JP4856184B2 - オリゴペプチドアミドからオリゴペプチドアルキルエステルへの酵素転化 - Google Patents
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Description
の化合物によって表すことができ、式中、PはHまたはN−末端保護基を表し、nは少なくとも2の整数であり、mは少なくとも1の全ての整数を表すがn以下であり、RmAおよびRmBはそれぞれ独立してHまたはアミノ酸側鎖を表し、Rは任意で置換されたアルキル基を表す。
の化合物で表され、式中、PはHまたはN−末端保護基を表し、nは少なくとも2の整数であり、mは少なくとも1の全ての整数を表すがn以下であり、RmAおよびRmBはそれぞれ独立してHまたはアミノ酸側鎖を表す。
b)本発明の第1の態様に従って、ペプチドアミダーゼの存在下で、任意でN−保護されたオリゴペプチドC−末端カルボキシアミドをアルキルアルコールと反応させるステップと、
c)ペプチド結合の形成を触媒する酵素の存在下で、形成された任意でN−保護されたオリゴペプチドC−末端アルキルエステルをアミノ酸C−末端カルボキシアミドまたはオリゴペプチドC−末端カルボキシアミドと反応させて、任意でN−保護されたオリゴペプチドC−末端カルボキシアミドを形成するステップと
を含む、オリゴペプチドの調製方法を提供する。
b)本発明の第1の態様に従って、ペプチドアミダーゼの存在下で、任意でN−保護されたオリゴペプチドC−末端カルボキシアミドをアルキルアルコールと反応させるステップと、
c)ペプチド結合の形成を触媒する酵素の存在下で、形成された任意でN−保護されたオリゴペプチドC−末端アルキルエステルをアミノ酸C−末端カルボキシアミドまたはオリゴペプチドC−末端カルボキシアミドと反応させて、任意でN−保護されたオリゴペプチドC−末端カルボキシアミドを形成するステップと
を含むオリゴペプチドの合成方法であって、
所望のアミノ酸配列を有する任意でN−保護されたオリゴペプチドC−末端カルボキシアミドが得られるまでステップb)およびc)が繰り返される方法にも関する。
a)ペプチド結合の形成を触媒する酵素の存在下で、任意でN−末端保護されたアミノ酸C−末端アルキルエステルまたは任意でN−末端保護されたオリゴペプチドC−末端アルキルエステルをアミノ酸C−末端カルボキシアミドまたはオリゴペプチドC−末端カルボキシアミドと反応させるステップと、
b)本発明の第1の態様に従って、ペプチドアミダーゼの存在下で、形成された任意でN−保護されたオリゴペプチドC−末端カルボキシアミドをアルキルアルコールと反応させるステップと、
c)ペプチド結合の形成を触媒する酵素の存在下で、形成された任意でN−保護されたオリゴペプチドC−末端アルキルエステルをアミノ酸C−末端カルボキシアミドまたはオリゴペプチドC−末端カルボキシアミドと反応させて、任意でN−保護されたオリゴペプチドC−末端カルボキシアミドを形成するステップと、
を含むオリゴペプチドの調製方法であって、
所望のアミノ酸配列を有する任意でN−保護されたオリゴペプチドC−末端カルボキシアミドが得られるまでステップb)およびc)が繰り返され得る方法にも関する。
[材料]
フラベドからのペプチドアミダーゼ(「PAF」と呼ばれる)は、フルカ(Fluka)から入手し、そのまま使用した(Z−Gly−Tyr−NH2からZ−Gly−Tyr−OHへの脱アミドにおける活性:2.4U/mL)。凍結乾燥PAFを使用する場合には、セントリー・フリーズ−モバイル(Sentry Freeze−Mobile)125(G−25)を用いて5mLの市販のPAF溶液を凍結乾燥し、30U/gの活性を有し、カール−フィッシャー滴定で決定した2.5重量%の水を含有する0.40gの固体PAFを得た。ステノトロホモナス(以前は「キサントモナス」として知られる)マルトフィリアからの微生物ペプチドアミダーゼ(「PAM」と呼ばれる)は、Juelich Fine Chemicals(独国ユーリッヒ)から入手し、そのまま使用した(Z−Gly−Tyr−NH2からZ−Gly−Tyr−OHへの脱アミドにおける活性:2.87U/mL)。PAFおよびPAMの酵素活性は、実施例1Aに記載されるようにHPLC法を用いてZ−Gly−Tyr−OHへの転化を監視することによって、5体積%のDMFを含有する50mMのTris/HCl緩衝水溶液(pH=7.5)中でZ−Gly−Tyr−NH2の加水分解により30℃で検定した。
