ES2345606T3 - Multiplicacion de virus en un cultivo celular. - Google Patents

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Abstract

Procedimiento para preparar un medicamento o agente de diagnóstico, que comprende pasos en los cuales (a) se infectan células MDCK con un virus; (b) después de la infección se cultivan las células MDCK en cultivo celular en condiciones que permiten una multiplicación de los virus y al mismo tiempo una multiplicación adicional deliberada, en al menos un factor de 2, de las células mediante un incremento del volumen total del cultivo, en donde el virus está seleccionado del grupo consistente en virus de la meningoencefalitis primaveroestival europea (FMSE) y de las formas orientales (rusa u otras) relacionadas, virus de la encefalitis japonesa, virus del dengue, virus de la fiebre amarilla, virus de la rabia, virus de la hepatitis A, o rotavirus.

Description

Multiplicación de virus en un cultivo celular.
La invención se refiere a procedimientos para multiplicar virus seleccionados en cultivo celular, en los cuales se infectan con un virus células MDCK y tras la infección se cultivan las células en cultivo celular en condiciones que permiten una multiplicación de los virus y al mismo tiempo una multiplicación adicional deliberada, en al menos un factor de 2, de las células. La invención se refiere además al empleo de los virus que se pueden obtener así, o de proteínas expresadas por los mismos, para preparar medicamentos y agentes de diagnóstico.
Las enfermedades infecciosas, en especial las infecciones víricas, han tenido siempre gran importancia médica. Por tanto, sigue existiendo de manera inalterada la necesidad de poner a disposición mejores procedimientos mediante los cuales se puedan multiplicar virus en cultivo, para permitir la investigación de los virus y la preparación de vacunas. En especial, la producción de vacunas contra infección vírica requiere habitualmente la multiplicación y aislamiento de grandes cantidades del virus en cuestión.
Dependiendo del virus de que se trate, en el estado de la técnica se emplean distintos sistemas de hospedamiento y condiciones de cultivo para la multiplicación del virus. Habitualmente, como sistemas de hospedamiento se utilizan animales hospedantes, huevos de gallina embrionizados, cultivos de células tisulares primarios o establecidos, líneas celulares permanentes (Rolle y Mayr [compiladores], Mikrobiologie, Infektions- und Seuchenlehre, 1978; Mahy [compilador], Virology, A Practical Approach, 1985; Horzinek [compilador] Kompendium der allgemeine Virologie, 1985).
La multiplicación de virus en huevos de gallina embrionizados conlleva elevados gastos en tiempo y costes económicos. Antes de la infección hay que empollar los huevos y después se debe comprobar la viabilidad de los embriones. Sólo los embriones vivos están en condiciones de multiplicar virus. Una vez conseguida la infección con el virus a multiplicar, y tras continuar empollando durante un tiempo adicional, finalmente se mata a los embriones. Se liberan de impurezas los virus aislables de los huevos, y se concentran. Puesto que la multiplicación de virus en huevos empollados no es posible en condiciones estrictamente estériles, se deben eliminar de los aislados los microorganismos patógenos contaminantes, si aquéllos han de llegar a una aplicación médica o diagnóstica.
Las líneas celulares definidas de células hospedantes eucarióticas ofrecen una alternativa a la multiplicación de virus en huevos de gallina (Gregersen, J.P., Pharmazeutische Biotechnologie, Kayser y Müller [compiladores], 2000, páginas 257-281). Sin embargo, gran número de líneas celulares no son adecuadas para la preparación de vacunas o preparados similares con aplicación médica, a causa de persistentes contaminaciones con virus extraños o a causa de una deficiente evidencia de estar libres de virus, o por un origen o historia inciertos.
Los procedimientos utilizados en el estado de la técnica para multiplicar virus en cultivo celular presentan todos el mismo esquema básico, en el cual primera-mente se multiplican las células en ausencia del virus, a continuación se añade el virus y se multiplica en condiciones en las cuales no tiene lugar una multiplicación significativa de las células, y se cosecha el cultivo después de la máxima multiplicación de los virus.
Por ejemplo, para multiplicar algunos virus (poliovirus, virus de la rabia) con el fin de preparar vacunas, se han utilizado células Vero derivadas de células renales de mono. Estas células se pueden conseguir en diversos bancos de células (por ejemplo la colección estadounidense de cultivos tipo, American Type Culture Collection, ATCC), y además han sido puestas a disposición de la investigación médica por la Organización Mundial de la salud (OMS) procedentes de un banco de células verificado.
Estas células Vero son líneas adherentes, que precisan para crecer superficies de soporte tales como, por ejemplo, frascos de vidrio, placas de cultivo de plástico, o frascos de plástico. En caso de cultivar células correspondientes en un fermentador, el crecimiento se lleva a cabo sobre los denominados microsoportes, es decir, por regla general pequeñas esférulas de material sintético, sobre cuya superficie pueden crecer las células.
Es sabido que, además de las células Vero antes mencionadas, también células BHK (de riñón de cría de hámster, "Baby Hamster Kidney") adherentes y células MDCK (células renales caninas Madin Darby, "Madin Darby Canine Kidney") adherentes, y otras células, pueden multiplicar activamente varias clases de virus, y se han empleado, o se ha considerado su empleo como sustrato para la producción de productos farmacéuticos. En la línea de células MDCK, ATCC CRL34 (NBL-2), se han multiplicado experimentalmente, además del virus de la gripe, también el virus de la estomatitis vesicular, el virus de Coxsackie B5 (pero no el B3 o el B4), el reovirus tipo 2 y tipo 3, el adenovirus tipo 4 y tipo 5, y virus de la viruela vacuna. Sin embargo, todas las publicaciones correspondientes están dirigidas exclusivamente a cultivos adherentes (véase la información de producto de ATCC). Sin embargo, para la multiplicación de mayores cantidades de células se prefiere el cultivo en suspensión, habiendo sido posible hasta la fecha multiplicar en este sistema sólo las células linfoides y varias células transformadas (Lindl [compilador], Zell- und Gewebekultur, 2000, página 173 y siguientes). En el documento WO 97/37000 se divulga una línea celular MDCK que puede crecer en suspensión en medios de cultivo exentos de proteína. La multiplicación de virus de la gripe mediante el empleo de las correspondientes células hospedantes está asimismo descrita.
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Además de la elección de un sistema de células u hospedante adecuado, para conseguir un rendimiento aceptablemente elevado también son muy importantes las condiciones de cultivo en las cuales se multiplica una cepa vírica. Por tanto, para maximizar el rendimiento de la cepa vírica deseada, deben estar específicamente ajustados tanto el sistema hospedante como las condiciones de cultivo, a fin de lograr condiciones ambientales favorables para la cepa vírica deseada. Así, para lograr un rendimiento elevado de las distintas cepas víricas, es necesario un sistema que cree condiciones de crecimiento óptimas. Muchos virus están limitados a sistemas hospedantes especiales, algunos de los cuales son muy poco eficientes en cuanto al rendimiento vírico. Además, los sistemas de producción eficientes se basan frecuentemente en adaptaciones de la población vírica al sistema de cultivo respectivo, a menudo haciendo uso de etapas intermedias que utilizan otros sistemas hospedantes, y aplicando aditivos proteínicos - suero en la mayoría de los casos - de origen animal o humano.
Además, es conocido para los especialistas en el tema que, después de la multiplicación inicial en que se añade suero u otros factores de crecimiento, casi todos los cultivos celulares pueden mantenerse al menos durante cierto tiempo sin adiciones de suero o proteínas. Así, por ejemplo, un cultivo celular cualquiera se puede transformar, en el momento de la infección vírica o poco tiempo antes de la recolección, a medio sin suero ni aditivos proteínicos, y mantenerse así hasta dicha recolección. Esta es la práctica habitual desde hace años para, evitando o reduciendo las proteínas extrañas, obtener material vírico para vacunas o ensayos de diagnóstico. Las vacunas procedentes de cultivos celulares que han sido obtenidas sin esta práctica, añadiendo suero durante la fase de infección, presentan grandes problemas para que se admita su uso en personas o animales, ya que de ellas casi no se pueden eliminar de manera suficiente los componentes del suero (véanse las recomendaciones de la OMS "Proposed requirements for Measles Vaccine (Live)" [requisitos propuestos para la vacuna (viva) contra el sarampión], Requirements for Biological Subtances No.12, revisado en 1978).
También es sabido que muchos virus se pueden multiplicar sólo deficientemente, o incluso no se pueden multiplicar en absoluto, en medios que contienen proteína. Se trata en estos casos de virus que, para ser multiplicados en sistemas de cultivo, dependen de la actividad de enzimas que escinden proteínas (proteasas). Al ser inhibidas competitivamente estas proteasas por las adiciones proteicas al medio, lógicamente está vedada la adición de proteínas, al menos desde el momento de la infección o la fase de producción. Son ejemplos de virus que habitualmente deben ser multiplicados añadiendo proteasas y, por tanto, en lo posible sin adiciones de proteína si se desea conseguir buenos rendimientos, los virus de la gripe y rotavirus. A otras clases de virus tales como, por ejemplo, paramixovirus y reovirus también les puede beneficiar en su multiplicación el empleo de medios en lo posible pobres en proteína (Ward et al. (1984) J. Clin. Microbiol. 748-753 "Efficiency of Human Rotavirus Propagation in Cell Culture". El documento WO 96/15231 propone cultivar células Vero y otras células en cultivo celular, debiendo ser utilizado un medio que carezca de los habituales aditivos proteínicos.
