ES2340885T3

ES2340885T3 - Hidrolisis enzimatica selectiva de esteres terc-butilicos c terminal de peptidos.

Info

Publication number: ES2340885T3
Application number: ES07703919T
Authority: ES
Inventors: Ivo Franci Eggen; Carmen G. Boeriu
Original assignee: Organon NV
Current assignee: Organon NV
Priority date: 2006-01-17
Filing date: 2007-01-16
Publication date: 2010-06-10
Anticipated expiration: 2027-01-16
Also published as: US20090093016A1; DK1979370T3; US20120231497A1; ATE461208T1; EP1979370A1; WO2007082890A1; BRPI0706400A2; DE602007005349D1; EP1979370B1

Abstract

Un proceso para la hidrólisis enzimática selectiva de ésteres terc-butílicos C terminales de sustratos peptídicos en la síntesis de péptidos, que comprende hidrolizar uno o más sustratos peptídicos que comprenden ésteres terc-butílicos C terminales usando la proteasa subtilisina en cualquier forma adecuada.

Description

Hidrólisis enzimática selectiva de ésteres terc-butílicos C terminal de péptidos.

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La invención se refiere a un proceso de hidrólisis enzimática selectiva de ésteres terc-butílicos C terminales de sustratos peptídicos en la síntesis de péptidos.

En la síntesis de péptidos la selección apropiada de grupos protectores es muy importante. En la síntesis química de péptidos, el alargamiento del péptido en crecimiento habitualmente ocurre en la dirección N terminal para evitar la ramecización de los aminoácidos constituyentes. Para permitir el alargamiento gradual del péptido en crecimiento en dirección N terminal, el grupo protector de la función amino N terminal es de una naturaleza temporal. Este grupo se escinde selectivamente del péptido en cada ciclo de una síntesis peptídica sin afectar a los grupos protectores semipermanentes en las cadenas laterales funcionales y el extremo C. Los grupos funcionales en las cadenas laterales de los aminoácidos constituyentes habitualmente están protegidos para evitar las reacciones secundarias.

En la síntesis química de péptidos, se puede seguir un enfoque completamente lineal o un enfoque convergente, es decir, un enfoque en el que el péptido final se ensambla a partir de fragmentos peptídicos protegidos. El último enfoque generalmente se prefiere para péptidos más largos, ya que los rendimientos globales son intrínsecamente más altos y se pueden preparar fragmentos paralelamente lo que da como resultado un tiempo de síntesis global más corto. En una síntesis convergente, todos los fragmentos excepto el fragmento C terminal se tienen que proteger en su extremo C con una función protectora que se puede escindir selectivamente. En el caso de síntesis peptídica en un soporte sólido, esta función habitualmente se proporciona por un asa en el propio soporte. Sin embargo, para la síntesis peptídica en una escala industrial se prefiere la síntesis en fase de solución por enzima de la síntesis en fase sólida. Particularmente se prefiere una síntesis de acuerdo con DioRaSSF^{1}®, un método en fase de solución que combina las ventajas de la fase sólida y el proceso en fase de solución clásico (documentos EP-A-1.291.356; US 6.864.357; Eggen I. et al., Org. Process Res. Dev. 2005, 9, 98-101; Eggen I. et al., J. Pept. Sci. 2005, 11.633-641).

