BR112020008435A2 - vetores de adenovírus e seus usos - Google Patents

Abstract

No presente documento são conferidos vetores adenovirais quiméricos. Os vetores adenovirais quiméricos conferidos podem ser usados para induzir uma resposta imune protetora em um indivíduo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VETORES DE ADENOVÍRUS E SEUS USOS".

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se à biotecnologia. Mais particularmente, ao campo e uso de vetores adenovirais, tais como vetores adenovirais deficientes na replicação para administrar antígenos e provocar uma resposta imune nos hospedeiros.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Os vetores adenovirais recombinantes são amplamente aplicados para aplicações de terapia genética e vacinas. As vacinas baseadas em vetores AdV-5 mostraram provocar respostas imunes e protetoras potentes em uma variedade de modelos animais (ver, por exemplo, o documento WO2001/02607; WO2002/22080; Shiver et al., Nature 415:331 (2002); Letvin et al., Ann. Rev. Immunol. 20:73 (2002); Shiver e Emini, Ann. Rev. Med. 55:355 (2004)). No entanto, a utilidade das vacinas baseadas em vetores AdV-5 recombinantes provavelmente será limitada pela elevada soroprevalência de anticorpos neutralizantes específicos para AdV-5 (NAbs) nas populações humanas. Foi demonstrado que a existência de imunidade anti-AdV-5 suprime substancialmente a imunogenicidade de vacinas baseadas em AdV-5 em estudos em camundongos, macacos rhesus e seres humanos.

[003] Uma estratégia promissora para contornar a existência de imunidade preexistente em indivíduos previamente infectados ou tratados com o adenovírus humano mais comum, por exemplo, o AdV- 5, envolve o desenvolvimento de vetores recombinantes a partir de sorotipos de adenovírus que não encontram tais imunidades preexistentes. Uma dessas estratégias é baseada no uso de adenovírus quiméricos compreendendo a substituição de sequências de proteína do capsídeo nativas (por exemplo, sequências de proteína de hexon e/ou fibra) por sequências de proteína do capsídeo (por exemplo,

sequências de proteína de hexon e/ou fibra) a partir de adenovírus com baixa soroprevalência (ou sem soroprevalência).

[004] Desse modo, existe uma necessidade no campo para vetores adenovirais alternativos que possam ser produzidos em grandes quantidades, que não encontram imunidades preexistentes no hospedeiro, mas que ainda são imunogênicos e capazes de induzir uma resposta imune forte contra os antígenos codificados pelos ácidos nucleicos heterólogos inseridos no vetor.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] No presente documento são conferidos vetores adenovirais. O vetor adenoviral pode compreender uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo de hexon compreendendo um polipeptídeo englobando regiões hipervariáveis de hexon compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2. Em certas modalidades, o vetor adenoviral pode compreender a sequência de polipeptídeo de hexon compreendendo a SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4.

[006] Em certas modalidades, o vetor adenoviral adicionalmente pode compreender uma deleção E1. Em certas modalidades, o vetor adenoviral adicionalmente pode compreender uma deleção E3. O vetor adenoviral adicionalmente pode compreender um adenovírus humano 5 (HAdV-5) E4 orf6. O vetor adenoviral pode, por exemplo, compreender uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6.

[007] Em certas modalidades, o vetor adenoviral adicionalmente compreende, pelo menos, um transgene. Em certas modalidades o, pelo menos um, transgene está localizado na deleção E1, na deleção E3 e/ou adjacente à repetição terminal invertida direita (rITR).

[008] Em certas modalidades, o vetor adenoviral compreende uma ou mais sequências de ácido nucleico a partir do adenovírus humano

26 (Ad26).

[009] Também são conferidas células recombinantes compreendendo os vetores adenovirais descritos no presente documento. Também são conferidos métodos de produção dos vetores adenovirais. Os métodos compreendem (a) o crescimento das células recombinantes descritas no presente documento sob condições para a produção do vetor adenoviral; e (b) isolamento do vetor adenoviral a partir da célula recombinante.

[0010] Também são conferidas composições imunogênicas compreendendo os vetores adenovirais descritos no presente documento e um veículo farmaceuticamente aceitável. Também são conferidos métodos de indução de uma resposta imune em um indivíduo que dela necessite. Os métodos compreendem a administração ao indivíduo das composições imunogênicas descritas no presente documento. Também são conferidos métodos de produção das composições imunogênicas, ou os métodos compreendem a combinação dos vetores adenovirais descritos no presente documento com um veículo farmaceuticamente aceitável.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0011] O sumário anterior, bem como a seguinte descrição detalhada de modalidades preferidas do presente pedido, serão melhor entendidos quando lidos em conjunto com os desenhos em anexo. No entanto, deve ser entendido que o pedido não está limitado às modalidades precisas mostradas nos desenhos.

[0012] A Figura 1 mostra um esquema das substituições de sequência de hexon dos vetores quiméricos de hexon descritas no presente documento. A Figura 1A mostra um esquema que demonstra as localizações no gene hexon HAdV-26 de comprimento total (barra aberta) dos cinco segmentos de gene de hexon (barras cinza) e as sete regiões hipervariáveis curtas (HVRs) (barras pretas) que foram trocadas anteriormente entre hexons HAdV-5 e HAdV-48 de modo a gerar o vetor HAdV-5 quimérico de hexon Ad5HVR48 (1-7) (Roberts et al, Nature 441: 239-43. (2006)). A Figura 1B mostra um alinhamento parcial das sequências polipeptídicas de hexon de HAdV-26, PtroAdV-1, PtroAdV- 12, e PtroAdV-13. As barras cinza correspondem aos cinco segmentos de genes de hexon trocados no presente documento entre HAdV-26 e PtroAdV-1, PtroAdV-12 ou PtroAdV-13. As barras pretas indicam as sequências correspondentes às HVRs atribuídas anteriormente acima mencionadas que foram trocadas entre HAdV-5 e HAdV-48.

[0013] A Figura 2 mostra um esquema dos vetores pAd26 quiméricos. A Figura 2A mostra um esquema das características gerais de pAd26.HVRPtr12.luc (SEQ ID NO:21). A Figura 2B mostra um esquema das características gerais de pAd26.HVRPtr13.luc (SEQ ID NO:22).

[0014] A Figura 3 mostra um esquema das características gerais de pAd26.ApoA1.RSVF-2A-GLuc (SEQ ID NO:29).

[0015] A Figura 4 mostra um esquema da estratégia de recombinação homóloga que foi usada para gerar vetores adenovirais Ad26HVRPtr12.RSVF-2A-GLuc e Ad26HVRPtr13.RSVF-2A-GLuc (em células que complementam E1).

[0016] A Figura 5 mostra as respostas imunes celulares e humorais induzidas por Ad26HVRPtr12.FLuc e Ad26HVRPtr13.FLuc. A Figura 5A mostra a configuração experimental. A Figura 5B mostra um gráfico da resposta imune induzida por Ad26.FLuc, Ad26HVRPtr12.FLuc e Ad26HVRPtr13.FLuc contra o antígeno codificado por vetor (isto é, Fluc, luciferase de vaga-lume), conforme determinado pela análise ELISPOT de interferon gama (IFN-γ). O eixo y mostra o número de Unidades Formadoras de Pontos (SFU) por 106 esplenócitos e a linha pontilhada indica o percentil 95% dos estímulos médios.

[0017] A Figura 6 mostra respostas imunes celulares e humorais induzidas por Ad26HVRPtr12.RSVF-2A-GLuc e Ad26HVRPtr13.RSVF- 2A-GLuc. A Figura 6A mostra a configuração experimental. A Figura 6 B mostra os resultados de um ensaio de neutralização de um vírus RSV A2 (VNA) realizado a oito semanas após a imunização com Ad26.RSVF- 2A-GLuc, Ad26HVRPtr12.RSVF-2A-GLuc e Ad26HVRPtr13.RSVF-2A- GLuc. A Figura 6C mostra a resposta imunes celulares induzidas por Ad26.RSVF-2A-GLuc, Ad26HVRPtr12.RSVF-2A-GLuc e Ad26HVRPtr13.RSVF-2A-GLuc contra o antígeno codificado por vetor RSV F, conforme determinado pela análise IFN-γ ELISPOT. O eixo y mostra o número de Unidades Formadoras de Pontos (SFU) por 10 6 esplenócitos e a linha pontilhada indica o percentil 95% dos estímulos médios. A Figura 6D mostra um gráfico de anticorpos de ligação a IgG específicos para RSVF induzidos por Ad26.RSVF-2A-GLuc, Ad26HVRPtr12.RSVF-2A-GLuc e Ad26HVRPtr13.RSVF-2A-GLuc no soro de camundongos imunizados 8 semanas após a imunização. O gráfico mostra os títulos ELISA de IgG calculados como títulos de ponto final (log10).

[0018] A Figura 7 mostra títulos de neutralização de adenovírus homólogos e heterólogos induzidos em camundongos imunizados com vetores adenovirais Ad35, Ad26, Ad5, Ad4, Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13.

[0019] A Figura 8 mostra a soroprevalência de Ad26, Ad5, Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13 em 200 amostras de soro de coorte humana de adultos, com idades entre 18 e 55 anos, residentes nos Estados Unidos (EUA) e União Europeia (UE). Os títulos de neutralização medidos nesses soros em relação a cada vetor foram divididos em quatro categorias (<16 (sem neutralização), 16 a 300, 300 a 1.000, 1.000 a 4.000 e > 4.000), representadas nos gráficos, conforme indicado.

[0020] A Figura 9 mostra a produtividade de vetores quiméricos de capsídeo AdHVRPtr12.FLuc e Ad26HVRPtr13.FLuc na linha de células de produção sPER.C6.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0021] A presente divulgação é baseada, pelo menos em parte, na criação de vetores adenovirais quiméricos compreendendo uma estrutura humana e pelo menos uma de uma sequência quimérica de hexon ou de polipeptídeo de fibra. Os vetores adenovirais são capazes de provocar uma resposta imune enquanto mantêm baixa soroprevalência. Os vetores adenovirais podem ser formulados para vacinas e usados de forma a induzir imunidade protetora contra antígenos específicos de interesse.

[0022] Várias publicações, artigos e patentes são citados ou descritos nos antecedentes e ao longo da especificação; cada uma dessas referências é incorporada neste documento a título de referência na sua totalidade. A discussão de documentos, atos, materiais, dispositivos, artigos ou similares que foi incluída na presente especificação se destina ao propósito de conferir contexto para a invenção. Tal discussão não é uma admissão de que qualquer uma ou todas essas matérias fazem parte da técnica anterior no que diz respeito a quaisquer invenções divulgadas ou reivindicadas.

[0023] A não ser que definidos de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado comumente entendido pelo perito na técnica à qual a presente invenção pertence. De outro modo, certos termos usados neste documento têm os significados como apresentados na especificação.

[0024] Deve ser notado que, conforme usadas neste documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem referências no plural a menos que o contexto determine claramente de outro modo.

[0025] A não ser que afirmado de outro modo, quaisquer valores numéricos, tais como uma concentração ou uma gama de concentrações descrita neste documento, deve ser entendido como sendo modificados em todos os casos pelo termo "cerca de". Assim, um valor numérico inclui tipicamente ± 10% do valor apresentado. Por exemplo, uma concentração de 1 mg/mL inclui 0,9 mg/mL até 1,1 mg/mL. Do mesmo modo, uma gama de concentrações de 1% até 10% (p/v) inclui 0,9% (p/v) até 11% (p/v). Conforme usado neste documento, o uso de uma gama numérica inclui expressamente todas as possíveis subgamas, todos os valores numéricos individuais dentro dessa gama, incluindo números inteiros dentro de tais gamas e frações dos valores a não ser que o contexto indique claramente de outro modo.

