ES2331838T3 - Vesicula celular denominada "exosoma", su preparacion y su utilizacion en la estimulacion de una respuesta inmunitaria. - Google Patents
Vesicula celular denominada "exosoma", su preparacion y su utilizacion en la estimulacion de una respuesta inmunitaria. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2331838T3 ES2331838T3 ES04005883T ES04005883T ES2331838T3 ES 2331838 T3 ES2331838 T3 ES 2331838T3 ES 04005883 T ES04005883 T ES 04005883T ES 04005883 T ES04005883 T ES 04005883T ES 2331838 T3 ES2331838 T3 ES 2331838T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cells
- tumor
- texosomes
- vesicles
- molecules
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 35
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 title claims description 10
- 230000028993 immune response Effects 0.000 title description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 title description 6
- 241001161492 Exosoma Species 0.000 title 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 80
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 56
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 14
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 claims abstract description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 219
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 183
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 104
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 104
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 103
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 86
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 78
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 55
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 36
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 36
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 25
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 21
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 20
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 claims description 19
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 19
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 claims description 18
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims description 18
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 claims description 18
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 17
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 15
- 230000004940 costimulation Effects 0.000 claims description 15
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 13
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 12
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 11
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 10
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 10
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 claims description 9
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 claims description 9
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 8
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 7
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 6
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 claims description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 6
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 claims description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 5
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 claims description 3
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 claims description 3
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 claims description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 3
- -1 chemoattractors Substances 0.000 claims description 2
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 claims description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003637 steroidlike Effects 0.000 claims 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 155
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 38
- 101000578784 Homo sapiens Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Proteins 0.000 description 37
- 102100028389 Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Human genes 0.000 description 37
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 31
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 28
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 23
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 21
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 21
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 20
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 20
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 20
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 19
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 17
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 17
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 16
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 16
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 15
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 15
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 15
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 14
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 14
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 13
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 13
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 13
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 13
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 11
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 11
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 11
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 description 10
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 10
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 9
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 9
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 9
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 9
- 230000004044 response Effects 0.000 description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 9
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 8
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 8
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 8
- 230000002121 endocytic effect Effects 0.000 description 8
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 8
- 201000006512 mast cell neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 208000006971 mastocytoma Diseases 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 7
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 6
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 6
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 6
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 6
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 102000034342 Calnexin Human genes 0.000 description 5
- 108010056891 Calnexin Proteins 0.000 description 5
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 5
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 5
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 5
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 description 5
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 5
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 5
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 5
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 5
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 5
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 description 4
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 description 4
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 4
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 4
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 4
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 4
- 108010010995 MART-1 Antigen Proteins 0.000 description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 4
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 4
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 4
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 4
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 4
- 230000005917 in vivo anti-tumor Effects 0.000 description 4
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 3
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 3
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 3
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 3
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 3
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 3
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 3
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 3
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 3
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 3
- 102000016200 MART-1 Antigen Human genes 0.000 description 3
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 3
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 3
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 3
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 3
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 2
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102100027217 CD82 antigen Human genes 0.000 description 2
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 108010035452 HLA-A1 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000914469 Homo sapiens CD82 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 2
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 2
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 2
- 241000232901 Nephroma Species 0.000 description 2
- KYRVNWMVYQXFEU-UHFFFAOYSA-N Nocodazole Chemical compound C1=C2NC(NC(=O)OC)=NC2=CC=C1C(=O)C1=CC=CS1 KYRVNWMVYQXFEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 229940123237 Taxane Drugs 0.000 description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 2
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 2
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- 229930192649 bafilomycin Natural products 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000002975 chemoattractant Substances 0.000 description 2
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 2
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 230000003447 ipsilateral effect Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 2
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 208000025351 nephroma Diseases 0.000 description 2
- 229950006344 nocodazole Drugs 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- NEHKZPHIKKEMAZ-ZFVKSOIMSA-N (2s)-2-[[(2s,3r)-2-[[(2s)-2-[[(2s,3s)-2-[[2-[[(2s,3s)-2-[[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-azaniumylpropanoyl]amino]propanoyl]amino]acetyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-methylb Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NEHKZPHIKKEMAZ-ZFVKSOIMSA-N 0.000 description 1
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 1
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 1
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100024458 Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 208000006313 Delayed Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 1
- 101001005728 Homo sapiens Melanoma-associated antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101000934346 Homo sapiens T-cell surface antigen CD2 Proteins 0.000 description 1
- 101000915595 Homo sapiens Zinc finger HIT domain-containing protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 108010031099 Mannose Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100025050 Melanoma-associated antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 101100335081 Mus musculus Flt3 gene Proteins 0.000 description 1
- ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N N-debenzoyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-10-deacetyltaxol Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C=4C=CC=CC=4)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 231100000632 Spindle poison Toxicity 0.000 description 1
- 108700025695 Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100025237 T-cell surface antigen CD2 Human genes 0.000 description 1
- 101710154778 Thymidylate synthase 1 Proteins 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 229940045799 anthracyclines and related substance Drugs 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000014102 antigen processing and presentation of exogenous peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 238000011398 antitumor immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000005667 attractant Substances 0.000 description 1
- XDHNQDDQEHDUTM-UHFFFAOYSA-N bafliomycin A1 Natural products COC1C=CC=C(C)CC(C)C(O)C(C)C=C(C)C=C(OC)C(=O)OC1C(C)C(O)C(C)C1(O)OC(C(C)C)C(C)C(O)C1 XDHNQDDQEHDUTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 208000009060 clear cell adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000010897 colon adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001609 comparable effect Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000007402 cytotoxic response Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229960003668 docetaxel Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 201000003911 head and neck carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000019691 hematopoietic and lymphoid cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000054533 human ZNHIT2 Human genes 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 210000001821 langerhans cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229960000502 poloxamer Drugs 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000030786 positive chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 230000025726 positive regulation of exocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000009117 preventive therapy Methods 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000009966 trimming Methods 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0008—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4615—Dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4622—Antigen presenting cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/46449—Melanoma antigens
- A61K39/464491—Melan-A/MART
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/46449—Melanoma antigens
- A61K39/464492—Glycoprotein 100 [Gp100]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5152—Tumor cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55588—Adjuvants of undefined constitution
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/5005—Wall or coating material
- A61K9/5063—Compounds of unknown constitution, e.g. material from plants or animals
- A61K9/5068—Cell membranes or bacterial membranes enclosing drugs
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Vesícula membranaria inmunógena, caracterizada porque está liberada de su entorno natural, se deriva de una célula tumoral, comprende una bicapa lipídica que rodea una fracción citosólica, y presenta, en su superficie, unas moléculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad o CMH.
Description
Vesícula celular denominada "exosoma", su
preparación y su utilización en la estimulación de una respuesta
inmunitaria.
La presente invención tiene por objeto un nuevo
procedimiento de sensibilización de células presentadoras de
antígeno, nuevos medios para la realización del procedimiento, y
nuevas vesículas membranarias que tienen poder inmunógeno.
Después de la demostración de la existencia de
linfocitos T citotóxicos CD8+ específicos de antígenos tumorales
presentados en el contexto de las moléculas de clase I (Rosenberg
et al., 1996; Boon, 1992), varios laboratorios han podido
demostrar que la inmunoterapia antitumoral es una estrategia
terapéutica eficaz en los modelos animales (Pardoll, 1995). El
principio de la inmunoterapia es inducir una respuesta inmunitaria
eficaz contra unos antígenos específicos de tumores. Actualmente,
esto ha podido ser efectuado de diferentes formas. En principio,
unas células tumorales que expresan unas moléculas de coestimulación
recombinantes y/o unas citoquinas inmunomoduladoras son capaces de
estimular unas respuestas antitumorales capaces de erradicar unos
tumores sólidos in vivo (Zitvogel et al. 1996 [a]).
Asimismo, unos péptidos derivados de antígenos tumorales (o
antígenos exógenos expresados en las células tumorales) inyectados
en diferentes formas químicas comprendida la utilización de
liposomas o de virus (adenovirus o poxvirus por ejemplo) como
vectores, son capaces de hacer remitir unos tumores. Finalmente,
unas células presentadoras de antígenos profesionales, como las
células dendríticas sensibilizadas con unos péptidos derivados de
antígenos tumorales reinyectadas in vivo inducen unas
respuestas antitumorales potentes, así como la regresión de tumores
sólidos establecidos del ratón (Mayordomo et al., 1995).
Amigorena et al. (ver referencias p. 59)
han descrito la acumulación, en el compartimento endocítico de los
linfocitos B, de vesículas que expresan unas moléculas del CMH de
clase II.
Zitvogel et al. (1998) dan a conocer los
exosomas derivados de las células dendríticas.
La inmunoterapia basada en la utilización de las
células dendríticas ha podido mostrar su eficacia en los estudios
realizados en el ratón. Por ello, esta terapia ha sido recientemente
transpuesta a clínica. En los Estados Unidos, unos ensayos están
actualmente en curso con el fin de demostrar que unas células
dendríticas cargadas de péptidos tumorales aumentan de manera
significativa la frecuencia de células T citotóxicas específicas
(CTL).
Una primera limitación de esta aproximación es
la sensibilización de las células dendríticas con unos péptidos
derivados de antígenos tumorales. En efecto, en la mayoría de los
tumores, no han sido identificados antígenos específicos. Unos
antígenos específicos del tumor son solamente conocidos en unos
casos de tumores inducidos por virus (carcinoma del cuello
uterino), en los casos de melanoma (antígenos de sí mismo, antígenos
mutados, antígenos de diferenciación) o en un pequeño porcentaje de
tumores de mama (oncógenos, o productos de genes supresores de
tumor que han sufrido mutaciones). Sin embargo, la implicación
directa de estos péptidos o antígenos tumorales en la eliminación
de los tumores en el hombre queda por demostrar. Unos nuevos
procedimientos de sensibilización de las células presentadoras de
antígenos tales como las células dendríticas resultan por tanto
necesarios. Estos procedimientos tienen por objetivo inducir unas
respuestas antitumorales específicas en el contexto de moléculas de
clase I y de clase II del CMH.
La mayor parte de los procedimientos de
sensibilización de células dendríticas utilizados actualmente
utilizan unos péptidos que corresponden a unos epítopos presentados
en asociación con las moléculas de clase I e identificados en las
células tumorales gracias a unos clones de CTL específicos del
tumor. Sin embargo, estos procedimientos no son verosímilmente
óptimos puesto que no tienen en cuenta los epítopos reconocidos en
el contexto de las moléculas de clase II que son críticos para la
proliferación de los linfocitos T auxiliares, necesarios para la
obtención de las respuestas citotóxicas óptimas. Además, unos
epítopos presentados por las células tumorales y los presentados
por las células presentadoras de antígenos (como por ejemplo las
células dendríticas), no son probablemente los mismos. Finalmente,
unos péptidos tumorales reconocidos por los CTL están solamente
disponibles para un pequeño porcentaje de pacientes que tienen unas
moléculas de clase I de haplotipo apropiado.
El procedimiento de sensibilización ideal, de
manera que pueda ser aplicado a cualquier tumor con un riesgo
mínimo de inmunoselección, no debe estar restringido a un pequeño
número de antígenos tumorales identificados. Asimismo, dicho
procedimiento debería utilizar unos antígenos proteicos intactos más
bien que unos péptidos, con el fin de permitir a la célula
dendrítica prepararlos y presentar la combinación adecuada de
péptidos en asociación con las moléculas de clase I y de clase II,
y ello para cualquier individuo.
Recientemente, Gilboa et al. (Boczkowsky
et al., 1996) han podido demostrar que unos ARN mensajeros
preparados a partir de biopsias de tumores cargados en las células
dendríticas pueden tener un efecto antitumoral in vivo. Sin
embargo, los ARN son muy inestables y la cantidad de ARN
potencialmente interesante comparado con el ARN total es
verosímilmente muy baja. Zitvogel et al., (Zitvogel et
al., 1996 [b]) han demostrado que los péptidos tumorales
preparados a partir de un eluado ácido de tumores (eluado peptídico
ácido: EPA) pueden ser utilizados para cargar unas células
dendríticas. Estas células así cargadas, una vez inyectadas, tienen
la capacidad de hacer remitir unos tumores. Sin embargo, en el caso
de tumores que no expresan moléculas de clase I (que representan la
mayoría de los tumores humanos metastásicos), o en el caso de
tumores que no pueden ser disociados en una suspensión celular, la
aproximación que utiliza los eluados ácidos no es muy eficaz y no
es reproducible.
Una segunda limitación de la inmunoterapia
basada en el empleo de células dendríticas está ligada a los cambios
fenotípicos que pueden sobrevenir cuando estas células son
mantenidas en cultivo, o sometidas a diferentes tratamientos. Esto
puede en efecto conducir a unas poblaciones celulares poco
homogéneas e insuficientemente caracterizadas para un uso
terapéutico.
Existe por tanto una necesidad real de mejorar
los procedimientos de sensibilización de las células presentadoras
de antígenos, con el fin de aumentar la eficacia de estas
aproximaciones y ensanchar sus aplicaciones, así como elaborar
nuevos medios de vectorización de antígenos u otras moléculas.
La presente invención aporta unas soluciones a
estas cuestiones. La presente invención tiene en efecto por
objetivo proporcionar nuevos procedimientos de sensibilización de
células presentadoras de antígeno, en particular de las células
dendríticas, así como la identificación, el aislamiento y la
caracterización de las nuevas vesículas membranarias que tienen
propiedades inmunógenas destacables.
Uno de los aspectos de la invención es más
particularmente proponer un nuevo procedimiento reproducible de
sensibilización de células presentadoras de antígeno por unos
antígenos tumorales.
Uno de los otros aspectos de la invención es
proponer un nuevo procedimiento reproducible de sensibilización de
células presentadoras de antígeno por unos antígenos tumorales, en
el cual no es necesario que los antígenos tumorales sean
conocidos.
Otro aspecto es proponer los medios que permitan
establecer un banco de antígenos tumorales.
Otro aspecto de la invención reside en unas
vesículas membranarias, lipídicas producidas por las células
dendríticas y dotadas de propiedades inmunógenas, así como su
utilización para la producción de bancos de antígenos, la
sensibilización de células presentadoras de antígenos o la
vectorización de antígenos, en particular en el marco de
aproximaciones inmunoterapéuticas.
A este respecto, un primer objeto de la
invención se refiere a una vesícula derivada de células tumorales
que tienen las características siguientes:
- -
- está liberada de su entorno natural,
- -
- comprende una bicapa lipídica (designada por "superficie") que rodea una fracción citosólica,
- y eventualmente,
- -
- presenta en su superficie unas moléculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) y de clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH), eventualmente cargadas con péptidos antigénicos y/o unas moléculas de adhesión y/o unas moléculas de coestimulación linfocitaria, y/o,
- -
- contiene en su fracción citosólica unas moléculas antigénicas tumorales y/o unos inmunomoduladores y/o unos quimioatractores y/o hormonas y/o unos ácidos nucleicos.
\vskip1.000000\baselineskip
La secreción de las vesículas por unas células
es un fenómeno descrito en la técnica anterior (reticulocitos,
linfocitos B, macrófagos). Estas vesículas son generalmente
designadas por el término genérico "exosoma" que refleja su
mecanismo de producción por exocitosis de vesículas internas. Son
embargo, la función fisiológica de estas vesículas no ha sido
verdaderamente establecida. Además, las características
estructurales, las propiedades y las funciones de estas vesículas
son variables según el tipo celular del cual han salido.
De forma inesperada, los inventores han puesto
ahora en evidencia que las células tumorales son capaces de
segregar unas vesículas que presentan unas propiedades inmunógenas
particularmente interesantes. Estas vesículas corresponden
generalmente a una vesícula interna contenida en un endosoma de una
célula tumoral y segregada por dicha célula tumoral a consecuencia
de la fusión de la membrana externa del mencionado endosoma con la
membrana citoplásmica de la mencionada célula tumoral. En razón de
este mecanismo de formación, de su célula de origen y de sus
características y propiedades funcionales originales, estas
vesículas se designan en lo que sigue por el término
"texosoma".
La expresión "liberada de su entorno
natural" significa que la vesícula está separada físicamente de
la célula de la cual ha salido, o también que está parcialmente
aislada o purificada. Generalmente, la vesícula es por tanto
producida por la célula por exocitosis, y después parcialmente
aislada o purificada de manera que se obtenga una composición
enriquecida. Esta expresión puede también significar que, no
solamente la vesícula ha sido segregada por la célula cuando tiene
lugar la fusión de los endosomas multivesiculares con la membrana
plásmica, sino que ya no está rodeada de los elementos solubles que
están en el lumen del endosoma, o que está desprovista de células
intactas. La expresión "derivada de la célula tumoral"
significa que la vesícula posee unos elementos estructurales de una
célula tumoral. Esta vesícula es generalmente "derivada" de una
célula tumoral en el sentido de que es producida, por lo menos en
parte y después liberada por una célula tumoral, en una fase dada
de su desarrollo.
Según un modo de realización ventajoso, los
texosomas de la invención presentan unas moléculas del CMH cargadas
de péptidos multigénicos y/o expresan unas moléculas de adhesión y/o
expresan unas moléculas de coestimulación linfocitaria, pero están
desprovistos, en su fracción citosólica, de moléculas antigénicas
tumorales y de inmunomoduladores y de ácidos nucleicos.
Según otro modo de realización ventajoso, los
texosomas son tales que las moléculas del CMH están "vacías",
es decir, no cargadas de péptidos de la invención antigénicos y los
texosomas comprenden, en su fracción citosólica, unas moléculas
antigénicas tumorales, unos inmunomoduladores y/o unos ácidos
nucleicos. Unos texosomas que tienen unas moléculas del CMH vacías
pueden ser obtenidos o bien a partir de células tumorales que
presentan por ejemplo una deficiencia para el transportador de
péptidos (TAP), o bien por lavado de texosomas o de células
tumorales, con el fin de eluir los péptidos asociados a las
moléculas del CMH.
Según un modo de realización ventajoso de la
invención, los texosomas de la invención son tales que las moléculas
del CMH están cargadas de péptidos antigénicos y/o expresan unas
moléculas de adhesión y/o moléculas de coestimulación linfocitaria
y los texosomas contienen en su fracción citosólica unas las
moléculas antigénicas tumorales, unos inmunomoduladores y/o unos
ácidos nucleicos.
El término "células tumorales" engloba de
forma general cualquier célula que proviene de un tumor, por ejemplo
un tumor sólido o líquido, así como las células transformadas o
inmortalizadas in vitro. Se trata preferentemente de un
tumor sólido, ascítico o hematopoyético.
Se pueden citar, a título de ejemplo, unas
células de cáncer de tipo melanoma maligno (que provienen de
progenies primarias establecidas "ex vivo" o bien de
células disociadas que provienen de la pieza operatoria) que
expresan en su superficie unos péptidos como
MART-1/Melan-A, en el contexto
CMH-clase 1, HLA-A
02-01, y que contienen el antígeno proteico
MART-1.
Se pueden también citar unas células que
provienen de cáncer del riñón (adenocarcinoma de células claras) o
de leucemias cuya células expresan unos productos específicos de
translocación.
Así, los péptidos antigénicos susceptibles de
cargar las moléculas del CMH provienen por ejemplo de los antígenos
siguientes: los que provienen de melanomas tales como:
MART-1, tirosinasa, MAGE-1/2/3, P53
(en diferentes tumores) o Her2/Neu, PSA, CEA o también PSMA. Otros
antígenos tumorales se citan por ejemplo en el artículo de
Rosenberg (Immunology Today 18 (1997)175).