La multiplicación de otros virus es notablemente inadecuada, con independencia de la composición del medio y de las condiciones de cultivo, por ejemplo el virus de la rabia, los rotavirus, neumovirus o virus de la hepatitis A (Provost y Hillemann, Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 160:213-221 (1979); y Rolle y Mayr, citados más arriba).
Usualmente, tras la multiplicación del virus, éste debe ser aislado del cultivo. Son conocidos en el estado de la técnica numerosos procedimientos mediante los cuales, después de la multiplicación, se pueden aislar del medio y/o de las células virus, productos de expresión vírica u otras proteínas (Gregersen, citado más arriba; Mahy, citado más arriba; Reimer C., et al., Journal of Virology, diciembre de 1967, páginas 1207-1216; Navarro del Canizo, A., et al., Applied Biochemistry and Biotechnology, vol. 61, 1996, 399; Prior, C., et al., BioPharm, octubre de 1996, 22; Janson, Jan-C. y Ryden, L. [compiladores], Protein Purification, 1997; y Deutscher M. [compilador], Methods in Enzymology, vol. 182, 1990).
Sin embargo, a causa del curso esquemático del procedimiento (multiplicación celular, multiplicación vírica, recolección), los procedimientos conocidos en el estado de la técnica permiten sólo una multiplicación y recolección de virus limitadas.
El documento WO 01/02548 describe un procedimiento para multiplicar organismos líticos en un biorreactor de fibras huecas.
La presente invención se basa en la misión de poner a disposición procedimientos para multiplicar virus en cultivo celular, que posibiliten una mayor multiplicación de virus y una recolección simplificada de mayores cantidades de virus.
Esta misión se ha cumplido ahora por medio de un procedimiento para preparar un medicamento o agente de diagnóstico, que comprende pasos en los cuales
(a)
se infectan células MDCK con un virus;
(b)
después de la infección se cultivan las células MDCK en cultivo celular en condiciones que permiten una multiplicación de los virus y al mismo tiempo una multiplicación adicional deliberada, en al menos un factor de 2, de las células mediante el incremento del volumen total del cultivo,
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en donde el virus está seleccionado del grupo consistente en virus de la meningoencefalitis primaveroestival europea, siglas alemanas FMSE) y de las formas orientales (rusa u otras) relacionadas, virus de la encefalitis japonesa, virus del dengue, virus de la fiebre amarilla, virus de la rabia, virus de la hepatitis A, o rotavirus.
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Sorprendentemente, se consigue un procedimiento sustancialmente mejorado para multiplicar virus en cultivo celular si se modifica el curso básico del procedimiento haciendo que sea posible el crecimiento de las células también durante la multiplicación del virus. Esto tiene la ventaja de que se pueden obtener en un tiempo más corto un número significativamente mayor de virus. Además, se mejora el aprovechamiento de las instalaciones de cultivo celular.
De acuerdo con la invención, el cultivo celular se lleva a cabo de manera tal que tras la infección se incrementan las células en un factor de al menos 2 o al menos 5, preferiblemente al menos en un factor de 10.
La multiplicación de las células origina también que el cultivo se pueda llevar a cabo a lo largo de un período de tiempo de al menos 7 días después de la infección, pero preferiblemente se multiplican las células y virus en cultivo celular a lo largo de al menos 21, 28 o 35 días.
Dependiendo de la ejecución del procedimiento puede ser ventajoso durante la multiplicación de los virus y de las células añadir al menos una vez medio fresco, concentrado de medio, o componentes del medio, o al menos traspasar una parte de los virus y las células a un recipiente de cultivo que contenga medio fresco, concentrado de medio, o componentes del medio. No obstante, se prefiere añadir durante la multiplicación de los virus y de las células al menos una vez medio fresco, concentrado de medio, o componentes del medio.
La adición del medio, del concentrado de medio, o de los componentes del medio se repite preferiblemente al menos una vez o varias veces.
Según otra forma de realización preferida de la presente invención, durante el cultivo de las células infectadas se reemplaza el medio de cultivo por medio de cultivo fresco, o bien se incrementa el volumen de cultivo por adición de medio de cultivo fresco. El reemplazo o el incremento del medio de cultivo se puede también realizar mediante concentrado de medio o componentes del medio tales como por ejemplo aminoácidos, vitaminas, fracciones lipídicas, fosfatos, u otras sustancias. Estos pasos se pueden llevar a cabo también varias veces durante el cultivo de las células.
Esto permite aumentar el rendimiento vírico gracias a múltiples recolecciones de virus a partir de sobrenadantes del cultivo, y especialmente gracias al incremento del volumen total de cultivo, y por consiguiente también del número de células, mediante la adición de medio fresco. Las recolecciones reiteradas correspondientes constituyen una ventaja significativa del procedimiento de acuerdo con la invención, ya que mejoran sustancialmente el rendimiento del sistema.
En el procedimiento de la presente invención se utilizan células MDCK para la multiplicación de los virus.
Las células que se utilizan en el procedimiento de acuerdo con la invención son células que tienen la propiedad de crecer en cultivo en suspensión o como células adherentes. Se denominan "células que crecen en cultivo en suspensión" a aquellas líneas que pueden crecer también en ausencia de partículas de soporte en un fermentador a escala técnica, lo que presenta considerables ventajas, en comparación con otras células, en la manipulación de los cultivos, en el aumento de escala de los cultivos, y en la multiplicación de los virus. En el estado de la técnica (documento WO 97/37000) son conocidos procedimientos para adaptar células MDCK al cultivo en suspensión. Las células MDCK pueden descender, por ejemplo, de la línea celular MDCK-33016.
Según otra forma de realización de la invención se utilizan células que, tanto antes como después de la infección, tienen la propiedad de crecer de manera adherente y como cultivo en suspensión. Esta forma de realización presenta la ventaja especial de que se puede utilizar un sistema de cultivo celular, y por tanto también un medio, para el desarrollo de las células desde la escala de laboratorio hasta la producción industrial a gran escala. Los correspondientes sistemas facilitan considerablemente la aprobación del medicamento, ya que hay que demostrar sólo la seguridad de un único sistema de cultivo celular.
El virus puede tener un genoma de ácido ribonucleico bicatenario (en inglés abreviado dsRNA), o de ácido ribonucleico monocatenario. Las moléculas de ácido ribonucleico monocatenario pueden tener en esta caso la polaridad de un ARN mensajero, abreviado ARN(+), o la polaridad contraria, abreviado ARN(-).
El virus puede ser también un virus mencionado más adelante. Los virus que se emplean en el marco del procedimiento de acuerdo con la invención pueden ser suministrados por diversas colecciones, tales como por ejemplo la ATCC (American Type Culture Collection) o la ECACC (Euopean Collection of Animal Cell Cultures). Por regla general, se recurre en este caso a cepas de producción existentes o cepas víricas que ya han sido multiplicadas previamente en cultivo celular. Se pueden establecer además aislados propios, si éstos son más adecuados para la aplicación respectiva. Según una forma de realización, el virus que se emplea en el procedimiento está seleccionado del grupo consistente en: virus de la hepatitis A, virus de la encefalitis japonesa, virus de la meningoencefalitis primaveroestival europea y de las formas orientales (rusa u otras) relacionadas, virus del dengue, virus de la fiebre amarilla, virus de la rabia.
Según otra forma de realización de la presente invención, el genoma del virus puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifique una proteína heteróloga funcional con un tamaño de al menos 10 kDa. En el estado de la técnica son conocidos numerosos vectores para la expresión de proteínas heterólogas que se basan en un genoma vírico, por ejemplo en un genoma de herpes, viruela bovina, o adenovirus (Galler R. et al., Braz. J. Med. Biol. Res., febrero de 1997, 30(2):157-68; Willemse MJ. et al., Vaccine, noviembre de 1996, 14(16):1511-6; Efstathiou S., Minson AC., Br. Med. Bull., enero de 1995, 51(1):45-55; Hammerschmidt W., Curr. Opin. Mol. Ther., octubre de 2000, 2(5):532-9; Graham FI. Prevec L., Mol. Biotechnol., junio de 1995, 3(3):207-20; Carroll MW., Moss B.; Curr. Opin. Biotechnol., octubre de 1997; 8(5):573-7; Wojcik J., Acta. Microbiol. Pol., 1995, 44 (2):191-6; Ramirez JC. et al., J. Virol., agosto de 2000; 74(16):7651-5; Hagen, Anna, et al., Biotechnol. Prog., 1996, 12, 406-408; Huyghe, Bernard, et al., Human Gene Therapy, noviembre de 1995, 6:1403-1416).