[0026] A menos que indicado de outro modo, o termo "pelo menos" precedendo uma série de elementos é para ser entendido como se referindo a todos os elementos na série. Os peritos na técnica irão reconhecer, ou ser capazes de determinar usando não mais do que rotina de experimentação, muitos equivalentes das modalidades específicas da invenção descritas no presente documento. Tais equivalentes são destinados a ser englobados pela invenção.

[0027] Conforme usado no presente documento, os termos "compreende", "compreendendo", "inclui", "incluindo", "tem", "tendo", "contém" ou "contendo", ou qualquer outra variação dos mesmos, serão entendidos como significando a inclusão de um inteiro mencionado ou grupo de inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro inteiro ou grupo de inteiros, e pretendem ser não exclusivos ou abertos. Por exemplo, uma composição, uma mistura, um processo, um método, um artigo ou um dispositivo que compreende uma lista de elementos não é necessariamente limitada a apenas esses elementos, mas pode incluir outros elementos não expressamente listados ou inerentes a tal composição, mistura, processo, método, artigo ou dispositivo. Adicionalmente, salvo expressamente mencionado em contrário, "ou"

se refere a um "ou" de inclusão e não a um "ou" de exclusão. Por exemplo, uma condição A ou B é atendida por qualquer um dos seguintes: A é verdadeira (ou está presente) e B é falsa (ou não está presente), A é falsa (ou não está presente) e B é verdadeira (ou está presente), e tanto A como B são verdadeiras (ou estão presentes).

[0028] Conforme usado no presente documento, o termo conjuntivo "e/ou" entre múltiplos elementos recitados é entendido como abrangendo tanto as opções individuais como combinadas. Por exemplo, onde dois elementos são unidos por "e/ou", uma primeira opção se refere à aplicabilidade do primeiro elemento, sem o segundo. Uma segunda opção se refere à aplicabilidade do segundo elemento sem o primeiro. Uma terceira opção se refere à aplicabilidade dos primeiros e segundos elementos em conjunto. Qualquer uma dessas opções é entendida como caindo dentro do significado, e, portanto, satisfaz os requisitos do termo "e/ou" conforme usado no presente documento. Aplicabilidade concorrente de mais do que uma das opções também é entendida como caindo dentro do significado, e, desse modo, satisfaz o requisito do termo "e/ou".

[0029] Conforme usado no presente documento, o termo "consiste em" ou variações tais como "consistem em" ou "consistindo em", conforme usados ao longo da especificação e das reivindicações, indicam a inclusão de qualquer inteiro ou grupo de inteiros mencionado, mas que nenhum inteiro ou grupo de inteiros adicional pode ser adicionado ao método, estrutura ou composição especificado.

[0030] Conforme usado no presente documento, o termo "consiste essencialmente em" ou variações tais como "consistem essencialmente em" ou "consistindo essencialmente em", conforme usados ao longo da especificação e das reivindicações, indica a inclusão de qualquer inteiro ou grupo de inteiros mencionado, e a inclusão opcional de qualquer inteiro ou grupo de inteiros mencionado que não mude de forma material as propriedades básicas ou novas do método, estrutura ou composição especificado. Ver M.P.E.P. § 2111.03.

[0031] Conforme usado neste documento, "indivíduo" significa qualquer animal, preferencialmente um mamífero, o mais preferencialmente um ser humano, que será ou foi vacinado por um método de acordo com uma modalidade da invenção. O termo "mamífero", conforme usado neste documento, abrange qualquer mamífero. Exemplos de mamíferos incluem, mas não se limitam a, vacas, cavalos, ovelhas, porcos, gatos, cães, camundongos, ratos, coelhos, porquinhos-da-índia, macacos, seres humanos, etc., mais preferencialmente um ser humano.

[0032] As palavras "direita", "esquerda", "inferior" e "superior" designam direções nos desenhos aos quais é feita referência.

[0033] Deve ser também entendido que os termos "cerca de", "aproximadamente", "geralmente", "substancialmente" e termos similares, usados no presente documento quando se referindo a uma dimensão ou característica de um componente da invenção preferencial, indicam que a dimensão/característica descrita não é um limite ou parâmetro estrito e não exclui pequenas variações das mesmas que sejam funcionalmente iguais ou similares, conforme seria entendido por uma pessoa de conhecimento comum na técnica. No mínimo, tais referências que incluem um parâmetro numérico incluiriam variações que, usando princípios matemáticos e industriais aceites na técnica (por exemplo, erros de arredondamento, medição ou outros erros sistêmicos, tolerâncias de fabricação, etc.) não variariam o dígito menos significativo.

[0034] Os termos "idêntico" ou porcentagem de "identidade", no contexto de dois ou mais ácidos nucleico ou sequências de polipeptídeos (por exemplo, polipeptídeos de hexon e de fibra e polinucleotídeos que codificam os mesmos), se referem a duas ou mais sequências ou subsequências que são a mesma ou têm uma porcentagem especificada de resíduos aminoácido ou nucleotídeos que são o mesmo, quando comparados e alinhados para máxima correspondência, conforme medido usando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequência ou por inspeção visual.

[0035] Para comparação de sequências, tipicamente uma sequência atua como uma sequência de referência, com a qual as sequências de teste são comparadas. Ao usar um algoritmo de comparação de sequência, as sequências de teste e de referência são inseridas em um computador, as coordenadas de subsequência são designadas, se necessário, e os parâmetros do programa do algoritmo de sequência são designados. A sequência de comparação de algoritmo, em seguida, calcula a porcentagem de sequência de identidade para a(s) sequência(s) de teste em relação à da sequência de referência, com base nos parâmetros do programa designados.

[0036] Alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo., pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pela procura de método de semelhança de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. E.U.A.85:2444 (1988), por implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Pacote de Software da Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por inspeção visual (ver geralmente, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, uma joint venture entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (Suplemento de 1995) (Ausubel)).

[0037] Exemplos de algoritmos que são adequados para a determinação porcentual da sequência de identidade e semelhança de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que estão descritos em Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 e Altschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3.389- 3.402, respectivamente. O software para realizar análises BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information. Esse algoritmo envolve primeiro a identificação de elevada pontuação de pares de sequência (HSPs) por identificação de palavras de comprimento curto W na sequência de consulta, que ou correspondem ou satisfazem alguns limites de pontuação T de valor positivo quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma base de dados de sequência. T é referido como o limite de pontuação da palavra vizinha (Altschul et al, supra). Esses acessos de palavras vizinhas iniciais atuam como pontos para iniciar pesquisas de forma a encontrar HSPs mais longos que as contenham. Esses acessos de palavras são então estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência tão longe como a pontuação de alinhamento cumulativo poder ser aumentada.

[0038] As pontuações acumuladas são calculadas usando, para sequências de nucleotídeos, os parâmetros M (pontuação de recompensa para um par de resíduos correspondentes; sempre > 0) e N (pontuação de penalidade para resíduos incompatíveis; sempre < 0). Para sequências de aminoácidos, uma matriz de pontuação é usada de forma a calcular a pontuação cumulativa. A extensão dos acessos de palavras em cada direção é interrompida quando: a pontuação de alinhamento cumulativa cai fora pela quantidade X desde o seu valor máximo alcançado; a pontuação cumulativa tende para zero, ou abaixo, devido à acumulação de um ou mais alinhamentos de resíduos de pontuação negativa; ou é atingido o fim de qualquer sequência. Os parâmetros W, T, e X do algoritmo BLAST determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M = 5, N =-4 e uma comparação de ambas as cadeias. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrões um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 89:10915 (1989)).

[0039] Em adição ao cálculo da identidade de sequência porcentual, o algoritmo BLAST também executa uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (ver, por exemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. E.U.A. 90:5873-5787 (1993)). Uma medida da similaridade conferida pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), que confere uma indicação da probabilidade pela qual uma correspondência entre dois nucleotídeos ou sequências de aminoácidos iria ocorrer por acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado semelhante a uma sequência de referência se a menor soma de probabilidade em uma comparação do ácido nucleico de teste com o ácido nucleico de referência for menos do que cerca de 0,1, mais preferencialmente menos do que cerca de 0,01, e o mais preferencialmente menos do que cerca de 0,001.

[0040] Uma indicação adicional que duas sequências de ácido nucleico ou polipeptídeos são substancialmente idênticas é que o polipeptídeo codificado pelo primeiro ácido nucleico é imunologicamente cruzado de forma reativa com o polipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucleico, conforme descrito abaixo. Desse modo, um polipeptídeo é tipicamente substancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, onde os dois peptídeos diferem apenas por substituições conservadoras. Outra indicação que duas sequências de ácido nucleico são substancialmente idênticas é que as duas moléculas hibridam uma com a outra sob condições severas, conforme descrito abaixo.

[0041] Conforme usado neste documento, o termo "imunidade protetora" ou "resposta imune protetora" significa que o indivíduo vacinado é capaz de controlar uma infecção com o agente patogênico contra o qual foi efetuada a vacinação. O agente patogênico pode, por exemplo, ser um produto de gene antigênico ou proteína antigênica, ou um seu fragmento. Habitualmente, o indivíduo tendo desenvolvido uma "resposta imune protetora" apenas desenvolve sintomas clínicos ligeiros a moderados ou nem sequer tem sintomas. Habitualmente, um indivíduo tendo uma "resposta imune protetora" ou "imunidade protetora" contra um determinado agente não irá morrer devido a infecção com o referido agente.

[0042] O termo "adjuvante" é definido como uma ou mais substâncias que causam estimulação do sistema imunitário. Nesse contexto, um adjuvante é usado para melhorar uma resposta imune aos vetores adenovirais da invenção.

[0043] Conforme usado no presente documento, o termo "produto de gene antigênico ou seu fragmento" ou "proteína antigênica " pode incluir uma proteína bacteriana, viral, parasitária ou fúngica ou um seu fragmento. Preferencialmente, uma proteína antigênica ou produto de gene antigênico é capaz de gerar em um hospedeiro uma resposta imune protetora, por exemplo, induzir uma resposta imune contra uma doença ou infecção (por exemplo, uma doença ou infecção bacteriana, viral, parasitária ou fúngica), e/ou produção de imunidade (isto é, vacinação) de um indivíduo contra uma doença ou infecção, que protege o indivíduo contra a doença ou infecção.

