 que
contienen 500 mg/l de paromomicina. Después de 2 - 3 semanas, el
callo se subdivide en pequeñas partes (aproximadamente de 2 - 4
mm de diámetro) y se transfirieron a medio de selección reciente.
De este modo la etapa de subcultivo se repite a intervalos de 2 - 3
semanas durante hasta aproximadamente 15 semanas después del
bombardeo, con subdivisión y selección visual para callo sano y en
desarrollo.
El callo tolerante a paromomicina se transfiere
a medio 735 sin 2,4 D pero que contenía 3,52 mg/ml de BAP durante 3
- 9 días en la oscuridad a aproximadamente 27ºC y posteriormente se
transfirió a medio 110 (1/2 X de sales de MS, 0,5 mg/l de tiamina,
0,5 mg/l de ácido nicotínico, sacarosa al 3%, 3,6 g/l de Gelgro, pH
5,8), que contenía 100 mg/l de paromomicina en Phytatrays (Sigma) y
se cultivó a aproximadamente 27ºC a la luz. Las plántulas que se
desarrollan en Phytatrays después de 3 - 6 semanas, se transfieren
después al suelo. Las plántulas se aclimatas en una cámara de
crecimiento y se desarrollan hasta madurez en el invernadero.
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Ejemplo
10
- 1.
- Soluciones de convencionales combinadas para el tampón de ensayo, se preparan de manera reciente:
Ferricianuro de potasio | solución madre 50 mM | 1 ml |
Ferricoanuro de potasio | solución madre 50 mM | 1 ml |
Tampón fosfato de sodio | solución madre 200 mM, pH 7,0 | 5 ml |
EDTA de sodio | solución madre 10 mM, pH 8,0 | 1 ml |
Triton-X100 | solución madre 10% v/v | 1 ml |
- 2.
- Filtrar de manera estéril la mezcla en tampón de ensayo a través de un filtro de 0,2 micrómetros.
- 3.
- El sustrato cromagénico es X-gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil-Beta-D-glucuronida) que se disuelve en N, N-dimetilformamida a una concentración de 25 mg/ml.
- 4.
- Preparar la solución de ensayo de GUS de trabajo mediante la combinación de los siguientes reactivos:
Tampón fosfato de sodio | 200 mM, pH 7,0 | 26 ml |
Tampón de ensayo de GUS | (de la etapa 1 anterior) | 9 ml |
Sustrato X-gluc | solución madre 25 mg/ml | 1,2 ml. |
- 5.
- Incubar el tejido en la mezcla del ensayo GUS a 37ºC. El color azul aparecerá en el tejido que contiene la enzima de GUS activa. El tejido se puede incubar durante toda una noche o más a temperatura ambiente si es necesario.
Los granos de las plantas transgénicas
descritos en el ejemplo 7 se ensayaron para la expresión del gen
de GUS. Se obtuvieron los granos a partir de plantas transgénicas R0
de 9 días después de la polinización (DAP) a través de 27 DAP. Los
granos se dividieron longitudinalmente con una cuchilla de afeitar.
Las rodajas de los granos se colocaron en los pocillos de una placa
de 24 pocillos de microvaloración y se incubaron en solución de
ensayo de GUS a temperatura ambiente usando el procedimiento
descrito por Jefferson (Jefferson, R. A., 1987). El color azul
indicador de la actividad de GUS se registró usando una escala de 0
- 4 (0, sin tinción de color azul; 4, tinción intenso).
De las plantas ensayadas en la fase R0 para la
expresión de GUS en los granos, se observó la tinción de azulen
cinco de las nueve plantas que contenían la construcción
GcxPro(900)/GUS/NOS, cuatro de nueve plantas que contenían
la construcción GcxPro(900)/rActin1/GUS/NOS, tres de 12
plantas que contienen la construcción
GcxPro(400)/rActin1/GUS/NOS, y dos de seis plantas que
contienen la construcción GcxPro(220)/rActin1/GUS/NOS (TABLA
11). Ninguna de las plantas examinadas que contenían o bien la
construcción GcxPro(400)/GUS/NOS o GcxPro(220)/GUS/NOS
mostraron cualquier tinción en el grano.