En el marco de la presente invención también están comprendidos procedimientos para multiplicar aquellos virus en los cuales el genoma vírico ha sido modificado por adición o sustitución de secuencias, de manera tal que el genoma codifica un proteína funcional heteróloga, que no pertenecía originalmente al virus, con un tamaño de al menos 10 kDa. De acuerdo con la invención, a una proteína se la denomina aquí "proteína funcional" si la proteína puede al menos desencadenar una reacción inmunitaria contra esa proteína. Evidentemente, además de la actividad inmunológica, la proteína puede tener otras actividades biológicas, por ejemplo actuar como enzima o citocina.
Los virus que se emplean en el procedimiento de acuerdo con la invención pueden presentar además deleciones de genes individuales en el genoma vírico. Así, por ejemplo, se pueden eliminar deliberadamente de un virus que vaya a ser empleado como vacuna, genes que codifican factores de patogenicidad. Las deleciones correspondientes comprenden preferiblemente no más de 500 o 1000 nucleótidos.
Evidentemente, el virus empleado para el procedimiento de acuerdo con la invención también puede comprender un genoma vírico completo.
Según el procedimiento de acuerdo con la invención, la multiplicación de los virus en el cultivo en suspensión se puede llevar a cabo en presencia o en ausencia de suero en el medio. La ausencia de suero procura especiales ventajas, ya que estas condiciones de cultivo celular simplifican sustancialmente la autorización del empleo medicinal de los productos así producidos. Al renunciar a añadir suero al medio de cultivo se evitan además costosos pasos de purificación para eliminar las contaminaciones del medio. De este modo se pueden conseguir también mejoras en cuanto a la calidad del producto y a la vez ahorrar costes.
En el marco de la presente invención se denomina "medio exento de suero" a un medio que no tiene ninguna adición de suero de tipo humano o animal.
A los cultivos en cuestión se les puede añadir cantidades definidas de determinadas proteínas que no repercuten negativamente sobre el cultivo y su posterior utilización. Un medio de cultivo semejante se denomina un medio químicamente definido. A este medio se añaden proteínas seleccionadas, tales como péptidos mitógenos, insulina, transferrina o lipoproteínas, que pueden ser suministrados por distintos fabricantes, conocidos por el especialista. En el marco de la presente invención se entienden por péptidos mitógenos con preferencia hidrolizados vegetales, por ejemplo hidrolizado proteínico de semillas de soja, o lisados de proteínas de otras plantas útiles.
Sin embargo, según una forma de realización especialmente preferida los medios están completamente "exentos de proteína". Se entienden por "exentos de proteína", cultivos en los cuales la multiplicación de las células se realiza con exclusión de proteínas, factores de crecimiento, otros aditivos proteínicos, y proteínas no séricas. Evidentemente, las células que crecen en tales cultivos contienen proteínas propias.
Son medios exentos de proteínas conocidos, por ejemplo, medio de Iscove, Ultra-CHO-Medium (BioWhittaker) ó EX-CELL (JHR Bioscience). Por ejemplo, son medios que contienen suero usuales el medio basal de Eagle (BME), medio esencial mínimo (MEM) (Eagle, Science 130, 432 (1959) o medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM ó EDM) a los cuales se añade usualmente hasta 10% de suero fetal de bovino o aditivos similares. También son suficientemente conocidos en el estado de la técnica medios exentos de proteína tales como, por ejemplo, PF-CHO (JHR-Bioscience), medios químicamente definidos, tales como ProCHO 4CDM (Bio Whittaker) o SMIF 7 (Gibco/BRL-Life Technologies), y péptidos mitógenos, tales como por ejemplo Primactone, Pepticase ó Hypep^{TM} (todos de Quest International), o bien hidrolizado de lactoalbúmina (Gibco y otros fabricantes). En especial, los aditivos para medios basados en hidrolizados vegetales presentan la ventaja particular de que puede ser excluida una contaminación con virus, micoplasmas o agentes infecciosos desconocidos.
Según una forma de realización preferida de la presente invención, durante el cultivo de las células infectadas se añade medio fresco, concentrado de medio, o componentes del medio tales como, por ejemplo, aminoácidos, vitaminas, fracciones lipídicas o fosfatos.
El procedimiento de acuerdo con la invención se puede llevar a cabo así en un sistema de perfusión o en un sistema por lotes. Se denominan "sistemas de perfusión" aquellos sistemas de cultivo en los cuales se aporta y se retira medio de manera continua. Como alternativa a ello, también se pueden cultivar las células en un sistema "por lotes", en el cual el sistema es conducido como un sistema esencialmente cerrado, sin aportación de medio, desde la inoculación hasta la recolección.
Las condiciones de cultivo celular (temperatura, densidad de células, valor de pH, etc.) que deben ser utilizadas para la aplicación deseada pueden ser modificadas dentro de un rango muy amplio, en virtud de la idoneidad de la línea celular empleada de acuerdo con la invención, y pueden ser adaptadas a las necesidades de la aplicación. Por tanto, los siguientes datos representan exclusivamente valores orientativos.
La multiplicación de las células antes de la infección se puede llevar a cabo partiendo de cultivos de siembra o pequeños recipientes de cultivo en un sistema de perfusión, utilizando procedimientos de retención habituales tales como, por ejemplo, la centrifugación o la filtración. Ha demostrado ser ventajoso recambiar el medio de cultivo, durante el cultivo de las células en un sistema de este tipo, con una tasa de hasta 3 rellenos de fermentador al día. En estas condiciones se pueden multiplicar las células hasta densidades de células de, por ejemplo, 2 x 10^{7}. Durante el cultivo, el control de la velocidad de perfusión se realiza preferiblemente por medio de parámetros conocidos para el especialista tales como, por ejemplo, el número de células, o el contenido de glutamina, de glucosa o de lactato.
En caso de emplear un sistema por lotes, por ejemplo a una temperatura de 37ºC y un tiempo de generación de 20-30 segundos, se pueden conseguir densidades celulares de alrededor de 8-25 x 10^{5} células/ml.
Antes de la infección, las células también se pueden multiplicar, de acuerdo con la invención, en un sistema por lotes alimentado ("fed-batch" en inglés). Se denomina "sistema por lotes alimentado" en el marco de la presente invención a un sistema de cultivo en el cual primeramente se cultivan las células en un sistema por lotes, y el agotamiento de los nutrientes (o de una parte de los nutrientes) en el medio se compensa mediante una aportación regulada de nutrientes concentrados. En un sistema por lotes alimentado, se pueden multiplicar las células, por ejemplo, hasta una densidad de células de aproximadamente 1-10 x 10^{6}.
Ha demostrado ser ventajoso, además, ajustar el valor de pH del medio durante la multiplicación de las células antes de la infección a un valor entre pH 6,6 y pH 7,8, y de manera especialmente ventajosa a un valor entre pH 7,2 y pH 7,3.
El cultivo de las células antes de la infección se realiza preferiblemente a una temperatura entre 30º y 40ºC, y de manera especialmente preferible a una temperatura entre 33º y 37ºC. En el cultivo antes de la infección, la presión parcial de oxígeno se ajusta preferiblemente a un valor entre 25% y 95%, de manera especialmente preferible a un valor entre 35% y 60%. Los valores de presión parcial de oxígeno que se indican en el marco de la invención se basan en la saturación del aire.
Ha demostrado ser ventajoso para el procedimiento de acuerdo con la invención que la infección de las células se realice a una densidad celular de, preferiblemente, alrededor de 8-25 x 10^{5} células/ml en un sistema por lotes o bien, preferiblemente, alrededor de 5 - 20 x 10^{6} células/ml en un sistema de perfusión. En el procedimiento de acuerdo con la invención se puede infectar a las células con una dosis vírica (valor m.o.i, siglas inglesas de "multiplicidad de infección", correspondiente al número de unidades de virus por célula en el momento de la infección) entre 10^{-8} y 10, preferiblemente entre 0,001 y 0,5.
El cultivo de las células después de la infección se puede realizar asimismo en un sistema de perfusión, por lotes o por lotes alimentado. En este caso se pueden emplear las mismas condiciones de cultivo que se han empleado antes (temperatura entre 30º y 40ºC, presión parcial de oxígeno entre 5% y 100%, valor de pH del medio entre pH 6,6 y pH 7,8).
Según la invención, se ponen a disposición además procedimientos que comprenden una recolección y aislamiento de los virus o de las proteínas producidas por éstos. En el aislamiento de los virus o de las proteínas, las células se separan del medio de cultivo por métodos habituales, por ejemplo mediante separación, filtración o ultrafiltración. A continuación se concentran los virus o las proteínas por procedimientos suficientemente conocidos por el especialista tales como, por ejemplo, centrifugación en gradiente, filtración, precipitación, cromatografía, y otros, y después se purifican. Según la invención se prefiere, además, que se inactiven los virus durante o después de la purificación. La inactivación de los virus, por ejemplo por medio de \beta-propiolactona o por medio de formaldehído, se puede realizar en cualquier punto dentro del proceso de purificación.
Los procedimientos de acuerdo con la invención son adecuados, de manera especial, para preparar medicamentos, en particular para preparar vacunas y para preparar agentes de diagnóstico.