[0044] Conforme usado no presente documento, o termo "quimérico" significa um gene, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou polipeptídeo que compreende dois ou mais genes, ácidos nucleicos, proteínas, peptídeos ou polipeptídeos que normalmente não estão associados em conjunto. Um gene, ácido nucleico ou proteína

"quimérico(a)" pode ser uma fusão entre duas ou mais sequências não relacionadas (por exemplo, dois ou mais ácidos nucleicos distintos que codificam duas ou mais proteínas diferentes). Um gene, ácido nucleico, ou proteína "quimérico(a)" pode ser uma fusão entre duas ou mais sequências relacionadas (por exemplo, os ácidos nucleicos codificam a mesma proteína, no entanto, os ácidos nucleicos são derivados a partir de um material de fonte diferente, isto é, um ácido nucleico é humano e o outro ácido nucleico é símio). Vetores adenovirais

[0045] A exposição a certos adenovírus resultou em respostas imunes contra certos sorotipos adenovirais, que podem afetar a eficácia dos vetores adenovirais. Uma vez que as infecções por adenovírus humanos são comuns em seres humanos, a prevalência de anticorpos neutralizantes contra adenovírus humanos em populações humanas é elevada. Se pode esperar que a presença de tais anticorpos neutralizantes em indivíduos reduza a eficácia de um vetor de transferência de genes com base em uma estrutura adenoviral humana. Uma maneira de contornar a redução da eficácia é substituir os epitopos nas proteínas do capsídeo adenoviral que são os alvos dos anticorpos neutralizantes. As sequências alvo nas proteínas do capsídeo podem ser substituídas por sequências de proteínas de outros adenovírus (por ex., adenovírus de símio) que são de baixa prevalência e, portanto, contra as quais os anticorpos neutralizantes são raros em populações humanas.

[0046] Uma "proteína do capsídeo" se refere a uma proteína no capsídeo de um adenovírus ou um seu fragmento ou derivado funcional, que está envolvida na determinação do sorotipo e/ou tropismo de um adenovírus particular. As proteínas do capsídeo incluem, tipicamente, as proteínas de fibra, penton e/ou hexon. Em certas modalidades, a proteína do capsídeo é uma proteína do capsídeo inteira ou de comprimento completo do adenovírus. Em outras modalidades, a proteína do capsídeo é um fragmento ou derivado de uma proteína do capsídeo de comprimento completo do adenovírus. Em certas modalidades, o hexon, penton e fibra codificados por um vetor adenoviral da invenção são da mesma ou de estrutura adenoviral diferente.

[0047] Um "polipeptídeo de hexon" se refere a proteínas de revestimento de hexon de adenovírus, seus fragmentos funcionais e derivados.

[0048] Um "polipeptídeo de fibra" se refere a proteínas de fibra de adenovírus, seus fragmentos funcionais e derivados.

[0049] Um alvo de anticorpos neutralizantes contra o adenovírus é a principal proteína de revestimento, a proteína de hexon. Substituindo a proteína de hexon ou as sequências variáveis dentro da proteína de hexon, que definem o sorotipo e se ligam a anticorpos neutralizantes, pela proteína de hexon ou sequências variáveis dentro da proteína de hexon a partir de adenovírus que são raros na população humana pode permitir a construção de vetores de adenovírus que seriam menos suscetíveis à neutralização por anticorpos comumente encontrados em seres humanos.

[0050] Regiões hipervariáveis de hexon (HVRs) são regiões do polipeptídeo de hexon representando a maior variabilidade entre os diferentes sorotipos adenovirais. Em geral, se acredita que essas HVRs correspondam às superfícies expostas a solvente do trímero da proteína de hexon (dentro do contexto da partícula viral intacta) e, de modo relacionado, se espera que sejam determinantes importantes da neutralização do adenovírus mediado por anticorpos (Roberts et al., Nature 441:239-43 (2006)). A substituição das HVRs de hexon de um dado vetor adenoviral por aquelas de um adenovírus com baixa (ou nenhuma) soroprevalência em seres humanos representa, por conseguinte, um meio possível para contornar a imunidade humoral antivetorial preexistente em populações-alvo humanas. Consequentemente, tem havido vários estudos que exploram o conceito de quimerismo de hexon, envolvendo principalmente substituições de sequência de hexon dentro de vetores baseados em HAdV-5 (Roy et al., J Virol. 72:6.875-9 (1998); Gall et al., J Virol. 72:10.260-4 (1998); Youil et al., Hum. Gene Ther. 13:311-20 (2002); Wu et al. J Virol. 76:12.775- 82 (2002); Roy et al., Virology. 333:207-14 (2005); Roberts et al., Nature 441:239-43 (2006); Bradley et al., J Virol. 86:1.267-72 (2012); Yu et al., Biochem Biophys Res Commun. 421:170-6 (2012); Bruder et al, PLoS One. 7(4):e33920 (2012)).

[0051] Um segundo alvo de anticorpos neutralizantes contra adenovírus é a proteína de fibra. Substituindo a proteína de fibra com as sequências de fibra a partir de adenovírus raros de origem não humana, mais preferencialmente substituindo as sequências variáveis dentro da proteína de fibra, também pode permitir a construção de vetores de adenovírus que seriam menos suscetíveis à neutralização por anticorpos comumente encontrados em seres humanos. Uma combinação da substituição de fibra com substituições de hexons acima descritas pode conferir resistência adicional à neutralização por anticorpos comumente presentes em populações humanas.

[0052] A presente divulgação confere vetores adenovirais quiméricos compreendendo transgenes e sequências de ácido nucleico de hexon quimérico. Os vetores adenovirais podem, por exemplo, compreender uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo de hexon compreendendo um polipeptídeo englobando regiões hipervariáveis de hexon compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2. Em certas modalidades a sequência de polipeptídeo de hexon compreende a SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4. O vetor adenoviral pode, por exemplo,

compreender uma ou mais das sequências de ácido nucleico a partir de adenovírus humano 4, adenovírus humano 5, adenovírus humano 26 ou adenovírus humano 35. Em certas modalidades, o vetor adenoviral compreende uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir de SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:6.

[0053] Um "vetor adenoviral" se refere a um vetor recombinante derivado a partir de, ou contendo pelo menos uma porção de, um genoma adenoviral.

[0054] Tipicamente, um vetor adenoviral da invenção compreende o genoma adenoviral recombinante completo em, por exemplo, um vetor de plasmídeo, cosmídeo ou baculovírus. As moléculas de ácido nucleico da invenção podem estar na forma de RNA ou na forma de DNA obtido por clonagem ou produzido sinteticamente. O DNA pode ser de cadeia dupla ou cadeia simples.

[0055] Um perito na técnica irá reconhecer que os elementos obtidos a partir de vários sorotipos podem ser combinados em um único vetor adenoviral, por exemplo, adenovírus humano ou de símio. Desse modo, um vetor de adenovírus quimérico que combina propriedades desejáveis de diferentes sorotipos pode ser produzido. Desse modo, em algumas modalidades, um vetor de adenovírus quimérico da invenção pode combinar a ausência de imunidade preexistente de sequências de polipeptídeo de hexon e/ou de fibra quiméricas com a capacidade de entrega de antígeno e de apresentação de elevado nível de vetores adenovirais existentes, tais como rAd4, rAd5, rAd26 ou rAd35.

[0056] As vantagens dos vetores adenovirais para uso como vacinas incluem a facilidade de manipulação, boa manufaturabilidade a grande escala e um excelente registro de segurança com base em muitos anos de experiência em pesquisa, desenvolvimento, produção e ensaios clínicos com inúmeros vetores adenovirais que foram reportados. Os vetores adenovirais que são utilizados como vacinas proporcionam geralmente uma boa resposta imune à proteína codificada por transgene ou produto de gene antigênico codificado por transgene, incluindo uma resposta imune celular. Um vetor adenoviral de acordo com a invenção pode ser baseado em qualquer tipo de adenovírus e, em certas modalidades, é um adenovírus humano, que pode ser de qualquer grupo ou sorotipo. Em modalidades preferidas, o adenovírus recombinante é baseado em um adenovírus humano do grupo A, B, C, D, E, F ou G. Em outras modalidades preferidas, o adenovírus recombinante é baseado em um sorotipo do adenovírus humano 5, 11, 26, 34, 35, 48, 49 ou 50. Em outras modalidades, é um adenovírus símio, tal como um adenovírus de chimpanzé ou gorila, que pode ser de qualquer sorotipo. Em certas modalidades, o adenovírus recombinante é baseado em um adenovírus de chimpanzé do tipo 1, 3, 7, 8, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,1, 28,1, 29, 30, 31,1, 32, 33, 34, 35,1, 36, 37,2, 39, 40,1, 41,1, 42,1, 43, 44, 45, 46, 48, 49, 50, 67, ou SA7P.

[0057] Em uma modalidade mais preferida, o vetor de adenovírus de chimpanzé da segunda composição é ChAdV3. O sorotipo de adenovírus de chimpanzé recombinante 3 (ChAd3 ou cAd3) é um adenovírus do subgrupo C com propriedades semelhantes às do sorotipo de adenovírus humano 5 (Ad5). O ChAd3 demonstrou ser seguro e imunogênico em estudos em humanos que avaliaram vacinas candidatas para o vírus da hepatite C (HCV) (Barnes E, et al. 2012 Science translational medicine 4: 115ra1). Foi reportado que as vacinas baseadas em ChAd3 eram capazes de induzir uma resposta imune comparável a uma vacina humana vetorizada de Ad5. Ver, por ex., Peruzzi D, et al. 2009 Vaccine 27: 1293-300 e Quinn KM, et al. 2013 J Immunol 190: 2720-35; WO 2005/071093; WO2011/0130627, etc.

[0058] Os vetores adenovirais, os métodos para a sua construção e métodos para a sua propagação, são bem conhecidos na técnica e são descritos em, por exemplo, Pat. dos E.U.A. Nos. 5,559,099, 5,837,511,

5,846,782, 5,851,806, 5,994,106, 5,994,128, 5,965,541, 5,981,225, 6,040,174, 6,020,191 e 6,113,913 e Thomas Shenk, "Adenoviridae and their Replication", M. S. Horwitz, "Adenoviruses", Capítulos 67 e 68, respectivamente, em Virology, B. N. Fields et al., eds., 3ª ed., Raven Press, Ltd., Nova Iorque (1996), e outras referências mencionadas neste documento. Tipicamente, a construção de vetores adenovirais envolve a utilização de técnicas de biologia molecular convencionais, tais como as descritas em, p. ex., Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual,2ª ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1989), Watson et al., Recombinant DNA, 2ª ed., Scientific American Books (1992), e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, Nova Iorque (1995), e outras referências mencionadas no presente documento.

[0059] Em certas modalidades, o vetor adenoviral compreende uma deleção E1 e/ou uma deleção E3. Uma deleção E1 ou E3 pode, por exemplo, incluir uma deleção completa do gene ou uma deleção parcial, o que torna funcionalmente defeituoso o produto do gene E1 ou E3. Desse modo, em certas modalidades, o adenovírus é de replicação deficiente, por exemplo, uma vez que contém uma deleção na região E1 do genoma. Tal como é conhecido pelo perito na técnica, em caso de deleções de regiões essenciais do genoma do adenovírus, as funções codificadas por essas regiões têm de ser fornecidas em trans, de preferência, pela célula produtora, ou seja, quando partes ou a totalidade de regiões E1, E2 e/ou E4 são deletadas do adenovírus, essas têm de estar presentes na célula produtora, por exemplo integradas no seu genoma, ou sob a forma dos chamados adenovírus auxiliares ou plasmídeos auxiliares. O adenovírus também pode ter uma deleção na região E3, que é dispensável para replicação, e, desse modo essa deleção não tem de ser complementada. Uma ou mais das regiões E1, E2, E3 e E4 também podem ser inativadas por outros meios, tais como a inserção de um transgene de interesse (geralmente ligado a um promotor) nas regiões a serem inativadas.