Más generalmente, se pueden citar unos productos
de fusión/translocación, de oncógenos o de antioncógenos, o bien
unos antígenos de diferenciación o unos péptidos de sí mismo o
péptidos mutados.
Por moléculas de coestimulación linfocitaria, se
designan por ejemplo las moléculas que dan a los linfocitos T unas
señales complementarias a las dadas cuando tiene lugar la
interacción de los complejos Molécula de clase I y
II-péptido con el receptor de las células T.
Se pueden citar, a título de ejemplo:
CD80, CD86, ICAM, LFA, CD40, algunos miembros de
la familia TNF R y unas moléculas de adhesión o de quimioatracción
(que permiten el contacto entre la célula profesional presentadora
de antígeno y los linfocitos efectores, o el transporte
intracelular/localización específica ("trafficking/homing") de
otras células en el sitio vacunante o inflamatorio.
Las moléculas antigénicas tumorales contenidas
en el citosol o presentadas por los texosomas provienen de
proteínas expresadas de forma selectiva y/o abundante por las
células tumorales.
Los inmunomoduladores que pueden estar presentes
en el citosol de los texosomas son por ejemplo:
- -
- TNF-\alpha, o
- -
- Interleucina 1, o
- -
- Interleucina 15, o
- -
- C-CR (quimioquinas).
\newpage
Los ácidos nucleicos susceptibles de estar
presentes en el citosol de los texosomas provienen de la célula
tumoral misma. Estos ácidos nucleicos se encuentran en el citosol de
los texosomas a consecuencia directa de su mecanismo de formación.
Puede también tratarse de ácidos nucleicos heterólogos.
Unas características más particulares de los
texosomas son las siguientes:
- -
- son pequeñas vesículas membranarias de 60 a 100 nm aproximadamente, muy a menudo de 60 a 90 nm aproximadamente, en particular de 60 a 80 nm, segregadas por las células tumorales,
- -
- poseen unas moléculas normalmente presentes en los endosomas,
- -
- contienen unos antígenos tumorales, como por ejemplo MART-1 en el caso de células de melanoma,
- -
- están desprovistos de células muertas, y/o desechos celulares,
- -
- están desprovistos de contaminantes tales como contaminantes membranarios, retículo endoplásmico, aparato de Golgi, mitocondrias o constituyentes de núcleos,
- -
- llevan en su membrana unas moléculas de clase I/II funcionales cargadas de péptidos antigénicos tumorales,
- -
- pueden estimular in vitro la proliferación de linfocitos T específicos,
- -
- pueden sensibilizar in vivo e in vitro unas células dendríticas capaces a continuación de activar unas células T específicas del tumor,
- -
- presentan la capacidad, cuando son inoculados in vivo, en particular en intradérmica, de hacer remitir unos tumores sólidos establecidos,
- -
- llevan unas moléculas de coestimulación linfocitaria tales como CD40 y CD80, y/o,
- -
- contienen la proteína ("heat-shock") HSP70,
- -
- están desprovistos de la proteína gp96,
- -
- contienen unas interleucinas, o unos quimioatrayentes o unos inmunomoduladores.
\vskip1.000000\baselineskip
Otra característica interesante de los texosomas
es que contienen fosfatidilserina en su hoja externa. La
fosfatidilserina (PS) es uno de los componentes principales de las
membranas celulares, normalmente presente muy mayoritariamente en
la hoja interna de las bicapas lipídicas. En algunas circunstancias,
como en las etapas precoces de la apoptosis, la PS es redistribuida
hacia la hoja externa. La presencia de PS en la hoja externa de la
membrana citoplásmica de las células apoptósicas constituye una
señal de reconocimiento por los macrófagos. Con el fin de
determinar si la PS está expuesta en la superficie de los texosomas,
unas preparaciones de exosomas purificados a partir de
sobrenadantes de las células de melanoma humano FON han sido
analizadas por el procedimiento descrito por Aupeix et al.
(J. Clin. Invest. 99: 1546-1554, 1997). El contenido
de fosfatidilserina en la hoja externa de las muestras FON (que
contienen 390 microg/ml de proteínas) es de 460 nM de PS. Los
exosomas contienen por tanto cantidades importantes de PS en su
hoja externa.
Unas pruebas que permiten verificar que los
texosomas de la invención poseen moléculas normalmente presentes en
los endosomas consisten en la microscopía electrónica y la
inmunomarca (Western Blot). Estas pruebas permiten demostrar que
los texosomas de la invención expresan el receptor de la
transferrina, de las moléculas LAMP ("lysozome associated
membrane protein": proteína membranaria asociada al lisozoma), de
las moléculas de clase I/II, de los antígenos tumorales.
Una prueba que permite verificar que los
texosomas de la invención están desprovistos de contaminantes es la
microscopía electrónica y la inmunomarca con unos anticuerpos
anticalnexina que está presente en el retículo endoplásmico.
Una prueba que permite verificar que los
texosomas llevan en su membrana unas moléculas de clase I/II
funcionales cargadas de péptidos antigénicos tumorales consiste en
una presentación antigénica a unos linfocitos T específicos de los
antígenos del tumor interesado (pruebas de proliferación de clones T
específicos de antígenos y CMH clase I restringidos).
Se puede también utilizar una prueba de
secreción de citoquinas (IFN\gamma, GMCSF, TNF\beta) por los
clones T antes citados.
Una prueba que permite verificar que hay
sensibilización in vivo e in vitro de las células
dendríticas capaces de activar unas células T específicas del tumor
se da en la figura 7 (prueba de proliferación y/o secreción de
citoquinas por los clones T específicos de antígenos, por el
procedimiento de sensibilización cruzada
("cross-priming"): texosomas de un tumor
MART-1+, HLA-A2- cargados sobre una
célula dendrítica MART-1-,
HLA-A2+).
Una prueba que permite verificar que los
texosomas presentan la capacidad, cuando son inoculados, en
particular por intradérmica, de hacer remitir los tumores sólidos
establecidos se da en la figura 6.
A título de ejemplo se practica una inyección de
10 a 40 \mug de texosomas de tumor en intradérmica por el lado
homolateral al tumor establecido desde 3 a 10 días; se observa el
animal portador del tumor y la desaparición progresiva del tumor
establecido en 7 a 10 días (en los roedores del tipo ratón).
Un texosoma ventajoso está constituido por un
texosoma tal como el definido anteriormente y que presenta sobre su
superficie unas moléculas de clase I y/o de clase II del CMH,
eventualmente cargado con péptidos antigénicos y que contiene en su
fracción citosólica unas moléculas antigénicas tumorales. Más
particularmente, el texosoma preferido comprende también una o
varias moléculas de coestimulación linfocitaria y/o la proteína
HSP70. En un modo particular de realización, el texosoma está
desprovisto de la proteína gp96.
Según un modo de realización ventajoso, la
invención se refiere a un texosoma tal como el definido
anteriormente,
- -
- que expresa en su superficie unas moléculas de clase I y/o de clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH), y/o unos antígenos característicos de los tumores y/o unas moléculas de coestimulación linfocitaria/adhesión y/o unos inmunomoduladores y/o quimioatrayentes, exógenos con respecto a la célula tumoral de la que deriva el exosoma, o
- -
- que contiene unos antígenos tumorales y/o unos inmunomoduladores y/o unos ácidos nucleicos o unos agentes citotóxicos o unas hormonas exógenas con respecto a la célula tumoral de la que deriva el exosoma.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere asimismo a un
procedimiento de preparación de texosomas tales como los definidos
anteriormente. Este procedimiento comprende ventajosamente una etapa
de puesta a disposición de una muestra biológica y una etapa de
aislamiento de texosomas a partir de dicha muestra.
La muestra biológica está ventajosamente
constituida por fracciones membranarias, por sobrenadantes de
cultivo o por lisados de células tumorales, o bien por suspensiones
tumorales frescas.
La muestra biológica puede provenir de piezas
tumorales operatorias después de excisión quirúrgica (1^{er}
caso) o bien de órganos portadores de tumor (órgano extirpado
quirúrgicamente) (2º caso), que se trata por disociación mecánica
(1^{er} caso) o por perfusión prolongada (2º caso).
La suspensión celular final es tratada de la
misma manera que los sobrenadantes de cultivo.
Puede también tratarse de células tratadas por
congelación/descongelación en varios ciclos sucesivos.
Según un modo de realización ventajoso, la
muestra biológica utilizada en el procedimiento de la invención
es:
- -
- una extracción de sangre eferente de la vena del órgano tumoral aislado, o
- -
- una extracción de suero o de plasma de la sangre que circula de un paciente, o
- -
- el producto de drenaje (suero fisiológico que contiene eventualmente dexametasona, o agente citotóxico que estimula la exocitosis de los texosomas) de un órgano extirpado quirúrgicamente y tratado ex vivo por circuito aislado-perfundido para el drenaje del tumor que lleva, o también
- -
- el sobrenadante de un explante tumoral disociado in vitro.
\vskip1.000000\baselineskip
La extracción de sangre eferente del órgano
tumoral aislado corresponde a 20 a 50 ml de sangre de la vena
principal eferente del órgano tumoral, extraída antes de la
intervención de ablación quirúrgica.
El producto de drenaje de un órgano extirpado
quirúrgicamente y tratado ex vivo por circuito
aislado-perfundido tiene lugar de la forma
siguiente.
En el caso de órgano que presenta una arteria
aferente y una vena eferente, se cateteriza la arteria por un tubo
plástico conectado a una bolsa proclive que contiene suero
fisiológico con eventualmente otros agentes. Se drena el órgano y
el líquido sale por otro tubo que cateteriza la vena, en declive
(por ejemplo en el caso de cáncer de riñón o de un glioblastoma
cerebral).
La dexametasona, contenida eventualmente en el
producto de drenaje, tiene por objetivo aumentar el estrés celular
y la exocitosis de los texosomas fuera de la célula tumoral.
El sobrenadante de un explante tumoral disociado
in vitro se obtiene de la forma siguiente:
- -
- se procede a la disociación mecánica del tumor que conduce a una suspensión unicelular que contiene unas células tumorales y unas células del estroma tumoral y unas células del sistema inmunitario; esta suspensión puede ser irradiada y recuperada por las ultracentrifugaciones diferenciales.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha indicado anteriormente, en un modo
particular de realización del procedimiento de la invención, la
muestra biológica puede ser tratada por uno o varios agentes que
estimulan la producción de texosomas. Este tratamiento puede
comprender la adición de agentes esteroides (dexametasona por
ejemplo), agentes farmacológicos (por ejemplo unos agentes
citotóxicos tales como taxanos, cisplatino, etc), de agentes
susceptibles de aumentar la cantidad de endosomas multivesiculares
y/o una irradiación de la muestra.
Tratándose de la irradiación, la misma debe ser
suficiente para provocar la acción citostática de las células
tumorales. La irradiación de las células tumorales puede ser
realizada antes de la puesta en cultivo de las células, o durante o
después de la puesta en cultivo de las células tumorales. Por otra
parte, conviene irradiar cuando las células tumorales están vivas,
es decir:
- -
- o bien sobre el órgano extirpado portador del tumor antes de la perfusión,
- -
- o bien sobre las células en cultivo,
- -
- o bien sobre la suspensión celular disociada mecánicamente; pero, en todos los casos, antes de sufrimiento celular tumoral por causa de hipoxia/necrosis vascular/deshidratación.
\vskip1.000000\baselineskip
Tratándose del tratamiento con la ayuda de
esteroides, el mismo permite provocar una activación celular que
conduce a la exocitosis de los texosomas.
Tratándose del tratamiento con la ayuda de
agentes farmacológicos, el mismo permite:
- -
- modificar el citoesqueleto y reordenar los compartimentos intracelulares para desajustar los fenómenos de internalización y de exocitosis,
- -
- despolimerizar los microtúbulos.
Tratándose del tratamiento con un agente
susceptible de aumentar la cantidad de endosomas multivesiculares,
el mismo tiene lugar durante la puesta en cultivo de las células,
como agente se puede citar el nocodazol, (droga que permite
despolimerizar los microtúbulos), la bafilomicina (droga que inhibe
los ATPasas vacuolares) ("Bafilomycins: A class of inhibitors of
membrane ATPases from microorganisms, animal cells, and plant
cells" (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:
7972-7976).
Un procedimiento de preparación de texosomas
según la invención se efectúa:
a) o bien a partir de cultivos celulares
tumorales, y comprende:
- -
- una irradiación, con una intensidad suficiente para provocar la acción citostática de las células tumorales y que no sobrepasa de 15.000 rads, ventajosamente aproximadamente 10.000 rads, de las células tumorales antes, durante o después de su puesta en cultivo, o
- -
- un tratamiento, durante el cultivo, de las células tumorales con la ayuda de esteroides, por ejemplo dexametasona, o de agentes citotóxicos, por ejemplo 5-fluorouracilo (5 Fu) o cisplatino, docetaxel, antraciclina, veneno del huso, antipirimídico o de interleucina por ejemplo IL10, IL2, IL15, GM-CSF, o
- -
- un tratamiento con un agente susceptible de aumentar la cantidad de endosomas multivesiculares, por ejemplo el nocodazol (Gruenberg J. et al., (1989) "Characterization of the Early Endosome and Putative Endocytic Carrier Vesicles In vivo and with an Assay of Vesicle Fusion In vitro" The Journal of Cell Biology 108: 1301-1316) y por tanto aumentar la producción de texosomas,
b) o bien a partir de una extracción de suero
fisiológico que drena un órgano extirpado quirúrgicamente y tratado
ex vivo por circuito aislado-perfundido para
el drenaje del tumor que lleva,
c) o bien a partir del sobrenadante de un
explante tumoral disociado in vitro y que comprende:
- -
- un tratamiento con la ayuda esteroides, por ejemplo dexametasona, o de agentes citotóxicos, por ejemplo 5-fluorouracilo (5-Fu); cisplatino, taxanos o de interleucina por ejemplo IL-10, IL-2, GM-CSF.
\vskip1.000000\baselineskip
La etapa de aislamiento de los texosomas puede
ser realizada según diferentes técnicas tales como la
centrifugación, la cromatografía, la electroforesis, la
nanofiltración, etc. Se trata por ejemplo de una centrifugación
diferencial de fracciones membranarias de sobrenadantes de cultivo
o de lisados de células tumorales o de suspensiones tumorales
frescas y de recuperación de la o de las fracción(es) que
contienen dichos exosomas (Raposo et al., J. Exp. Med. 1996,
183: 1161-1172). En este modo particular de
realización, la fracción membranaria de sobrenadantes es la
obtenida después de ultracentrifugación a 100.000 g. Puede tratarse
ventajosamente de una electroforesis en fase fluida, que permite la
separación de materiales biológicos después de su carga. Los
ejemplos siguientes muestran que esta técnica puede ser
ventajosamente utilizada para el aislamiento de texosomas con
buenos rendimientos. Esta técnica es por otra parte particularmente
ventajosa en el plano industrial.
La invención tiene asimismo por objeto un
procedimiento de preparación de texosomas tales como los definidos
anteriormente, que comprende además:
- -
- o bien la modificación genética de las células tumorales por unos genes exógenos que codifican para unas moléculas de clase I y/o de clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH), y/o unos genes que codifican para unos antígenos característicos de tumores y/o unos genes que codifican para unas moléculas de coestimulación/adhesión o unas quimioquinas atrayentes, pudiendo los productos de estos genes exógenos encontrarse expresados en la superficie de los texosomas y/o estar secuestrados en el interior de los texosomas,
- -
- o bien la modificación in vitro de los texosomas producidos por las células tumorales, tal como la introducción (por electroporación, por fusión con un liposoma sintético, por virus recombinante o por procedimiento químico), de proteínas o de ácidos nucleicos o medicamentos farmacéuticamente definidos en y/o con los texosomas.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se refiere asimismo a los texosomas
susceptibles de ser obtenidos según el procedimiento descrito
anteriormente.
Los texosomas de las células tumorales
transfectadas como se ha indicado anteriormente son recogidos y
utilizados como vacunas tumorales.
Los texosomas modificados in vitro como
se ha indicado anteriormente están destinados a suministrar el
material exógeno a una célula diana in vitro o in
vivo.
Tratándose de la fusión con un liposoma
sintético, este procedimiento se realiza por ejemplo como se ha
indicado en Nabel et al. (1996) o en Walker et al.
(1997, Nature 387, páginas 61 y siguientes).
La invención se refiere asimismo a unas células
presentadoras de antígenos, en particular linfocitos B, macrófagos,
monocitos o células dendríticas, cargadas con texosomas tales como
los definidos anteriormente. Se trata ventajosamente de células
dendríticas.
Las células dendríticas presentan en particular
las características siguientes:
- -
- en unos modelos de tumores que no expresan moléculas de clase I y que, por consiguiente, no tienen la capacidad de estimular unas células T CD8+, unas células dendríticas cargadas con unos texosomas de células tumorales, pueden presentar estos péptidos tumorales a unas células T citotóxicas en el contexto de las moléculas de clase I del CMH, (característica nº 1)
- -
- unas células dendríticas cargadas con texosomas de células tumorales inyectadas por vía intravenosa o subcutánea son asimismo eficaces (característica nº 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Una prueba que permite poner en evidencia la
característica nº 1 es la siguiente.
En el sistema humano, un texosoma de clase I
negativo, incubado en presencia de una célula dendrítica de clase I
positiva, puede permitir la estimulación de clones CD8+T específicos
del antígeno contenido en el texosoma (véase la figura 7).
Una prueba que permite poner en evidencia la
característica nº 2 es la siguiente.
En un sistema murino en el que el tumor está
clasificado como I negativo y en el que los texosomas están a su
vez desprovistos de moléculas de clase I, estos texosomas pueden,
cuando se incuban y se cargan en las células dendríticas, mediar
una respuesta inmunitaria anti-tumoral mientras que,
solos, en inyección intradérmica, no pueden.
La invención se refiere asimismo a un
procedimiento de preparación de células presentadoras de antígenos
tales como las definidas anteriormente, que comprende las etapas de
incubación de células presentadoras de antígenos en presencia de
texosomas tales como los definidos anteriormente y de recuperación
de dichas células presentadoras de antígeno cargadas con dicho
texosoma.
La invención se refiere asimismo a unas células
presentadoras cargadas de texosomas y susceptibles de ser obtenidas
mediante el procedimiento descrito anteriormente.
La invención tiene asimismo por objeto la
utilización de texosomas tales como los definidos anteriormente,
para la sensibilización de células presentadoras de antígenos, en
particular linfocitos B, macrófagos, monocitos o células
dendríticas o para la estimulación de linfocitos T específicos.
La presente invención da a conocer asimismo una
vesícula membranaria liberada de su entorno natural, segregada por
unas células presentadoras de antígeno cargadas de texosomas tales
como los definidos anteriormente.
Para obtener estas vesículas membranarias
definidas anteriormente, se puede recurrir a un procedimiento que
comprende:
- -
- una etapa de preparación de un texosoma tal como el definido anteriormente,
- -
- una etapa de incubación de un texosoma con unas células presentadoras de antígeno,
- -
- una etapa de centrifugación diferencial de fracciones membranarias de sobrenadantes de cultivo o de lisados de las mencionadas células presentadoras de antígenos, cargadas de texosomas, y
- -
- una etapa de recuperación de la fracción que contiene las mencionadas vesículas membranarias.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención da a conocer asimismo unas
vesículas membranarias tales como las definidas anteriormente y
susceptibles de ser obtenidas según el procedimiento descrito
anteriormente.