Así, la preparación del medicamento puede comprender la multiplicación y aislamiento de un virus o de proteínas producidas por éste, y la mezcladura con un adyuvante, sustancia auxiliar, tampón, agente diluyente y/o excipiente farmacéutico, adecuados. En el marco de la presente invención se entienden por "adyuvantes" aquellas sustancias que incrementan la respuesta inmunitaria. Entre ellas se encuentran, por ejemplo, hidróxidos de distintos metales, tales como el hidróxido de aluminio, componentes de la pared celular bacteriana, aceites o saponinas. Las vacunas son apropiadas, en especial, para el tratamiento profiláctico o terapéutico de infecciones víricas.
La inmunogenicidad y/o la actividad de las vacunas en cuestión pueden verificarse por métodos conocidos para el especialista tales como, por ejemplo, ensayos de protección con infección de carga, o determinación del título de anticuerpo necesario para la neutralización. La determinación de la cantidad de virus o de la cantidad de anticuerpos producidos se puede realizar, por ejemplo, mediante la determinación del título o de la cantidad de antígeno, por procedimientos suficientemente conocidos para el especialista tales como, por ejemplo, determinación del título de virus, ensayo de hemoaglutinación, determinación de antígeno o determinación de proteínas de las clases más diversas.
Los procedimientos de acuerdo con la invención son apropiados, además, para preparar una composición para diagnóstico. Las composiciones pueden comprender un virus obtenible a través de los procedimientos o una proteína producida por el mismo. En combinación con aditivos y reactivos de detección usuales en el estado de la técnica, estas composiciones se pueden utilizar como ensayos diagnósticos que son apropiados para la detección de virus o de anticuerpos anti-virus.
En los siguientes ejemplos, todos los títulos de virus se han determinado mediante el método, conocido para un especialista, de dilución final y determinación estadística del punto final de 50% según Spearman-Kaerber (véase Horzinek, Kompendium der allgemeinen Virologie, 2ª edición, 1985, Parey Verlag, páginas 22-33). En cada caso se infectaron, en placas de microvaloración, 8 cultivos de ensayo con cantidades de 100 \mul de una dilución de virus, utilizándose diluciones del material vírico desde 10^{-2} hasta 10^{-8}. La evaluación de las determinaciones del título del virus se realizó, o bien microscópicamente por medio del efecto citopático de los cultivos de ensayo, o con ayuda de métodos inmunológicos de detección utilizando anticuerpos específicos para el virus. La fijación de los anticuerpos específicos se hace visible como inmunofluorescencia con anticuerpos marcados con fluoresceína o utilizando anticuerpos secundarios marcados con biotina y un complejo reforzador de estreptoavidina/biotina/peroxidasa, así como un colorante precipitable (Gregersen et al., Med. Microbiol. ImmunoI., 177: 91-100). La unidad de título de virus se denomina "dosis infecciosa de cultivos 50%" (abreviado KID_{50}). Las células detectoras específicas para virus y - en tanto que sean aplicables - los procedimientos de detección inmunológicos utilizados en cada caso para las distintas clases de virus son citados en los ejemplos específicos para cada virus.
Ejemplos Ejemplo 1 Gestión del sistema de cultivo celular en los primeros pasos de trabajo y a escala de laboratorio
Se descongelaron rápidamente, sumergiéndolas en un baño de agua, células MDCK procedentes de ampollas de células de siembra que habían sido conservadas en nitrógeno líquido, e inmediatamente se diluyeron aproximadamente 1:100, por regla general, en medio de cultivo (Ultra CHO con suplemento, BioWhittaker, denominado en lo sucesivo "medio estándar") hasta un número de células en torno a 1 x 10^{5} células/ml. Después de esto se separaron las células del medio por centrifugación (10 minutos a 800 x g), se suspendieron de nuevo en medio fresco, y se traspasaron a frascos de cultivo en agitación centrífuga (volumen de trabajo 100 ml, Bellco o Techne). Estos preparados de cultivo fueron incubados a 37ºC sobre un agitador magnético a 50-60 revoluciones por minuto. Se vigiló el crecimiento celular por medio de controles del número de células. Al alcanzar números de células desde 8 x 10^{5} hasta como máximo 1,6 x 10^{6} células/ml, se traspasaron los cultivos de 100 a 1000 ml diluyendo las células en medio estándar fresco y sembrándolas en frascos para cultivo en agitación centrífuga nuevos, y se incubaron con agitación, de la manera antes descrita, hasta alcanzar las densidades celulares máximas o deseadas. En estos traspasos de células la dilución del cultivo respectivo se adaptó, dentro del intervalo entre 1:4 y 1:10, al crecimiento celular, de modo que el número de células máximo se alcanzase, dependiendo de la necesidad, en el transcurso de 3 a 5 días. De manera alternativa, este mismo tipo de cultivo de células se probó sin adición de suplementos al medio, y se pudo mantener sin problemas durante al menos 10 traspasos.
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Ejemplo 2 Gestión del sistema de cultivo celular como cultivo adherente
Se diluyeron en diversos medios cultivos en suspensión establecidos (véase el Ejemplo 1), de manera tal que el número de células se situase en aproximadamente 1 x 10^{5} células/ml, y a continuación se introdujeron en los más diversos recipientes para cultivo celular (véase la Tabla 1). En cada caso el volumen de cultivo celular correspondía a las cantidades habituales para los recipientes de cultivo respectivos, es decir, aproximadamente 4 mm de medio de cultivo por encima de la superficie de siembra o bien aproximadamente 1 ml de medio por 2,5 cm^{2} de superficie de cultivo. Por regla general, los cultivos fueron incubados a 37ºC, la temperatura habitual para la mayoría de los cultivos celulares, aunque eran posibles considerables desviaciones de la temperatura de incubación sin mermas notables (véase la Tabla 1). En la Tabla 1 están representados los sistemas de cultivo probados y los resultados del crecimiento celular obtenidos con ellos, y muestran que este sistema celular se comporta de manera aproximadamente igual y robusta en distintos medios y sistemas de cultivo.
Los cultivos en monocapa preparados de esta manera se utilizaron para la determinación del título de cosechas de virus en placas de microvaloración, así como para el cultivo de virus bajo control microscópico o para investigaciones de inmunofluorescencia, ensayos de hemoadsorción y otros métodos estándar virológicos o inmunológicos, que se pueden realizar mejor en cultivos monocapa adherentes que en cultivos en suspensión. Además, tales cultivos eran especialmente adecuados para obtener cepas víricas puras mediante purificación en placas o dilución. Por último, los cultivos adherentes se utilizaron también para la multiplicación de virus a pequeña y gran escala; cantidades mayores preferiblemente en frascos para cultivo por rodadura.
TABLA 1 Crecimiento celular de diversos sistemas de cultivo adherentes
1
BME: siglas inglesas de Medio basal de Eagle (Basal Medium Eagle); complementado con bicarbonato (2-2,5% de una disolución madre al 5%)
MEM: siglas inglesas de Medio esencial mínimo (Minimum Essential Medium); complementado con bicarbonato (2-2,5% de una disolución madre de 5%)
EDM: siglas inglesas de Medio de Eagle modificado por Dulbecco (Dulbecco's Modified Eagle Medium); complementado con bicarbonato (2-2,5% de una disolución madre de 5%)
FCS: suero fetal de bovino
Supl.: suplemento Ultra-CHO
#): valores ajustados; valores efectivamente medidos con desviaciones en +2ºC y -3ºC
\text{*}): fabricante: Bio-Whittaker.
Ejemplo 3 Aislamiento de virus, obtención y fabricación de preparados de virus para siembra
En un baño de hielo se deslieron en medio estándar (también son posibles otros medios cualesquiera, o tampón de fosfato) con adición de antibióticos (PSN: 100 unidades/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina, 50 \mug/ml de neomicina), y en su caso se homogenizaron (desmenuzándolas finamente con un mortero, con cuchillas de escalpelo, o con los denominados homogenizadores "tipo Dounce" o "tipo Potter"), aislados primarios tales como, por ejemplo, muestras de órganos, de tejidos o de fluidos tisulares, de frotis faríngeos o de heces, que contenían virus. La suspensión obtenida se filtró con ayuda de un prefiltro de jeringa común de laboratorio, de tamaño de poro 0,45 \mum (pero también 0,2 \mum para aislar virus más pequeños, sin envoltura). Se inoculó el filtrado en frascos de cultivo pequeños (de 25 cm^{2}, véase el Ejemplo 2) con medio de cultivo fresco y adición de antibiótico. Para aumentar el rendimiento, se dotó a varios cultivos con un inóculo de, por ejemplo, 100 \mul hasta 1 ml, y a continuación se incubó a 37ºC. Para aislados víricos procedentes de las vías respiratorias superiores se recomienda disponer cultivos adicionales a una temperatura de incubación inferior, en concreto 33ºC.
Los aislados víricos puros, ya multiplicados en cultivo, se emplearon para la infección directa en el sistema de cultivo de acuerdo con la invención según el Ejemplo 1 ó 2. Sin embargo, puesto que aquí se podía presuponer un contenido de virus mayor de la preparación vírica, se emplearon cantidades menores de inóculo, en concreto de 100 \mul o inferiores. Para estas primeras infecciones en el sistema de cultivo de acuerdo con la invención se prefirió una MOI (multiplicidad de infección) de 0,1 y 0,001; en caso de un resultado insatisfactorio se repitió la infección con MOIs en escalones decrecientes de potencias de 10, desde 10 hasta 0,0001.
