JP4856184B2 - オリゴペプチドアミドからオリゴペプチドアルキルエステルへの酵素転化 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

本発明は、任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端アルキルエステルの調製方法に関する。また本発明は、オリゴペプチドの調製方法にも関する。

オリゴペプチドは、例えば、医薬品、食品または飼料成分もしくは農薬として多くの用途を有する。

本発明のために、ペプチドは２つ以上のアミノ酸の鎖を意味する。本発明のために、オリゴペプチドは２〜１００のアミノ酸の直鎖を意味する。

酵素カップリング反応によってペプチド結合が形成されるオリゴペプチド合成として本発明のために定義される酵素オリゴペプチド合成は、化学的なオリゴペプチド合成よりも優れたいくつかの利点を有する。例えば、アミノ酸側鎖の保護が全くまたは少ししか必要とされないという事実のために大規模製造の場合の費用−価格が低い。また、追加の活性化剤が必要とされず、そしてより少量の有機溶媒が必要とされるので、該方法は環境にあまり悪くない。さらに、酵素触媒されたカップリングはラセミ化が起こらず（「ペプチド：化学および生物学」、第１版再版、ウィリー−ＶＣＨ出版社（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ）、ワインハイム ２００２年、４．６．２セクション、２５０頁において、Ｎ．セワルド（Ｓｅｗａｌｄ）およびＨ．−Ｄ．ヤクブケ（Ｊａｋｕｂｋｅ）による）、より純粋な生成物および／またはより簡単な単離が導かれる。

酵素カップリング法に関して、ペプチド結合を生じるために２つの選択肢がある。いわゆる熱力学的な（または平衡制御された）アプローチでは、カルボキシ成分は遊離カルボン酸官能性を有するが、動力学的に制御されたアプローチでは、好ましくはアルキルエステルの形態、例えばメチルエステルの形態の活性化されたカルボキシ成分が使用される。熱力学的アプローチは、ｉ）通常、ペプチド結合の切断側に平衡があるのでカップリングの歩留まりが低い、ｉｉ）通常、大量の酵素が必要とされる、ｉｉｉ）通常、反応速度が非常に遅いという３つの主な不都合を有する。動力学的に制御されたアプローチでは、出発材料としてアルキルエステルが必要とされるが、遥かに少ない酵素が必要とされ、反応時間が著しく短く、そして何よりも、得られる最大歩留まりが通常かなり高い。従って、産業用途のためには、動力学的アプローチに基づく酵素オリゴペプチド合成の概念、すなわち活性化されたカルボキシ成分用いることが、最も魅力的である（「ペプチド：化学および生物学」、第１版再版、ウィリー−ＶＣＨ出版社、ワインハイム ２００２年、４．６．２セクションにおいて、Ｎ．セワルド（Ｓｅｗａｌｄ）およびＨ．−Ｄ．ヤクブケ（Ｊａｋｕｂｋｅ）による）。

酵素ペプチド結合合成は、Ｃ→Ｎ末端方向またはＮ→Ｃ末端方向に実施することができる。

Ｃ→Ｎ末端方向の酵素オリゴペプチド合成の一例は、スキーム１において提供される。スキーム１はトリペプチドを得るための一例として使用され、決して本発明を制限することは意図されない。

スキーム１において、ＰはＮ−末端保護基を表す。Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３はアミノ酸側鎖を表す。スキーム１によって示されるように、Ｃ→Ｎ末端方向の酵素合成は、式ＩＩのＣ−保護されたアミノ酸の式ＩａのＮ−保護されたアミノ酸への酵素カップリングから開始され、後者は、この場合にはメチルエステルによってＣ−活性化されている。形成された式ＩＩＩのジペプチドは次にＮ−脱保護され、そして得られた式ＩＶの遊離アミノ官能基を有するジペプチドは、次に、式Ｉｂの別のＮ−保護された（そしてＣ−活性化された）アミノ酸構成要素へ酵素的にカップリングされて、式Ｖのトリペプチドの形成がもたらされ得る。このＮ−脱保護およびカップリングサイクルは、所望のオリゴペプチド配列が得られるまで繰り返すことができ、その後Ｎ−およびＣ−保護基が除去されて、所望の（無保護の）オリゴペプチドが得られる。また、式ＩａのＮ−保護されたアミノ酸を、式ＩＩのＣ−末端保護されたアミノ酸の代わりにＣ−末端保護されたオリゴペプチドとカップリングさせることも可能である。

Ｃ→Ｎ方向のオリゴペプチドの合成の主な欠点は、各サイクルの後にＮ−保護基が除去されて、さらなるＮ−保護アミノ酸残基の付加が可能になることである。アミノ酸（エステル）における（高価な）Ｎ−保護基の導入と、ペプチドカップリング後のこの同じ（高価な）Ｎ−保護基の除去および（通常は）廃棄とによって、Ｃ→Ｎ方向のオリゴペプチドの合成は、実用的および経済的な観点から魅力的でないとされる。

Ｎ→Ｃ末端方向の酵素オリゴペプチド合成の一例は、スキーム２において提供される。スキーム２はトリペプチドを得るための一例として使用され、決して本発明を制限することは意図されない。

スキーム２において、ＰはＮ−末端保護基を表す。Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３はアミノ酸側鎖を表す。スキーム２に示されるように、Ｎ→Ｃ末端方向の酵素合成も、式ＩＩａのＣ−保護されたアミノ酸と式ＩのＮ−保護されたアミノ酸との酵素カップリングから開始され、後者の化合物は、この場合にはメチルエステルによってＣ−活性化されている。形成された式ＩＩＩのジペプチドは次にＣ−脱保護され得る。得られた式ＶＩの遊離カルボン酸官能基を有するジペプチドは、次に、「再活性化」されて、式ＶＩＩのＮ−保護されたオリゴペプチドアルキルエステル（スキーム２の場合には、メチルエステル）が形成される。このエステル化は通常、アルコール（例えば、メタノール）および硫酸または塩化チオニルなどの試薬を用いる化学変化によって実行される。続いて、式ＶＩＩのＮ−保護されたオリゴペプチドアルキルエステルは、式ＩＩｂの別のＣ−保護アミノ酸とカップリングされて、式ＶＩＩＩのトリペプチドの形成がもたらされ得る。このＣ−脱保護およびカップリングサイクルは、所望のアミノ酸配列が得られるまで繰り返すことができ、その後Ｎ−およびＣ−保護基が除去されて、所望の（無保護の）オリゴペプチドが得られる。また、式ＩのＮ−保護されたアミノ酸を、式ＩＩａのＣ−末端保護されたアミノ酸の代わりにＣ−末端保護されたオリゴペプチドとカップリングさせることも可能である。

Ｎ→Ｃ方向のオリゴペプチドの合成は、（高価な）Ｎ−保護基の繰り返される付加および除去を必要としない。しかしながら、さらなるアミノ酸残基の付加を可能にするために２つの反応ステップが必要であり、Ｃ−末端部は脱保護される必要があり、その後、例えば、形成されたカルボン酸基のエステル化によって活性化されなければならない。従って、Ｎ→Ｃ方向のオリゴペプチド合成の場合、Ｎ−保護されたオリゴペプチドに１つのアミノ酸残基を付加するために全部で３つの反応ステップ（脱保護、活性化およびカップリング）が必要とされる。

Ｎ→Ｃ方向のオリゴペプチドの合成のために適切なＣ−保護基は当業者に知られている。適切なＣ−保護基の一例としてはｔｅｒｔ−ブチルがあり、これは、例えば、強酸性の非水性条件（例えば、トリフルオロ酢酸による）を用いて切断することができる。Ｃ−末端保護基（スキーム２では、Ｘ＝ＮＨ_２）としてカルボキシアミドを使用することは有利である。保護基としてカルボキシアミドを用いると、式ＩＩａのアミノ酸構成要素は、例えば、アミノ酸のメチルエステル化の後、アンモニアによるアミド化を１ポット法で行うことによって調製することができ、この調製は簡単で費用効果的である。強鉱酸の水溶液を用いる従来の手段によるカルボキシアミドの切断は、ペプチド結合の同時的な部分切断を引き起こす。しかしながら、ペプチド結合を切断することなくオリゴペプチドのカルボキシアミド保護されたＣ−末端部の選択的な脱保護を酵素的に行うことができる。ＥＰ０４５６１３８号明細書およびＥＰ０７５９０６６号明細書は、それぞれ、オレンジのフラベド（「ＰＡＦ」と呼ばれる）から、またはキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）（ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ））マルトフィリア（ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）（「ＰＡＭ」と呼ばれる）からのペプチドアミダーゼを用いる酵素的な方法を開示しており、Ｎ−（無）保護ジペプチドＣ−末端カルボキシアミドのカルボキシアミド基が加水分解されて、対応するＣ−末端カルボン酸が形成され、これによりジペプチドのペプチド結合はそのまま残される。