El éster C terminal en una síntesis convergente debería ser estable en las condiciones del ensamblaje del péptido y más particularmente en las condiciones de desprotección del grupo protector N terminal temporal, que se repite en cada ciclo de una síntesis peptídica. Por otra parte, el grupo protector N terminal y los grupos protectores de las cadenas laterales necesitan permanecer sin afectarse cuando el éster en el extremo C se retira antes del propio acoplamiento de fragmento. Aunque se conoce una variedad de ésteres que se pueden usar para la protección del extremo C de los fragmentos peptídicos y están disponibles varias opciones para la desprotección química, ninguno de los métodos disponibles es generalmente aplicable. La mayoría de estos ésteres son de una naturaleza primaria, por ejemplo, ésteres metílicos, y por tanto, dan origen a formación de dicetopiperazina en la fase del dipéptido desprotegido. Adicionalmente, la introducción de la función éster con frecuencia requiere una activación relativamente fuerte de la función carboxílica que da como resultado la pérdida de la integridad enantiomérica del aminoácido esterificado. Finalmente, la función de éster con frecuencia se desbloquea en condiciones ácidas o básicas que conducen a modificaciones en el propio péptido. Basándose en su estabilidad elevada, su facilidad de introducción y su amplia disponibilidad comercial, se prefiere el éster terc-butílico si se puede conseguir la desprotección selectiva en presencia de grupos protectores de cadena lateral. Sin embargo, la desprotección química generalmente no es aplicable para este propósito.

Los métodos enzimáticos han ganado interés en la síntesis peptídica durante el último par de años. Las enzimas con frecuencia muestran selectividad química, de región y estereoselectividad elevada. Además, las enzimas habitualmente funcionan en condiciones muy suaves, a valores de pH neutros y a temperaturas de 20-50ºC. Por tanto, en tales condiciones, se pueden evitar las reacciones secundarias catalizadas por ácido o base.

En la técnica se conoce que algunos grupos protectores se pueden escindir por enzimas, que se pueden usar en el desbloqueo de péptidos. En particular se pueden aplicar ésteres, que se pueden hidrolizar mediante lipasas, esterasas y proteasas. Las lipasas y esterasas habitualmente se consideran más generalmente aplicables a química de grupos protectores en síntesis peptídica, ya que una desventaja de las proteasas es que las mismas también pueden hidrolizar los enlaces peptídicos (actividad endopeptidasa). Recientemente, se ha observado que determinadas lipasas y esterasas que portan el motivo de aminoácido GGG(A)X (donde G indica glicina y X cualquier aminoácido; en pocas enzimas una glicina se reemplaza por alanina, A) muestran remoción leve y selectiva de grupos protectores de éster terc-butílico en derivados de aminoácidos y compuestos relacionados. Se concluyó que en particular dos enzimas, BsubpNBE (p-nitrobenzil esterasa recombinante de Bacillus subtilis producida en E. coli) y CAL-A (lipasa A de Candida antarctica (Novozymes)) se pueden usar en química orgánica sintética para escindir ésteres terc-butílicos a partir de diversos sustratos (Schmidt M. et al., J. Org. Chem. 2005, 70, 3737-3740). Sin embargo, las actividades de esas enzimas no se han ensayado en ésteres terc-butílicos C terminales de péptidos, con la excepción de un dipéptido que no mostró ninguna actividad. La solubilidad de péptidos protegidos probablemente comportará un problema en los sistemas de disolvente que se han aplicado para ensayar las actividades enzimáticas, que usan en particular tolueno, n-hexano y éter dietílico como co-disolventes. Sin embargo, en general, los péptidos protegidos y especialmente los péptidos protegidos largos requieren disolventes orgánicos polares para disolverse (por ejemplo, DMF, NMP, diclorometano, metanol o acetonitrilo).

A pesar del hecho de que las proteasas son menos preferidas, el uso de una proteasa denominada termitasa se dice que ha dado como resultado la hidrólisis eficaz de ésteres peptídicos (Schultz M. et al., Synlett. 1992, 1,37-38). Sin embargo, la termitasa no ha encontrado un uso amplio en la síntesis peptídica desde el momento en el que se ha indicado esto. Entre otras razones, esto se puede deber a su disponibilidad comercial limitada (código de familia EC 3.4.21.66), que impide gravemente el cambio de escala a una escala industrial. Por tanto, todavía existe una necesidad de procesos enzimáticos aplicables de forma general para la remoción de ésteres C terminales, en particular, ésteres terc-butílicos, en química peptídica, especialmente para procesos a escala industrial.