[0060] Uma célula produtora (por vezes também referida na técnica e neste documento como "célula de empacotamento" ou "célula complementar") que pode ser usada pode ser qualquer célula produtora em que um adenovírus desejado pode ser propagado. Por exemplo, a propagação de vetores de adenovírus recombinantes é realizada em células produtoras que complementam deficiências no adenovírus. Tais células produtoras, preferencialmente, têm no seu genoma, pelo menos, uma sequência E1 de adenovírus e, assim, são capazes de complementar adenovírus recombinantes com uma deleção na região E1. Qualquer célula produtora complementar de E1 pode ser usada, tal como as células da retina humana imortalizadas por E1, p.ex., células 911 ou PER.C6 (ver patente dos E.U.A. 5,994,128), amniócitos transformados com E1 (Ver patente EP 1230354), células A549 transformadas com E1 (ver, p.ex., WO 98/39411, patente dos E.U.A. 5,891,690), GH329:HeLa (Gao et al., 2000, Hum Gene Ther 11: 213- 19), 293 e semelhantes. Em certas modalidades, as células produtoras são, por exemplo, células HEK293 ou células PER.C6 ou células 911 ou células IT293SF e semelhantes. A produção de vetores adenovirais em células produtoras é revista em (Kovesdi et al., 2010, Viruses 2: 1681-703).

[0061] Em certas modalidades, o vetor adenoviral é um vetor adenoviral quimérico compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico adenoviral humano. Os ácidos nucleicos adenovirais humano podem, por exemplo, ser selecionados a partir de adenovírus humano 4 (Ad-4), adenovírus humano 5 (Ad-5), adenovírus humano 26 (Ad-26) ou adenovírus humano 35 (Ad-35). Em certas modalidades, um vetor adenoviral deficiente em E1 compreende a sequência codificante E4- orf6 de um adenovírus do Ad5 humano. Isso permite a propagação de tais adenovírus em linhas de células complementares bem conhecidas que expressam os genes E1 de Ad5, tal como, p.ex., células 293 ou células PER.C6 (ver, p.ex., Fallaux et al., 1998, Hum Gene Ther 9: 1909- 17, Havenga et al., 2006, J Gen Virol 87: 2135-43; documento WO 03/104467, incorporado no presente documento na sua totalidade por referência).

[0062] Em certas modalidades, o vetor adenoviral compreende um transgene. Um "transgene" se refere a um ácido nucleico heterólogo, que é um ácido nucleico que não está naturalmente presente no vetor e, de acordo com a presente invenção, o transgene pode codificar um produto de gene antigênico ou proteína antigênica que provoca uma resposta imune no indivíduo. O transgene pode, por exemplo, ser introduzido no vetor por técnicas convencionais de biologia molecular. O transgene pode, por exemplo, ser clonado em uma região E1 ou E3 deletada de um vetor adenoviral, ou na região entre a região E4 e o rITR. Um transgene está, geralmente, operacionalmente ligado a sequências de controle da expressão. Em modalidades preferidas, o transgene é inserido em um local de inserção de transgene.

[0063] Se necessário, as sequências de ácido nucleico de hexon ou de fibra de acordo com as modalidades da invenção e/ou o transgene podem ser otimizadas por códon de modo a assegurar a expressão adequada no hospedeiro tratado (por exemplo, ser humano). A otimização por códon é uma tecnologia amplamente aplicada na técnica.

[0064] O transgene pode estar sob o controle de (isto é, operacionalmente ligado a) um promotor derivado de adenovírus (por exemplo, o Major Late Promotor) ou pode estar sob o controle de um promotor heterólogo. Exemplos de promotores heterólogos adequados incluem o promotor CMV e o promotor RSV. Preferencialmente, o promotor está localizado a montante do gene heterólogo de interesse dentro de uma cassete de expressão.

[0065] Em modalidades preferidas, o vetor adenoviral compreende uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir de SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:6. Composições imunogênicas

[0066] As composições imunogênicas são composições compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz de vetores adenovirais humanos purificados ou parcialmente purificados para uso na invenção. As composições referidas podem ser formuladas como uma vacina (também referidas como uma "composição imunogênica") de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Tais composições podem incluir adjuvantes no sentido de realçar as respostas imunes. As proporções ótimas de cada componente na formulação podem ser determinadas por técnicas bem conhecidas pelos peritos na técnica em vista da presente divulgação.

[0067] As composições imunogênicas de acordo com modalidades da presente invenção podem ser feitas usando métodos conhecidos pelos peritos na técnica tendo em vista a presente divulgação. As composições farmacêuticas líquidas geralmente incluem um veículo líquido, tal como água, petróleo, óleos animais ou vegetais, óleo mineral ou óleo sintético. Solução salina fisiológica, dextrose ou outra solução sacarídica ou glicóis, tal como etilenoglicol, propilenoglicol ou polietilenoglicol podem ser incluídas.

[0068] As composições imunogênicas úteis na invenção podem compreender adjuvantes. Os adjuvantes adequados para a coadministração em conformidade com a invenção devem ser aqueles que são potencialmente seguros, bem tolerado e eficazes em pessoas incluindo QS-21, Detox-PC, MPL-SE, MoGM-CSF, TiterMax-G, CRL- 1005, GERBU, TERamida, PSC97B, Adjumer, PG-026, GSK-I, AS01, AS03, AS04, AS15, GcMAF, B-aletina, MPC-026, Adjuvax, CpG ODN,

Betafectina, Alum, e MF59.

[0069] Outros adjuvantes que podem ser administrados incluem lectinas, fatores de crescimento, citocinas e linfocinas, tais como alfa- interferon, gama interferon, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator estimulante de colônias de granulócitos (g-CSF), fator estimulante de colônias de macrófagos de granulócitos (gMCSF), fator de necrose tumoral (TNF), fator de crescimento epidérmico (EGF), IL-I, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, e IL-12 ou codificando os seus ácidos nucleicos.

[0070] As composições da invenção podem compreender um excipiente, veículo, tampão, estabilizante ou outros materiais farmaceuticamente aceitáveis, bem conhecidos pelos peritos na técnica. Tais materiais devem ser não tóxicos e não devem interferir com a eficácia do ingrediente ativo. A natureza precisa do veículo ou outro material pode depender da via de administração, por exemplo, via intramuscular, subcutânea, oral, intravenosa, cutânea, intramucosa (por exemplo, intestinal), intranasal ou intraperitoneal. Método para Indução de Imunidade Protetora

[0071] Outro aspecto geral da invenção se refere a um método de indução de uma resposta imune em um indivíduo com necessidade da mesma. Os métodos podem, por exemplo, compreender a administração ao indivíduo de uma vacina compreendendo um vetor adenoviral descrito no presente documento e um veículo farmaceuticamente aceitável. No presente documento também são conferidos métodos de produção de uma vacina. Os métodos compreendem a combinação de um vetor adenoviral descrito no presente documento com um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0072] Qualquer uma das composições imunogênicas de acordo com as modalidades da invenção, incluindo, mas não se limitando, às descritas no presente documento, pode ser usada nos métodos da invenção como uma vacina.

[0073] A administração das composições imunogênicas/vacinas compreendendo os vetores é tipicamente por via intramuscular ou subcutânea. No entanto outros modos de administração, tais como injeção intravenosa, cutânea, intradérmica ou nasal também podem ser previstos. Pode ser obtida administração intramuscular das composições imunogênicas usando uma agulha para injetar uma suspensão do vetor de adenovírus. Uma alternativa consiste no uso de um dispositivo de injeção sem agulha para administrar a composição (usando, por exemplo, BiojetorTM) ou um pó liofilizado contendo a vacina.

[0074] Para injeção intravenosa, cutânea ou subcutânea, ou injeção no local de aflição, o vetor vai ser na forma de uma solução aquosa parentericamente aceitável que é isenta de pirogênios e tem pH, isotonicidade e estabilidade adequados. Os peritos na técnica são bem capazes de preparar soluções adequadas usando, por exemplo, veículos isotônicos, tais como Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de Ringer Lactato. Conservantes, estabilizadores, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos podem ser incluídos, conforme necessário. Uma formulação de liberação lenta também pode ser utilizada.

[0075] Tipicamente, a administração irá ter um objetivo profilático de gerar uma resposta imune contra um antígeno de interesse (por exemplo, um agente patogênico bacteriano, viral, parasitário e/ou fúngico) antes da infecção ou do desenvolvimento de sintomas. As doenças e distúrbios que podem ser tratados ou prevenidos de acordo com a invenção incluem aqueles em que uma resposta imune pode desempenhar um papel protetor ou terapêutico. Em outras modalidades, os vetores de adenovírus podem ser administrados para profilaxia pós-exposição.

[0076] As composições imunogênicas contendo os vetores humanos de adenovírus são administrados a um indivíduo, dando origem a uma resposta imune ao antígeno de interesse no indivíduo. Uma quantidade de uma composição suficiente para induzir uma resposta imune detectável é definida como sendo uma "dose imunologicamente eficaz" ou uma "quantidade eficaz" da composição. As composições imunogênicas da invenção podem induzir uma resposta imune humoral bem como uma mediada por células. Em uma modalidade típica a resposta imune é uma resposta imune de proteção.

[0077] A quantidade real administrada, e a taxa e tempo de curso de administração, vai depender da natureza e gravidade do que está a ser tratado. Prescrição de tratamento, por exemplo, decisões sobre a dosagem etc., está dentro da responsabilidade dos praticantes gerais e de outros médicos, ou em um contexto veterinário de um veterinário, e tipicamente tem em conta o distúrbio a ser tratado, a condição do indivíduo doente, o local de administração, o método de administração e outros fatores conhecidos pelos profissionais. Exemplos das técnicas e protocolos acima mencionados podem ser encontrados em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16ª edição, Osol, A. ed., 1980.

[0078] Após a produção de vetores de adenovírus e a formulação opcional de tais partículas em composições, os vetores podem ser administrados a um indivíduo, particularmente ser humano ou outro primata. A administração pode ser em seres humanos ou em outro mamífero, por exemplo, camundongo, rato, hamster, porquinho-da- índia, coelho, ovelha, cabra, porco, cavalo, vaca, burro, macaco, cão ou gato. A administração a um mamífero não humano não necessita de ser para uma finalidade terapêutica, mas pode ser para uso em um contexto experimental, por exemplo, na investigação de mecanismos de respostas imunes para os vetores de adenovírus.

[0079] Em um regime exemplar, o vetor adenoviral é administrado

(por exemplo, por via intramuscular) em um volume variando entre cerca de 100 µL a cerca de 10 mL, contendo concentrações de cerca de 104 a 1012 partículas de vírus/mL. Preferencialmente, o vetor adenoviral é administrado em um volume variando entre 0,1 e 2,0 mL. Por exemplo, o vetor adenoviral pode ser administrado com 100 µL, 500 µL, 1 mL, 2 mL. Mais preferencialmente, o vetor adenoviral é administrado em um volume de 0,5 mL. Opcionalmente, o vetor adenoviral pode ser administrado em uma concentração de cerca de 107 vp/mL, 108 vp/mL, 109 vp/mL, 1010 vp/mL, 5x1010 vp/mL, 1011 vp/mL, ou 1012 vp/mL. Tipicamente, o vetor adenoviral é administrado em uma quantidade de cerca de 109 a cerca de 1012 partículas virais (vp) a um ser humano durante uma administração, mais tipicamente em uma quantidade de cerca de 1010 a cerca de 1012 vp. A vacinação inicial é seguida por um reforço, conforme descrito acima.

