ES2337374T3 - Portadores de vacunas de adenovirus de chimpance. - Google Patents

Portadores de vacunas de adenovirus de chimpance. Download PDF

Info

Publication number
ES2337374T3
ES2337374T3 ES05701091T ES05701091T ES2337374T3 ES 2337374 T3 ES2337374 T3 ES 2337374T3 ES 05701091 T ES05701091 T ES 05701091T ES 05701091 T ES05701091 T ES 05701091T ES 2337374 T3 ES2337374 T3 ES 2337374T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
baselineskip
seq
chad
hskip0
adenoviral
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES05701091T
Other languages
English (en)
Inventor
Agostino Cirillo
Stefano Colloca
Bruno Bruni Ercole
Annalisa Meola
Alfredo Nicosia
Elisabetta Sporeno
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P Angeletti SpA
Original Assignee
Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P Angeletti SpA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P Angeletti SpA filed Critical Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P Angeletti SpA
Application granted granted Critical
Publication of ES2337374T3 publication Critical patent/ES2337374T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/10362—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Secuencia de ácido nucleico de chimpancé aislada seleccionada de entre el grupo constituido por: a) SEC ID nº 1; y b) una secuencia de ácido nucleico complementaria a la secuencia de (a).

Description

Portadores de vacunas de adenovirus de chimpancé.
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de vectores recombinantes y más específicamente a la producción y a la utilización de vectores adenovirales de chimpancé de replicación defectuosa recombinantes para producir respuestas inmunitarias en huéspedes mamíferos.
Antecedentes de la invención
Los adenovirus (Ad) comprenden una gran familia de virus de ADN bicatenario que se encuentran en anfibios, aves y mamíferos que presentan una estructura de cápside icosaédrica sin envuelta (Straus, Adenovirus infections in humans. En The Adenoviruses. 451-498, 1984; Hierholzer et al., J. Infect. Dis., 158: 804-813, 1988; Schnurr y Dondero, Intervirology., 36: 79-83, 1993; Jong et al., J Clin Microbiol., 37:3940-3945:1999). A diferencia de los retrovirus, los adenovirus pueden transducir numerosos tipos de células de varias especies de mamíferos, incluyendo tanto células que se dividen como células que no se dividen, sin integrarse en el genoma de la célula huésped.
En términos generales, el ADN adenoviral es normalmente muy estable y permanece episómico (es decir, extracromosómico), a menos que se haya producido transformación o tumorigénesis. Además, los vectores adenovirales pueden propagarse con altos rendimientos en sistemas de producción bien definidos que son fácilmente susceptibles de producción a escala farmacéutica de composiciones de calidad clínica. Estas características y su genética molecular bien caracterizada les hace buenos candidatos para vectores adenovirales recombinantes para su utilización como portadores de vacunas. Normalmente, la producción de vectores adenovirales recombinantes se basa en la utilización de una línea celular de empaquetamiento que puede complementar las funciones de los productos génicos adenovirales que o bien se han delecionado o bien se han modificado mediante ingeniería genética para que no sean
funcionales.
En la actualidad, se utilizan ampliamente dos serotipos de adenovirus del subgrupo C humano bien caracterizados (es decir, hAd2 y hAd5) como fuentes de la estructura principal del virus para la mayoría de los vectores adenovirales que se utilizan para terapia génica. También se han sometido a prueba vectores adenovirales humanos de replicación defectuosa como portadores de vacuna para el suministro de una variedad de inmunógenos derivados de una variedad de agentes infecciosos (por ejemplo, virus, parásitos o patógenos bacterianos) y células tumorales, incluyendo antígenos asociados a tumor (TAA). Estudios realizados en animales experimentales (por ejemplo, roedores, perros y primates no humanos) indican que los vectores adenovirales humanos de replicación defectuosa recombinantes que portan transgenes que codifican para inmunógenos derivados de las oncoproteínas E6 y E7 del virus del papiloma humano (VPH-16) (He, Z et al., (2001) Virology, 270:3583-3590, la glicoproteína del virus de la rabia (Xiang, Z. et al (1996) Virology, 219:220-227), la proteína del circumsporozoíto de Plasmodium falciparum (Rodriguez, E. et al. (1997) J. Immunol. 158:1268-1274) así como otros antígenos heterólogos producen respuestas inmunitarias tanto humorales como mediadas por células contra el producto transgénico. En términos generales, los investigadores han notificado el éxito en la utilización de vectores adenovirales humanos como portadores de vacuna en sistemas experimentales no humanos o bien utilizando protocolos de inmunización que utilizan altas dosis de vectores adenovirales recombinantes que se pronostica que producen respuestas inmunitarias; o bien utilizando protocolos de inmunización que emplean la administración secuencial de vectores adenovirales que se derivan de diferentes serotipos pero que portan el mismo producto transgénico como inmunizaciones de refuerzo (Mastrangeli, et al., Human Gene Therapy, 7: 79-87 (1996).
Sin embargo, se pronostica que los portadores de vacuna derivados de serotipos humanos ubicuos, tales como los tipos 2 y 5, se encontrarán con una inmunidad humoral y celular preexistente en la población humana. Por tanto, aunque se han empleado con éxito adenovirus humanos recombinantes de replicación defectuosa como portadores de vacuna en sistemas experimentales que emplean huéspedes roedores, caninos y primates no humanos; se espera que la inmunidad adaptativa e innata humana limite significativamente la utilidad de estos serotipos como portadores de vacuna. Estas expectativas se basan en el hecho de que la infección adenoviral de subgrupo C, que incluye el tipo 2 y el tipo 5, es endémica en la población humana. Como consecuencia, en la mayoría de los seres humanos se produce seroconversión en los primeros cinco años de vida como resultado de una infección natural. Por tanto, los vectores derivados de virus que infectan de manera natural y se replican en seres humanos pueden no ser candidatos óptimos para su utilización como portadores de vacuna.
Otro problema asociado con la utilización de vectores derivados de adenovirus humanos es el riesgo de que el procedimiento de producción utilizado para propagar los virus recombinantes dé lugar a reservas de vectores que se contaminan con adenovirus de replicación competente (RCA). Esto está provocado por la recombinación homóloga entre secuencias solapantes del vector recombinante y los genes adenovirales que están presentes en las líneas celulares auxiliares de complementación de E1 tales como células 293 humanas (Graham, F.L. et al, (1977) J. Gen. Virol. 36:59-72.). La presencia de RCA en reservas de vectores preparados para su utilización en ensayos clínicos constituye un riesgo de seguridad porque puede promover la movilización y propagación del virus de replicación defectuosa. La propagación del virus defectuoso puede agravar la respuesta inmunitaria del huésped y provocar otras consecuencias inmunopatológicas adversas (Fallux, F. J., et al. Human Gene Therapy 9: 1909-1917 (1998). Por consiguiente, la Food and Drug Administration (FDA) y otros organismos reguladores han promulgado directrices que establecen límites sobre los niveles de RCA que pueden estar presentes en preparaciones de vectores destinadas a utilización clínica. El intento de imponer límites de RCA es para garantizar una exposición limitada de los pacientes a adenovirus en replicación en composiciones que se utilizan en ensayos clínicos.
Por tanto, sigue habiendo una necesidad del desarrollo de portadores de vacuna adenovirales que sean adecuados para su utilización en huéspedes mamíferos que sean: fáciles de manipular, susceptibles de producción a escala farmacéutica y almacenamiento a largo plazo, que puedan replicarse a alto nivel en líneas celulares de complementación humanas, sumamente inmunógenos, que carezcan de epítopos de células B neutralizantes que reaccionen de manera cruzada con los serotipos comunes de adenovirus humanos, que cumplan con las normas de seguridad de RCA promulgadas por agencias reguladoras y que sean susceptibles de utilización en protocolos de sensibilización/refuerzo que sean adecuados para su utilización en seres humanos.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a vectores de adenovirus de replicación defectuosa derivados de adenovirus ChAd3 de chimpancé (SEC ID nº 1) y a procedimientos para generar dichos vectores adenovirales de chimpancé en líneas celulares que expresan E1 humano. La invención también proporciona procedimientos para generar reservas de vectores de calidad clínica adecuados para su utilización en seres humanos y medios para utilizar los vectores dados a conocer como portadores de vacuna para producir respuestas inmunitarias protectoras y/o terapéuticas. La invención proporciona además procedimientos para utilizar los adenovirus recombinantes de la invención para preparar composiciones de vacunas diseñadas para suministrar, y dirigir la expresión de, transgenes que codifican para inmunógenos. En una forma de realización, la invención contempla la utilización de los vectores dados a conocer como portadores de vacuna para la administración de vacunas que comprenden transgenes que codifican para inmunógenos derivados de un agente infeccioso. En una segunda forma de realización, la invención contempla la utilización de los vectores dados a conocer para preparar y administrar vacunas contra el cáncer. En una forma de realización particular, la invención contempla la preparación y administración de una vacuna contra el cáncer que comprende un transgén que codifica para un TAA.
Se dan a conocer en la presente memoria las secuencias genómicas completas de cinco adenovirus de chimpancé (ChAd), denominadas en la presente memoria ChAd3 (SEC ID nº 1) (figuras 5A-5K), ChAd6 (SEC ID nº 2) (figuras 6A-6K, CV32 (SEC ID nº 3) (figuras 7A-7K), CV33 (SEC ID nº 4) (figuras 8A-8K) y CV23 (SEC ID nº 5) (figuras 9A-9J). Sin embargo, se busca protección sólo para ChAd3 y vectores, células huésped y procedimientos derivados del mismo, tal como se define mediante las reivindicaciones adjuntas a la presente memoria.
ChAd3 y ChAd6 representan adenovirus novedosos aislados según los procedimientos dados a conocer en la presente memoria. Los genomas de ChAd3 y ChAd6 presentan 37741 y 36648 pares de bases de longitud, respectivamente. El gen de hexones de ChAd3 (SEC ID nº 41) comprende los nucleótidos (nt) 19086-21965 de SEC ID nº 1 (excluido el codón de terminación) y el gen de fibras de ChAd3 (SEC ID nº 42) comprende los nt 32805-34487 de SEC ID nº 1 (excluido el codón de terminación). El gen de hexones de ChAd6 comprende los nt 18266-21124 (SEC ID nº 43) de SEC ID nº 2 (excluido el codón de terminación) y su gen de fibras (SEC ID nº 44) comprende los nt 32218-33552 de SEC ID nº 2 (excluido el codón de terminación). Basándose en la homología de secuencia deducida a partir de una alineación de secuencias múltiples de péptidos hexones de longitud completa, se ha clasificado ChAd3 en el subgrupo C humano y se ha clasificado ChAd6 en el subgrupo E humano.
Los genomas de los adenovirus CV32, CV33 y CV23 presentan 36.606, 36.535 y 32.020 pares de bases de longitud, respectivamente. Se ha determinado que CV32 (Pan 6) (ATCC N. VR-592), CV33 (Pan 7) (ATCC N. VR-593) y CV23 (Pan 5) (Esoterix Inc.,) están relacionados todos con Ad4 humano (hAd4) (subgrupo E) (Wigand, R et al. Intervirology 1989, 30:1-9). Sin embargo, basándose en la alineación de secuencias de hexones, se ha caracterizado posteriormente que CV32 es más estrechamente análogo a los miembros del subgrupo D humano que a hAd4.
También se dan a conocer, aunque no forman parte de la invención, secuencias de nucleótidos para los genes de fibras y hexones de 21 adenovirus de chimpancé adicionales (ChAd20, ChAd4, ChAd5, ChAd7, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd8, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 y ChAd82) aislados según los procedimientos dados a conocer en la presente memoria.
Las secuencias de nucleótidos de los genes de fibras para ChAd20, ChAd4, ChAd5, ChAd7, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19 se exponen en las figuras 10-19, respectivamente, y se denominan en la presente memoria SEQ ID NOS: 6-15: (SEC ID nº 6, ChAd20); (SEC ID nº 7, ChAd4); (SEC ID nº 8, ChAd5); (SEC ID nº 9, ChAd7); (SEC ID nº 10, ChAd9); (SEC ID nº 11, ChAd10); (SEC ID nº 12, ChAd11); (SEC ID nº 13, ChAd16) (SEC ID nº 14, ChAd17) y (SEC ID nº 15, ChAd19).
Las secuencias de nucleótidos de los genes de fibras para ChAd8, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 y ChAd82 se denominan en la presente memoria: (SEC ID nº 58, ChAd8), (SEC ID nº 60, ChAd22), (SEC ID nº 62, ChAd24), (SEC ID nº 64, ChAd26), (SEC ID nº 66, ChAd30), (SEC ID nº 68, ChAd31), (SEC ID nº 70, ChAd37), (SEC ID nº 72, ChAd38), (SEC ID nº 74, ChAd44), (SEC ID nº 76, ChAd63) y (SEC ID nº 78, ChAd82) y se exponen en la lista de secuencias.
Las secuencias de nucleótidos de los genes de hexones para ChAd20, ChAd4, ChAd5, ChAd7, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19 se exponen en las figuras 21-30, respectivamente, y se denominan en la presente memoria SEQ ID NOS: 16-25: (SEC ID nº 16, ChAd20); (SEC ID nº 17, ChAd4); (SEC ID nº 18, ChAd5); (SEC ID nº 19, ChAd7); (SEC ID nº 20, ChAd9); (SEC ID nº 21, ChAd10); (SEC ID nº 22, ChAd11); (SEC ID nº 23, ChAd16); (SEC ID nº 24, ChAd17) y (SEC ID nº 25, ChAd19).
Las secuencias de nucleótidos de los genes de hexones para ChAd8, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30,
ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 y ChAd82 se denominan en la presente memoria: (SEC ID nº 97, ChAd8), (SEC ID nº 99, ChAd22), (SEC ID nº 101, ChAd24), (SEC ID nº 103, ChAd26), (SEC ID nº 105, ChAd30), (SEC ID nº 107, ChAd31), (SEC ID nº 109, ChAd37), (SEC ID nº 111, ChAd38), (SEC ID nº 113, ChAd44), (SEC ID nº 115, ChAd63) y (SEC ID nº 117, ChAd82) y se exponen en la lista de secuencias.
También se dan a conocer secuencias de aminoácidos para las proteínas de fibras y hexones de 21 adenovirus de chimpancé adicionales (ChAd20, ChAd4, ChAd5, ChAd7, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd8, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 y ChAd82) aisladas según los procedimientos dados a conocer en la presente memoria.
Las proteínas de fibras que se dan a conocer se denominan: (SEC ID nº 83, ChAd3), (SEC ID nº 84, ChAd6), (SEC ID nº 48, ChAd20), (SEC ID nº 49, ChAd4), (SEC ID nº 50, ChAd5), (SEC ID nº 51, ChAd7), (SEC ID nº 52, ChAd9), (SEC ID nº 53, ChAd10), (SEC ID nº 54, ChAd11), (SEC ID nº 55, ChAd16), (SEC ID nº 56, ChAd17), (SEC ID nº 57, ChAd19), (SEC ID nº 59, ChAd8), (SEC ID nº 61, ChAd22), (SEC ID nº 63, ChAd24), (SEC ID nº 65, ChAd26), (SEC ID nº 67, ChAd30), (SEC ID nº 69, ChAd31), (SEC ID nº 71, ChAd37), (SEC ID nº 73, ChAd38), (SEC ID nº 75, ChAd44), (SEC ID nº 77, ChAd63) y (SEC ID nº 79, ChAd82). Las figuras 20A-20G proporcionan una alineación que compara las secuencias de aminoácidos de las proteínas de fibras dadas a conocer y reivindicadas en la presente memoria con las secuencias de aminoácidos de las proteínas de fibras de: C1 (SEC ID nº 85), CV68 (SEC ID nº 86), Pan5 (denominado alternativamente CV23) (SEC ID nº 80), Pan6 (denominado alternativamente CV32) (SEC ID nº 81) y Pan7 (denominado alternativamente CV33) (SEC ID nº 82).
Las proteínas de hexones que se dan a conocer se denominan: (SEC ID nº 122, ChAd3), (SEC ID nº 123, ChAd6), (SEC ID nº 87, ChAd20), (SEC ID nº 88, ChAd4), (SEC ID nº 89, ChAd5), (SEC ID nº 90, ChAd7), (SEC ID nº 91, ChAd9), (SEC ID nº 92, ChAd10), (SEC ID nº 93, ChAd11), (SEC ID nº 94, ChAd16), (SEC ID nº 95, ChAd17), (SEC ID nº 96, ChAd19), (SEC ID nº 98, ChAd8), (SEC ID nº 100, ChAd22), (SEC ID nº 102, ChAd24), (SEC ID nº 104, ChAd26), (SEC ID nº 106, ChAd30), (SEC ID nº 108, ChAd31), (SEC ID nº 110, ChAd37), (SEC ID nº 112, ChAd38), (SEC ID nº 114, ChAd44), (SEC ID nº 116, ChAd63) y (SEC ID nº 118, ChAd82). Las figuras 31A-31J proporcionan una comparación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas de hexones dadas a conocer y reivindicadas en la presente memoria con las secuencias de aminoácidos de las proteínas de hexones de: C1 (SEC ID nº 124), CV68 (SEC ID nº 125), Pan5 (denominado alternativamente CV23) (SEC ID nº 119), Pan6 (denominado alternativamente CV32) (SEC ID nº 120) y Pan7 (denominado alternativamente CV33) (SEC ID nº 121). Una alineación de secuencias múltiples de proteínas de hexones permite al experto en la materia realizar un análisis filogenético de esto que es consecuente con la clasificación 
\hbox{propuesta de
serotipos adenovirales humanos (Rux, J.J.,  et al   (2003) J.
Virol. 77:9553-9566).}
También se dan a conocer 21 aislados de adenovirus de chimpancé adicionales. Las muestran que comprenden ChAd20, ChAd4, ChAd5, ChAd7, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17 y ChAd19 se depositaron el 12 de diciembre de 2003 en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, Reino Unido) como depósito original según el Tratado de Budapest. Se asignaron a los depósitos números de registro: 03121201 (ChAd4), 03121202 (ChAd5), 03121203 (ChAd7), 03121204 (ChAd9), 03121205 (ChAd10), 03121206 (ChAd11), 03121207 (ChAd16), 03121208 (ChAd17), 03121209 (ChAd19) y 03121210 (ChAd20).
Las muestras que comprenden ChAd8, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38,
ChAd44, ChAd63 y ChAd82 se depositaron en la ECACC (Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, Reino Unido) como depósito original según el Tratado de Budapest el 12 de enero de 2005. Se asignaron a estos depósitos números de registro: 05011201 (ChAd8), 05011202 (ChAd22), 05011203 (ChAd24), 05011204 (ChAd26), 05011205 (ChAd30), 05011206 (ChAd31), 05011207 (ChAd37), 05011208 (ChAd38), 05011209 (ChAd44), 05011210 (ChAd63) y
05011211 (ChAd82).
Estos depósitos se mantendrán según los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los fines del Procedimiento en Materia de Patentes. Estos depósitos se realizaron simplemente para comodidad de los expertos en la materia y no son un admisión de que se requiera un depósito según la ley 35 U.S.C. \NAK112. Todas las restricciones sobre la disponibilidad al público del material depositado se eliminarán irrevocablemente, excepto para los requisitos especificados en la ley 37 C.F.R. \NAK1.808(b), sobre la concesión de una patente.
En un aspecto adicional, la invención también proporciona vectores adenovirales recombinantes de replicación defectuosa basados en Seq ID No 1 que pueden infectar células de mamífero, preferiblemente células humanas, y dirigir la expresión de producto(s) transgénico(s) codificado(s). Tal como se demuestra en la presente memoria, los vectores dados a conocer son adecuados para su utilización como portadores de vacuna para el suministro de transgenes que comprenden inmunógenos contra los que se desea una respuesta inmunitaria. En formas de realización particulares, la invención proporciona vectores adenovirales de chimpancé de replicación defectuosa recombinantes que pueden producir una replicación de alto nivel en líneas celulares que expresan E1 humano (es decir, de empaquetamiento). En una forma de realización, la invención proporciona adenovirus recombinantes que pueden replicarse en células PER.C6^{TM}.
En términos generales, los vectores recombinantes abarcados por la invención definida en las reivindicaciones proporcionan portadores de vacuna que evadirán la inmunidad preexistente frente a los serotipos de adenovirus que se encuentran normalmente en la población humana. Más específicamente, los vectores recombinantes de la invención comprenden secuencias de estructura principal de vector que se muestran en la presente memoria que carecen de epítopos B neutralizantes que reaccionan de manera cruzada con los serotipos comunes de vectores derivados de adenovirus humanos.
La invención proporciona además vectores lanzadera específicos de grupo definidos en las reivindicaciones que incluyen una parte adenoviral y una parte de plásmido, en los que dicha parte adenoviral comprende generalmente: a) extremo izquierdo viral (ITR y señal de empaquetamiento), parte del gen pIX y extremo derecho del genoma viral; y b) un casete de expresión génica. Los vectores lanzadera específicos de grupo se diseñan para aprovechar la homología de secuencia de nucleótidos que se observa entre adenovirus que se asignan al mismo subgrupo de serotipos (es decir, subgrupos A, B, C, D o E), y pueden utilizarse para manipular las secuencias de nucleótidos dadas a conocer en la presente memoria y/o para clonar otros adenovirus de chimpancé que pertenecen al mismo subgrupo generando un preplásmido de adenovirus que contiene un genoma adenoviral de chimpancé delecionado en la región E1.
Otros aspectos de la presente invención incluyen células huésped que comprenden los vectores de vacunas adenovirales y/o los vectores de preplásmido de adenovirus, procedimientos de producción de los vectores que comprenden introducir el vector de vacuna adenoviral en una célula huésped que expresa la proteína E1 adenoviral y recoger los vectores de vacunas adenovirales resultantes. En una forma de realización particular, la invención proporciona un procedimiento de producción de un vector adenoviral de chimpancé de replicación defectuosa que comprende introducir uno de los vectores adenovirales dados a conocer en una célula humana que expresa E1 adenoviral, y recoger los adenovirus recombinantes resultantes.
Otro aspecto de la invención también proporciona composiciones de vacuna definidas en las reivindicaciones que comprenden un vector adenoviral de la invención. Pueden administrarse composiciones que comprenden vectores adenovirales de chimpancé recombinantes solas o en combinación con otras vacunas de proteínas/ADN basadas en virus o no basadas en virus. También pueden administrarse como parte de un régimen de tratamiento más amplio. Estas composiciones pueden administrarse a huéspedes mamíferos, preferiblemente huéspedes humanos, en un entorno o bien profiláctico o bien terapéutico. Tal como se muestra en la presente memoria, la administración de las composiciones de vacuna dadas a conocer, o bien solas o bien en una modalidad combinada, tal como un régimen de sensibilización y refuerzo o inyecciones múltiples de vectores Ad serológicamente distintos, da como resultado la inducción de una respuesta inmunitaria en un mamífero que puede reconocer específicamente el inmunógeno codificado por el transgén.
Uno de los procedimientos dados a conocer y reivindicados en la presente memoria comprende administrar a un mamífero (que o bien no ha recibido tratamiento previo o bien está sensibilizado para que sea inmunorreactivo frente a un antígeno diana) una cantidad suficiente de un vector adenoviral de chimpancé recombinante, que contiene por lo menos una deleción funcional de su gen E1 de tipo natural, que porta una secuencia que comprende un promotor que puede dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica para el menor antígeno diana, en el que la administración del vector recombinante produce (o sensibiliza) una respuesta inmunitaria específica de antígeno.
En una forma de realización, la invención proporciona un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria (profiláctica o terapéutica) contra un agente infeccioso (por ejemplo, un patógeno viral o bacteriano o un parásito de mamíferos). En una segunda realización, la invención proporciona un procedimiento diseñado para inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero que romperá la tolerancia a un autoantígeno, tal como un TAA. Este aspecto de la invención contempla la utilización de los vectores dados a conocer como un portador de vacuna para la preparación y administración de vacunas contra el cáncer.
Aún otras ventajas y formas de realización de la presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de la invención.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un dibujo esquemático que resume la estrategia de clonación utilizada para construir un vector lanzadera de ChAd6 (pARS ChAd6-3).
La figura 2 es un dibujo esquemático que ilustra la estrategia de clonación utilizada para clonar el genoma viral de ChAd6 mediante recombinación homóloga en la cepa BJ5183 de E. coli.
La figura 3 es un dibujo esquemático que ilustra los elementos de diversos plásmidos lanzadera de ChAd6 incluyendo: pARS ChAd6-3 GAG; pARS ChAd6-3 SEAP; pARS ChAd6-3 EGFP; y pARS ChAd6-3 NS MUT.
La figura 4 es un dibujo esquemático que ilustra el esquema de recombinación homóloga utilizado para clonar los vectores de expresión ChAd6\DeltaE1.
Las figuras 5A-5K proporcionan la secuencia de nucleótidos genómica de ChAd3 (SEC ID nº 1).
Las figuras 6A-6K proporcionan la secuencia de nucleótidos genómica de ChAd6 (SEC ID nº 2).
Las figuras 7A-7K proporcionan la secuencia de nucleótidos genómica de CV32 (SEC ID nº 3).
Las figuras 8A-8K proporcionan la secuencia de nucleótidos genómica de CV33 (SEC ID nº 4).
Las figuras 9A-9J proporcionan la secuencia de nucleótidos genómica de CV23 (SEC ID nº 5).
La figura 10 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de fibras de ChAd20 (SEC ID nº 6).
La figura 11 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de fibras de ChAd4 (SEC ID nº 7).
La figura 12 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de fibras de ChAd5 (SEC ID nº 8).
La figura 13 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de fibras de ChAd7 (SEC ID nº 9).
La figura 14 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de fibras de ChAd9 (SEC ID nº 10).
La figura 15 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de fibras de ChAd10 (SEC ID nº 11).
La figura 16 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de fibras de ChAd11 (SEC ID nº 12).
La figura 17 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de fibras de ChAd16 (SEC ID nº 13).
La figura 18 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de fibras de ChAd17 (SEC ID nº 14).
La figura 19 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de fibras de ChAd19 (SEC ID nº 15).
Las figuras 20A-20G proporcionan una comparación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas de fibras de: ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8,ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17 ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 y ChAd82 con las secuencias de proteínas de fibras de referencia de C1 (SEC ID nº 85), CV68 (SEC ID nº 86), PAN5 (también denominado CV23) (SEC ID nº 80), PAN6 (también denominado CV32)-(SEC ID nº 81) y Pan7 (también denominado CV33) (SEC ID nº 82).
La figura 21 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de hexones de ChAd20 (SEC ID nº 16).
La figura 22 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de hexones de ChAd4 (SEC ID nº 17).
La figura 23 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de hexones de ChAd5 (SEC ID nº 18).
La figura 24 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de hexones de ChAd7 (SEC ID nº 19).
La figura 25 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de hexones de ChAd9 (SEC ID nº 20).
La figura 26 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de hexones de ChAd10 (SEC ID nº 21).
La figura 27 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de hexones de ChAd11 (SEC ID nº 22).
La figura 28 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de hexones de ChAd16 (SEC ID nº 23).
La figura 29 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de hexones de ChAd17 (SEC ID nº 24).
La figura 30 proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de hexones de ChAd19 (SEC ID nº 25).
Las figuras 31A-31J proporcionan una comparación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas de hexones de ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8,ChAd9, ChAd10, ChAd11 ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 y ChAd82 con las secuencias de proteínas de fibras de referencia de C1 (SEC ID nº 124), CV68 (SEC ID nº 125), PAN5 (también denominado CV23) (SEC ID nº 119), PAN6 (también denominado CV32) (SEC ID nº 120) y Pan7 (también denominado CV33) (SEC ID nº 121).
La figura 32 proporciona una lista de las secuencias artificiales SEQ ID NOS: 26-40 y SEQ ID NOS: 45 y 46, incluyendo oligómeros y cebadores, dadas a conocer en la presente memoria.
\newpage
La figura 33 es una representación gráfica del punto de rotura de la inmunización de vectores de ChAd que pertenecen a diferentes subgrupos de serotipos (es decir, subgrupos C, E y D). Se determinó la dosis más baja que provocaba una respuesta inmunitaria medible realizando experimentos de titulación en ratones inmunizados con vectores de ChAd3, ChAd11, ChAd20, CV33, CV68, ChAd6, ChAd9, ChAd10 CV32, ChAd4, ChAd7 y ChAd16 que expresaban gag.
La figura 34 proporciona una representación gráfica de una respuesta de células T específica de CEA provocada en macacos Rhesus inmunizados secuencialmente con un vector adenoviral humano (MRKAd5 RhCEA) seguido por un vector adenoviral de chimpancé (CV33 RhCEA) tras un intervalo de 12 semanas. Se evaluaron las respuestas inmunitarias mediante ensayo ELISPOT de IFN-\gamma, y los datos ilustran el número de células que formaban puntos (SFC) por millón de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) tras la incubación en ausencia (DMSO) y presencia de los conjuntos de péptidos C y D de CEA de Rhesus.
La figura 35 proporciona un árbol filogenético de adenovirus de chimpancé y humanos deducido a partir de una alineación de secuencias múltiples de secuencias de péptidos de hexones de longitud completa utilizando PAUPSEARCH (Wisconsin Package versión 10.3, Accelrys Inc.) y visualizado y manipulado con TREEVIEW.
La figura 36 es una representación gráfica de los resultados de inmunización obtenidos en respuesta a la administración de vectores de ChAd3 y hAd5 gag a ratones que se expusieron previamente a hAd5. Se evaluó la inmunidad mediada por células 3 semanas tras la inmunización mediante ELISPOT de IFN-\gamma utilizando esplenocitos purificados.
La figura 37 es una representación gráfica de la cinética de CMI anti-CEA producida en ratones transgénicos para CEA humano inmunizados con ChAd3hCEA y Ad5hCEA. Se evaluó la CMI mediante ICS de PBMC estimuladas con el conjunto de péptidos CEA. Los resultados se expresan como el % de IFN\gamma^{+} CD8^{+}/PBMC totales.
Las figuras 38 A-D son una representación gráfica de la eficacia de infección de diferentes células primarias humanas expuestas a moi 50, 250 y 1250 de diferentes vectores de ChAd que expresan EGFP y que pertenecen a diferentes subgrupos (B, C, D, E). Los resultados se expresan como el % de células fluorescentes/sobre células totales.
Descripción detallada de la invención
Tal como se utiliza en toda la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, se aplican las siguientes definiciones y abreviaturas:
El término "casete" se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende por lo menos una secuencia de ácido nucleico que va a expresarse, junto con sus secuencias de control de la transcripción y traducción. El cambio de casete provocará que el vector en el que se incorpora dirija la expresión de una secuencia o combinación de secuencias diferente. En el contexto de la presente invención, las secuencias de ácido nucleico presentes en el casete codificarán habitualmente para un inmunógeno. Debido a los sitios de restricción que están presentes por modificación mediante ingeniería genética en los extremos 5' y 3', el casete puede insertarse, eliminarse o sustituirse fácilmente por otro casete.
La expresión "elemento de acción en cis" se refiere a secuencias de nucleótidos que regulan genes a los que están unidos. Los elementos de acción en cis presentes en el ADN regulan la transcripción, y los que se transcriben en ARNm pueden regular el procesamiento del ARN, el recambio y la síntesis de proteínas.
El término "vector" se refiere a algunos medios mediante los cuales pueden introducirse fragmentos de ADN en un organismo huésped o tejido huésped. Hay varios tipos de vectores incluyendo plásmidos, virus (incluyendo adenovirus), bacteriófagos y cósmidos.
El término "promotor" se refiere a un sitio de reconocimiento en una cadena de ADN al que se une una ARN polimerasa. El promotor forma un complejo de iniciación con la ARN polimerasa para iniciar y dirigir la actividad de transcripción. El complejo puede modificarse activando secuencias tales como potenciadores, o inhibiendo secuencias tales como silenciadores.
La expresión "cantidad farmacéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de adenovirus recombinante que es eficaz en una vía de administración particular para transducir células huésped y proporcionar niveles suficientes de expresión transgénica para producir una respuesta inmunitaria.
La expresión adenovirus (AdV) recombinante de "replicación competente" se refiere a un adenovirus con genes tempranos esenciales intactos o funcionales (es decir, E1A, E1B, E2A, E2B y E4). Los adenovirus de tipo natural son de replicación competente.
La expresión AdV recombinante de "replicación defectuosa" se refiere a un adenovirus que se ha hecho que no pueda replicarse debido a que se ha modificado mediante ingeniería genética para que presente por lo menos una deleción funcional, o una eliminación completa, de un producto génico que es esencial para la replicación viral. Los vectores adenovirales de chimpancé recombinantes de la invención son de replicación defectuosa.
El término "mamífero" se refiere a cualquier mamífero, incluyendo un ser humano.
La expresión "porcentaje de identidad de secuencia" o "idéntico" en el contexto de secuencias de ácido nucleico se refiere a los residuos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para obtener una correspondencia máxima. Se desea que la longitud de la comparación de identidad de secuencia pueda ser con respecto a la longitud completa del genoma (por ejemplo, aproximadamente 36 kpb), la longitud completa de un marco de lectura abierto de un gen, una proteína, una subunidad o una enzima [véanse, por ejemplo, las tablas que proporcionan las regiones codificantes adenovirales], o un fragmento de por lo menos aproximadamente 500 a 5000 nucleótidos. Sin embargo, también puede desearse la identidad entre fragmentos más pequeños, por ejemplo de por lo menos aproximadamente nueve nucleótidos, habitualmente por lo menos de aproximadamente 20 a 24 nucleótidos, por lo menos de aproximadamente 28 a 32 nucleótidos, por lo menos de aproximadamente 36 o más nucleótidos. De manera similar, puede determinarse fácilmente el "porcentaje de identidad de secuencia" para secuencias de aminoácidos, con respecto a la longitud completa de una proteína, o un fragmento de la misma. Adecuadamente, un fragmento presenta por lo menos aproximadamente 8 aminoácidos de longitud, y puede presentar hasta aproximadamente 700 aminoácidos. Se describen ejemplos de fragmentos adecuados en la presente memoria.
Se determina fácilmente la identidad utilizando algoritmos y programas informáticos tales como los definidos en la presente memoria con parámetros por defecto. Preferiblemente, tal identidad es con respecto a la longitud completa de la proteína, enzima, subunidad, o con respecto a un fragmento de por lo menos aproximadamente 8 aminoácidos de longitud. Sin embargo, la identidad puede basarse en regiones más cortas, cuando sea adecuado para la utilización a la que está destinándose el producto génico idéntico.
En general, los constructos adenovirales y los constructos génicos se nombran en referencia a los genes contenidos en los mismos. Por ejemplo, "pChAd3 \DeltaE1gag" se refiere a un constructo de plásmido que comprende un genoma adenoviral de chimpancé de ChAd3 delecionado en la región E1. En este plásmido, la región E1 se sustituye por un casete de expresión de inmunógeno que comprende un gen gag de VIH bajo el control de un promotor de CMV humano seguido por una señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. De manera similar, pCV33DE1-E3 NSmut se refiere a un segundo constructo de plásmido dado a conocer en la presente memoria que comprende un genoma adenoviral de chimpancé de CV33, delecionado en las regiones de E1 y E3, que se sustituyen por un casete de expresión de inmunógeno que comprende genes no estructurales de VHC bajo el control de un promotor de CMV humano seguido por una señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina.
La abreviatura "Ag" se refiere a un antígeno.
Tal como se utiliza en toda la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen la referencia al plural a menos que el contexto dictamine claramente lo contrario.
Los adenovirus (Ad) son virus icosaédricos, sin envuelta que se han identificado en varios huéspedes mamíferos y aviares. Los Ad humanos (hAd) pertenecen al género Mastadenovirus que incluye todos los Ad humanos conocidos y muchos Ad de origen animal (por ejemplo, bovino, porcino, canino, murino, equino, simio y ovino). Los adenovirus humanos se dividen en seis subgrupos (A-F) basándose en varios criterios biológicos, químicos, inmunológicos y estructurales que incluyen las propiedades de hemaglutinación de eritrocitos de mono Rhesus y rata, homología del ADN, patrones de escisión mediante enzimas de restricción, porcentaje de contenido en C+G y oncogenicidad (Straus, 1984, en The Adenoviruses, ed. H. Ginsberg, págs. 451-498, Nueva York: Plenus Press, y Horwitz, 1990 en Virology, eds. B.N. Fields y D.M. Knipe, págs. 1679-1721). Hasta la fecha, se han reconocido 51 serotipos distintos y se han agrupado en subgrupos basándose en sus propiedades de hemaglutinación y criterios biofísicos y bioquímicos.
