ES2331451B1 - Inmunosupresor basado en la interrupcion de la interaccion tcr-nck. - Google Patents
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Abstract
Inmunosupresor basado en la interrupción de la
interacción TCR-Nck.
La presente invención se refiere a un compuesto
de fórmula estructural (I) y sus derivados, para su uso como
medicamento. Preferiblemente como agente inmunosupresor basado en
la interrupción de la interacción TCR-Nck.
Description
Inmunosupresor basado en la interrupción de la
interacción TCR-Nck.
La presente invención se refiere a un compuesto
de fórmula estructural (I)
y sus derivados, para su uso como
medicamento. Preferiblemente como agente inmunosupresor basado en
la interrupción de la interacción
TCR-Nck.
Los linfocitos T desempeñan un papel central en
el rechazo de alotransplantes y, de forma más o menos directa, en
la generación de enfermedades autoinmunes. Por ello los fármacos
inmunosupresores actuales basan su mecanismo de acción en la
inhibición de la activación de los linfocitos T. Estos
inmunosupresores presentan alta toxicidad, debido a que no inhiben
vías linfocitarias de modo especifico.
Los linfocitos T son activados a través del
receptor para antígeno (TCR) que reconoce al complejo principal de
histocompatibilidad (MHC) del órgano transplantado como extraño. El
TCR está formado por 6 subunidades, dos de las cuales (TRC\alpha
y TCR\beta) son responsables del reconocimiento de MHC unido a
péptidos antigénicos, mientras que las otras cuatro (CD3\gamma,
CD3\delta, CD3\varepsilon y CD3\zeta) son responsables de la
transmisión de señales al citoplasma del linfocito (revisado en
Alarcon, B., Gil, D., Delgado, P. and Schamel, W.W. (2003)
Immunol Rev, 191, 38-46). Uno de los
procesos iniciales que ocurren tras la ligación del TCR por parte
del MHC es la activación de las tirosina quinasas de la familia src,
Lck y Fyn, que fosforilan las tirosinas de los motivos ITAM de las
subunidades de CD3, que a su vez se convierten en sitios de anclaje
de las tirosina quinasas de la familia Syk (ZAP70 y Syk). Hasta
hace poco se pensaba que éste era el esquema lineal de transmisión
de señales, y que a partir de las quinasas de la familia Syk (ZAP70
sobre todo) se producía la divergencia en la cascada de activación
que resulta en la activación de diversos factores de transcripción,
incluido NFAT, blanco de los fármacos inmunosupresores ciclosporina
A y FK506 (Lin, J. and Weiss, A. (2001) J Cell Sci,
114, 243-244). Por su parte, los autores de
la presente invención descubrieron hace algunos años que, para
activarse, el TCR sufre un cambio conformacional que resulta en el
reclutamiento del adaptador Nck directamente a una secuencia rica
en prolinas (PRS) de la subunidad CD3\varepsilon (Gil, D.,
Schamel, W.W., Montoya, M., Sanchez-Madrid, F. and
Alarcon, B. (2002) Cell, 109,
901-912). Esta interacción TCR-Nck
se determinó como esencial para la activación de TCR mediante
experimentos de sobre-expresión del dominio SH3.1
amino-terminal de Nck (el que se
une a CD3\varepsilon) y mediante la introducción en los linfocitos T de el anticuerpo APA1/1, que se une a PRS y lo bloquea.
une a CD3\varepsilon) y mediante la introducción en los linfocitos T de el anticuerpo APA1/1, que se une a PRS y lo bloquea.
Un problema importante con los inmunosupresores
actuales es su toxicidad, debido a que no inhiben vías
linfocitarias de modo especifico.
La presente invención proporciona un compuesto
inmunosupresor más específico de linfocitos T y con menos efectos
secundarios que los actualmente existentes, basado en la
interrupción de la interacción TCR-Nck.
Para seleccionar el compuesto de la presente
invención, se ha tenido en cuenta tanto el cambio conformacional
del TCR, como el mecanismo de inicio de la transmisión de señales,
paso fundamental para el reclutamiento de proteínas efectoras.
El cambio conformacional en el TCR, que ocurre
tras la unión de anticuerpos estimuladores y de MHC, se puso
primeramente de manifiesto mediante un ensayo de
"pull-down", donde el TCR se une de forma
inducible a una matriz de la proteína de fusión
GST-Nck. Este ensayo bioquímico no permite
identificar de forma individual aquellas células cuyo TCR está
sufriendo el cambio conformacional. Sin embargo, los autores de la
presente invención demostraron que el anticuerpo APA1/1 también
reconoce el cambio conformacional (Risueno, R.M., Gil, D.,
Fernandez, E., Sanchez-Madrid, F. and Alarcon, B.