A continuación, se estudiaron microscópicamente a diario los cultivos infectados en busca de daños celulares debidos a los virus (efecto citopático, siglas en inglés CPE), y se compararon con testigos. En el caso de virus que no provocaban CPE, como alternativa se analizó el cultivo en busca de la presencia de determinados antígenos víricos o sus genes (por ejemplo, según el tipo de virus, mediante ensayos de hemoaglutinación (HA), ELISA; PCR). Al cabo de 3 a 4 días, o en caso de un hallazgo positivo (retracción de las células, muerte celular, redondeamiento y desprendimiento del tapiz celular en el caso de cultivos adherentes, formación de placas) se congelaron como muestras los sobrenadantes de cultivo centrifugados para quedar libres de células, y por el contrario, en el caso de hallazgos negativos o dudosos, con medio fresco se ajustó todo el cultivo a un número de células de 1 x 10^{5} células (dilución de los cultivos en suspensión o tratamiento con tripsina de los cultivos adherentes y posterior dilución de las células individualizadas) y se continuó incubando, dividido entre nuevos cultivos. Puesto que esto, en la mayoría de los medios, correspondía a una dilución de los cultivos de 1:4 hasta 1:20, para evitar una multiplicación logarítmica del número de los cultivos, como muy tarde después del segundo de tales traspasos de cultivo, se siguieron conservando sólo una parte de los cultivos posibles. Por regla general, al cabo de 3-4 traspasos, se pudieron aislar y verificar aislados víricos con éxito a partir del material de partida que contenía virus, adecuado.
Para la mayoría de las clases de virus, y dependiendo del contenido de virus y de la naturaleza del material de partida, se comprobó una CPE debida a virus tras una incubación de 2-7 días (véanse también los Ejemplos específicos de virus). No obstante, algunas clases de virus se multiplican muy lentamente o bien no muestran CPE alguno, y por tanto deben ser demostradas a través de prolongados traspasos y tiempos de incubación, o bien por ensayos específicos (los métodos necesarios en cada caso se expondrán en los Ejemplos específicos de virus). Como ejemplo de un virus sin CPE y con multiplicación lenta, que además requiere un sistema de detección especial, se remite al lector al Ejemplo especial del virus de la hepatitis A. El ensayo de detección allí descrito es apropiado en caso de utilizar así mismo antisueros correspondientes para la detección de otros virus, en especial aquellos que no presenten CPE específico.
Convenientemente, un virus aislado por primera vez debería ser utilizado ulteriormente sólo tras triple purificación en placa o bien tras la preparación de un aislado puro mediante la técnica denominada "de dilución limitada". Los métodos necesarios para ello, que corresponden al estado de la técnica, se podrán tomar de los pertinentes libros de texto (véase por ejemplo B.W. Mahy: Virology - a practical approach; IRL Press, Oxford, 1985).
Cuando ya se dispone de preparaciones adecuadas de virus procedentes de un aislado primario, o bien en forma de una cepa establecida, éstas se utilizan después para infectar cultivos de agitación centrífuga, con el fin de obtener virus de siembra homogéneos con fines productivos. Sin que el objeto de la invención quede limitado a esto, se recomienda llevar a cabo primeramente una primera infección en pequeños cultivos de agitación centrífuga con 100 ml de medio de cultivo y MOIs de 10 hasta 0,00001, preferiblemente de 0,1 hasta 0,001. Las condiciones más favorables (en particular en lo referente a MOIs y tiempos de recolección) para conseguir más rápidamente elevados títulos de virus o rendimientos han sido elegidas con el fin de preparar virus de siembra en un sistema de cultivo del tamaño adecuado - en función de la escala de producción prevista y el número de ciclos productivos - en un posterior traspaso del virus. Dependiendo de los rendimientos víricos obtenidos y de la escala de producción prevista, el orden de magnitud de este traspaso de virus para siembra puede consistir en el paso desde algunos cultivos de agitación centrífuga a escala de hasta 1000 ml, a pequeños fermentadores con un volumen de hasta aproximadamente 10 litros o más. El virus recolectado es liberado de eventuales restos celulares mediante filtración o centrifugación, y se conserva en pequeñas cantidades alícuotas destinadas a la producción, a temperaturas en lo posible inferiores a -70ºC.
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Ejemplo 4 Gestión del sistema como cultivo adherente con microsoportes con fines productivos
El cultivo de las células MDCK adherentes se llevó a cabo en frascos de agitación por rodadura de acuerdo con el Ejemplo 2, Tabla 1, con BME más 3% de suero fetal de bovino (FCS). Tras el cultivo en este sistema se desprendieron las células separándolas de la superficie de los frascos de agitación por rodadura. Esto se consiguió enzimáticamente con ayuda de una solución de tripsina adecuada, por procedimientos habituales, que son conocidos para el especialista. Como alternativa, se cultivaron células en suspensión según el Ejemplo 1 en cultivos de agitación centrífuga y se utilizaron directamente para recubrir el microsoporte.
Se cargó el fermentador de producción con microsoportes del tipo Cytodex 3 (Pharmacia). Se trataron en autoclave los microsoportes (cantidad específica 5 g por litro) y se acondicionaron con medio nutritivo. El procedimiento garantizaba la adherencia de las células a la superficie del microsoporte. Se transfirieron las células obtenidas de la manera antes descrita al sistema de producción, de manera tal que la densidad celular ascendió a 1 x 10^{5} células/ml. Las células se adhirieron a los microsoportes, y se las cultivó hasta llegar a la confluencia o hasta conseguir una densidad celular de 3 x 10^{6} células/ml.
Después de la fase de cultivo celular se cambió el medio nutritivo presente por medio nutritivo fresco. Se empleó para ello medio nutritivo exento de proteína. Se realizaron dos ciclos de lavado. Un ciclo de lavado se componía de: detener el sistema de agitación, dejar sedimentar el microsoporte, retirar el medio nutritivo gastado, añadir el medio nutritivo fresco, y resuspender el microsoporte. Después del paso de lavado se añadió tripsina (2,5 mg/ml) al cultivo.
A continuación se llevó a cabo la infección del cultivo celular con virus de siembra. Este virus de siembra se obtuvo y se empleó de acuerdo con el Ejemplo 3. La MOI fue en este caso específica para el virus, y se situó entre 0,1 y 0,000001, preferiblemente entre 0,01 y 0,0001. Una vez finalizada la fase de infección, cuya duración estuvo determinada por una parte por el virus específico (ver los ejemplos específicos), y por otra parte por la MOI elegida, se detuvo el mecanismo de agitación y se dejaron sedimentar los microsoportes. Se retiró el sobrenadante que contenía los virus, y se purificó eliminando los restos celulares por medio de procedimientos de separación adecuados. Para separar las células se emplearon centrífugas o separadores, filtros e instalaciones de filtración con flujo transversal, que son conocidos para el especialista.
Ejemplo 5 Gestión del sistema como cultivo en suspensión hasta un volumen de producción a escala de 1000 l, utilizando medio exento de suero
El cultivo de cultivos en suspensión para un volumen de producción de 1000 l se llevó a cabo con ayuda de frascos con agitación centrífuga (de la razón social Techne) en pequeña escala hasta un volumen de cultivo de 1000 ml (véase el Ejemplo 1). La densidad celular al aplicar la agitación centrífuga ascendía a 1 x 10^{5} células/ml. Las células fueron cultivadas en un procedimiento por lotes y, al alcanzar una densidad celular de 1 x 10^{6} células/ml se transfirieron por simple dilución en proporción 1:10 con medio fresco. Para el cultivo de células se utilizó medio exento de suero (UltraCHO, Biowhittaker). A partir de un volumen de 10 l se emplearon fermentadores agitados (30 revoluciones del agitador por minuto) con aireación permanente y control de temperatura (temperatura regulada de 37ºC para el cultivo de células), valor de pH (intervalo regulado 7,1 a 7,3) y presión parcial de oxígeno (pO_{2} de 45 a 55%) (los detalles técnicos son los mismos que en la Tabla 2). En correspondencia con una proporción de transformación de 1:10, los volúmenes de escalado ascendieron a 10 l, 100 l, 1000 l. Con una densidad celular inicial de 1 x 10^{5} células/ml, los fermentadores alcanzaron la densidad celular final de 1 x 10^{6} células/ml en un tiempo de 3-4 días. A la escala de 1000 l se realizó además una alimentación de lote (en inglés fed-batch) con disolución de glucosa (100-200 g/l), con el fin de incrementar la densidad celular a 3 x 10^{6} células/ml. En la Tabla 2 se presentan comparativamente los rendimientos celulares alcanzados.