El virión adenoviral presenta una simetría icosaédrica y, dependiendo del serotipo, un diámetro de 60-90 nm. La cápside icosaédrica consiste en tres proteínas principales, hexón (II), base de pentones (III) y una fibra redondeada (IV) así como varias proteínas minoritarias (es decir, VI, VIII, IX, IIIa y IVa2) (W.C. Russel, J. Gen. Virol., 81: 2573-2604 (2000). Un aspecto de la inmunidad preexistente que se observa en seres humanos es la inmunidad humoral, que puede dar como resultado la producción y persistencia de anticuerpos que son específicos para proteínas virales. La respuesta humoral producida por adenovirus se dirige principalmente contra las proteínas estructurales principales: hexón, pentón y fibra.
Informes publicados han establecido que son comunes títulos que comprenden anticuerpos contra múltiples serotipos (Dambrosio, E. (1982) J. Hyg. (Londres) 89: 209-219) y que una parte sustancial de los títulos preexistentes presentan actividad neutralizante. La inmunidad neutralizante frente a adenovirus es específica de tipo, y la infección con un serotipo particular de adenovirus confiere inmunidad sólo frente a ese serotipo. Varios informes han sugerido que anticuerpos dirigidos contra el hexón son los más fuertes y los más neutralizantes (Toogood, C.I.A., Crompton, J. y Hay R.T. (1992) J. Gen. Virol. 73, 1429-1435). Por tanto, es razonable suponer que los epítopos responsables de la neutralización específica de tipo están ubicados dentro de siete regiones hipervariables identificadas mediante alineación de las secuencias de hexones que se derivan de diferentes serotipos. (Crawford-Miksza, L y D. P. Schnurr. (1996) J. Virol. 70:1836-1844).
Se ha establecido una correlación directa entre la presencia de anticuerpos neutralizantes específicos de tipo y la incapacidad de producir una respuesta inmunitaria con un vector basado en el mismo serotipo mediante diferentes procedimientos, incluyendo la transferencia pasiva de sueros inmunitarios desde animales tratados hasta animales no tratados previamente. En términos generales, la inmunidad humoral preexistente para un serotipo viral específico reduce la eficacia terapéutica de la administración del vector. Además, la administración de un vector basado en un serotipo viral específico produce una respuesta inmunitaria contra el vector que impide la readministración del mismo serotipo.
En una forma de realización particular, la invención proporciona un procedimiento para burlar los efectos adversos asociados con las consecuencias de la inmunidad preexistente frente a serotipos comunes de hAd. Más específicamente, la invención contempla la utilización de vectores adenovirales de chimpancé caracterizados por un serotipo que no circula en absoluto en seres humanos. Por consiguiente, la invención proporciona vectores adenovirales (Chad) que carecen de epítopos de células B neutralizantes que reaccionan de manera cruzada con los de serotipos humanos comunes como portadores de vacuna.
Aunque se ha notificado que la inmunidad mediada por células (CMI) específica de adenovirus puede producir reacciones cruzadas, estudios de vacunación basados en inyecciones repetidas de serotipos múltiples demostraron una mayor eficacia que programas de inmunización basados en un único vector. Estos experimentos demuestran además que la principal limitación de una administración de vectores para fines de vacuna es la inmunidad humoral preexistente contra el vector. Las posibles soluciones a los problemas asociados con la utilización de un adenovirus humano como portador de vacuna incluyen la administración de una dosis superior de un adenovirus (por ejemplo, un serotipo del subgrupo C) que se pronostica que se encuentra con una respuesta inmunitaria preexistente, y la utilización de vectores basados en serotipos humanos poco comunes. Sin embargo, la utilización de dosis superiores de vacunas aumenta el coste de la vacuna y el riesgo de efectos secundarios no deseados y los resultados de las pruebas preclínicas sugieren que los serotipos humanos alternos son menos inmunógenos que hAd5 y hAd6.
En un intento por evitar los problemas de las respuestas inmunitarias humorales y celulares en el huésped contra los elementos de la estructura principal de los adenovirus del vector, y para minimizar el riesgo de utilizar reservas de vectores derivados de adenovirus humanos que puedan estar contaminados con adenovirus de replicación competente (RCA), se han caracterizado y desarrollado varios adenovirus no humanos como portadores de vacuna (Soudois, C. et al (2000) J. Virology, 74:10639-10649; Farina, S. F. et al (2001) J. Virology, 75:11603-11613; Cohen, C. J. et al (2002) J. Gen. Virology, 83:151-155). La premisa subyacente a la utilización de secuencias adenovirales no humanas para burlar los problemas asociados con la inmunidad preexistente se basa en la observación de que no es probable que los anticuerpos neutralizantes frente a serotipos de adenovirus humanos comunes neutralicen de manera cruzada virus no humanos. Sin embargo, la incompatibilidad de factores virales y celulares impone una limitación práctica sobre la gran mayoría de sistemas de vector alternativos (bovinos, ovinos, caninos) que se caracterizan por la desventaja de tener que propagarse en líneas celulares no humanas.
Wilson et al. han publicado un artículo que describe la caracterización de un vector de replicación defectuosa basado en el adenovirus de chimpancé tipo 68 (CV68) C68, que se aisló originalmente a partir de un ganglio linfático mesentérico de un chimpancé (Basnight, M., et al. (1971) Am. J. Epidemiol. 94:166-171). CV68 se secuenció completamente y se encontró que era similar en su estructura global a los adenovirus humanos (Farina, S. F. et al., J. Virol. 75(23): 11603-11613 (2001). El genoma del virus presenta 36.521 pares de bases de longitud y se ha descrito como el más similar al subgrupo E de adenovirus humanos, con un 90% de identidad con la mayoría de los marcos de lectura abiertos de Ad4 humano que se han secuenciado. Las ITR de CV68 presentan 130 pares de bases de longitud, y están presentes todos los genes tempranos y tardíos adenovirales principales. CV68 se caracteriza por un serotipo que no circula en seres humanos y que carece de epítopos de células B neutralizantes que reaccionan de manera cruzada con los de serotipos humanos comunes. Aunque los adenovirus de chimpancé son similares a los adenovirus humanos, no se ha documentado en seres humanos inmunidad neutralizante que produzca reacción cruzada contra serotipos de chimpancé (Farina, S. F. et al. J. Virol. (2001) 75(23):11603-13).
Los vectores recombinantes derivados de CV68 se describen como suficientemente similares a serotipos humanos como para ayudar en la transducción de células que expresan el receptor de adenovirus y virus de Coxsackie (Cohen, C. et al., J. Gen. Virol. 83: 151-155 (2002). De manera significativa, CV68 se caracteriza por un nivel de similitud suficiente con los adenovirus humanos como para ayudar en su replicación a células 293 que albergan E1 del adenovirus humano tipo 5 (Farina, S. F. et al., J. Virol. 75(23): 11603-11613 (2001). Además, basándose en la observación de que las secuencias flanqueantes de E1 del serotipo humano 5 no son homólogas con las de las secuencias de vectores derivados de CV68, se pronostica que no se producirá recombinación homóloga. Por tanto, se ha pronosticado que hay una baja probabilidad de que reservas de vacunas derivadas de CV68 estén contaminadas con RCA.
El mismo grupo de investigadores notificó posteriormente la utilización de secuencias adenovirales derivadas de CV68 como portador de vacuna para la inducción de anticuerpos frente a la glicoproteína del virus de la rabia en ratones. Se creó una versión de replicación defectuosa de CV68 sustituyendo los genes E1A y E1B por un casete de minigén. Ratones inmunizados con un vector recombinante adenoviral (AdC68rab.gp) que contenía deleción de E1 que comprendía un producto transgénico que codificaba para la glicoproteína del virus de la rabia desarrollaron inmunidad protectora frente al virus de la rabia y siguieron siendo resistentes a la exposición a una dosis por lo demás letal del virus de la rabia (Xiang, Z et al., J. Virol. 76(5): 2667-2675 (2002). Recientemente, se notificó que un segundo constructo de CV68 que expresaba una forma truncada, con codones optimizados de gag de VIH-1 inducía una vigorosa respuesta de células T CD8^{+} específica de gag en ratones. Se mostró que la respuesta inducida por la vacuna proporcionaba protección frente a la exposición a un virus vaccinia recombinante para gag (Fitzgerald, J. C. et al., J. Immunol. 170: 1416-1422 (2003). La vacunación experimental de ratones preinmunizados frente al serotipo 5 de adenovirus humano con los vectores CV68gag o Ad5gag demostró una reducción más pronunciada de células T específicas de gag y protección contra la exposición viral producida por la vacuna de Ad5 que por la vacuna de CV68. La reducción de la eficacia de la vacuna de C68gag se atribuyó a una reactividad cruzada de células T CD8+ específicas de Ad5 (Id.).
Considerados juntos, estos datos sugieren que los vectores adenovirales de replicación defectuosa derivados de simios pueden ser más adecuados para su utilización como portadores de vacunas humanas que los vectores basados en serotipos humanos comunes. Tal como se muestra en la presente memoria, los resultados de experimentos en los que ratones que se inmunizaron fuertemente contra Ad5 humano (figura 3) pueden inmunizarse con vectores adenovirales ChAd3-gag indican que la inmunidad anti-Ad5 humano no redujo la respuesta de CMI específica de gag producida por los vectores de ChAd. Estos resultados son consecuentes con la conclusión de que no están presentes epítopos de células T y B que producen reacciones cruzadas frente a Ad5 humano en los vectores de ChAd3 o ChAd6.
En términos generales, el genoma adenoviral está muy bien caracterizado y a pesar de la existencia de varios serotipos distintos, hay algo de conservación general en la organización global del genoma adenoviral colocándose funciones específicas de manera similar. Las secuencias de nucleótidos de los adenovirus de chimpancé C1 y CV68 dadas a conocer por Wilson et al., y la ubicación de los genes E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4, L1, L2, L3, L4 y L5 de cada virus se proporcionan en la patente US nº 6.083.716 (Vectores de adenovirus de chimpancé), y en la solicitud PCT publicada WO 03/000851 (Methods for Rapid Screening of Bacterial Trnasformants and Novel Simion Adenoviral Proteins, Procedimientos para la selección rápida de transformantes bacterianos y proteínas adenovirales de simios novedosas).
Cada extremo del genoma adenoviral comprende una secuencia conocida como repetición terminal invertida (ITR), que es necesaria para la replicación viral. Este virus también comprende una proteasa codificada por el virus, que es necesaria para procesar algunas de las proteínas estructurales requeridas para producir viriones infecciosos. La estructura del genoma adenoviral se describe basándose en el orden en el que los genes virales se expresan tras la transducción de la célula huésped. Más específicamente, los genes virales se denominan genes tempranos (E) o tardíos (L) dependiendo de si la transcripción se produce antes o tras el inicio de la replicación del ADN. En la fase temprana de la transducción, se expresan los genes E1, E2, E3 y E4 de adenovirus para preparar a la célula huésped para la replicación viral. El virus puede hacerse de replicación defectuosa mediante la deleción de la región temprana 1 esencial (E1) del genoma viral. Brody et al, 1994 Ann N Y Acad Sci., 716:90-101. Durante la fase tardía, se activa la expresión de los genes tardíos L1-L5, que codifican para los componentes estructurales de las partículas de virus. Todos los genes tardíos están bajo el control de un único promotor y codifican para proteínas que incluyen el pentón (L2), el hexón (L3), la proteína de andamiaje de 100 kDa (L4) y la proteína de fibras (L5), que forman la nueva partícula de virus en la que se encapsida el ADN adenoviral. Dependiendo del serotipo del virus, pueden generarse 10.000-100.000 partículas de adenovirus de la progenie en una única célula huésped. Por último, el proceso de replicación adenoviral produce la lisis de las células.
Los vectores adenovirales de replicación defectuosa dados a conocer en la presente memoria se construyeron mediante la deleción de secuencias de nucleótidos específicas a partir de las secuencias de ácido nucleico de chimpancé dadas a conocer y la inserción de las secuencias derivadas de otras secuencias de ADN que son útiles para la expresión, inserción transgénica u otras manipulaciones genéticas. Por consiguiente, los adenovirus de chimpancé recombinantes descritos en la presente memoria pueden contener secuencias adenovirales derivadas de uno o varios adenovirus de chimpancé, o secuencias de un adenovirus de chimpancé y de un adenovirus humano. Pueden producirse secuencias de polinucleótidos adecuados de manera recombinante, sintética o aislarse de fuentes naturales. Las secuencias adenovirales adecuadas para su utilización en aspectos particulares de la invención incluyen secuencias que carecen de epítopos de células B neutralizantes que producen reacciones cruzadas con serotipos humanos comunes.
Como mínimo, los adenovirus de chimpancé recombinantes (por ejemplo, vectores) de la invención contienen los elementos de acción en cis de adenovirus de chimpancé necesarios para la replicación y la encapsidación del virión, en combinación con por lo menos un casete de expresión de inmunógeno. Normalmente, los elementos de acción en cis flanquean el casete de expresión que comprende un transgén que codifica para por lo menos un antígeno. Más específicamente, los vectores de la invención contienen las secuencias de repetición terminal invertida (ITR) en 5' de acción en cis requeridas de los adenovirus (que funcionan como orígenes de replicación), secuencias de ITR en 3', dominios potenciadores/de empaquetamiento y una secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula heteróloga. Independientemente de si el vector recombinante comprende sólo las secuencias adenovirales mínimas o un genoma adenoviral completo con sólo deleciones funcionales en genes particulares (por ejemplo, las regiones E1 y/o E3 o E4), los vectores de la invención comprenden una cápside de adenovirus de chimpancé.
En términos generales, los vectores adenovirales dados a conocer en la presente memoria comprenden un genoma adenoviral de replicación defectuosa, en los que el genoma adenoviral no presenta un gen E1 funcional, y un casete de expresión de inmunógeno que comprende: a) un ácido nucleico que codifica para por lo menos un inmunógeno contra el que se desea una respuesta inmunitaria; y b) un promotor heterólogo (es decir, con respecto a la secuencia adenoviral) funcionalmente unido a la secuencia de ácido nucleico que codifica para el/los inmunógeno(s); y un terminador de la transcripción.
Más específicamente, la invención proporciona vectores de replicación defectuosa que consisten en un genoma adenoviral recombinante que carece de por lo menos un gen temprano seleccionado de entre el grupo constituido por E1, E2, E3 y E4. En una forma de realización, se prepara un vector de replicación defectuosa sustituyendo, o alterando, el gen E1 de ChAd3 con un casete de expresión de inmunógeno. Por ejemplo, puede prepararse un vector delecionando/alterando el gen E1 de ChAd 3 (SEC ID nº 1). En otras formas de realización, los vectores de replicación defectuosa de la invención comprenden un genoma adenoviral derivado de ChAd3 que opcionalmente se ha modificado mediante ingeniería genética para que carezca de un gen E3 funcional. Debe entenderse que las secuencias adenovirales de chimpancé dadas a conocer en la presente memoria pueden hacerse de replicación defectuosa o bien eliminando completamente un gen temprano o bien haciendo que el gen no sea operativo ni funcional.
Debe entenderse que la invención abarca vectores que se caracterizan por presentar modificaciones, tales como una "deleción funcional" que destruye la capacidad del adenovirus para expresar uno o varios productos génicos seleccionados. La expresión "deleción funcional" tal como se utiliza en la presente memoria abarca en sentido amplio modificaciones que presentan el efecto de hacer que un producto génico particular no sea funcional. En términos generales, las deleciones funcionales toman la forma de una deleción parcial o total de un gen adenoviral. Sin embargo, un experto en la materia admitirá fácilmente que otras modificaciones, incluyendo pero sin limitarse a realizar una modificación que introduzca una mutación de desplazamiento del marco de lectura, también lograrán una deleción funcional. Por ejemplo, los vectores adenovirales de chimpancé recombinantes de la invención pueden hacerse de replicación defectuosa introduciendo una modificación que se diseña para interferir con, o para delecionar funcionalmente, la capacidad del virus para expresar E1A y/o E1B adenovirales.
Es bien sabido que pueden obtenerse vectores adenovirales de replicación defectuosa introduciendo una modificación que esté diseñada para interferir con, o para delecionar funcionalmente la expresión de uno o varios genes del grupo de genes E2. Más en detalle, puede construirse un vector de replicación defectuosa inactivando el gen de la polimerasa, o el gen de la proteína preterminal o el gen de la proteína de unión al ADN. Además, la deleción o inactivación de genes expresados mediante la región E4 es una estrategia alternativa para construir vectores Ad de chimpancé de replicación defectuosa. Puede combinarse la inactivación o deleción de genes tempranos con el fin de producir más vectores atenuados. Alternativamente, los vectores de ChAd de replicación defectuosa también pueden comprender modificaciones adicionales en otros genes virales, tales como los genes tardíos L1 a L5. Además, pueden generarse portadores de vacuna adenovirales novedosos combinando genes de hexones y fibras de diferentes serotipos. La utilización de una estrategia de intercambio de genes de hexones y fibras permitirá también a un investigador cambiar las propiedades biológicas de un ChAd y facilitar la producción de vectores con un tropismo diferente o con nuevas características serológicas.
Se entiende que la presente invención abarca vectores adenovirales recombinantes que comprenden deleciones de genes enteros o partes de los mismos que destruyen eficazmente la actividad biológica del gen modificado o bien solo o bien en cualquier combinación. Por ejemplo, pueden construirse adenovirus de simio recombinantes que presentan una deleción funcional de los genes expresados por la región E4, aunque tal como se muestra en la presente memoria, puede ser deseable introducir la secuencia de E4 de Ad5 heteróloga en el vector en combinación con la deleción funcional de un gen E1. Alternativamente, puede eliminarse la función del gen E3 temprano retrasado adenoviral; sin embargo, debido a que la función de E3 no es necesaria para la producción de una partícula adenoviral recombinante, no es necesario sustituir este producto génico con el fin de producir un recombinante que pueda empaquetar un virus útil en la invención.
En una forma de realización de la presente invención, el vector adenoviral de replicación defectuosa utilizado es un adenovirus del subgrupo C de chimpancé que contiene deleciones en E1 y opcionalmente en E3. Por ejemplo, para ChAd3, puede introducirse una deleción/alteración de E1 adecuada en la región desde el pb 460 hasta el pb 3542 (con referencia a SEC ID nº 1). Para ChAd6, puede introducirse una deleción/alteración de E1 adecuada en la región desde el pb 457 hasta el pb 3425 (con referencia a SEC ID nº 2). Para CV32, la deleción de E1 es preferiblemente desde el pb 456 hasta el pb 3416 (con referencia a SEC ID nº3); para CV33, la deleción de E1 es preferiblemente desde el pb 456 hasta el pb 3425 (con referencia a SEC ID nº 4) y para CV23, la deleción de E1 es preferiblemente desde el pb 456 hasta el pb 3415 (con referencia a SEC ID nº 5). Las deleciones de E3 para CV32 y CV33 son preferiblemente desde el pb 27446 hasta el pb 31911 (con referencia a SEC ID nº 3); desde el pb 27146 hasta el pb 31609 (con referencia a SEC ID nº 4) respectivamente. Los expertos en la materia pueden determinar fácilmente las secuencias equivalentes para otros aislados de chimpancé basándose en las homologías de secuencia y alineaciones de secuencias
múltiples.
Un experto en la materia admitirá fácilmente que con el fin de construir un vector adenoviral delecionado en E1, deben tomarse varias decisiones referentes a la estructura de la estructura principal del vector y la composición de la secuencia de ácido nucleico que comprende el transgén. Por ejemplo, un investigador debe determinar si el tamaño de la deleción de E1 se adaptará al tamaño del transgén. Si no es así, entonces tendrán que introducirse deleciones adicionales en la estructura principal del vector.
La secuencia de ácido nucleico que constituye el transgén puede ser un gen, o una parte funcional de un gen y normalmente existirá en forma de un casete de expresión. Normalmente, un casete de expresión génica incluye: (a) ácido nucleico que codifica para una proteína o un antígeno de interés; (b) un promotor heterólogo funcionalmente unido al ácido nucleico que codifica para la proteína; y (c) una señal de terminación de la transcripción. El ácido nucleico puede ser ADN y/o ARN, puede ser mono o bicatenario. El ácido nucleico puede presentar codones optimizados para su expresión en el huésped deseado (por ejemplo, un huésped mamífero).
También deben tomarse decisiones referentes al sitio dentro de la estructura principal en el que se introducirá el transgén y la orientación del transgén. Más específicamente, el transgén puede insertarse en una orientación paralela a E1 (transcrito de 5' a 3') o antiparalela (transcrito en una dirección de 3' a 5' en relación con la estructura principal del vector). Además, elementos reguladores transcripcionales apropiados que puedan dirigir la expresión del transgén en las células huésped de mamífero que está preparándose el vector para su utilización como portador de vacuna necesitan identificarse y unirse funcionalmente al transgén. Secuencias "funcionalmente unidas" incluyen tanto secuencias de control de la expresión que están contiguas a las secuencias de ácido nucleico que regulan como secuencias reguladoras que actúan en trans, o a una distancia para controlar la secuencia de ácido nucleico regulada.
Las secuencias reguladoras incluyen: secuencias de control de la expresión apropiadas, tales como secuencias promotoras, potenciadoras, de terminación y de iniciación de la transcripción, señales de procesamiento del ARN eficaces, tales como señales de poliadenilación y de corte y empalme; secuencias que potencian la eficacia de la traducción (por ejemplo, secuencias consenso de Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de las proteínas y opcionalmente secuencias que promueven la secreción de proteínas. La selección de estos y otros elementos de vectores comunes es convencional y los expertos en la materia conocen bien muchas secuencias adecuadas (véase, por ejemplo, Sambrook et al, y la bibliografía citada en, por ejemplo, las páginas 3.18-3.26 y 16.17-16.27 y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, 1989).
En formas de realización específicas, el promotor es un promotor heterólogo (es decir, con respecto a las secuencias de adenovirus) que es reconocido por una ARN polimerasa eucariota. En una forma de realización preferida, el promotor es un promotor "fuerte" o "eficaz". Un ejemplo de un promotor fuerte es el promotor de citomegalovirus humano temprano inmediato (Chapman et al, 1991 Nucl. Acids Res 19:3979-3986, que se incorpora como referencia). El promotor de CMV humano puede utilizarse sin (CMV) o con la secuencia del intrón A (CMV-intA), aunque los expertos en la materia reconocerán que puede utilizarse cualquiera de varios otros promotores conocidos, tales como el promotor de inmunoglobulinas fuerte u otros promotores de genes eucariotas, incluyendo el promotor de EF1 alfa, el promotor de CMV murino, el promotor del virus del sarcoma de Rous (VSR), los promotores temprano/tardío de SV40 y el promotor de beta-actina.
Ejemplos adicionales de promotores que pueden utilizarse en la presente invención son el promotor de inmunoglobulinas fuerte, el promotor de EF1 alfa, el promotor de CMV murino, el promotor del virus del sarcoma de Rous, los promotores temprano/tardío de SV40 y el promotor de beta actina, aunque los expertos en la materia pueden apreciar que cualquier promotor que pueda efectuar la expresión en el huésped pretendido puede utilizarse según los procedimientos de la presente invención. El promotor puede comprender una secuencia regulable tal como la secuencia de operador Tet. Secuencias tales como éstas que ofrecen la posibilidad de regulación de la transcripción y expresión son útiles en casos en los que se busca la represión de la transcripción génica.
Los casetes de expresión génica adecuados comprenderán también una secuencia de terminación de la transcripción. Un terminador transcripcional preferido es el terminador de la hormona de crecimiento bovina. La combinación de promotor/terminación de la transcripción de terminador de CMVintA-BGH se prefiere particularmente aunque también pueden utilizarse otras combinaciones de promotor/terminador. Tal como se muestra en la presente memoria, la señal de poliadenilación/terminación de la hormona de crecimiento bovina (bGHpA) o la señal de poliA sintética corta (SPA) de 50 nucleótidos de longitud definida tal como sigue:
AATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTG
(SEC ID nº 26).
En términos generales, muestra a modo de ejemplo secuencias de terminación adecuadas. La señal de poliA se inserta tras la secuencia de ácido nucleico que comprende el transgén y antes de la secuencia de ITR de adenovirus en 3'.
Los vectores adenovirales recombinantes descritos en la presente memoria pueden contener secuencias adenovirales derivadas de una o varias cepas de adenovirus. Pueden obtenerse secuencias adecuadas a partir de fuentes naturales, producidas de manera recombinante, sintética o mediante otros procedimientos químicos o de modificación mediante ingeniería genética. En una forma de realización particular, el adenovirus de chimpancé recombinante es un recombinante quimérico que comprende secuencias de polinucleótido adenovirales que no son de chimpancé. Pueden obtenerse secuencias adenovirales que no son de chimpancé adecuadas a partir de cepas adenovirales humanas. Por ejemplo, puede sustituirse la región E4 nativa por E4 de hAd5 (nt 32816 a nt 35619 de Ad5) o por Ad5E4orf6 (nt 33193 a nt 34077 de Ad5) (número de registro de GenBank de Ad5: M73260).
En términos generales, el inmunógeno (molécula antigénica) suministrada por el vector adenoviral recombinante de la invención comprende un producto enzimático, proteico o polipeptídico que está codificado por un transgén en combinación con una secuencia de nucleótidos que proporciona las secuencias reguladoras necesarias para dirigir la transcripción y/o traducción del producto codificado en una célula huésped. La composición del transgén depende de la utilización prevista del vector. Por ejemplo, si la composición inmunogénica está diseñándose para producir una respuesta de anticuerpos o una respuesta inmunitaria mediada por células en un huésped mamífero que es específico para un agente infeccioso, entonces es apropiado utilizar una secuencia de ácido nucleico que codifica para por lo menos un producto inmunogénico que se pronostica que confiere inmunidad específica de patógeno al receptor. Alternativamente, si la composición está preparándose para su utilización como vacuna contra el cáncer, un transgén adecuado puede comprender una parte inmunogénica de un autoantígeno, tal como un TAA, que se ha seleccionado con el objetivo de producir una respuesta inmunitaria protectora de potencia suficiente tanto para romper la tolerancia del huésped a un TAA particular como para producir una respuesta de larga vida (por ejemplo, memoria) que será suficiente para prevenir el inicio del cáncer o para prevenir la evolución del tumor. Por consiguiente, pueden obtenerse productos génicos inmunogénicos adecuados a partir de una amplia variedad de agentes patógenos (tales como, pero sin limitarse a virus, parásitos, bacterias y hongos) que infectan huéspedes mamíferos, o a partir de una célula cancerosa o tumoral. Aunque la invención se ilustra en la presente memoria con un conjunto particular de inmunógenos de prueba, debe entenderse que la invención no se limita a la utilización de los antígenos mostrados como ejemplo en la presente memoria. Más específicamente, la invención contempla la utilización tanto de antígenos heterólogos como autoantígenos como inmunógenos, incluyendo pero sin limitarse a TAA.
En una forma de realización, la invención proporciona una composición inmunogénica (por ejemplo, una vacuna) para inducir una respuesta inmunitaria contra antígenos (es decir, inmunógenos) expresados por un agente infeccioso. Por ejemplo, es deseable producir una respuesta inmunitaria contra un virus que infecta seres humanos y/o especies animales no humanas. Los ejemplos de familias de virus contra las que sería deseable una respuesta inmunitaria profiláctica y/o terapéutica incluyen la familia Picornaviridae que incluye seis géneros diferentes tales como Aphtovirus, Cardiovirus, Enterovirus, Hepatovirus, Parechovirus, Rhinovirus. Ejemplos de Picornavirus contra los que sería deseable una respuesta inmunitaria: virus de la fiebre aftosa, virus de encefalomiocarditis, poliovirus, virus de Coxackie, virus de la hepatitis A humana, parechovirus humanos, rhinovirus. La familia Caliciviridae incluye diferentes géneros asociados con gastroenteritis epidémica en seres humanos provocada por el grupo de virus Norwalk y otros síndromes en animales como la enfermedad hemorrágica en conejos asociada con el virus de la enfermedad hemorrágica de conejos o enfermedad respiratoria en gatos provocada por calicivirus felino.
Otra familia de virus, contra la que puede ser deseable producir una respuesta inmunitaria, es la Astroviridae, que comprende virus aislados de seres humanos así como muchas especies animales diferentes. Los astrovirus humanos están asociados con gastroenteritis y diarrea en niños pequeños. Alternativamente, puede ser deseable conferir a los huéspedes mamíferos inmunidad frente a miembros de la familia Togaviridae de virus que comprende dos géneros: alfavirus y rubivirus. Los alfavirus están asociados con enfermedades humanas y veterinarias tales como artritis (es decir, virus Chikungunya, virus Sindbis) o encefalitis (es decir, virus de la encefalitis equina oriental, virus de la encefalitis equina occidental).
El virus de la rubéola proporciona una diana viral alternativa contra la que el único miembro del género rubivirus es responsable de los brotes de una enfermedad exantemática leve asociada con fiebre y linfoadenopatía. La infección por el virus de la rubéola está asociada también con anomalías en el feto cuando la adquiere la madre durante el embarazo temprano. Flaviviridae es otra familia de virus que consiste en tres géneros: los flavivirus, los pestivirus y los hepacivirus que incluyen patógenos humanos así como animales importantes. Muchos de los miembros del género flavivirus son patógenos humanos transmitidos por artrópodos que provocan una variedad de enfermedades incluyendo fiebre, encefalitis y fiebres hemorrágicas. Los virus de la fiebre del dengue, el virus de la fiebre amarilla, el virus de la encefalitis japonesa, el virus de la fiebre del Nilo occidental, el virus de la encefalitis transmitido por garrapatas son patógenos de interés global principal o de interés regional (endémicos). El género pestivirus incluye patógenos animales de importancia económica principal tales como el virus de la diarrea viral bovina, el virus de la fiebre porcina clásica, el virus de la enfermedad de la frontera. El virus de la hepatitis C es el único miembro del género hepacivirus responsable de hepatitis aguda y crónica. Las proteínas del VHC expresadas por un adenovirus recombinante pueden producir una respuesta inmunitaria protectora así como terapéutica que limita las consecuencias de una infección viral que afecta a 170 millones de personas en todo el mundo.
Alternativamente, pueden expresarse antígenos derivados de miembros de la familia Coronaviridae mediante vectores de adenovirus recombinantes con el fin de obtener protección contra la infección. Puede obtenerse protección contra el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (virus SARS-Co) inmunizando con uno o varios adenovirus de chimpancé elegidos del grupo que incluye ChAd3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 16, 17, 19, 20, ChAd8, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 y ChAd82 que expresan una o varias proteínas de SARS-CoV incluyendo sin limitaciones proteína de la nucleocápside (N), proteína polimerasa (P), glicoproteína de membrana (M), glicoproteína de la espícula (S), proteína de la envuelta pequeña (E) o cualquier otro polipéptido expresado por el virus. Los miembros de la familia Rhabdoviridae incluyendo el virus de la rabia pueden ser la diana de una vacuna recombinante que expresa proteínas virales.
Otras posibles dianas incluyen la familia Filoviridae que comprende géneros de virus similares al Ébola y similares al Marburg, que son responsables de brotes de fiebre hemorrágica grave; la familia Paramyxoviridae que comprende algunos de los virus más prevalentes conocidos en seres humanos como virus del sarampión, virus respiratorio sincitial, virus parainfluenza y virus de interés veterinario como el virus de la enfermedad de Newcastle y el virus de la peste bovina; la familia Orthomyxoviridae que incluye los virus de la gripe A, B, C; la familia Bunyaviridae transmitida principalmente por artrópodos a huéspedes vertebrados que comprende importantes patógenos humanos como el virus de la fiebre del valle del Rift, virus Sin Nombre, virus Hantaan, virus Puumala; la familia Arenaviridae que comprende el virus de la coriomeningitis linfocítica, el virus de la fiebre de Lassa, el virus de la fiebre hemorrágica argentina, el virus de la fiebre hemorrágica boliviana; la familia Bornaviridae que comprende virus que provocan enfermedades del sistema nervioso central principalmente en caballos y ovejas; la familia Reoviridae que incluye rotavirus, la causa más importante de enfermedad diarreica grave en lactantes y niños pequeños en todo el mundo, orbivirus que pueden afectar tanto a seres humanos como a otros mamíferos (virus de la lengua azul, virus de la enfermedad hemorrágica epizoótica); la familia Retroviridae, un gran grupo de virus que comprende importantes patógenos humanos como el virus de la inmunodeficiencia humana 1 y 2 (VIH-1 y VIH-2) y el virus de la leucemia de células T humanas tipo 1 y 2 (VLTH 1 y 2) así como lentivirus no humanos tales como virus Maedi/Visna que afecta a ovejas y cabras, virus de la anemia infecciosa equina que afecta a caballos, virus de la inmunodeficiencia bovina que afecta al ganado, virus de la inmunodeficiencia felina que afecta a gatos; grupos de la familia Polyomaviridae de virus oncogénicos de ADN pequeño, virus prototipo son polioma y SV40 que infectan a ratones y monos rhesus respectivamente, (se aislaron virus BK y JC estrechamente relacionados con SV40 de pacientes humanos); la familia Papillomaviridae consiste en un grupo de virus de ADN que infectan vertebrados superiores incluyendo seres humanos generando verrugas y condilomas. La infección por el virus del papiloma está asociada con el desarrollo de cáncer tanto en seres humanos como animales. Los virus del papiloma humano están asociados con cáncer de cuello uterino, cáncer vaginal y cáncer cutáneo. La familia Herpesviridae incluye subfamilias en las que se clasifican varios patógenos importantes para seres humanos y otros mamíferos. Fuentes adecuadas de antígenos pueden ser pero no se limitan a virus del herpes simple 1 y 2, virus de la varicela zóster, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus, virus del herpes humano 6A, 6B y 7, virus del herpes asociado al sarcoma de Kaposi. Fuentes adecuadas adicionales de antígenos son miembros de la familia Poxviridae como el virus de la viruela del mono, virus Molluscum contagiosum, virus de la viruela; virus de la hepatitis B, el miembro prototipo de la familia Hepadnaviridae así como otros virus que provocan hepatitis aguda y/o crónica como el virus de la hepatitis delta, el virus de la hepatitis E.
Los vectores adenovirales de la presente invención son también adecuados para la preparación de composiciones inmunogénicas diseñadas para estimular una respuesta inmunitaria en seres humanos o animales contra proteínas expresadas por patógenos no virales incluyendo patógenos bacterianos, fúngicos y parasitarios. Por ejemplo, los vectores dados a conocer en la presente memoria pueden utilizarse para preparar vacunas contra, pero sin limitarse a: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Vibrio cholerae, Clostridium tetani, Neisseria meningitis, Corynebacterium diphteriae, Mycobacteria tuberculosis y leprae, Listeria monocytogenes y Legionella pneumofila. Los ejemplos de hongos y parásitos de mamíferos para los que puede ser deseable preparar vacunas profilácticas o terapéuticas incluyen: Candida albicans, Aspergillus fumigatus, Histoplasma capsulatum, Plasmodium malariae, Leishmania major, Trypanosome cruzi y brucei, Schistosoma haematobium, mansoni y japonicum; Entamoeba histolytica y numerosas especies de Filaria que se sabe que son responsables de filariasis humana.