しかしながら、ＥＰ０４５６１３８号明細書およびＥＰ０７５９０６６号明細書に記載されるような方法の不都合は、アミノ酸によるオリゴペプチド鎖のさらなる伸長ごとに、形成された対応するカルボン酸の別個のエステル化（カルボン酸基を活性化するため）が必要とされることである。もう１つの不都合は、硫酸または塩化チオニルなどの試薬を用いるカルボン酸のこのエステル化は本質的に非水性条件を必要とするが、Ｃ−末端カルボキシアミドの酵素脱保護反応は水溶液中で実施されることである。従って、多大な抽出および乾燥操作が必要とされる。

従って、本発明の目的は、任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドのカルボキシアミド基をアルキルエステル官能基に活性化するためのより容易な方法を提供することであり、これは次に、ペプチドカップリング反応において使用することができる。

この目的は、任意でＮ−保護されたオリゴペプチドアルキルエステルを、対応する任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドから直接得ることができる方法によって達成される。

従って、第１の態様では、本発明は、任意でＮ−保護されたオリゴペプチドアルキルエステルの調製方法であって、ｂ）ペプチドアミダーゼの存在下で、対応する任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドをアルキルアルコールと反応させるステップを含む方法に関する。従って、本発明の方法は、Ｎ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドのカルボキシアミド基をアルキルエステル官能基に活性化するための一段階の方法を提供し、該方法は簡単で費用効果的である。

本発明は、驚くことに、このようなペプチドアミダーゼが任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドから任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端アルキルエステルへの直接転化を触媒できることを示す。これは、セロブスキ（Ｃｅｒｏｖｓｋｙ）、Ｖ．およびＭ．−Ｒ．クラ（Ｋｕｌａ）、１９９８年、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、１８８５−１８８７頁（ペプチドアミダーゼにはエステラーゼ活性が欠けていると書かれている）を考慮すると驚くべきことであり、つまり驚くことに、酵素がエステルを産生できることを意味する。

任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドは、本発明の説明全体を通してペプチドアミダーゼと呼ばれるペプチドアミダーゼ活性を示す酵素と反応させられる。ペプチドアミダーゼは、オリゴペプチドのペプチド結合の１つまたはいくつかを加水分解することなく任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドのＣ−末端カルボキシアミド基を加水分解するその能力について、例えば、ＥＰ０４５６１３８号明細書およびＥＰ０７５９０６６号明細書に記載されている。好ましくは、柑橘果実（のフラベド）から、より好ましくはオレンジ（のフラベド）からのペプチドアミダーゼが使用される。

ペプチドアミダーゼは任意の形態で使用することができる。例えば、ペプチドアミダーゼは、自然にまたは遺伝子改変によってペプチドアミダーゼ活性を有する細胞全体（任意で、透過処理および／または固定化される）において、あるいはこのような活性を有する細胞のライセートにおいて、粗酵素として、市販の酵素として、市販の調製物からさらに精製される酵素として、既知の精製方法の組み合わせによってその原料から得られる酵素として（例えば、分散液、エマルジョン、溶液または固定化型の形態で）使用することができる。

本発明に従う方法において、ペプチドアミダーゼ活性を有する天然に存在する（野生型）酵素の変異体の使用も可能であることは、当業者には明らかであろう。野生型酵素の変異体は、例えば、当業者に既知の変異誘発技法（ランダム変異誘発、部位特異的変異誘発、定向進化、遺伝子シャフリングなど）を用いて、ＤＮＡが野生型酵素とは少なくとも１つのアミノ酸だけ異なる酵素をコードするように、あるいはＤＮＡが野生型と比較してより短いまたはより長い酵素をコードするように野生型酵素をコードするＤＮＡを改変し、そして適切な（宿主）細胞においてこのように改変されたＤＮＡの発現をもたらすことによって作成され得る。ペプチドアミダーゼの変異体は、任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端アルキルエステルに対する選択性および／または活性および／または安定性および／または耐溶剤性および／またはｐＨプロファイルおよび／または温度プロファイルおよび／または基質プロファイルに関して改善された特性を有し得る。

ペプチドアミダーゼが純粋な形態で使用されない場合、好ましくは、ペプチド結合切断活性を有する他の酵素は、任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドの９９％よりも多くが転化されるときに１％以下、より好ましくは０．１％以下のペプチド結合が切断されるように除去される。好ましくは、酵素は純粋な形態、例えば市販されるような形態で使用される。

あるいは、ペプチドアミダーゼが純粋な形態で使用されない場合には、ペプチド結合切断活性を阻止する化合物を使用して、ペプチド結合の切断を防止することもできる。

本発明の方法では、ペプチドアミダーゼの加水分解活性（任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドから、対応するＣ−末端アルキルエステルの代わりに対応するＣ−末端カルボン酸への転化）は、好ましくは、できるだけ低く保たれる。このために、ペプチドアミダーゼとの反応は実質的に水を含有しない媒体中で行われる。当業者には、実質的に水を含有しないということは、酵素がその触媒活性を適切に実施できるようにするような量の水だけが反応媒体中に存在することを意味することが理解されるであろう。好ましくは、反応媒体は、５０体積％未満の水、より好ましくは３０体積％未満の水、最も好ましくは２０体積％未満の水を含有する。好ましくは、反応媒体は、少なくとも０．１体積％、より好ましくは少なくとも０．３体積％、より好ましくは少なくとも０．５体積％、より好ましくは少なくとも１体積％、最も好ましくは少なくとも５体積％の水を含有する。反応媒体中の好ましい水濃度は、０．５〜５０体積％の間、より好ましくは１〜３０体積％の間、最も好ましくは５〜２０体積％の間である。

本発明の１つの実施形態では、アルキルエステル化中に遊離されるＮＨ_３の少なくとも一部は反応混合物から除去される。好ましくは、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは実質的に全ての遊離ＮＨ_３は反応混合物から除去される。例えば、反応混合物からのＮＨ_３の除去は、ＮＨ_３と錯体を形成する化合物、例えばＮＨ_３と錯体を形成した後に沈殿する化合物（その例には、ＭｇＨＰＯ_４、Ａｌ_２Ｏ_３およびＫ_２ＳＯ_４が含まれる）の添加によって行うことができる。あるいは例えば、ＮＨ_３の除去は、吸着剤、例えばゼオライトを反応混合物に添加することによって実施することもできる。またＮＨ_３の除去は、例えば、酸塩基反応を適用することによりＮＨ_３をプロトン化することによって、あるいは、例えば低圧力の印加および／または加熱により反応中に反応混合物からＮＨ_３を蒸発させることによって実施されてもよい。本発明の好ましい実施形態では、錯体形成後に沈殿するＮＨ_３錯化剤が使用され、より具体的には、ＭｇＨＰＯ_４、Ａｌ_２Ｏ_３またはＫ_２ＳＯ_４が使用される。

任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端アルキルエステルは、例えば、式Ｘ

の化合物によって表すことができ、式中、ＰはＨまたはＮ−末端保護基を表し、ｎは少なくとも２の整数であり、ｍは少なくとも１の全ての整数を表すがｎ以下であり、Ｒ^ｍＡおよびＲ^ｍＢはそれぞれ独立してＨまたはアミノ酸側鎖を表し、Ｒは任意で置換されたアルキル基を表す。