Además, como una alternativa a la síntesis química de péptidos, existe un interés creciente en la síntesis enzimática de péptidos, en la que las etapas tanto de acoplamiento como de desprotección pueden estar mediadas por enzimas específicas. Debido a que las etapas de acoplamiento mediadas por enzimas no suscitan ramecización a diferencia de la alternativa química, el alargamiento del péptido en crecimiento en síntesis enzimática de péptidos puede ocurrir en dirección C terminal. Una síntesis de este tipo es, en efecto, una síntesis convergente en la que el fragmento C terminal se reemplaza por un derivado de aminoácido; por lo tanto, sería igualmente de beneficio a partir de la disponibilidad de procesos enzimáticos aplicables generalmente para la remoción de ésteres C terminales, en particular ésteres terc-butílicos.

Finalmente, la disponibilidad de procesos aplicables de forma general para la remoción de ésteres C terminales, en particular ésteres terc-butílicos, sería muy provechosa en la síntesis peptídica que comprende ciclaciones peptídicas que implican el extremo C del precursor lineal (es decir, ciclaciones de cabeza a cola y de cola a cadena lateral). Tales ciclaciones pueden tener lugar en solución, pero también en un soporte sólido cuando el precursor lineal está anclado a través de su extremo N o una cadena lateral.

Ahora se ha encontrado un nuevo proceso para la hidrólisis enzimática selectiva de ésteres terc-butílicos C terminales de sustratos peptídicos en la síntesis de péptidos, que comprende hidrolizar uno o más sustratos peptídicos que comprenden ésteres terc-butílicos C terminales que usan la proteasa subtilisina en cualquier forma adecuada.

De forma sorprendente, se ha observado que se pueden obtener rendimientos altos, hasta cuantitativos, del producto hidrolizado usando la proteasa subtilisina, mientras la actividad endopeptidasa está sustancialmente suprimida.

El proceso nuevo de esta invención se puede usar convenientemente en la producción de péptidos protegidos o no protegidos. El proceso es en particular favorable en síntesis convergente de péptidos.

Preferiblemente, el éster terc-butílico C terminal de los sustratos peptídicos comprende un resto acilo C terminal que es un resto \alpha-amino acilo de origen natural o sintético. El resto \alpha-amino acilo C terminal puede estar protegido o no protegido en la cadena lateral. Los restos \alpha-amino C terminales seleccionados entre Ala, Cys protegida, Asp protegida, Glu protegida, Phe, Gly, His, Lys (protegida), Leu, Met, Asn, Gln (protegida), Arg (protegida), Ser (protegida), Thr, Val, Trp (protegida) y Tyr (protegida) son particularmente preferidos, en los que los paréntesis alrededor de la palabra "protegida" significan que el resto puede estar presente en forma de cadena lateral tanto protegida como no protegida. En este caso se usa el código de tres letras de aminoácidos de acuerdo con la nomenclatura IUPAC (IUPAC-IUB Commission (1985) J. Biol. Chem. 260, 14-42).

Preferiblemente, los sustratos peptídicos protegidos o no protegidos usados en el proceso de esta invención se preparan mediante síntesis en fase de solución. En una realización adicional preferida, los sustratos peptídicos protegidos o no protegidos usados en el proceso de esta invención se preparan de acuerdo con DioRaSSP®. Por tanto, un sustrato peptídico que comprende un éster terc-butílico C terminal preferiblemente se prepara de acuerdo con este proceso para síntesis en solución rápida de un péptido en un disolvente orgánico o una mezcla de disolventes orgánicos, comprendiendo el proceso los ciclos repetitivos de las etapas (a)-(d):

(a): una etapa de acoplamiento, que usa un exceso de un componente carboxílico activado para acilar un componente amino,

(b): una etapa de inactivación en la que se usa un eliminador para retirar funciones carboxílicas activadas residuales, en la que el eliminador también se puede usar para la desprotección del péptido en crecimiento,

(c): una o más extracciones acuosas y

opcionalmente, (d) una etapa de desprotección separada, seguida por una o más extracciones acuosas,

por lo que en al menos un ciclo en la etapa b del proceso una amina que comprende un anión libre o un anión latente se usa como un eliminador de funciones carboxílicas activadas residuales. La amina preferiblemente es bencil \beta-alaninato o una sal de la misma.