El cáncer implica normalmente la desregulación de genes que codifican para polipéptidos que contribuyen a mantener el ciclo celular o a controlar la proliferación celular (por ejemplo, factores de crecimiento, oncogenes, receptores y supresores de tumores). Los productos de muchos de los genes implicados en el cáncer se expresan en la superficie de una amplia variedad de células tumorales. Se ha identificado una variedad de antígenos tumorales que pueden ser reconocidos por linfocitos T y B en cáncer humano y animal. La gran mayoría de antígenos asociados a tumores humanos (TAA) que son adecuados para su utilización en un ensayo de vacuna contra el cáncer se describen como "autoantígenos" debido al hecho de que además de expresarse en células tumorales, también se expresan en tejido normal y/o durante el desarrollo fetal. La inmunotolerancia de la población diana a TAA puede explicar por qué muchas vacunas contra el cáncer han demostrado ser ineficaces.
Pueden producirse antígenos tumorales mediante mutantes oncogénicos de protooncogenes alterados de genes celulares normales o genes supresores de tumores tales como Ras, las proteínas p53 o Bcr-Abl son ejemplos de proteínas celulares alteradas que pueden estimular la respuesta de células T/B. Los antígenos tumorales pueden ser proteínas celulares normales que se sobreexpresan en células tumorales (tirosinasa, GP100, MART se expresan normalmente a bajos niveles en melanocitos y se sobreexpresan en melanoma) o se expresan de manera aberrante en células tumorales (MAGE, BAGE, GAGE se expresan en melanomas y muchos carcinomas pero se expresa normalmente en los testículos y la placenta). Los antígenos tumorales pueden ser productos de virus oncogénicos: proteínas E6 y E7 del virus del papiloma expresadas por carcinomas de cuello uterino; proteína EBNA-1 del VEB producida por carcinomas nasofaríngeos y linfomas VEB+; antígeno T de SV40 en tumores experimentales inducidos por SV40. Se expresan antígenos oncofetales en altos niveles en células cancerosas y en tejidos en desarrollo normales (fetales) pero no en tejidos adultos. El antígeno carcinoembrionario (CEA) y la alfa-fetoproteína (AFP) son ejemplos de antígenos oncofetales bien caracterizados.
Pruebas recientes apoyan la existencia de TAA que pueden producir una respuesta inmunitaria, haciendo así que esta clase de antígenos sean inmunógenos adecuados para la terapia con vacunas. Sin embargo, como clase de antígenos, los TAA son inmunógenos notoriamente malos y las células T que son sumamente específicas para TAA o bien se delecionan o bien se energizan durante el desarrollo de células T. Por consiguiente, existe la expectativa de que la respuesta inmunitaria de un huésped que porta un tumor frente a un TAA particular será extremadamente baja. Debido a la necesidad inherente de romper la tolerancia del huésped a un TAA diana, los estudios de vacunas clínicas experimentales se centran particularmente en el desarrollo de estrategias de inmunización que potencien respuestas de células T específicas de TAA. En términos generales, una vacuna contra el cáncer eficaz debe superar tanto la inmunotolerancia como potenciar la respuesta inmunitaria del huésped hasta un nivel que sea preventivo y/o protector. En muchos estudios de vacunas experimentales, se han correlacionado los efectos antitumorales con respuestas de células T frente a TAA.
En una forma de realización alternativa, la invención contempla una composición inmunogénica (por ejemplo, una vacuna contra el cáncer) que puede utilizarse para inducir una respuesta inmunitaria contra antígenos tumorales. Una composición adecuada contendría un adenovirus de chimpancé recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un antígeno tumoral y un vehículo fisiológicamente aceptable. En una forma de realización particular, el elemento de secuencia codificante del casete puede codificar para un único inmunógeno, tal como una secuencia de péptido inmunogénico derivado de un autoantígeno, tal como un antígeno asociado a tumor. En algunas formas de realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica para el inmunógeno (es decir, el transgén) puede presentar codones optimizados para su expresión en una especie de mamífero particular. En otras formas de realización, la secuencia codificante puede codificar para más de un inmunógeno, tal como uno o varios antígenos tumorales con codones optimizados. Por ejemplo, una vacuna contra el cáncer que utiliza los vectores adenovirales dados a conocer puede codificar para una combinación de autoantígenos tales como: HER2/neu, CEA, Hepcam, PSA, PSMA, Telomerasa, gp100, Melan-A/MART-1, Muc-1, NY-ESO-1, Survivina, Estromelisina 3, Tirosinasa, MAGE3, CML68, CML66, OY-TES-1, SSX-2, SART-1, SART-2, SART-3, NY-CO-58, NY-BR-62, hKLP2, VEGF.
El desarrollo de una vacuna contra el cáncer eficaz requiere la identificación de una estrategia que produzca inmunidad específica de antígeno en pacientes vacunados y la generación de una respuesta inmunitaria que persista tras haber finalizado la inmunización activa. El éxito de la estrategia dependerá de si una respuesta inmunitaria medible dirigida contra un antígeno diana se correlaciona con la protección contra la aparición o recidiva del cáncer. Se ha mostrado que los mecanismos efectores tanto de la inmunidad mediada por células como de la inmunidad humoral son la destrucción de células tumorales. Sin embargo, datos de sistemas experimentales sugieren que las células T específicas de antígeno representan el mecanismo inmunológico más poderoso para la eliminación de células tumorales. Se pronostica que el reconocimiento de antígenos específicos de tumor (por ejemplo, TAA) por células T efectoras permite al TAA funcionar como antígeno de rechazo de tumores. Estudios publicados sugieren que la estimulación de respuestas de células T auxiliares CD8+ y CD4+ es importante para lograr una eliminación óptima del tumor ((Greenberg, P. D. (1991) Adv. Immunol. 49: 281-355; Pardoll, D. M. et al. (1998) Curr. Opin. Immunol. 10: 588-94). La respuesta clínica (es decir, la eficacia) se ha asociado con aumentos en células T citotóxicas que secretan interferón \gamma. La aparición de ensayos, tales como el ensayo ELISPOT utilizado en la presente memoria, para demostrar la eficacia de los presentes portadores de vacuna, permite a los investigadores medir las respuestas de células T frente a regímenes de vacunación y de este modo facilita el desarrollo de vacunas contra el cáncer.
Las vacunas contra el cáncer pueden ser o bien profilácticas o bien terapéuticas. La suposición general que subyace a la utilización profiláctica de vacunas contra el cáncer es que los TAA son inmunógenos extremadamente débiles o son funcionalmente no inmunogénicos en sujetos que portan tumores. Más específicamente, en el campo de la inmunología del cáncer, pueden utilizarse vacunas como inmunoterapia en pacientes aquejados de cáncer. Por consiguiente, pueden diseñarse vacunas contra el cáncer para producir una respuesta inmunitaria que se dirige contra un TAA que se expresa por un tumor maligno o tumor preexistente. Por tanto, en formas de realización particulares, las vacunas contra el cáncer terapéuticas están destinadas para su utilización en pacientes que portan tumores que han desarrollado resistencia a regímenes de tratamiento convencionales o que presentan una alta probabilidad de desarrollar una recidiva tras el tratamiento convencional.
La alta inmunogenicidad de los adenovirus hace que los vectores adenovirales sean candidatos particularmente buenos para su utilización en el contexto de un portador de vacuna diseñado para romper la tolerancia del huésped a un autoantígeno. El fenómeno de propagación de determinantes o epítopos, que se describió por primera vez en enfermedades autoinmunitarias, se ha asociado con respuestas restringidas tanto por el CMH de clase I como por el CMH de clase II y se ha correlacionado con el desarrollo de inmunidad de células T específica de proteína HER-2/neu. La propagación de epítopos representa la generación de una respuesta inmunitaria frente a una parte particular de una proteína inmunogénica seguido por la propagación natural de la inmunidad a otros determinantes antigénicos presentes en la misma proteína. Por ejemplo, Disis et al. observaron propagación de epítopos en el 84% de los pacientes aquejados de tumores malignos que sobreexpresaban HER-2/neu a los que se les administraron vacunas que comprendían péptidos derivados de posibles epítopos auxiliares T de la proteína HER-2 mezclados con factor estimulante de las colonias de granulocitos y macrófagos (J. Clin. Oncol. (2002) 20(11): 2624-2632). De manera importante, se correlacionó la propagación de epítopos con la generación de una respuesta frente al dominio de proteína HER-2/neu y sugiere que la inmunización burló de manera eficaz la tolerancia inmunológica.
Los TAA que son adecuados para su utilización en los procedimientos y vectores adenovirales dados a conocer como diana para una vacuna contra el cáncer deben poseer varias características. Por ejemplo, un TAA diana debe presentar un perfil de expresión favorable, lo que significa que debe expresarse o sobreexpresarse preferentemente en el tumor o tejido maligno en comparación con el tejido normal. Además, debido a que los TAA que desempeñan un papel en la tumorigénesis es más probable que se conserven durante los diferentes estadios de la evolución del cáncer, un TAA diana adecuado debe conservarse también durante toda la metástasis y la evolución del tumor. Los TAA diana adecuados deben expresarse también de manera homogénea dentro del tumor. En tercer lugar, los TAA diana adecuados no deben ser sujeto de tolerancia inmunológica absoluta. Más específicamente, debe haber algunas pruebas de que las células T que pueden tanto reconocer como responder frente al TAA de interés no se han delecionado por completo del repertorio de células T del huésped (Berinstein, N. L., J. Clin. Oncol. 29(8): 2197 (2002).
El antígeno carcinoembrionario (CEA) presenta muchas características que lo hacen atractivo como TAA para su utilización como antígeno diana para una vacuna contra el cáncer. Es un miembro de la superfamilia de Ig que se caracteriza por un patrón de expresión favorable. Se expresa en más del 50% de todos los cánceres humanos y se ha implicado en el proceso de tumorigénesis, lo que sugiere que su expresión puede seleccionarse y conservarse durante toda la evolución del cáncer. Además, se ha establecido que la tolerancia inmunológica a CEA no es absoluta. Estudios publicados establecen que las células T humanas pueden reconocer, activarse frente y lisar células cancerosas que expresan CEA (Berinstein, N. L., J. Clin. Oncol. 29(8): 2197 (2002). Por ejemplo, la inmunización de pacientes con virus vaccinia recombinante que expresa CEA, combinada con estimulaciones in vitro posteriores a base de péptidos, generaba CTL restringidos por el CMH CD8+ que podían lisar tumores autólogos (Tsang, K. Y. et al. J. Natl. Cancer Inst., (1995) 87:982-990). Alternativamente, se notificó que la inmunización de pacientes con carcinoma colorrectal tras la cirugía con CEA recombinante inducía respuestas celulares y de anticuerpos débiles frente a CEA recombinante (Samanci, A., et al. (1998) Cancer Immunol. Immunother. 47: 131-142.) Además, la administración de anticuerpos antiidiotípico anti-CEA a pacientes con diagnóstico de cáncer colorrectal generaba anticuerpos anti-CEA y proliferación de células T específicas de idiotipo (Foon, L, A. et al. (1995) J. Clin. Invest., 96: 334-342). La bibliografía indica también que la tolerancia a CEA en pacientes con cáncer puede superarse con varios enfoques de vacunación diferentes (es decir, vacunación con CEA recombinante o virus orthopox o avipox-CEA recombinantes, administración de anticuerpos anti-idiotipo, pulsado de células dendríticas con epítopos agonistas de CEA).
CEA es una glicoproteína oncofetal que se expresa en colon fetal normal y en un grado mucho menor en mucosa colónica normal. Se sobreexpresa también en la gran mayoría de adenocarcinomas, particularmente los del colon, páncreas, mama, pulmón, recto y estómago. Muchos cánceres colorrectales y algunos carcinomas producen altos niveles de CEA que pueden medirse en suero, lo que le convierte en uno de los marcadores serológicos de tumores malignos más ampliamente utilizados, especialmente en pacientes con cáncer colorrectal.
Un segundo TAA que proporciona un inmunógeno adecuado para su utilización en las composiciones y los procedimientos de la invención es producto del protooncogén HER2/erb-2 (también denominado neu). Como CEA, HER2/neu presenta un patrón de expresión favorable y no es sujeto de tolerancia absoluta. Más específicamente, se detectan bajos niveles de expresión del transcrito HER2/neu, y el producto de polipéptido de 185 kD, en células epiteliales adultas normales de diversos tejidos, incluyendo la piel y las mamas, y tejidos del tubo digestivo, las vías reproductivas y las urinarias; se detectan niveles de expresión superiores en los tejidos fetales correspondientes durante el desarrollo embrionario (Press et al., Oncogene 5: 953-962 (1990). Varios conjuntos de pruebas sugieren un vínculo entre la amplificación de HER-2 y la transformación neoplásica en tumores de mama, pulmón, próstata, ovarios, endometriales y colorrectales humanos (Disis y Cheever, Adv. Cancer Research 71: 343-371(1997). En términos generales, la sobreexpresión de HER2/neu se correlaciona con un mal pronóstico y una tasa de recidiva superior para pacientes con cáncer (Slamon et al., Science 244: 707-712 (1989). Por tanto, una vacuna específica para la proteína HER-2/neu podría presentar una amplia aplicación y utilidad en la prevención de la recidiva de la enfermedad en muchos tumores malignos humanos diferentes.
HER2/neu codifica para una glicoproteína transmembrana que posee actividad tirosina cinasa intrínseca y que presenta homología extensa con el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Akiyama, T et al., (1986) Science 232: 1644-1646). Uno de los primeros estudios clínicos que utilizaron HER2 como diana para la inmunoterapia contra el cáncer empleó el anticuerpo monoclonal específico de HER-2 Herceptina para el tratamiento del cáncer de mama (Goldenberg MM (1999) Clin. Ther. 21: 309-318). Esto condujo a esfuerzos posteriores que se centraron en la utilización de HER-2 como diana para que la rama de células T del sistema inmunitario produjese respuestas antitumorales eficaces, incluyendo la utilización de proteínas de fusión recombinantes que comprenden dominios de HER-2 para activar células presentadoras de antígeno autólogas. Informes publicados establecen que numerosos pacientes con cáncer aquejados de cánceres de ovarios y mama que expresan neu montaron respuestas inmunitarias (por ejemplo, producción de células T y anticuerpos específicos de antígeno) contra el producto proteico del oncogen
HER2/neu.
El ensamblaje de las secuencias adenovirales recombinantes, el transgén y otros elementos del vector para dar diversos plásmidos intermedios y vectores lanzadera, y la utilización de los plásmidos y vectores para producir una partícula viral recombinante, se logran todos utilizando técnicas convencionales descritas en manuales convencionales que conocen bien los expertos en la materia (Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989). Tales técnicas incluyen, pero no se limitan a técnicas de clonación de ADNc convencionales, utilización de secuencias de oligonucleótidos solapantes derivadas del genoma adenoviral, recombinación homóloga, reacción en cadena de la polimerasa, técnicas de transfección convencionales, formación de placas de virus en recubrimiento de agar y otras metodologías relacionadas.
Para ayudar en la preparación de polinucleótidos en células procariotas, se prepara a menudo una versión de plásmido del vector de adenovirus (preplásmido de adenovirus). El preplásmido de adenovirus contiene una parte adenoviral y una parte de plásmido. La parte adenoviral es esencialmente igual que la parte adenoviral contenida en los vectores adenovirales de la invención (que contienen secuencias adenovirales con regiones E1 y opcionalmente E3 no funcionales o delecionadas) y un casete de expresión de inmunógeno, flanqueado por sitios de restricción convenientes.
La parte de plásmido del preplásmido de adenovirus contiene a menudo un marcador de resistencia a antibióticos bajo el control transcripcional de un promotor procariota de modo que la expresión del antibiótico no se produce en absoluto en células eucariotas. Pueden utilizarse genes de resistencia a ampicilina, genes de resistencia a neomicina y otros marcadores de resistencia a antibióticos farmacéuticamente aceptables. Para ayudar en el alto nivel de producción del polinucleótido mediante fermentación en organismos procariotas, es ventajoso que el preplásmido de adenovirus contenga un origen de replicación procariota y presente un alto número de copias. Varios vectores de clonación procariotas comercialmente disponibles proporcionan estos beneficios. Es deseable eliminar secuencias de ADN no esenciales. También es deseable que los vectores no puedan replicarse en células eucariotas. Esto minimiza el riesgo de integración de las secuencias de vacunas polinucleotídicas en el genoma de los receptores. Pueden utilizarse potenciadores o promotores específicos de tejido siempre que sea deseable para limitar la expresión del polinucleótidos a un tipo de tejido particular.
Pueden generarse preplásmidos de adenovirus (plásmidos que comprenden el genoma del adenovirus de replicación defectuosa con inserciones y deleciones deseadas) mediante recombinación homóloga utilizando ADN de estructuras principales de adenovirus y un vector lanzadera apropiado (diseñado para seleccionar como diana deleciones específicas e incorporar sitios de restricción deseados en el plásmido resultante). Pueden generarse vectores lanzadera de utilización en este procedimiento utilizando procedimientos generales ampliamente entendidos y apreciados en la técnica, por ejemplo, PCR de los extremos terminales adenovirales teniendo en cuenta las deleciones deseadas, y la clonación secuencial de los segmentos respectivos en un plásmido de clonación apropiado. El preplásmido adenoviral puede digerirse y transfectarse entonces en la línea celular de complementación mediante coprecipitación con fosfato de calcio u otros medios adecuados. Se produce entonces amplificación y replicación del virus, un fenómeno que se hace evidente por el notable efecto citopático. Se recogen entonces los medios y las células infectadas tras completarse la replicación viral (generalmente, 7-10 días tras la transfección).
En términos generales, tras la construcción y el ensamblaje de los preplásmidos de adenovirus deseados, se rescatan los preplásmidos de adenovirus en los virus transfectando una línea celular humana que expresa E1 adenoviral. La complementación entre la línea celular de empaquetamiento y los genes virales del vector permite que las secuencias de adenovirus-transgén del vector se repliquen y empaqueten en cápsides de viriones, dando como resultado la producción de adenovirus recombinantes. Los virus resultantes pueden aislarse y purificarse mediante cualquiera de una variedad de procedimientos conocidos por los expertos en la materia para su utilización en los procedimientos de la invención.
Resultará evidente para los expertos en la materia que cuando una o varias deleciones seleccionadas de entre genes adenovirales de chimpancé se introducen en un vector viral, la función del producto génico delecionado puede suministrarse durante el procedimiento de producción por secuencias presentes en la línea celular de producción. Por tanto, la función de los genes manipulados puede proporcionarse mediante una línea celular transformada de manera permanente que se caracteriza por alguna o todas las funciones adenovirales que se requieren para el empaquetamiento pero que no son funcionales en el vector (por ejemplo, cualquiera de E1A, E1B, E2A, E2B E4). Alternativamente, las funciones adenovirales requeridas pueden proporcionarse a una línea celular de empaquetamiento adecuada infectando o transfectando de manera transitoria una célula adecuada con un constructo que comprende el gen requerido para proporcionar la función.
Por consiguiente, la presente invención también proporciona un procedimiento de producción de vectores adenovirales de chimpancé en líneas celulares humanas que expresan E1. Más específicamente, los vectores dados a conocer pueden propagarse en una línea celular de complementación de E1, incluyendo las líneas celulares conocidas 293 y PER.C6^{TM}. Ambas líneas celulares expresan el producto génico E1 adenoviral. PER.C6^{TM} se describe en el documento WO 97/00326, publicado el 3 de enero de 1997. Es una línea celular de retinoblasto humano primario transducida con un segmento del gen E1 que complementa la producción de adenovirus de la primera generación de replicación defectuosa, pero se diseña para impedir la generación de adenovirus de replicación competente mediante recombinación homóloga. Las células 293 se describen en Graham et al (1977) J. Gen. Virol 36:59-72, que también se incorpora a la presente memoria como referencia. Un experto en la materia reconocerá que la expresión "adenovirus de la primera generación" se refiere a un adenovirus de replicación defectuosa que presenta una región E1 o bien no funcional o bien delecionada, y opcionalmente una región E3 no funcional o delecionada.
Debe comprobarse que los lotes de vectores adenovirales de replicación defectuosa que están destinados a su utilización como composición de vacuna en un ensayo clínico estén libres de RCA (Fallaux, F.J. et al (1998) Human Gene Therapy, 9:1909-1917). En la práctica, esto es un procedimiento laborioso que requiere establecer y utilizar un programa de selección caro. Un experto en la materia admitirá que una alta frecuencia de generación de RCA no sólo da como resultado una alta tasa de fallo para los lotes producidos, sino que también limita gravemente los esfuerzos de aumento a escala. La eliminación de la homología de secuencia entre la secuencia de nucleótidos del vector y las secuencias adenovirales presentes en el genoma de la línea celular de empaquetamiento/producción auxiliar debe limitar la posibilidad de producir lotes del vector que estén contaminados con RCA producidos mediante recombinación homóloga.
Normalmente, los vectores adenovirales de replicación defectuosa recombinantes se propagan en líneas celulares que proporcionan productos génicos de E1 en trans. La suplementación de los productos génicos de E1 esenciales en trans es muy eficaz cuando los vectores son del mismo serotipo o uno muy similar. Por ejemplo, es bien sabido que los vectores de serotipo del grupo C (Ad2 y Ad5) delecionados en E1 (es decir, \DeltaE1) pueden propagarse en células 293 o PER.C6 que contienen y expresan la región E1 de Ad5. Sin embargo, se ha observado que las secuencias de E1 de Ad5 presentes en las células de producción 293 y PER.C6 no siempre complementan totalmente la replicación de serotipos que no son del grupo C. Por consiguiente, los serotipos delecionados en E1 fuera del subgrupo C, por ejemplo los de los subgrupos A, B, D, E y F, pueden replicarse con una eficacia inferior respecto al virus de tipo natural correspondiente o pueden no replicarse en absoluto en las células 293 o PER.C6. Esto puede deberse a la incapacidad del producto génico de E1 B 55 K de Ad5 (grupo C) para establecer una interacción funcional con el producto génico de E4 orf6 de los serotipos que no son del grupo C.
La disminución de la eficacia de replicación en células que expresan E1 de Ad5 es variable considerando vectores de diferentes subgrupos. Mientras que los vectores \DeltaE1 que se derivan de adenovirus del subgrupo D y E pueden rescatarse y propagarse en células 293 y Per.C6^{TM} con eficacia variable, la propagación de vectores \DeltaE1 del subgrupo B está completamente alterada (Vogels R, et al. (2003) Aug. Replication-deficient human adenovirus type 35 vectors for gene transfer and vaccination: efficient human cell infection and bypass of preexisting adenovirus immunity. J Virol. 77 (15):8263-71).
Aunque la interacción entre E1b 55 k de Ad5 y el vector que expresa la proteína E4 orf6 se conserva dentro de los miembros del mismo subgrupo, puede no ser suficientemente estable cuando se expresa la proteína E4 orf6 de un serotipo que no es C. Esta formación ineficaz o inestable del complejo E1B-55K/E4-orf6 conduce a una ausencia de propagación reducida del vector \DeltaE1. Por consiguiente, se ha determinado empíricamente que con el fin de rescatar satisfactoria y eficazmente adenovirus recombinantes de serotipos del grupo B, puede ser necesario generar una línea celular que exprese la región E1 del serotipo de interés. En células que expresan Ad5E1 como 293 o Per.C6^{TM}, la expresión puede limitarse a la proteína E1b 55K. Alternativamente, podría modificarse una línea celular adecuada que expresa Ad5E1 para que exprese la región E4 de Ad5 completa (o E4 orf6 sólo) además de Ad5E1. La generación de líneas celulares que expresan tanto E1 de Ad5 como orf6 es útil en la complementación de serotipos de adenovirus alternativos; véase, por ejemplo, Abrahamsen et al., 1997 J. Virol. 8946-8951. Se muestra la incorporación de E4 (orf6) en líneas celulares de complementación de Ad5, como en la generación de líneas celulares específicas de serotipo proporcionan producto(s) génico(s) de E1 específico(s) de serotipo en trans. Alternativamente, puede mejorarse la eficacia de la propagación de un vector que no es del grupo C mediante la modificación de la estructura principal viral sustituyendo la región E4 nativa por Ad5 orf6. Pueden lograrse resultados similares sustituyendo sólo el orf6 nativo por un orf6 que se deriva de Ad5 u otros virus del subgrupo C (Ad1, Ad2, Ad6). La patente US nº 5.849.561 da a conocer la complementación de un vector de adenovirus que no es del grupo C delecionado en E1 en una línea celular de complementación de Ad5-E1 que también expresa parte del gen Ad5-E4.
La patente US nº 6.127.175, concedida a Vigne, et al., da a conocer una línea celular de mamífero transfectada de manera estable que expresa una parte de la región E4 de adenovirus, preferiblemente orf6/orf6/7. Una línea celular de este tipo es útil para la complementación de genomas Ad recombinantes deficientes en la región E4.
Las composiciones, incluyendo composiciones de vacuna, que comprenden los vectores adenovirales dados a conocer son un aspecto importante de la presente invención. Estas composiciones pueden administrarse a huéspedes mamíferos, preferiblemente huéspedes humanos, en un entorno o bien profiláctico o bien terapéutico. Los posibles huéspedes/vacunados incluyen pero no se limitan a primates y especialmente seres humanos y primates no humanos, e incluyen cualquier mamífero no humano de importancia veterinaria doméstica o comercial. Pueden administrarse composiciones que comprenden vectores adenovirales de chimpancé recombinantes solas o en combinación con otras vacunas de proteínas/ADN basadas en virus o no basadas en virus. También pueden administrarse como parte de un régimen de tratamiento más amplio.
En una forma de realización particular de la invención, los vectores dados a conocer pueden utilizarse en un protocolo de inmunización diseñado para romper la tolerancia del huésped a un autoantígeno o un antígeno asociado a tumor. La identificación de varios TAA ha permitido el desarrollo de enfoques de vacunación activa para la terapia del cáncer. Tanto antígenos de la superficie celular como antígenos intracelulares que se procesan y presentan proporcionan dianas útiles. En términos generales, el procedimiento dado a conocer de rotura de la tolerancia del huésped a un autoantígeno comprende: (a) estimular una respuesta específica de antígeno frente a un autoantígeno administrando una primera composición de vacuna que comprende un primer vector de ChAd o un vector de plásmido que porta una secuencia de nucleótidos que codifica para el autoantígeno contra el que se desea una respuesta inmunitaria específica de antígeno, y (b) sostener y expandir la respuesta inmunitaria de (a) administrando una segunda composición de vacuna que comprende un vector de ChAd recombinante de un serotipo diferente que contiene por lo menos una deleción funcional de su gen E1 genómico, y en el sitio del gen E1, una secuencia que comprende un promotor que puede dirigir la expresión de ADN que codifica para el mismo autoantígeno suministrado en la etapa de sensibilización, mediante lo cual el huésped monta una respuesta inmunitaria que presenta el efecto de romper la tolerancia al autoantígeno.
Por consiguiente, un experto en la materia puede utilizar esta descripción para diseñar varios protocolos de inmunización diferentes que pueden ser adecuados para su utilización para romper la tolerancia del huésped. Por ejemplo, puede ser posible utilizar un protocolo en el que la primera, o la inmunización de sensibilización, comprende un ADN de plásmido que codifica para un autoantígeno particular, tal como TAA y cualquier inmunización posterior comprende un vector de ChAd. Las secuencias de ADN de plásmido que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican para autoantígenos pueden suministrarse por vía intramuscular, con o sin electroestimulación, en una o varias inyecciones. Por ejemplo, el procedimiento general dado a conocer y reivindicado en la presente memoria abarca un protocolo de inmunización basado en inyecciones intramusculares múltiples (por ejemplo, 3 ó 4 ó 5) de ADN de plásmido que codifica para un TAA mediante electroporación seguido por una o varias inyecciones intramusculares de un vector de ChAd que comprende un transgén que codifica para el mismo TAA.
Alternativamente, un protocolo adecuado para romper la tolerancia podría implicar una o varias inmunizaciones de sensibilización con un vector de ChAd o hAd que comprende un transgén que codifica para un autoantígeno, seguido por una o varias inmunizaciones de refuerzo con o bien el mismo o bien un vector de ChAd diferente que se sabe que no produce reacción cruzada con el vector utilizado para la(s) inmunización/inmunizaciones de sensibilización. Por ejemplo, podría utilizarse un protocolo de inmunización que utiliza ChAd3 para la sensibilización y ChAd6 para el refuerzo, o ChAd3 para la sensibilización seguido por ChAd6 y ChAd9 para el refuerzo, para romper la tolerancia del huésped. En formas de realización particulares, la invención contempla la utilización de autoantígenos que comprenden por lo menos un antígeno asociado a tumor seleccionado de entre el grupo constituido por: HER2/neu, CEA, EpCAM, PSA, PSMA, Telomerasa, gp100, Melan-A/MART-1, Muc-1, NY-ESO- 1, Survivina, Estromelisina 3, Tirosinasa, MAGE3, CML68, CML66, OY-TES-1, SSX-2, SART-1, SART-2, SART-3, NY-CO-58, NY-BR-62, hKLP2, VEGF. En una forma de realización particular, la invención proporciona un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria (por ejemplo humoral o mediada por células) frente a un antígeno asociado a tumor que es específico para un tumor maligno seleccionado suministrando un adenovirus de chimpancé recombinante que codifica para el TAA a un mamífero aquejado de cáncer. En una forma de realización preferida de este aspecto de la invención, la respuesta inmunitaria producida constituye una respuesta inmunitaria caracterizada por la producción de células T CD4+ y CD8+ específicas de antígeno.
Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden administrarse a huéspedes mamíferos, preferiblemente huéspedes humanos, en un entorno o bien profiláctico o bien terapéutico. Los posibles huéspedes/vacunados incluyen pero no se limitan a primates y especialmente seres humanos y primates no humanos, e incluyen cualquier mamífero no humano de importancia veterinaria doméstica o comercial. Pueden administrarse composiciones que comprenden vectores adenovirales de chimpancé recombinantes solas o en combinación con otras vacunas de proteínas/ADN basadas en virus o no basadas en virus. También pueden administrarse como parte de un régimen de tratamiento más amplio. Las composiciones adecuadas, para su utilización en los procedimientos de la invención, pueden comprender los vectores virales recombinantes de la invención en combinación con componentes fisiológicamente aceptables, tales como un tampón, solución salina normal o solución salina tamponada con fosfato, sacarosa, otras sales y polisorbato. No provoca irritación de los tejidos tras su inyección intramuscular. Preferiblemente, se congela hasta su utilización. Opcionalmente, puede formularse una composición de vacuna de la invención para que contenga otros componentes, tales como pero sin limitarse a, un adyuvante, un estabilizador, un agente de ajuste del pH o un conservante. Tales componentes los conoce bien el experto en la materia.
Se prevé que los adenovirus de chimpancé recombinantes de la invención se administren a huéspedes humanos o veterinarios en una "cantidad eficaz", es decir, una cantidad de virus recombinante que sea eficaz en una vía de administración elegida para transducir células huéspedes y proporcione niveles de expresión suficientes del transgén para provocar una respuesta inmunitaria que confiera un beneficio terapéutico o inmunidad protectora al receptor/vacunado.
La cantidad de partículas virales en la composición de vacuna que va a introducirse en un receptor de la vacuna dependerá de la fuerza de los promotores de la transcripción y traducción utilizados y de la inmunogenicidad del producto génico expresado. En general, se administra directamente en el tejido muscular una dosis inmunológica o profilácticamente eficaz de 1x10^{7} a 1x10^{12} partículas (es decir, 1x 10^{7}, 2x10^{7}, 3x10^{7}, 5x10^{7} 1x10^{8}, 2x10^{8}, 3x10^{8}, 5x10^{8} ó 1x10^{9}, 2x10^{9}, 3x10^{9}, 5x10^{9}) y preferiblemente de aproximadamente 1x10^{10} a 1x10^{11} partículas. También se contemplan inyección subcutánea, introducción intradérmica, impresión a través de la piel y otros modos de administración tales como administración intraperitoneal, intravenosa o por inhalación.
Los vectores adenovirales de chimpancé recombinantes de la presente invención pueden administrarse solos, como parte de un régimen de vacunación de sensibilización/refuerzo de modalidad mixta o en un régimen de vacunación basado en la combinación de múltiples inyecciones de diferentes serotipos de vectores. Normalmente, se administra(n) una(s) dosis de sensibilización que comprende(n) por lo menos un inmunógeno a un huésped mamífero que necesita una respuesta inmunitaria eficaz frente a un autoantígeno o patógeno particular. Esta dosis sensibiliza de manera eficaz la respuesta inmunitaria de modo que, tras la identificación posterior del/de los antígeno(s), el huésped puede montar inmediatamente una respuesta inmunitaria potenciada o reforzada frente al inmunógeno. Un esquema de vacunación de modalidad mixta que utiliza formulaciones alternativas para la sensibilización y el refuerzo puede dar como resultado una respuesta inmunitaria potenciada. Las administraciones de sensibilización-refuerzo implican normalmente la sensibilización del sujeto (mediante un vector viral, plásmido, proteína, etc.) por lo menos una vez, dejando que pase un periodo de tiempo predeterminado, y entonces realizar el refuerzo (mediante un vector viral, plásmido, proteína, etc.). Se emplean habitualmente inmunizaciones múltiples, normalmente 1-4, aunque pueden utilizarse más. El periodo de tiempo entre la sensibilización y el refuerzo puede variar normalmente desde aproximadamente cuatro meses hasta un año, aunque pueden utilizarse otros marcos de tiempo tal como apreciará un experto habitual en la materia. Pueden administrarse inyecciones múltiples de cada vector en el plazo de aproximadamente un marco de tiempo de 2 semanas, antes de que la inmunidad neutralizante se haga evidente.
En algunas formas de realización de la presente invención, una vacuna administra más de una administración de vector de vacuna de adenovirus, y puede administrarse en un régimen acompañado por la administración de una vacuna de plásmido. Las vacunas de plásmidos adecuadas para su utilización en combinación con los vectores dados a conocer en la presente memoria comprenden un plásmido que codifica para por lo menos un inmunógeno contra el que se desea una respuesta inmunitaria sensibilizada o reforzada, en combinación con un promotor heterólogo, que puede dirigir la expresión de las secuencias de ácido nucleico que codifican para el/los inmunógeno(s), funcionalmente unido a la secuencia que codifica para el inmunógeno, y una secuencia de terminador de la transcripción.
Por ejemplo, puede utilizarse un régimen de dosificación que utiliza inyecciones múltiples de diferentes serotipos de vectores adenovirales de chimpancé de replicación defectuosa. Alternativamente, puede administrarse a un individuo una primera dosis (es decir, una dosis de sensibilización) de una vacuna de plásmidos, y una segunda dosis (es decir, una dosis de refuerzo) que comprende un vector adenoviral de chimpancé recombinante de replicación defectuosa que comprende una secuencia que codifica para el mismo inmunógeno que se suministró en la vacuna de plásmidos. Alternativamente, puede administrarse al individuo una primera dosis de un vector de vacuna de adenovirus humano que codifica para por lo menos un inmunógeno, seguido por una segunda dosis que comprende un vector adenoviral de chimpancé recombinante de replicación defectuosa dado a conocer en la presente memoria, que comprende una secuencia codificante para el mismo inmunógeno que se suministró en la dosis de sensibilización. En una segunda forma de realización alternativa, puede administrarse en primer lugar una composición de vacuna que comprende un vector de la invención, seguido por la administración de una vacuna de plásmidos. En cualquiera de estas formas de realización, pueden administrarse a un individuo múltiples dosis del mismo inmunógeno o bien en forma de plásmido o bien de vector viral. Puede haber una cantidad de tiempo mínima predeterminada que separa las administra-