任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端アルキルエステルが式Ｘの化合物であれば、対応する任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドは、式ＩＸ

の化合物で表され、式中、ＰはＨまたはＮ−末端保護基を表し、ｎは少なくとも２の整数であり、ｍは少なくとも１の全ての整数を表すがｎ以下であり、Ｒ^ｍＡおよびＲ^ｍＢはそれぞれ独立してＨまたはアミノ酸側鎖を表す。

Ｒは、好ましくは、１〜６個のＣ原子を有する任意で置換されたアルキル基を表し、より好ましくは、１〜３個のＣ原子を有する任意で置換されたアルキル基を表し、最も好ましくは、Ｒはメチルを表す。非置換アルキル基の例は、メチル、エチル、イソブチルおよびｎ−オクチルである。置換アルキル基の例は、カルバモイルメチル、Ｎ−メチル−カルバモイルメチル、ベンジル、ｐ−ニトロベンジル、シアノメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、２，２，２−トリクロロエチルおよび４−ピリジルメチルである。

本発明の方法においてどのアルキルアルコールを使用するかは、任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端アルキルエステルのどれが所望されるかに左右される。例えば、メタノールが使用される場合、形成される任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端アルキルエステルは任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端メチルエステルである。例えば、エタノールが使用される場合には、形成される任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端アルキルエステルは、任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端エチルエステルである、というようにいろいろである。好ましくは、アルキルアルコールはメタノールである。

最適なアルキルアルコール濃度は、所定の実験を通して当業者によって決定することができる。本発明の好ましい実施形態において、使用されるアルキルアルコールはメタノールである。

しかしながら、アルキルアルコールに加えて１つまたは複数の他の溶媒の存在も可能であり、いくつかの場合には、例えば、式ＩＸの任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドを可溶化するために、１つまたは複数の他の溶媒の存在が有利なこともある。

本発明の方法の驚くべき態様は、高メタノール濃度においても（これは、酵素が通常ごくわずかな活性を示す条件であるにもかかわらず）、ペプチドアミダーゼ活性が現れることである。（Ｋ．ドロウツ（Ｄｒａｕｚ）およびＨ．ワルトマン（Ｗａｌｄｍａｎｎ）の「有機合成における酵素触媒」、第１巻、第２版、ウィリー−ＶＣＨ出版社、ワインハイム ２００２年、１．６および８．６セクション、Ｍ．ポゴレブク（Ｐｏｇｏｒｅｖｃ）、Ｈ．ステッチャー（Ｓｔｅｃｈｅｒ）およびＫ．フェーバー（Ｆａｂｅｒ）のＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００２年、２４巻、８５７−８６０頁）。

好ましくは、ペプチドアミダーゼは、工程の最初に一回で全部が添加される代わりに、２回以上に分けて時間をかけて反応媒体に添加される。

ペプチドカップリング反応中にオリゴペプチドＣ−末端アルキルエステルの遊離Ｎ−末端アミノ官能基の反応を防止するために、好ましくは、適切な保護基によってこのアミノ官能基が保護され得る。適切なＮ−保護基は、（オリゴ）ペプチドの合成のために使用することができるＮ−保護基であり、当業者には知られている。適切なＮ−保護基の例としては、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）、Ｂｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）およびＰｈＡｃ（フェナセチル（ｐｈｅｎａｃｅｔｙｌ））があげられ、後者は、酵素ＰｅｎＧアシラーゼを用いて酵素的に導入および切断することができる。

本発明との関連では、「アミノ酸側鎖」とは、タンパク新生または非タンパク新生アミノ酸側鎖を意味する。アミノ酸側鎖の反応基はアミノ酸側鎖保護基によって保護されてもよいし、あるいは保護されなくてもよい。タンパク新生アミノ酸の例としては、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、メチオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、トリプトファン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アルギニン、およびフェニルアラニンがあげられる。非タンパク新生アミノ酸の例としては、フェニルグリシンおよび４−フルオロ−フェニルアラニンがあげられる。

ｎは少なくとも２の整数を表すので、２、３、４、５、６、７、８、９、１０などを表す。ｍは少なくとも１である全ての整数を表すが、ｎ以下である。言い換えれば、ｍは、オリゴペプチド鎖（側基Ｒ^ＡおよびＲ^Ｂはその一部である）中のアミノ酸残基の位置を表す。従って、Ｒ^ｍＡは、ｎ個のＲ^Ａ基の完全な集合を表し、各基は潜在的に異なる側基（すなわち、Ｈまたはアミノ酸側鎖）を表し、Ｒ^ｍＢは、ｎ個のＲ^Ｂ基の完全な集合を表し、各基は潜在的に異なる側基（すなわち、Ｈまたはアミノ酸側鎖）を表す。

原則として、使用されるｐＨは重要ではなく、例えば５〜１１の間、好ましくは６〜９の間で選択され得る。ｐＨは反応の間に変化し得るが、例えば１０ｍＭ〜５００ｍＭの間の緩衝液濃度を用いる緩衝水溶液を使用することによって一定に保持することもできる。あるいは、反応のｐＨは、自動ｐＨ−スタットシステムを用いることによって一定に保持されてもよい。最適なｐＨ条件は、所定の実験を通して当業者によって容易に確認することができる。

原則として、使用される温度は重要ではなく、好ましくは０〜４５℃の間、より好ましくは１５〜４０℃の間の温度を使用することができる。あるいは、好熱性ペプチドアミダーゼが使用される場合には、温度は、より高温（例えば、４０〜９０℃の間）を選択することができる。最適な温度条件は、所定の実験を通して当業者によって容易に確認することができる。

任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端アルキルエステル、例えば、式Ｘのオリゴペプチドを十分に純粋な形態で単離するために、対応する任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミド、例えば式ＩＸのＣ−末端カルボキシアミドを、式ＸのＣ−末端アルキルエステルにほとんど完全にまたは完全に転化し、そして対応するＣ−末端カルボン酸に部分的に転化することが有利であることもある。Ｃ−末端カルボン酸は、ペプチドアミダーゼ活性に必要とされる水の存在による加水分解副反応の結果である。通常、任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端アルキルエステルは、対応するＣ−末端カルボン酸よりも、対応するＣ−末端カルボキシアミドから分離するのが困難なので、対応するＣ−末端カルボキシアミドの一部だけの転化のときよりも完全な転化のときに任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端アルキルエステルの総量が少ない場合には、任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドこの（ほとんど）完全な転化は実に有利であり得る。任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端アルキルエステルは、例えば、Ｃ−末端カルボン酸の遊離カルボキシル官能基のｐＫａ値（通常、約３．５よりも高い）よりも高いｐＨ値を有する２相系（水と混合しない有機溶媒および水相）を用いて、対応するＣ−末端カルボン酸から分離することができる。この場合、任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端アルキルエステルは有機相中に残存し、対応するＣ−末端カルボン酸は、１回または複数回の抽出で水相へ除去される。

第２の態様では、本発明は、本発明に従う方法を含む、オリゴペプチドの調製方法を提供する。

特に本発明は、以下のステップ：
ｂ）本発明の第１の態様に従って、ペプチドアミダーゼの存在下で、任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドをアルキルアルコールと反応させるステップと、
ｃ）ペプチド結合の形成を触媒する酵素の存在下で、形成された任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端アルキルエステルをアミノ酸Ｃ−末端カルボキシアミドまたはオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドと反応させて、任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドを形成するステップと
を含む、オリゴペプチドの調製方法を提供する。

従って、本発明は、酵素的な手段によってＣ−末端部が脱保護されると同時に活性化されるので、これまでよりも少ない反応ステップを用いるＮ→Ｃ方向のオリゴペプチド合成を可能にする、オリゴペプチドの合成方法も提供する。さらに、Ｃ−末端カルボン酸中間体のために、多大な抽出および脱水手順は必要とされない。オリゴペプチド鎖伸長ならびにＮ−末端アミノ官能基の保護および脱保護はいずれも完全に酵素的に実施され得るので、これは、有利なことに、Ｎ→Ｃ方向のペプチドの合成のための完全に酵素的な方法を可能にする。従って、本発明の方法は、例えば、経済的および／または環境的な観点から、これまで既知の方法よりも魅力的である。