Ejemplo 6 Gestión del sistema como cultivo en suspensión hasta un volumen de producción hasta un volumen de 1000 l, utilizando medio químicamente definido
El cultivo de cultivos en suspensión para un volumen de producción de 1000 l se llevó a cabo de manera análoga a lo descrito en el Ejemplo 5. Sin embargo, se utilizó para el cultivo de las células, como alternativa, medio químicamente definido (ProCHO4CDM). Demostró ser ventajoso el realizar de 3 a 5 traspasos previos para la adaptación a este medio. En la Tabla 2 se presentan comparativamente los rendimientos celulares alcanzados.
Ejemplo 7 Gestión del sistema como cultivo en suspensión hasta un volumen de producción a escala de 1000 l, utilizando medio exento de proteína
El cultivo de cultivos en suspensión para un volumen de producción de 1000 l se llevó a cabo de manera análoga a lo descrito en el Ejemplo 5. Se utilizó como medio para el cultivo de las células medio exento de proteína (SMIF7, LifeTechnologies). Demostró ser ventajoso el realizar de 5 a 10 traspasos previos para la adaptación a este medio. En la Tabla 2 se presentan comparativamente los rendimientos celulares alcanzados.
TABLA 2 Cultivo de células (MDCK 33016) a escala de producción en fermentador, utilizando diversos procedimientos y medios
2
X_{0}: densidad celular inicial
X: densidad celular final
N/T/pO2/pH: revoluciones del agitador, temperatura, presión parcial de oxígeno, valor de pH.
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Ejemplo 8 Gestión del sistema como cultivo en la fase de producción con medio exento de suero
Después de cultivar cultivos en suspensión hasta la escala de producción según el Ejemplo 5 se distribuyeron las células en tres fermentadores de igual volumen, 3 x 1000 l, y se rellenaron con medio fresco. De esta manera cada fermentador recibió 1/3 de su volumen de cultivo previo y 2/3 de su volumen de medio fresco. Se utilizó el mismo medio que en la fase de cultivo (UltraCHO, Biowhittaker). Después del relleno se añadió al cultivo celular tripsina 10 mg/l.
A continuación se realizó la infección del cultivo celular con un virus de siembra (gripe B/Harbin/7/94) con una MOI de 0,001 y una incubación posterior en las mismas condiciones de fermentación que durante el cultivo de células, pero a 33ºC, durante 96 horas. Después se retiró el sobrenadante que contenía células, y se separaron las células del mismo por medio de un separador. Se llevó a cabo un paso adicional de filtración a través de filtros de cartucho con un tamaño de poro de 0,45 \mum, para separar más partículas finas.
Las cosechas de virus se analizaron en cuanto al contenido de virus en las mismas con ayuda de métodos estándar en el ensayo de hemoaglutinación (HA) con eritrocitos de pollo al 0,5% y mediante la determinación del título de virus en células MDCK adherentes: el contenido medido por HA ascendió a 1024 unidades, y el título de virus se situó en 10^{8,2} KID_{50}/ml.
Ejemplo 9 Gestión del sistema en la fase de producción con medios químicamente definidos
La preparación de las células de producción se realizó tal como se ha descrito en el Ejemplo 8. Como medio fresco se utilizó, no obstante, medio químicamente definido (ProCH04CDM, BioWhittaker). Después del relleno se añadió al cultivo celular tripsina 2,5 mg/l. La posterior infección se llevó a cabo de la manera descrita en el Ejemplo 8.
El contenido medido por HA ascendió a 1024 unidades, y el título de virus se situó en 10^{7,5} KID_{50}/ml.
Ejemplo 10 Gestión del sistema en la fase de producción con medio exento de proteína
La preparación de las células de producción se realizó tal como se ha descrito en el Ejemplo 8. Como medio fresco se utilizó, no obstante, medio exento de proteína (SMIF7, Life Technologies). Después del relleno se añadió al cultivo celular tripsina 2,5 mg/l.
La posterior infección se llevó a cabo de la manera descrita en el Ejemplo 8. El contenido medido por HA ascendió a 1024 unidades, y el título de virus se situó en 10^{7,9} KID_{50}/ml.
Ejemplo 11 Cultivo e infección con medio químicamente definido
El cultivo de las células se realizó tal como se ha descrito en el Ejemplo 6, y la infección tal como se ha descrito en el Ejemplo 9. Por tanto, todo el cultivo celular, desde el inicio del cultivo hasta la recolección de la infección tuvo lugar en medio químicamente definido.
Ejemplo 12 Cultivo con medio químicamente definido e infección con medio exento de proteína
El cultivo de las células se realizó tal como se ha descrito en el Ejemplo 6, en medio químicamente definido, y la infección tal como se ha descrito en el Ejemplo 10, en medio exento de proteína.
Ejemplo 13 Cultivo e infección en medio exento de proteína
El cultivo de las células se realizó tal como se ha descrito en el Ejemplo 7. La infección tal como se ha descrito en el Ejemplo 10. Por tanto, todo el cultivo celular, desde el inicio del cultivo hasta la recolección de la infección tuvo lugar en medio exento de proteína.
Ejemplo 14 Descripción general de la purificación de virus
Una vez finalizada la fase de multiplicación de virus se filtró la cosecha del cultivo celular a través de un filtro en profundidad con un tamaño de poro de 0,45 ó 0,5 \mum, para separar células y fragmentos de células. Como alternativa, esta separación se llevó a cabo con ayuda de un separador. Los virus contenidos en la cosecha clarificada fueron concentrados y purificados, en caso necesario, por medio de ultrafiltración, utilizando una membrana con un límite de exclusión entre 50.000 y 1.000.000, preferiblemente de 100.000 a 500.000. El concentrado de virus obtenido se cargó sobre una columna de cromatografía que estaba empaquetada con CS (Cellufine Sulfate, Millipore). Después de eliminar las impurezas por lavado con tampón, se eluyeron los virus con una disolución de cloruro sódico de 0,3 a 3 M. Se desaló el eluato por medio de ultrafiltración, y se concentró aún más. Como alternativa o en combinación con una purificación cromatográfica, se puede conseguir un efecto de purificación adicional por medio de la ultracentrifugación. La mayoría de las clases de virus pueden ser purificadas adicionalmente, en lo que se refiere a su densidad en suspensión, mediante ultracentrifugación en un gradiente de sacarosa con posterior fraccionamiento del gradiente. En cualquier punto dentro del proceso de purificación se puede introducir una inactivación del virus con formaldehído o \beta-propiolactona, pero preferiblemente se realiza después de la concentración o después de la purificación, ya que entonces el volumen a inactivar está ya considerablemente reducido.
Ejemplo 15 Obtención de preparados de virus inactivados puros para formulación de vacunas
Se cultivaron flavivirus (virus de la meningoencefalitis primaveroestival, cepa K 23) de acuerdo con los Ejemplos 5, 6 y 7 en distintos medios, con una dosis de inoculación de 0,2 MOI (para más detalles véase el Ejemplo 19).
El medio de cultivo cosechado, que contenía virus, fue liberado de restos celulares eventualmente contenidos por centrifugación y filtración a través de filtros con un tamaño de poro de 0,45 \mum. Por razones de seguridad, este material fue inactivado ya después de la filtración, mediante la adición de \beta-propiolactona a una dilución de 1:2000 ó 1:2500 e incubación a 2-8ºC durante 24 horas. Un ensayo de cultivo celular de los preparados inactivados después de hidrolizar durante 2 horas a 37ºC el agente inactivante mostró que, hasta un límite de detección de menos de 0,03 unidades infecciosas por ml, ya no estaba presente ningún virus activo.
En el estudio analítico de los pasos de purificación que se describen a continuación, para determinar el contenido total de proteína se utilizó un ensayo de BCA (Pierce). El contenido específico de antígeno se determinó con ayuda de un ensayo ELISA con doble anticuerpo ("sandwich-ELISA" en inglés), utilizando anticuerpos monoclonales específicos contra la glicoproteína E (Niedrig et al., 1994, Acta Virologica 38: 141-149) y un antisuero policlonal autopreparado, contra virus purificado procedente de conejos. En este caso se aplicaron como valores de referencia (correspondientes al 100%) los valores para el material de partida inactivado.
Purificación mediante centrifugación en gradiente
Preparados de virus inactivados fueron purificados según métodos conocidos por medio de una ultracentrifugación en gradiente de densidad (sacarosa al 15-60%) a 80.000 x g. A continuación se fraccionó el gradiente y en muestras de las fracciones se determinó la extinción a 280 nm para identificar el pico de virus. En cada caso se comprobó un fuerte incremento de la extinción en el intervalo de concentración de sacarosa entre 30 y 40%, situándose el máximo en 34 y 35%. En este intervalo se midió también el contenido más alto de proteína vírica específica y la mayor pureza (determinada como proporción de proteína vírica respecto a proteína total). En total se volvieron a encontrar en estas fracciones pico más de 50% del contenido de antígeno específico que había sido comprobado en el material de partida.