ciones.
Además de administrarse una única proteína o antígeno de interés mediante los vectores de adenovirus de chimpancé de replicación defectuosa, recombinantes, de la presente invención pueden administrarse dos o más proteínas o antígenos o bien mediante vehículos separados o bien administrarse mediante el mismo vehículo. Pueden ligarse múltiples genes/equivalentes funcionales en un plásmido lanzadera apropiado para la generación de un preplásmido de adenovirus que comprende múltiples marcos de lectura abiertos. Los marcos de lectura abiertos para los múltiples genes/equivalentes funcionales pueden estar funcionalmente unidos a distintos promotores y secuencias de terminación de la transcripción.
Tal como se muestra en la presente memoria, los regímenes de inmunización adecuados pueden emplear diferentes serotipos adenovirales. Un ejemplo de un protocolo de este tipo sería una(s) dosis de sensibilización que comprende(n)
un vector adenoviral recombinante de un primer serotipo, por ejemplo un ChAd3 o ChAd6 seguido por una dosis de refuerzo que comprende un vector adenoviral de chimpancé recombinante de un segundo serotipo. En una forma de realización alternativa, la dosis de sensibilización puede comprender una mezcla de vehículos adenovirales separadas que comprenden cada uno un gen que codifica para una proteína/un antígeno diferente. En tal caso, la dosis de refuerzo comprendería también una mezcla de vectores que comprende cada uno un gen que codifica para una proteína/un antígeno separado, siempre que la(s) dosis de refuerzo administre(n) vectores virales recombinantes que comprenden material genético que codifica para el mismo conjunto o similar de antígenos que se administraron en la(s) dosis de sensibilización. Estas modalidades de administración de genes/vectores múltiples pueden combinarse adicionalmente. Está adicionalmente dentro del alcance de la invención emprender regímenes de modalidad combinada que incluyen componentes múltiples aunque distintos de un antígeno específico.
La utilización de vectores recombinantes derivados de adenovirus de chimpancé que no se neutralizan por la inmunidad preexistente dirigidos contra los elementos virales de vector humano ofrece una alternativa a la utilización de vectores de Ad humanos como portadores de vacuna. Debido a que los adenovirus son sumamente inmunogénicos, los vectores adenovirales son candidatos particularmente buenos para su utilización en el contexto de un portador de vacuna diseñado para romper la tolerancia del huésped a un autoantígeno. Además, la capacidad para propagar los virus de chimpancé en células humanas, particularmente en la línea celular Per.C6^{TM}, con una eficacia comparable a virus humanos, ofrece ventajas considerables tanto desde un punto de vista regulatorio como para la producción a gran escala de compuestos terapéuticos o vacunas. Por consiguiente, la presente invención proporciona una colección de plásmidos, vectores y secuencias adenovirales de chimpancé que permiten la preparación de virus recombinantes que pueden utilizarse, solos o en combinación, como portador de vacuna para vacunación genética.
Habiendo descrito formas de realización preferidas de la invención haciendo referencia a los dibujos adjuntos, se entiende que la invención no se limita a esas formas de realización precisas, y que un experto en la materia puede efectuar en la misma diversos cambios y modificaciones. Los siguientes ejemplos ilustran, pero no limitan la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1
Aislamiento, clonación, secuenciación y caracterización de ChAd Aislamiento de adenovirus de chimpancé
Se recogieron muestras de deposiciones en medio de transporte viral (VTM; Microtest M4-R Multi-Microbe Transport Medium, Remel Inc.), luego se congelaron o se congelaron directamente a -70ºC en el NIRC (New Iberia Research Center 4401 W. Admiral Doyle Drive New Iberia, LA 70560). Se mantuvieron congeladas las muestras a < -70ºC hasta que se procesaron para su inoculación en cultivos celulares. En ese momento, se descongelaron las muestras y entonces se agitaron con vórtex en exceso de medio de transporte viral enfriado. Tras haberse disociado las muestras en suspensiones, se centrifugaron durante 10 min. a 1500-1800 rpm. Se filtraron los sobrenadantes a través de filtros de jeringa de 0,8 y 0,2 \mum en serie y entonces se inoculó el material filtrado en cultivos celulares (200-250 \mul en viales con tapa y 250-300 \mul en cultivos en tubo). Se inoculó cada muestra procesada en cultivos en tubo y cultivos en viales con tapa sembrados con células 293 o células A549.
Se prepararon cultivos control (positivo y negativo) cada vez que se inoculó un conjunto de muestras. Una vez que se habían inoculado todos los viales con tapa en un sistema, se centrifugaron a temperatura ambiente durante 60 \pm 10 min. a 2000 rpm (900 x g). Se retiraron los viales de la centrífuga inmediatamente tras detener la rotación del rotor para evitar el daño por calor en los cultivos. Tras la centrifugación, se aspiraron los inóculos de los viales con tapa, utilizando una pipeta Pasteur estéril nueva en cada vial para evitar la contaminación cruzada. Se lavaron los cultivos tres veces utilizando 1,0 ml de medio de cultivo nuevo para cada lavado. Se pipeteó medio nuevo (1,0 ml) en cada vial tras el tercer lavado y se colocaron los viales con tapa en un incubador a 35-37ºC durante de tres a cuatro días (aproximadamente 96 h).
Al final del periodo de cultivo, se aspiraron los sobrenadantes de los cultivos y se lavó la capa de células de cada vial dos veces con tampón de ensayo de inmunofluorescencia (IFA) utilizando aproximadamente 1,0 ml de tampón con cada lavado. Se fijaron las células añadiendo 1,0 ml de acetona refrigerada a cada vial (10 min. a 2-8ºC). Se marcaron portaobjetos limpiados con acetona con el/los número(s) de identificación de la muestra asociado(s) con los cubreobjetos de vial con tapa. Se procesaron los cubreobjetos de vial con tapa para el marcaje mediante fluorescencia de células infectadas por adenovirus utilizando un anticuerpo de ratón primario anti-adenovirus [MAB8052, Chemicon]. Se evaluaron los portaobjetos con la ayuda de un microscopio de fluorescencia. Se exploró cada preparación utilizando el objetivo 10X observando el grado de cobertura de inmunofluorescencia a través del pocillo (de 1+ a 4+). Se confirmó la presencia o ausencia de inmunofluorescencia específica utilizando el objetivo 40X. Se inocularon cultivos en tubo en la misma secuencia que se describió para los viales con tapa (por ejemplo, control negativo primero, seguido por muestras clínicas y controles positivos). Se dejó que los inóculos se adsorbieran durante 60-120 min. a 36-38ºC. Tras el periodo de adsorción, se aspiraron las muestras/los controles de los tubos y se sustituyeron por medio de cultivo nuevo.
De tres a cuatro días tras la inoculación, y una vez a la semana después de eso, se aspiró el medio de los tubos de cultivo y se sustituyó por 1,5 ml de medio nuevo. Se monitorizaron visualmente los tubos de cultivo para detectar CPE por lo menos cada dos días durante por lo menos 21 días tras la inoculación. Los cultivos inoculados con muestras de chimpancé se compararon con los controles y se clasificaron observando el grado de CPE. Los cultivos que no mostraban CPE se pasaron a cultivos en tubo nuevos tras 14 días; los tubos de cultivo que eran negativos para CPE tras 21 días se consideraron negativos. Los tubos de cultivo con CPE 3-4+ se agitaron con vórtex durante 10 segundos. Se rasparon las células de la pared del tubo utilizando una pipeta serológica de 1,0 ml estéril y se suspendieron en el sobrenadante de cultivo. Tras marcar un tubo con tapón a presión de 5 ml con la fecha y el número de identificación de la muestra y almacenarse a -70ºC, se transfirieron 500 \mul de la suspensión celular del tubo de cultivo al tubo con tapón a presión y se almacenó durante hasta un día a 2-8ºC hasta que se procesó utilizando una técnica de anticuerpos inmunofluorescente indirecta para detectar adenovirus (equivalente al procedimiento para teñir viales con tapa).
Amplificación de adenovirus de chimpancé
Se adquirieron adenovirus de chimpancé de tipo natural CV32, CV33, CV23 y CV68 de la ATCC (números de registro de la ATCC: CV32, VR-592; CV-33, VR-593;) o de Esoterix Inc. Austin, Texas y se propagaron aislados originales tal como sigue utilizando la línea celular de expresión de E1 humano PER.C6^{TM} o 293. En resumen, se cultivaron células en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; GibcoBRL, Life Technologies) complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS GibcoBRL, Life Technologies), penicilina-estreptomicina al 1%, glutamina 2 mM y MgCl_{2} 10 mM (Per.C6^{TM}). Se llevó a cabo la infección por adenovirus en DMEM complementado con suero de caballo al 5% (GibcoBRL, Life Technologies). Se recogieron el medio y las células infectadas cuando el 100% de las células mostraban efecto citopático (CPE) inducido por el virus y se lisaron mediante tres ciclos de congelación y descongelación.
Se clonaron todas las reservas adenovirales de chimpancé (CV) de tipo natural infectando células 293 sembradas en placas de 96 pocillos, tras el primer pase de amplificación. Se realizó la clonación del virus limitando la dilución del lisado celular obtenido en el primer pase de la amplificación del virus. Se recogieron cinco clones aislados y se propagaron en serie. Tras 3-4 pases de amplificación en serie, se realizó una preparación de adenovirus a gran escala en células plantadas en 5 factorías celulares de dos capas (NUNC) (200 millones de células/factoría celular). Se obtuvieron partículas virales purificadas del lisado celular mediante dos etapas de ultracentrifugación en gradientes de densidad de cloruro de cesio.
Secuenciación de ADN genómico viral
Se aisló ADN genómico a partir de 3 X 10^{12} pp de preparación de virus purificado mediante digestión con proteinasa K (0,5 mg/ml) en SDS-TEN al 1% (2 h a 55ºC). Tras una extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol, se resuspendió el ADN genómico en agua y se sometió a secuenciación genómica.
Para la secuenciación del genoma de Ad de longitud completa, se nebulizó el ADN viral purificado para producir fragmentos aleatoriamente cortados. Se hicieron romos los extremos de los fragmentos de ADN con el fragmento klenow de polinucleótido cinasa y ADN polimerasa de E. coli. Se procesaron los fragmentos de extremos romos en un gel de agarosa de bajo punto de fusión para purificar los fragmentos en el intervalo de tamaño de 1-3 kb y se clonaron en el sitio de SmaI del vector pUC19 para crear una biblioteca al azar. Se utilizaron los ligamientos para transformar XL1-Blue MRF' competente. Se identificaron colonias positivas mediante selección blanco/azul en agar LB que contenía X-gal e IPTG. Se aislaron de tres a cuatro bloques de 96 pocillos de ADN de plásmido de la biblioteca y se secuenciaron con cebadores directos e inversos pUC. Se examinaron todas las lecturas de secuenciación para determinar la calidad y la secuencia del vector utilizando el paquete de software Phred-Phrap. Las lecturas que pasaron el examen se ensamblaron en cóntigos. Se diseñaron cebadores para secuenciar directamente el ADN adenoviral para cerrar los huecos y determinar la secuencia de ADN de ambos extremos.
\newpage
\global\parskip0.930000\baselineskip
Se obtuvo la secuenciación del genoma viral completo para virus seleccionados incluyendo ChAd3 (SEC ID nº 1), ChAd6 (SEC ID nº 2), CV32 (SEC ID nº 3), CV33 (SEC ID nº 4) y CV23 (SEC ID nº 5). La tabla 1 proporciona datos que resumen el porcentaje de identidad entre las secuencias de nucleótidos de los genomas adenovirales de ChAd3, ChAd6, Pan5 (CV23), Pan6 (CV32), Pan7 (CV33), C1 y C68. Se calcularon alineaciones utilizando el programa ALIGN como parte del paquete FASTA versión 2 (William R. Penson, University of Virginia; Myers & Miller, CABIOS 1989, 4:11-17).
TABLA 1 Porcentaje de identidad de la secuencia de nucleótidos entre genomas de adenovirus de chimpancé
1
Para caracterizar los nuevos aislados adenovirales (por ejemplo, ChAd20, ChAd4, ChAd5, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 y ChAd82), se determinó también la secuencia de nucleótidos de los genes de hexones y fibras mediante paseo con cebador. Gen de fibras: SEQ ID NOS: 6-15: (SEC ID nº 6, ChAd20); (SEC ID nº 7, ChAd4); SEC ID nº 8, ChAd5); SEC ID nº 9, ChAd7); SEC ID nº 10, ChAd9); SEC ID nº 11, ChAd10); SEC ID nº 12, ChAd11); SEC ID nº 13, ChAd16), SEC ID nº 14, ChAd17), SEC ID nº 15, ChAd19) y (SEC ID nº 58, ChAd8), (SEC ID nº 60, ChAd22), (SEC ID nº 62, ChAd24), (SEC ID nº 64, ChAd26), (SEC ID nº 66, ChAd30), (SEC ID nº 68, ChAd31), (SEC ID nº 70, ChAd37), (SEC ID nº 72, ChAd38), (SEC ID nº 74, ChAd44), (SEC ID nº 76, ChAd63) y (SEC ID nº 78, ChAd82). Las figuras 20A-20G proporcionan una comparación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas de fibras de los aislados de ChAd dados a conocer y reivindicados en la presente memoria.
Las secuencias de genes de hexones se exponen en SEQ ID NOS: 16-25: (SEC ID nº 16, ChAd20); SEC ID nº 17, ChAd4); SEC ID nº 18, ChAd5); SEC ID nº 19, ChAd7); SEC ID nº 20, ChAd9); SEC ID nº 21, ChAd10) SEC ID nº 22, ChAd11); SEC ID nº 23, ChAd16); SEC ID nº 24, ChAd17), SEC ID nº 25, ChAd19), (SEC ID nº 97, ChAd8), (SEC ID nº 99, ChAd22), (SEC ID nº 101, ChAd24), (SEC ID nº 103, ChAd26), (SEC ID nº 105, ChAd30), (SEC ID nº 107, ChAd31), (SEC ID nº 109, ChAd37), (SEC ID nº 111, ChAd38), (SEC ID nº 113, ChAd44), (SEC ID nº 115, ChAd63) y (SEC ID nº 117, ChAd82). Las figuras 31A-31J proporcionan una comparación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas de hexones de los aislados de ChAd dados a conocer y reivindicados en la presente memoria.
Clasificación de adenovirus de chimpancé
La clasificación de las diferentes cepas adenovirales de chimpancé sigue la clasificación ya propuesta de serotipos de adenovirus humanos en 6 subgrupos (Horowitz, MS (1990) Adenoviridae and their replication. En Virology B.N. Fields y D.M. Knipe, eds (Raven Press, Nueva York) págs.1679-1740) y se obtuvo mediante alineación de la secuencia de aminoácidos y nucleótidos utilizando el programa Align X (Informax, Inc).
Se obtuvo una clasificación inicial de los nuevos aislados estudiando el patrón de restricción del genoma viral con diferentes endonucleasas de restricción y mediante análisis de secuencia de la región hipervariable 7 (HVR7) del gen de hexones. Para este fin, se diseñaron dos cebadores en las regiones sumamente conservadas que flanqueaban HVR7: TGTCCTACCARCTCTTGCTTGA (SEQ ID NO. 45) y GTGGAARGGCACGTAGCG (SEQ ID NO. 46). Se amplificó la HVR7 mediante PCR utilizando ADN viral purificado o lisado de 293 bruto como molde y entonces se secuenció. Basándose en el análisis de secuencia de HVR7, se clasificaron los nuevos virus aislados en los subgrupos (A-F) propuestos para virus Ad humanos (Horowitz, MS (1990) Adenoviridae and their replication. En Virology B.N. Fields y D.M. Knipe, eds (raven Press, Nueva York) págs.1679-1740).
Se obtuvo el árbol filogenético presentado en la figura 35 mediante alineación de las secuencias de aminoácidos de hexones de adenovirus de chimpancé y humanos. Los resultados concuerdan con la clasificación inicial basada en la alineación de la secuencia de nucleótidos limitada a HVR7 de hexones utilizando el programa Align X (Informax, Inc). Se dedujo el árbol a partir de una alineación de secuencias múltiples de secuencias de péptidos de hexones de longitud completa utilizando PAUPSEARCH (Wisconsin Package versión 10.3, Accelrys Inc.) y se visualizó y manipuló con TREEVIEW. Se realizó análisis de confianza bootstrap utilizando el programa PAUPSEARCH tal como se implementa en el paquete Wisconsin. Para cada una de las alineaciones, se ejecutó el programa en 1000 duplicados utilizando la "búsqueda heurística" como criterio de búsqueda y la parsimonia máxima como el criterio de optimalidad y se tomaron valores de confianza notificados a partir de un consenso según la regla de la mayoría del 50%.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2
Vector lanzadera de ChAd y construcción del vector de expresión y construcción del vector de rescate y rescate
Se clonó ADN genómico viral en un vector de plásmido convencional mediante recombinación homóloga con un vector lanzadera apropiado que contenía secuencias de ADN viral derivadas tanto del extremo izquierdo como del extremo derecho del genoma viral (figura 2). Tal como se describe más en detalle a continuación, se aprovechó la homología de secuencia observada entre virus clasificados en el mismo subgrupo de serotipo para desarrollar vectores lanzadera específicos de grupo. El ADN genómico viral de adenovirus de chimpancé clasificado en el subgrupo D y E resultó ser suficientemente homólogo como para permitir la construcción de un vector lanzadera común con el fin de clonar virus que pertenecen a ambos subgrupos.
Construcción de un vector lanzadera del subgrupo E/D
Se secuenció completamente el genoma viral de ChAd6 (SEC ID nº 2) y se utilizó la información obtenida para construir un vector lanzadera para facilitar la clonación mediante recombinación homóloga de adenovirus de chimpancé del subgrupo D y E.
La construcción del vector lanzadera de ChAd6, denominado en la presente memoria pARS ChAd6-3, se describe en figura 1. La figura 32 proporciona una lista de las secuencias de oligonucleótidos (SEQ ID NOS: 26-40 y SEQ ID NOS: 45-46) utilizadas en los experimentos de clonación descritos en la presente memoria. En resumen, se amplificaron 457 pb que se derivaban del extremo izquierdo del ADN de ChAd6 mediante PCR con los oligonucleótidos 5'-ATGGAATTCGTTTAAACCATCATCAATAATATACCTC-3 (SEC ID nº 27) y 5'-CGCTGGCACTCAA
GAGTGGCCTC-3' (SEC ID nº 28) digeridos con EcoRI y SnaBI y se clonaron en pNEBAd35-2 cortado con EcoRI-SnaBI, generando pNEBChAd6-LI. Se amplificó la ITR derecha de ChAd6 (pb 36222 a pb 36648) mediante PCR utilizando los oligonucleótidos: 5'-ATGAAGCTTGTTTAAACCCAT CATCAATAATATACCT-3 '(SEC ID nº 29) y
5'-ATCTAGACAGCGTCCATAGCTTACCG-3' (SEC ID nº 30) digeridos con las enzimas de restricción HindIII y XbaI y se clonó en pNEBChAd6-LI digerido con HindIII-XbaI generando así pNEBChAd6-RLI. Finalmente, se amplificó el fragmento de ADN correspondiente a los nucleótidos 3426-3813 de la secuencia de ADN genómico de ChAd6 con los oligonucleótidos: 5' ATGCTACGTAGCGATCGCGTGAGTAGTGTTTGGGGGTGGGTGGG-3' (SEC ID nº 31) y 5'-TAGGCGCGCCGCTTCTCCTCGTTCAGGCTGGCG-3' (SEC ID nº 32), digeridos con SnaBI y AscI, entonces se ligó con pNEBChAd6-RLI digerido con SnaBI-AscI generando así pNEBChAd6-RLIdE1.
Para mejorar la eficacia de la recombinación y la propagación de plásmidos en la cepa de E. coli DH5a, se cortó el fragmento de 1306 pb que contenía las ITR tanto izquierda como derecha de ChAd6 así como el fragmento del gen pIX mediante digestión con PmeI a partir de pNEBChAd6-RLIdE1 y se transfirió a un vector de plásmido diferente obtenido mediante amplificación por PCR con los oligonucleótidos 5'-GATCTAGTTAGTTTAAACGAATTCGGATCTGC
GACGCG-3' (SEC ID nº 33) y 5' TTCGATCATGTTTAAACGAAATTAAGAATTCGGATCC-3' (SEC ID nº 34) a partir de pMRKAd5SEAP. Esta etapa de ligamiento final generó el vector lanzadera de ChAd6 pARSChAd6-3.
Construcción de un vector lanzadera del subgrupo C
Se secuenció completamente el genoma viral de ChAd3 (SEC ID nº 1) y se utilizó la información obtenida para construir un vector lanzadera para facilitar la clonación mediante recombinación homóloga de adenovirus de chimpancé del subgrupo C.
En resumen, el vector lanzadera utilizado para clonar adenovirus de chimpancé del subgrupo C, denominado en la presente memoria pChAd3EGFP, se construyó tal como sigue: se amplificó un fragmento de ADN de ChAd3 (nt 3542-4105) que contenía la región codificante de pIX mediante PCR con los oligonucleótidos 5'-TATTCTGCGATCGCT
GAGGTGGGTGAGTGGGCG-3' (SEC ID nº 35) y 5'-TAGGCGCGCCCTTAAACGGCATTTGTGGGAG-3' (SEC ID nº 36) digeridos con SgfI-AscI, entonces se clonó en pARSCV32-3 digerido con SgfI-AscI, generando pARS-ChAd3D. Se amplificó el extremo derecho de ChAd3 (nt 37320-37441) mediante PCR con los oligonucleótidos 5'-CGTCTAGAAGACCCGAGTCTTACCAGT-3' (SEC ID nº 37) y 5'-CGGGATCCGTTTAAACCATCATCAATAA
TATACCTTATT-3' (SEC ID nº 38) digeridos con XbaI y BamHI, entonces se ligó con pARS-ChAd3D restringido con XbaI y BamHI, generando pARS-ChAd3RD. Se amplificó el extremo izquierdo del ADN viral de ChAd3 (nt 1-460) mediante PCR con los oligonucleótidos 5'-ATGGAATTCGTTTAAACCATCATCAATAATATACCTT-3' (SEC ID nº 39) y 5'-ATGACGCGATCGCTGATATCCTATAATAATAAAACGCAGACTTTG-3' (SEC ID nº 40) digeridos con EcoRI y SgfI, entonces se clonó en pARS-ChAd3RD digerido con EcoRI y SgfI, generando así pARS-ChAd3RLD. Se diseñó también el casete de ADN viral para que contuviese sitios de enzimas de restricción (PmeI) ubicados en el extremo de ambas ITR de modo que la digestión liberase ADN viral a partir de ADN de plásmido.
Construcción de un vector lanzadera del subgrupo B
La construcción de una lanzadera del subgrupo B siguió la estrategia ya descrita para las construcciones de lanzadera de los subgrupos C y D/E. En resumen, se modificó pARS-ChAd3RLD sustituyendo el extremo izquierdo, la región de pIX, el extremo derecho con los fragmentos correspondientes de ChAd30. Además, se sustituyó la región E4 de ChAd30 con E4orf6 de Ad5 que se clonó bajo el control del promotor de E4 de ChAd30. El plásmido lanzadera se denominó plásmido lanzadera pChAd30 EGFP.
Construcción de vectores adenovirales de chimpancé \DeltaE1
Subgrupo B: Se construyeron vectores de adenovirus de chimpancé del subgrupo B mediante recombinación homóloga en la cepa BJ5183 de E. coli. Se cotransformaron células BJ5183 con el vector lanzadera pChAd30EGFP digerido con BstEII y Bst1107I y ADN viral purificado de ChAd8 y ChAd30. La recombinación homóloga entre genes pIX, secuencias de ADN de la ITR derecha presentes en los extremos de la lanzadera pChAd30EGFP linealizada y ADN genómico viral permitió su inserción en el vector de plásmido, delecionando al mismo tiempo la región E1 que se sustituyó por el casete de expresión de EGFP. Se construyeron casetes de expresión basados en el promotor de citomegalovirus humano (CMVH) y la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (Bgh poliA) para expresar fosfatasa alcalina secretada (SEAP), EGFP, gag de VIH, región NS de VHC (tal como se describe en la figura 3 para vectores lanzadera de ChAd6) así como antígenos asociados a tumor como CEA y HER2/neu de origen humano y de mono rhesus. Se insertaron todos los casetes de expresión en vectores de ChAd30 mediante recombinación homóloga.
Subgrupo C: Se construyeron vectores de adenovirus de chimpancé del subgrupo C mediante recombinación homóloga en la cepa BJ5183 de E. coli. Se cotransformaron células BJ5183 con el vector lanzadera pChAd3EGFP digerido con BstEII y Bst1107I y ADN viral purificado de ChAd3, ChAd11, ChAd19 y ChAd20. La recombinación homóloga entre genes pIX, secuencias de ADN de ITR derecha presentes en los extremos de pChAd3EGFP linealizado y ADN genómico viral permitió su inserción en el vector de plásmido, delecionando al mismo tiempo la región E1 que se sustituyó por el casete de expresión de EGFP. Se construyeron casetes de expresión basados en el promotor de citomegalovirus humano (CMVH) y la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (Bgh poliA) para expresar fosfatasa alcalina secretada (SEAP), EGFP, gag de VIH, región NS de VHC (tal como se describe en la figura 3 para vectores lanzadera de ChAd6) así como antígenos asociados a tumor como CEA y HER2/neu de origen humano y de mono rhesus.
Subgrupos D y E: Con el fin de construir vectores \DeltaE1 basados en adenovirus de chimpancé del subgrupo D y E, se digirió el vector lanzadera pARS ChAd6-3 con AscI y se cotransformó en la cepa BJ5183 de E. coli con ADN viral purificado de CV32, CV33, CV68, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd9, ChAd10 y ChAd16. La recombinación homóloga entre secuencias de ADN de genes pIX e ITR derecha presente en los extremos de pARS ChAd6-3 linealizado y ADN genómico viral permitió su inserción en el vector de plásmido, delecionando al mismo tiempo la región E1 (figuras 2 y 4). Se construyeron casetes de expresión basados en el promotor de citomegalovirus humano (CMVH) y la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (Bgh poliA) para expresar fosfatasa alcalina secretada (SEAP), EGFP, gag de VIH, región NS de VHC (figura 3) así como antígenos asociados a tumor como CEA y HER2/neu de origen humano y de mono rhesus. Se insertaron todos los casetes de expresión en el sitio SnaBI único del vector pARS ChAd6-3 que va a transferirse mediante recombinación homóloga en los preplásmidos de adenovirus \DeltaE1 tal como se describe en la figura 4.
Rescate y amplificación de vectores \DeltaE1
Se transfectaron 5X10^{6} células PER.C6^{TM} plantadas en placas de cultivo celular de 6 cm con 10 microgramos de vector viral clonado liberado de secuencias de plásmido mediante digestión con endonucleasas. Se realizó la transfección del ADN utilizando lipofectamina (Invitrogen). Se recogieron el medio de cultivo y las células transfectadas 5-10 días tras la transfección y se lisaron mediante congelación-descongelación. Se amplificaron entonces los vectores rescatados mediante pase en serie en células 293 o PER.C6^{TM}. Se realizó una amplificación a gran escala infectando células plantadas en 5-10 factorías celulares (NUNC, Inc.) sobre un total de 1-2x10^{9} células. Se obtuvo una preparación de vector purificado en gradiente de cloruro de cesio mediante dos rondas de ultracentrifugación, se dializó frente a PBS que contenía glicerol al 10% y se almacenó a -70ºC en alícuotas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3
Estudios de neutralización
Se llevaron a cabo ensayos de neutralización con el fin de evaluar la prevalencia en sueros humanos de anticuerpos neutralizantes contra los adenovirus de chimpancé dados a conocer en la presente memoria. El ensayo evaluó los efectos de la preincubación con suero sobre la capacidad de los adenovirus de chimpancé que portan el gen para la fosfatasa alcalina secretada (SEAP) para transducir células 293 humanas. El título de neutralización se define como la dilución de suero que proporciona una reducción del 50% de la actividad SEAP observada en el control positivo con el virus solo.
Se diluyeron desde 2x10^{6} hasta 1,5x10^{7} partículas físicas de vectores CV33-SEAP, CV32-SEAP y ChAd3-SEAP en 100 \mul de medio completo y se añadieron a un volumen igual de suero humano o de chimpancé diluido en medio completo. Se sometió a prueba cada muestra de suero a diversas diluciones (cinco aumentos de 4 veces partiendo de dilución 1/18 hasta 1:4608). Se preincubaron las muestras durante una hora a 37ºC y entonces se añadieron a células 293 sembradas en placas de 96 pocillos (3x10^{4} células/pocillo). Se eliminó el inóculo tras una hora de incubación, se realimentaron las células con medio nuevo y, 24 horas más tarde, se retiraron 50 \mul de medio y se midió la actividad SEAP mediante un ensayo quimioluminiscente. El título de neutralización se define como la dilución de suero que proporciona un 50% de reducción de la actividad SEAP observada en el control positivo con el virus solo. Se sometió a prueba un conjunto de 100 sueros humanos para determinar la actividad de neutralización de ChAd. En paralelo, se sometió a prueba el mismo conjunto con el vector Ad5 SEAP.
TABLA 2 Prevalencia de anticuerpos neutralizantes contra adenovirus de chimpancé
2
Los resultados proporcionados en la tabla 2 indican una prevalencia muy baja en sueros humanos de anticuerpos neutralizantes dirigidos contra vectores derivados de adenovirus de chimpancé. Sólo cuatro sueros mostraron un título por encima del umbral de 200 en el vector CV32 mientras que 8 mostraron un título por encima de 200 en el vector ChAd3 SEAP. En cambio, el conjunto de sueros de chimpancé examinado mostró una prevalencia muy alta de inmunidad anti-Ad de chimpancé. Estos hallazgos confirman que, tal como se esperaba, los vectores basados en Ad de chimpancé presentan muy pocas posibilidades de neutralizarse en seres humanos. Por tanto, representan una solución ideal al problema de la inmunidad anti-Ad humano preexistente que limita la administración de vectores virales basados en serotipos Ad humanos comunes tales como Ad5.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4
Tropismo de vectores de ChAd
Se evaluó la eficacia de la transferencia génica mediada por vectores de Ad5 y ChAd mediante la expresión de EGFP en un conjunto de células humanas primarias de diferente origen histológico. Se cultivaron condrocitos, osteoblastos, queratinocitos, melanocitos, células musculares esqueléticas y melanocitos humanos según la indicación del fabricante. Se obtuvieron células dendríticas (DC) maduras e inmaduras y monocitos humanos tal como se describe (Romani, N. et al. 1996, J. Immunol. Methods, 196,137.). Se detectaron células transducidas, fluorescentes mediante análisis FACS. El conjunto de células humanas primarias sometidas a prueba incluye células que son células diana importantes para diferentes estrategias terapéuticas basadas en transferencia génica in vivo así como ex vivo en el campo de la enfermedad cardiovascular, artritis reumatoide, ingeniería de tejidos (hueso, piel y cartílago) y vacunación. Los resultados presentados en las figuras 38A-D sugieren que diferentes adenovirus de chimpancé pueden reconocer receptores alternativos a CAR tal como se demuestra mediante la eficacia de infección diferencial de los diferentes tipos celulares.
Estudios de inmunización murina Procedimientos y materiales Protocolos de inmunización y preparación de esplenocitos/PBMC
Inmunizaciones: Se inmunizaron ratones con los adenovirus seleccionados diluidos en 0,1 ml de tampón. Se dividió cada dosis de vector en dos alícuotas de 50 \mul y se inyectaron en ambos cuádriceps de los ratones.
Preparación de esplenocitos: Se sacrificaron los ratones 3 semanas tras la inyección y se extirparon sus bazos y se transfirieron a 10 ml de R10 (FCS al 10%, 2-mercaptoetanol 55 mM, tampón HEPES 1 M, L-glutamina 2 mM, disolución de 1X penicilina-estreptomicina en medio RPMI 1640). Se desmenuzaron los bazos a través de un tamiz de acero y, tras lavarse el tamiz con 2 ml de R10, se transfirieron los esplenocitos a un tubo Falcon de 50 ml y se centrifugaron a 1200 rpm, 10 min., temperatura ambiente (ta). Se eliminó el sobrenadante y se añadieron 3 ml de tampón de lisis ACK (formulación n.º 79-0422DG de Gibco BRL). Se incubaron las células 5 min., ta. Se añadieron 45 ml de 1X PBS y se centrifugaron los tubos como anteriormente. Tras lavar con 30 ml de R10, se resuspendieron las células en 5 ml de R10, se filtraron a través de un filtro celular de nailon 70 m (Falcon 2350). Se diluyeron 10 \mul de células con 990 \mul de solución de Turk (Merck 040417345) y se contaron. Se diluyeron finalmente las células hasta 10^{7} células/ml en R10.
Preparación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC): Se transfirieron muestras de sangre de ratones (150 \mul) a tubos eppendorf de 2 ml con 50 \mul de PBS/EDTA al 2%. Se añadió 1 ml de tampón ACK a cada tubo. Se mezclaron suavemente y se incubaron a TA durante 5 min. Se centrifugaron las muestras a 1500 rpm en una microcentrífuga durante 5 min. Se descargó el sobrenadante, se combinaron los sedimentos de leucocitos que se derivaban de las mismas cohortes inmunizadas. Se repitió la incubación con tampón ACK, entonces se resuspendieron los sedimentos de PBMC en 1 ml de medio R10.
Ensayo ELISPOT de IFN-\gamma
Se recubrieron placas Millipore MAIP 45 con 100 \mul/pocillo de anticuerpo monoclonal de rata anti-IFN-\gamma de ratón purificado (Pharmingen, cat. 551216) diluido a 2,5 \mug/ml en PBS y se incubaron durante la noche (o/n) a 4ºC. Se lavaron las placas 2X con PBS estéril y se bloquearon los sitios de unión no específica mediante incubación durante 2 h en el incubador de CO_{2} con 200 \mul/pocillo de R10. En los experimentos de inmunización con vectores de Ad que expresan gag de VIH, se diluyó un péptido de 9 meros (AMQMLKETI, un epítopos de gag de VIH CD8 mapeado en ratones Balb/C) (SEC ID nº 47) hasta 2 \mug/ml en R10 y se añadió a los pocillos en la cantidad de 50 \mul/pocillo. En experimentos de inmunización realizados con vectores que expresan NS de VHC, se utilizó un conjunto de péptidos que cubrían el dominio de helicasa NS3 así como un péptido de 9 meros que representaba un epítopo de CD8 mapeado comprendido en el dominio helicasa. Se evaluaron los experimentos de inmunización con ChAdd que expresaban antígeno CEA humano mediante conjuntos de péptidos de 15 meros solapantes que cubrían toda la secuencia de aminoácidos. Como controles, se utilizaron DMSO y concanavalina A. Se añadieron las células a cada pocillo a la cantidad de 5X10^{5} y 2,5X10^{5}. Tras una incubación o/n en el incubador de CO_{2}, se lavaron las placas con Tween 20 al 0,05%/PBS y se añadieron 50 \mul/pocillo de anticuerpo monoclonal de rata anti-IFN-\gamma de ratón biotinilado (PharMingen cat. 554410) diluido 1/250 en tampón de ensayo (FBS al 5%, Tween20 al 0,005%, PBS). Se incubaron las placas o/n a 4ºC y se lavaron como anteriormente. Se diluyó conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina (BD554065) 1/2500 en tampón de ensayo y se añadió en la cantidad de 50 \mul/pocillo durante 2 h ta. Tras lavar, se revelaron las placas añadiendo 50 \mul/pocillo de disolución BCIP/NBT1-step (Pierce 34042). Se detuvo la reacción lavando los pocillos con agua desionizada. Se contaron automáticamente los puntos mediante un lector de
ELISPOT.
Tinción intracelular de IFN-\gamma murino (ICS)
Se diluyeron esplenocitos a 2X10^{6} células en 1 ml de R10 y se estimularon con los mismos antígenos descritos anteriormente a la concentración de 2 \mug/ml. Como controles, se utilizaron DMSO y enterotoxina B estafilocócica (SEB). Tras una incubación durante la noche en el incubador de CO_{2}, se lavaron las células con tampón FACS (FCS al 1%, NaN_{3} al 0,01%, PBS) y se diluyó 1/25 el bloque de Fc anti-CD16/CD32 de ratón purificado (clon 2.4G2, Pharmingen cat. 553142), se añadió en la cantidad de 100 \mul/muestra y se incubó durante 15 min. a 4ºC. Se lavaron las células en tampón FACS y se añadieron anticuerpos anti-CD3e de ratón conjugado con APC (clon 145-2C11, Pharmingen n.º 553066), anti-CD4 de ratón conjugado con PE (clon L3T4, BD Pharmingen cat. 553142) y anti-CD8a de ratón conjugado con PerCP (clon 53-6.7, Pharmingen cat. 553036) diluidos 1:50 en tampón FACS en la cantidad de 100 \mul/muestra. Se incubaron las células 30 min. ta, se lavaron, se fijaron y se permeabilizaron (Becton Dickinson, FACS Perm 2) y se incubaron con anticuerpo anti-IFN-\gamma de ratón conjugado con FITC (Pharmingen cat. 554411) diluido 1:50 en PermWash (100 \mul/muestra) durante 30 min. a TA. Tras lavar las células, se resuspendieron en 500 \mul de formaldehído al 1%/PBS y se analizaron mediante tinción intracelular de citocinas (ICS) en un citómetro de flujo FACS-Calibur, utilizando el software Cell Quest (Becton Dickinson).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5
Vectores de ChAd producen respuestas CMI fuertes en ratones
Se evaluó la capacidad de los vectores de ChAd dados a conocer en la presente memoria para producir una respuesta inmunitaria mediada por células (CMI) en ratones utilizando vectores que expresaban un transgén de gag de VIH. En resumen, se les inyectó a grupos de 5 ratones Balb/C dosis crecientes en diez veces de los diferentes vectores partiendo de 10^{5} hasta 10^{10} pv/ratón.
Se determinó la fuerza de la respuesta inmunitaria tres semanas tras la inyección cuantificando las células T CD8+ específicas de gag en los esplenocitos. Se determinó el número de células T CD8+ que secretaban IFN-\gamma mediante ensayo ELISPOT o mediante tinción intracelular de IFN-\gamma y análisis FACS tras la estimulación in vitro con un péptido que reproduce un epítopo de células T CD8+ gag mapeado en ratones Balb/C.
Los resultados obtenidos a partir de los 5 animales inmunizados, notificados en la tabla 3, se expresan como células formadoras de puntos por 10^{6} esplenocitos. Se muestra el número de células formadoras de puntos por millón de esplenocitos tras la incubación con epítopo de gag CD8+ de 9 meros o con un conjunto de péptidos gag. El conjunto de péptidos gag consistía en un péptido de 20 aa solapante en 10 aa que abarcaba toda la secuencia de gag. Los valores positivos se notifican en negrita.
Los datos proporcionados en la tabla 3 indican que la administración de los vectores de ChAd dados a conocer y reivindicados en la presente memoria produce una fuerte respuesta inmunitaria mediada por células que es comparable con la respuesta producida por hAd5. Estudiando la dosis de vector más baja que daba como resultado un resultado de inmunización positivo (punto de rotura de la inmunización), se clasificó la potencia de los diferentes vectores siendo ChAd3gag del subgrupo C el más potente con un punto de rotura a 10^{6} pp de dosis de vector. La clasificación por puntos de rotura de la inmunización se muestra en la figura 33.
3
4 
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr}
5 
\newpage
Ejemplo 6
Vectores de ChAd3 y CV33 GAG producen una respuesta CMI caracterizada por células T CD8+ específicas de GAG