El patrón de tinción espacial también se observó
con respecto a la tinción de azul para las partes diferentes del
grano. Los granos de las plantas de GcxPro(900)//GUS/NOS
mostraron un patrón de expresión exclusivamente en el endospermo,
con la mayoría de la tinción en el almidón del endospermo y la
tinción limitada en la aleurona en algunos ganos; los granos de las
plantas GcxPro(900)/rActin1/GUS/NOS mostraron un patrón de
tinción principalmente en el almidón del endospermo y luz, tinción
limitada en el germen en algunos granos; y los granos de las plantas
GcxPro(400)/rActin1/GUS/NOS o
GcxPro(220)/rActin1/GUS/NOS mostraron tinción tanto en el
endospermo como germen, indicando una pérdida del patrón de
expresión específico de endospermo. No fue detectable ninguna
tinción de azul en los granos de las plantas o bien
GcxPro(400)/GUS/NOS o GcxPro(220)/GUS/NOS. Las plantas
que expresan o bien el transgen GcxPro(900)/GUS/NOS o
GcxPro(900)/rActin1/GUS/NOS también mostró un patrón de
tinción regulado temporalmente, con las semillas antiguas que
mostraban un grado mayor de la tinción de azul que las semillas
más jóvenes (Tabla 12).
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Ejemplo
11
Muchas variaciones en las técnicas para el
bombardeo de microproyectiles se conocen bien en la técnica y por
lo tanto se consideran útiles en la presente invención. Los
procedimientos ejemplares para el bombardeo se describen en, por
ejemplo, la solicitud PCT WO 95/06128, que se incorporan de manera
específica en el presente documento por referencia en su totalidad.
Los ejemplos de los tejidos diana que se pueden usar en la presente
invención incluyen embriones inmaduros, callo de tipo I, callo de
Tipo II, callo de Tipo III, cultivos de suspensión y tejido
meristemático (solicitud PCT WO 96/04392). Algunos genotipos que son
especialmente útiles para la transformación de maíz se han descrito
anteriormente específicamente, así como en, por ejemplo, la
solicitud PCT WO 95/06128. Los genotipos preferidos serán aquellos
que se pueden transformar de manera fácil y también se pueden
regenerar para producir una planta transgénica fértil.
Cualquier procedimiento para la aceleración de
las microproyectiles se puede usar de manera potencial para
transformar célula vegetal en la presente invención. Un
procedimiento preferido será una pistola de gas partículas de tal
como el dispositivo de bombardeo de partículas PDS1000He. Las
partículas ejemplares para el bombardeo incluyen los comprendidos
por tungsteno, oro, platino, y similares. Las partículas de oro se
consideran particularmente útiles en la presente invención, siendo
preferidas las partículas de 0,6 \mum o 0,7 \mum y las más
preferidas las partículas de 0,6 \mum. Las partículas más
preferidas serán las revestidas por ADN y que tienen un tamaño
medio entre 0,6 \mum y 1,0 \mum.
Como se ha descrito en el presente documento, se
puede usar cualquier secuencia de ADN para la transformación. Los
segmentos de ADN usados para la transformación incluirán de manera
preferible uno o más marcadores que se pueden seleccionar, secretar
o rastrear. Muchos ejemplos de tales se conocen bien en la técnica y
se describen específicamente en el presente documento. En el caso
de los marcadores que se pueden seleccionar, la selección puede
estar en medio sólido o líquido. Los segmentos de ADN usados también
preferiblemente incluirán uno o más genes que confieren o bien
individualmente o en combinación con otras secuencias, un fenotipo
deseado de las plantas transformadas. Los genes ejemplares para la
transformación y los fenotipos correspondientes se pueden conferir
estas secuencias a la planta transformada y se describen en el
presente documento.