Purificación cromatográfica
Los preparados de virus inactivados (ver más arriba) fueron aplicados a una columna de CS, que había sido previamente equilibrada con 5 volúmenes de columna de tampón de fosfato 50 mM, pH 7,5. Después se lavó con 10 volúmenes de columna de tampón de fosfato, para eliminar el material no fijado. A continuación se eluyó con el mismo tampón, con adiciones escalonadas de cantidades crecientes del mismo tampón al que se había añadido NaCl 3 M, el material fijado. En el caudal recogido durante la aplicación del material vírico se recuperó analíticamente entre 3,2 y 3,9% del antígeno específico y de 79 a 83% de la proteína total. En el tampón de lavado se encontró 6-11% de la proteína total y 0-2,3% del antígeno. Así pues, más de 95% del antígeno se había fijado al material de la columna. Al eluir con NaCl de 0,6 a 1,8 M se recuperó aproximadamente 60,0% del antígeno, y la máxima pureza se consiguió en la elución con NaCl 1,2 M. Concentraciones salinas superiores, hasta NaCl 3 M, eluyeron pequeñas cantidades adicionales (< 15%) de antígeno con escasa pureza específica.
Purificación por combinación de cromatografía y ultracentrifugación
Los eluatos obtenidos tras la elución con NaCl 0,6 M y 1,2M en una purificación cromatográfica tal como se ha descrito antes, reunidos, fueron sometidos a una ultracentrifugación durante 2,5 horas a 80.000 x g. Se resuspendió la pella de virus en tampón de fosfato 50 mM, pH 7,5, y se analizó. La concentración de proteína total de este preparado se había reducido a 0,7% del contenido inicial, y en este paso el grado de pureza se había incrementado en un factor de diez.
Se sometió este preparado de virus a una purificación en gradiente tal como se ha descrito más arriba. Después del fraccionamiento se halló un perfil de gradiente muy similar al encontrado tras la purificación en gradiente directa. Con todo, el máximo del pico del virus se había desplazado ligeramente, y se situaba ahora en 37% de sacarosa.
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Ejemplo 16 Multiplicación de flavivirus
Se infectaron cultivos en suspensión de células MDCK 33016 que tenían una densidad celular de 1-1,5 x 10^{6} células/ml, en condiciones estándar (medio estándar, temperatura de cultivo y de infección 37ºC) con el virus de la meningoencefalitis primaveroestival (cepa K 23, Niedrig et al., 1994, Acta Virologica 38: 141-149). A diferencia de los ejemplos precedentes, se utilizaron para la infección MOIs muy variadas. Además, los cultivos de infección se mantuvieron en parte en medio químicamente definido o en medio sin aditivos que contuviesen proteína. Se aplicaron diversos procedimientos de cultivo y de recolección, que demuestran ilustrativamente que con el sistema, y también habiendo modificado distintos parámetros, se pueden conseguir elevados rendimientos e incluso múltiples cosechas. Estas modificaciones están reunidas en la Tabla 3. Las determinaciones del título del virus se realizaron en células A 549 (ECACC nº 86012804) y se evaluaron al cabo de 5 días por su CPE. Hay que señalar el hecho de que la recolección repetida del mismo cultivo iba acompañada del reemplazo del medio de cultivo, de manera tal que en cada recolección se aportaba a las células medio nuevo, y por tanto podían seguir creciendo. Sin estas recolecciones, el cultivo no podía seguir siendo viable y productivo durante un período prolongado. Puesto que los reemplazos frecuentes de medio, con cortos intervalos entre los mismos, no permitían compensar el elevado rendimiento metabólico de los cultivos, se efectuaron adiciones complementarias de medio y aumentos de tamaño de los cultivos, adicionales, tras un tiempo de infección de 4 o 5 días.
TABLA 3 Multiplicación de virus FSME/K23 en cultivos MDCK 33016 en medio estándar y en medios alternativos con empleo de diversas MOI y variantes de recolección
3
^{+)}(M+30) significa relleno con medio + 30% del volumen del cultivo en el día indicado.
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Ejemplo 17 Multiplicación de picornavirus
Se cultivaron cultivos adherentes de MDCK-33016 para infección con virus de la hepatitis A (HAV, cepa HM 175, ATCC VR-1358) en medio MEM con adición de 5% de suero fetal de bovino y bicarbonato (compárese con el Ejemplo 2). En el marco del experimento se utilizó además otro aislado vírico, denominado "München" (véase Frösner et al., 1979; Infection 7: 303-305). El virus se inoculó diluido en el cultivo recientemente iniciado, y se incubaron los cultivos a 37ºC. A intervalos de 3-4 días se continuaron traspasando los cultivos en proporción 1:4.
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Se cultivaron cultivos en suspensión de células MDCK-33016 en medio estándar de acuerdo con el Ejemplo 1, se inocularon con HM 175, se incubaron a 33ºC, y después se traspasaron en proporción 1:10 cada semana. Las células adherentes y cultivos en suspensión se mantuvieron hasta durante 35 días después de la infección. Después se efectuó la detección de la replicación activa del virus por medio del CPE (cepa HM 175) o según uno de los métodos ya descritos (véase el apartado sobre determinación del título de virus, página 39 en Gregersen et al. 1988; Med. Microbiol. Immunol. 177: 91-100). Sin embargo, en lugar de IgG purificada se empleó como anticuerpo específico para el virus un anticuerpo anti-HAV, humano, (con la denominación F 86012, amablemente cedido por la razón social Dade Behring). Como anticuerpo anti- IgG humana con marcado mediante biotina se empleó el número de producto 39015 (razón social Sigma). La detección específica de una multiplicación activa de virus con este sistema proporcionó células teñidas de color pardo-rosado, que se podían reconocer fácilmente al microscopio con pocos aumentos. Por el contrario, las células negativas para el virus aparecen sin teñir o muestran sólo una coloración muy escasa. Con el mismo método de detección se evaluaron también determinaciones del título de virus tres semanas después del inicio, utilizándose como sistema de cultivo para las células humanas diploides (MRC-5).
En todas las preparaciones de infección antes descritas y con los dos aislados víricos utilizados se pudo detectar una replicación activa de HAV en las células MDCK. En cultivos en suspensión se detectó con la cepa HM 175 una multiplicación sorprendentemente rápida del virus. El séptimo día después de la infección el título de virus medido en el sobrenadante se situó en 10^{5,4} KID_{50}/ml; este cultivo se traspasó cada semana mediante una simple dilución 1:10, y produjo de nuevo en los cultivos resultantes, al cabo de otros 7 días, títulos de virus similares. Al final del cultivo, y después de dos traspasos celulares adicionales, se determinó el título de virus en una muestra del medio libre de células. Se tomó además una muestra de todo el cultivo y se disgregaron las células contenidas en la misma por congelación hasta -20ºC y descongelación dos veces. Los componentes celulares se eliminaron por centrifugación, antes de determinar el título de estas muestras. En la Tabla 4 están reunidos los rendimientos víricos obtenidos en esta preparación, y muestran que es posible una decuplicación semanal de los cultivos sin merma de los rendimientos específicos, pudiendo ser recolectados buenos títulos de virus por unidad de volumen a pesar del incremento masivo de las cantidades. Es digno de mención en este caso que se encontrase en el sobrenadante una porción considerable de virus, lo cual resulta también sorprendente para este virus, que está muy fijado a las células (véase la Tabla 4).
TABLA 4 Multiplicación de virus de hepatitis A (cepa HM 175) en cultivos en suspensión de MDCK 33016 con continua multiplicación e incremento del volumen de cultivo
4
Ejemplo 18 Multiplicación de rabdovirus
Se sembraron cultivos en suspensión en medio estándar de acuerdo con el Ejemplo 1, en frascos para cultivo celular, con una densidad celular de 1 x 10^{6} células por ml. Una vez arraigados los cultivos se infectaron en cada caso dos cultivos con una MOI de 0,01 y un cultivo con una MOI de 0,001, con un virus de la rabia (cepa Pitman-Moore, cepa de virus para vacunas). Los cultivos fueron incubados a 37ºC, y cada 4 o 3 días se desprendieron con tripsina y se traspasaron en proporción 1:10 (al cabo de 4 días) o en proporción 1:8 (al cabo de 3 días), manteniéndolos así durante 18 días (véase la Tabla 5). Se verificó el éxito de la infección en cada traspaso. A un cultivo se le añadió disolución de formol al 3,5%, y se incubó durante tres días a temperatura ambiente en esta disolución, para conseguir la inactivación del virus. Tras eliminar la disolución de formol se lavó el cultivo con PBS y se incubó durante 25 minutos a temperatura ambiente con Triton X-100 al 1% en PBS. Tras eliminar esta disolución se lavó tres veces con PBS y se aplicó un anticuerpo contra el virus de la rabia marcado con FITC (50 \mul de IgG-FITC anti-rabia de conejo, diluido 1:400, Dade Behring, OSHY 005). Después de 90 minutos de incubación a 37ºC se lavó nuevamente con PBS, y se evaluó el cultivo bajo un microscopio de fluorescencia invertido.
Como alternativa, se llevaron a cabo determinaciones del título de virus de los sobrenadantes de cultivo según métodos estándar en células MRC-5, que fueron evaluadas asimismo por medio de inmunofluorescencia después de pretratamiento con formol/Triton de la manera antes descrita. Mediante los títulos de virus obtenidos con este sistema se dispuso de una gran correlación con los rendimientos del procedimiento de preparación correspondiente que utilizaba cultivos MRC-5 para una vacuna humana aprobada (Rabivac), lo que posibilitó una orientación acerca de cuánto antígeno de vacuna estaba contenido por ml de recolectado de cultivo (véase la Tabla 5).