[0080] A vacinação inicial pode ser seguida por um reforço ou um estímulo de uma vacina/composição compreendendo o mesmo vetor adenoviral codificando um antígeno de interesse ou uma vacina/composição compreendendo um vetor adenoviral diferente codificando o mesmo antígeno de interesse.

[0081] A composição pode, se desejado, ser apresentada em um kit, embalagem ou dispensador, que pode conter uma ou mais formas de dosagem unitárias contendo o ingrediente ativo. O kit, por exemplo, pode compreender folha de metal ou de plástico, tal como um pacote de blíster. O kit, embalagem ou dispensador pode ser acompanhado de instruções para administração.

[0082] As composições da invenção podem ser administradas sozinhas ou em combinação com outros tratamentos, quer simultaneamente ou sequencialmente dependentes da condição a ser tratada.

MODALIDADES

[0083] A Modalidade 1 é um vetor adenoviral compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo de hexon compreendendo um polipeptídeo englobando regiões hipervariáveis de hexon compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2.

[0084] A Modalidade 2 é o vetor adenoviral da modalidade 1, em que a sequência de polipeptídeo de hexon compreende a SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4.

[0085] A Modalidade 3 é o vetor adenoviral da modalidade 1 ou 2, em que o vetor adenoviral adicionalmente compreende uma deleção E1.

[0086] A Modalidade 4 é o vetor adenoviral de qualquer uma das modalidades 1-3, em que o vetor adenoviral adicionalmente compreende uma deleção E3.

[0087] A Modalidade 5 é o vetor adenoviral de qualquer uma das modalidades 1-4, em que o vetor adenoviral adicionalmente compreende um adenovírus humano 5 (HAdv-5) E4 orf6.

[0088] A Modalidade 6 é o vetor adenoviral de qualquer uma das modalidades 1-5, em que o vetor adenoviral compreende uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6.

[0089] A Modalidade 7 é o vetor adenoviral de qualquer uma das modalidades 1-6, em que o vetor adenoviral adicionalmente compreende pelo menos um transgene.

[0090] A Modalidade 8 é o vetor adenoviral de qualquer uma das modalidades 1-7, em que o transgene está localizado na deleção E1, na deleção E3, e/ou adjacente a uma repetição terminal invertida (rITR).

[0091] A Modalidade 9 é o vetor adenoviral de qualquer uma das modalidades 1-8, em que o vetor adenoviral compreende uma ou mais sequências de ácido nucleico a partir de adenovírus humano 26 (Ad26).

[0092] A Modalidade 10 é uma célula recombinante compreendendo o vetor adenoviral de qualquer uma das modalidades 1-9.

[0093] A Modalidade 11 é um método para produzir um vetor adenoviral, compreendendo: (a) o crescimento das células recombinantes na modalidade 10 sob condições para a produção do vetor adenoviral; e (b) isolamento do vetor adenoviral a partir da célula recombinante.

[0094] A Modalidade 12 é uma composição imunogênica compreendendo o vetor adenoviral, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-9 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0095] A Modalidade 13 é um método para induzir uma resposta imune em um indivíduo com necessidade da mesma, o método compreendendo a administração ao indivíduo da composição imunogênicas da modalidade 12.

[0096] A Modalidade 14 é um método de produção de uma composição imunogênica, o método compreendendo a combinação de um vetor adenoviral, de acordo com qualquer uma das modalidades 1- 9, com um veículo farmaceuticamente aceitável.

EXEMPLOS Exemplo 1: Concepção de vetores adenovirais hexon-quiméricos Ad26HVRPtr1, Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13.

[0097] Descritos neste exemplo são as concepções de Ad26HVRPtr1, Ad26HVRPtr12, e Ad26HVRPtr13, que são novos vetores baseados em HAdV-26 que portam determinadas substituições de sequência de hexon obtidas a partir de adenovírus de chimpanzés. Esses vetores adenovirais hexon-quiméricos foram concebidos com o objetivo de gerar possíveis novos vetores baseados em adenovírus (vacina) que são manufaturáveis, sorologicamente distintos do HAdV- 26 e contra os quais existe baixa (ou nenhuma) imunidade preexistente em populações humanas.

[0098] Ad26HVRPtr1, Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13, compreendendo sequências de genoma de vetor adenoviral SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, e SEQ ID NO:6, respectivamente, foram concebidos como versões hexon-quiméricas do vetor HAdV-26 recombinante descrito anteriormente (WO2007104792 A2; Abbink et al., 2007). Portanto, esses vetores foram concebidos para portar a mesma deleção E1, deleção E3 e substituição de E4 orf6 (pela de HAdV-5) conforme anteriormente especificado (WO2007104792 A2; Abbink et al., 2007).

[0099] Variantes específicos dos vetores hexon-quiméricos gerados e analisados no presente documento, conforme descrito nos exemplos seguintes, são Ad26HVRPtr1.Fluc, Ad26HVRPtr12.Fluc, Ad26HVRPtr13.Fluc, Ad26HVRPtr12.RSVF-2A-GLuc e Ad26HVRPtr13.RSVF-2A-GLuc, que compreendem sequências genômicas virais SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 e SEQ ID NO:11, respectivamente. Conforme indicado nos seus nomes de vetor, esses vetores foram gerados de modo a portar, no local de sua deleção E1, um cassete de expressão acionados por promotor de CMV codificando tanto a luciferase de vaga-lume (FLuc) como a proteína quimérica ""RSV-FA2-2A-GLuc" (RSVF-2A-GLuc), que é uma fusão da glicoproteína de fusão da estirpe A2 do vírus sincicial respiratório (RSV-F2A), um peptídeo do vírus da febre aftosa 2A e Gaussia luciferase (GLuc). Tanto os cassetes de expressão FLuc e RSVF-2A-GLuc são acionados por um promotor de CMV e portam um sinal de poliadenilação SV40. O cassete para RSVF-2A-GLuc adicionalmente contém dentro da sua região não traduzida 5 ' uma sequência compreendendo o íntron 2 do gene da apolipoproteína A1 (ApoA1) humana.

[00100] Os vetores adenovirais Ad26HVRPtr1, Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13 (compreendendo SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, e SEQ

ID NO:6, (SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6, respectivamente) foram concebidos como hexon-quiméricos no sentido de que certos segmentos de genes de hexon dentro de seus genomas baseados em HAdV-26 foram substituídos pelos segmentos de genes hexon correspondentes de outros adenovírus. Os vírus que serviram de doadores de sequência de hexon para Ad26HVRPtr1, Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13 foram, respectivamente, PtroAdV-1, PtroAdV-12, e PtroAdV-13. Esses vírus foram identificados em amostras fecais de chimpanzés selvagens e foram alocados às espécies E de adenovírus humanos (HAdV-E) (Wevers et al., J. Virol. 85(20):10.774-84 (2011)). As sequências parciais do gene de hexon desses vírus foram conferidas publicamente sob os números de acesso do GenBank JN163971, JN163982 e JN163983, respectivamente. Considerando que o vetor aceitador para as sequências de hexon é baseado em HAdV-26, ou seja, um membro das espécies D de adenovírus humano (HAdV-D), enquanto os três vírus doadores de sequências de hexon pertencem ao HAdV-E, os vetores criados no presente documento representam vetores hexon-quiméricos de espécies de adenovírus cruzadas.

[00101] Os segmentos de genes de hexon HAdV-26 que foram substituídos no presente documento de modo a gerar vetores hexon- quiméricos Ad26HVRPtr1, Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13 (e os seus derivados construídos no presente documento contendo cassetes de expressão de transgene) corresponderam aos nucleotídeos 18.178 a

18.357, 18.379 a 18.438, 18.556 a 18.633, 18.685 a 18.723 e 19.027 a

19.158 do genoma completo de tipo selvagem de HAdV-26 depositado sob o número de acesso do Genbank EF153474 (versão 1). Esses cinco segmentos de genes de hexon HAdV-26, e os seus respectivos segmentos de substituição derivados a partir de PtroAdV-1, PtroAdV- 12, ou PtroAdV-13, corresponderam, em grande parte, mas não totalmente, às sequências codificando as regiões hipervariáveis

(HVRs). Isso é mostrado na Figura 1A onde as localizações dos cinco segmentos, bem como aqueles das HVRs anteriormente atribuídas são indicadas dentro de uma representação esquemática do gene de hexon HAdV-26. Além disso, com maior detalhe do que é ilustrado por um alinhamento de aminoácidos efetuado com sequências polipeptídicas do hexon (parcial) de HAdV-26, PtroAdV-1, PtroAdV-12, e PtroAdV-13, em que os segmentos específicos que foram trocados no presente documento são especificamente destacados ao lado das HVRs anteriormente atribuídas (Figura 1B).

[00102] De nota, os cinco segmentos de genes de hexon de HAdV- 26 que foram substituídos no presente documento de forma a gerar Ad26HVRPtr1, Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13 não correspondem inteiramente com as sequências compreendendo hexon HVRs que foram substituídas em relatórios anteriores que descrevem vetores hexon-quiméricos, baseados em HAdV-5 (Roberts et al., Nature 441:239-43 (2006); Bradley et al., J Virol. 86:1.267-72 (2012); Yu et al., Biochem Biophys Res Commun. 421:170-6 (2012); Bruder et al, PLoS One. 7(4):e33920 (2012)). Por exemplo, conforme ilustrado nas Figuras 1A e 1B, os cinco segmentos de gene de hexon falharam em corresponder com os sete trechos de aminoácidos previamente trocados de forma a gerar Ad5HVR48 (1-7), um vetor hexon-quimérico baseado em HAdV-5 e compreendendo HVRs de hexon de HAdV-48 (Roberts et al., Nature 441: 239-43 (2006)).

[00103] As sequências de nucleotídeos de gene de hexon-quimérico completos de vetores adenovirais Ad26HVRPtr1, Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13 são estabelecidas nas SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, e SEQ ID NO:15, respectivamente. As sequências de polipeptídeo de hexon-quimérico completos desses vetores são estabelecidas nas SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:3, e SEQ ID NO:4, respectivamente. Exemplo 2: Construção molecular de plasmídeos que portam os genomas de vetores adenovirais completos de Ad26HVRPtr1.Fluc, Ad26HVRPtr12.Fluc e Ad26HVRPtr13.Fluc

[00104] Os plasmídeos contendo o genoma de vetor Ad26HVRPtr1, Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13 portando um cassete de expressão Fluc acionado pelo promotor de CMV na região E1 adenoviral foram construídos usando os mesmos métodos e estratégia, conforme descrito anteriormente para a geração do vetor hexon-quimérico, codificador de Fluc "Ad26.HVR5C" (Ma et al., J. Canc. Res. Clin. Oncol. 141(3):419-29 (2015), figura 4 suplementarmente). Resumidamente, as alterações desejadas no gene hexon foram primeiro introduzidas no contexto do plasmídeo intermediário "de porte de hexon" pHex26- Shuttle.BamHI. Isso foi feito por procedimentos padrão de síntese e subclonagem de genes (realizados por GeneArt (LifeTechnologies, Carlsbad, CA)) e resultou em plasmídeos de porte de hexons modificados, portando as sequências de gene de hexon-quimérico acima mencionadas estabelecidas na SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 e SEQ ID NO:15. Em seguida, por recombinação homóloga em E.coli BJ5183 (Stratagene/Agilent Technologies, Santa Clara, CA), os genes hexon-quiméricos foram portados desde os plasmídeos de porte de hexon para o pAd26.luc.dH, um plasmídeo que porta, entre dois locais de restrição PacI, um genoma de vetor HAdV-26 recombinante deletado quanto a gene hexon equipado no local de sua deleção E1 com um cassete de expressão codificando Fluc acionado por promotor de CMV. Os procedimentos de clonagem molecular acima resultaram na geração dos plasmídeos pAd26.HVRPtr1.luc (SEQ ID NO:20), pAd26.HVRPtr12.luc (SEQ ID NO:21; Figura 2A), e pAd26.HVRPtr13.luc (SEQ ID NO:22; Figura 2B).