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Ejemplo
12
Se puede usar retrocruzamiento para mejorar una
planta de parida. El retrocruzamiento transfiere un carácter
deseable específico de una a otra planta endogámica u otra que
carece del carácter. Esto se puede llevar a cabo por ejemplo,
mediante, primero, cruzando una línea endogámica (A) (precursor
recurrente) a un la planta de endogamia donante (no se requiere
precursor), que lleva el (los) gen (genes) apropiado (s) para el
carácter en cuestión, por ejemplo, una construcción preparada de
acuerdo con la presente invención. La progenie de este cruce se
selecciona primero en la progenie resultante para el carácter
deseado a transferir desde el precursor no recurrente, después la
progenie seleccionada se vuelve a cruzar con el precursor
recurrente superior (A). Después de cinco o más generaciones de
retrocruzamiento para el carácter deseado, la progenie es
hemicicótica para los locus que controlan la característica que se
está transfiriendo, pero son parecidos al precursor superior para
la mayoría o casi todos los otros genes. La última generación de
retrocruzamiento, se autofecundaría al menos una vez para
proporcionar la progenie que son puras para la mejora genética del
(de los genes) que se están transfiriendo, es decir, uno o más
episodios de
transformación.
transformación.
Por lo tanto, aunque una serie de manipulaciones
de mejora genética, un transgen seleccionado se puede mover desde
una línea a una línea completamente diferente sin la necesidad de
manipulaciones de recombinación adicionales. Los transgenes son
valiosos ya que se comportan típicamente de manera genética como
cualquier otro gen y se puede manipular mediante técnicas de mejora
genética de una manera idéntica a cualquier otro gen de maíz. Por
lo tanto, se pueden producir líneas endogámicas que son de mejora
genética verdadera para uno o más transgenes. Cruzando diferentes
plantas endogámicas, se puede producir un gran número de híbridos
diferentes con diferentes combinaciones de transgenes. De este
modo, se pueden producir plantas que tengan las propiedades
agronómicas deseadas asociadas frecuentemente a híbridos ("vigor
híbrido") así como las características deseables impartidas por
uno o más
transgen (es).
transgen (es).
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Ejemplo
13
Se pueden usar marcadores genéticos para ayudar
a la introgresión de uno o más transgenes de la invención a partir
de un fondo genético en otro. La selección asistida por marcador
ofrece ventajas con relación a la mejora genética convencional ya
que se puede usar para evitar errores provocados por las variaciones
fenotípicas. Además, se pueden proporcionar datos de marcadores
genéticos con relación al grado del plasma germinal de elite en la
progenie individual de un cruce particular. Por ejemplo, cuando una
planta con un carácter deseado que de otra manera tiene un
antecedente no agronómicamente deseable se cruza con un precursor de
élite, se pueden usar marcadores genéticos para seleccionar la
progenie que no solamente posee el carácter de interés pero también
tienen una proporción relativamente grande del plasma germinal
deseado. De esta forma el número de generaciones requeridas para
introgresar uno o más caracteres en un fondo genético particular se
minimiza.
En el proceso de mejora genética asistida por
marcador, se usan secuencias de ADN para conseguir los caracteres
agronómicos deseables (Tanksley et al., 1989) en el proceso
de mejora genética de las plantas. La mejora genética asociada al
marcador se puede llevar a cabo como sigue. Se plantas semillas de
plantas con el carácter deseado a partir de la plantas para la
preparación de de ADN en cualquier punto de crecimiento al que
aproximadamente un gramo del tejido de las hojas se puede retirar
de la planta sin comprometer la viabilidad de la planta. Se aísla
el ADN genómico usando un procedimiento modificado de Shure et
al (1983). Aproximadamente un gramo del tejido de las hojas de
una plántula se liofiliza durante toda una noche en 15 ml de tubo de
polietileno. El tejido seco congelado se muele hasta un polvo en el
tubo usando una barra de vidrio. El tejido en polvo se mezcla
concienzudamente con 3 ml de tampón de extracción (7,0 urea, 0,35 M
NaCl, 0,05 M Tris-HCl ph 8,0, 0,01 M EDTA,
sarcosina al 1%). Se extrae el homogenato de tampón/tejido con 3 ml
de fenol/cloroformo. Se separa la fase acuosa mediante
centrifugación, y se precipita dos veces usando 1/10 de volumen de
acetato de amonio 4,4 M, pH 5,2, y un volumen igual de isopropanol.