Los dexosomas comprenden ventajosamente unas
moléculas de coestimulación linfocitarias, y en particular unas
moléculas CD63 y/o CD82 y/o CD86, preferentemente por lo menos CD86.
Los estudios presentados en los ejemplos muestran en efecto que los
dexosomas están muy marcados por los anticuerpos dirigidos
específicamente contra estas moléculas de coestimulación.
Por otra parte, los análisis en microscopía
electrónica muestran que los dexosomas son homogéneos y poseen un
diámetro comprendido entre 60 y 100 nm aproximadamente, muy a menudo
entre 60 y 90 nm aproximadamente.
comprende:
- -
- una o varias moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I,
- -
- una o varias moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II,
- -
- una o varias moléculas CD63, y
- -
- CD82.
\vskip1.000000\baselineskip
Los dexosomas comprenden además uno o varios
péptidos antigénicos y/o se obtienen a partir de células dendríticas
inmaduras.
Los dexosomas pueden estar desprovistos de los
marcadores H2-M, cadena li, y calnexina (un marcador
específico del retículo endoplásmico).
Por otra parte, los dexosomas de la invención
pueden comprender además fosfatidilserina (PS) en su hoja externa.
Así, unas preparaciones de exosomas purificados a partir de
sobrenadantes de células dendríticas derivadas de la médula ósea
han sido analizadas por el procedimiento descrito por Aupeix et
al. (J. Clin. Invest. 99: 1546-1554, 1997). El
contenido de fosfatidilserina en la hoja externa de las muestras de
BMDC (que contienen 35 microg/ml de proteínas), es de 80 nM de PS.
Los dexosomas contienen por tanto cantidades importantes de PS en
su hoja externa.
Los dexosomas pueden prepararse según una
metodología que comprende una primera etapa de obtención de células
dendríticas o de cultivo celular que comprende unas células
dendríticas, una segunda etapa, facultativa, en el curso de la cual
las células pueden ser sensibilizadas a unos antígenos de interés, y
una tercera etapa que comprende la producción de dexosomas a partir
de estos cultivos celulares. Estas diferentes etapas pueden ser
realizadas ventajosamente según las metodologías descritas a
continuación.
La primera etapa del procedimiento comprende una
puesta a disposición de un(os) cultivo(s) de células
dendríticas. Puede tratarse de cultivos de células enriquecidas con
células dendríticas, incluso de cultivos celulares que comprenden
esencialmente células dendríticas. Ventajosamente, se trata
evidentemente de células dendríticas humanas.
La preparación de células dendríticas ha sido
bien documentada en la literatura. Así, es conocido que estas
células pueden ser obtenidas a partir de células cepas del sistema
inmunitario o a partir de precursores monocitos, o también aisladas
directamente en forma diferenciada (Revue par Hart, Blood 90 (1997)
3245).
La obtención de células dendríticas a partir de
células cepas está ilustrada por ejemplo por Inaba et al.,
(J. Exp. Med. 176 (1992) 1693), Caux et al. (Nature 360
(1992) 258) o Bernhard et al. (Cancer Res. 55 (1995) 1099).
Estos trabajos muestran en particular que unas células dendríticas
pueden ser producidas por cultivo de médula ósea en presencia de
Factor de Estimulación de las Colonias de
Granocitos-Macrófagos (GM-CSF) o,
más precisamente, a partir de células cepas hematopoyéticas (CD34+)
por cultivo en presencia de una combinación de citoquinas
(GM-CSF + TNF\alpha).
La obtención de células dendríticas a partir de
precursores monocitos está ilustrada por ejemplo por Romani et
al. (J. Exp. Med. 180 (1994) 83), Sallusto et al. (J.
Exp. Med. 179 (1994) 1109), Inaba et al. (J. Exp. Med. 175
(1992) 1157) o también Jansen et al. (J. Exp. Med. 170 (1989)
577). Estas metodologías descansan esencialmente en la extracción
de células mononucleadas en la sangre y la puesta en cultivo en
presencia de diferentes combinaciones de citoquinas. Un
procedimiento particular consiste en tratar los precursores
monocitos de la sangre en presencia de combinaciones de citoquinas
tales como la Interleucina-4 +
GM-CSF o Interleucina-13 +
GM-CSF por ejemplo. Esta técnica está también
ilustrada por Mayordomo et al., 1995. Por otra parte, es
también posible tratar los precursores monocitos por unos agentes
farmacológicos de diferenciación celular tales como unos
activadores de canales
cálcicos.
cálcicos.
Otra aproximación para la obtención de células
dendríticas consiste en aislar, a partir de muestras biológicas,
unas células dendríticas ya diferenciadas. Esta aproximación ha sido
descrita por ejemplo por Hsu et al. (Nature Medicine 2
(1996) 52). La metodología descrita por este equipo consiste
esencialmente en recolectar unas muestras de sangre periférica y en
tratarlas por diferentes gradientes y centrifugaciones de manera que
se extraigan de las mismas las células dendríticas.
La metodología descansa en la producción de
células dendríticas a partir de precursores monocitos o de médula
ósea. Estas metodologías están ilustradas en los ejemplos. Más
particularmente, se ha preferido utilizar en el marco de la
presente invención unas células dendríticas obtenidas por
tratamiento de precursores monocitos (contenidos en la sangre o en
la médula) en presencia de una combinación
GM-CSF+IL-4 o
GM-CSF+IL-13).
Por otra parte, para la realización de la
presente invención, es muy particularmente ventajoso utilizar una
población de células dendríticas que comprenden unas células
dendríticas inmaduras. Ventajosamente, se utiliza una población de
células dendríticas compuesta principalmente (es decir, por lo menos
60%, preferentemente 70%) de células dendríticas inmaduras. El
estado inmaduro de las células dendríticas corresponde a una fase
precoz de su desarrollo, en la cual presentan una gran actividad
endocítica y expresan unos niveles bajos de moléculas de clase I y
II del CMH y de moléculas de coestimulación linfocitaria en su
superficie. De manera sorprendente, los inventores han encontrado
en efecto que solamente las células dendríticas inmaduras eran
capaces de producir unas vesículas membranarias en cantidad
significativa. Este descubrimiento es tanto más sorprendente puesto
que las células dendríticas en fase inmadura son conocidas por su
baja capacidad para estimular los linfocitos T, y por tanto por su
baja actividad biológica (Cella, Nature, Londres, 388 (1997)
782).
La primera etapa del procedimiento de la
invención puede por tanto comprender ventajosamente la preparación
de una población de células dendríticas que comprenden unas células
dendríticas inmaduras, en particular a partir de precursores
monocitos, más particularmente por tratamiento con una combinación
de citoquinas tales como
GM-CSF+IL-4 o
GM-CSF+IL-13.
Por otra parte, es también posible utilizar en
el marco de la presente invención, unas poblaciones de células
dendríticas inmortalizadas. Puede tratarse de progenies de células
dendríticas inmortalizadas (progenie D1 utilizada en los ejemplos,
o cualquier otra progenie producida por ejemplo por introducción del
oncógeno myc en las células dendríticas). Puede también tratarse de
células dendríticas preparadas y después inmortalizadas in
vitro. El interés de células dendríticas inmortalizadas reside
en la constitución de bancos de células sensibilizadas para unos
grupos de antígenos dados, utilizables industrialmente para preparar
unos dexosomas susceptibles de ser administrados a unas familias
enteras de pacientes.
Cuando se preparan las células dendríticas, las
mismas pueden ser mantenidas en cultivo, purificadas aún más,
almacenadas o utilizadas directamente en las etapas siguientes del
procedimiento.
\newpage
Los dexosomas pueden ser preparados a partir de
células dendríticas no cargadas de antígenos, es decir, que no
comprenden antígenos determinados en sus membranas o en su citosol.
Dichos dexosomas se designan entonces "nativos" o
"vírgenes".
Según un modo preferido de realización, los
dexosomas de la invención son sin embargo preparados a partir de
células dendríticas sensibilizadas para un antígeno o para un grupo
de antígenos. En este modo de realización, los dexosomas son, en
efecto, a su vez portadores de dicho o de dichos antígenos y son así
capaces de inducir una respuesta en contra de éstos.
Se pueden utilizar diferentes técnicas para
sensibilizar las células dendríticas para unos antígenos. Estas
técnicas han sido mencionadas más arriba y comprenden en
particular:
- -
- la puesta en contacto de las células dendríticas con unos péptidos antigénicos ("peptide pulsing"). Esta aproximación consiste en incubar las células dendríticas, durante un tiempo variable (generalmente de 30 minutos a 5 horas aproximadamente) con uno o varios péptidos antigénicos, es decir, con un péptido salido de un antígeno, tal como podría resultar del tratamiento de dicho antígeno por una célula presentadora del antígeno. Este tipo de aproximación ha sido descrita por ejemplo para unos péptidos antigénicos del virus HIV, de la influenza o de HPV o para unos péptidos derivados de los antígenos Mut1, Mart, Her2 o Neu por ejemplo (Macatonia et al., J. Exp. Med. 169 (1989) 1255; Takahashi et al., Int. Immunol. 5 (1993) 849; Porgador and Gilboa, J. Exp. Med. 182 (1995) 255; Ossevoort et al., J. Immunother. 18 (1995) 86; Mayordomo et al., citado; Mehta-Damani et al., J. Immunol. (1994) 996). Es también posible incubar las células dendríticas con un eluado peptídico ácido de una célula tumoral según la metodología descrita por Zitvogel et al. (1996, citado);
- -
- la puesta en contacto de las células dendríticas con uno o varios antígenos ("antigen pulsing"). Esta aproximación consiste en incubar las células dendríticas no con uno o varios péptidos antigénicos, sino con el o los antígenos intactos. El interés de esta técnica reside en el hecho de que el antígeno será transformado en péptidos antigénicos por los mecanismos naturales de la célula dendrítica, de manera que los péptidos antigénicos que resultan y presentados por la célula dendrítica deberían proporcionar una mejor inmunogenicidad. Esta aproximación ha sido ilustrada por ejemplo por Inaba et al. (J. Exp. Med. 172 (1990) 631) o por Hsu et al., (Nature Medicine 2 (1996) 52).
- -
- La puesta en contacto de las células dendríticas con uno o varios complejos proteínicos antigénicos. Esta aproximación es similar a la anterior pero puede permitir mejorar la eficacia de transformación y/o de presentación del antígeno. En particular, el antígeno puede ser utilizado en forma soluble o complejada con unos elementos de apuntado, que permiten en particular apuntar unos receptores membranarios como los receptores de la manosa o los receptores de inmunoglobulinas (Rfc). Es también posible hacer el antígeno particular de manera que mejore su penetración o también su fagocitosis por las células.
- -
- La puesta en contacto de las células dendríticas con unas células o membranas de células que expresan unos antígenos o péptidos antigénicos. Esta técnica descansa en la transferencia directa de antígenos o péptidos antigénicos por fusión de células o de membranas celulares. Esta aproximación ha sido ilustrada por ejemplo por la fusión entre unas células dendríticas y unas membranas de células tumorales (Zou et al., Cancer Immunol. Immunother. 15 (1992) 1).
- -
- La puesta en contacto de las células dendríticas con unas vesículas membranarias que contienen unos antígenos o péptidos antigénicos (en particular unos exosomas de células tumorales tales como los descritos anteriormente). Esta aproximación de sensibilización de las células dendríticas que utilizan unos exosomas, tal como la puesta en evidencia en la presente invención, es particularmente ventajosa en la medida en que no necesita el conocimiento de los antígenos particulares y en la que los péptidos antigénicos cargados están en una conformación nativa. Esta tecnología está ilustrada en los ejemplos.
- -
- La puesta en contacto de las células dendríticas con unos liposomas que contienen unos antígenos o péptidos antigénicos (Nair et al., J. Exp. Med. 175 (1992) 609).
- -
- La puesta en contacto de las células dendríticas con unos ARN que codifican para unos antígenos o péptidos antigénicos, (ver Boczkowsky et al., 1996, citado).
- -
- La puesta en contacto de las células dendríticas con unos ADN que codifican para unos antígenos o péptidos antigénicos (eventualmente incorporados en unos vectores de tipo plasmídico, viral o químico). Así, un modo de sensibilización de las células dendríticas consiste por ejemplo en infectar las células dendríticas con un virus contra el cual se busca una protección. Este ha sido descrito por ejemplo para el virus de la Influenza (Bhardwaj et al., J. Clin. Invest. 94 (1994) 797; Macatonia et al., citado). Otra aproximación consiste en suministrar, por medio de un virus u otros vectores de transferencia de ácidos nucleicos, un ADN que codifica para el o los antígenos o péptidos antigénicos de interés. Dicha aproximación ha sido ilustrada por ejemplo por Arthur et al. (Cancer Gene Therapy, 1995) o por Alijagie et al. (Eur. J. Immunol. 25 (1995) 3100). Algunos virus tales como los adenovirus, los AAV o los retrovirus parecen poder ser utilizados a este fin para suministrar un ácido nucleico en una célula dendrítica.
\vskip1.000000\baselineskip
Unas técnicas preferidas en el marco de la
presente invención son los procedimientos de sensibilización que
utilizan unas vesículas membranarias (de tipo exosoma), unos
péptidos antigénicos, unos vectores, unos ARN o unos eluados
peptídicos ácidos de tumor (EPA). La utilización de vesículas
membranarias así como el "peptide pulsing" y el procedimiento
EPA están ilustrados en los ejemplos y son muy particularmente
preferidos.
Cuando las poblaciones de células se han
obtenido y eventualmente sensibilizado para uno o varios antígenos,
pueden prepararse los dexosomas.
Esta preparación comprende una primera etapa,
facultativa, de tratamiento de las células, seguida de una segunda
etapa de aislamiento de los dexosomas.
La primera etapa de tratamiento de las células
resulta de la puesta en evidencia por los inventores de que la
producción de los dexosomas por las células dendríticas es un
fenómeno regulado. Así, en ausencia de tratamiento las cantidades
de dexosomas producidas son relativamente bajas. En particular,
cuando se utiliza una población de células dendríticas maduras no
previamente estimuladas, la producción de dexosomas es prácticamente
indetectable. Los inventores han demostrado por tanto que la
producción de dexosomas era esencialmente dependiente del tipo de
células dendríticas y de la utilización de un tratamiento de estas
células. Son estos elementos previos que permiten obtener unos
dexosomas que tienen propiedades ventajosas, en cantidades
significativas para un uso industrial. Un tratamiento de las
células dendríticas es por tanto ventajosamente realizado de manera
que se estimule la producción de dexosomas por estas células. Este
tratamiento estimulante puede ser realizado o bien por cultivo de
las células en presencia de ciertas citoquinas, o bien por
irradiación de las células, o bien disminuyendo el pH del cultivo,
o bien combinando estos diferentes tipos de tratamiento.
En el primer modo de realización, las células
dendríticas son incubadas en presencia de una citoquina seleccionada
preferentemente de entre el interferón gamma (IFN\gamma), la
interleucina-10 (IL-10) y la
interleucina-12 (IL-12),
preferentemente el interferón gamma y la IL-10. Como
se ha ilustrado en los ejemplos, estas citoquinas parecen ejercer
un efecto estimulante bastante pronunciado sobre la producción de
dexosomas (factor 3 a 5). Además, de forma sorprendente, ningún
efecto estimulante ha sido observado en presencia de las citoquinas
siguientes: IL-1\beta, IL-2,
IL-4, IL-6 e IL-15,
y un efecto inhibidor ha sido incluso observado en presencia de
lipopolisacárido (LPS) o de TNF\alpha, que se describen sin
embargo como que estimulan la maduración de las células
dendríticas. Estos resultados muestran por tanto (i) el carácter
regulado de la producción de dexosomas y (ii) el efecto específico
de ciertas citoquinas sobre esta producción. Estos resultados
ilustran además el interés sorprendente de utilizar unas células
dendríticas inmaduras, y la utilización, en la etapa de
estimulación, de citoquinas que inducen un estado inmaduro de las
células, tales como la IL-10 en particular. En este
modo de realización las citoquinas se utilizan a unas dosis
adaptables por el experto en la materia en función (i) de la
citoquina, (ii) de la población celular y (iii) de la realización
eventual de otros tratamientos. Queda entendido que las citoquinas
son preferentemente utilizadas a unas dosis subtóxicas. Las dosis de
interleucina están generalmente comprendidas entre 1 y 100 ng/ml,
preferentemente entre 1 y 50 ng/ml. El interferón puede ser
utilizado a unas dosis comprendidas entre 1 y 500 UI/ml,
preferentemente entre 5 y 200 UI/ml.
En el segundo modo de realización, las células
dendríticas son sometidas a una irradiación. Los resultados
presentados en los ejemplos muestran en efecto que una irradiación
de las células permite también aumentar los niveles de producción
de dexosomas. La irradiación se efectúa generalmente entre 1000 y
5000 rads, preferentemente entre 2000 y 4000 rads, ventajosamente
alrededor de 3000 rads.
La segunda etapa comprende el aislamiento de los
dexosomas. Esta etapa tiene por objeto separar los dexosomas de las
células dendríticas y/o del medio de cultivo. Esta etapa permite en
particular obtener una composición enriquecida en dexosomas y
esencialmente desprovista de células intactas. Preferentemente, esta
etapa conduce a una composición que comprende 70% por lo menos de
dexosomas, preferentemente 85% por lo menos.
El aislamiento de los dexosomas puede realizarse
según diferentes técnicas de separación de materiales biológicos.
Como se ha descrito anteriormente para los texosomas de células
tumorales, esas técnicas pueden estar basadas en las diferencias de
tamaño, de masa, de carga o de densidad de los dexosomas.
Así, los dexosomas pueden ser aislados por
centrifugación del medio de cultivo o del sobrenadante de cultivo o
de fracciones membranarias o de lisados de células dendríticas.
Puede tratarse por ejemplo de una centrifugación diferencial y/o de
una centrifugación en gradiente de densidad, seguido(s) de
una recuperación de la o de las fracción(es)
que contiene(n) dichos dexosomas. Este tipo de metodología descansa en la separación, por centrifugaciones sucesivas, de las vesículas membranarias por una parte y de las células, residuos celulares, vesículas internas, etc., por otra parte. En este modo particular de realización, la fracción que comprende los dexosomas es generalmente la obtenida después de ultracentrifugación a 100.000 g. Este procedimiento está ilustrado en particular en los ejemplos 1 y 8.
que contiene(n) dichos dexosomas. Este tipo de metodología descansa en la separación, por centrifugaciones sucesivas, de las vesículas membranarias por una parte y de las células, residuos celulares, vesículas internas, etc., por otra parte. En este modo particular de realización, la fracción que comprende los dexosomas es generalmente la obtenida después de ultracentrifugación a 100.000 g. Este procedimiento está ilustrado en particular en los ejemplos 1 y 8.
\newpage
La etapa de aislamiento de los dexosomas puede
también ser realizada por cromatografía, electroforesis y/o
nanofiltración.
Puede tratarse ventajosamente de una
electroforesis en fase fluida y/o en gradiente de densidad. La
electroforesis en fase fluida, que permite la separación de
materiales biológicos según su carga, es totalmente ventajosa. El
ejemplo 11 que sigue muestra en efecto que esta técnica puede ser
ventajosamente utilizada para el aislamiento de exosomas con buenos
rendimientos. Esta técnica es por otra parte particularmente
ventajosa en el plano industrial.