3.2gのMeOH中の1(15mg、0.04mmol)の溶液に、250μLのフラベドからのペプチドアミダーゼ(PAF、2.4U/mL)およびMgHPO4(35mg、0.2mmol、5当量)を30℃で添加した。この温度で186時間反応混合物を攪拌し、24時間の間隔で新たな量のPAF(250μL)を添加しながら、HPLCで監視した(以下を参照)。転化の経過は表1に示される。66時間後、アミド1からエステル2への転化は最大であった(41%)。その時点で、10%の酸3も形成されている。
0.1%のHCOOH水およびアセトニトリル(1.0mL/分、40℃)のグラジエントを用いて、オルテック(Alltech)からのプリベイル(Prevail)カラム(250×内径4.6mm、5μm)における逆相HPLCにより1から2および3への転化を監視した。t=0において15体積%のアセトニトリルを用い、8分間で74.5体積%まで増大させ、7分間74.5体積%に維持した。15.1分の時点で、グラジエントプロファイルは開始条件に戻った。総分析時間は22分であった。注入体積は5μLであり、検出は分光光度計を用いてUV254および270nmで実施した。1、3および2の保持時間は、それぞれ5.9、9.8および25.4分であった。
3.2gのMeOH中の1(15mg、0.04mmol)の溶液に、830μLのフラベドからのペプチドアミダーゼ(PAF、2.4U/mL)およびMgHPO4(35mg、0.2mmol、5当量)を30℃で添加した。反応をHPLC(実施例1Aに記載したものと同じ方法を用いる)で監視し、24時間および40時間の両方の時点の1からエステル2への転化は14%、酸3への転化は0.2%であることが示された。
3.2gのMeOH中の1(15mg、0.04mmol)の溶液に、250μLのフラベドからのペプチドアミダーゼ(PAF、2.4U/mL)およびMgHPO4(35mg、0.2mmol、5当量)を30℃で添加した。反応混合物をこの温度で15日間攪拌し、1日の間隔で新たな量のPAF(250μL)を添加しながら、HPLC(実施例1Aを参照)で監視した。転化の経過は表2に示される。明らかに、15日後に、1はほとんど完全に2(30%)および3(60%)に転化した。
3.16gのMeOH中の1(15mg、0.04mmol)の溶液に、249μLのフラベドからのペプチドアミダーゼ(PAF、2.4U/mL)および特定の量の添加剤(表3を参照)を添加した。反応混合物を30℃で24時間攪拌した後、一定分量を取り出し、実施例1Aに記載したものと同じHPLC法を用いてHPLCで分析した。形成されたエステル2の量は表3で与えられる。
溶液の総体積が4mLであるMeOHおよび特定の量の脱塩水またはTris/HCl緩衝液(pH=7.5、5重量%のDMFを含有)中の1(15mg、0.04mmol)の溶液(以下の表を参照)に、特定の量(以下の表を参照)の凍結乾燥したフラベドからのペプチドアミダーゼ(PAF、30U/g)を添加し、場合によっては(表4を参照)、続いて34.9mg(0.2mmol、5当量)のMgHPO4を添加した。得られた反応混合物を30℃で24時間攪拌し、一定分量を取り出し、実施例1Aに記載したものと同じHPLC法を用いてHPLCで分析した。形成されたエステル2および酸3の量は表4で与えられる。