El precipitado se lava con etanol al 75% y se vuelve a suspender
en 100 - 500 \mul de TE (0,01 M Tris - HCl, 0,001 M EDTA,
pH
8,0).
8,0).
El ADN genómico se digiere después con un exceso
de 3 veces de enzimas de restricción, se somete a electroforesis
mediante agarosa al 0,8% (FMC), y se transfirió (Southren, 1975) a
Nytran (Schleicher y Schuell) usando 10 X SCP (20 SCP; 2 M NaCl,
0,6 M fosfato disódico, 0,02 M EDTA disódico). Los filtros se
hibridan previamente en 6 X SCP, sulfato de dextrano al 10%,
sarcosina al 2%, y 500 \mug/ml de ADN de esperma de salmón
desnaturalizado y sonda marcada con ^{32}P generada mediante
cebado al azar (Feinberg & Vogelstein, 1983). Los filtros
hibridizados se lavan en 2 X SCP, SDS al 1% a 65º durante 30
minutos y se visualizó mediante autorradiografía usando película
Kodak XAR5. Los polimorfismos genéticos que están unidos de manera
genética a los caracteres de interés se usan en consecuencia para
predecir la presencia o ausencia de los caracteres de interés.
Los expertos en la técnica reconocerán que
existen muchas formas diferentes de aislar el ADN de tejidos de
plantas y que existen muchos protocolos diferentes para la
hibridación de Southern que producirá idénticos resultados. Los
expertos en la técnica reconocerán que una banda de Southern se
puede despojar de la sonda radiactiva después de la
autorradiografía y volver a sondar con una sonda diferente. De esta
manera se puede identificar cada uno de los diversos transgenes que
están presentes en la planta. Además, los expertos en la técnica
reconocerán que cualquier tipo de marcador genético que es
polimórfico en la (s) región (es) de interés se puede usar para el
propósito de identificar la presencia o ausencia relativa de un
carácter, y que tal introducción se puede usar para la mejora
genética asistida por marcador.
Cada carril de la banda de Southern representa
ADN aislado de una planta. A través del uso de la multiplicidad de
episodios de integración de genes como sondas sobre la misma banda
de ADN genómica, la composición del episodios de integración de
cada planta se pueden determinar. Las correlaciones se pueden
establecer entre las contribuciones de episodios de integración
particular al fenotipo de la planta. Solamente estas plantas que
contienen una combinación deseada de episodios de integración se
puede avanzar hasta la madurez y usarse para la polinización. Las
sondas de ADN que corresponden a los episodios de integración de
transgenes particulares son marcadores útiles durante el curso de
la mejora genética de las plantas para identificar y combinar los
episodios de integración particulares sin que tengan que crecer las
plantas y ensayo de las plantas para el comportamiento
agronómico.
Se espera que una o más enzimas de restricción
se usarán para digerir el ADN genómico, o bien individualmente o en
combinaciones. Los expertos en la técnica reconocerán que muchas
enzimas de restricción diferentes serán útiles y la elección de las
enzimas de restricción dependerá de la secuencia de ADN del episodio
de integración de transgenes que se usa como una sonda y las
secuencias de ADN en el genoma que rodea los transgenes. Para una
sonda, se deseará el uso de secuencias de ADN o ARN que se
hibridarán al ADN usado para la transformación. Se seleccionará una
enzima de restricción que produce un fragmento de ADN después de la
hibridación que se puede identificar como el episodio de
integración de transgenes serán aquellos que revelen polimorfismos
que están unidos de manera genético a transgenes específicos o
caracteres de interés.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
14
El análisis de ADN de las plantas transformadas
se realiza como sigue. El ADN genómico se aísla usando un
procedimiento modificado de Shure et al., 1983.