Con el fin de caracterizar la respuesta CMI producida en respuesta a los vectores de ChAd que comprenden un transgén de gag de VIH, se analizaron esplenocitos agrupados de cohortes de cinco ratones inmunizados con diferentes dosis de vector mediante tinción de IFN-\gamma intracelular. Los datos mostrados en la tabla 3 y la tabla 4 se recogieron en experimentos separados.
Se diluyeron esplenocitos a 2X10^{6} células en 1 ml de R10 y se estimularon con los mismos antígenos descritos anteriormente a la concentración de 2 \mug/ml. Como controles, se utilizaron DMSO y SEB (enterotoxina B estafilocócica). Tras una incubación o/n en el incubador de CO_{2}, se lavaron las células con tampón FACS (FCS al 1%, NaN_{3} al 0,01%, PBS) y se diluyó 1/25 el bloque de Fc anti-CD16/CD32 de ratón purificado (clon 2.4G2, Pharmingen cat. 553142), se añadió en la cantidad de 100 \mul/muestra y se incubó durante 15 min. a 4ºC. Se lavaron las células en tampón FACS y se añadieron anticuerpos anti-CD3e de ratón conjugado con APC (clon 145-2C11, Pharmingen n.º 553066), anti-CD4 de ratón conjugado con PE (clon L3T4, BD Pharmingen cat. 553142) y anti-CD8a de ratón conjugado con PerCP (clon 53-6.7, Pharmingen cat. 553036) diluidos 1:50 en tampón FACS en la cantidad de 100 \mul/muestra. Se incubaron las células 30 min. ta, se lavaron, se fijaron y se permeabilizaron (Becton Dickinson, FACS Perm 2) y se incubaron con anticuerpo anti-IFN-\gamma de ratón conjugado con FITC (Pharmingen cat. 554411) diluido 1:50 en PermWash (100 \mul/muestra) durante 30 min. a TA. Tras lavar las células, se resuspendieron en 500 \mul de formaldehído al 1%/PBS y se analizaron en un citómetro de flujo FACS-Calibur, utilizando el software Cell Quest (Becton
Dickinson).
La tabla 4 proporciona datos que resumen el porcentaje de células T CD3+ específicas de gag que eran células T o bien CD4+ o bien CD8+ específicas de gag. Los resultados positivos se notifican en negrita. Los datos proporcionados en la presente memoria indican que el perfil celular de la respuesta inmunitaria producida por vectores de ChAd derivados de virus clasificados en diferentes subgrupos de serotipos (es decir, subgrupos C, D y E) es similar y todas las respuestas específicas de gag se caracterizan predominantemente por células T CD8+. Además, se observa que a dosis altas de vector, resulta evidente una respuesta CD4+ específica de gag en todos los experimentos de inmunización. El ensayo ICS confirmó que el vector de ChAd3 puede estimular una respuesta CD8+ anti-gag a una dosis de vector de 10^{6}.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
6 
\newpage
Ejemplo 7
Vectores de ChAd producen una respuesta de células T específica de NS de VHC
Se evaluó la potencia de los vectores CV32-NSmut y CV33-NSmut en ratones C57/Black6 en relación con la potencia de MRKAd6NSmut. Se inyectaron a los animales dosis crecientes en 10 veces de vector partiendo de 10^{7} hasta 10^{9} pv/ratón. Se analizó la CMI 3 semanas tras una única inyección mediante ELISPOT de IFN-\gamma y tinción intracelular de IFN-\gamma estimulando células con un péptido de 9 meros que reproduce un epítopo de células T CD8+ mapeado en el dominio helicasa de la proteína NS3. Los datos proporcionados en la tabla 5 resumen el número de células formadoras de puntos por millón de esplenocitos tras la incubación en ausencia (simulada) o en presencia de péptido de 9 meros de NS3.
Los datos indican que ambos vectores CV32 y CV33 que expresan NS de VHC estimulan respuestas de células T fuertes. Basándose en la observación de que el primer resultado positivo para el vector CV32 se obtuvo inyectando 10^{9} pv/dosis, la potencia de inmunización del vector CV32DE1E3 NSmut parece ser aproximadamente 100 veces inferior que el vector Ad6DE1E3 NSmut del subgrupo C humano. El experimento paralelo con MRKAd6NSmut indicó que una dosis de 10^{7} pv/animal era suficiente para estimular la inmunidad celular mediada por células. Por tanto, estos resultados confirman la potencia de inmunización inferior de vectores derivados de CV32 en relación con vectores humanos del subgrupo C (tales como hAd5 y hAd6) que también se observó en el experimento con vectores de expresión de gag (véase la tabla 3).
TABLA 5 Respuesta de células T específica de NS de VHC en ratones inmunizados con Mrkad6 Nsmut, CV32NSmut o CV33NSmut
7
Ejemplo 8
La inmunidad preexistente anti-Ad5 no suprime la CMI anti-GAG producida por ChAd3gag
Para evaluar el impacto sobre la inmunización con ChAd3 de la inmunidad preexistente contra el Ad5 sumamente seroprevalente, se preinmunizaron 4 cohortes de 5 ratones BalbC con dos inyecciones de 10^{10} pv de Ad5 de tipo natural en el cuádriceps a las semanas 0 y 2. Como control, se les inyectó a 2 cohortes de 5 ratones a los mismos puntos de tiempo tampón solo. Se inmunizaron entonces las cohortes de ratones preinmunizados con Ad5 con 10^{6} y 10^{7} pv/ratón de vectores o bien Ad5gag o bien ChAd3gag. Se inmunizaron cohortes de ratones control (sin tratamiento previo) con 10^{6} pv/ratón de vectores Ad5gag o ChAd3gag.
Se evaluó la actividad neutralizante anti-Ad5 y ChAd3 en la semana 4 mediante el ensayo de neutralización descrito anteriormente utilizando vectores de Ad5 y ChAd3 SEAP. Se evaluó la inmunidad anti-gag mediante análisis ELISPOT en esplenocitos purificados estimulados con un péptido de 9 meros gag que contenía un epítopo de gag mapeado en ratones BalbC. Los resultados notificados en la figura 36 demostraron que la inmunidad anti-Ad5 no suprime la CMI anti-gag producida por ChAd3gag mientras que, tal como se esperaba, la inmunidad anti-Ad5 bloqueó completamente la inmunización con Ad5gag.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 9
La inmunización con ChAd3hCEA produce una respuesta inmunitaria fuerte específica de CEA en ratones transgénicos que expresan CEA humano
Se evaluó también la capacidad de los vectores de ChAd dados a conocer y reivindicados en la presente memoria para producir una respuesta inmunitaria contra un autoantígeno rompiendo por tanto la tolerancia, en ratones transgénicos que expresaban CEA humano (Clarke, P et al. Cancer Res. (1998) 58(7):1469-77.)
Se les inyectó a cohortes de 8 ratones en el cuádriceps 10^10 pv de ChAd3hCEA o Ad5hCEA tal como ya se describió. Se siguió la respuesta inmunitaria contra CEA semanalmente hasta el día 75 en PBMC estimuladas con un conjunto de péptidos de 15 meros que abarcan la secuencia de aminoácidos de CEA humano desde el aa 497 hasta el extremo (aa 703). Se evaluó la inmunidad anti-CEA mediante ICS determinando las células T CD4-CD8+ que secretaban interferón-\gamma en respuesta a la incubación con un conjunto de péptidos CEA.
Los resultados notificados en la figura 37 demuestran que la inmunización con el vector ChAd3hCEA estimula una respuesta de células T CD8+ más sostenida contra CEA humano que Ad5 que expresa el mismo transgén.
Estudios de inmunización de primates Procedimientos y materiales Protocolo de inmunización
Se evaluó también la capacidad de los vectores de ChAd dados a conocer y reivindicados en la presente memoria para producir CMI en macacos rhesus (denominados en la presente memoria monos). Se anestesiaron los macacos (ketamina/xilazina) y se administraron las vacunas por vía i.m. en alícuotas de 0,5 ml en ambos músculos deltoides utilizando jeringas de tuberculina (Becton-Dickinson). En todos los casos, los macacos presentaban entre 3-10 kg de peso, y la dosis total de cada vacuna se administró en 1 ml de tampón.
Se prepararon sueros y células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de muestras de sangre recogidas a diversos puntos de tiempo durante el régimen de inmunización. Todo el tratamiento y cuidado de los animales estaba de acuerdo con las normas aprobadas por el Institutional Animal Care and Use Committee según los principios expuestos en la Guide for Care and Use of Laboratory Animals, Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council.
Ensayo ELISPOT
Se realizaron ensayos ELISPOT de IFN-\gamma para macacos rhesus siguiendo un protocolo descrito anteriormente (Allen et al., 2001 J. Virol. 75(2): 738-749), con algunas modificaciones. Para la estimulación específica de gag, se preparó un conjunto de péptidos a partir de péptidos de 20 aa que abarcan toda la secuencia de gag de VIH-1 con solapamientos de 10 aa (Synpep Corp., Dublin, CA). Para la estimulación específica de NS de VHC, se prepararon 6 conjuntos de péptidos a partir de péptidos de 15 aa que abarcan toda la secuencia de NS de VHC desde NS3 hasta NS5b con solapamientos de 10 aa. Se realizaron estimulaciones específicas de HER2/neu y CEA con péptidos de 15 aa que abarcan toda la secuencia de proteínas con solapamientos de 10 aa.
A cada pocillo, se le añadieron 50 \mul de 2-4 x 10^{5} células mononucleares de sangre periférica (PBMC); se contaron las células utilizando el analizador de partículas Beckman Coulter Z2 con un punto de corte del tamaño inferior fijado a 80 fl. Se añadieron a las PBMC o bien 50 \mul de medio o bien el conjunto de péptidos gag a una concentración de 8 \mug/ml por péptido. Se incubaron las muestras a 37ºC, un 5% de CO_{2} durante 20-24 h. Se revelaron los puntos por tanto y se procesaron las placas utilizando un generador de imágenes construido a medida y una subrutina de recuento automático basada en la plataforma ImagePro (Silver Spring, MD); se normalizaron los recuentos para una entrada de 10^{6} células.
Tinción intracelular de citocinas (ICS)
A 1 ml de 2 x 10^{6} PBMC/ml en medio RPMI completo (en tubos de polipropileno de fondo redondo de 17x100 mm (Sarstedt, Newton, NC)), se le añadieron anticuerpos monoclonales anti-hCD28 (clon L293, Becton-Dickinson) y anti-hCD49d (clon L25, Becton-Dickinson) hasta una concentración final de 1 \mug/ml. Para la estimulación específica de gag, se añadieron 10 \mul del conjunto de péptidos (a 0,4 mg/ml por péptido). Se utilizaron condiciones similares para la estimulación específica de NS de VHC. Se incubaron los tubos a 37ºC durante 1 h, tras lo que se añadieron 20 \mul de 5 mg/ml de brefeldina A (Sigma). Se incubaron las células durante 16 h a 37ºC, un 5% de CO_{2} y un 90% de humedad. Se añadieron 4 ml de PBS frío/FBS al 2% a cada tubo y se sedimentaron las células durante 10 min. a 1200 rpm. Se resuspendieron las células en PBS/FBS al 2% y se tiñeron (30 min., 4ºC) para detectar marcadores de superficie utilizando varios Acm marcados de manera fluorescente: 20 \mul por tubo de anticuerpo anti-hCD3-APC, clon FN-18 (Biosource); 20 \mul de anticuerpo anti-hCD8-PerCP, clon SK1 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ); y 20 \mul de anticuerpo anti-hCD4-PE, clon SK3 (Becton Dickinson). El manejo de las muestras a partir de esta fase se realizó en la oscuridad. Se lavaron las células y se incubaron en 750 \mul de tampón 1xFACS Perm (Becton Dickinson) durante 10 min. a temperatura ambiente. Se sedimentaron las células y se resuspendieron en PBS/FBS al 2% y se añadieron 0,1 \mug de anticuerpo FITC-anti-hIFN-\gamma, clon MD-1 (Biosource). Tras 30 min. de incubación, se lavaron las células y se resuspendieron en PBS. Se analizaron las muestras utilizando los cuatro canales de color del instrumento FACSCalibur de Becton Dickinson. Para analizar los datos, se activó inicialmente la población de linfocitos de dispersión frontal y lateral baja; se utilizó un punto de corte de fluorescencia común para acontecimientos positivos para citocina tanto para poblaciones CD4+ como CD8+, y para tubos de reacción tanto simulada como de péptido gag de una
muestra:
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 10
Un régimen de sensibilización-refuerzo homólogo utilizando vectores ChAd AEI-gag produce células T específicas de gag en monos
Se administró a cohortes de 3 animales una inyección intramuscular en la semana 0 y la semana 4 de cualquiera de los siguientes constructos: 10^10 pv de CV-32\DeltaE1-gag; o 10^10 pv de CV33\DeltaE1-gag; o 10^10 pv y 10^8 pv de MRKAd5\DeltaE1gag. Se recogieron PBMC a intervalos regulares de 4 semanas y se analizaron en un ensayo ELISPOT. Los resultados proporcionados en la tabla 6, que indican el número de células formadoras de puntos por millón de PBMC tras la incubación en ausencia (simulada) o presencia de conjuntos de péptidos Gag establecen que tanto CV32\DeltaE1-gag como CV-33\DeltaE1gag pueden inducir niveles significativos de células T específicas de gag en primates no humanos. Es interesante observar que tras una única dosis (semana 4), las respuestas frente a CV32\DeltaE1-gag eran comparables a una dosis de 10^8 pv de MRKAd5 \DeltaE1-gag e inferiores a las de 10^10 pv/dosis de MRKAd5-gag. 10^10 pv/dosis de CV33\DeltaE1-gag induce una respuesta comparable a la de 10^10 pv/dosis de MRKAd5-gag. Este resultado se confirmó en la semana 8 tras la segunda dosis.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 6 Respuesta de células T específicas de gag en monos inmunizados con Mrkad5 \DeltaE1-Gag, CV32\DeltaE1-Gag, CV33\DeltaE1-Gag
8 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 11
Vectores de ChAd producen una respuesta de células T específica de NS de VHC en un régimen de sensibilización-refuerzo heterólogo
En un experimento separado, se inmunizaron grupos de dos y tres monos a las semanas 0, 4 con el vector MRK Ad6NSoptmut a 10^8 ó 10^10 pv por animal. Se reforzaron los animales con el mismo virus a la misma dosis en la semana 24 y entonces se reforzaron de nuevo en la semana 104 con CV33-NSmut a 10^10 pv por animal. Los resultados se presentan en las tablas 7 y 8, que resumen el número de células formadoras de puntos por millón de PBMC tras la incubación en ausencia (simulada) o presencia de conjunto de péptidos de NS de VHC.
La inmunidad de células T, tal como se evaluó mediante ELISPOT de IFN-\gamma, mostró una respuesta pico en la semana 4, tras la primera dosis en los animales a los que se les inyectaron 10^10 pv (tabla 8) y en la semana 8 (tras la dosis 2) en los animales a los que se les inyectaron 10^8 (tabla 7). La respuesta no se reforzó mediante la inyección en la semana 24 ("refuerzo homólogo"), mientras que se observó un fuerte efecto de refuerzo tras la inyección con CV33-NSmut ("refuerzo heterólogo").
9 
\newpage
Se evaluó la eficacia del refuerzo heterólogo con vectores de Ad de chimpancé en un segundo experimento. Se inmunizaron cohortes de tres monos en la semana 0 y la semana 4 con MRKAd5gag (10^10 pv/animal), MRKAd6NSmut (10^10 pv/animal) o con la combinación de ambos vectores (10^10 pv/animal de cada vector) luego se reforzaron con el mismo inmunógeno en la semana 24 (refuerzo homólogo). Se realizó el refuerzo homólogo con los mismos inmunógenos; se realizó el refuerzo heterólogo con CV33 gag, CV32 NSmut o con los dos vectores en combinación. Los resultados proporcionados en la tabla 9 resumen el número de células formadoras de puntos por millón de PBMC tras la incubación en ausencia (simulada) o presencia de conjunto de péptidos VHC NS. Se reforzaron las mismas cohortes de nuevo en la semana 51 con CV33gag (10^10 pv/animal), CV32NSmut (10^10 pv/animal) y con la combinación de los dos vectores (10^10 pv/animal de cada vector). Los resultados proporcionados en la tabla 9 indican además que el refuerzo homólogo no fue eficaz puesto que las respuestas están por debajo del pico observado en la semana 4 tras la inyección de la primera dosis de vacuna. Se midió un fuerte efecto de refuerzo mediante ELISPOT de IFN-\gamma en la semana 54 tras la inmunización con vectores heterólogos de chimpancé.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa página siguiente)
10
11 
\newpage
Ejemplo 12
La vacunación con un vector de ChAd que comprende un TAA que rompe la tolerancia y provoca una respuesta de células T específicas de TAA en monos
Se realizaron experimentos diseñados para determinar si los vectores adenovirales de chimpancé son suficientemente inmunogénicos para romper la tolerancia a un autoantígeno y para documentar la utilidad de vectores de chimpancé para reforzar una respuesta inmunitaria provocada por la sensibilización con un vector adenoviral humano, en cohortes de cuatro monos. Se inmunizaron los animales con tres inyecciones en las semanas 0, 2 y 4 de Ad5DE1 RhCEA (10^11 pv), que comprendían el antígeno asociado a tumor CEA, seguido por vacunación en las semanas 16, 18 y 20 con CV33DE1 RhCEA (10^11 pv). Se midió la respuesta de células T mediante ELISPOT de IFN-\gamma con péptidos de CEA de rhesus.
Los resultados notificados en la figura 34, que proporcionan el número de células formadoras de puntos por millón de PBMC tras la incubación en ausencia (DMSO) o en presencia de conjuntos de péptidos C y D de CEA de rhesus, establecen que un protocolo de inmunización basado en la vacunación con dos serotipos de Ad diferentes conduce a una respuesta sostenida de células T frente a CEA en primates no humanos.
Aunque se ha descrito la invención en detalle haciendo referencia a ciertas formas de realización preferidas de la misma, se entenderá que las modificaciones y variaciones están dentro del espíritu y el alcance de lo que se describe y reivindica.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Merck & Co., Inc.
\hskip1cm
Instituto di Ricerche di Biologia Molecolare P. Angeletti S.p.A. 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Portadores de vacunas de adenovirus de chimpancé
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> ITR0048Y PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/538.799
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2004-01-23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 125
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37741
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- ChAd3 Genómico
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
12 
\hskip0,5cm
13 
\hskip0,8cm
14 
\hskip0,8cm
15 
\hskip0,8cm
16 
\hskip0,8cm
17 
\hskip0,8cm
18 
\hskip0,8cm
19 
\hskip0,8cm
20 
\hskip0,8cm
21 
\hskip0,8cm
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36648
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé-ChAd6 Genómico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
23 
\hskip0,8cm
24 
\hskip0,8cm
25 
\hskip0,8cm
26 
\hskip0,8cm
27 
\hskip0,8cm
28 
\hskip0,8cm
29 
\hskip0,8cm
30 
\hskip0,8cm
31 
\hskip0,8cm
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36606
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chimpancé Pan 6 (CV32) Genómico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
33 
\hskip0,8cm
34 
\hskip0,8cm
35 
\hskip0,8cm
36 
\hskip0,8cm
37 
\hskip0,8cm
38 
\hskip0,8cm
39 
\hskip0,8cm
40 
\hskip0,8cm
41 
\hskip0,8cm
42 
\hskip0,8cm
43 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36535
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chimpancé Pan 7 (CV33) Genómico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
44 
\hskip0,8cm
45 
\hskip0,8cm
46 
\hskip0,8cm
47 
\hskip0,8cm
48 
\hskip0,8cm
49 
\hskip0,8cm
50 
\hskip0,8cm
51 
\hskip0,8cm
52 
\hskip0,8cm
53 
\hskip0,8cm
54 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32020
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chimpancé Pan 5 (CV23) Genómico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
55 
\hskip0,8cm
56 
\hskip0,8cm
57 
\hskip0,8cm
58 
\hskip0,8cm
59 
\hskip0,8cm
60 
\hskip0,8cm
61 
\hskip0,8cm
62 
\hskip0,8cm
63 
\hskip0,8cm
64 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1737
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- ChAd 20 Fibra
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
65 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1278
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
66 
\hskip0,8cm
67 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1335
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
68 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1338
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
69 
\hskip0,8cm
70 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1278
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
71 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1278
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
72 
\hskip0,8cm
73 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1737
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
74 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1632
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 16
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip0,8cm
75 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1632
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
76 
\hskip0,8cm
77 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1632
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
78 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2865
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de chimpancé- Hexón ChAd 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
79 
\hskip0,8cm
80 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2823
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
81 
\hskip0,8cm
82 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2823
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
83 
\hskip0,8cm
84 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2823
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
85 
\hskip0,8cm
86 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2793
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
87 
\hskip0,8cm
88 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2793
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
89 
\hskip0,8cm
90 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2883
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
91 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2835
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
92 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2883
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 17
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
93 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2877
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 19
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
94 
\hskip0,3cm
95 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> polA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aataaaagat ctttattttc attagatctg tgtgttggtt ttttgtgtg 
\hfill
49 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atggaattcg tttaaaccat catcaataat atacctc 
\hfill
37 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgctggcact caagagtggc ctc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgaagcttg tttaaaccca tcatcaataa tatacct 
\hfill
37 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atctagacag cgtccatagc ttaccg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgctacgta gcgatcgcgt gagtagtgtt tgggggtggg tggg 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
taggcgcgcc gcttctcctc gttcaggctg gcg 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatctagtta gtttaaacga attcggatct gcgacgcg 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttcgatcatg tttaaacgaa attaagaatt cggatcc 
\hfill
37 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tattctgcga tcgctgaggt gggtgagtgg gcg 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
taggcgcgcc cttaaacggc atttgtggga g 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgtctagaag acccgagtct taccagt 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgggatccgt ttaaaccatc atcaataata taccttatt 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atggaattcg tttaaaccat catcaatatt atacctt 
\hfill
37 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligómero
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgacgcgat cgctgatatc ctataataat aaaacgcaga ctttg 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2880
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
96 
\hskip0,8cm
97 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1683
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
98 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2859
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
99 
\hskip0,8cm
100 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1335
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
101 
\hskip0,8cm
102 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgtcctacca rctcttgctt ga 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtggaarggc acgtagcg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Epítopo HIV gag CD8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
103 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 578
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 20
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\hskip0,8cm
104 
\hskip0,8cm
105 
\hskip0,8cm
106 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 425
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
107 
\hskip0,8cm
108 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 444
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
109 
\hskip0,8cm
110 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 445
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
111 
\hskip0,8cm
112 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 425
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
113 
\hskip0,8cm
114 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 425
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
115 
\hskip0,8cm
116 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 578
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
117 
\hskip0,8cm
118 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 442
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chimpansee Adenovirus- Fibra ChAd 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
119 
\hskip0,8cm
120 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 543
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
121 
\hskip0,8cm
122 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 543
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
123 
\hskip0,8cm
124 
\hskip1,3cm
125 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 963
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chimapnzee Adenovirus- Fibra ChAd 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
126 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 320
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
127 
\hskip0,8cm
128 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1062
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
129 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 353
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
130 
\hskip0,8cm
131 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1686
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
132 
\hskip0,8cm
133 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 543
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
134 
\hskip0,8cm
135 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1335
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
136 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 444
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
137 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1062
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
138 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 353
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
139 
\hskip0,8cm
140 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1791
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
141 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 578
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
142 
\hskip0,8cm
143 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 978
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
144 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 325
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\hskip0,8cm
145 
\hskip0,8cm
146 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1332
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
147 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 443
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
148 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1332
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
149 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 443
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
150 
\hskip0,8cm
151 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1278
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
152 
\hskip1.1cm
153 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 425
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
154 
\hskip1cm
155 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1338
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
156 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 445
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
157 
\hskip0,8cm
158 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 445
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra CV23/Pan5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
159 
\hskip0,8cm
160 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 443
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra CV32/Pan6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
161 
\hskip0,8cm
162 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 443
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra CV33/Pan7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
163 
\hskip0,8cm
164 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 543
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
165 
\hskip0,8cm
166 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 445
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra ChAd 6
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
167 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra C1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
168 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 425
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Fibra CV68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
169 
\hskip0,8cm
170 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 954
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
171 
\hskip0,8cm
172 
\hskip0,8cm
173 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 940
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
174 
\hskip0,8cm
175 
\hskip0,8cm
176 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 940
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
177 
\hskip0,8cm
178 
\hskip0,8cm
179 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 940
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 7
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\hskip0,8cm
180 
\hskip0,8cm
181 
\hskip0,8cm
182 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 930
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 9
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\hskip0,8cm
183 
\hskip0,8cm
184 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 930
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 10
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
185 
\hskip0,8cm
186 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 960
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 11
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
187 
\hskip0,8cm
188 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 944
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
189 
\hskip0,8cm
190 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 960
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
191 
\hskip0,8cm
1910 
\hskip0,6cm
192 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 958
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
193 
\hskip0,8cm
194 
\hskip0,9cm
195 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2865
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
196 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 954
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé ChAd 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
197 
\hskip0,8cm
198 
\hskip1.2cm
199 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2871
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
200 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 956
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 22
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 100
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
201 
\hskip0,8cm
202 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2865
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
203 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 954
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 24
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
204 
\hskip0,8cm
205 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2841
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 103
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
206 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 946
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 26
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 104
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
207 
\hskip0,8cm
208 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2838
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 30
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 105
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
209 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 945
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 30
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 106
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
210 
\hskip0,8cm
211 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2877
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 31
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
212 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 958
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 31
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
213 
\hskip0,8cm
214 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2856
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 37
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 109
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
215 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 951
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 37
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 110
\hskip1cm
216 
\hskip0,8cm
217 
\hskip0,8cm
218 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2817
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 38
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 111
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
219 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 938
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 112
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
220 
\hskip0,8cm
221 
\hskip0,8cm
222 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2781
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 113
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
223 
\hskip0,8cm
224 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 926
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 114
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
225 
\hskip0,8cm
226 
\hskip0,8cm
227 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2877
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 115
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
228 
\hskip0,8cm
229 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 941
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 116
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
230 
\hskip0,8cm
231 
\hskip0,8cm
232 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2811
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 117
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
233 
\hskip0,8cm
234 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 936
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 118
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
235 
\hskip0,8cm
236 
\hskip0,8cm
237 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 933
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón CV23 Pan5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 119
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
238 
\hskip0,8cm
239 
\hskip0,8cm
240 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 942
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- CV32 Hexón Pan6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 120
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
241 
\hskip0,8cm
242 
\hskip0,8cm
243 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 121
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 932
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón CV33 Pan7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 121
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
244 
\hskip0,8cm
245 
\hskip0,8cm
246 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 122
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 960
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 122
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
247 
\hskip0,8cm
248 
\hskip0,8cm
249 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 937
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón ChAd 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 123
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
250 
\hskip0,8cm
251 
\hskip0,8cm
252 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 956
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón C1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 124
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
253 
\hskip0,8cm
254 
\hskip0,8cm
255 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 125
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 933
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Adenovirus de Chimpancé- Hexón CV68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 125
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
256 
\hskip0,8cm
257 
\hskip0,8cm
258