100.0gのGlyOMe.HCl(4、0.796mol)および108.4gのフェニル酢酸(5、0.796mol)を500mLの水中に懸濁させた。83.3mLの32重量%のNaOHの添加によりpHを6.3に調整した。得られた溶液に、48gの固定化assemblaseを添加し、反応混合物を20℃で16時間攪拌した。得られたスラリーを0℃まで冷却し、その温度で1時間攪拌し、生成物PhAc−GlyOMe(6)および固定化assemblaseをろ過により単離した。固体材料をEtOAc(500mL)中でスラリー状にし、固定化assemblaseをろ過して除去した。EtOAc層を乾燥させ(Na2SO4)、真空中で濃縮し、100.0g(0.483mol)の6(4に基づいて61%)を得た。
640gのt−ブタノール中の54.6g(0.264mol)のPhAc−GIy−OMe(6)の溶液に、61.8g(0.343mol、1.30当量)のL−Tyr−NH2(7)を添加した。得られたスラリーに、8mLのアルカラーゼ溶液に基づいた乾燥アルカラーゼを添加し、24時間の間隔で同量のアルカラーゼを添加しながら反応混合物を35℃で160時間攪拌した。160時間後、反応混合物から一定分量を取り出し、HPLCにより分析した(以下を参照)。6からPhAc−Gly−Tyr−NH2(8)への転化は60%であり、副産物PhAc−GIy−OHへの加水分解は10%であった。反応混合物を真空中で濃縮し、残渣を100mLのEtOAcおよび100mLの水の間で分配し、水相のpHを3.0に調整した(12NのHCl水を用いて)。激しく攪拌した後、8が結晶化し、ろ過により単離した。得られた母液の相分離の後、EtOAc層をpH3.0の別の100mLの水と共に攪拌した。この結果、8の別の部分の結晶化が起こり、これをろ過により単離した。得られた母液のうち、EtOAc層をpH7.5(1NのNaOH水で調整)の別の100mLの水と共に攪拌した。8の別の部分の結晶化がもたらされ、これもろ過により単離した。全部で30.0g(0.084mol)の8(6を基準として32%の収率)が得られた。
40℃で100mMのHClO4水(pH1.0)およびアセトニトリル(1.0ml/分)のグラジエントを用いて、オルテックからのプリベイルカラム(250×内径4.6mm、5μm)における逆相HPLCによって6および7の8へのカップリングを監視した。t=0分において、25体積%のアセトニトリルを用い、8分間で70体積%まで増大させ、2分間70体積%に維持した。10.1分の時点で、グラジエントプロファイルは開始条件に戻った。総分析時間は16分であった。注入体積は5μlであり、検出は分光光度計を用いてUV220nmで実施した。7、PhAc−GIy−OH、8および6の保持時間は、それぞれ2.9、4.9、5.3および5.9分であった。
1050gのMeOH中の5g(14mmol)のPhAc−Gly−Tyr−NH2(8)の溶液に、30℃の83mLのフラベドからのペプチドアミダーゼ(PAF、2.4U/mL)および11.7g(67mmol)のMgHPO4を添加した。24時間ごとに83mLの新しい酵素を添加した。反応の経過をHPLCで監視した(以下を参照)。攪拌の140時間後、8から10への転化は40%であり、加水分解による8からPhAc−Gly−Tyr−OH(9)への転化は60%であった。メタノールを蒸発させ、pH=7で残渣を50mLのEtOAcおよび50mLの水の間で分配し、pH=7でEtOAc層を別の50mLの水で洗浄し、続いて、乾燥(Na2SO4)させてEtOAc層を真空中で濃縮することにより所望のエステル10が単離され得る。これにより、1.9gの10(5.14mmol、8を基準として37%の収率)が得られた。
実施例1Aに記載されるものと同じ逆相HPLC法によって8から10への転化を監視した。8、9および10の保持時間は、それぞれ6.9、7.8および8.9分であった。
5体積%のDMFを含有する4.2Lの50mMのTris/HCl緩衝水溶液(pH=7.5)中の15g(42mmol)のPhAc−Gly−Tyr−NH2(8)の懸濁液に、87.6mLのフラベドからのペプチドアミダーゼ(PAF、2.4U/mL)を添加し、反応混合物を30℃で24時間攪拌した。反応混合物から一定分量を取り出し、HPLCによって分析し(以下を参照)、8から9への転化は100%であると示された。反応混合物を真空中で500mLまで濃縮し、pHを1.0にした(32重量%のHCl水を用いて)。酢酸エチルによる抽出(3×300mL)の後、合わせた有機相を乾燥させ(Na2SO4)、真空中で濃縮して、10.8g(30mmol)の9(8を基準として72%)および8.8g(0.12mol)のDMFを含有する残渣を得た。