Puede también tratarse de una purificación por
cromatografía. Se pueden citar en particular las cromatografías de
intercambio de iones, de permeación de gel (o de exclusión) o la
cromatografía hidrófoba. Teniendo en cuenta la naturaleza lipídica
de los exosomas, la cromatografía de intercambio de iones es
particularmente interesante. La nanofiltración puede ser realizada
según las técnicas conocidas, a partir de un sobrenadante de
células.
El recurso a unas técnicas de la cromatografía
y/o de la electroforesis y/o de nanofiltración constituye otro
aspecto importante de la presente invención, puesto que permite, con
respecto a las tecnologías corrientes, una producción de calidad
mejorada, en cantidades adaptadas a un uso industrial (en particular
farmacológico).
A este respecto, la invención se refiere
asimismo a un procedimiento de preparación de vesículas membranarias
que comprende por lo menos una etapa de separación por
electroforesis, cromatografía o nanofiltración. Este procedimiento
está más particularmente adaptado para la preparación de vesículas
membranarias de tipo exosoma, tales como los texosomas o los
dexosomas. En este procedimiento, la etapa de separación por
electroforesis o cromatografía puede ser realizada directamente
sobre un sobrenadante de cultivo, un lisado celular, o una
preparación prepurificada. La electroforesis es más preferentemente
una electroforesis en fase fluida.
Los dexosomas presentan unas propiedades
destacables que están ilustradas en los ejemplos. Así, los dexosomas
estimulan la proliferación de linfocitos T citotóxicos in
vitro. Además, in vivo, los dexosomas son capaces de
bloquear el crecimiento tumoral. Estas vesículas son por tanto
capaces de presentar de forma muy eficaz, en asociación con unas
moléculas del CMH de clase I y de clase II, unos antígenos de
interés. Los dexosomas presentan por tanto numerosas aplicaciones,
en el campo del cáncer, de las enfermedades infecciosas o
parasitarias por ejemplo. Además, a unas dosis elevadas
(susceptibles de inducir una tolerancia), los dexosomas pueden
también ser utilizados en el tratamiento de patologías tales como la
alergia, el asma o las enfermedades autoinmunes. Además, los
dexosomas "nativos" pueden también ser utilizados como
adyuvante para estimular y/o modular una respuesta inmunitaria.
La invención tiene asimismo por objeto la
utilización:
- -
- de texosomas tales como los definidos anteriormente, para la estimulación y eventualmente la amplificación in vitro de linfocitos T específicos de antígenos contenidos en los mencionados texosomas, o
- -
- de linfocitos B, y en particular para la estimulación y la amplificación in vitro de linfocitos T.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se refiere asimismo a la
utilización de texosomas tales como los definidos anteriormente,
para la selección ex vivo de un repertorio de linfocitos T,
susceptibles de reconocer unos antígenos específicos contenidos en
los mencionados texosomas.
La invención tiene asimismo por objeto un
medicamento que comprende, a título de sustancia activa, por lo
menos un texosoma tal como el definido anteriormente, en asociación
con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Ventajosamente, la invención se refiere a un
medicamento tal como el definido anteriormente para una utilización
en el tratamiento de los cánceres, enfermedades infecciosas o
parasitarias.
Más preferentemente, el medicamento comprende
unos texosomas tales como los definidos anteriormente.
Según otro modo de realización, la invención se
refiere a un medicamento tal como el definido anteriormente para
una utilización en el tratamiento de las patologías de tipo alergia,
asma o enfermedad autoinmune.
Como forma galénica apropiada, los texosomas
pueden estar contenidos en suero fisiológico, en una ampolla o
cualquier otro medio apropiado (jeringa, bolsa, etc.). Pueden ser
preparados extemporáneamente o almacenados, por ejemplo en forma
congelada a -80ºC. Las soluciones utilizadas pueden estar compuestas
por soluciones salinas, eventualmente suplementadas con agentes
estabilizantes y/o adyuvantes. Los agentes estabilizantes pueden ser
en particular unas proteínas o moléculas de alto peso molecular. Se
puede citar más particularmente unas proteínas tales como la
sero-albúmina humana, o unas moléculas tales como el
dextrano o el poloxámero por ejemplo.
Las composiciones de la invención pueden
comprender asimismo o ser utilizadas en asociación con uno o varios
adyuvantes. El adyuvante puede ser más particularmente cualquier
agente farmacológico inmunoestimulante, tal como por ejemplo una
citoquina (en particular interleucina-12). Dichos
agentes son clásicamente utilizados en los protocolos clínicos o en
composiciones de vacunas. Por otra parte, el adyuvante según la
invención puede también ser un agente capaz de estimular la
producción de células dendríticas in vivo. Se puede citar a
título de ejemplo el compuesto Flt3. La utilización combinada de
este tipo de agente permite aumentar el número de células
dendríticas, y por tanto mejorar potencialmente la eficacia de las
composiciones de la invención.
Otro objeto de la invención se refiere por tanto
a una asociación de texosomas y de un adyuvante, con vistas a una
utilización simultánea, separada o espaciada en el tiempo.
Un modo de administración apropiado de los
medicamentos de la invención está constituido por unas inyecciones,
y en particular unas inyecciones intradérmicas o subcutáneas. Este
modo de administración está particularmente adaptado cuando la
sustancia activa del medicamento está constituida por unas células
dendríticas cargadas de texosomas o por unos dexosomas.
Las posologías apropiadas son de 0,01 a 10, y en
particular 0,10 a 5, aún más particularmente de 0,15 a 2 \mug/kg
de peso corporal, y de 10 \mug para las pruebas de reacción
intradérmicas.
Los medicamentos de la invención pueden ser
utilizados asimismo a razón de 100 \mug para los tratamientos de
vacunaciones profilácticas.
Los objetivos previstos por la utilización de
los medicamentos de la presente invención son:
- -
- la hipersensibilidad retardada (pruebas en los cancerosos), o
- -
- la terapia profiláctica, o
- -
- la utilización en el marco de la detección de la frecuencia de los precursores linfocitarios específicos citotóxicos o secretores de interferón por la técnica de dilución límite.
\vskip1.000000\baselineskip
Se trata de utilizar las células dendríticas
autólogas o alogénicas preincubadas con unos texosomas de la
invención, como dianas de linfocitos periféricos de sujetos
portadores del tumor, antes, durante y después del tratamiento
antitumoral (tratamiento clásico o inmunización activa
específica).
La invención se refiere asimismo a la
utilización de un texosoma tal como el definido anteriormente, para
la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de
tumores, en particular sólidos, ascíticos y hematopoyéticos.
Como tumores sólidos, se pueden citar: el cáncer
de riñón, de mama, de colon, de pulmón, de estómago, de hígado, los
melanomas, sarcomas, etc.
Como tumores hematopoyéticos, se pueden citar:
las leucemias, los linfomas malignos hodgkinianos o no
hodgkinianos.
La invención se refiere asimismo a la
utilización de un texosoma tal como el definido anteriormente, en el
marco de una prueba de hipersensibilidad retardada del cáncer o
también como herramienta de diagnóstico de búsqueda de frecuencia
de precursores específicos CTL citotóxicos.
La invención se refiere asimismo a la
utilización de un texosoma, o de una fracción o de un componente
constitutivo de un texosoma tal como el definido anteriormente para
la transferencia de material biológico a una célula in vitro
o para la preparación de un medicamento para transferir material
biológico a una célula in vivo.
La invención se refiere asimismo a la creación
de bancos de texosomas derivados de células tumorales de tipo
histológico común o diferente.
Éstos están compuestos por mezclas de texosomas
realizados a partir de progenies de células tumorales para un tipo
de cáncer dado. Estos bancos de texosomas pueden permitir
sensibilizar unas células presentadoras de antígeno, en particular
unas células dendríticas, contra todos los tumores de este tipo.
La invención se refiere asimismo a unas mezclas
de texosomas.
Se pueden citar por ejemplo unas mezclas de
texosomas para unos tumores genéticamente ligados (cáncer de mama y
de ovario) o que presentan unas mutaciones p53, p16 conocidas
(cáncer de mama, sarcoma).
Se pueden también mencionar unas mezclas de
texosomas tumorales con unas vesículas que provienen de células
inmortalizadas y transfectadas para expresar unas moléculas de
coestimulación, unas moléculas de adhesión, unas quimioquinas
atrayentes (diferentes de las expresadas sobre los texosomas).
La presente invención será descrita con mayor
detalle con la ayuda de los ejemplos siguientes, que deben ser
considerados como ilustrativos y no limitativos.
Tabla 1. Las células de progenies tumorales han
sido incubadas durante 24 horas a una densidad de un millón de
células por mililitro. Los texosomas han sido preparados a
continuación (ver ejemplo) a partir de los medios de cultivo por
ultracentrifugación diferencial. La concentración de proteínas
texosomales es medida por el test de Bradford (Bio Rad Protein
Assay [BioRad].
MZ-2 se describe en Traversari
et al., (1992)
Los * significan que las diferentes progenies
primarias han sido establecidas y caracterizadas en el laboratorio
de biología clínica del Institut Gustave Roussy y son accesibles
bajo demanda.
Figuras 1A y 1B. Morfología de los endosomas
multivesiculares y de los texosomas derivados de las células
TS/A.
A. Secciones ultrafinas de las células TS/A
analizadas por microscopía electrónica. Detalle del citoplasma que
muestra un compartimento endosomal que contiene vesículas de
60-80 nm de diámetro.
B. Preparación de texosomas de células TS/A
analizadas en microscopía electrónica por la técnica sobre vesícula
intacta (Raposo et al. (1996)). Las preparaciones de
texosomas contienen una población mayoritaria de vesículas de
60-80 nm de diámetro, de tamaño y morfología
similares a las vesículas internas de los endosomas
multivesiculares mostrados en A.
Figura 2. Presencia de diferentes marcadores en
los texosomas de células tumorales.
A. Dos microgramos de proteínas texosomales
(Exos) o 2x10^{5} células tumorales han sido analizadas por
Western Blot con la ayuda de anticuerpos monoclonales específicos
de: moléculas de clase I del CMH (Machold Robert P. et al.
(1995) "Peptide Influences the Folding and Intracellular Tansport
of Free Major Histocompatibility Complex Class I Heavy Chains"
J. Exp. Med. 181: 1111-1122), receptor de la
transferrina (TfR) (estando el anticuerpo correspondiente H68.4
descrito en Biochimica et Biophysica Acta (1992) 1136(1):
28-34), Lamp 1 y 2 (rat anti-mouse
monoclonal antibodies, Pharmigen) y Calnexine (Hebert Daniel N.
et al. (1995) "Glucosa Trimming and Reglucosylation
determine Glycoproteine Association with Calnexin in the Endoplasmic
Reticulum" Cell 81: 425-433).
B. Diez microgramos de proteínas texosomales de
una progenie de células de melanoma (FON) o 10 \mum de proteínas
totales de las mismas células han sido analizados por Western Blot
con la ayuda de un anticuerpo
anti-MART-1 (Marincola F. et
al. (1996) "Analysis of expression of the melanoma associated
antigens" MART-1 and gp100 in metastatic
melanoma cell lines and "in situ lesions" Journal of
Immunotherapy 19:192-205.
C. Las proteínas texosomales de una progenie de
células de melanoma (FON) o las proteínas totales de las mismas
células han sido analizadas por Western Blot con la ayuda de un
anticuerpo anti-HSP70.
D. Las proteínas texosomales de una progenie de
células de melanoma (FON) o de la progenie MZ-2 han
sido analizadas por Western Blot con la ayuda de un anticuerpo
anti-gp96.
Figura 3. Los texosomas derivados de una
progenie tumoral MART-1 positiva (FON) estimulan un
clon T específico de MART-1.
Veinte mil células del clon T LT8 (o LT12,
resultados no representados) han sido incubadas con unos texosomas
derivados de FON (progenies de células MART-1 y
HLA-A2 positiva), o de GIAM (células de una progenie
de nefroma, MART-1 negativo) como control negativo
durante 48 h. La producción de TNF\beta por las células del clon
T ha sido medida por ensayo biológico con las células WEHI (Espavik
et al.). Los texosomas inducen la producción de IFN\gamma
por el clon T, revelando así la presencia de complejos
HLA-A2/péptido derivados de MART-1
en la superficie de los texosomas.
- -
- "LT8 + TexGIAM" corresponde a unos clones T LT8 incubados en presencia de texosomas derivados de células tumorales GIAM;
- -
- "LT8 + TexFON" corresponde a unos clones T LT8 incubados en presencia de texosomas derivados de células tumorales FON;
- -
- "LT8 + TumFON" corresponde a unos clones T LT8 incubados en presencia de texosomas derivados de células tumorales FON;
\vskip1.000000\baselineskip
En abscisas, se han representado las células
acondicionadas y en ordenadas la cantidad producida de TNF\beta
(pg/ml).
Figura 4. Los texosomas de células P815 que
expresan el \betaGal estimulan unos esplenocitos de ratones
inmunizados por unos adenovirus \betaGal recombinantes.
Unos esplenocitos (10^{5}) de ratones BALB/c
inmunizados 2 meses antes con 10^{6} pfu adenovirus recombinante
\betaGal que han rechazado un tumor que expresa \betaGal han
sido incubados con los texosomas derivados de las células P815
(cuadrados vacíos \lozenge) o unas células
P815-\betaGal (cuadrados llenos \blacksquare).
Los esplenocitos no incubados en texosomas dan el ruido de fondo
simbolizado por unos puntos macizos (\bullet). Después de 5 días
de cultivo, 1 \muCi de timidina tritiada ha sido añadido por
pocillo de cultivo. La incorporación de tritio en el ADN celular ha
sido medida 18 h más tarde. Los resultados significativamente
diferentes según el procedimiento exacto de Fisher están marcados
*.
En abscisas, se ha representado la cantidad de
texosomas derivados de las células tumorales P815 (\mug/ml) y en
ordenadas los golpes por minuto (CPM).
Figura 5. El antígeno tumoral
MART-1 contenido en unos texosomas puede ser
presentado a los linfocitos T por unas células dendríticas.
Unos texosomas con dosis crecientes derivadas de
las progenies de células tumorales FON (MART-1+,
HLA-A2+, A1-) y MZ2 (MART-1+,
HLA-A2-, A1+) han sido incubadas con los clones
(20.000 células por pocillo de 96 microplacas) T LT12 (específico
de HLA-A2/péptido de MART-1) en
presencia de células dendríticas HLA-A2+ derivadas
de macrófagos circulantes (DCA2) (Sallusto, F. y Lanzavecchia A.,
1994, Efficient presentation of soluble antigen by cultured human
dendritic cells is maintained by GMCSF et IL-4 and
down regulated by TNF\alpha. J. Exp. Med.
179:1109-1118). La secreción de IFN\gamma
representada en ordenadas (pg/ml) ha sido medida en los
sobrenadantes de cultivo después de 2 días. Los texosomas derivados
de FON, así como los derivados de MZ2, han inducido la secreción de
IFN\gamma por LT12 y LT8 (resultados no representados). Las
células FON han inducido también una fuerte secreción de
IFN\gamma por los clones T, mientras que las células MZ2, que no
expresan el haplotipo de molécula HLA adecuada
(HLA-A2) no han inducido producción de
IFN\gamma.
- -
- "LT12+DCA2" corresponde a unos clones T LT12 incubados en presencia de células dendríticas HLA-A2+;
- -
- "LT12+DCA2+TexFON" corresponde a unos clones T LT12 incubados en presencia de células dendríticas cargadas de texosomas derivados de células tumorales FON.
- -
- "LT12+DCA2+TexMZ2" corresponde a unos clones TL12 incubados en presencia de células dendríticas cargadas de texosomas derivados de células tumorales MZ2.
\vskip1.000000\baselineskip
Figuras 6A y 6B. Efectos antitumorales de los
texosomas in vivo.
Cien mil células tumorales TS/A han sido
inyectadas por ratón BALB/c (A) o Nude (B). Tres días más tarde,
cada ratón ha recibido dos inyecciones sucesivas, con 24 h de
intervalo (representadas por J3 y J4 en la figura), de 20 \mug a
30 \mug de texosomas en intradérmica. El tamaño de los tumores ha
sido medido a continuación dos veces por semana. Los análisis
estadísticos se han realizado por el procedimiento exacto de Fisher
(la significatividad al 95% está indicada por *).
A. Dos grupos de 5 ratones han recibido unos
texosomas derivados de TS/A (triángulos macizos) o de MCA38
(triángulos vacíos \Delta) (una progenie de células de
adenocarcinoma de colon derivado de un ratón C57BL/6), como control
negativo. Solamente los texosomas derivados de TS/A tienen un efecto
antitumoral in vivo.
B. Dos grupos de ratones Nude han recibido en
paralelo las mismas dosis de las mismas preparaciones de texosomas
(\blacksquare: exosomas de TS/A; \boxempty: exosomas de
MC38).
No se ha observado ningún efecto antitumoral
sobre los ratones Nude. Los linfocitos T son por tanto necesarios
para los efectos antitumorales de los texosomas in vivo.
En abscisas, se han indicado los días y en
ordenadas el tamaño medio del tumor (mm^{2}).
Figura 7. Unas células dendríticas derivadas de
médula ósea sensibilizadas por los texosomas derivados de células
tumorales inducen la erradicación total in vivo de tumores
sólidos establecidos.
Quinientas mil células tumorales P815 han sido
inyectadas en el flanco derecho de los ratones DBA/2 10 días antes
del tratamiento. El tratamiento ha consistido en una sola inyección
de texosomas (10 \mug/ratón) en el mismo flanco, pero a distancia
del tumor. Otro grupo ha sido inyectado en intravenoso por unas
células dendríticas (derivadas de médula ósea por tratamiento
durante 5 días en GM-CSF+IL4 (Mayordomo et
al., 1995), incubadas previamente durante 3 h con los texosomas
de P815. Los tumores han sido medidos y los resultados analizados
como se ha descrito en la figura 6. Los texosomas de P815 han
sensibilizado las células dendríticas para inducir el rechazo de
los tumores establecidos. Los microsomas no han tenido efecto
significativo sobre el crecimiento tumoral. La inserción muestra el
porcentaje de ratón sin tumor (en ordenadas), la barra maciza
corresponde únicamente a los grupos de animales de tipo cuadrados
macizos, y la abscisa corresponde a los días. Estos ratones no han
desarrollado tumor después de reinyección del doble de la dosis
tumoral mínima, que muestra que habían desarrollado una inmunidad
antitumoral. Los símbolos utilizados en la figura son los
siguientes:
\ding{109}: células dendríticas incubadas con
unos texosomas testigos,
\blacksquare: células dendríticas incubadas
con unos texosomas P815, triángulos macizos: texosomas P815 en
intradérmica,
X: animales no tratados.
En abscisas, se han indicado los días y en
ordenadas el volumen medio del tumor.
Figuras 8A, 8B y 8C. Unos agentes
quimioterapéuticos/citotóxicos y la irradiación pueden estimular la
exocitosis de los texosomas tumorales.
La leucemia murina L1210 y la progenie de cáncer
de riñón primitivo humano GIAM han sido utilizadas (figura 8C). Dos
millones de células tumorales han sido incubadas en presencia de
cantidades crecientes de 5 Fu (para L1210) o de cisplatino (CDDP)
(para GIAM) por ml durante 16 horas.
El sobrenadante ha sido recuperado, y después ha
constituido el objeto de ultracentrifugaciones diferenciales como
se ha descrito en la Tabla I.