Las dos preparaciones (MOI 0,01 y 0,001) ya presentaban resultados positivos al cabo de 4 días, y después de ello un curso de la infección similar, aunque en el caso de la MOI más pequeña el curso de la infección estaba ligeramente retardado - lo que se podía apreciar en los títulos de virus, que hasta el día 11 eran aproximadamente 1,2 a 0,5 log KID_{50} más pequeños. A partir del tercer traspaso de los cultivos, en el día 11, se manifestó en todos los cultivos una inmunofluorescencia específica muy intensa, con comienzo de destrucción celular, que después siguió creciendo hasta que en el curso del quinto traspaso, en el día 18, una gran parte de las células habían sido totalmente destruidas, por lo que se finalizó la infección. El contenido de virus específico aumentó continuamente hasta el día 14, y después volvió a disminuir a causa de la creciente destrucción celular. En la tabla siguiente se resumen los resultados de este curso de la infección, y muestran que - en comparación con la conocida lenta multiplicación vírica del virus de la rabia - es de esperar una multiplicación vírica muy rápida sin adaptación en estas células, aunque continuando la multiplicación de las células se pueden recolectar de manera repetida buenos rendimientos de antígeno, y a intervalos regulares.
TABLA 5 Multiplicación de virus de la rabia en cultivos MDCK 33016 con incremento continuo del volumen de cultivo
5
De manera similar se inoculó el mismo virus directamente en cultivos en suspensión según el Ejemplo 1, empleándose además una MOI de 0,0001. De nuevo se utilizó exclusivamente medio estándar para todo el curso de la infección, y asimismo se traspasaron dos veces por semana los cultivos, en proporción 1:8 o bien 1:10. Aquí el traspaso se realizó en cada caso sólo por simple dilución de las células en medio fresco y nueva siembra. El éxito de la infección se controló en este caso sólo mediante determinaciones del título de virus en células MRC-5 de la manera descrita más arriba. Con cada una de las tres MOIs, las infecciones proporcionaron ya al cabo de 4 días títulos positivos de virus en el sobrenadante del cultivo. Después de unas pérdidas de título iniciales, los títulos de virus crecieron de manera continua de traspaso a traspaso a partir del día 7, y ello a pesar de la dilución exponencial realizada cada vez, pero en estos cultivos en suspensión no condujeron a la destrucción masiva de las células. Se continuó la infección hasta el octavo traspaso (día 28 después de la infección), y después se interrumpió.
Se congelaron como virus de siembra muestras víricas de estas infecciones, y se utilizaron para una nueva infección de cultivos en suspensión, comenzando por 100 ml, y asimismo en medio estándar y en las mismas condiciones de traspaso antes descritas. En este caso la MOI se redujo a 0,000025. Se continuó la infección durante 6 traspasos de células (21 días). Con los títulos de virus que aumentaban lentamente a pesar de las masivas diluciones de traspaso se midieron al final de este curso de infección títulos de virus que equivalían aproximadamente a 0,3 dosis de vacuna por ml de sobrenadante. Si realmente se hubiera traspasado todo el volumen de cultivo y no en cada caso sólo una parte del mismo, al cabo de los 6 traspasos se habrían podido recolectar unos 500 litros de cultivo, y el rendimiento de virus habría correspondido en este caso a unas 150.000 dosis de vacuna.
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Ejemplo 19 Multiplicación de reovirus
Se infectaron con reovirus tipo 3 (obtenido de la razón social Bio Doc, Hannover) cultivos en suspensión de células MDCK 33016 en medio estándar, con una MOI de 0,01, y se continuaron incubando durante 3 o 5 días a 33ºC o a 37ºC. Se tomaron muestras del sobrenadante de cultivo tras 5 y 7 días, y se determinó su título en el sistema tradicional, utilizando células BHK en medio MEM con 3% de FCS. La evaluación de las determinaciones de título se realizaron al cabo de 7 días.
Los rendimientos víricos de los cultivos en suspensión después de 5 días ascendieron, a la temperatura de 37ºC, a 10^{8,1} KID_{50}/ml, y a la temperatura de 33ºC, a 10^{8,0} KID_{50}/ml. Transcurridos 7 días, los títulos de las preparaciones a ambas temperaturas se situaron en 10^{8,0} KID_{50}/ml.
La misma cepa vírica se utilizó en medios químicamente definidos y medios exentos de proteína para infección en cultivos de MDCK-33016, de manera análoga al Ejemplo 12, con una MOI de 0,01. En los días 3, 7 y 10 después de la infección se extrajo respectivamente 22% del volumen de cultivo y se reemplazó por medio fresco. El día 7 se extrajo 50% del volumen de cultivo, comprendidas las células, y se reemplazó por medio nuevo. Con ello, en el curso de la infección se intercambió casi por completo el volumen total de cultivo, y gracias al relleno con medio se les dio a las células la oportunidad de seguir multiplicándose. El procedimiento utilizado correspondió en conjunto a un traspaso aproximadamente 1:2 del cultivo, debiendo ser eliminadas sólo las cantidades en exceso. El traspaso o dilución considerablemente superiores de los cultivos, que son posibles especialmente en la fase inicial, aquí no se aprovecharon por completo, ni mucho menos.
Se midieron los siguientes rendimientos de virus:
6

Claims (27)

1. Procedimiento para preparar un medicamento o agente de diagnóstico, que comprende pasos en los cuales
(a)
se infectan células MDCK con un virus;
(b)
después de la infección se cultivan las células MDCK en cultivo celular en condiciones que permiten una multiplicación de los virus y al mismo tiempo una multiplicación adicional deliberada, en al menos un factor de 2, de las células mediante un incremento del volumen total del cultivo,
en donde el virus está seleccionado del grupo consistente en virus de la meningoencefalitis primaveroestival europea (FMSE) y de las formas orientales (rusa u otras) relacionadas, virus de la encefalitis japonesa, virus del dengue, virus de la fiebre amarilla, virus de la rabia, virus de la hepatitis A, o rotavirus.
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2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se cultivan las células después de la infección en condiciones que originan una multiplicación de las células en un factor de al menos 5, preferiblemente al menos en un factor de 10.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque después de la infección se cultivan las células en cultivo celular durante al menos 7, 21 o 28 días, preferiblemente al menos 35 días.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque durante la multiplicación deliberada de los virus y de las células se añade al menos una vez medio fresco, concentrado de medio o componentes del medio, o bien se trasfiere al menos una parte de los virus y células a un recipiente de cultivo que contiene medio fresco, concentrado de medio o componentes del medio.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la adición del medio, del concentrado de medio o de los componentes del medio o bien la transferencia de las células y virus a otro recipiente de cultivo se repite al menos una vez.
6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la adición del medio, del concentrado de medio o de los componentes del medio o bien la transferencia de las células y los virus a otro recipiente de cultivo se repite varias veces.
7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se retira medio durante la multiplicación de los virus y las células.
8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque durante la multiplicación de los virus y de las células se retira medio de manera continua y se añade medio fresco, concentrado de medio o componentes del medio.
9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque las células se cultivan antes de la infección de manera adherente o como cultivo en suspensión.
10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque las células se cultivan después de la infección de manera adherente o como cultivo en suspensión.
11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque las células MDCK descienden de la línea celular MDCK-33016.
12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el medio está exento de suero.
13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el medio es un medio químicamente definido.
14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el medio está exento de proteína.
15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque la multiplicación de los virus y de las células se lleva a cabo en un sistema de perfusión.
16. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque la multiplicación de los virus y de las células se lleva a cabo en un sistema por lotes.
17. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque para la multiplicación de los virus y de las células se cultivan las células a una temperatura entre 30º-40ºC.
18. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque para la multiplicación de los virus se cultivan las células a una presión parcial de oxígeno entre 35%-60%.
19. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque el valor de pH del medio para la multiplicación de los virus se sitúa entre pH 6,8 y pH 7,8.
20. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque se introduce el virus en las células mediante infección con un valor m.o.i. entre 10^{-8} y 10.
21. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque se aíslan los virus o una proteína expresada por éstos a partir del sobrenadante de cultivo o de las células cosechadas.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, caracterizado porque se separa al menos una parte del medio de cultivo para el aislamiento de los virus o de la proteína de al menos una parte de las células.
23. Procedimiento según la reivindicación 22, caracterizado porque la separación se efectúa por medio de un filtro en profundidad o de un separador.
24. Procedimiento según una de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizado porque la purificación comprende una ultracentrifugación para concentrar.
25. Procedimiento según una de las reivindicaciones 21 a 24, caracterizado porque la purificación comprende una cromatografía.
26. Procedimiento según una de las reivindicaciones 21 a 25, caracterizado porque durante la purificación los virus son inactivados.
27. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque se mezclan los virus o la proteína aislados con un adyuvante, sustancia auxiliar, tampón, agente diluyente o excipiente farmacéutico adecuados.
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