ステップｃ）に関して、ペプチド結合の形成を触媒することができる酵素はどれも使用することができる。このような酵素は当業者には公知であり、例としては、プロテアーゼ、アシラーゼ（例えば、ｐｅｎＧアシラーゼ）およびアミノ酸エステルヒドロラーゼがあげられる。

ステップｂ）およびｃ）は、所望のアミノ酸配列を有する任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドが得られるまで繰り返すことができる。

従って、本発明は、以下のステップ：
ｂ）本発明の第１の態様に従って、ペプチドアミダーゼの存在下で、任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドをアルキルアルコールと反応させるステップと、
ｃ）ペプチド結合の形成を触媒する酵素の存在下で、形成された任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端アルキルエステルをアミノ酸Ｃ−末端カルボキシアミドまたはオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドと反応させて、任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドを形成するステップと
を含むオリゴペプチドの合成方法であって、
所望のアミノ酸配列を有する任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドが得られるまでステップｂ）およびｃ）が繰り返される方法にも関する。

ステップｂ）で出発材料として使用される任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドは、ａ）ペプチド結合の形成を触媒する酵素の存在下で、任意でＮ−末端保護されたアミノ酸Ｃ−末端アルキルエステルまたは任意でＮ−末端保護されたオリゴペプチドＣ−末端アルキルエステルを、アミノ酸Ｃ−末端カルボキシアミドまたはオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドと反応させることによって調製することができる。

従って、本発明は、以下のステップ：
ａ）ペプチド結合の形成を触媒する酵素の存在下で、任意でＮ−末端保護されたアミノ酸Ｃ−末端アルキルエステルまたは任意でＮ−末端保護されたオリゴペプチドＣ−末端アルキルエステルをアミノ酸Ｃ−末端カルボキシアミドまたはオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドと反応させるステップと、
ｂ）本発明の第１の態様に従って、ペプチドアミダーゼの存在下で、形成された任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドをアルキルアルコールと反応させるステップと、
ｃ）ペプチド結合の形成を触媒する酵素の存在下で、形成された任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端アルキルエステルをアミノ酸Ｃ−末端カルボキシアミドまたはオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドと反応させて、任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドを形成するステップと、
を含むオリゴペプチドの調製方法であって、
所望のアミノ酸配列を有する任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドが得られるまでステップｂ）およびｃ）が繰り返され得る方法にも関する。

所望される場合には、所望のアミノ酸配列を有する任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドは、Ｃ−末端部および／またはＮ−末端部において脱保護されてもよく、そして／あるいは少なくとも１つのアミノ酸側鎖保護基が存在すれば、任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドは、アミノ酸側鎖の少なくとも１つにおいて脱保護されてもよく、その後、保護されたまたは無保護のオリゴペプチドが回収され得る。

形成されたＮ−保護オリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドまたはＮ−保護Ｃ−末端脱保護オリゴペプチドのＮ−末端保護基の脱保護は、当業者に既知の方法によって実施することができる。好ましくは、Ｎ−末端保護基は酵素的に除去され、より好ましくは、Ｎ−末端保護基は酵素的に導入および除去される。

Ｎ−保護基の酵素的な導入および／または除去は、方法をより費用効果的にすると共に、環境により優しくするので、特に有利である。ｉ）酵素的に導入可能および切断可能なＮ−保護基、およびｉｉ）アミノ酸Ｃ−末端カルボキシアミドまたはオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドを用いるペプチド鎖の酵素的な段階的伸長、およびｉｉｉ）成長するオリゴペプチド鎖の繰り返される酵素的なＣ−末端カルボキシアミド脱保護、およびＣ−末端アルキルエステルへの同時的な活性化、というこの新規の組み合わせによって、これまでに記載されたことがないオリゴペプチドの完全に酵素的な合成の概念が可能になる。

オリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドまたはアルキルエステルのＮ−末端保護基を導入および除去することができる酵素は当業者には公知であり、このような酵素の例としては、ｐｅｎＧアシラーゼがある。

強鉱酸水溶液を用いてＣ−末端カルボキシアミド官能基を除去するための従来の手段は、同時にペプチド結合の部分的な切断を引き起こす。従って、形成された任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドのＣ−末端部の脱保護は、好ましくは、対応するＣ−末端アルキルエステルが限られた程度で形成されるかあるいは全く形成されない条件下、例えば、４０重量％以下のアルキルアルコール、より好ましくは１０重量％以下のアルキルアルコール、最も好ましくは３重量％以下のアルキルアルコールを含有する水溶液中で、ペプチドアミダーゼを用いることによって実施され得る。

最後のペプチドカップリングステップの後に得られるような１つまたはいくつかのアミノ酸側鎖保護基を有さないまたは有するＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドが所望の最終生成物であれば、例えば、当業者に既知の抽出または結晶化方法を用いてこれを直接回収することができる。部分的に保護されたオリゴペプチドが所望される最終生成物である場合には、Ｃ−および／またはＮ−および／または（最後のペプチドカップリングステップ後に１つまたはいくつかのアミノ酸側鎖保護基が存在する場合には）アミノ酸側鎖の脱保護反応を実行することができ、任意で仕上げ手順の後に、所望の部分的に保護された最終生成物を回収することができる。しかしながら通常、完全に脱保護されたオリゴペプチドが所望の最終生成物であり、連続したＮ−、Ｃ−および（最後のペプチドカップリングステップ後に１つまたはいくつかのアミノ酸側鎖保護基が存在する場合には）アミノ酸側鎖の脱保護ステップによって得ることができる。完全に脱保護されたオリゴペプチドを最終的に回収するための手段（例えば、抽出および結晶化を含む）は、当業者によって確認され得る。

好ましくは、反応混合物は、ステップａ）および／またはｃ）のカップリング反応の後に仕上げられて、残存する出発化合物および形成されたかもしれない副生成物が除去される。特に有用な実施形態は、任意でＮ−保護されたアミノ酸Ｃ−末端アルキルエステルまたは任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端アルキルエステルを（わずかに）過剰のアミノ酸Ｃ−末端カルボキシアミドまたはオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドと反応させて、エステル化合物の完全またはほとんど完全な転化を達成し、続いて、水と混合しない有機溶媒と、アミノ酸Ｃ−末端カルボキシアミドまたはオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドのｐＫａよりも低いｐＨ値を有する水相とからなる２相系に反応混合物を分配することである。このような場合、過剰のアミノ酸Ｃ−末端カルボキシアミドまたはオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドはプロトン化形態で水相中に抽出され、所望のカップリング生成物は有機相中に残存し得る。Ｎ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドカップリング生成物の収率および／または純度を最適にするために、水による抽出または有機溶媒による水相の逆抽出を多数回適用するのが有利なこともある。最も適切な条件は、当業者によって容易に決定することができる。

本発明の方法を用いて調製することができるオリゴペプチドの例は、トリペプチドＨ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＯＨおよびＨ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＯＨ、ならびにテトラペプチドＨ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｌａ−パラフルオロ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−ＮＨ_２である。本発明の方法によって生成されるオリゴペプチドは、好ましくは、２〜５０のアミノ酸の直鎖、より好ましくは２〜２０のアミノ酸の直鎖、最も好ましくは２〜１０のアミノ酸の直鎖である。