Aproximadamente un gramo de callo o de tejido de las hojas se muele
hasta un polvo fino en nitrógeno líquido usando un mortero y una
mano de almirez. El tejido en polvo se mezcla concienzudamente con
4 ml de tampón de extracción (7,0 M urea, 0,35 M NaCl, 0,05 M
Tris-HCl ph 8,0, 0,01 M EDTA, sarcosina al 1%). Se
extrae el homogenato de tampón/tejido con 4 ml de fenol/cloroformo.
Se separa la fase acuosa mediante centrifugación, se pasa a través
de Miracloth y se precipita dos veces usando 1/10 de volumen de
acetato de amonio 4,4 M, pH 5,2, y un volumen igual de isopropanol.
El precipitado se lava con etanol al 70% y se vuelve a suspender
en 200 - 500 \mul de TE (0,01 M Tris - HCl, 0,001 M EDTA,
pH
8,0).
8,0).
La presencia de una secuencia de ADN en una
célula transformada se puede detectar mediante el uso de la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR). Usando esta técnica se pueden
amplificar fragmentos específicos de ADN y detectar después de la
electroforesis en gel de agarosa. Por ejemplo, doscientos a 1000 ng
de ADN genómico se añade a una mezcla de reacción que contiene 10
mM Tris - HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl_{2}, 50 mM KCl, 0,1 mg/ml de
gelatina, 200 \muM de cada dATP, dCTP, dGTP, 0,5 \muM de cada
cebador directo e inverso de ADN, glicerol al 20%, y 2,5 unidades
de Taq ADN polimerasa. Se lleva a cavo la reacción en una máquina de
ciclación térmica como sigue: 3 minutos a 94ºC, 39 repeticiones del
ciclo 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 50ºC, 30 segundos a 72ºC, seguido
de 5 minutos a 72ºC. Veinte \mul de cada mezcla de reacción se
desarrolla sobre un gel de NuSieve al 3,5% en tampón de TBE (90 mM
Tris - borato, 2 mM EDTA) a 50V durante dos a cuatro horas. Usando
este procedimiento, por ejemplo, se puede detectar la presencia del
gen bar, usando el cebador directo CATCGAGACAAGCACGGTCAACTTC
(SEQ ID Nº 20) y el cebador inverso AAGTCCCTGGAGGCACAGGGCTTCAAGA
(SEQ ID Nº 21).
Un procedimiento para detectar la presencia de
fosfinotricin acetil transferasa (PAT) implica el uso de una
reacción enzimática in vitro seguido de cromatografía en capa
fina, como se describe en la solicitud PCT WO 95/06128 (que se
incorpora específicamente en el presente documento en su totalidad
por referencia). El procedimiento se lleva a cabo preparando
diversos extractos de proteína a partir de homogenatos de células
potencialmente transformadas, y a partir de células de control que
ni se han transformado ni expuesto a selección por bialafos, y
después ensayando mediante incubación con PPT y
^{14}C-acetil Coenzima A seguido de cromatografía
en capa fina. Los resultados de este ensayo proporcionan la
confirmación de la expresión del gen bar que codifica la
PAT.
Para el análisis de la banda de Southern se
digiere el ADN genómico con un exceso de 3 veces de enzimas de
restricción, se somete a electroforesis mediante agarosa al 0,8%
(FMC), y se transfirió (Southren, 1975) a Nytran (Schleicher y
Schuell) usando 10 X SCP (20 SCP; 2 M NaCl, 0,6 M fosfato disódico,
0,02 M EDTA disódico). Las sondas se marcan con ^{32}P usando el
procedimiento de cebado al azar (Boehinger Mannheim) y se purifica
usando columnas de giro Quick - Step ® (Isolab Inc., Akron, OH).
Los filtros se hibridizan previamente a 65º en hibridizados se
lavan en 6 X SCP, sulfato de dextriano al 10%, sarcosina al 2%, y
500 \mug/ml de heparina (Chomet et al., 1987) durante 15
minutos. Los filtros después se hibridizan durante toda una noche a
65ºC en 6 X SCP que contiene 100 \mug/ml de ADN de esperma de
salmón desnaturalizado y sonda marcada con ^{32}P. Los filtros se
lavan con 2 X SCP, SDS al 1% a 65ºC durante 30 minutos, y se
visualizaron mediante autorradiografía usando película Kodak XAR5.