(2005) Blood, 106, 601-608). El
anticuerpo se puede utilizar en preparaciones de linfocitos T en
cultivo y también en cortes inmunohistoquímicos. Este reactivo
permite demostrar por otro procedimiento distinto al
"pull-down" la existencia del cambio
conformacional, además de demostrar que el cambio conformacional
ocurre in vivo. Es más, el anticuerpo reconoce las sinapsis
inmunitarias formadas entre linfocitos T y células presentadoras de
antígeno cargadas con un péptido agonista, pero no las sinapsis
formadas por un agonista parcial/antagonista. Estos datos sugieren
que el cambio conformacional en el TCR podría estar detrás de la
distinción entre agonistas fuertes y débiles por parte de los
linfocitos T y podría activar cascadas de activación específicas
durante el reconocimiento de ligandos fuertes. Esta hipótesis
parece corroborada por el hecho de que durante el desarrollo tímico
el cambio conformacional (visualizado mediante tinción con APA1/1)
ocurre durante el reconocimiento de ligandos que inducen selección
negativa, pero no durante el reconocimiento de ligandos que inducen
selección positiva (Risueno, R.M., van Santen, H.M. and Alarcon, B.
(2006) Proc Natl Acad Sci U S A., 103,
9625-9630). Por otra parte, la única consecuencia
conocida del cambio conformacional en el TCR es la exposición de la
PRS en CD3\varepsilon, aunque no se descarta que el cambio
conformacional se transmita también a las regiones citoplasmáticas
de las otras subunidades CD3 e influya globalmente en todo el
proceso de iniciación de la transmisión de señales por el TCR,
incluyendo la fosforilación en las tirosinas de los ITAMs (Minguet,
S., Swamy, M., Alarcon, B., Luescher, I.F. and Schamel, W.W. (2007)
Immunity., 26, 43-54). Sin embargo, el
reclutamiento de Nck a la PRS de CD3\varepsilon constituye un
posible mecanismo de la transmisión del cambio conformacional a
rutas de activación intracelulares (Gil, D., Schamel, W.W.,
Montoya, M., Sanchez-Madrid, F. and Alarcon, B.
(2002) Cell, 109, 901-912).
Con el fin de demostrar la importancia de la
interacción Nck-CD3\varepsilon en la activación
de linfocitos T y validar esta interacción como blanco de agentes
inmunomoduladores, se ha procedido al diseño de péptidos sintéticos
que mimetizaran la secuencia del PRS y que pudieran bloquear el
sitio de unión en Nck a CD3\varepsilon. Se ha obtenido así un
péptido, denominado 11R085, que es 300 veces más potente que un
péptido con la secuencia silvestre en la inhibición de la
interacción de CD3\varepsilon con el dominio SH3.1 de Nck.
Utilizando este péptido, se consigue inhibir de forma específica la
proliferación de linfocitos T humanos tanto CD4+ como CD8+ en
respuesta a la estimulación con anticuerpos
anti-CD3, con una IC50 de aproximadamente 20
\muM, mientras que la proliferación de linfocitos T humanos
dependiente de un recep-
tor diferente, el IL2R, no es prácticamente afectada por dicho péptido, incluso a concentraciones 3 veces superiores.
tor diferente, el IL2R, no es prácticamente afectada por dicho péptido, incluso a concentraciones 3 veces superiores.
Por tanto, el péptido 11R085 inhibe la
activación iniciada por el TCR pero no la activación mediada por
otro receptor, y por ello, es específico del blanco molecular para
el que está diseñado.
El péptido 11R085 también inhibe la producción
de IL2 y la proliferación inducida por antígeno en linfocitos
primarios de ratones transgénicos OT-I con una IC50
de aproximadamente 5 \muM. Queda así validada la interacción
Nck-CD3\varepsilon como blanco molecular para el
desarrollo de inmunosupresores.
A partir de este hecho, y utilizando estrategias
bioinformáticas de selección se realizó un cribado virtual de
compuestos que se unen al dominio SH3.1, tal y como se describe en
los ejemplos de la invención. Tras este cribado, se seleccionaron
los diez que teóricamente encajaban mejor en un bolsillo
hidrofóbico del SH3.1, encargado del reconocimiento de la secuencia
PRS de CD3\varepsilon (ver Fig. 1). Todos estos compuestos,
estrucuturalmente muy diferentes, tuvieron un cierto grado de
actividad, pero el que presenta un mayor grado de actividad y menos
toxicidad, incluso a dosis altas, (Fig.7), es el compuesto
denominado CBM-1,compuesto de formula estructural
(I).