本発明はここで以下の実施例によって説明されるがこれらに限定されない。

［実施例］
［材料］
フラベドからのペプチドアミダーゼ（「ＰＡＦ」と呼ばれる）は、フルカ（Ｆｌｕｋａ）から入手し、そのまま使用した（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＮＨ_２からＺ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＯＨへの脱アミドにおける活性：２．４Ｕ／ｍＬ）。凍結乾燥ＰＡＦを使用する場合には、セントリー・フリーズ−モバイル（Ｓｅｎｔｒｙ Ｆｒｅｅｚｅ−Ｍｏｂｉｌｅ）１２５（Ｇ−２５）を用いて５ｍＬの市販のＰＡＦ溶液を凍結乾燥し、３０Ｕ／ｇの活性を有し、カール−フィッシャー滴定で決定した２．５重量％の水を含有する０．４０ｇの固体ＰＡＦを得た。ステノトロホモナス（以前は「キサントモナス」として知られる）マルトフィリアからの微生物ペプチドアミダーゼ（「ＰＡＭ」と呼ばれる）は、Ｊｕｅｌｉｃｈ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（独国ユーリッヒ）から入手し、そのまま使用した（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＮＨ_２からＺ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＯＨへの脱アミドにおける活性：２．８７Ｕ／ｍＬ）。ＰＡＦおよびＰＡＭの酵素活性は、実施例１Ａに記載されるようにＨＰＬＣ法を用いてＺ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＯＨへの転化を監視することによって、５体積％のＤＭＦを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝水溶液（ｐＨ＝７．５）中でＺ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＮＨ_２の加水分解により３０℃で検定した。

アルカラーゼ（ａｌｃａｌａｓｅ）はノボザイムズ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）（バッチＰＬＮ０４８１０）から入手し、使用の前に乾燥させた。乾燥は、８．０ｍＬのアルカラーゼ溶液を６０ｍＬのエタノール中に懸濁させ、懸濁液を３０００Ｇ、４℃で遠心分離することによって行った。上澄みをデカントし、固体を６０ｍＬのエタノール中に３倍以上に懸濁させ、遠心分離した。得られた残渣をそのまま使用した。ａｓｓｅｍｂｌａｓｅは、ＤＳＭ Ａｎｔｉ−ｉｎｆｅｃｔｉｖｅｓ（オランダ、デルフト）から入手し、国際公開第９７／０４０８６号パンフレットによるとポリマー支持体上に共有結合で固定化された大腸菌からのｐｅｎＧアシラーゼに相当する。セパラーゼ（ｓｅｐａｒａｓｅ）は、ＤＳＭ Ａｎｔｉ−ｉｎｆｅｃｔｉｖｅｓから入手し、国際公開第９７／０４０８６号パンフレットによるとポリマー支持体上に共有結合で固定化されたおよびＡ．フェカリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）からのｐｅｎＧアシラーゼに相当する。

Ｚ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＮＨ_２およびＺ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＯＨ（バッケム（Ｂａｃｈｅｍ））、メタノール（フルカ）、フェニル酢酸およびＭｇＨＰＯ_４（アクロス（Ａｃｒｏｓ））およびクロロスルホン酸（メルク（Ｍｅｒｃｋ））は、受け取った状態で使用した。ｔ−ブタノール（メルク）は使用の前に蒸留により乾燥させた。

Ｚ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＯＭｅ基準材料は、ＥＰ９７７７２６号明細書（１９９８年、Ｐ．Ｊ．Ｌ．Ｍ．クエドフリーグ（Ｑｕａｅｄｆｌｉｅｇ）およびＷ．Ｈ．Ｊ．ボーステン（Ｂｏｅｓｔｅｎ））に記載される方法に従ってＺ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＯＨから調製した。クロロスルホン酸（０．５５ｇ、４．７２ｍｍｏｌ、１．１当量）を窒素下で激しく攪拌しながら０〜５℃でＺ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＯＨ（１．６０ｇ、４．３０ｍｍｏｌ）のメタノール（１４ｍＬ）溶液に液滴状で添加した。５０℃で２時間攪拌した後、溶液を２０℃まで冷却し、５０ｍＬの激しく攪拌した７重量％のＫＨＣＯ_３水に液滴状で添加し、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、真空中で濃縮し、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＯＨを基準として８５％の収率で、９９重量％よりも高純度のＺ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＯＣＨ_３が得られた。

ブルッカー（Ｂｒｕｋｅｒ）３００ＭＨｚウルトラシールド（Ｕｌｔｒａｓｈｉｅｌｄ^ＴＭ）ＮＭＲスペクトロメータにおいてＤＭＳＯ−ｄ_６中３００ＭＨｚで^１ＨＮＭＲスペクトルを記録した。

本発明との関連では、１Ｕは、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＮＨ_２を基質として用いて、ｐＨ７．５および３０℃の水溶液中で、１分あたり１マイクロモルのＺ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＯＨの形成を触媒する酵素の量に相当する。

［実施例１：Ｚ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＮＨ_２（１）からＺ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＯＭｅ（２）への酵素転化］

［実施例１Ａ：ＰＡＦの繰り返しの添加を用いるＺ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＮＨ_２（１）の転化］
３．２ｇのＭｅＯＨ中の１（１５ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）の溶液に、２５０μＬのフラベドからのペプチドアミダーゼ（ＰＡＦ、２．４Ｕ／ｍＬ）およびＭｇＨＰＯ_４（３５ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ、５当量）を３０℃で添加した。この温度で１８６時間反応混合物を攪拌し、２４時間の間隔で新たな量のＰＡＦ（２５０μＬ）を添加しながら、ＨＰＬＣで監視した（以下を参照）。転化の経過は表１に示される。６６時間後、アミド１からエステル２への転化は最大であった（４１％）。その時点で、１０％の酸３も形成されている。

［ＨＰＬＣ分析：］
０．１％のＨＣＯＯＨ水およびアセトニトリル（１．０ｍＬ／分、４０℃）のグラジエントを用いて、オルテック（Ａｌｌｔｅｃｈ）からのプリベイル（Ｐｒｅｖａｉｌ）カラム（２５０×内径４．６ｍｍ、５μｍ）における逆相ＨＰＬＣにより１から２および３への転化を監視した。ｔ＝０において１５体積％のアセトニトリルを用い、８分間で７４．５体積％まで増大させ、７分間７４．５体積％に維持した。１５．１分の時点で、グラジエントプロファイルは開始条件に戻った。総分析時間は２２分であった。注入体積は５μＬであり、検出は分光光度計を用いてＵＶ２５４および２７０ｎｍで実施した。１、３および２の保持時間は、それぞれ５．９、９．８および２５．４分であった。

［実施例１Ｂ：開始時に全てのＰＡＦを添加したときのＺ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＮＨ_２（１）の転化］
３．２ｇのＭｅＯＨ中の１（１５ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）の溶液に、８３０μＬのフラベドからのペプチドアミダーゼ（ＰＡＦ、２．４Ｕ／ｍＬ）およびＭｇＨＰＯ_４（３５ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ、５当量）を３０℃で添加した。反応をＨＰＬＣ（実施例１Ａに記載したものと同じ方法を用いる）で監視し、２４時間および４０時間の両方の時点の１からエステル２への転化は１４％、酸３への転化は０．２％であることが示された。

［実施例１Ｃ：繰り返しのＰＡＦ添加を用いるＺ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＮＨ_２（１）の完全転化］
３．２ｇのＭｅＯＨ中の１（１５ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）の溶液に、２５０μＬのフラベドからのペプチドアミダーゼ（ＰＡＦ、２．４Ｕ／ｍＬ）およびＭｇＨＰＯ_４（３５ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ、５当量）を３０℃で添加した。反応混合物をこの温度で１５日間攪拌し、１日の間隔で新たな量のＰＡＦ（２５０μＬ）を添加しながら、ＨＰＬＣ（実施例１Ａを参照）で監視した。転化の経過は表２に示される。明らかに、１５日後に、１はほとんど完全に２（３０％）および３（６０％）に転化した。

［実施例２：添加剤の影響］

３．１６ｇのＭｅＯＨ中の１（１５ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）の溶液に、２４９μＬのフラベドからのペプチドアミダーゼ（ＰＡＦ、２．４Ｕ／ｍＬ）および特定の量の添加剤（表３を参照）を添加した。反応混合物を３０℃で２４時間攪拌した後、一定分量を取り出し、実施例１Ａに記載したものと同じＨＰＬＣ法を用いてＨＰＬＣで分析した。形成されたエステル２の量は表３で与えられる。