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La hidrólisis del proceso de la presente invención se puede realizar en un tampón acuoso. Sin embargo, con propósitos de solubilidad y/o para suprimir la actividad endopeptidasa, la hidrólisis del proceso de la invención preferiblemente se realiza en una mezcla de un tampón acuoso y uno o más disolventes orgánicos. Los tampones adecuados se pueden seleccionar entre tampones que se usan generalmente para transformaciones que usan enzimas proteolíticas. En particular, el tampón acuoso es un tampón fosfato, borato o TRIS. Los disolventes orgánicos polares son preferidos, y en particular el disolvente orgánico se selecciona entre N,N-dimetilformamida (DMF), N,N-metil-2-pirrolidona (NMP), dioxano, N,N-dimetilacetamida (DMA), diclorometano (DCM), tetrahidrofurano (TF), acetonitrilo y terc-butanol. Particularmente preferido es DMF. Por consiguiente, el porcentaje del disolvente orgánico en la mezcla puede variar del 0 al 60% (v/v), preferiblemente del 30 al 60% (v/v). Es especialmente útil cuando el porcentaje del disolvente orgánico en la mezcla es de aproximadamente el 50-60% (v/v).

El pH al que se realiza la reacción se puede seleccionar entre el intervalo de 6,5-10, en particular 6,5-8 y preferiblemente el pH es 7.

Las temperaturas de reacción para la hidrólisis se pueden seleccionar adecuadamente en el intervalo de 20-60ºC. Se prefiere una temperatura de reacción de 40ºC.

La cantidad de enzima se puede seleccionar adecuadamente en el intervalo del 1 al 50% p de enzima con relación al sustrato peptídico. En una realización adicional de la invención, la hidrólisis se realiza gradualmente añadiendo porciones de la proteasa subtilisina (en cualquier forma adecuada) a la mezcla de reacción que comprende uno o más sustratos peptídicos que comprenden ésteres terc-butílicos C terminales.

Los sustratos peptídicos de los cuales se hidrolizan los ésteres terc-butílicos C terminales en el proceso de la invención, pueden llevar grupos protectores en otras partes de su secuencia peptídica.

La hidrólisis se puede realizar con un sustrato peptídico así como una mezcla del mismo. Se ha establecido que el rendimiento de la hidrólisis de una mezcla de sustratos peptídicos que comprende ésteres terc-butílicos C terminales no está significativamente reducido por la presencia de más de un sustrato peptídico.

Un proceso adecuado de acuerdo con la presente invención es el siguiente.

A una solución agitada de un éster terc-butílico de un péptido en una mezcla de un disolvente orgánico adecuado (o mezcla de disolventes orgánicos) y un tampón, se añade subtilisina [por ejemplo: a 0,1 mmol de un éster terc-butílico de un péptido en una mezcla de 2,5 ml de DMF y 2,5 ml de tampón fosfato de sodio (0,1 M, pH 7,0, 40ºC), se añaden 5 mg de subtilisina]. Cuando la conversión de sustrato ha alcanzado un nivel deseado, por ejemplo mayor del 95% (determinado por HPLC), se añade una cantidad de acetato de etilo. Después de la separación de la fase acuosa, la fase orgánica se extrae dos veces con solución de cloruro de sodio y se concentra en vacío. El péptido o fragmento peptídico desprotegido en el extremo C se aísla por precipitación con un no disolvente como éter dietílico, éter terc-butílico de metilo o heptano. En caso de una enzima inmovilizada, la enzima se retira mediante filtración antes del procedimiento de tratamiento descrito.