GIAM ha sido también incubado en
IL-2 1000 Ui/ml, o en dexametasona (10^{-6} M), o
irradiado a 10.000 rads.
Las altas dosis de quimioterapia y la
irradiación son buenos ejemplos de regulación positiva de exocitosis
de los texosomas en estos modelos tumorales. Los resultados han
sido encontrados de nuevo en otros tumores también (figuras 8A y
8B); en particular, la irradiación parece ser el estímulo de
exocitosis más potente.
La figura 8A corresponde al melanoma FON antes
descrito y la figura 8B corresponde a un linfoma murino designado
por EL4 (J. Nat. Ins. (1972) 48:
265-271).
En la figura 8A, se han representado las células
FON incubadas en diferentes condiciones:
- 1)
- CM: medio de cultivo de base (RPMI que contiene 10% de suero de ternera fetal),
- 2)
- DXM = en presencia de dexametasona,
- 3)
- irradiación: irradiado a 10.000 rads,
- 4)
- sin suero,
- 5)
- IL-10 = en presencia de IL-10, a razón de 10 ng/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Las irradiaciones anteriores son válidas también
para las células EL4, L1210 y GIAM.
Figuras 9A, 9B y 9C. las vesículas membranarias
(dexosomas) producidas por las células dendríticas sensibilizadas
para unos antígenos tumorales de melanomas son eficaces para
estimular los linfocitos T específicos de estos melanomas, y su
producción está regulada por las citoquinas.
- -
- LY8 (CM) corresponde a los clones T LT8 incubados en medio de cultivo de base como se ha definido en la figura 8A,
- -
- DexTexNUN corresponde al dexosoma derivado de células dendríticas cargadas de texosoma que proviene de células tumorales NUN,
- -
- DexTexFON corresponde al dexosoma derivado de células dendríticas cargadas de texosoma que proviene de células tumorales FON,
- -
- TumFON corresponde a las células tumorales FON.
A. Ensayos de proliferación: los texosomas Fon
(utilizados figura 3) han sido incubados con unas células
dendríticas HLA-A2 durante 3 horas, después lavados
en solución salina al 9%, y después incubados en medio ácido pH 6.3
durante 18 horas. Las vesículas membranarias de células dendríticas
(dexosomas) son así recuperadas del sobrenadante de cultivo de las
mencionadas células dendríticas HLA-2.
Las vesículas membranarias que provienen de
células dendríticas cargadas con unos texosomas (DexTex) son
entonces incubadas con los clones LT8 específicos de
MART-1 presentados en el contexto
HLA-A2 (los texosomas Fon contienen el antígeno
MART-1). Como control negativo, han sido utilizados
los texosomas Nun (progenie de cáncer del riñón
HLA-A2 negativo, MART-1 negativo).
Como control positivo, se ha utilizado la progenie tumoral irradiada
FON (TumFON) o el anticuerpo anti-CD3, preabsorbido
sobre plástico (anti-CD3Ab). La incubación de los
DexTex con los clones LT8 dura 48 horas, y después 1 \muCi de
timidina tritiada es añadido por pocillo de 200 \mul. Las
proliferaciones linfocitarias LT8 son medidas 18 horas más
tarde.
En ordenadas, se han representado los golpes por
minuto.
B. Las mismas manipulaciones, pero el
IFN\gamma es medido en el sobrenadante de cultivo a 48 horas, por
ELISA. En ordenadas, se ha representado el contenido de IFN\gamma
(pg/ml).
C. Los dexosomas han sido aislados a partir de
sobrenadantes de células dendríticas después de 48 horas de
incubación en presencia o en ausencia de LPS (20 \mug/ml,
IFN\gamma (100 Ul/ml) o IL-10 (10 \mu g/ml).
Figura 10. Imágenes en microscopía
inmuno-electrónica de dexosomas. Los dexosomas
poseen un diámetro homogéneo comprendido entre 50 y 90 nm y están
marcados de forma intensa por unos anticuerpos
anti-CD63 (Figura 10A). La mayor parte de estos
dexosomas está también marcada por unos anticuerpos
anti-MHC-I (Página 15, Figura 10B)
y anti-MCH-II (Página 15, Figura
10C): Barras: 250 nm.
Figura 11. Medición de los niveles de interferón
gamma segregados por los linfocitos T incubados en presencia de
dexosomas cargados de péptidos o de dexosomas controlados. Las
células dendríticas (2x10^{6}/ml) han sido incubadas durante 3 a
12 horas, o bien en presencia de 10 \mug/ml del péptido antigénico
MART-1/MelanA_{(27-35)}, o bien
en presencia de 10 \mug/ml de péptido
gp100_{(280-288}) (control) en suspensión en el
ácido cítrico a pH 3,7, y después los dexosomas han sido aislados.
Las células del clon LT12 (clon de CTL HLA-A2
restringido, MART-1(27-35)
específico) han sido entonces incubadas (100.000 CTL por pocillo)
con unas dosis crecientes de dexosomas o de péptidos gp100
(control) en unas placas de 96 pocillos durante 5 días. La secreción
de interferón gamma por las células ha sido medida a continuación
por ELISA (Genzyme).
Figura 12. Análisis en Western Blot de los
marcadores presentes en los dexosomas (1,4 y 10 \mug) producidos
por unas células dendríticas derivadas de médula ósea:
H-2K (MHC-I),
I-A\alpha (MHC-II), CD86, CD63,
TfR (receptor de transferrina), Clx (Calnexina), li p31 (cadena
invariable).
Figura 13. Efecto antitumoral in vivo de
los dexosomas sobre un modelo de tumor de mastocitoma (P815).
Dex-H2d-AEP-P815:
Dexosomas derivados de células dendríticas de médula ósea cargadas
de eluado peptídico ácido del tumor P815.
Dex-H2d-AEP-Spleens:
Dexosomas derivados de células dendríticas de médula ósea cargadas
de eluado peptídico de ácido del bazo.
Figura 14. Efecto antitumoral in vivo de
los dexosomas derivados de células dendríticas de médula ósea
cargadas de eluado peptídico ácido de tumor sobre un modelo de tumor
mamario (TS/A). Leyendas: ver Figura 13. (A) Experimento realizado
sobre unos ratones inmunocompetentes. (B) Experimento realizado
sobre ratones Nude.
Figura 15. Test de liberación del cromo
radioactivo (51 Cr). Este test permite mostrar que los dexosomas de
la invención disparan una respuesta CTL específica in vivo.
Células diana: P815, progenie leucémica L1210, progenie YAC
insensible a las células NK.
Figura 16. Eficacia comparada de los dexosomas y
de las células dendríticas. Esta figura muestra que los dexosomas
son más potentes que las células dendríticas inmaduras de las cuales
derivan para erradicar unos tumores establecidos in vivo. 5
millones de células dendríticas cargadas de eluado peptídico ácido
del bazo (rombos vacíos) o del tumor P815 (triángulos vacíos) han
sido administradas por vía intravenosa o intradérmica a unos ratones
que presentan unos tumores establecidos P815 el día 8 a 10. En
paralelo, el sobrenadante de estas células ha sido recolectado
después de incubación 18 h con los péptidos del bazo (rombos vacíos)
o del tumor P815 (triángulos llenos), ultracentrifugado y
caracterizado para su contenido en dexosomas. 5 millones de células
dendríticas han permitido obtener de 5 a 10 \mug de dexosomas, que
han permitido la inmunización de 5 ratones por administración
intradérmica en el flanco ipsilateral. Una administración única de
dexosoma ha sido realizada en el día 8-10. El
tamaño de los tumores ha sido medido dos veces por semana y está
representado en la figura. Los (*) representan unos resultados
significativos al 95% según el procedimiento exacto de Fisher, en
comparación con las inyecciones de solución salina (cuadrados
vacíos) o de células dendríticas pulsadas. En el encarte están
representados los porcentajes de ratones inmunizados contra P815 que
muestran la ausencia total (desaparición) de tumor durante (día 21)
y al final (día 60) del experimento, en los diferentes grupos de 5
ratones.
Figura 17. Purificación de los dexosomas por
electroforesis en fase fluida.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra la capacidad de las células
tumorales para producir vesículas lipídicas.
Las células tumorales murinas o humanas que
provienen de leucemias o de tumores sólidos (riñón o melanoma del
colon) (ver tabla 1) han sido incubadas durante 24 h a una densidad
de un millón de células por mililitro. El medio de cultivo (RPMI
que contiene 10% de suero de ternera fetal) ha sido a continuación
liberado de las células por centrifugación a 300 g durante 10
minutos. Los desechos celulares han sido a continuación eliminados
por dos centrifugaciones sucesivas de 15 min, cada uno a 800 g (y
una centrifugación eventual de 30 minutos a 10.000 g). Los
texosomas son finalmente recogidos por centrifugación de 60 minutos
a 100.000 g, y después lavados una vez con PBS en las mismas
condiciones. La concentración de proteínas en las preparaciones de
texosomas ha sido medida por el procedimiento de Bratford (BioRad
Protein Assay [BioRad].
Todas las progenies tumorales ensayadas, humanas
y murinas (sólidas o hematopoyéticas, primarias o establecidas en
cultivo o que provienen de tumores frescos disociados), producen
unos texosomas (Tabla 1). Sin embargo, las eficacias de producción
son variables entre diferentes progenies. Las progenies de células
tumorales murinas producen entre 100 y 200 microgramos de proteínas
de texosomas por 50 millones de células en 24 horas. Las progenies
humanas de melanoma y de nefroma producen entre 10 y 100 microgramos
de proteínas de texosomas por 20 millones de células en 24
horas.
Con el fin de determinar si las vesículas
purificadas a partir de los sobrenadantes de las progenies de
células tumorales son de origen endocítico, se ha realizado un
estudio morfológico por microscopía electrónica de una de estas
progenies tumorales, TS/A (progenie de carcinoma mamario de ratón)
(Nanni P. et al. (1983) "TS/A: a new metastasizing cell in
the originate from a BALB/c sponteneous mammary adenocarcinoma"
Clin. Exp. Metastasis 1:373-380). Las
células tumorales han sido fijadas y aprestadas para la microscopía
electrónica como se ha descrito anteriormente. Los texosomas han
sido directamente depositados sobre las rejillas y analizados.
La figura 1A muestra unos ejemplos de
compartimentos intracelulares de aspecto multivesicular observados
en las células tumorales. Estos compartimentos endocíticos tienen
un diámetro de 200-300 nm (la barra en la parte
baja de los paneles A y B representa 200 nm) y están compuestos por
una membrana externa que rodea múltiples vesículas internas de
68-80 nm de diámetro. Las preparaciones de texosomas
contienen una población mayoritaria de vesículas
60-80 nm de diámetro (figura 1B), algunas veces
agregadas, y de morfología parecida a las vesículas internas de los
endosomas multivesiculares observados en el interior de las células
(Figura 1A). Estos resultados sugieren que los texosomas son
secretados en el medio extracelular después de la fusión de la
membrana externa de los endosomas con la membrana citoplásmica. En
efecto, dichos perfiles de exocitosis se observan en estas células
(datos no representados).
Con el fin de determinar si los texosomas son
efectivamente de origen endocítico, se ha efectuado a continuación
un análisis por Western Blot de los marcadores presentes definidos a
continuación en los texosomas derivados de progenies tumorales,
TS/A y P815 (mastocitoma proporcionados por T. Boon, Ludwig
Institute, Bruxelles, Bélgica) (mastocitoma murino). Para ello, se
han separado dos microgramos de proteínas de texosomas o el lisado
celular de 200.000 células TS/A por gel de poliacrilamida, y después
transferidos sobre una membrana de Nylon (Amersham). La presencia
eventual de diferentes marcadores ha sido revelada a continuación
con ayuda de anticuerpos específicos. Los texosomas de TS/A y de
P815 contienen unas moléculas de clase I del CMH, así como
diferentes marcadores de la vía endocítica (el receptor de la
transferrina, las glicoproteínas lisosomales Lamp 1 y 2) (figura
2A). Por el contrario, un marcador característico del Retículo
Endoplásmico (RE), la calnexina, no está presente en las
preparaciones de texosomas, demostrando que unas membranas del RE no
contaminan los texosomas.
Estos resultados muestran que los texosomas
secretados por las células tumorales corresponden a las membranas
internas de los endosomas multivesiculares. Ahora bien, estas
vesículas intraendosomales se forman por invaginación, y después
abotonado de la membrana externa de los endosomas hacia el interior
del endosoma. Estas vesículas intraendosomales, y en consecuencia
los texosomas, deberían contener una fracción de citosol. Esto es
particularmente importante en el marco de la inmunoterapia
antitumoral puesto que en cierto número de antígenos tumorales,
comprendido MART-1 (uno de los más estudiados), son
unas proteínas citosólicas. Se ha probado por tanto la presencia de
MART-1 en los texosomas.
Para ello, diez microgramos de proteínas de
texosomas o el lisado celular de 200.000 células de una progenie de
melanoma humano (M10) (T. Boon, Ludwig Institute, Bruxelles,
Bélgica) han sido analizados por Western Blot, como anteriormente.
La eventual presencia de MART-1 ha sido a
continuación revelada con la ayuda de anticuerpos específicos
anti-MART-1 (S. Rosenberg, NCI,
Bethesda, U.S.A.). Los texosomas secretados por la progenie tumoral
FON (melanoma del paciente FON que proviene de F. Faure, Institut
Pasteur, Paris, Francia) contienen el antígeno tumoral
MART-1. Unos experimentos de protección con la
proteinasa K (Sigma) han demostrado que el epítopo de
MART-1 reconocido por este anticuerpo monoclonal
está en el interior de los texosomas (resultados no
representados).
Esta primera parte del trabajo demuestra:
- -
- que las células tumorales producen y secretan unas vesículas,
- -
- que estas vesículas son unas vesículas de origen endosomal y comprenden una membrana externa donde se encuentran diferentes moléculas membranarias (clase I del CMH, diferentes marcadores de los endosomas),
- -
- que estas vesículas contienen una fracción de citosol, comprendidos unos antígenos tumorales citosólicos, como MART-1.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados han conducido a verificar las
actividades biológicas siguientes de las vesículas, designadas
texosomas.
Puesto que los texosomas llevan unas moléculas
de clase I en su superficie, se ha probado si son capaces de
estimular unos linfocitos T CD8. Se han utilizado dos clones T, LT8
y LT12 dados por Faure F., Institut Pasteur, Paris, Francia, que
reconocen un péptido derivado de MART-1 en
asociación con HLA-A2 (Dufour et al., 1997).
A este fin, puesto que las células tumorales FON son
HLA-A2, se han incubado las células de los clones T
LT8 o LT12 con unos texosomas preparados a partir de los
sobrenadantes de FON, o, a modo de control positivo, unas células
FON intactas. La activación de los linfocitos T ha sido medida por
la secreción de TNF\beta. Los texosomas de FON han inducido la
secreción de TNF\beta por LT8 y LT12 de una forma dosis
dependiente (Figura 3). Las células FON han inducido también una
secreción de TNF\beta, mientras que unos texosomas derivados de
células tumorales que no expresan MART-1 no lo hacen
(figura 3).
Por tanto, unos complejos
HLA-A2/péptido de MART-1 están
presentes en la superficie de los texosomas.
Unos resultados similares se han obtenido en el
ratón con unos linfocitos T de bazo de un ratón inmunizado por la
\beta-galactosidasa
(\beta-gal).
Se han producido unos texosomas a partir de
sobrenadantes de células de mastocitoma P815 o de células P815 que
expresan la \beta-gal (progenies de A. Albina,
Institut Gustave Roussy, Villejuif, Francia), o de células de otro
tumor (L1210) leucemia murina (H2\alpha) que no expresan la
\beta-gal, L210. Unas concentraciones crecientes
(0,3 \mug/ml a 20*g/ml) de estas diferentes preparaciones de
texosomas han sido a continuación incubadas durante 4 días con unas
células esplénicas de ratones inmunizados por la
\beta-gal expresada en un adenovirus
recombinante. Solamente los texosomas de células P815 (a la mayor
concentración de 20 \mug/ml) que expresan la
\beta-gal han inducido una proliferación
significativa (ver figura 4) (medida por la incorporación de
timidina tritiada), aunque poco fuerte, de las células esplénicas.
Estos resultados muestran que los texosomas producidos por las
células P815 que expresan la \beta-gal llevan en
su superficie unos complejos H2^{\alpha}/péptidos derivados de
\beta-gal que son capaces de activar unos
linfocitos T murinos.
A este fin, se han utilizado los clones T LT8 y
LT12 que reconocen específicamente un péptido derivado de
MART-1
(MART-1_{27-25=} AAGIGILTV, Dufour
E. et al., Diversity of the cytotoxic
melanoma-especific immune response. J. Immunol.
1997, 158: 3787-3795) en asociación con
HLA-A2. Se ha demostrado que los texosomas
producidos por la progenie de melanoma humano FON (que es
HLA-A2) contienen el antígeno tumoral
MART-1 (ver figura 2) y son capaces de activar los
clones LT8 y LT12. Con el fin de disponer de texosomas que contienen
también MART-1, pero incapaces de estimular
directamente los clones LT12 y LT8, se ha utilizado la progenie de
melanoma MZ2 (T. Boon, Ludwig Institute, Bruselas, Bélgica),
MART-1 positivo pero que expresa otro elemento de
restricción que HLA-A2 (HLA-A1 en el
ejemplo). En efecto, las células MZ2, así como los texosomas
derivados de estas células, no activan los clones LT8 y LT12
(resultados no representados), contrariamente a las células FON y a
los texosomas derivados de estas células (Figura 3). Por el
contrario, cuando estos mismos texosomas derivados de MZ2 son
incubados en presencia de células dendríticas que expresan
HLA-A2, se observa una estimulación de los clones T
LT12 y LT8, como en el caso de los texosomas derivados de FON
(figura 5).
En el caso de los texosomas derivados de MZ2, la
activación de los clones T no puede ser debida a unos complejos
HLA-A2/péptido derivados de MART-1
preexistentes, puesto que no expresan el elemento de restricción
adecuado (HLA-A2). Por consiguiente, sólo puede
tratarse del antígeno contenido en los texosomas que ha sido tomado
de nuevo por las células presentadoras de antígenos, degradado en
péptidos que se han asociado a continuación a las moléculas
HLA-A2 de la célula presentadora. Los texosomas
permiten por tanto la transferencia de un antígeno entre una célula
tumoral y una célula presentadora de antígenos. Los texosomas tienen
por tanto una función parecida a la de los "liposomas
naturales".
Finalmente, puesto que los texosomas son capaces
de estimular unos linfocitos T in vitro y de sensibilizar
unas células dendríticas para la activación de linfocitos T
específicos de tumores, se ha comprobado la actividad antitumoral
de los texosomas in vivo.
Para analizar dicha actividad antitumoral, se
han inyectado unos ratones con dos veces (10^{5}) la dosis
tumorígena mínima de células tumorales de un tumor mamario (células
TS/A de haplotipo H2^{d}, singénicas de células BALB/c) en el
flanco. Después de 3 ó 4 días, los animales que tienen unos tumores
establecidos han sido inyectados dos veces (días 3 y 4) con unos
texosomas preparados a partir de sobrenadantes de células TS/A o
como control negativo unos texosomas de células MC38 (S. Rosenberg,
NCI, Bethesda, U.S.A.) (célula tumoral de haplotipo H2^{b}) o un
volumen similar de PBS. El tamaño medio de los tumores en el grupo
de ratones inoculados con unas preparaciones de texosomas de TS/A
está muy disminuido en comparación con los grupos de ratones
control. Este efecto antitumoral es dependiente de las células T,
puesto que unos ratones Nude (ratones mutantes desprovistos de
linfocitos T) que llevan el tumor e inoculados de forma similar con
unas preparaciones de texosomas, no muestran disminución de la masa
tumoral (Figura 6B).