［実施例３：水の量の影響］

溶液の総体積が４ｍＬであるＭｅＯＨおよび特定の量の脱塩水またはＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝７．５、５重量％のＤＭＦを含有）中の１（１５ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）の溶液（以下の表を参照）に、特定の量（以下の表を参照）の凍結乾燥したフラベドからのペプチドアミダーゼ（ＰＡＦ、３０Ｕ／ｇ）を添加し、場合によっては（表４を参照）、続いて３４．９ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ、５当量）のＭｇＨＰＯ_４を添加した。得られた反応混合物を３０℃で２４時間攪拌し、一定分量を取り出し、実施例１Ａに記載したものと同じＨＰＬＣ法を用いてＨＰＬＣで分析した。形成されたエステル２および酸３の量は表４で与えられる。

［実施例４：ＰＡＦによるＮ→Ｃアプローチを用いるトリペプチドＨ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＯＨ（１４）の完全酵素合成］
１４の合成のために、以下の合成スキームが追従される。

［４Ａ．ＧｌｙＯＭｅ．ＨＣｌ（４）からＰｈＡｃ−Ｇｌｙ−ＯＭｅ（６）への酵素Ｎ−保護］
１００．０ｇのＧｌｙＯＭｅ．ＨＣｌ（４、０．７９６ｍｏｌ）および１０８．４ｇのフェニル酢酸（５、０．７９６ｍｏｌ）を５００ｍＬの水中に懸濁させた。８３．３ｍＬの３２重量％のＮａＯＨの添加によりｐＨを６．３に調整した。得られた溶液に、４８ｇの固定化ａｓｓｅｍｂｌａｓｅを添加し、反応混合物を２０℃で１６時間攪拌した。得られたスラリーを０℃まで冷却し、その温度で１時間攪拌し、生成物ＰｈＡｃ−ＧｌｙＯＭｅ（６）および固定化ａｓｓｅｍｂｌａｓｅをろ過により単離した。固体材料をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）中でスラリー状にし、固定化ａｓｓｅｍｂｌａｓｅをろ過して除去した。ＥｔＯＡｃ層を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、真空中で濃縮し、１００．０ｇ（０．４８３ｍｏｌ）の６（４に基づいて６１％）を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）、δ（ｐｐｍ）：３．６３（３Ｈ，ｓ，ＯＣＨ_３）、３．６９（２Ｈ，ｓ，ＣＨ_２ＰｈＡｃ）、３．８７（２Ｈ，ｓ，ＣＨ_２Ｇｌｙ）、７．２７−７．３４（５Ｈ，ｍ，ＰｈＡｃ）、８．５（１Ｈ，ｂｓ，ＮＨ）。

［４Ｂ．ＰｈＡｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＮＨ_２（８）への酵素カップリング］
６４０ｇのｔ−ブタノール中の５４．６ｇ（０．２６４ｍｏｌ）のＰｈＡｃ−ＧＩｙ−ＯＭｅ（６）の溶液に、６１．８ｇ（０．３４３ｍｏｌ、１．３０当量）のＬ−Ｔｙｒ−ＮＨ_２（７）を添加した。得られたスラリーに、８ｍＬのアルカラーゼ溶液に基づいた乾燥アルカラーゼを添加し、２４時間の間隔で同量のアルカラーゼを添加しながら反応混合物を３５℃で１６０時間攪拌した。１６０時間後、反応混合物から一定分量を取り出し、ＨＰＬＣにより分析した（以下を参照）。６からＰｈＡｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＮＨ_２（８）への転化は６０％であり、副産物ＰｈＡｃ−ＧＩｙ−ＯＨへの加水分解は１０％であった。反応混合物を真空中で濃縮し、残渣を１００ｍＬのＥｔＯＡｃおよび１００ｍＬの水の間で分配し、水相のｐＨを３．０に調整した（１２ＮのＨＣｌ水を用いて）。激しく攪拌した後、８が結晶化し、ろ過により単離した。得られた母液の相分離の後、ＥｔＯＡｃ層をｐＨ３．０の別の１００ｍＬの水と共に攪拌した。この結果、８の別の部分の結晶化が起こり、これをろ過により単離した。得られた母液のうち、ＥｔＯＡｃ層をｐＨ７．５（１ＮのＮａＯＨ水で調整）の別の１００ｍＬの水と共に攪拌した。８の別の部分の結晶化がもたらされ、これもろ過により単離した。全部で３０．０ｇ（０．０８４ｍｏｌ）の８（６を基準として３２％の収率）が得られた。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）、δ（ｐｐｍ）：２．６（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２Ｔｙｒ）、２．９（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２Ｔｙｒ）、３．４（２Ｈ，ｓ，ＣＨ_２ＰｈＡｃ）、３．６（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２Ｇｌｙ）、３．８（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２Ｇｌｙ）、４．３５（１Ｈ，ｍ，α−ＨＴｙｒ）、６．６（２Ｈ，ｄ，ＣＨＴｙｒ）、６．９（２Ｈ，ｄ，ＣＨＴｙｒ）、７．１（１Ｈ，ｓ，ＮＨ_２）、７．２５−７．３５（５Ｈ，ｍ，ＰｈＡｃ）、７．４（１Ｈ，ｓ，ＮＨ_２）、８．０（１Ｈ，ｄ，ＮＨＴｙｒ）、８．２５（１Ｈ，ｔ，ＮＨＧｌｙ）、９．３（１Ｈ，ｓ，ＯＨＴｙｒ）。

［ＨＰＬＣ分析：］
４０℃で１００ｍＭのＨＣｌＯ_４水（ｐＨ１．０）およびアセトニトリル（１．０ｍｌ／分）のグラジエントを用いて、オルテックからのプリベイルカラム（２５０×内径４．６ｍｍ、５μｍ）における逆相ＨＰＬＣによって６および７の８へのカップリングを監視した。ｔ＝０分において、２５体積％のアセトニトリルを用い、８分間で７０体積％まで増大させ、２分間７０体積％に維持した。１０．１分の時点で、グラジエントプロファイルは開始条件に戻った。総分析時間は１６分であった。注入体積は５μｌであり、検出は分光光度計を用いてＵＶ２２０ｎｍで実施した。７、ＰｈＡｃ−ＧＩｙ−ＯＨ、８および６の保持時間は、それぞれ２．９、４．９、５．３および５．９分であった。

［４Ｃ−１．ＰｈＡｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＮＨ_２（８）からＰｈＡｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＯＭｅ（１０）への酵素転化］
１０５０ｇのＭｅＯＨ中の５ｇ（１４ｍｍｏｌ）のＰｈＡｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＮＨ_２（８）の溶液に、３０℃の８３ｍＬのフラベドからのペプチドアミダーゼ（ＰＡＦ、２．４Ｕ／ｍＬ）および１１．７ｇ（６７ｍｍｏｌ）のＭｇＨＰＯ_４を添加した。２４時間ごとに８３ｍＬの新しい酵素を添加した。反応の経過をＨＰＬＣで監視した（以下を参照）。攪拌の１４０時間後、８から１０への転化は４０％であり、加水分解による８からＰｈＡｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＯＨ（９）への転化は６０％であった。メタノールを蒸発させ、ｐＨ＝７で残渣を５０ｍＬのＥｔＯＡｃおよび５０ｍＬの水の間で分配し、ｐＨ＝７でＥｔＯＡｃ層を別の５０ｍＬの水で洗浄し、続いて、乾燥（Ｎａ_２ＳＯ_４）させてＥｔＯＡｃ層を真空中で濃縮することにより所望のエステル１０が単離され得る。これにより、１．９ｇの１０（５．１４ｍｍｏｌ、８を基準として３７％の収率）が得られた。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）、δ（ｐｐｍ）：２．６（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２Ｔｙｒ）、２．９（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２Ｔｙｒ）、３．５（２Ｈ，ｓ，ＣＨ_２ＰｈＡｃ）、３．６（３Ｈ，ｓ，ＣＨ_３）、３．７（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２Ｇｌｙ）、３．９（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２Ｇｌｙ）、４．４（１Ｈ，ｍ，α−ＨＴｙｒ）、６．７（２Ｈ，ｄ，ＣＨＴｙｒ）、７．０（２Ｈ，ｄ，ＣＨＴｙｒ）、７．２８（５Ｈ，ｍ，ＰｈＡｃ）、８．３（１Ｈ，ｄ，ＮＨＴｙｒ）、８．３（１Ｈ，ｔ，ＮＨＧｌｙ）、９．３（１Ｈ，ｓ，ＯＨＴｙｒ）。