[00105] Três comparadores comparativos de plasmídeos de vetor adenoviral hexon-quimérico também foram construídos exatamente da mesma maneira conforme descrito acima. Nesses plasmídeos,

denominados pAd26.HVR5.luc (SEQ ID NO:17), pAd26.HVR35.luc (SEQ ID NO:18), e pAd26.HVR52.luc (SEQ ID NO:19), o conjunto acima mencionado de cinco segmentos de gene de hexon HAdV-26 foram substituídos pelos conjuntos correspondentes de segmentos de HAdV- 5, HAdV-35 e HAdV-52, respectivamente. Esses plasmídeos compreendem as sequências nucleotídicas de gene hexon-quimérico apresentadas nas SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO:25, respectivamente. Esses genes de hexon codificam as sequências polipeptídicas de hexon-quiméricas apresentadas nas SEQ ID NO:26, SEQID NO:27 e SEQ ID NO:28, respectivamente. Exemplo 3: Avaliação inicial da viabilidade, eficiência de crescimento e produtividade dos vetores adenovirais Ad26HVRPtr1.Fluc, Ad26HVRPtr12.Fluc e Ad26HVRPtr13.Fluc

[00106] Estudos anteriores demonstraram que vetores adenovirais quiméricos compreendendo trocas de sequências de hexon de espécies de adenovírus cruzadas muitas vezes não são viáveis ou podem apresentar uma cinética de crescimento retardada e dão rendimentos inferiores (Youil et al, Hum.. Gene Ther. 13:311-20 (2002); Wu et al. J Virol. 76:12.775-82 (2002); Bradley et al., J Virol. 86:1267-72 (2012); Bruder et al., PLoS One. 7(4):e33920 (2012)). Novos vetores adenovirais hexon-quiméricos (vacina) devem, portanto, ser testados quanto às propriedades básicas de crescimento, rendimentos de produção e qualidade de partículas.

[00107] Os vetores adenovirais hexon-quiméricos concebidos e construídos no presente documento foram avaliados quanto à viabilidade, eficiência de crescimento, produtividade e infecciosidade de partículas, comparando-os com o seu vetor baseado em HAdV-26 parental. Para esse fim, os vetores adenovirais Ad26HVRPtr1.Fluc, Ad26HVRPtr12.Fluc e Ad26HVRPtr13.Fluc, bem como os vetores comparadores Ad26HVR5.Fluc, Ad26HVR35.Fluc e Ad26HVR52.Flucc foram gerados por transfeção, de acordo com os procedimentos padrão usando reagente de transfeção Lipofectamina (Invitrogen; Carlsbad, CA), dos correspondentes plasmídeos do genoma do vetor Ad descritos no Exemplo 2 (isto é, pAd26.HVRPtr1.luc, pAd26.HVRPtr12.luc, pAd26.HVRPtr13.luc, pAd26.HVR5, pAd26.HVR35, e pAd26.HVR52, respectivamente) em células PER.55K que complementam E1 (Vogels et al., J.

Virol. 77: 8.263-71 (2003)) cultivadas em balões T25. Antes das transfeções, os plasmídeos do genoma do vetor Ad foram digeridos com PacI no sentido de liberar os respectivos genomas do vetor adenoviral do plasmídeo.

As culturas celulares transfetadas foram monitoradas diariamente de forma a registrar o dia do início da formação da primeira placa viral, bem como o dia em que o efeito citopático total (CPE) foi atingido (Tabela 1). No CPE completo, as células e o meio infectados foram coletados e o vírus foi liberado por três ciclos de congelação e descongelação.

Após a colheita das transfeções de resgate virais, os vírus foram adicionalmente amplificados por várias rondas sucessivas de infecção nas culturas de células de complemento de E1. Os vírus foram purificados a partir de colheitas virais em bruto (por um procedimento de ultracentrifugação em gradiente de densidade de cloreto de césio (CsCl) em dois passos) e as partículas virais (VP) e os títulos de unidade infecciosa (IU/mL) foram determinados posteriormente, todos por métodos padrão anteriormente descritos (Alba R, Baker AH, Nicklin SA.

Vector systems for prenatal gene therapy: principles of adenovírus design and production.

Methods Mol Biol 2012; 891:55-84.:55-84). Tabela 1: Eficiências de resgate, rendimentos finais de produção, e proporções VP/I observados para vetores adenovirais hexon- quiméricos.

Caracterização de lote Eficiência do resgate de vírus Espécies purificado HAdV do Vetor 1a placa Rendimento doador Placas CPE viral Total em 25 Proporção HVR virais Total (dias frascos VP-para-IU formadas (dias p.t.) p.t.) T150 (VP) Ad26.FLuc n.a. Sim 3-5 7-8 1,10 X 1013 337 Ad26HVR5.FLuc C Sim 5 11 1,05 X 1011 4.000 Ad26HVR35.FLuc B Sim 5 12 1,75 X 1012 829 Ad26HVR52.FLuc G Não - - - - Ad26HVRPtr1.FLuc E Sim 3 9 3,78 X 1011 1029 12 Ad26HVRPtr12.FLuc E Sim 4 8 2,16 X 10 272 Ad26HVRPtr13.FLuc E Sim 3 7 1,07 X 1013 150 n.a., não aplicável; p.t., após a transfeção

[00108] Dos seis vetores quiméricos testados, apenas Ad26HVRPtr12.Fluc e Ad26HVRPtr13.Fluc deram resultados indicando que suas modificações no capsídeo não comprometeram a produtividade e a infetividade do vetor (Tabela 1). O resgate viral e as eficiências de crescimento desses dois vetores, conforme refletidas pelo tempo de início da formação da placa e pelo tempo necessário para atingir o CPE completo (após a transfeção do DNA viral nas células que complementam a E1), estavam na gama daquelas vistas para o vetor Ad26.Fluc parental. Esse não foi o caso dos outros vetores quiméricos testados, exceto para Ad26HVRPtr1.Fluc. Além disso, de todos os vetores testados, Ad26HVRPtr12.Fluc e Ad26HVRPtr13.Fluc deram os maiores rendimentos de partículas virais (VP) após produção e purificação em larga escala. Finalmente, enquanto os outros vetores quiméricos apresentaram todos proporções de VP:IU mais elevadas do que a de Ad26.Fluc parental, se verificou que Ad26HVRPtr12.Fluc e Ad26HVRPtr13.Flu têm proporções de VP:IU não afetadas.

[00109] Os quatro outros vetores quiméricos, isto é, Ad26HVR5.Fluc,

Ad26HVR35.Fluc, Ad26HVR52.Fluc e Ad26HVRPtr1.Fluc, mostraram vários graus de produtividade e/ou infecciosidade comprometida. Ad26HVR52.Fluc não era viável (isto é, não se conseguiu detectar qualquer placa viral após a transfeção do DNA viral), enquanto os outros três vetores foram resgatados com sucesso. Desses três, Ad26HVR5.Fluc e Ad26HVR35.Fluc exibiram claramente uma cinética de resgate e de crescimento retardada, enquanto Ad26HVRPtr1.Fluc pareceu resgatar e crescer com cerca da mesma eficiência do vetor parental. A caracterização dos lotes de vetor purificado revelou que os rendimentos de partículas virais físicas foram especialmente influenciados por AAd26HVR5.Fluc e Ad26HVRPtr1.Fluc, enquanto que a infecciosidade das partículas apareceu fortemente comprometida para todos os três (conforme indicado pelas maiores proporções de VP:IU vistas para esses vetores).

[00110] Em conclusão, Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13, que são vetores hexon-quiméricos compreendendo trocas de sequência hexon de espécies de adenovírus cruzado, exibiram boas propriedades de crescimento e de produção e são, portanto, considerados candidatos promissores para servirem como novos vetores de vacina (do ponto de vista da manufaturabilidade). Quatro outros vetores hexon-quiméricos, que foram gerados usando a mesma concepção de hexon-quiméricos mas usando outros adenovírus como doador de sequência de hexon, mostraram propriedades menos favoráveis. Exemplo 4: Geração de vetores adenovirais Ad26HVRPtr12.Fluc e Ad26HVRPtr13.Fluc

[00111] Esse exemplo descreve a geração dos vetores adenovirais hexon-quiméricos, codificando Fluc, usados nas experiências de imunogenicidade, soroprevalência, neutralização cruzada e capacidade de manufaturabilidade descritas nos Exemplos 6, 8 e 9.

[00112] Os vetores adenovirais Ad26HVRPtr12.Fluc (também designado Ad26C4NVT005) e Ad26HVRPtr13.Fluc (também designado Ad26C3NVT005), que compreendem respectivamente as sequências genômicas do vetor adenoviral SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO:9, foram gerados por transfeção dos plasmídeos do genoma do vetor Ad correspondentes (isto é, pAd26.HVRPtr12.luc e pAd26.HVRPtr13.luc, respectivamente) em células PER.C6 que complementam E1. Antes da transfeção em células PER.C6 que foram cultivadas como culturas celulares aderentes em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS) e MgCl 2 a 10 mM, os plasmídeos do genomas do vetor Ad foram digeridos com PacI de forma a liberar os respectivos genomas do vetor adenoviral do plasmídeo. As transfeções foram realizadas de acordo com procedimentos padrão usando o reagente de transfeção Lipofectamine (Invitrogen; Carlsbad, CA). Após a colheita das transfeções de resgate virais, os vírus foram adicionalmente amplificados por várias rondas sucessivas de infecção em culturas de células PER.C6. Os vírus foram purificados a partir de colheitas virais em bruto usando um procedimento de ultracentrifugação em gradiente de densidade de cloreto de césio (CsCl) em dois passos, conforme descrito anteriormente (Havenga et al., "Novel replication-incompetent adenoviral B-group vectors: high vector stability and yield in PER.C6 cells," J. Gen. Virol. 87(8):2135-43 (2006)). Os títulos das partículas virais (VP) foram medidos por um procedimento baseado em espectrofotometria descrito anteriormente (Maizel et al., "The polypeptides of adenovírus: I. Evidence for multiple protein components in the virion and a comparison of types 2, 7A, and 12," Virology, 36(1):115-25 (1968)). Exemplo 5: Geração de vetores adenovirais Ad26HVRPtr12.RSVF- 2A-GLuc e Ad26HVRPtr13.RSVF-2A-GLuc

[00113] Esse exemplo descreve a geração dos vetores adenovirais hexon-quiméricos, codificando RSVF-2A-GLuc, usados nas experiências de imunogenicidade descritas no Exemplo 7.