El compuesto CBM-1 presentó
buena actividad y capacidad inmunosupresora, CBM-1
inhibe la proliferación de linfocitos T humanos inducida por
anticuerpos anti-CD3 pero no la proliferación
dependiente de IL2. Asimismo, inhibe la proliferación de linfocitos
T de ratón dependiente de antígeno y también inhibe la liberación
de IL2. En linfocitos humanos estimulados con anticuerpos
anti-CD3 y anti-CD28 inhibe la
producción de IFN\gamma, de IL-10 y de
TNF\beta, así como la generación de células humanas productoras
de IFN\gamma en respuesta a anti-CD3 y
anti-CD28. Estos datos verifican que este compuesto
tiene una acción inhibidora de la activación de linfocitos T, tanto
de ratón como humanos, a concentraciones bajas de a partir de 0.1
\muM, y preferiblemente en el rango de entre 0,1 y 1 \muM.
Por tanto, CBM-1 es activo como
inmunosupresor.
Por todo ello, un primer aspecto de la presente
invención, se refiere a un compuesto de fórmula (I):
o cualquiera de sus derivados,
entre los que se incluyen, sus sales, isómeros o mezclas de
isómeros, profármacos, formas cristalinas, etc... para su uso como
medicamento, preferiblemente como
inmunosupresor.
Entendiéndose por isómeros o mezclas de isómeros
en la presente invención:
- 1)
- isómeros en disposición Z o E definidos por la posición de los sustituyentes respecto a los enlaces múltiples que presentan los compuestos,
- 2)
- isómeros ópticos o enantiómeros, originados por la presencia de centros quirales (átomos unidos a cuatro sustituyentes diferentes) que provocan la diferenciación entre enantiómeros respecto a su actividad óptica (rotación de la luz polarizada al pasar a través de una solución del enantiómero),
- 3)
- diastereoisómeros, isómeros con al menos dos centros quirales, estando los sustituyentes de uno de dichos centros dispuestos igual en ambos diastereoisómeros y los sustituyentes de al menos otro de los centros dispuestos de forma distinta entre ambos.
Entendiéndose por
"pro-fármacos" de los compuestos de fórmula
(I), cualquier derivado (por ejemplo, ésteres, carbamatos, amidas
etc.), que, cuando se administra a un individuo, es capaz de
proporcionarle, directa o indirectamente, uno o varios de los
compuestos de dicha fórmula (I).
También se incorpora en la definición de
derivados, "formas cristalinas" de los compuestos de fórmula
(I) en estado libre o como solvatos. El término "solvato", tal
como aquí se utiliza, incluye tanto solvatos que puedan ser
utilizados en la composición de un medicamento, como solvatos útiles
en la preparación de dicho medicamento. Los solvatos pueden
obtenerse por métodos convencionales de solvatación bien conocidos
en el estado de la técnica.
En la presente invención, se entiende por
"sales", tanto las farmacéuticamente aceptables como las que
no sean farmacéuticamente aceptables pero que pueden ser útiles
asimismo en la preparación de fármacos, por lo que todas las sales
de los compuestos de la invención, sean o no farmacéuticamente
aceptables están incluidas en el ámbito de la presente
invención.
Por último, se incluye en la definición de
"derivados", aquellos compuestos de la invención que contengan
uno o más átomos isotópicamente enriquecidos. Por ejemplo,
compuestos con una de las fórmulas de la invención en las que uno o
varios átomos de hidrógeno han sido sustituidos por átomos de
deuterio o de tritio, uno o varios átomos de de carbono han sido
sustituidos por átomos de ^{13}C o ^{14}C o uno o varios átomos
de nitrógeno han sido sustituidos por ^{15}N.
El compuesto de fórmula (I) es capaz de unirse
al dominio SH3.1 de Nck interrumpiendo la interacción
TCR-Nck y por tanto, es un compuesto inmunosupresor
específico de linfocitos T, que presenta ventajas claras frente a
otros inmunosupresores, entre otras, originar menos efectos
secundarios.
Por todo ello, un aspecto de la invención versa
en el uso del compuesto de fórmula estructural (I) o cualquiera de
sus derivados para preparar un medicamento para el tratamiento y/o
prevención de enfermedades que cursen con la hiperproliferación de
linfocitos T.
Preferiblemente estas enfermedades son
enfermedades autoinmunes, enfermedades que cursan con rechazo de
alotranspiantes ó xenotransplantes de órganos ó tejidos, o linfomas
y/o leucemias T.
Más preferiblemente las enfermedades autoinmunes
son aquellas donde la activación de linfocitos T juegue un papel
importante en la fase de inducción y/o en la fase efectora, y más
preferiblemente las enfermedades autoinmunes sistémicas como
específicas de órgano de la lista que comprende: esclerosis
múltiple y variedades, lupus eritematoso sistémico, psoriasis,
vitíligo, artritis reumatoide, asma, psoriasis, hepatitis
autoinmune, diabetes de tipo I, miastenia gravis, espondilitis
anquilosante, enfermedad de Crohn, etc.