［ＨＰＬＣ分析：］
実施例１Ａに記載されるものと同じ逆相ＨＰＬＣ法によって８から１０への転化を監視した。８、９および１０の保持時間は、それぞれ６．９、７．８および８．９分であった。

［４Ｃ−２．比較例：ＰｈＡｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＮＨ_２（８）からＰｈＡｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＯＨ（９）への酵素加水分解の後、ＰｈＡｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＯＭｅ（１０）を得るための化学的なエステル化］
５体積％のＤＭＦを含有する４．２Ｌの５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝水溶液（ｐＨ＝７．５）中の１５ｇ（４２ｍｍｏｌ）のＰｈＡｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＮＨ_２（８）の懸濁液に、８７．６ｍＬのフラベドからのペプチドアミダーゼ（ＰＡＦ、２．４Ｕ／ｍＬ）を添加し、反応混合物を３０℃で２４時間攪拌した。反応混合物から一定分量を取り出し、ＨＰＬＣによって分析し（以下を参照）、８から９への転化は１００％であると示された。反応混合物を真空中で５００ｍＬまで濃縮し、ｐＨを１．０にした（３２重量％のＨＣｌ水を用いて）。酢酸エチルによる抽出（３×３００ｍＬ）の後、合わせた有機相を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、真空中で濃縮して、１０．８ｇ（３０ｍｍｏｌ）の９（８を基準として７２％）および８．８ｇ（０．１２ｍｏｌ）のＤＭＦを含有する残渣を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）、δ（ｐｐｍ）：２．６（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２Ｔｙｒ）、２．９（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２Ｔｙｒ）、３．４（２Ｈ，ｓ，ＣＨ_２ＰｈＡｃ）、３．７（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２Ｇｌｙ）、３．９（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２Ｇｌｙ）、４．４（１Ｈ，ｍ，α−ＨＴｙｒ）、６．７（２Ｈ，ｄ，ＣＨＴｙｒ）、７．０（２Ｈ，ｄ，ＣＨＴｙｒ）、７．３１−７．３３（５Ｈ，ｍ，ＰｈＡｃ）、８．１（１Ｈ，ｄ，ＮＨＴｙｒ）、８．３（１Ｈ，ｔ，ＮＨＧｌｙ）、９．２（１Ｈ，ｓ，ＯＨＴｙｒ）、１２（１Ｈ，ｂｓ，ＣＯＯＨ）。

［ＨＰＬＣ分析：］
実施例１Ａに記載されるものと同じ逆相ＨＰＬＣ法によって８から９への転化を監視した。８および９の保持時間は、それぞれ６．９および７．８分であった。

１１１ｇのメタノール中に１０．８ｇの９を含有する残渣の冷却（０℃）溶液に、３．８４ｇ（３３ｍｍｏｌ）のクロロスルホン酸（ＣｌＳＯ_３Ｈ）を液滴状で添加し、反応混合物を４５℃で２時間加熱した。ＴＬＣ分析（溶離液ｎ−ブタノール／ＨＣＯＯＨ／水７５／１５／１０ｖ／ｖ／ｖ）は、９から１０への転化が完了したことを示した。反応混合物を周囲温度に冷却し、５０ｍＬの０．２ＭのＫＨＣＯ_３水および１００ｍＬの水の攪拌した混合物中に注ぎ、酢酸エチルで抽出（２×２００ｍＬ）した。合わせた有機相を乾燥（Ｎａ_２ＳＯ_４）させ、真空中で濃縮して、無色のオイルが得られた。オイルをＣＨ_２Ｃｌ_２（１００ｍＬ）中に溶解し、水（１００ｍＬ）で洗浄し、ＣＨ_２Ｃｌ_２層を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、真空中で濃縮して、９．２ｇの１０が無色のオイルとして得られた（２４．９ｍｍｏｌ、９を基準として８３％の収率）。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）、δ（ｐｐｍ）：２．６（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２Ｔｙｒ）、２．９（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２Ｔｙｒ）、３．５（２Ｈ，ｓ，ＣＨ_２ＰｈＡｃ）、３．６（３Ｈ，ｓ，ＣＨ_３）、３．６５（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２Ｇｌｙ）、３．９（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２Ｇｌｙ）、４．４（１Ｈ，ｍ，α−ＨＴｙｒ）、６．７（２Ｈ，ｄ，ＣＨＴｙｒ）、７．０（２Ｈ，ｄ，ＣＨＴｙｒ）、７．２８（５Ｈ，ｍ，ＰｈＡｃ）、８．３（１Ｈ，ｄ，ＮＨＴｙｒ）、８．３（１Ｈ，ｔ，ＮＨＧｌｙ）、９．３（１Ｈ，ｓ，ＯＨＴｙｒ）。

［４Ｄ．ＰｈＡｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ_２（１２）への酵素カップリング］
１５．６ｇのｔ−ＢｕＯＨ中の３．５ｇ（９．５ｍｍｏｌ）のＰｈＡｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＯＭｅ（１０）および４．６５ｇ（２８．３ｍｍｏｌ）のＬ−Ｐｈｅ−ＮＨ_２（１１）の溶液に、３ｍＬのアルカラーゼ溶液に基づく乾燥アルカラーゼを添加し、反応混合物を３５℃で攪拌した。２４時間後、８ｇのｔ−ＢｕＯＨを添加して、攪拌性（ｓｔｉｒｒａｂｉｌｉｔｙ）を増大させた。４０時間後、反応混合物から一定分量を取り出し、ＨＰＬＣで分析し（以下を参照）、１０の６２％がＰｈＡｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ_２（１２）に転化し、３８％が加水分解生成物ＰｈＡｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＯＨに転化したことが示された。反応混合物を真空中で濃縮し、残渣を３０ｇの水および４５ｇのＥｔＯＡｃの間で分配した。ＥｔＯＡｃ層をｐＨ３の１０ｇの水で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）真空中で濃縮されて、２．５ｇ（５．０ｍｍｏｌ）の純粋な１２（１０を基準として５３％）が得られた。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）、δ（ｐｐｍ）：２．６（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２ＴｙｒまたはＰｈｅ）、２．７（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２ＴｙｒまたはＰｈｅ）、２．９（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２ＴｙｒまたはＰｈｅ）、３．０（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２ＴｙｒまたはＰｈｅ）、３．４５（２Ｈ，ｓ，ＣＨ_２ＰｈＡｃ）、３．６（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２Ｇｌｙ）、３．８（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２Ｇｌｙ）、４．４５（１Ｈ，ｍ，α−ＨＴｙｒ）、４．４５（１Ｈ，ｍ，α−ＨＰｈｅ）、６．６（２Ｈ，ｄ，ＣＨＴｙｒ）、７．０（２Ｈ，ｄ，ＣＨＴｙｒ）、７．１（１Ｈ，ｓ，ＮＨ_２）、７．２−７．３（１０Ｈ，ｍ，ＰｈＡｃ、Ｐｈｅ）、７．４（１Ｈ，ｓ，ＮＨ_２）、８．１（１Ｈ，ｄ，ＮＨＴｙｒまたはＰｈｅ）、８．１（１Ｈ，ｄ，ＮＨＴｙｒまたはＰｈｅ）、８．３（１Ｈ，ｔ，ＮＨＧｌｙ）、９．３（１Ｈ，ｓ，ＯＨＴｙｒ）。

［ＨＰＬＣ分析：］
実施例１Ａに記載されるものと同じ逆相ＨＰＬＣ法によって、１２を形成するための１０と１１とのカップリングを監視した。１１、ＰｈＡｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＯＨ、１０および１２の保持時間は、それぞれ３．４、７．８、８．９および９．１分であった。