En esta misma serie de experimentos, se ha
observado un efecto antitumoral de los texosomas preparados a partir
de células de mastocitoma P815 de haplotipo H2^{d} lo que permite
pensar que estos dos tumores expresan unos antígenos comunes. Se
han obtenido unos resultados similares con otro modelo tumoral muy
inmunogénico, el mastocitoma P815 (singénico de ratón DBA/2 y de
haplotipo H2^{d}). En este modelo, se ha demostrado que unos
texosomas inyectados en intradérmica en el flanco de un ratón que
lleva un tumor (P815) establecido al 10º día (tumor que mide
80-100 mm^{2}) tiene capacidad de conducir a la
erradicación del tumor en más del 60% de los casos. Además, estos
ratones muestran una inmunidad antitumoral a largo plazo (resultados
no representados). En esta serie de experimentos, se han observado
unos efectos antitumorales de texosomas preparados a partir de
linfocitos L1210 aislados a partir de una leucemia murina de
haplotipo H2^{d} y de células TS/A, lo que indica que existen
también unos epítopos comunes entre estos tres tumores (entre P815 y
TS/A, p53 mutada es común a los dos tumores).
Dos mecanismos podrían ser la base del efecto
antitumoral de los texosomas.
En principio, una vez inyectados, los texosomas
podrían activar directamente los linfocitos T del huésped,
específicos del tumor. De esta manera, podría tener lugar una
expansión clonal de linfocitos T específicos del tumor o un
"priming" de células. Una segunda hipótesis implica una
interacción directa de los texosomas inyectados con las células
dendríticas del huésped. Esto podría entonces estimular la respuesta
antitumoral. Con el fin de probar esta segunda hipótesis, se ha
seguido el crecimiento de tumores en unos ratones inyectados por
vía intravenosa con unas células dendríticas derivadas de la médula
ósea cargadas con unos texosomas de células tumorales. Unos ratones
DBA/2 (IFFA CREDO, Orléans, Francia) han sido así inyectados con dos
veces (50 x 10^{5}) la dosis tumorígena mínima de células de
mastocitoma P815. Diez días después, cada animal ha sido inyectado
con 5 x 10^{5} células dendríticas cargadas, y por ello
sensibilizadas, con 9 \mug de texosomas. El tamaño medio de los
tumores en estas condiciones disminuye de forma significativa en
comparación con unos grupos de ratones inyectados con PBS o con
unas células dendríticas cargadas de texosomas de células de un
tumor control MC38. En efecto, más del 60% de los animales tratados
no presentan ya tumor al final del experimento. Además, no han sido
observadas recidivas a largo plazo (en 80% a 100% de los casos). Es
interesante constatar que dicha dosis subóptima de texosomas
inyectada en intradérmica no tiene efecto, lo que sugiere que las
células dendríticas pueden preparar unos texosomas que contienen los
antígenos tumorales de forma mucho más eficaz que las células
dendríticas de la dermis o las células de Langerhans. Se han
obtenido resultados similares con el modelo de células del tumor de
mama TS/A.
Los resultados obtenidos en el marco de la
invención muestran que los texosomas sensibilizan las células
dendríticas de forma eficaz. Estas células, así sensibilizadas,
tienen la capacidad de inducir unas respuestas antitumorales
potentes in vivo, y ello en el caso de diferentes tumores.
Estos resultados sugieren que los efectos antitumorales observados
después de la inoculación directa de texosomas in vivo son
debidos a la sensibilización de las células dendríticas del
huésped. De una manera destacable, el efecto es observado después de
una sola inyección de células dendríticas sensibilizadas. La
mayoría de los ratones tratados muestran una regresión tumoral
completa o una supervivencia prolongada (de 60 días contra 20 días
en el control) debida a la regresión tumoral.
El procedimiento de sensibilización de las
células presentadoras de la invención posee diferentes ventajas con
respecto a los procedimientos de la técnica anterior:
- i)
- no necesita el conocimiento previo de antígenos tumorales: esto es particularmente importante puesto que unos antígenos tumorales no son conocidos en la mayor parte de los tumores;
- ii)
- el procedimiento de la invención puede ser aplicado a cualquier tumor que produzca unos texosomas; en más de 15 progenies de células tumorales ensayadas hasta el presente, una sola no produce texosomas (una de las seis progenies de melanoma ensayadas);
- iii)
- este procedimiento no depende del haplotipo del CMH del paciente y de las células tumorales, puesto que los antígenos tumorales presentes en los texosomas son reaprestados y presentados a los linfocitos T por unas moléculas del CMH de las células presentadoras de antígenos del paciente;
- iv)
- el procedimiento de la invención puede en principio ser eficaz entre tumores de orígenes diferentes, puesto que existen unos antígenos tumorales comunes no solamente a un tipo particular de tumor (MART-A por ejemplo en el melanoma), sino también unos antígenos comunes a unos tumores completamente diferentes (como las moléculas implicadas en la tumorigénesis, p53 por ejemplo);
- v)
- la utilización de texosomas puede también resultar eficaz en el tratamiento de tumores que expresan bajos niveles de moléculas de clase I del CMH, o que no los expresan en absoluto (estos tumores representan 40-50% de los cánceres metastásicos humanos). En efecto, los texosomas permiten la transferencia de antígenos intactos entre células tumorales y células dendríticas, siendo estos antígenos a continuación presentados a los linfocitos T por las moléculas de CMH de la célula dendrítica. Los resultados preliminares muestran que los texosomas permiten inducir el rechazo de tumores murinos que expresan bajos niveles de moléculas de clase I del CMH (como MCA101, S. Rosenberg, NCI, Bethesda, U.S.A.). Esto es probablemente debido al hecho de que los niveles de expresión de moléculas del CMH necesarios para la inducción de una respuesta inmunitaria eficaz son mucho más elevados que los necesarios cuando tiene lugar la fase efectora (citotoxicidad celular);
- vi)
- los texosomas solos constituyen en sí mismos, por su poder inmunógeno, una modalidad de vacunación profiláctica o terapéutica nueva y eficaz.
Este ejemplo demuestra que las células
dendríticas producen unas vesículas membranarias y que estas
vesículas constituyen unas vesículas inmunógenas potentes para la
inmunización antitumoral. Estas vesículas son particularmente
ventajosas puesto que permiten evitar la etapa de inyección in
vivo de las células dendríticas enteras de las cuales
provienen.
La terapia celular dendríticas no ofrece la
certidumbre del fenotipo estable de la célula inyectada, ni de la
homogeneidad de las composiciones celulares utilizadas.
Administrando un producto estable secretado por estas células, es
decir, las vesículas membranarias antes descritas, se ofrece al
huésped portador de tumores una garantía de eficacia y de poder
inmunizante.
En este ejemplo, unas células dendríticas
derivadas de médula ósea por tratamiento durante 5 días en
GM-CSF+IL4 (Mayordomo et al., 1995) han sido
incubadas durante 3 horas con unos exosomas de células tumorales.
Las células así sensibilizadas han sido a continuación cultivadas
en medio ácido durante 18 horas (con el fin de estimular la
producción de vesículas), y después unas vesículas han sido
observadas y recolectadas según la metodología descrita en el
ejemplo 1. Con el fin de determinar su poder inmunógeno, estas
vesículas han sido a continuación incubadas in vitro con
unos linfocitos T citotóxicos específicos del antígeno MART1. Los
resultados presentados en la figura 9 muestran que 0,6 \mug de
estas vesículas membranarias, denominadas DexTexFON (es decir
dexosoma que proviene de células dendríticas incubadas con unos
texosomas que provienen de células tumorales FON), permiten
estimular directamente la proliferación y la secreción de
IFN\gamma de clones LT8 específicos de MART-1 y
es esto lo que no pueden hacer 0,6 \mug de dexosomas que provienen
de células dendríticas incubadas con unos texosomas de células
tumorales NUN: DexTexNUN (siendo NUN un tumor del riñón, HLAA2
negativo, MART-1 negativo). Estos resultados
muestran por tanto (i) que las células dendríticas producen unas
vesículas membranarias y que estas vesículas membranarias
constituyen un inmunógeno potente.
Además, los resultados presentados en la figura
9C muestran que, de forma inesperada, la producción de dexosomas
para las células dendríticas es un fenómeno regulado, que puede ser
estimulado en presencia de ciertas citoquinas tales como
IFN-\gamma y la IL-10. Así, los
resultados presentados muestran que el IFN-\gamma
o la IL-10 aumentan de manera significativa (factor
5 aproximadamente), la producción de dexosomas. Unos resultados
comparables han sido observados con la IL-12.
La capacidad de las células dendríticas de
producir vesículas membranarias ha sido en principio confirmada
sobre unas células dendríticas producidas a partir de precursores
monocitos humanos y sobre la progenie de células dendríticas
murinas D1.
La progenie celular D1 y las condiciones de
maduración de esta progenie han sido descritas por Winzler et
al. (J. Exp. Med. 185 (1997) 317.
Las células dendríticas derivadas de precursores
monocitos humanos han sido obtenidas a partir de la fracción
adherente de células mononucleadas, extraídas a partir de sujetos
sanos, incubadas 7-8 días en medio AIMV que
contiene L-Glu, unos antibióticos, 1.000 UI/ml de
rhGM-CSF y de rhIL-4 (Schering
Plough, Kenilworth, NJ, USA). Después de 8 días de cultivo, las
células débilmente adherentes y las células en suspensión presentan
una morfología típica de células dendríticas, que expresan unos
niveles elevados de moléculas CMH I y II, así como CD40 y CD86. La
mayor parte de estas células es positiva para CD1a y CD11b y
negativa para CD2, CD3, CD14, CD19 y CD83.
Los análisis microscópicos de estas células han
hecho aparecer la presencia de vesículas membranarias ricas en
moléculas del CMH I y II. Estas vesículas han sido aisladas por
centrifugaciones y analizadas en microscopía inmunoelectrónica. Más
particularmente, los sobrenadantes de cultivo de las células
dendríticas han sido recolectados, centrifugados a 300 g durante 20
minutos y después a 10.000 g durante 30 minutos a 4ºC, para eliminar
las células y los desechos celulares. Los dexosomas han sido a
continuación aislados por una centrifugación a 100.000 g durante 1h
a 4ºC seguida de un lavado con PBS en las mismas condiciones
(centrifugación a 100.000 g durante 1h a 4ºC). La concentración de
proteínas en las preparaciones de dexosomas ha sido medida por el
procedimiento de Bradford (BioRad Protein Assay [BioRad]).
\newpage
Los resultados obtenidos muestran (Figura 10)
una población homogénea de vesículas que tienen un diámetro
comprendido entre 60 y 90 nm aproximadamente. Por otra parte, más de
95% de los dexosomas están marcados por unos anticuerpos
anti-CD63, anti-CD82,
anti-MHC-I y
anti-MHC-II.
Estos resultados confirman que las células
dendríticas producen unas vesículas membranarias que presentan unas
moléculas de presentación de los antígenos así como unas moléculas
de coestimulación linfocitaria.
Una de las características ventajosas de los
dexosomas reside en la presencia de moléculas del CMH de clase I.
estas moléculas son en efecto necesarias para la generación de una
respuesta celular eficaz, y en particular para la activación y para
la expansión de las células CTL. La capacidad de los dexosomas para
estimular los linfocitos CD8+ y el carácter específico de los
linfocitos obtenidos han sido por tanto probados.
Para ello, las células dendríticas obtenidas a
partir de precursores monocitos humanos (de sujetos
HLA-A2) han sido en principio sensibilizadas por
"peptide pulsing" para un antígeno particular. A este fin, las
células (2X10^{6}/ml) han sido incubadas durante 3 a 12 horas, o
bien en presencia de 10 \mug/ml del péptido antigénico
MART-1/MelanA_{(27-35)}, o bien en
presencia de 10 \mug/ml de péptido
gp100_{(280-288)} (control) en suspensión en
ácido cítrico a pH 3,7. Después de esta etapa de sensibilización,
los dexosomas han sido aislados como se ha descrito en el ejemplo
1. Las células del clon LT12 (clon de CTL HLA-A2
restringido, MART-1(27-35)
específico) han sido entonces incubadas (100.000 CTL por pocillo)
con unas dosis crecientes de dexosomas o de péptidos gp100
(control) en unas placas de 96 pocillos durante 5 días. La secreción
de interferón gamma por las células ha sido a continuación medida
por ELISA (Genzyme).
Como se ha representado en la figura 11, los
dexosomas que llevan el péptido MART-1 son capaces
de estimular la producción de interferón gamma por el clon LT12, de
manera dosis dependiente. Por el contrario, los dexosomas
producidos a partir de las células dendríticas pulsadas con el
péptido control gp100 no ejercen ningún efecto estimulante sobre
este clon.
Estos resultados confirman que las moléculas del
CMH-I expresadas por los dexosomas de la invención
son funcionales.
Este ejemplo demuestra la capacidad de los
dexosomas para inducir una respuesta inmunitaria in vivo y
más particularmente para inducir la proliferación de células T
específicas de un tumor.
Unas células dendríticas obtenidas a partir de
médula ósea han sido cargadas con un eluado ácido de tumor que
comprende diferentes péptidos antigénicos tumorales. La tecnología
de preparación y de sensibilización de las células dendríticas ha
sido descrita por Zitvogel et al. (1996). La figura 12
presenta los marcadores expresados por los dexosomas producidos por
estas células dendríticas. Como se ha indicado anteriormente, esta
figura muestra la presencia abundante de moléculas del CMH de clase
I y de clase II así como los marcadores CD86 y el receptor para la
transferrina. Por el contrario, aunque aparecen en los lisados
celulares, los marcadores H2-M, li y calnexina son
indetectables en las preparaciones exosomales.
Se han seleccionado dos modelos experimentales
de tumores para ensayar las propiedades antitumorales in
vivo de los dexosomas de la invención. El primer modelo, P815,
es un mastocitoma agresivo singénico de DBA/2 (H2^{d}) para el
cual muy pocas inmunoterapias eficaces han sido referidas sobre unos
tumores establecidos al día 10. El modelo TS-A es
un carcinoma mamario espontáneo débilmente inmunógeno que expresa
unos niveles muy bajos de moléculas del CMH de clase I, singénico
de BALB/c (H2^{d}). los péptidos tumorales de los tumores P815 o
TS/A eluidos por tratamiento ácido han sido cargados sobre las
células singénicas dendríticas, derivadas de la médula ósea, como
se ha descrito anteriormente. Los dexosomas han sido a continuación
preparados a partir de los sobrenadantes de estas células
dendríticas y utilizados para la inmunización in vivo.
Los ratones hembras DBA/2J (H2^{d}) y BALB/c
(H2^{d}) de una edad de seis a ocho semanas han sido comprados al
Laboratoire Iffa Credo, Lyon, Francia y mantenidos en unas
condiciones desprovistas de patógenos. Los ratones nude han sido
mantenidos en un microentorno protegido. Las células P815 han sido
proporcionadas por T. Boon (Ludwig Institute, Bélgica). El modelo
TS/A ha sido proporcionado por Guido Forni (Immunogenetic and
Histocompatibility Center, Turín, Italia). Todas las progenies
tumorales han sido conservadas en medio RPMI 1640 suplementado con
10% de suero de ternera fetal desprovisto de endotoxina (Gibco BRL),
2 mM de L-Glutamina, 100 unidades/ml de penicilina,
100 mg/ml de estreptomicina, aminoácidos esenciales y piruvato. Este
medio es también designado en lo que sigue: medio CM.
Dos veces la dosis tumorígena mínima de células
tumorales (5X10^{5}P815, 10^{5} TS/A) han sido inoculadas en
intradérmica en la zona superior del flanco derecho de los ratones
DBA/2 y BALB/c respectivamente. Los animales que presentan unos
tumores TS/A establecidos de tres a cuatro días o unos tumores P815
establecidos de seis a diez días han sido a continuación
inmunizados por una inyección intradérmica única de 3 a 5 \mug de
dexosomas en la parte inferior del flanco ipsilateral. Estos
procedimientos han sido efectuados de forma similar a la vez en los
animales inmunocompetentes y en los ratones nude. Una sola inyección
terapéutica ha sido realizada para cada ratón. El tamaño de los
tumores ha sido controlado dos veces por semana y los ratones han
sido sacrificados cuando llevaban unos tumores ulcerados o de un
tamaño demasiado importante. Cada serie de experimentos ha sido
realizada dos a tres veces utilizando unos grupos de cinco ratones
para cada tratamiento individual. Los resultados obtenidos están
representados en la figura 13. Como muestra la figura 13B, el
tratamiento de tumores P815 establecidos el día 10 (que tienen un
tamaño de 50 a 90 mm^{2}) ha podido ser realizado por una sola
administración intradérmica de 3 a 5 \mug de dexosomas por ratón.
En una semana, el crecimiento tumoral se ha parado en los grupos
que han recibido los dexosomas derivados de células dendríticas
cargadas con el péptido tumoral autólogo, y en 40 a 60% de los
ratones, los tumores habían desaparecido completamente al día
60.
Estos animales presentan por otra parte una
respuesta inmune duradera y han rechazado una inyección
suplementaria de P815 normalmente letal para unos ratones no
tratados. En contrapartida, estos ratones no están protegidos
contra una inyección del clon leucémico singénico L1210, lo que
muestra bien el carácter inmunoespecífico del efecto obtenido.
Finalmente, los grupos de ratones inmunizados con unos dexosomas
controles (cargados con unos péptidos del bazo del ratón) no
presentan ningún efecto antitumoral así como los ratones no
tratados. Estos resultados muestran por tanto que los dexosomas
cargados con péptido tumoral según la invención son capaces de
inducir una regresión tumoral in vivo.
Unos efectos antitumorales similares han sido
obtenidos sobre el modelo de tumor TS/A que comprende unos tumores
establecidos en los días 3/4. En esta serie de experimentos, todos
los ratones presentaban un retardo de crecimiento tumoral
estadísticamente significativo que prolongaban su supervivencia
(figura 14). Este efecto antitumoral no ha sido observado en los
ratones atímicos Nu/Nu como se ha indicado en la figura 14B, lo que
demuestra que la presencia de células T es necesaria para la
expresión del efecto antitumoral de los dexosomas de la
invención.
Además, el experimento siguiente muestra que los
dexosomas estimulan directamente una respuesta CTL específica en
los animales que presentan el tumor P815. Los esplenocitos de
ratones que han rechazado los tumores P815 después de inmunización
con unos dexosomas han sido recogidos al día 90 y cultivados durante
cinco días en presencia de células P815 irradiadas que expresan el
antígeno B7.1 para aumentar la frecuencia de precursores
específicos. Estas células efectoras han sido probadas en un ensayo
de liberación de cromo contra (i) las células tumorales autólogas
P815 (H2^{d}), (ii) las células no emparentadas L1210 y (iii) las
células YAC. Una actividad citolítica específica significativa ha
sido observada contra las células P815 en los esplenocitos de
ratones inmunizados con los dexosomas (figura 15). De manera
interesante, ninguno de los bazos de ratones que rechazan
espontáneamente el tumor P815 o que presentan unos tumores P815
presentan esta actividad citolítica en las mismas condiciones.