La proteasa subtilisina (EC 3.4.21.62) se puede usar en el proceso de la invención en cualquier forma, por tanto, la misma se puede usar en forma soluble y/o cristalizada, pero también en forma inmovilizada u otra forma insoluble, por ejemplo, en la forma de agregados de enzima reticulados (CLEA) o cristales de enzima reticulados (CLEC).

El término "sustrato" en este documento se refiere a una entidad que se convierte en un producto mediante la proteasa subtilisina en cualquier forma. Este producto puede ser un producto peptídico final por lo que si estuvieran presentes sólo los grupos laterales protegidos todavía tendrían que desprotegerse. Como alternativa, este producto también puede ser un fragmento peptídico que posteriormente se somete a reacción con otros fragmentos peptídicos en una síntesis convergente para obtener un péptido más largo con el número final necesario de aminoácidos.

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Un experto en la materia puede identificar fácilmente sustratos adecuados, por ejemplo, realizando una hidrólisis de ensayo sencilla de un péptido seleccionado que comprende una funcionalidad de éster terc-butílico C terminal en condiciones adecuadas como se ha descrito en este documento anteriormente y a continuación conversión, por ejemplo, mediante técnicas de HPLC. Se ha encontrado por hidrólisis de dipéptidos modelo de la estructura general Z-Val-X-OBu^{t} en presencia de Alcalasa CLEA y DMF al 50% v/v (véase el Ejemplo 3 para más detalles) que la reactividad para estos sustratos modelo que comprenden una funcionalidad de éster terc-butílico C terminal se puede dividir en cuatro categorías:

1

Si se indica que la reactividad es "insensible", también después de la optimización, el péptido seleccionado no es un sustrato de acuerdo con la invención.

Basándose en la estructura de estos sustratos peptídicos modelo los resultados se consideran indicativos de la reactividad del derivado de aminoácido seleccionado X hacia la proteasa subtilisina en cualquier forma adecuada. Esto se comprueba mediante el Ejemplo 5 en el que se ha ensayado qué combinaciones de aminoácidos son susceptibles de actividad endopeptidasa de la proteasa subtilisina. Más particularmente, los sustratos de tretapéptido modelo de la estructura general Z-Val-Val-X-Leu-OBu^{t} se hidrolizaron en presencia de Alcalasa CLEA y DMF al 50% v/v (véase el Ejemplo 5 para más detalles). Además, el Ejemplo 5 demuestra que la actividad esterasa en relación con el derivado de aminoácido X es indicativa de la actividad endopeptidasa en relación con ese derivado de aminoácido X. Sin embargo, se enfatiza que en condiciones optimizadas del proceso de la presente invención la actividad endopeptidasa es significativamente más baja que la actividad esterasa.

Se ha establecido que el proceso es muy adecuado para preparar péptidos cortos, tales como dipéptidos, tripéptidos y tetrapéptidos. Además, basándose en los argumentos mencionados anteriormente en base a los Ejemplos 3 y 5 un experto también es capaz de preparar péptidos más largos que comprenden derivados de aminoácidos que se espera que tengan reactividad mala o mediocre en cualquier posición del péptido excepto el extremo C. En este sentido, los derivados de D-aminoácidos se pueden considerar derivados de aminoácido insensibles y, por tanto se pueden preparar péptidos también con D-aminoácidos en cualquier posición excepto el extremo C.