Para la rehibridación, los filtros se someten a ebullición durante
10 minutos en H_{2}O destilada para retirar la primera sonda y
después se hibridiza previamente como se ha descrito
anteriormente.
\newpage
Ejemplo
15
El último objetivo en la transformación de
plantas es producir plantas que son útiles para el hombre. A este
respecto, las plantas transgénicas creadas de acuerdo con la
presente invención se pueden usar para cualquier propósito
virtualmente que se considera valioso para el cultivador o para el
consumidor. Por ejemplo, se puede desear recolectar semilla de las
plantas transgénicas. Esta semilla se puede a su vez usar para una
amplia diversidad de propósitos. La semilla se puede vender a los
granjeros para plantar en el campo o se puede usar directamente
como alimento, o bien para animales o para los seres humanos. Como
alternativa, los productos se pueden preparar para la propia
semilla. Los ejemplos de los productos que se pueden preparar a
partir de la semilla incluyen, almidón, alimento animal de humano,
compuestos farmacéuticos, y diversos productos industriales. Los
usos alimentarios del maíz, además del consumo humano de granos de
maíz, incluyen ambos productos de las industrias de molienda en
seco o en húmedo. Los productos principales de la molienda en seco
del maíz son partículas, sémola y harina. La industria de la
molienda en húmedo del maíz puede proporcionar almidón de maíz,
jarabes de maíz, y dextrosa para uso en alimentación. El aceite de
maíz se recupera del germen de maíz, que es un subproducto de las
industrias de molienda tanto en seco como en húmedo.
El maíz, que incluye tanto las partículas de
grano como no grano de la planta, también se usa de manera extensiva
como pienso de ganado, principalmente para el ganado vacuno, ganado
de leche, cerdos, y aves. Los uso industriales de maíz incluyen la
producción de etanol, almidón de maíz en la industria de molienda en
húmedo y harina de maíz en la industria de la molienda en seco. Las
aplicaciones industriales de almidón y harina de maíz se basan en
las propiedades funcionales, tales como viscosidad, formación de
película, propiedades adhesivas, y capacidad de suspender
partículas. El almidón y harina de maíz tiene aplicación en las
industrias del papel y textil. Otros usos industriales incluyen las
aplicaciones en materiales adhesivos, de construcción, aglutinantes
de fundición, almidones de lavandería, explosivos, lodos de los
pozos de petróleo, y otras aplicaciones de minería. Las partes de
las plantas diferentes del grano o maíz también se usan en la
industria, por ejemplo, tallos y pajas se preparan en papel y
tablero para tabiques y las mazorcas se usan para carburante y para
hacer carbón. Otros medios para la utilización de las plantas, tales
como los que se pueden realizar con la presente invención, se han
conocido bien desde el punto de vista de diseño de agricultura y se
conocen bien por los expertos de la técnica a la luz de la presente
descripción. Los procedimientos específicos para la utilización
del cultivo se puede encontrar en, por ejemplo, Sprague y Dudley
(1988), y Watson y Ramstad (1987).
Las referencias mencionadas a continuación se
incorporan en el presente documento por referencia hasta el grado
que suplementan, explican, proporcionan un antecedente para, o
enseñar la metodología, técnicas, y/ o composiciones empleadas en el
presente documento.
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<120> PROCEDIMIENTOS Y COMPOSICIONES PARA
LA EXPRESIÓN DE TRANSGENES EN PLANTAS
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<130> DEKM: 158P
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<140> PRESENTADA CON EL PRESENTE
DOCUMENTO
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<141> 11 de 05 de 1999
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<170> Patent. In. Ver. 2.0
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Artificial. Cebador sintético
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Artificial. Cebador sintético
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial.