Claims (26)

1. Secuencia de ácido nucleico de chimpancé aislada seleccionada de entre el grupo constituido por:
a)
SEC ID nº 1; y
b)
una secuencia de ácido nucleico complementaria a la secuencia de (a).
2. Vector adenoviral de chimpancé (ChAd) de replicación defectuosa que comprende:
la secuencia de nucleótidos expuesta en SEC ID nº 1, modificada porque por lo menos un gen seleccionado de entre el grupo constituido por E1, E2 y E4 adenoviral está funcionalmente delecionado; y
un transgén que codifica para por lo menos un inmunógeno funcionalmente unido a secuencias reguladoras que dirigen la expresión de dicho transgén en células de mamífero.
3. Vector de ChAd de replicación defectuosa según la reivindicación 2, en el que la secuencia de nucleótidos que corresponde a por lo menos un gen seleccionado de entre el grupo constituido por E1, E2 y E4 adenoviral se ha delecionado.
4. Vector de ChAd de replicación defectuosa según la reivindicación 2, caracterizado porque comprende la deleción funcional de E1 y opcionalmente de E3.
5. Vector de ChAd de replicación defectuosa según la reivindicación 2 ó 4, que comprende una deleción/alteración en la secuencia de nucleótidos de E1 en la región desde el pb 460 hasta el pb 3542 de SEC ID nº 1.
6. Vector de ChAd según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que el vector comprende un transgén seleccionado de entre el grupo constituido por: VIH, VHB, VHC, VPH, VHS1, VHS2, SARS CoV, Plasmodium malariae, virus Ébola, virus del oeste del Nilo, virus del Dengue, gripe A, gripe B y Mycobacterium tuberculosis.
7. Vector de ChAd según la reivindicación 5, comprendiendo el vector una deleción/alteración en la secuencia de nucleótidos de E1 en la región desde el pb 460 hasta el pb 3542 de SEC ID nº 1 y comprendiendo el vector además un transgén que codifica para por lo menos un antígeno asociado a tumor (TAA).
8. Vector de ChAd según la reivindicación 7, en el que el por lo menos un TAA se selecciona de entre el grupo constituido por: HER2 NEU, CEA, EPCAM, PSA, PSMA, TELOMERASA, GP100, MELAN-A/MART-1, MUC-1, NY-ESO-1, SURVIVINA, ESTROMELISINA 3, TIROSINASA, MAGE3, CML68, CML66, OY-TES-1, SSX-2, SART-1, SART-2, SART-3, NY-CO- 58, NY-BR-62, HKLP2, 5T4 y VEGFR2.
9. Célula huésped que comprende un vector de ChAd de replicación defectuosa según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en la que dicha célula huésped expresa una o varias regiones adenovirales seleccionadas de entre el grupo constituido por E1a, E1b, E2a, E2b, E4 orf 1, 2, 3, 4, 5, 6, 6/7, pIX, IVa2, regiones L1, L2, L3, L4, L5.
10. Procedimiento de producción de un vector adenoviral de chimpancé de replicación defectuosa que comprende introducir un vector adenoviral según la reivindicación 5 en una célula humana que expresa E-1 adenoviral, y recoger los adenovirus resultantes.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que la célula humana es una célula 293 o una célula PER.C6^{TM}.
12. Composición de vacuna que comprende un vector de ChAd de replicación defectuosa según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8.
13. Célula humana que expresa E1 adenoviral que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEC ID nº 1, en la que la secuencia de nucleótidos comprende una deleción/alteración en la secuencia de nucleótidos de E1 en la región desde el pb 460 hasta el pb 3542 de SEC ID nº 1.
14. Vector de ChAd según la reivindicación 5 para su utilización en un procedimiento de refuerzo de una respuesta inmunitaria específica de antígeno en un mamífero que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad suficiente de dicho vector de ChAd, en el que la administración de dicho vector de ChAd produce una respuesta reforzada.
15. Vector de ChAd según la reivindicación 14, que comprende una deleción completa de sus genes E1 y en el que el vector comprende además opcionalmente una deleción de sus genes E3.
16. Vector de ChAd según la reivindicación 14 ó 15, en el que la respuesta inmunitaria reforzada es específica para un antígeno derivado de un agente infeccioso seleccionado de entre el grupo constituido por: VIH, VHB, VHC, VPH, VHS1, VHS2, SARS CoV, Plasmodium malariae, virus Ébola, virus del oeste del Nilo, virus del Dengue, Gripe A, Gripe B y Mycobacterium tuberculosis.
17. Vector de ChAd según la reivindicación 14 ó 15, en el que la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria reforzada que es específica para un TAA.
18. Vector de ChAd según la reivindicación 14, 15 ó 17, en el que la respuesta inmunitaria reforzada comprende la producción de células T CD8+ específicas de antígeno.
19. Vector de ChAd según la reivindicación 5 para su utilización en un procedimiento de producción de una respuesta inmunitaria en un mamífero sin tratamiento previo que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad suficiente de dicho vector de ChAd, en el que la administración del vector de ChAd produce una respuesta inmunitaria primaria.
20. Vector de ChAd según la reivindicación 19, en el que la respuesta inmunitaria primaria es específica para un antígeno derivado de un agente infeccioso seleccionado de entre VIH, VHC, VPH, VHS1, VHS2, SARS CoV, Plasmodium malariae, virus Ébola, virus del oeste del Nilo, virus del Dengue, Gripe A, Gripe B, Mycobacterium tuberculosis.
21. Vector de ChAd según la reivindicación 19, en el que la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria primaria que es específica para un TAA contra el que el mamífero es tolerante.
22. Vector de ChAd según la reivindicación 5 para su utilización en un procedimiento de inducción de una respuesta inmunitaria contra un antígeno derivado de un agente infeccioso seleccionado de entre el grupo constituido por: VIH, VHC, VPH, VHS1, VHS2, SARS, Plasmodium malariae, virus Ébola, virus del oeste del Nilo, virus del Dengue, Gripe A, Gripe B y Mycobacterium tuberculosis que comprende las etapas siguientes:
(a)
sensibilizar a un huésped para responder a un agente infeccioso-antígeno administrando una primera composición de vacuna que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un agente infeccioso-antígeno contra el que se desea una respuesta inmunitaria específica de antígeno; y
(b)
reforzar la respuesta inmunitaria de la etapa (a) administrando una segunda composición de vacuna que comprende el vector de ChAd según la reivindicación 5 que contiene por lo menos una deleción funcional de su gen E1, y en el sitio de la deleción del gen E1, una secuencia que comprende un promotor que puede dirigir la expresión de ADN que codifica para el mismo agente infeccioso-antígeno suministrado en la etapa de sensibilización;
en el que la administración de la composición de refuerzo produce una respuesta inmunitaria que presenta el efecto de conferir inmunidad protectora.
23. Vector de ChAd según la reivindicación 5 para su utilización en un procedimiento de rotura de la tolerancia del huésped a un autoantígeno que comprende:
(a)
sensibilizar a un huésped para responder a un autoantígeno administrando una primera composición de vacuna que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un autoantígeno contra el que se desea una respuesta inmunitaria específica de antígeno, produciendo de este modo una respuesta sensibilizada; y
(b)
reforzar la respuesta inmunitaria sensibilizada de la etapa (a) administrando una segunda composición de vacuna que comprende el vector de ChAd según la reivindicación 5 que contiene por lo menos una deleción funcional de su gen E1, y en el sitio de la deleción del gen E1, una secuencia que comprende un promotor que puede dirigir la expresión de ADN que codifica para el mismo autoantígeno suministrado en la etapa de sensibilización,
en el que la administración de la composición de refuerzo produce una respuesta inmunitaria que presenta el efecto de romper la tolerancia del huésped al autoantígeno.
24. Vector de ChAd según la reivindicación 23, que comprende ADN que codifica para un autoantígeno seleccionado de entre el grupo constituido por: HER2 NEU, CEA, HEPCAM, PSA, PSMA, TELOMERASA, GP100, MELAN-A/MART-1, MUC-1, NY-ESO-1, SURVIVINA, ESTROMELISINA 3, TIROSINASA, MAGE3, CML68, CML66, OY-TES-1, SSX-2, SART-1, SART-2, SART-3, NY-CO-58, NY-BR-62, HKLP2, 5T4 y VEGFR2.
25. Vector de ChAd según la reivindicación 22 ó 23, en el que la primera composición de vacuna comprende ADN de plásmido que se administra por vía intramuscular en combinación con estimulación eléctrica.
26. Vector de ChAd según la reivindicación 22 ó 23, en el que la respuesta inmunitaria comprende la producción de células T CD8+ específicas de antígeno.
ES05701091T 2004-01-23 2005-01-18 Portadores de vacunas de adenovirus de chimpance. Active ES2337374T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US53879904P 2004-01-23 2004-01-23
US538799P 2004-01-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2337374T3 true ES2337374T3 (es) 2010-04-23