El término "protegido" se refiere a que los grupos funcionales (dentro del péptido) están protegidos con grupos protectores adecuados. Un experto en la materia sabrá qué tipo de protección seleccionar para qué tipo de grupo funcional. Por ejemplo, las funciones amina presentes en los compuestos se pueden proteger durante el procedimiento sintético mediante un grupo N-protector, que se refiere a un grupo usado comúnmente en la química peptídica para la protección de un grupo a-amino, como el grupo ter-c-butiloxicarbonilo (Boc), el grupo benciloxicarbonilo (Z) o el grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). Se proporcionan visiones de conjunto de grupos protectores amino y métodos para su remoción en: Geiger R. y Konig W. (1981) en Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol 3, Gross E. y Meienhofer, J., eds, Academic Press, New York, págs. 1-99, y Peptides: Chemistry and Biology, Sewald N. y Jakubke H.-D., eds, Wiley-VCH, Weinheim, 2002, págs. 143-154. Las funciones del tipo terc-butílico o funciones de inestabilidad similar se prefieren para la protección de otros grupos funcionales en las cadenas laterales; éstas incluyen, pero sin limitación, terc-butilo (But^{t}) para la protección de las cadenas laterales de Asp, Glu, Ser, Thr y Tyr, terc-butoxicarbonilo (Boc) para la protección de las cadenas laterales de Lys y Trp, tritilo (Trt) para la protección de las cadenas laterales de Asn, Gln y His y 2,2,5,7-8-pentametilcromano-6-sulfonilo (Pmc) o 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofurano-5-sulfonilo (Pbf) para la protección de la cadena lateral de Arg [Barany, G. y Merrifield, R.B. (1980) en: "The Peptides", vol. 2 (Gross, E. y Meienhofer, J., eds.) Academic Press, New York, págs. 1-284; para Trp(Boc): Franzen, H. et al. (1984) J. Chem. Soc, Chem. Commun., 1699-1700; para Asn(Trt) y Gin (Trt): Sieber, P. y Riniker, B. (1991) Tetrahedron Lett. 32, 739-742; para His(Trt): Sieber, P. y Riniker, B. (1987) Tetrahedron Lett. 28, 6031-6034; para Pmc: Ramage, R. y Green, J. (1987) Tetrahedron Lett. 28, 2287-2290; para Pbf: Carpino, L.A. et al. (1993) Tetrahedron Lett. 34, 7829-7832].

La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.

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Ejemplos

El tetrapéptido del Ejemplo 2 y el tetrapéptido del Ejemplo 5 donde X=Met se han preparado de acuerdo con DioRaSSP® (documentos EP-A-1.291.356; US 6.864.357; Org. Process Res. Dev. 2005, 9, 98-101; Eggen I. et al., J. Pept. Sci. 2005, 11, 633-641), mientras que los dipéptidos, tripéptidos y el tetrapéptido del Ejemplo 5 donde X=Arg se han producido de acuerdo con métodos en fase de solución convencionales para síntesis peptídica. Los otros tetrapéptidos del Ejemplo 5 se preparan de acuerdo con métodos en fase de solución convencionales aplicando un protocolo de separación y mezcla. El protocolo de separación y mezcla se ha aplicado para reducir la cantidad de trabajo de preparación.

La enzima libre subtilisina A (S. Carlsberg) usada en el Ejemplo 1 se adquirió en Sigma Aldrich. La enzima libre subtilisina A usada en los otros Ejemplos se adquirió en Novozymes. La Alcalasa CLEA se obtuvo en CLEA Technologies B.V., Delft, Países Bajos.

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Ejemplo 1 Subtilisina Libre Procedimiento general de Subtilisina A

0,1 mmol de cada uno de los péptidos se disolvió en una mezcla de temperatura controlada por termostato de 2,5 ml de DMF y 2,5 ml de tampón fosfato 0,1 M pH 7. Se añadieron 5 mg de enzima a la solución peptídica. La mezcla de reacción se incubó a 40ºC durante un total de dos horas. Las mezclas de reacción se analizaron después de 2 horas usando HPLC.

(Algunos resultados seleccionados de buenos sustratos de subtilisina se muestran)

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TABLA 1

2

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Ejemplo 2

0,05 mmol de Boc-Gly-Phe-Phe-Leu-OBu^{t} se disolvieron en una mezcla con temperatura controlada por termostato de 2,5 ml de NMP y 2,5 ml de tampón fosfato 0,1 M pH 8. A esta solución se añadieron 5 mg de Alcalasa CLEA. La mezcla de reacción se incubó a 40ºC durante un total de 17 horas. La conversión de sustrato se determina mediante HPLC. La reacción dio como resultado después de 17 h un rendimiento >95% de Boc-Gly-Phe-Phe-Leu-OH.