[00114] A geração de vetores adenovirais Ad26HVRPtr12.RSVF-2A- GLuc (também designado Ad26C4NVT001) e Ad26HVRPtr13.RSVF- 2A-Gluc (também designado Ad26C3NVT001) que compreendem, respectivamente, sequências de genoma de vetores adenovirais SEQ ID NO:10 e SEQ ID NO:11, envolveu o uso dos plasmídeos acima mencionados pAd26.HVRPtr12.luc (SEQ ID NO:21; Figura 2A) e pAd26.HVRPtr13.luc (SEQ ID NO:22; Figura 2b), respectivamente, bem como o plasmídeo pAdApt26.ApoAI.RSVF-2A-GLuc (SEQ ID NO:29; Figura 3).

[00115] O pAdApt26.ApoAI.RSVF-2A-GLuc é um plasmídeo abrigando um fragmento de genoma da extremidade esquerda do vetor baseado em HAdV-26 deletado em E1 descrito anteriormente (WO2007104792 A2; Abbink et al., 2007) que adicionalmente contém, no local da deleção de E1 adenoviral, o anteriormente referido cassete de expressão de transgene codificando "RSV-FA2-2A-GLuc" (RSVF-2A- GLuc). O pAdApt26.ApoAI.RSVF-2A-GLuc foi construído por vários passos padrão de síntese de gene e de clonagem molecular que, em conjunto, contribuem para a criação do referido cassete RSVF-2A-GLuc e a sua inserção em pAdApt26, um plasmídeo anteriormente descrito abrigando o referido fragmento do genoma do vetor Ad da extremidade esquerda (WO2007104792 A2; Abbink et al., 2007).

[00116] Os vetores adenovirais Ad26HVRPtr12.RSVF-2A-GLuc e Ad26HVRPtr13.RSVF-2A-GLuc foram gerados como se segue. Os plasmídeos pAd26.HVRPtr12.luc e pAd26.HVRPtr13.luc foram digeridos por enzimas de restrição PacI e PsiI, a fim de liberar a partir desses plasmídeos um certo fragmento de genoma de vetor adenoviral de 28 kb, deletado na extremidade esquerda, compreendendo a sequência hexon-quimérica. Os respectivos produtos de digestão resultantes foram, cada um, separadamente cotransfetados com pAdApt26.ApoAI.RSVF-2A-GLuc digerido por PacI PER.C6 complementando E1 de modo a permitir o resgate dos respectivos vírus hexon-quiméricos, codificando RSVF-2A-Gluc através de recombinação homóloga entre fragmentos de restrição de genoma de vetor sobrepostos, conforme ilustrado na Figura 4. Nessa estratégia, a recombinação homóloga ocorre em uma região de 2,7 kb da região de sobreposição entre um fragmento de restrição PacI-PacI de 6,7 kb de pAdApt26.ApoAI.RSVF-2A-GLuc (Figura 4, parte superior) e um fragmento de restrição PsiI-PacI de 28 kb de pAd26.HVRPtr12.luc ou pAd26.HVRPtr13.luc (Figura 4, parte inferior). As transfeções foram realizadas de acordo com procedimentos padrão usando o reagente de transfeção Lipofectamine (Invitrogen; Carlsbad, CA). As placas únicas isoladas dos dois vírus resgatados, Ad26HVRPtr12.RSVF-2A-GLuc e Ad26HVRPtr13.RSVF-2A-Gluc, foram adicionalmente propagadas em células PER.C6 e subsequentemente purificadas e tituladas conforme descrito no presente documento para os vetores Ad26HVRPtr12.FLuc e Ad26HVRPtr13.Fluc no Exemplo 4). Respostas imunes celulares e humorais induzidas pelo novo vetor adenoviral

[00117] Os exemplos 6 e 7 descrevem experiências realizadas para avaliar a imunogenicidade dos novos vetores Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13 aí gerados. Nessas experiências, os novos vetores foram avaliados quanto à sua capacidade de induzir respostas imunes humorais e celulares contra antígenos (modelo) codificados por vetores em camundongos após imunização intramuscular. Os vetores foram testados usando dois antígenos diferentes: Luciferase de vaga-lume (FLuc) e RSV-FA2-2A-GLuc (RSVF-2A-GLuc). RSVF-2A-GLuc é uma proteína quimérica composta pela glicoproteína de fusão A2 da estirpe do vírus sincicial respiratório, um peptídeo 2A do vírus da febre aftosa e Gaussia luciferase (GLuc). Cada vetor foi comparado lado a lado com um vetor de referência com base em adenovírus humano de tipo 26 (HAdV-26, também referido no presente documento como Ad26) portando o mesmo cassete de transgene codificando o antígeno. As respostas imunes contra os antígenos respectivos foram medidas utilizando ensaios imunológicos bem conhecidos, tais como ensaio "immunospot" ligado a enzima (ELISPOT), ensaio imunoabsorvente ligados a enzima (ELISA) e, no caso do antígeno RSVF-2A-GLuc, um ensaio de neutralização do vírus sincicial respiratório (VNA). Exemplo 6: Respostas imunes celulares induzidas por Ad26HVRPtr12.FLuc e Ad26HVRPtr13.FLuc

[00118] De modo a avaliar a imunogenicidade celular dos novos vetores adenovirais Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13, camundongos Balb/C foram imunizados intramuscularmente com Ad26.FLuc (controle positivo), uma FLuc expressando os vetores Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13 (isto é, Ad26HVRPtr12.FLuc e Ad26HVRPtr13.FLuc), ou com um adenovetor não codificando FLuc, Ad26 vazio. Os vetores expressando FLuc foram testados a 109 e 1010partículas virais (vp) por camundongo e o vetor vazio Ad26 foi administrado a 1010 vp. Duas semanas após a imunização, os camundongos foram sacrificados e os esplenócitos foram isolados (Figura 5A). As respostas imunes celulares foram determinadas por ensaio ELISPOT ex-vivo medindo o número relativo de células secretoras de IFN-γ após estimulação durante a noite com esplenócitos com um conjunto de peptídeos FLuc com 15mer de sobreposição (Figura 5 B). Os resultados mostram que na dose de imunização mais elevada (1010), as respostas imunes celulares induzidas pelos vetores Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13 estavam na mesma faixa, ou superior, do que a resposta observada para Ad26.Fluc.

[00119] Em geral, as respostas imunes celulares induzidas pelos vetores adenovirais Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13 recombinantes expressando FLuc da invenção indicam claramente uma potente imunogenicidade desses vetores em camundongos. Exemplo 7: Respostas imunes celulares e humorais induzidas por Ad26HVRPtr12.RSVF-2A-GLuc e Ad26HVRPtr13.RSVF-2A-GLuc.

[00120] A imunogenicidade dos novos vetores adenovirais Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13 foi adicionalmente avaliada utilizando RSV-FA2-2A-GLuc (RSVF-2A-GLuc) como um antígeno de vacina codificado por vetor (modelo). Camundongos Balb/C foram imunizados intramuscularmente com Ad26.RSVF-2A-GLuc (controle positivo), Ad26HVRPtr12.RSVF-2A-GLuc, ou Ad26HVRPtr13.RSVF-2A-GLuc em três concentrações diferentes (cada uma com 108vp, 109vp, ou 1010 por camundongo), ou com Ad26.FLuc, Ad26HVRPtr12.FLuc, ou Ad26HVRPtr13.FLuc a 1010 por camundongo). Oito semanas após a imunização, os camundongos foram sacrificados e amostras de sangue e esplenócitos foram coletados (Figura 6 A). Diferentes parâmetros imunes foram avaliados conforme descrito abaixo.

[00121] Um ensaio de neutralização do vírus (VNA) foi realizado a fim de avaliar a capacidade de Ad26HVRPtr12.RSVF-2A-GLuc e Ad26HVRPtr13.RSVF-2A-GLuc de representarem os vírus anticorpos de neutralização do vírus sincicial. A Figura 6B representa os títulos de VNA da estirpe A2 do vírus sincicial respiratório (RSV A2) medidos para amostras de soro colhidas oito semanas após a imunização. Cada ponto representa um camundongo; as barras representam a média do grupo e a linha pontilhada corresponde ao limite inferior de quantificação (LLOQ = 6,88; título do ponto final médio das amostras de linearidade). Os resultados mostram que as 1010 imunizações de dose de vp com Ad26HVRPtr12.RSVF-2A-GLuc e Ad26HVRPtr13.RSVF-2A-GLuc deram origem a títulos de neutralização de RSV A2 semelhantes aos encontrados para o vetor de referência Ad26 codificando o mesmo antígeno. Os títulos induzidos pelos três vetores Ad26, Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13 codificando RSVF-2A-GLuc foram detectados principalmente na dose mais elevada usada para imunização, 1010 vp. Conforme esperado, não foram detectadas quaisquer respostas específicas de RSV A2 contra os respectivos adenovetores codificando luciferase de vaga-lume.

[00122] A indução da imunidade celular contra o antígeno codificado por vetor foi avaliada por um ensaio ELISPOT específico para RSV-FA2. Para esse fim, oito semanas após a imunização, esplenócitos de camundongos imunizados foram isolados e estimulados durante a noite com peptídeos com 15mer de sobreposição abrangendo a proteína RSV-FA2 e as respostas imunes celulares foram determinadas por ensaio ELISPOT ex-vivo medindo o número relativo de células secretando IFN-γ. Os dados mostram que as respostas imunes celulares específicas de antígeno induzidas pelos novos vetores Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13 codificando RSVF-2A-GLuc foram dependentes da dose e, por dose, respectivamente superiores e semelhantes em magnitude do que aquela induzida pelo vetor de referência, Ad26.RSVF-2A-Gluc (Figura 6C). Conforme esperado, não foi medida qualquer resposta específica de RSVF-FA2 a partir de esplenócitos de camundongos imunizados com adenovetores codificando Luciferase de vaga-lume.

[00123] A capacidade dos vetores expressando RSVF-2A-Gluc para representar anticorpos IgG específicos de RSV-FA2 foi avaliada por ELISA. Os soros coletados 8 semanas após a imunização dos camundongos imunizados com Ad26 (controle positivo), Ad26HVRPtr12, Ad26HVRPtr13 expressando transgene de RSVF-2A- Gluc ou luciferase de vaga-lume (controle) foram testados em um ELISA de anticorpo IgG de anti-RSV FA2. Especificamente, esse ELISA detecta anticorpos IgG capazes de se ligar a uma proteína RSV-FA2 de pré-fusão estável recombinante (pre-RSV-F). Os resultados mostram que Ad26HVRPtr12.RSVF-2A-GLuc e Ad26HVRPtr13.RSVF-2A-GLuc provocaram títulos de anticorpos IgG específicos para pre-RSV-F, semelhantes dependentes da dose, daqueles induzidos por Ad26.RSVF-2A-GLuc (Figura 6D). Conforme esperado, não foram detectados títulos de anticorpos específicos para RSV-FA2 em soros a partir de camundongos imunizados com vetores codificando apenas a luciferase de vaga-lume. O gráfico mostra os títulos ELISA de IgG calculados como títulos de ponto final (log10). Cada ponto representa um camundongo; as barras representam a média do grupo e a linha pontilhada o limite inferior de quantificação (LLOQ) calculado como 1,36 log10.