Family

ID=34807229

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES05701091T Active ES2337374T3 (es) 2004-01-23 2005-01-18 Portadores de vacunas de adenovirus de chimpance.
ES09176105.6T Active ES2627288T3 (es) 2004-01-23 2005-01-18 Portadores de vacuna de adenovirus de chimpancé
ES17156766T Active ES2871907T3 (es) 2004-01-23 2005-01-18 Portadores de vacuna de adenovirus de chimpancé

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES09176105.6T Active ES2627288T3 (es) 2004-01-23 2005-01-18 Portadores de vacuna de adenovirus de chimpancé
ES17156766T Active ES2871907T3 (es) 2004-01-23 2005-01-18 Portadores de vacuna de adenovirus de chimpancé

Country Status (17)

Country Link
US (2) US8216834B2 (es)
EP (3) EP2163260B1 (es)
JP (4) JP4814800B2 (es)
CN (3) CN101014613B (es)
AT (1) ATE449105T1 (es)
AU (2) AU2005206292B2 (es)
CA (5) CA2993042A1 (es)
CY (2) CY1109841T1 (es)
DE (1) DE602005017743D1 (es)
DK (2) DK2163260T3 (es)
ES (3) ES2337374T3 (es)
HU (1) HUE033576T2 (es)
LT (1) LT2163260T (es)
PL (2) PL1711518T3 (es)
PT (2) PT1711518E (es)
SI (2) SI1711518T1 (es)
WO (1) WO2005071093A2 (es)