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Ejemplo 3 Desprotección de dipéptidos modelo mediante Alcalasa CLEA y subtilisina A Procedimiento general de Subtilisina A

0,1 mmol de cada uno de los péptidos se disolvieron en 2,5 ml de DMF. 5 mg de enzima se disolvieron en 2,5 ml de tampón fosfato 0,1 M pH 7 y se añadieron a la solución peptídica. La mezcla de reacción se incubó a 40ºC durante un total de seis horas. Las mezclas de reacción se analizaron después de 6 horas usando HPLC y LC/MS.

Procedimiento general de Alcalasa CLEA

0,1 mmol de cada uno de los péptidos se disolvieron en 2,5 ml de DMF. A esta solución se añadieron 5 mg de enzima junto con 2,5 ml de tampón fosfato 0,1 M pH 7. La mezcla de reacción se incubó a 40ºC durante un total de seis horas. Las mezclas de reacción se analizaron después de 6 horas usando HPLC y LC/MS.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2

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Ejemplo 4 Optimización de la cantidad de enzima para un sustrato peptídico bueno y uno mediocre Procedimiento general

0,1 mmol de cada uno de los péptidos se disolvieron en 2,5 ml de DMF. Subtilisina A se disolvió en 2,5 ml de tampón fosfato 0,1 M pH 7 y se añadió a la solución peptídica. La mezcla de reacción se incubó a 40ºC. Las mezclas de reacción se muestrearon en los tiempos de reacción indicados y se analizaron mediante HPLC. Cuando fueron necesarias, se añadieron porciones adicionales de enzima en intervalos de 2 horas.

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TABLA 3

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Ejemplo 5 Identificación de sustratos peptídicos sensibles a escisión endopeptídica Procedimiento general de Alcalasa CLEA

0,1 mmol de cada uno de los tetrapéptidos (o mezclas de tetrapéptidos) se disolvieron en 2,5 ml de DMF. A esta solución se añadieron 5 mg de enzima junto con 2,5 ml de tampón fosfato 0,1 M pH 7 y se añadieron a la solución anterior. La mezcla de reacción se incubó a 40ºC. Las mezclas de reacción se analizaron después de 2 horas y 6 horas mediante HPLC. En el caso de que la reacción no hubiera alcanzado la finalización se añadieron porciones adicionales de enzima [5 mg cada una] al final de seis horas y durante una noche (aproximadamente 24 horas de reacción). La última alícuota se analizó mediante LC/MS para verificar la presencia del compuesto deseado y cualquier impureza que fuera Z-Val-Val-X-OH y/o H-X-Leu-OH.

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TABLA 4

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Ejemplo 6 Aumento de escala del procedimiento

A una solución agitada de 606 mg (1 mmol) de Z-Val-Trp-Leu-OBu^{t} en 25 ml de DMF, se añadieron 25 mg de Alcalasa CLEA junto con 25 ml de tampón fosfato 0,1 M pH 7. La mezcla se agitó a 40ºC. El avance de la reacción se supervisó mediante HPLC. Se añadieron porciones adicionales de enzima (25 mg de Alcalasa CLEA cada una) después de 24 horas y después de 48 horas. Después de 6 días la reacción se detuvo. La mezcla de reacción se acidificó a pH 2 y se evaporó el DMF. El producto se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se secó usando sulfato de sodio, se concentró en vacío y el producto final se precipitó a partir de heptano. No se identificaron impurezas relacionadas con endopeptidasa durante el análisis del compuesto final tanto por HPLC como LC/MS.

Producción: 96,2%

Pureza de HPLC: 96,5% a/a (del compuesto final también contenía 2,5% a/a del material de partida).