［４Ｅ．ＰｈＡｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＯＨ（１３）を与えるためのＰｈＡｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ_２（１２）の酵素脱保護］
５体積％のＤＭＦを含有する２００ｍＬの５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝水溶液（ｐＨ＝７．５）中の１．０ｇ（２．０ｍｍｏｌ）のＰｈＡｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＮＨ_２（１２）の懸濁液に、１ｍＬのステノトロホモナス・マルトフィリアからのペプチドアミダーゼ（ＰＡＭ、２．８７Ｕ／ｍＬ）を添加し、反応混合物を３０℃で攪拌した。２４時間後、反応混合物から一定分量を取り出し、ＨＰＬＣで分析し（以下を参照）、ＰｈＡｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＯＨ（１３）への転化が１００％であることが示された。混合物を真空中で濃縮し、ｐＨ１．０において残渣を２３ｇのＥｔＯＡｃおよび２５ｇの水の間で分配した。激しく攪拌した後、１３が結晶化し、これをろ過により単離した。水層を２０ｇのＥｔＯＡｃでもう一度抽出し、合わせたＥｔＯＡｃ相を乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、真空中で濃縮して、無色のオイルが得られた。ｐＨ１．０においてオイルを２５ｇのＣＨ_２Ｃｌ_２および２５ｇの水の間で分配した。ＣＨ_２Ｃｌ_２層をｐＨ１．０で２５ｇの水で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、真空中で濃縮して、１３の別の収穫物が白色固体として得られた。１３の総収量は０．６ｇ（１．２ｍｍｏｌ、１２を基準として６０％）であった。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）、δ（ｐｐｍ）：２．５（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２ＴｙｒまたはＰｈｅ）、２．６（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２ＴｙｒまたはＰｈｅ）、２．９（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２ＴｙｒまたはＰｈｅ）、３．０（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２ＴｙｒまたはＰｈｅ）、３．４５（２Ｈ，ｓ，ＣＨ_２ＰｈＡｃ）、３．５５（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２Ｇｌｙ）、３．８（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２Ｇｌｙ）、４．５（１Ｈ，ｍ，α−ＨＴｙｒ）、４．５（１Ｈ，ｍ，α−ＨＰｈｅ）、６．６（２Ｈ，ｄ，ＣＨＴｙｒ）、７．０（２Ｈ，ｄ，ＣＨＴｙｒ）、７．２−７．３（１０Ｈ，ｍ，ＰｈＡｃ、Ｐｈｅ）、７．９（１Ｈ，ｄ，ＮＨＴｙｒまたはＰｈｅ）、８．２（１Ｈ，ｔ，ＮＨＧｌｙ）、８．３（１Ｈ，ｄ，ＮＨＴｙｒまたはＰｈｅ）、９．２（１Ｈ，ｓ，ＯＨＴｙｒ）。

［ＨＰＬＣ分析：］
実施例１Ａに記載されるものと同じ逆相ＨＰＬＣ法によって１２から１３への加水分解を監視した。１２および１３の保持時間は、それぞれ９．１および９．３分であった。

［４Ｆ．Ｈ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＯＨ（１４）を得るためのＰｈＡｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＯＨ（１３）の酵素脱保護およびＨ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＯＨ（１４）の回収］
ｐＨ９．０の１０ｍＬの０．１ＭのＴＡＰＳ（トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸）緩衝水溶液中の５０ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）のＰｈＡｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−ＯＨ（１３）の溶液に、５０ｍｇの固定化セパラーゼを添加した。３０分後、反応混合物から一定分量を取り出し、ＨＰＬＣにより分析し（以下を参照）、１３から１４への転化が１００％であることが示された。酵素をろ過して除去し、反応混合物を真空中で完全に乾燥するまで濃縮した。残渣は、所望のトリペプチド１４をそのフェニル酢酸５との塩として含有した。

ＭＳ（質量分析）によって、１４の正確な分子量（４０８［Ｍ＋Ｎａ］^＋、３８４［Ｍ−Ｈ］⁻）を確認した。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）、δ（ｐｐｍ）：２．５（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２ＴｙｒまたはＰｈｅ）、２．６（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２ＴｙｒまたはＰｈｅ）、２．９（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２ＴｙｒまたはＰｈｅ）、３．０（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ_２ＴｙｒまたはＰｈｅ）、３．４５（２Ｈ，ｓ，ＣＨ_２ＰｈＡｃ）、３．５５（２Ｈ，ｓ，ＣＨ_２Ｇｌｙ）、４．０（１Ｈ，ｍ，α−ＨＴｙｒ）、４．５（１Ｈ，ｍ，α−ＨＰｈｅ）、６．６（２Ｈ，ｄ，ＣＨＴｙｒ）、７．０（２Ｈ，ｄ，ＣＨＴｙｒ）、７．２−７．３（５Ｈ，ｍ，Ｐｈｅ）。

［ＨＰＬＣ分析：］
実施例１Ａに記載されるものと同じ逆相ＨＰＬＣ法によって１３から１４への加水分解を監視した。１４および１３の保持時間は、それぞれ６．６および９．３分であった。

Claims (16)

1. 任意でＮ−保護されたオリゴペプチドアルキルエステルの調製方法であって、
   ｂ）ペプチドアミダーゼの存在下で、対応する任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドをアルキルアルコールと反応させるステップを含む方法。
2. 前記ペプチドアミダーゼが、柑橘果実のフラベドに由来する、請求項１に記載の方法。
3. 前記ペプチドアミダーゼが、オレンジのフラベドに由来する、請求項２に記載の方法。
4. 前記アルキルアルコールがメタノールである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. ０．５〜５０体積％の間の水濃度を有する反応媒体中で実施される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記反応媒体から、遊離ＮＨ_３の少なくとも５０％が除去される、請求項５に記載の方法。
7. 前記ＮＨ_３が、ＮＨ_３と錯体を形成する化合物の添加によって除去される、請求項６に記載の方法。
8. ＮＨ_３と錯体を形成する前記化合物が、ＭｇＨＰＯ_４、Ａｌ_２Ｏ_３またはＫ_２ＳＯ_４である、請求項７に記載の方法。
9. 前記ペプチドアミダーゼが、２回以上に分けて時間をかけて前記反応媒体に添加される、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法を含むオリゴペプチドの調製方法。
11. 以下のステップ：
    ｂ）請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法に従って、ペプチドアミダーゼの存在下で、任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドをアルキルアルコールと反応させるステップと、
    ｃ）ペプチド結合の形成を触媒する酵素の存在下で、形成された任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端アルキルエステルを、アミノ酸Ｃ−末端カルボキシアミドまたはオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドと反応させて、任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドを形成するステップと、
    を含む、オリゴペプチドの調製方法。
12. 所望のアミノ酸配列を有する任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドが得られるまで、前記ステップｂ）およびｃ）が繰り返される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記ステップｂ）で使用される前記任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドが、ａ）ペプチド結合の形成を触媒する酵素の存在下で、任意でＮ−末端保護されたアミノ酸Ｃ−末端アルキルエステルまたは任意でＮ−末端保護されたオリゴペプチドＣ−末端アルキルエステルを、アミノ酸Ｃ−末端カルボキシアミドまたはオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドと反応させるステップによって調製される、請求項１１または１２に記載の方法。
14. ｄ）Ｃ−末端部において、および／またはＮ−末端部において、および／または（少なくとも１つのアミノ酸側鎖の保護基が存在する場合には）アミノ酸側鎖の少なくとも１つにおいて、所望のアミノ酸配列を有する前記任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドを脱保護するステップ、および／または
    ｅ）前記保護されたまたは無保護のオリゴペプチドを回収するステップ
    をさらに含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. Ｎ−末端保護基が酵素的に導入および／または除去される、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドのＣ−末端部が、ペプチドアミダーゼの存在下、４０重量％以下のアルキルアルコールを含有する水溶液中で、前記任意でＮ−保護されたオリゴペプチドＣ−末端カルボキシアミドから対応するＣ−末端カルボン酸への転化によって脱保護される、請求項１４に記載の方法。