Estos resultados muestran que una inyección única de dexosomas según
la invención derivados de células dendríticas sensibilizadas con un
antígeno o unos péptidos antigénicos correspondientes, es capaz de
disparar de forma eficaz una respuesta específica antitumoral CTL
in vivo.
Para determinar si la respuesta inmunitaria y
antitumoral inducida por los dexosomas está restringida a los MHC y
no simplemente debida a un efecto directo de los péptidos tumorales,
unas células dendríticas derivadas de los ratones H2^{d} (DBA/2)
o H2^{b} (C57BL/6) han sido cargadas en paralelo con unos péptidos
tumorales eluidos del tumor P815. Los dexosomas producidos por
estas células dendríticas de ratón han sido a continuación aislados
y utilizados separadamente para unas inyecciones intradérmicas
directas en los ratones DBA/2 que llevan unos tumores P815
establecidos el día 6/10.
Como muestra la figura 13B, solamente los
dexosomas que llevan los péptidos tumorales singénicos son unas
vacunas antitumorales eficaces (que inducen en el 60% de los ratones
una desaparición del tumor) mientras que los dexosomas de las
células dendríticas alogénicas no inducen prácticamente ningún
efecto antitumoral. Estos resultados indican que los dexosomas
según la invención inducen una respuesta antitumoral in vivo
restringida al MHC.
Unos experimentos similares a los descritos
anteriormente han sido realizados procediendo a unas inyecciones no
intradérmicas sino intravenosas. Los resultados obtenidos están
representados en la figura 16. Muestran en principio una regresión
tumoral consecutivamente a la inyección intravenosa de dexosomas.
Además, estos resultados muestran que los dexosomas son más
potentes que las células dendríticas de las cuales derivan para
erradicar los tumores in vivo. Estos resultados ilustran por
tanto las propiedades destacables e inesperadas de los
dexosomas.
Los resultados presentados más arriba muestran
por tanto que las células dendríticas inmaduras humanas o murinas
secretan unos dexosomas, que estos dexosomas presentan unas
moléculas no solamente del CMH de clase II sino también del CMH de
clase I así como unas moléculas coestimulantes, y finalmente que
estos dexosomas son inmunógenos e inducen una regresión tumoral
in vivo.
Los dexosomas pueden ser obtenidos en cantidades
relativamente elevadas (1 \mug por millón de células dendríticas
por dieciocho horas, según el test Bradford) a partir del medio de
cultivo de células dendríticas (células dendríticas derivadas de
médula ósea en presencia de GM-CSF + IL4, progenies
de células dendríticas D1 o células dendríticas derivadas de
precursores monocitos humanos, aisladas de células mononucleadas de
la sangre periférica). Los dexosomas han sido caracterizados en el
plano morfológico y bioquímico. Las vesículas membranarias
analizadas por microscopía inmunoelectrónica representan una
población homogénea de vesículas que tienen un diámetro de
aproximadamente 60-90 nanómetros. Las preparaciones
dexosomales están aparentemente desprovistas de retrovirus,
membranas plásmicas, que constituyen microsomales o cuerpos
apoptósicos. Los dexosomas sobreexpresan de forma abundante las
moléculas del CMH de clase II, CD63 y CD86 comparativamente a las
membranas plásmicas. Ningún compartimento derivado del retículo
endoplásmico ha sido detectado en los dexosomas por Western
Blotting, utilizando los anticuerpos anticalnexina. Una muerte
celular programada no ha podido ser puesta en evidencia en estos
cultivos utilizando diferentes condiciones. De manera interesante,
la producción de estas vesículas aparece como un fenómeno regulado.
La cantidad de vesículas parece poder ser disminuida induciendo una
maduración de las células dendríticas, como se ha determinado por
el test Bradford, Western Blotting, y microscopía inmunoelectrónica.
Además, el nivel de secreción de estas vesículas puede ser mejorado
de forma significativa disminuyendo el pH del medio de cultivo, o
incubando las células en presencia de ciertas citoquinas, o también
tratando las células dendríticas por irradiación. Este fenómeno es
particularmente inesperado en la medida en que las células
dendríticas inmaduras son generalmente consideradas como que tienen
un bajo poder de presentación de antígeno y por tanto una baja
actividad inmunológica. Los resultados presentados demuestran que
las células dendríticas en esta fase inmaduras poseen la propiedad
de producir unos dexosomas de forma eficaz. Los resultados
presentados demuestran finalmente que estos dexosomas son capaces
de disparar una respuesta por unas células T eficaces a la vez
in vitro e in vivo y que son también capaces de
inducir la regresión del tumor in vivo. Estas vesículas
constituyen por tanto unos candidatos particularmente atractivos
para unas aproximaciones inmunoterapéuticas en sistema no
celular.
Este ejemplo describe la utilización de un
procedimiento original de purificación de exosomas basada en la
electroforesis en fase fluida.
La electroforesis en fase fluida es un
procedimiento preparativo de separación de compuestos biológicos
según su carga. Este procedimiento ha sido utilizado para separar
unas proteínas por isoelectroenfoque. Este procedimiento puede
presentar las ventajas siguientes:
- -
- es un procedimiento preparativo que permite una inyección continua de material, y por tanto la purificación de grandes cantidades de vesículas,
- -
- este procedimiento permite la purificación de los dexosomas en una o dos etapas, eliminando potencialmente las etapas de centrifugación.
Con el fin de determinar si este procedimiento
es aplicable a la purificación de exosomas, se ha realizado el
experimento siguiente:
Una preparación de dexosomas aislados a partir
de un sobrenadante de células dendríticas murinas por
ultracentrifugación diferencial ha sido inyectada en la
electroforesis en fase fluida, en las condiciones habituales
descritas por Amigorena et al. (Nature, 369 (1994), 113).
Han sido recolectadas 40 fracciones y la concentración proteica en
cada una de estas fracciones ha sido determinada por el test de
Bradford (BioRad), con el fin de detectar la presencia de los
dexosomas. Como muestra la figura 17, 90% de los dexosomas han sido
encontrados concentrados en cuatro fracciones de EPF. La migración
de los dexosomas en un pico estrecho según esta tecnología
demuestra la factibilidad de la electroforesis como procedimiento de
aislamiento de los dexosomas.
Amigorena, S., Drake, J. R.,
Webster, P., y Mellamn, I. (1994). Transient
accumulation of new class II molecules in a novel endocytic
compartment in B lymphocytes [see comments]. Nature 369, 113-120.
Boczkowski, D., Nair, S. K.,
Snyder, D., y Gilboa, E. (1996). Dendritic
cells pulsed with RNA are potent antigen-presenting
cells in vitro and in vivo. Journal of Experimental
Medecine 184, 465-72.
Boon, T. (1992). Toward a genetic
analysis of tumor rejection antigens. Advances in Cancer
Research 58, 177-210.
Espevik, T. &
Nissen-Meyer, J. (1986) J. Immunol.
Methods 95:99-103.
Felder, S., Miller, K.,
Moehren, G., Ullrich, A., Schlessinger, J., y
Hopkins, C. R. (1990). Kinase activity controls the
sorting of the epidermal growth factor receptor within the
multivesicular body. Cell 61,
623-634.
Mayordomo, J. L., Zorina, T.,
Storkus, W. J., Zitvogel, L., Celluzzi, C.,
Falo, L. D., Melief, C. J., Ildstad, S. T.,
Kast, W. M., Deleo, A. B., et al.
(1995). Bone marrow-derived dendritic cells
pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and
therapeutic antitumour immunity. Nature Medicine I,
1297-302.
Nabel, G. J., Gordon, D.,
Bishop, D. K., Nicholoff, B. J., Yang, Z. Y.,
Avuga, A., Cameron, M. J., Nabel, E. G.,
Chang, A. E. (1996) Immune response in human melanoma
after transfer of an allogenic class I major histocompatibility
complex gene with DNA-liposome complexes. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 93:15388-18393.
\newpage
Pardoll, D. M. (1995). Paracrine
cytokine adjuvants in cancer immunotherapy. Annual Review of
Immunology 13, 399-415.
Raposo, G., Nijman, H. W.,
Stoorvogel, W., Leijendekker, R., Harding, C.
V., Melief, C. J. M., y Geuze, H. J. (1996). B
lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.
J. Exp. Med. 183, 1161-1172.
Rosenberg, S. A., Kawakami, Y.,
Robbins, P. F., y Wang, R. (1996).
Identification of the genes encoding cancer antigens: implications
for cancer immunotherapy. Advances in Cancer Research 70, 145-77.
Traversasi, C., Van der Bruggen,
P., Leuscher, I. F., Lurguin, C., Chamez, P.,
Van Del, A., De Places, E.,
Amar-Costesec, A. y Boon, T.
(1992) A nonapeptide encoded by human gene
MART-1 is recognized on HLA-A1 by
cytotoxic T lymphocytes directed against tumor antigen
MZ2-E. J. Exp. Med. 176:
1453-1457.
Walker S. A. et al. (1997).
Nature, vol. 387, pp. 61 i siguientes.
Zitvogel, L., Robbins, P. D.,
Storkus, W. L., Clarke, M. R., Maeurer, M. J.,
Campbell, R. L., Davis, C. G., Tahara, H.,
Schreiber, R. D., y Lotze, M. T. (1996).
Interleukin-12 and B7.1
co-stimulation cooperate in the induction of
effective antitumor immunity and therapy of established tumors.
European Journal of Immunology 26,
1333-41 [a].
Zitvogel, L., Mayordomo, J. I.,
Tjandrawan, T., DeLeo, A. B., Clarke, M. R.,
Lotze, M. T., y Storkus, W. J. (1996). Therapy
of murine tumors with tumor peptide-pulsed dendritic
cells: dependence on T cells, B7 costimulation, and T helper cell
1-associated cytokines [see comments]. Journal of
Experimental Medicine 183, 87-97 [b].
Zitvogel, L et al. Nature
medicine, vol. 4, mayo 1998, 594-600.
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (23)
1. Vesícula membranaria inmunógena,
caracterizada porque está liberada de su entorno natural, se
deriva de una célula tumoral, comprende una bicapa lipídica que
rodea una fracción citosólica, y presenta, en su superficie, unas
moléculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad o
CMH.
2. Vesícula según la reivindicación 1, que
presenta en su superficie unas moléculas de clase I y de clase II
del complejo mayor de histocompatibilidad.
3. Vesícula según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque presenta en su
superficie unas moléculas de adhesión y/o unas moléculas de
coestimulación linfocitaria.
4. Vesícula según una de las reivindicaciones 1
a 3, caracterizada porque presenta en su superficie unos
péptidos antigénicos.
5. Vesícula según la reivindicación 4,
caracterizada porque los péptidos antigénicos están asociados
a las moléculas de clase I y/o de clase II del CMH.
6. Vesícula según una de las reivindicaciones 1
a 5, caracterizada porque contiene en su fracción citosólica
unas moléculas antigénicas tumorales, unos inmunomoduladores, unos
quimioatractores, unas hormonas y/o unos ácidos nucleicos.
7. Vesícula según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque contiene la
proteína HSP70.
8. Vesícula según la reivindicación 1,
caracterizada porque su tamaño está comprendido entre 60 y
100 nm.
9. Vesícula según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque está desprovista
de la proteína gp96.
10. Vesícula según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque contiene un
ácido nucleico heterólogo.
11. Procedimiento de preparación de vesículas
membranarias a partir de una muestra biológica de origen tumoral,
que comprende el aislamiento, a partir de células tumorales
contenidas en la muestra biológica, vesículas que presentan las
características de las vesículas según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10.
12. Procedimiento según la reivindicación 11,
caracterizada porque la muestra biológica está constituida
por fracciones membranarias, por sobrenadantes de cultivo o por
lisados de células tumorales, o bien por suspensiones tumorales
frescas.
13. Procedimiento según la reivindicación 11 ó
12, caracterizada porque la muestra biológica está sometida
a uno o varios tratamientos estimulantes seleccionados de entre unos
agentes esteroides y unos agentes farmacológicos que aumentan la
cantidad de endosomas multivesiculares, y/o está tratada mediante
irradiación.
14. Procedimiento según la reivindicación 11,
caracterizado porque el aislamiento de las vesículas se
realiza mediante centrifugación, electroforesis, cromatografía y/o
nanofiltración.
15. Procedimiento de preparación de células
presentadoras de antígenos sensibilizadas a unas vesículas según
una de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende la incubación de
células presentadoras de antígenos en presencia de una o varias
vesículas según una de las reivindicaciones 1 a 10 en unas
condiciones que permiten la sensibilización de las células
presentadoras de antígenos, y la recuperación de dichas células
presentadoras de antígenos sensibilizadas obtenidas.
16. Utilización de vesículas según una de las
reivindicaciones 1 a 10, para la estimulación in vitro de
linfocitos T específicos de antígenos contenidos en dichas vesículas
o de linfocitos B.
17. Utilización según la reivindicación 16,
caracterizada porque dichas vesículas se utilizan para la
estimulación y la amplificación in vitro de linfocitos T
específicos de antígenos contenidos en dichas vesículas.
18. Utilización de vesículas según una de las
reivindicaciones 1 a 10, para la selección ex vivo de un
repertorio de linfocitos T, susceptibles de reconocer unos antígenos
específicos contenidos en dichas vesículas.
19. Medicamento que comprende, a título de
sustancia activa, una o varias vesículas según una de las
reivindicaciones 1 a 10, en asociación con un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
20. Medicamento según la reivindicación 19, para
el tratamiento del cáncer.
21. Medicamento según la reivindicación 19 ó 20,
caracterizado porque comprende además un agente
estabilizante.
22. Medicamento según una de las
reivindicaciones 19 a 21, caracterizado porque comprende un
adyuvante inmunoestimulante.
23. Utilización de una vesícula según una de las
reivindicaciones 1 a 10, para la preparación de una composición
farmacéutica destinada al tratamiento de cánceres.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR9709007 | 1997-07-16 | ||
FR9709007A FR2766205B1 (fr) | 1997-07-16 | 1997-07-16 | Nouveau procede de sensibilisation de cellules presentatrices d'antigene et nouveaux moyens pour la mise en oeuvre du procede |
FR9801437A FR2774697B1 (fr) | 1997-07-16 | 1998-02-06 | Procede de sensibilisation de cellules presentatrices d'antigene et moyens pour la mise en oeuvre du procede |
FR9801437 | 1998-02-06 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2331838T3 true ES2331838T3 (es) | 2010-01-18 |
Family
ID=26233678
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES98935097T Expired - Lifetime ES2227863T3 (es) | 1997-07-16 | 1998-07-03 | Vesicula celular denominada "exosoma", preparacion y utilizacion en la estimulacion de una respuesta inmunitaria. |
ES04005883T Expired - Lifetime ES2331838T3 (es) | 1997-07-16 | 1998-07-03 | Vesicula celular denominada "exosoma", su preparacion y su utilizacion en la estimulacion de una respuesta inmunitaria. |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES98935097T Expired - Lifetime ES2227863T3 (es) | 1997-07-16 | 1998-07-03 | Vesicula celular denominada "exosoma", preparacion y utilizacion en la estimulacion de una respuesta inmunitaria. |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6685911B1 (es) |
EP (2) | EP1001806B1 (es) |
JP (2) | JP3484201B2 (es) |
CN (1) | CN1250285C (es) |
AT (2) | ATE275969T1 (es) |
AU (1) | AU743296B2 (es) |
CA (1) | CA2296750C (es) |
DE (2) | DE69826288T2 (es) |
DK (1) | DK1001806T3 (es) |
EA (2) | EA002827B1 (es) |
ES (2) | ES2227863T3 (es) |
FR (2) | FR2766205B1 (es) |
IL (1) | IL134043A0 (es) |
PT (1) | PT1001806E (es) |
TW (1) | TW592708B (es) |
WO (1) | WO1999003499A1 (es) |
Families Citing this family (113)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69635895D1 (de) * | 1995-08-03 | 2006-05-04 | Rijksuniversiteit Te Leiden Le | Antigen presentierende bläschen, die von zellen ableiten |
US5763445A (en) | 1996-03-08 | 1998-06-09 | Adolor Corporation | Kappa agonist compounds pharmaceutical formulations and method of prevention and treatment of pruritus therewith |
US6849452B1 (en) * | 1998-03-03 | 2005-02-01 | Institut Gustave Roussy | Methods for activating natural killer (NK) cells and means for carrying out said methods |
FR2788780B1 (fr) * | 1999-01-27 | 2001-03-30 | Ap Cells Inc | Procede de preparation de vesicules membranaires |
GB9927320D0 (en) | 1999-11-18 | 2000-01-12 | Chiron Spa | Exosome separation |
US20040241176A1 (en) * | 2000-04-27 | 2004-12-02 | Ap Cells. Inc. | Method of producing membrane vesicles |
EP2269629A3 (en) | 2000-05-11 | 2013-09-11 | Baylor Research Institute | Compositions and methods for producing antigen-presenting cells |
WO2002004603A2 (de) * | 2000-07-10 | 2002-01-17 | Eppendorf Ag | Verfahren zur modifizierung von biologischen zellen |
FR2827872A1 (fr) * | 2001-07-30 | 2003-01-31 | Roussy Inst Gustave | Vesicules membranaires de fluide biologique preleve in vivo, leur preparation et utilisation dans la stimulation d'une reponse immunitaire |
EP1417229B1 (en) | 2001-08-17 | 2011-06-15 | Exothera L.L.C. | Methods and compounds for the targeting of protein to exosomes |