Claims

1. Un proceso para la hidrólisis enzimática selectiva de ésteres terc-butílicos C terminales de sustratos peptídicos en la síntesis de péptidos, que comprende hidrolizar uno o más sustratos peptídicos que comprenden ésteres terc-butílicos C terminales usando la proteasa subtilisina en cualquier forma adecuada.

2. El proceso de la reivindicación 1, en el que el sustrato peptídico que comprende el éster terc-butílico C terminal comprende un resto acilo C terminal que es un resto \alpha-amino acilo de origen natural o sintético.

3. El proceso de la reivindicación 2, en el que el resto \alpha-amino acilo se selecciona entre Ala, Cys protegida, Asp protegida, Glu protegida, Phe, Gly, His, Lys (protegida), Leu, Met, Asn, Gln, Arg (protegida), Ser (protegida), Thr, Val, Trp (protegida) y Tyr (protegida).

4. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el sustrato peptídico es un di-, tri- o tetrapéptido.

5. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el sustrato peptídico se prepara mediante síntesis en fase de solución.

6. El proceso de la reivindicación 5, en el que el sustrato peptídico se prepara de acuerdo con un proceso para síntesis en solución rápida de un péptido en un disolvente orgánico o una mezcla de disolventes orgánicos, comprendiendo el proceso ciclos repetitivos de las etapas (a)-(d):

a): una etapa de acoplamiento, que usa un exceso de un componente carboxílico activado para acilar un componente amino,

b): una etapa de inactivación en la que se usa un eliminador para retirar funciones carboxílicas activadas residuales, en la que el eliminador también se puede usar para la desprotección del péptido en crecimiento,

c): una o más extracciones acuosas y

por lo que en al menos un ciclo en la etapa b del proceso una amina que comprende un anión libre o un anión latente se usa como un eliminador de funciones carboxílicas activadas residuales.

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7. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la proteasa subtilisina es de la familia EC 3.4.21.62.

8. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la proteasa subtilisina es subtilisina libre.

9. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la proteasa subtilisina es subtilisina de agregado de enzima reticulado (CLEA).

10. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la hidrólisis se realiza en una mezcla de un tampón acuoso y un disolvente orgánico.

11. El proceso de la reivindicación 10, en el que el disolvente orgánico es un disolvente polar.

12. El proceso de la reivindicación 11, en el que el disolvente orgánico se selecciona entre N,N-dimetilformamida (DMF), N-metil-2-pirrolidona (NMP), dioxano, N,N-dimetilacetamida (DMA), diclorometano (DCM), tetrahidrofurano (THF), acetonitrilo y terc-butanol.

13. El proceso de la reivindicación 12, en el que el disolvente orgánico es DMF.

14. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que el porcentaje del disolvente orgánico en la mezcla es del 50-60%.

15. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el pH al que se realiza la reacción se selecciona entre el intervalo de 6,5-10.

16. El proceso de la reivindicación 15, en el que el pH se selecciona entre intervalo de 6,5-8.

17. El proceso de la reivindicación 16, en el que el pH es 7.

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18. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en el que la temperatura de reacción para la hidrólisis es 20-60ºC.

19. El proceso de la reivindicación 18, en el que la temperatura de reacción para la hidrólisis es 40ºC.

20. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-19, en el que la cantidad de enzima varía del 1 al 50% p con relación al sustrato peptídico.

21. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-20, en el que la hidrólisis se realiza gradualmente añadiendo porciones de la proteasa subtilisina en la mezcla de reacción que comprende uno o más sustratos peptídicos que comprenden ésteres terc-butílicos C terminales.

22. Un proceso para la síntesis convergente de un péptido a partir de dos o más fragmentos peptídicos en el que al menos uno de los fragmentos peptídicos se prepara de acuerdo con un proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.

23. Un proceso para la síntesis enzimática gradual de un péptido en dirección C terminal de acuerdo con un proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.

24. Un proceso de síntesis peptídica que comprende ciclación peptídica que implica el extremo C del precursor lineal de acuerdo con un proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.