実施例1Aに記載されるものと同じ逆相HPLC法によって8から9への転化を監視した。8および9の保持時間は、それぞれ6.9および7.8分であった。
15.6gのt−BuOH中の3.5g(9.5mmol)のPhAc−Gly−Tyr−OMe(10)および4.65g(28.3mmol)のL−Phe−NH2(11)の溶液に、3mLのアルカラーゼ溶液に基づく乾燥アルカラーゼを添加し、反応混合物を35℃で攪拌した。24時間後、8gのt−BuOHを添加して、攪拌性(stirrability)を増大させた。40時間後、反応混合物から一定分量を取り出し、HPLCで分析し(以下を参照)、10の62%がPhAc−Gly−Tyr−Phe−NH2(12)に転化し、38%が加水分解生成物PhAc−Gly−Tyr−OHに転化したことが示された。反応混合物を真空中で濃縮し、残渣を30gの水および45gのEtOAcの間で分配した。EtOAc層をpH3の10gの水で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)真空中で濃縮されて、2.5g(5.0mmol)の純粋な12(10を基準として53%)が得られた。
実施例1Aに記載されるものと同じ逆相HPLC法によって、12を形成するための10と11とのカップリングを監視した。11、PhAc−Gly−Tyr−OH、10および12の保持時間は、それぞれ3.4、7.8、8.9および9.1分であった。
5体積%のDMFを含有する200mLの50mMのTris/HCl緩衝水溶液(pH=7.5)中の1.0g(2.0mmol)のPhAc−Gly−Tyr−Phe−NH2(12)の懸濁液に、1mLのステノトロホモナス・マルトフィリアからのペプチドアミダーゼ(PAM、2.87U/mL)を添加し、反応混合物を30℃で攪拌した。24時間後、反応混合物から一定分量を取り出し、HPLCで分析し(以下を参照)、PhAc−Gly−Tyr−Phe−OH(13)への転化が100%であることが示された。混合物を真空中で濃縮し、pH1.0において残渣を23gのEtOAcおよび25gの水の間で分配した。激しく攪拌した後、13が結晶化し、これをろ過により単離した。水層を20gのEtOAcでもう一度抽出し、合わせたEtOAc相を乾燥させ(Na2SO4)、真空中で濃縮して、無色のオイルが得られた。pH1.0においてオイルを25gのCH2Cl2および25gの水の間で分配した。CH2Cl2層をpH1.0で25gの水で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、真空中で濃縮して、13の別の収穫物が白色固体として得られた。13の総収量は0.6g(1.2mmol、12を基準として60%)であった。
実施例1Aに記載されるものと同じ逆相HPLC法によって12から13への加水分解を監視した。12および13の保持時間は、それぞれ9.1および9.3分であった。
pH9.0の10mLの0.1MのTAPS(トリス(ヒドロキシメチル)メチル−3−アミノプロパンスルホン酸)緩衝水溶液中の50mg(0.1mmol)のPhAc−Gly−Tyr−Phe−OH(13)の溶液に、50mgの固定化セパラーゼを添加した。30分後、反応混合物から一定分量を取り出し、HPLCにより分析し(以下を参照)、13から14への転化が100%であることが示された。酵素をろ過して除去し、反応混合物を真空中で完全に乾燥するまで濃縮した。残渣は、所望のトリペプチド14をそのフェニル酢酸5との塩として含有した。
実施例1Aに記載されるものと同じ逆相HPLC法によって13から14への加水分解を監視した。14および13の保持時間は、それぞれ6.6および9.3分であった。