EP1308167A1 (de) * | 2001-11-06 | 2003-05-07 | Pickl, Winfried, Ao. Univ. Prof. Dr. | Antigenpräsentierende Vesikel |
KR20030085659A (ko) * | 2002-04-30 | 2003-11-07 | 동부한농화학 주식회사 | 암 치료용 엑소좀 및 그를 이용한 암 백신 |
US20040022813A1 (en) * | 2002-08-05 | 2004-02-05 | Jean-Claude Bystryn | Shed antigen vaccine with dendritic cells adjuvant |
KR100519384B1 (ko) * | 2002-08-13 | 2005-10-06 | (주)누백스 | 유전자 이입을 이용한 엑소좀의 제조방법 및 상기 엑소좀의 용도 |
US7514084B2 (en) | 2002-09-12 | 2009-04-07 | Oncotherapy Science, Inc. | KDR peptides and vaccines comprising the same |
US8021847B2 (en) | 2004-06-02 | 2011-09-20 | Proxy Life Science Holdings, Inc. | Microvesicle-based compositions and methods |
EP1766053A4 (en) * | 2004-06-02 | 2007-12-12 | Sourcepharm Inc | MICROVESICLES CONTAINING RNA AND METHODS |
AU2005262319A1 (en) * | 2004-07-01 | 2006-01-19 | Orthogen Ag | Immunosuppressive exosomes |
DK2325306T3 (en) | 2005-02-25 | 2014-03-03 | Oncotherapy Science Inc | Peptide vaccines against lung cancers expressing TTK, URLC10 or KOC1 polypeptide |
EP2095822B1 (en) | 2005-02-28 | 2013-10-16 | Oncotherapy Science, Inc. | Epitope peptides derived from vascular endothelial growth factor receptor 1 and vaccines containing these peptides |
EP1712238A1 (en) * | 2005-04-11 | 2006-10-18 | Institut Gustave Roussy | Anthracyclin induced immunogenic dead or dying cells composition |
CA2504279A1 (en) * | 2005-04-15 | 2006-10-15 | University Of Saskatchewan | Materials and method of modulating the immune response using t helper-antigen presenting cells |
CN1322115C (zh) * | 2005-07-06 | 2007-06-20 | 清华大学 | 载有外源配体分子的胞外体及其制备方法与应用 |
RU2449020C2 (ru) | 2005-07-27 | 2012-04-27 | Онкотерапи Сайенс, Инк. | Связанный с раком толстого кишечника ген том34 |
EP1912672B1 (en) | 2005-07-29 | 2013-09-04 | Providence Health System | Defective ribosomal products in blebs (dribbles) and methods of use to stimulate an immune response |
US8758991B2 (en) | 2006-04-26 | 2014-06-24 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Isolation of membrane vesicles from biological fluids and methods of using same |
US9085778B2 (en) | 2006-05-03 | 2015-07-21 | VL27, Inc. | Exosome transfer of nucleic acids to cells |
CN101085349B (zh) * | 2006-06-09 | 2011-05-25 | 项雯华 | 囊泡导向的免疫细胞及其在制备抗肿瘤药物上的应用 |
US20100247562A1 (en) * | 2006-08-24 | 2010-09-30 | Trustees Of Boston University | Complexes Derived from Heterohybrid Cells and Uses Thereof |
CN102850434B (zh) | 2006-10-17 | 2016-04-13 | 肿瘤疗法科学股份有限公司 | 用于表达mphosph1或depdc1多肽的癌症的肽疫苗 |
JP2010516786A (ja) * | 2007-01-26 | 2010-05-20 | ユニバーシティー オブ ルイヴィル リサーチ ファウンデーション,インコーポレーテッド | ワクチンとしての使用のためのエキソソーム成分の改変 |
TWI438207B (zh) | 2007-02-21 | 2014-05-21 | Oncotherapy Science Inc | 表現腫瘤相關抗原之癌症的胜肽疫苗 |
TW201425333A (zh) | 2007-04-11 | 2014-07-01 | Oncotherapy Science Inc | 腫瘤血管內皮標誌8胜肽及包含此胜肽之疫苗 |
CN101129405B (zh) * | 2007-07-31 | 2011-05-11 | 崔澂 | 一种治疗习惯性流产的生物学制剂 |
WO2009020604A2 (en) | 2007-08-06 | 2009-02-12 | Southern Connecticut State University | Tissue organizing structure and therapeutic methods |
EP2696203A3 (en) | 2007-08-16 | 2014-05-28 | The Royal Institution for the Advancement of Learning/McGill University | Tumor cell-derived microvesicles |
US20100255514A1 (en) | 2007-08-16 | 2010-10-07 | The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University | Tumor cell-derived microvesicles |
DK2186889T3 (en) | 2007-08-20 | 2015-06-08 | Oncotherapy Science Inc | CDCA1 PEPTID AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION, INCLUDING THIS |
RU2487886C2 (ru) | 2007-08-20 | 2013-07-20 | Онкотерапи Сайенс, Инк. | Пептид foxm1 и включающее его медицинское средство |
EP2072617A1 (en) | 2007-12-12 | 2009-06-24 | Trimed Biotech GmbH | Method for producing dendritic cells |
TWI526219B (zh) | 2008-06-19 | 2016-03-21 | 腫瘤療法 科學股份有限公司 | Cdca1抗原決定位胜肽及含此胜肽的疫苗 |
WO2010062706A2 (en) | 2008-10-30 | 2010-06-03 | Caris Mpi, Inc. | Methods for assessing rna patterns |
EP2350320A4 (en) * | 2008-11-12 | 2012-11-14 | Caris Life Sciences Luxembourg Holdings | METHODS AND SYSTEMS FOR USING EXOSOMES TO DETERMINE PHENOTYPES |
TWI500932B (zh) | 2008-12-05 | 2015-09-21 | Oncotherapy Science Inc | Wdrpuh抗原決定位胜肽以及含此胜肽之疫苗 |
TWI469791B (zh) | 2009-02-18 | 2015-01-21 | Oncotherapy Science Inc | Foxm1胜肽以及含此胜肽之疫苗 |
CN102356155B (zh) | 2009-03-18 | 2016-02-24 | 肿瘤疗法科学股份有限公司 | Neil3肽及包含它的疫苗 |
ES2927225T3 (es) | 2009-04-17 | 2022-11-03 | Univ Oxford Innovation Ltd | Composición para entrega de material genético |
TWI507204B (zh) | 2009-05-26 | 2015-11-11 | Oncotherapy Science Inc | Cdc45l胜肽與含此胜肽之疫苗 |
US8431530B2 (en) | 2009-06-12 | 2013-04-30 | Morehouse School Of Medicine | Compositions and methods for treating aids or cancer by inhibiting the secretion of microparticles |
KR101314868B1 (ko) | 2009-07-01 | 2013-10-08 | 주식회사이언메딕스 | 포유류의 유핵세포에서 유래된 마이크로베시클 및 이의 용도 |
TW201136604A (en) | 2009-12-14 | 2011-11-01 | Oncotherapy Science Inc | TMEM22 peptides and vaccines including the same |
ES2362589B1 (es) | 2009-12-28 | 2012-05-16 | Centre De Recerca En Salut Internacional De Barcelona | Exosomas derivados de reticulocitos infectados con plasmodium sp., método para su obtención y su uso. |
US20120315324A1 (en) * | 2010-02-05 | 2012-12-13 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Exosomal compositions and methods for the treatment of disease |
RU2451292C2 (ru) * | 2010-02-09 | 2012-05-20 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Антидопинговый центр" | Способ определения эндогенных стероидов в плазме крови человека |
CA2791905A1 (en) | 2010-03-01 | 2011-09-09 | Caris Life Sciences Luxembourg Holdings, S.A.R.L. | Biomarkers for theranostics |
MX344579B (es) | 2010-03-11 | 2016-12-19 | Oncotherapy Science Inc * | Peptidos hjurp y vacunas que incluyen los mismos. |
TWI538685B (zh) | 2010-04-02 | 2016-06-21 | 腫瘤療法 科學股份有限公司 | Ect2胜肽及含此胜肽之疫苗 |
EP2555627A4 (en) * | 2010-04-06 | 2013-10-23 | John W Holaday | METHOD FOR TREATING CARCINOMA |
KR20130043104A (ko) | 2010-04-06 | 2013-04-29 | 카리스 라이프 사이언스 룩셈부르크 홀딩스 | 질병용 순환 생물학적 지표들 |
JP6204830B2 (ja) * | 2011-03-11 | 2017-09-27 | チルドレンズ メディカル センター コーポレーション | 間葉系幹細胞エキソソームに関連する方法および組成物 |
WO2012135844A2 (en) | 2011-04-01 | 2012-10-04 | Cornell University | Circulating exosomes as diagnostic/prognostic indicators and therapeutic targets of melanoma and other cancers |
MX350220B (es) | 2011-08-12 | 2017-08-30 | Oncotherapy Science Inc | Peptidos de mphosph1 y vacunas que incluyen los mismos. |
CN102302784B (zh) | 2011-08-22 | 2012-12-05 | 湖北盛齐安生物科技有限公司 | 一种肿瘤化疗药物制剂及其制备方法 |
EP2771350B1 (en) | 2011-10-28 | 2018-01-10 | OncoTherapy Science, Inc. | Topk peptides and vaccines including the same |
ES2967272T3 (es) | 2011-11-30 | 2024-04-29 | Bullerdiek Joern | Expresión de miARNs en tejido placentario |
GB201121070D0 (en) | 2011-12-07 | 2012-01-18 | Isis Innovation | composition for delivery of biotherapeutics |
CN103446580B (zh) * | 2012-05-31 | 2016-08-03 | 湖北盛齐安生物科技有限公司 | 一种肿瘤疫苗及其制备方法 |
AU2013302526B2 (en) | 2012-08-15 | 2018-03-22 | The University Of Chicago | Exosome-based therapeutics against neurodegenerative disorders |
TWI658049B (zh) | 2013-03-12 | 2019-05-01 | 腫瘤療法 科學股份有限公司 | Kntc2胜肽及含此胜肽之疫苗 |
RU2018101152A (ru) | 2013-03-15 | 2019-02-21 | Борд оф Риджентс, Дзе Юниверсити оф Тексас Систем | Использование биогенеза микрорнк в экзосомах для диагностики и лечения |
CA2914615C (en) | 2013-06-05 | 2023-10-17 | Biotime, Inc. | Compositions and methods for induced tissue regeneration in mammalian species |
US10987432B2 (en) | 2013-09-05 | 2021-04-27 | The University Of Hong Kong | Therapeutic delivery and expression system, methods and uses thereof |
EP3052616A4 (en) * | 2013-10-02 | 2017-03-29 | Paradigm Biopharmaceuticals Limited | A method of producing exosomes |
AU2014360344B2 (en) * | 2013-12-04 | 2018-11-29 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Analysis of genomic DNA, RNA, and proteins in exosomes for diagnosis and theranosis |
US11078462B2 (en) | 2014-02-18 | 2021-08-03 | ReCyte Therapeutics, Inc. | Perivascular stromal cells from primate pluripotent stem cells |
KR20170005854A (ko) | 2014-05-18 | 2017-01-16 | 칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션 | 엑소솜과 관련된 방법 및 조성물 |
US10240127B2 (en) | 2014-07-03 | 2019-03-26 | ReCyte Therapeutics, Inc. | Exosomes from clonal progenitor cells |
MX2017001651A (es) | 2014-08-04 | 2017-04-27 | Oncotherapy Science Inc | Peptido derivado de urlc10 y vacuna que lo contiene. |
MX2017001650A (es) | 2014-08-04 | 2017-04-27 | Oncotherapy Science Inc | Peptido derivado de cdca1 y vacuna que lo contiene. |
EP4353321A3 (en) | 2014-08-04 | 2024-07-10 | OncoTherapy Science, Inc. | Koc1-derived peptide and vaccine including same |
KR101726488B1 (ko) * | 2015-02-23 | 2017-04-13 | 이화여자대학교 산학협력단 | 바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체를 포함하는 임신관련 질환 치료용 조성물 |
CN105031661A (zh) * | 2015-05-28 | 2015-11-11 | 杭州优玛达生物科技有限公司 | 生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室作为基因转染试剂或者基因治疗试剂的应用 |
CN104984359A (zh) * | 2015-05-28 | 2015-10-21 | 杭州优玛达生物科技有限公司 | 生物膜、具有生物膜性的闭合结构或细胞区室作为疫苗载体或免疫调节剂的应用 |
BR112017026467A2 (pt) | 2015-06-10 | 2018-09-11 | Univ Texas | uso de exossomos para o tratamento de doença |
EP3115058A1 (fr) | 2015-07-09 | 2017-01-11 | Institut Gustave Roussy | Peptides immunogenes de preprocalcitonine |
SG10201913592QA (en) | 2015-08-12 | 2020-02-27 | Oncotherapy Science Inc | Depdc1-derived peptide and vaccine containing same |
RU2731099C2 (ru) | 2015-10-08 | 2020-08-28 | Онкотерапи Сайенс, Инк. | Пептид, полученный из mphosph1, и включающая его вакцина |
MX2018004308A (es) | 2015-10-08 | 2018-05-01 | Oncotherapy Science Inc | Peptido derivado de foxm1 y vacuna que lo incluye. |
EP3393511A1 (en) * | 2015-12-21 | 2018-10-31 | La Jolla Institute for Allergy and Immunology | Leveraging immune memory from common childhood vaccines to fight disease |
KR102414519B1 (ko) * | 2016-03-03 | 2022-06-28 | 인스티튜트 구스타브 루시 | Ptps-기반 항암 백신 |
WO2017177204A1 (en) * | 2016-04-09 | 2017-10-12 | La Jolla Institute For Allergy And Immunology | Leveraging immune memory from common childhood vaccines to fight disease |
WO2017194170A1 (en) * | 2016-05-13 | 2017-11-16 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Methods for predicting the usefulness of proteins or protein fragments for immunotherapy |
WO2017218533A1 (en) | 2016-06-13 | 2017-12-21 | Torque Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for promoting immune cell function |
US10294454B2 (en) | 2016-08-24 | 2019-05-21 | General Electric Company | Methods and kits for cell activation |
US20210024893A1 (en) | 2016-10-13 | 2021-01-28 | Vbc Holdings Llc | Medical uses of exosomes |
US20200046766A1 (en) * | 2016-10-13 | 2020-02-13 | Vbc Holdings Llc | Cancer stem cell exosomes |
EP3526318A1 (en) | 2016-10-13 | 2019-08-21 | VBC Holdings LLC | Anti-inflammatory exosomes from inflamed cells or tissues |
US10800817B2 (en) | 2016-12-19 | 2020-10-13 | Morehouse School Of Medicine | Compositions and methods for treating diseases by inhibiting exosome release |
CN110312549B (zh) | 2016-12-19 | 2021-06-29 | 莫尔豪斯医学院 | 用于通过抑制外泌体释放来治疗疾病的组合物和方法 |
KR101862502B1 (ko) * | 2017-01-02 | 2018-05-29 | 성균관대학교산학협력단 | 재구성 인공 암세포, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 항암 조성물 |
JP6923875B2 (ja) * | 2017-01-27 | 2021-08-25 | 東亞合成株式会社 | 腫瘍細胞のcd47発現を抑制するための薬剤組成物およびその利用 |
US20200056225A1 (en) * | 2017-02-24 | 2020-02-20 | Md Healthcare Inc. | Method for diagnosing chronic obstructive airway disease through bacterial metagenome analysis |
US10815520B2 (en) | 2017-04-07 | 2020-10-27 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Nanovesicles, methods, and systems for diagnosis and prognosis of cancer |
KR101999818B1 (ko) * | 2017-07-26 | 2019-07-12 | ㈜로제타엑소좀 | 소수성 상호작용을 이용한 세포밖 소포체의 분리방법 |
US11524033B2 (en) | 2017-09-05 | 2022-12-13 | Torque Therapeutics, Inc. | Therapeutic protein compositions and methods of making and using the same |
CN109576219A (zh) * | 2017-09-29 | 2019-04-05 | 河南省肿瘤医院 | 一种用于扩增t淋巴细胞的纳米级膜性囊泡的制备方法 |
BR112020013405A2 (pt) * | 2018-01-25 | 2020-12-01 | Acm Biolabs Pte Ltd. | polimerossomas compreendendo um antígeno encapsulado solúvel, assim como métodos de sua fabricação e uso |
CN110123842B (zh) * | 2018-02-09 | 2022-03-15 | 上海市第六人民医院 | 一种外泌体缓释体系及其构建方法与应用 |
TW202023581A (zh) | 2018-08-02 | 2020-07-01 | 日商腫瘤療法 科學股份有限公司 | 來自cdca1的胜肽及含有此的疫苗 |
CN110876734A (zh) * | 2018-09-06 | 2020-03-13 | 杨昆德 | 包含胞外囊泡的制剂、用以制备该制剂的方法及其用途 |
IT201800009235A1 (it) | 2018-10-08 | 2020-04-08 | Universita' Degli Studi Di Palermo | Procedimento per la sintesi di esosomi contenenti proteine da shock termico e loro uso per il trattamento della atrofia muscolare e della cachessia |
WO2020157122A1 (en) | 2019-01-29 | 2020-08-06 | Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) | Treating the causative agent in adhesiogenesis |
CN116785416A (zh) * | 2023-06-14 | 2023-09-22 | 首都医科大学附属北京佑安医院 | 一种树突状细胞外泌体肝癌疫苗制备方法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69635895D1 (de) * | 1995-08-03 | 2006-05-04 | Rijksuniversiteit Te Leiden Le | Antigen presentierende bläschen, die von zellen ableiten |
US5962318A (en) * | 1996-11-15 | 1999-10-05 | St. Jude Children's Research Hospital | Cytotoxic T lymphocyte-mediated immunotherapy |
EP0983345A1 (en) * | 1997-05-21 | 2000-03-08 | THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services | Methods and compositions for making dendritic cells from expanded populations of monocytes and for activating t cells |
US6274378B1 (en) * | 1997-10-27 | 2001-08-14 | The Rockefeller University | Methods and compositions for obtaining mature dendritic cells |
US6080399A (en) * | 1998-04-23 | 2000-06-27 | Arch Development Corporation | Vaccine adjuvants for immunotherapy of melanoma |
-
1997
- 1997-07-16 FR FR9709007A patent/FR2766205B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-02-06 FR FR9801437A patent/FR2774697B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-03 DE DE69826288T patent/DE69826288T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-03 EA EA200000130A patent/EA002827B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-07-03 AU AU84464/98A patent/AU743296B2/en not_active Ceased
- 1998-07-03 IL IL13404398A patent/IL134043A0/xx unknown
- 1998-07-03 EP EP98935097A patent/EP1001806B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-03 DE DE69841146T patent/DE69841146D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-03 JP JP50654899A patent/JP3484201B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-07-03 EA EA200200517A patent/EA004300B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-07-03 CN CNB988072076A patent/CN1250285C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-07-03 EP EP04005883A patent/EP1523990B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-03 CA CA2296750A patent/CA2296750C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1998-07-03 AT AT98935097T patent/ATE275969T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-07-03 AT AT04005883T patent/ATE442160T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-07-03 ES ES98935097T patent/ES2227863T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-03 WO PCT/FR1998/001431 patent/WO1999003499A1/fr active IP Right Grant
- 1998-07-03 PT PT98935097T patent/PT1001806E/pt unknown
- 1998-07-03 DK DK98935097T patent/DK1001806T3/da active
- 1998-07-03 ES ES04005883T patent/ES2331838T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-21 TW TW087111592A patent/TW592708B/zh not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-03-15 US US09/267,370 patent/US6685911B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-08-07 JP JP2002230240A patent/JP3691468B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-07-02 US US10/610,709 patent/US7625573B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2331838T3 (es) | Vesicula celular denominada "exosoma", su preparacion y su utilizacion en la estimulacion de una respuesta inmunitaria. | |
JP6134763B2 (ja) | GM−CSF及びインターフェロンαを用いて生成され、且つ熱処理され死滅したがん細胞を取り込んだ樹状細胞 | |
US11278605B2 (en) | Method for preparing an immunogenic lysate, the lysate obtained, dendritic cells loaded with such lysate and a pharmaceutical composition comprising the lysate or the dendritic cells | |
KR101374091B1 (ko) | 수포에 담긴 불완전 리보솜 생성물(DRibble) 및 면역 반응을 자극하기 위해 이를 이용하는 방법 | |
BRPI0817535B1 (pt) | método in vitro eficiente para obter células apresentadoras de antígenos ativadas (apcs), especialmente células dendríticas (dcs), úteis na preparação de vacinas para o tratamento do câncer | |
JP2002514408A (ja) | 新規アポトーシス小体、それを含有する単球由来細胞、それらの調製方法、及びワクチンとしてのそれらの使用 | |
RU2759728C2 (ru) | Лекарственное средство | |
AU2002247813B2 (en) | Use of gram-negative bacterial membrane fraction for inducing the maturation of dendritic cells | |
KR19990063672A (ko) | 표적배향된 미립자물 유전 면역화에 의한 세포-매개 면역응답의 자극. | |
US20040022813A1 (en) | Shed antigen vaccine with dendritic cells adjuvant | |
Romagnoli et al. | Dendritic cell vaccines for cancer therapy: fundamentals and clinical trials | |
US20070259006A1 (en) | Shed antigen vaccine with dendritic cells adjuvant | |
Qiang et al. | Melanoma vaccine based on the vector of membrane fusogenic liposomes | |
JP2003511419A (ja) | ウイルス/抗原処理された樹状細胞による抗原特異的t細胞の活性化 |