[00124] Em conjunto os dados mostram que os novos vetores adenovirais Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13 induziram resposta imune humoral e celular potente contra os antígenos codificados, semelhante em magnitude ou mais elevadas do que aquela induzida pelo vetor de referência com base em HAdV-26. Essas respostas imunes indicam claramente uma potente imunogenicidade dos vetores adenovirais Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13 em camundongos. Exemplo 8: Avaliação neutralização cruzada sorológica entre os novos vetores adenovirais e os existentes

[00125] Para a sua potencial utilidade como novos vetores de vacina adenoviral, os novos vetores adenovirais Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13 criados no presente documento seriam preferencialmente sorologicamente distintos dos vetores adenovirais existentes atualmente já em desenvolvimento como vetores de vacina, tal como vetores baseados nos sorotipos de adenovírus humanos HAdV-5 e HAdV-35. Portanto, foram realizados testes de neutralização cruzada entre os novos vetores adenovirais Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13 e vários vetores existentes baseados em HAdV-4, HAdV-5, HAdV-26 e HAdV-35. Para esse fim, os antissoros de camundongos, cada um criado contra um desses vetores adenovirais,

foram testados contra cada um dos diferentes vetores em um ensaio de neutralização de adenovírus. Os antissoros de camundongos usados para esse ensaio foram coletados a partir de camundongos Balb/C, duas ou oito semanas após a sua imunização com 10 10 partículas de vetor por camundongo. O ensaio de neutralização de adenovírus foi realizado conforme descrito anteriormente (Spangers et al. 2003. J.Clin. Microbiol. 41:5.046-5.052). Resumidamente, começando em uma diluição de 1:16, os soros foram diluídos 2 vezes em série e depois pré- misturados com os vetores adenovirais expressando a luciferase de vaga-lume (FLuc) e subsequentemente incubados durante a noite com células A549 (na multiplicidade de infecção de 500 partículas de vírus por célula). Os níveis de atividade da luciferase nos lisados celulares infectados, medidos 24 horas após a infecção, representaram eficiências de infecção do vetor. Os títulos de neutralização contra um dado vetor foram definidos como a diluição de soro mais elevada capaz de dar uma redução de 90% de eficiência de infecção do vetor. Os títulos de neutralização foram arbitrariamente divididos nas seguintes categorias: <16 (sem neutralização), 16 a 200, 200 a 2.000, e >2.000.

[00126] Os resultados mostram níveis nulos ou muito baixos de neutralização cruzada entre os vetores testados (Figura 7). A neutralização cruzada ligeira foi observada para os vetores Ad26HVRPtr12 em relação aos vetores Ad26 e Ad26HVRPtr13; e para os vetores Ad26HVRPtr13 em relação aos vetores Ad26 e Ad26HVRPtr12. Os títulos de neutralização cruzada recíprocos observados para esses vetores foram consideravelmente menores que os respectivos títulos de neutralização homólogos obtidos para esses mesmos vetores. Importante ainda, os novos vetores Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13 não apresentaram neutralização cruzada com os vetores adenovirais humanos incluídos no painel testado, ou seja, o Ad35, Ad5 e Ad4, exceto para Ad26 para o qual se observou neutralização cruzada a um nível muito baixo. Portanto, os novos vetores adenovirais Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13 poderiam, cada um, ser potencialmente usados em combinação com um ou mais desses ou outros vetores adenovirais distintos em imunizações sequenciais, por exemplo, no contexto de um regime de vacinação heterólogo por reforço primário ou, alternativamente ou adicionalmente, no contexto de uma série de dois ou mais regimes de vacinação consecutivos contra diferentes doenças ou antígenos. Exemplo 9: Soroprevalência de novos vetores adenovirais em populações humanas

[00127] Importante para a sua potencial utilização como vetores de vacina eficazes é que os novos vetores adenovirais descritos no presente documento não são prejudicados pelos elevados níveis de imunidade humoral antivetorial preexistentes em populações-alvo de vacina. Portanto, os vetores Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13 foram, cada um, avaliados quanto à sua soroprevalência em 200 amostras de soro de coorte humana de adultos, com idades entre 18 e 55 anos, residentes nos Estados Unidos (EUA) e na União Europeia (UE). Os vetores foram testados quanto à neutralização pelas amostras de soro humano, realizando um ensaio padrão de neutralização de adenovírus, conforme efetuado no Exemplo 7 e descrito anteriormente (Spangers et al. 2003. J.Clin. Microbiol. 41:5.046-5.052). Resumidamente, começando em uma diluição de 1:16, os soros foram diluídos 2 vezes em série e depois pré-misturados com os vetores adenovirais expressando a luciferase de vaga-lume (FLuc) e subsequentemente incubados durante a noite com células A549 (a uma multiplicidade de infecção de 500 partículas de vírus por célula). Os níveis de atividade da luciferase nos lisados celulares infectados, medidos 24 horas após a infecção, representaram eficiências de infecção do vetor. Os títulos de neutralização contra um dado vetor foram definidos como a diluição de soro mais elevada capaz de dar uma redução de 90% de eficiência de infecção do vetor. Os títulos de neutralização foram arbitrariamente divididos nas seguintes categorias: <16 (sem neutralização), 16 a 300, 300 a 1.000, 1.000 a 4.000 e >4.000.

[00128] Os resultados indicam que os vetores adenovirais Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13 têm uma soroprevalência consideravelmente mais baixa nos indivíduos humanos estudados do que o vetor de controle Ad5, e uma soroprevalência similar nos indivíduos como o vetor de referência Ad26 (Figura 8). Além disso, os títulos de neutralização positivos que foram vistos contra os novos vetores Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13 eram geralmente bastante baixos, principalmente não superiores a 300. Por outro lado, a maioria dos títulos de neutralização positivos encontrados contra ambos Ad26 e Ad5 eram superiores a 300.

[00129] Em conjunto, os dados acima indicam que a imunidade antivetor humoral preexistente contra vetores Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13 pode ser considerada como sendo baixa nas populações-alvo da vacina avaliadas, sugerindo que esses vetores têm potencial como vetores de vacina eficazes nessas populações. Exemplo 10: Produtividade do vetor adenoviral na suspensão de células PER.C6

[00130] Os vetores de adenovírus a serem usados em ensaios clínicos e além precisam ser rapidamente produzidos para títulos elevados em uma plataforma de produção de adenovírus escalável e isenta de soro. As células PER.C6® adaptadas à suspensão, também referidas no presente documento como células PER.C6 de suspensão ou sPER.C6, representam essa plataforma uma vez que demonstraram apoiar a fabricação em larga escala de vetores adenovirais em biorreatores, atingindo grandes quantidades de preparações de vetor de grau clínico, de elevado título, por exemplo, de vetores deletados em E1 baseados em HAdV-26 ou HAdV-35 (EP 2536829 B1, EP 2350268 B1).

[00131] Como uma avaliação inicial sobre se os novos vetores descritos no presente documento se ajustariam aos processos de produção baseados em células sPER.C6, foram realizadas experiências de produtividade vetorial em pequena escala em células sPER.C6 cultivadas em frascos agitadores. Essas experiências de produtividade foram realizadas usando as versões codificadas por Fluc dos novos vetores quiméricos Ad26HVRPtr12 e Ad26HVRPtr13 (descritos no Exemplo 4). Tomado como um controle de referência foi o vetor Ad26.Fluc baseado em HAdV-26. As culturas de células PER.C6 em suspensão, semeadas em frascos agitadores a uma densidade de 1x106 células/mL, em um volume total de 10 mL de meio de PERMEXCIS® (disponível a partir da Lonza) suplementado com L- glutamina a 4 mM (Lonza), foram infectadas com vetores diferentes em diferentes proporções de partículas de vírus (VP) para célula e depois incubadas por 4 dias. As diferentes proporções VP para célula usadas para infecção foram 70, 150 e 900. As amostras das culturas celulares infectadas foram coletadas todos os dias e os títulos de VP foram determinados nessas amostras por um protocolo quantitativo baseado em PCR (qPCR) que emprega iniciadores e sondas específicos para o promotor do CMV (que está presente em todos os vetores testados). Esse protocolo envolve um tratamento de DNAse das amostras de teste anteriores ao qPCR de forma a remover qualquer DNA livre de vetor (ou seja, genomas de vetor que não estão empacotados em partículas virais).

[00132] Os resultados de produtividade obtidos para os vetores quiméricos Ad26HVRPtr12.FLuc e Ad26HVRPtr13 são mostrados na Figura 9. Os dois vetores quiméricos renderam títulos de VP que foram equivalentes aos obtidos para o vetor de referência Ad26.Fluc parental. Esses resultados demonstram, desse modo, boa produtividade de cada um dos novos vetores quiméricos em um modelo de cultura de células em suspensão isento de soro à base de sPER.C6.

[00133] Coletivamente, os estudos de respostas imune humorais e celulares para os novos vetores adenovirais recombinantes da invenção, tal como apresentados acima, indicam claramente imunogenicidade potente desses vetores em camundongos. Adicionalmente, os vetores demonstraram não induzir, ou induzir muito poucas, respostas de anticorpos de neutralização cruzada contra certos candidatos a vetores de vacina adenoviral existentes (por exemplo, Ad26 e Ad35) ou vice-versa, bem como apenas respostas muito baixas de anticorpos de neutralização cruzada uns contra os outros. Além disso, os novos vetores mostraram baixa soroprevalência em seres humanos. Finalmente, os novos vetores podem ser facilmente produzidos a rendimentos elevados. A combinação de baixa soroprevalência, imunogenicidade e produtividade potentes sugere que os novos vetores adenovirais da invenção podem ser úteis como novos candidatos a vetores de vacinas contra uma variedade de patógenos e podem adicionalmente ter utilidade na terapia gênica e/ou no diagnóstico.

[00134] Será apreciado pelos peritos na técnica que podem ser feitas alterações nas modalidades acima descritas sem se afastar do seu amplo conceito inventivo. Em consequência, é entendido que essa invenção não está limitada às modalidades particulares divulgadas, sendo pretendido que abranja modificações dentro do espírito e escopo da presente invenção conforme definidos pela presente descrição.

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES

1. Vetor adenoviral, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo de hexon compreendendo um polipeptídeo englobando regiões hipervariáveis de hexon compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2.

2. Vetor adenoviral, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de polipeptídeo de hexon compreende a SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4.

3. Vetor adenoviral, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma deleção E1.

4. Vetor adenoviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma deleção E3.

5. Vetor adenoviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um adenovírus humano 5 (HAdV-5) E4 orf6.

6. Vetor adenoviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6.

7. Vetor adenoviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda pelo menos um transgene.

8. Vetor adenoviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o transgene está localizado na deleção E1, na deleção E3 e/ou adjacente a uma repetição terminal invertida direita (rITR).

9. Vetor adenoviral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais sequências de ácido nucleico a partir de adenovírus humano 26 (Ad26).

10. Célula recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor adenoviral, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

11. Método para produzir um vetor adenoviral, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) crescer a célula recombinante, como definida na reivindicação 10, sob condições de produção do vetor adenoviral; e (b) isolar o vetor adenoviral a partir da célula recombinante.

12. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor adenoviral, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

13. Método para induzir uma resposta imune em um indivíduo com necessidade da mesma, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo da composição imunogênica, como definida na reivindicação 12.

14. Método de produção de uma composição imunogênica, caracterizado pelo fato de que compreende a combinação de um vetor adenoviral, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, com um veículo farmaceuticamente aceitável.

15. Uso de um vetor adenoviral, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de uma composição imunogênica ou uma vacina para induzir uma resposta imune em um indivíduo com necessidade da mesma.

16. Invenção, em quaisquer formas de suas concretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação, por exemplo, produto ou processo ou uso, ou qualquer outro tipo de reivindicação englobada pela matéria inicialmente descrita, revelada ou ilustrada no pedido de patente.