Claims (16)
- 任意でN−保護されたオリゴペプチドアルキルエステルの調製方法であって、
b)ペプチドアミダーゼの存在下で、対応する任意でN−保護されたオリゴペプチドC−末端カルボキシアミドをアルキルアルコールと反応させるステップを含む方法。 - 前記ペプチドアミダーゼが、柑橘果実のフラベドに由来する、請求項1に記載の方法。
- 前記ペプチドアミダーゼが、オレンジのフラベドに由来する、請求項2に記載の方法。
- 前記アルキルアルコールがメタノールである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 0.5〜50体積%の間の水濃度を有する反応媒体中で実施される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記反応媒体から、遊離NH3の少なくとも50%が除去される、請求項5に記載の方法。
- 前記NH3が、NH3と錯体を形成する化合物の添加によって除去される、請求項6に記載の方法。
- NH3と錯体を形成する前記化合物が、MgHPO4、Al2O3またはK2SO4である、請求項7に記載の方法。
- 前記ペプチドアミダーゼが、2回以上に分けて時間をかけて前記反応媒体に添加される、請求項5〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法を含むオリゴペプチドの調製方法。
- 以下のステップ:
b)請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法に従って、ペプチドアミダーゼの存在下で、任意でN−保護されたオリゴペプチドC−末端カルボキシアミドをアルキルアルコールと反応させるステップと、
c)ペプチド結合の形成を触媒する酵素の存在下で、形成された任意でN−保護されたオリゴペプチドC−末端アルキルエステルを、アミノ酸C−末端カルボキシアミドまたはオリゴペプチドC−末端カルボキシアミドと反応させて、任意でN−保護されたオリゴペプチドC−末端カルボキシアミドを形成するステップと、
を含む、オリゴペプチドの調製方法。 - 所望のアミノ酸配列を有する任意でN−保護されたオリゴペプチドC−末端カルボキシアミドが得られるまで、前記ステップb)およびc)が繰り返される、請求項11に記載の方法。
- 前記ステップb)で使用される前記任意でN−保護されたオリゴペプチドC−末端カルボキシアミドが、a)ペプチド結合の形成を触媒する酵素の存在下で、任意でN−末端保護されたアミノ酸C−末端アルキルエステルまたは任意でN−末端保護されたオリゴペプチドC−末端アルキルエステルを、アミノ酸C−末端カルボキシアミドまたはオリゴペプチドC−末端カルボキシアミドと反応させるステップによって調製される、請求項11または12に記載の方法。
- d)C−末端部において、および/またはN−末端部において、および/または(少なくとも1つのアミノ酸側鎖の保護基が存在する場合には)アミノ酸側鎖の少なくとも1つにおいて、所望のアミノ酸配列を有する前記任意でN−保護されたオリゴペプチドC−末端カルボキシアミドを脱保護するステップ、および/または
e)前記保護されたまたは無保護のオリゴペプチドを回収するステップ
をさらに含む、請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。 - N−末端保護基が酵素的に導入および/または除去される、請求項11〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記任意でN−保護されたオリゴペプチドC−末端カルボキシアミドのC−末端部が、ペプチドアミダーゼの存在下、40重量%以下のアルキルアルコールを含有する水溶液中で、前記任意でN−保護されたオリゴペプチドC−末端カルボキシアミドから対応するC−末端カルボン酸への転化によって脱保護される、請求項14に記載の方法。
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