Families Citing this family (190)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE449105T1 (de) * 2004-01-23 2009-12-15 Angeletti P Ist Richerche Bio Impfstoffträger für schimpansen-adenovirus
EP1893636A2 (en) 2005-06-17 2008-03-05 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. Hepatitis c virus nucleic acid vaccine
EP1968629A2 (en) * 2005-12-21 2008-09-17 Glaxo Group Limited Method of eliciting immune response
GB0706914D0 (en) 2007-04-10 2007-05-16 Isis Innovation Novel adenovirus vectors
US20100285050A1 (en) 2007-10-05 2010-11-11 Isis Innovation Limited Compositions and Methods
GB0719526D0 (en) 2007-10-05 2007-11-14 Isis Innovation Compositions and methods
DK2220242T3 (en) 2007-11-28 2017-03-27 Univ Pennsylvania ABE-ADENOVIRA OF GROUP B, SADV-28,27, -29, -32, -33 AND -35 AND APPLICATIONS THEREOF
EP2220217A2 (en) * 2007-11-28 2010-08-25 The Trustees of the University of Pennsylvania Simian subfamily c adenoviruses sadv-40, -31, and-34 and uses thereof
AU2014203073B2 (en) * 2007-11-28 2016-07-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian E adenovirus SAdV-30
CN101883858B (zh) * 2007-11-28 2015-07-22 宾夕法尼亚大学托管会 猿猴亚家族E腺病毒SAdV-39、-25.2、-26、-30、-37和-38及其应用
TW200938633A (en) * 2007-12-06 2009-09-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
JP5661476B2 (ja) * 2008-03-04 2015-01-28 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア サルアデノウイルスＳＡｄＶ−３６、−４２．１、−４２．２および−４４ならびにそれらの用途
US9758794B2 (en) 2008-04-22 2017-09-12 Rutgers, The State University Of New Jersey HCV E2 construct compositions and methods
US20110091495A1 (en) * 2008-04-22 2011-04-21 Rutgers, The State University Of New Jersey Hcv e2 construct compositions and methods
WO2010051367A1 (en) 2008-10-31 2010-05-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenoviruses sadv-43, -45,-48,-49, and -50 and uses thereof
US20110229508A1 (en) 2008-11-26 2011-09-22 Merck Sharp & Dohme Corp. Polypeptides for inducing a protective immune response against staphylococcus aureus
CN102292105A (zh) 2008-11-26 2011-12-21 默沙东公司 用于诱导抗金黄色葡萄球菌的保护性免疫应答的多肽
AU2010209938A1 (en) 2009-02-02 2011-08-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Simian adenovirus nucleic acid- and amino acid-sequences, vectors containing same, and uses thereof
WO2010085984A1 (en) * 2009-02-02 2010-08-05 Okairos Ag Simian adenovirus nucleic acid- and amino acid-sequences, vectors containing same, and uses thereof
SG10201900819SA (en) * 2009-02-02 2019-03-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Simian adenovirus nucleic acid- and amino acid- sequences, vectors containing same, and uses thereof
CA2762203A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Soumitra Roy Simian adenovirus 41 and uses thereof
WO2011057254A2 (en) * 2009-11-09 2011-05-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Simian adenoviral vector-based vaccines
EA201270607A1 (ru) 2009-11-09 2012-09-28 Генвек, Инк. Аденовирус обезьян и способы его использования
TR201902214T4 (tr) 2010-04-16 2019-03-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa Şempanze adenoviral vektörü-bazlı filovirüs aşıları.
JP2012044910A (ja) * 2010-08-25 2012-03-08 Chubu Food & Environmental Safety Center Co Ltd ネコカリシウイルス遺伝子の発現用ベクター及びこれを用いたウイルスの製造方法
JP6077450B2 (ja) 2010-11-12 2017-02-08 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア コンセンサス前立腺抗原、それをコードする核酸分子、ならびにそれを含むワクチンおよび用途
EP2643465B1 (en) 2010-11-23 2016-05-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Subfamily e simian adenovirus a1321 and uses thereof
WO2012089231A1 (en) 2010-12-30 2012-07-05 Okairòs Ag Paramyxovirus vaccines
US10183069B2 (en) * 2011-03-21 2019-01-22 Altimmune Inc. Rapid and prolonged immunologic-therapeutic
DK3205353T3 (da) * 2011-03-21 2021-04-06 Altimmune Inc Hurtig- og langtidsvirkende immunologisk terapeutisk middel
GB201108879D0 (en) 2011-05-25 2011-07-06 Isis Innovation Vector
US9566318B2 (en) * 2011-07-01 2017-02-14 Biosceptre (Aust) Pty Ltd Combination therapy
TWI623618B (zh) 2011-07-12 2018-05-11 傳斯堅公司 Ｈｂｖ聚合酶突變體
WO2013045658A1 (en) 2011-09-29 2013-04-04 Transgene Sa Immunotherapy composition and regimen for treating hepatitis c virus infection
TW201321016A (zh) 2011-09-29 2013-06-01 Transgene Sa 免疫療法組成物及用於治療ｃ型肝炎病毒感染之療程（二）
CN107937440A (zh) * 2011-10-05 2018-04-20 金维克有限公司 猴腺病毒(大猩猩)或腺病毒载体及其使用方法
WO2013074501A1 (en) 2011-11-14 2013-05-23 Crucell Holland B.V. Heterologous prime-boost immunization using measles virus-based vaccines
SI2825640T1 (sl) 2012-03-12 2016-08-31 Crucell Holland B.V. Šarže rekombinantnega adenovirusa s spremenjenimi konci
US8932607B2 (en) 2012-03-12 2015-01-13 Crucell Holland B.V. Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
RU2737765C2 (ru) 2012-05-04 2020-12-02 Пфайзер Инк. Простатоассоциированные антигены и иммунотерапевтические схемы на основе вакцин
SG10201609511XA (en) * 2012-05-18 2016-12-29 Univ Pennsylvania Subfamily e simian adenoviruses a1302, a1320, a1331 and a1337 and uses thereof
WO2014005643A1 (en) 2012-07-05 2014-01-09 Okairos Ag Novel prime-boosting regimens involving immunogenic polypeptides encoded by polynucleotides
EP3842068A1 (en) 2012-07-05 2021-06-30 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Novel prime-boosting regimens involving immunogenic polypeptides encoded by polynucleotides
US10357555B2 (en) 2012-07-10 2019-07-23 Transgene Sa Mycobacterial antigen vaccine
WO2014009433A1 (en) 2012-07-10 2014-01-16 Transgene Sa Mycobacterium resuscitation promoting factor for use as adjuvant
GB201217868D0 (en) * 2012-10-05 2012-11-21 Isis Innovation Staphyolococcus aureus antigens
US9222142B2 (en) * 2013-01-15 2015-12-29 The Regents Of The University Of California Adenoviruses and their use
EP2971008B1 (en) 2013-03-14 2018-07-25 Salk Institute for Biological Studies Oncolytic adenovirus compositions
US9402888B2 (en) 2013-03-14 2016-08-02 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for treating cancer
WO2014139587A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Okairòs Ag Improved poxviral vaccines
KR102236497B1 (ko) 2013-04-25 2021-04-06 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 안정화된 가용성 예비융합 ｒｓｖ ｆ 폴리펩타이드
GB201310031D0 (en) * 2013-06-05 2013-07-17 Pirbright Inst The Cell
US9592327B2 (en) 2013-09-06 2017-03-14 Cardiac Pacemakers, Inc. Systems and methods for heart failure management
BR112016008806A2 (pt) * 2013-11-01 2017-10-03 Pfizer Vetores para expressão de antígenos associados à próstata
EP3092000A1 (en) 2014-01-09 2016-11-16 Transgene SA Fusion of heterooligomeric mycobacterial antigens
WO2015189425A1 (en) 2014-06-13 2015-12-17 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic combinations
MY183072A (en) 2014-09-03 2021-02-10 Bavarian Nordic As Methods and compositions for inducing protective immunity against filovirus infection
US10561722B2 (en) 2014-09-03 2020-02-18 Bavarian Nordic A/S Methods and compositions for enhancing immune responses
WO2017025782A1 (en) 2014-09-17 2017-02-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Improved poxviral vaccines
ES2865150T3 (es) 2014-09-26 2021-10-15 Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc Métodos y composiciones para inducir inmunidad protectora contra la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana
PT3200815T (pt) 2014-10-02 2021-05-07 Wistar Inst Métodos e composições para o tratamento de cancro
JP6647315B2 (ja) * 2015-01-09 2020-02-14 イーチュービクス コーポレイション 組み合わせ免疫療法のための方法および組成物
GB201501523D0 (en) * 2015-01-30 2015-03-18 Univ Plymouth Differential immune response modulation
WO2016131945A1 (en) 2015-02-20 2016-08-25 Transgene Sa Combination product with autophagy modulator
EP3283634B1 (en) 2015-04-14 2019-05-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Recombinant adenovirus expressing two transgenes with a bidirectional promoter
US11149087B2 (en) 2015-04-20 2021-10-19 Etubics Corporation Methods and compositions for combination immunotherapy
WO2016178167A1 (en) * 2015-05-04 2016-11-10 Vcn Biosciences Sl Oncolytic adenoviruses with mutations in immunodominant adenovirus epitopes and their use in cancer treatment
DK3294326T3 (da) 2015-05-15 2021-05-31 Curevac Ag Prime-boost-regimer indbefattende indgivelse af mindst én mrna-konstruktion
GB201514772D0 (en) * 2015-08-19 2015-09-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Adenovirus polynucleotides and polypeptides
BE1024824B1 (fr) * 2015-06-12 2018-07-13 Glaxosmithkline Biologicals Sa Polynucleotides et polypeptides d'adenovirus
EA038402B9 (ru) * 2015-06-12 2021-09-22 Глаксосмитклайн Байолоджикалс Са Аденовирусные полинуклеотиды и полипептиды
CN107847581B (zh) 2015-07-07 2022-03-22 扬森疫苗与预防公司 稳定化的可溶性融合前rsv f多肽
US10456462B2 (en) 2015-07-07 2019-10-29 Janssen Vaccines & Preventions B.V. Vaccine against RSV
GB201513010D0 (en) * 2015-07-23 2015-09-09 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel formulation
GB201513176D0 (en) * 2015-07-27 2015-09-09 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel methods for inducing an immune response
JP6510149B2 (ja) 2015-12-15 2019-05-08 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． ヒト免疫不全ウイルス抗原、ベクター、組成物、およびその使用方法
TWI709647B (zh) 2016-01-19 2020-11-11 美商輝瑞股份有限公司 癌症疫苗
US11208468B2 (en) 2016-02-18 2021-12-28 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for treating melanoma
JP7015551B2 (ja) 2016-02-23 2022-02-15 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ ウイルス動態への影響を最小限にするための治療用アデノウイルスにおける外因性遺伝子発現
JP7054527B2 (ja) 2016-02-23 2022-04-14 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ アデノウイルスの複製動態を測定するための高スループットアッセイ
DK3436591T3 (da) 2016-03-31 2023-03-20 The European Molecular Biology Laboratory Adenovirale coat-protein-afledte transportvehikler
PT3439672T (pt) 2016-04-05 2021-02-24 Janssen Vaccines & Prevention Bv Proteína f do rsv pré-fusão solúvel e estabilizada para uso na profilaxia de infeção por rsv
WO2017174564A1 (en) 2016-04-05 2017-10-12 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vaccine against rsv
CA3023022A1 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Transgene Sa Combination therapy with cpg tlr9 ligand
BR112018072865A2 (pt) 2016-05-12 2019-04-30 Janssen Vaccines & Prevention B.V. promotor bidirecional potente e equilibrado
PL3464331T3 (pl) 2016-05-30 2021-04-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilizowane przedfuzyjne białka F RSV
MX2018015540A (es) 2016-06-20 2019-04-11 Janssen Vaccines & Prevention Bv Promotor bidireccional potente y equilibrado.
GB2549809C (en) * 2016-06-23 2022-11-30 Univ Oxford Innovation Ltd Vector
WO2018011768A1 (en) 2016-07-15 2018-01-18 Janssen Vaccines And Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against a marburg virus infection
US10925955B2 (en) 2016-07-15 2021-02-23 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against a Marburg virus infection
CN107753941A (zh) * 2016-08-19 2018-03-06 中国科学院上海巴斯德研究所 基于黑猩猩腺病毒载体的埃博拉病毒疫苗
EP3504230A1 (en) 2016-08-23 2019-07-03 GlaxoSmithKline Biologicals SA Fusion peptides with antigens linked to short fragments of invariant chain (cd74)
WO2018060288A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Compositions and methods of treatment of persistent hpv infection
GB201616904D0 (en) 2016-10-05 2016-11-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine
US20190328869A1 (en) 2016-10-10 2019-10-31 Transgene Sa Immunotherapeutic product and mdsc modulator combination therapy
EP3544607A4 (en) * 2016-11-23 2020-10-14 Gritstone Oncology, Inc. VIRAL ADMINISTRATION OF NEO-ANTIGENS
GB201620968D0 (en) * 2016-12-09 2017-01-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Adenovirus polynucleotides and polypeptides
CN110036020A (zh) * 2016-12-09 2019-07-19 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 具有狂犬病病毒抗原的黑猩猩腺病毒构建体
CA3045892A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Salk Institute For Biological Studies Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof
GB201701239D0 (en) 2017-01-25 2017-03-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel formulation
CA3053212C (en) 2017-02-09 2021-04-13 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and short promoter for expression of heterologous genes
EP3606553A1 (en) 2017-04-06 2020-02-12 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Mva-bn and ad26.zebov or ad26.filo prime-boost regimen
JP2020518648A (ja) 2017-05-08 2020-06-25 グリットストーン オンコロジー インコーポレイテッド アルファウイルス新生抗原ベクター
CA3061278A1 (en) 2017-05-17 2018-11-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against rsv infection
WO2018210871A1 (en) 2017-05-17 2018-11-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against rsv infection
MA49397A (fr) 2017-06-15 2020-04-22 Bavarian Nordic As Vecteurs à poxvirus codant pour des antigènes du vih, et leurs procédés d'utilisation
CN111108192B (zh) 2017-07-05 2023-12-15 Nouscom股份公司 非人类人猿腺病毒核酸序列和氨基酸序列、含有其的载体及其用途
CA3069363A1 (en) 2017-07-11 2019-01-17 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising cea muc1 and tert
CN111093699A (zh) 2017-07-12 2020-05-01 Nouscom股份公司 用于治疗癌症的新抗原疫苗组合物
US11649467B2 (en) * 2017-07-21 2023-05-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Chikungunya virus antigen constructs
US11235051B2 (en) 2017-07-28 2022-02-01 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods and compositions for heterologous repRNA immunizations
BR112020004143A2 (pt) 2017-09-15 2020-09-01 Janssen Vaccines & Prevention B.V. método para a indução segura de imunidade contra vírus sincicial respiratório (rsv)
JP7274225B2 (ja) * 2017-10-25 2023-05-16 ノイスコム アーゲー 真核細胞系統
BR112020008435A2 (pt) * 2017-10-31 2020-11-17 Janssen Vaccines & Prevention B.V. vetores de adenovírus e seus usos
SG11202003399TA (en) 2017-10-31 2020-05-28 Janssen Vaccines & Prevention Bv Adenovirus and uses thereof
KR20200083510A (ko) 2017-10-31 2020-07-08 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 아데노바이러스 및 이의 용도
MA50502A (fr) 2017-10-31 2020-09-09 Janssen Vaccines & Prevention Bv Adénovirus et utilisations associées
BR112020008308A2 (pt) 2017-11-03 2020-11-17 Nouscom Ag polipeptídeo, polinucleotídeo, vetor, coleção de dois ou mais vetores, composição farmacêutica e kit
US10864263B2 (en) 2017-11-20 2020-12-15 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Method of providing safe administration of adenoviral vectors encoding a zika virus antigen
GB201721068D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B immunisation regimen and compositions
GB201721069D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B Immunisation regimen and compositions
MX2020006471A (es) 2017-12-19 2020-09-22 Janssen Sciences Ireland Unlimited Co Metodos y composiciones para inducir una respuesta inmune contra el virus de hepatitis b (hbv).
BR112020012361A2 (pt) 2017-12-20 2020-11-24 Glaxosmithkline Biologicals S.A. constructos de antígeno do vírus epstein-barr
CN111818943A (zh) 2018-01-04 2020-10-23 伊科尼克治疗公司 抗组织因子抗体、抗体-药物缀合物及相关方法
EP3796927A4 (en) * 2018-05-23 2022-04-20 Gritstone bio, Inc. SHARED ANTIGENS
WO2019239311A1 (en) 2018-06-12 2019-12-19 Glaxosmithkline Biologicals Sa Adenovirus polynucleotides and polypeptides
EP3581201A1 (en) 2018-06-15 2019-12-18 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Escherichia coli o157:h7 proteins and uses thereof
CN110616198B (zh) * 2018-06-19 2021-02-19 清华大学 一种基于黑猩猩腺病毒68型和MERS-CoV全长膜蛋白的新型冠状病毒疫苗
EP3587581A1 (en) 2018-06-26 2020-01-01 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Formulations for simian adenoviral vectors having enhanced storage stability
US11713469B2 (en) 2018-07-20 2023-08-01 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Recombinant adenoviral vector expressing Zika antigen with improved productivity
GB201812647D0 (en) * 2018-08-03 2018-09-19 Chancellor Masters And Scholars Of The Univ Of Oxford Viral vectors and methods for the prevention or treatment of cancer
KR20210081325A (ko) 2018-10-19 2021-07-01 노우스콤 아게 경골어류 불변 사슬 암 백신
CN113424264B (zh) 2018-11-15 2024-04-12 Nouscom股份公司 用于生成个性化癌症疫苗的癌症突变选择
EP3897846A1 (en) 2018-12-21 2021-10-27 GlaxoSmithKline Biologicals SA Methods of inducing an immune response
TW202043256A (zh) 2019-01-10 2020-12-01 美商健生生物科技公司 ***新抗原及其用途
CN113573730A (zh) 2019-03-05 2021-10-29 葛兰素史密斯克莱生物公司 乙型肝炎免疫方案和组合物
CA3140019A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 Gritstone Bio, Inc. Modified adenoviruses
CN112410375B (zh) * 2019-08-22 2024-06-14 苏州相奕生物技术有限公司 腺病毒载体AdC68XY、由其包装的病毒及应用
KR20220074917A (ko) * 2019-09-30 2022-06-03 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 Hbv 백신 및 hbv를 치료하는 방법
US20220372515A1 (en) 2019-10-03 2022-11-24 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus vectors and uses thereof
WO2021099906A1 (en) 2019-11-18 2021-05-27 Janssen Biotech, Inc. Vaccines based on mutant calr and jak2 and their uses
WO2021119545A1 (en) * 2019-12-11 2021-06-17 Gritstone Bio, Inc. Durable vaccination
CN113088538A (zh) * 2020-01-08 2021-07-09 怡道生物科技(苏州)有限公司 一种基于黑猩猩ChAd3型腺病毒的表达载体及其构建方法
CN113088530A (zh) * 2020-01-08 2021-07-09 怡道生物科技(苏州)有限公司 一种基于黑猩猩ChAd63型腺病毒的表达载体及其构建方法
CN111394334B (zh) * 2020-01-10 2022-02-15 中山大学 抑制ezh2活性的抗肿瘤多肽及其应用
US11498944B2 (en) 2020-01-31 2022-11-15 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for preventing and treating coronavirus infection—SARS-CoV-2 vaccines
CA3160511A1 (en) 2020-02-04 2021-08-12 Susanne RAUCH Coronavirus vaccine
TW202144389A (zh) 2020-02-14 2021-12-01 美商健生生物科技公司 在多發性骨髓瘤中表現之新抗原及其用途
TW202144388A (zh) 2020-02-14 2021-12-01 美商健生生物科技公司 在卵巢癌中表現之新抗原及其用途
EP3805392A4 (en) * 2020-02-23 2022-06-29 Guangzhou N Biomed Ltd. Nucleic acid sequence expressing sars-cov-2 virus antigen peptide and use thereof
CA3173793A1 (en) * 2020-04-03 2021-10-07 Andrew Ferguson Infectious disease antigens and vaccines
US20210315986A1 (en) 2020-04-13 2021-10-14 Janssen Biotech, Inc. Psma and steap1 vaccines and their uses
BR112022022937A2 (pt) 2020-05-11 2022-12-20 Janssen Pharmaceuticals Inc Proteínas de fusão estabilizadas de proteína de pico de coronavírus
BR112022024248A2 (pt) 2020-05-29 2023-10-10 CureVac SE Vacinas de combinação à base de ácido nucleico
MX2023000024A (es) 2020-06-29 2023-04-12 Janssen Vaccines & Prevention Bv Combinación vacunal contra la infección por el virus respiratorio sincicial.
US20230035403A1 (en) 2020-07-06 2023-02-02 Janssen Biotech, Inc. Method For Determining Responsiveness To Prostate Cancer Treatment
US20230024133A1 (en) 2020-07-06 2023-01-26 Janssen Biotech, Inc. Prostate Neoantigens And Their Uses
US20230029453A1 (en) 2020-07-06 2023-02-02 Janssen Biotech, Inc. Prostate Neoantigens And Their Uses
CN113897388B (zh) * 2020-07-06 2024-05-31 嘉兴安宇生物科技有限公司 一种新型黑猩猩腺病毒载体及其构建方法和应用
CN115916804A (zh) 2020-07-06 2023-04-04 杨森制药公司 稳定的冠状病毒刺突蛋白融合蛋白
TW202216190A (zh) 2020-07-08 2022-05-01 愛爾蘭商健生科學愛爾蘭無限公司 抗hbv之rna複製子疫苗
EP4178605A1 (en) 2020-07-13 2023-05-17 Transgene Treatment of immune depression
EP4172194A1 (en) 2020-07-31 2023-05-03 CureVac SE Nucleic acid encoded antibody mixtures
WO2022032196A2 (en) 2020-08-06 2022-02-10 Gritstone Bio, Inc. Multiepitope vaccine cassettes
CN112220921B (zh) * 2020-08-25 2022-08-16 北京交通大学 一种针对呼吸道合胞病毒感染的组合疫苗
CN112226450B (zh) * 2020-08-25 2022-10-14 北京交通大学 一种共表达呼吸道合胞病毒融合前蛋白和黏附糖蛋白的复制缺陷型腺病毒载体疫苗
CA3170743A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Susanne RAUCH Multivalent nucleic acid based coronavirus vaccines
GB202016604D0 (en) 2020-10-20 2020-12-02 Univ Of Oxford Compositions and methods for inducing an immune response
CN112138150A (zh) * 2020-11-26 2020-12-29 怡道生物科技(苏州)有限公司 基于黑猩猩腺病毒载体的治疗性hpv疫苗、其制备方法及应用
EP4255503A2 (en) * 2020-12-04 2023-10-11 Gritstone bio, Inc. Compositions and methods of use thereof
WO2022140759A2 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Janssen Biotech, Inc. Neoantigen peptide mimics
IT202100003470A1 (it) 2021-02-16 2022-08-16 Fond Toscana Life Sciences Vaccines against sars-cov-2
JP2024509756A (ja) 2021-02-19 2024-03-05 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー 安定化された融合前ｒｓｖ ｆｂ抗原
WO2022175479A1 (en) 2021-02-19 2022-08-25 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vaccine combinations against respiratory syncytial virus strain a and b infections
CA3214415A1 (en) 2021-04-01 2022-10-06 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion piv3 f proteins
WO2022218997A1 (en) 2021-04-12 2022-10-20 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Novel universal vaccine presenting system
KR20240024800A (ko) 2021-06-21 2024-02-26 노우스콤 아게 암호화된 아주반트를 포함하는 백신 조성물
WO2023020939A1 (en) 2021-08-17 2023-02-23 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Sars-cov-2 vaccines
WO2023026182A1 (en) 2021-08-24 2023-03-02 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Sars-cov-2 vaccines
WO2023047348A1 (en) 2021-09-24 2023-03-30 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Stabilized corona virus spike protein fusion proteins
WO2023047349A1 (en) 2021-09-24 2023-03-30 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Stabilized coronavirus spike protein fusion proteins
WO2023111725A1 (en) 2021-12-14 2023-06-22 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Sars-cov-2 vaccines
WO2023110618A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion hmpv fusion proteins
WO2023196634A2 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Vaccines and related methods
WO2023198815A1 (en) 2022-04-14 2023-10-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Sequential administration of adenoviruses
WO2023213764A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Transgene Fusion polypeptide comprising an anti-pd-l1 sdab and a member of the tnfsf
WO2024030856A2 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunomodulatory proteins and related methods
WO2024061759A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized coronavirus s proteins
WO2024061757A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Pre-fusion human piv1 f proteins
WO2024074584A1 (en) 2022-10-06 2024-04-11 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion piv3 f proteins

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL116816A (en) * 1995-01-20 2003-05-29 Rhone Poulenc Rorer Sa Cell for the production of a defective recombinant adenovirus or an adeno-associated virus and the various uses thereof
US6127525A (en) 1995-02-21 2000-10-03 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral coat protein and methods of using same
AU6261696A (en) * 1995-06-05 1996-12-24 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The A replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a vaccine carrier
SI0833934T2 (sl) 1995-06-15 2013-04-30 Crucell Holland B.V. Pakirni sistemi za humani rekombinantni adenovirus za uporabo v genski terapiji
WO1998010087A1 (en) * 1996-09-06 1998-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimpanzee adenovirus vectors
US5922315A (en) * 1997-01-24 1999-07-13 Genetic Therapy, Inc. Adenoviruses having altered hexon proteins
FR2761689B1 (fr) * 1997-04-02 1999-06-25 Transgene Sa Fibre adenovirale modifiee et adenovirus cibles
US5849561A (en) 1997-05-22 1998-12-15 Cornell Research Foundation, Inc. Method for the production of non-group C adenoviral vectors
US20040136963A1 (en) * 2001-06-22 2004-07-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus vectors and methods of use
AU2002322285A1 (en) * 2001-06-22 2003-01-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for rapid screening of bacterial transformants and novel simian adenovirus proteins
EP1409012B1 (en) * 2001-06-22 2009-02-11 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods of inducing a cytotoxic immune response and recombinant simian adenovirus compositions useful therein
MXPA04004876A (es) * 2001-11-21 2004-07-30 Univ Pennsylvania Secuencias de acido nucleico y de aminoacido de adenovirus de simio, vectores que contienen los mismos y metodos de uso.
AU2003210661A1 (en) * 2002-01-24 2003-09-02 Novartis Ag Fiber shaft modifications for efficient targeting
ES2478625T3 (es) 2003-06-20 2014-07-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Método de generación de adenovirus quiméricos y usos de tales adenovirus quiméricos
ATE449105T1 (de) * 2004-01-23 2009-12-15 Angeletti P Ist Richerche Bio Impfstoffträger für schimpansen-adenovirus

Also Published As

Publication number Publication date
LT2163260T (lt) 2017-06-26
US8673319B2 (en) 2014-03-18
DK2163260T3 (en) 2017-06-19
US20110217332A1 (en) 2011-09-08
CN101014613B (zh) 2012-09-05
CN107723298A (zh) 2018-02-23
JP2012110326A (ja) 2012-06-14
CA3028774A1 (en) 2005-08-04
EP2163260B1 (en) 2017-03-15
EP3269390A2 (en) 2018-01-17
CY1119285T1 (el) 2018-02-14
SI2163260T1 (sl) 2017-07-31
JP2007518414A (ja) 2007-07-12
JP2011120588A (ja) 2011-06-23
ES2871907T3 (es) 2021-11-02
CA2993042A1 (en) 2005-08-04
PL2163260T3 (pl) 2017-12-29
PT2163260T (pt) 2017-06-08
JP5427874B2 (ja) 2014-02-26
DE602005017743D1 (de) 2009-12-31
CN101014613A (zh) 2007-08-08
EP2163260A3 (en) 2010-06-23
JP2014158467A (ja) 2014-09-04
US20120328651A1 (en) 2012-12-27
US8216834B2 (en) 2012-07-10
CN102719478A (zh) 2012-10-10
AU2011247884B2 (en) 2014-11-20
HUE033576T2 (en) 2017-12-28
CA2880060C (en) 2018-03-13
WO2005071093A3 (en) 2006-03-30
EP3269390B1 (en) 2021-02-17
AU2005206292A1 (en) 2005-08-04
CA2553541C (en) 2015-04-21
DK1711518T3 (da) 2010-04-06
PL1711518T3 (pl) 2010-06-30
WO2005071093A2 (en) 2005-08-04
CA2880061C (en) 2018-03-13
PT1711518E (pt) 2010-02-26
AU2011247884A1 (en) 2011-12-01
EP1711518A2 (en) 2006-10-18
EP1711518B1 (en) 2009-11-18
CY1109841T1 (el) 2014-09-10
CA2880061A1 (en) 2005-08-04
ATE449105T1 (de) 2009-12-15
EP3269390A3 (en) 2018-04-18
CA2880060A1 (en) 2005-08-04
ES2627288T3 (es) 2017-07-27
EP2163260A2 (en) 2010-03-17
AU2005206292B2 (en) 2011-09-29
CA2553541A1 (en) 2005-08-04
SI1711518T1 (sl) 2010-04-30
JP4814800B2 (ja) 2011-11-16
JP5753377B2 (ja) 2015-07-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2337374T3 (es) Portadores de vacunas de adenovirus de chimpance.
ES2898235T3 (es) Secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos de adenovirus de simio, vectores que las contienen, y sus usos
JP2008538894A (ja) アデノウイルス血清型２６ベクター、核酸およびそれにより製造されたウイルス
JP7319368B2 (ja) アデノウイルスおよびアデノウイルスを使用するための方法
JP2008508899A (ja) アデノウイルスベクター組成物
JP2006513714A (ja) アデノウイルス血清型２４ベクター、核酸およびそれにより製造されたウイルス
JP2006521089A (ja) アデノウイルス血清型３４ベクター、核酸及びそれにより生産されるウイルス
Mittal et al. Xenogenic adenoviral vectors
AU2011247887B2 (en) Chimpanzee adenovirus vaccine carriers
Mittal et al. Adenoviral vectors: Potential and challenges as a gene delivery system