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial. Cebador sintético
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<400> 7
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\hskip-.1em\dddseqskipggccatgggg tgtcgatctt ctgtgctct
\hfill29
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<210> 8
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<211> 894
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial.
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial. Cebador sintético
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<213> Secuencia Artificial.
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial. Cebador sintético
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\hskip-.1em\dddseqskipctcagcccca gcagccacat cca
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial. Cebador sintético
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<213> Secuencia Artificial.
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Artificial. Cebador sintético
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial. Cebador sintético
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<212> ADN
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<212> ADN
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial.
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<223> Descripción de la Secuencia
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\hskip-.1em\dddseqskipcatcgagaca agcacggtca acttc
\hfill25
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<211> 28
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<212> ADN
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\hskip-.1em\dddseqskipaagtccctgg aggcacaggg cttcaaga
\hfill28
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<210> 22
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<211> 2647
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<212> ADN
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<223> Descripción de la Secuencia
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<210> 23
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<211> 3704
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<212> ADN
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<211> 21
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<212> ADN
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<220> Descripción de la Secuencia
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\hfill21
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<213> Secuencia Artificial.
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\hskip-.1em\dddseqskipggctcgagca ctcggcttgc t
\hfill21
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<223> Descripción de la Secuencia
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\hfill24
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\hskip-.1em\dddseqskiptccaaggccc gcgacgtcaa gga
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (5)
1. Un procedimiento de prevención de la
silenciación del gen dependiente de la homología del promotor en una
planta monocotiledónea tal como arroz, trigo, cebada, centeno,
avena, sorgo y maíz pero diferente de Coix, el procedimiento
comprende las etapas de:
(a) proporcionar un promotor de la coixina gamma
que comprende 80 a 894 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:
8;
(b) preparar una construcción que comprende
dicho promotor de la coixina gamma unido de manera operativa a un
gen seleccionado, en el que dicho gen que se puede seleccionar es
preferiblemente un gen de resistencia a insectos, un gen de
resistencia a enfermedad fúngica, un gen de resistencia a enfermedad
viral, un gen de resistencia a enfermedad bacteriana, un gen de
resistencia a herbicidas, un gen que afecta a la composición o
calidad del grano, un gen de utilización de nutrientes, un gen de
reducción de micotoxina, un gen de esterilidad masculina, un gen
marcador que se puede seleccionar, un gen marcador que se puede
rastrear, un gen marcador negativo que se puede seleccionar, un gen
que afecta a las características agronómicas de las plantas, o un
gen de resistencia al ambiente o estrés.
(c) transformar una célula receptora a partir de
una planta monocotiledónea distinta de de Coix con dicha
construcción, en la que dicha etapa de transformación
preferiblemente comprende bombardeo de microproyectiles,
electroporación, transformación mediada por filtro de carburo de
silicio, o transformación mediada por Agrobacterium, y
(d) regenerar una planta que expresa dicho gen a
partir de dicha célula receptora, mediante el cual dicha planta no
exhibe la silenciación del gen.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho bombardeo de microproyectiles comprende las etapas de
(i) revestimiento de microproyectiles con ADN que comprende la
construcción y (ii) poner en contacto dichas células receptoras con
dichos microproyectiles.
3. Un procedimiento de producción de progenie,
comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) preparar una planta de acuerdo con los
procedimientos descritos en la reivindicación 1, en el que la planta
comprende una construcción que comprende un promotor de la coixina
gamma unido de manera operativa a un gen seleccionado como se ha
definido en la reivindicación 1 (b); y
(b) cruzar dicha planta con una segunda planta o
consigo misma.
4. Un procedimiento de mejora de plantas,
comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) obtener una planta progenie de acuerdo con
el procedimiento de la reivindicación 3, en el dicha planta
progenie comprende la construcción como se ha definido en la
reivindicación (3 (a); y
(b) cruzar dicha planta con ella misma o con una
segunda planta.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el promotor de la coixina gamma tiene la secuencia de
nucleótidos SEQ ID Nº 8, SEQ ID Nº 18, o SEQ ID Nº 19.
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