Otro aspecto de la invención está dirigido a una
composición farmacéutica que comprende el compuesto de fórmula
estructural (I), o cualquiera de sus derivados anteriormente
descritos, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En cada caso la composición se adaptará al tipo
de administración utilizada. Por ello, la composición descrita
anteriormente se puede presentar en una forma farmacéutica de
administración por vía oral, bien en forma sólida (e.g.,
comprimidos, grageas, cápsulas, etc.) o líquida (e.g., soluciones,
suspensiones, emulsiones, etc.), por vía parenteral (e.g.,
intramuscular, subcutánea, intravenosa, etc.), rectal,.... o
cualquier otra forma de administración clínicamente permitida y en
una cantidad terapéuticamente eficaz.
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente
aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son
los vehículos habitualmente utilizados en el estado de la técnica.
La composición farmacéutica proporcionada por esta invención puede
ser facilitada por cualquier vía de administración, para lo cual
dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a
la vía de administración elegida.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las
siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de
ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente
invención.
Fig 1. Modelo del dominio SH3.1
y cribado virtual de compuestos con potencial de
unión.
Cribado virtual de compuestos que se unen al
dominio SH3.1 de Nck. Modelo teórico de estructura del dominio
SH3.1 de Nck (panel A). El panel B muestra cómo encaja uno de esos
compuestos en la parte superior del modelo virtual.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig 2. Efecto selectivo de los
compuestos resultantes del cribado virtual en la proliferación
inducida por
anti-CD3.
Proliferación evaluada por citometría de flujo
de acuerdo con la pérdida de fluorescencia verde (CFSE) dentro de la
población CD8+. Los distintos compuestos se representan mediante el
código NSI seguido de un número. CBM-1 es el
compuesto NSI-65.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig 3. Efecto selectivo del
compuesto CBM-1 en la proliferación inducida por
anti-CD3.
Inhibición por CBM-1 de la
proliferación de linfocitos T humanos en respuesta a estimulación
con anticuerpos anti-CD3. Se comparan estos
resultados con los de proliferación de linfoblastos humanos
dependientes de IL2.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig 4. Inhibición de la
liberación de citoquinas por
CBM-1.
Inhibición por CBM-1 de la
secreción de citoquinas por linfocitos T humanos en respuesta a
estimulación con anticuerpos anti-CD3. Se
estimularon células mononucleares de la sangre periférica (PBMNC)
purificadas de donantes sanos durante 72 h sobre placas recubiertas
del anticuerpo anti-CD3 OKT3 en presencia de
distintas dosis de CBM-1. La concentración en el
sobrenadante de las citoquinas indicadas (IL-10,
IFN-\gamma, y TFN-\beta) se
evaluó mediante citometría de flujo multiparamétrica (cytometric
bead array de BD). El compuesto CBM-1 no mostró
efecto sobre la liberación de IL5, IL1-\beta e
IL6, mientras que IL2 e IL4 no fueron detectables.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig 5. Inhibición de la
producción intracelular de
IFN\gamma.
Expresión intracelular de IFN\gamma en
respuesta a la estimulación con una mezcla de
anti-CD3 y anti-CD28. En la gráfica
se muestra la expresión de IFN\gamma intracelular (como producto
del porcentaje de células positivas y de la fluorescencia media) en
función de la concentración del compuesto CBM-1.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig 6. Estructura por RMN del
dominio SH3.1 y desplazamientos producidos tras la unión del
péptido de alta afinidad
11R085.
Estructura por RMN del dominio SH3.1 de
Nck\alpha (A). Las cinco láminas \beta están numeradas en forma
consecutiva. N y C indican los extremos amino- y
carboxi-terminal, respectivamente. (B) Comparación
de los residuos desplazados por la unión del péptido de alta
afinidad 11R085 al dominio SH3.1 de Nck\alpha (en negro), con los
residuos correspondientes de Nck\beta.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig 7. Estructura por RMN del
dominio SH3.1 y desplazamientos producidos tras la unión de
CBM-1.
Desplazamientos de residuos aminoacídicos en el
dominio SH3.1 producidos por la interacción con el compuesto
CBM-1. Se representan las cadenas laterales de los
aminoácidos que cambian su posición tras unirse el compuesto. Los
cambios son consecuentes con la unión del compuesto
CBM-1 al bolsillo prevista en el cribado
virtual.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig 8. Toxicidad de
CBM-1.
La línea celular de linfocitos T humanos Jurkat
y la línea celular linfoblastoide B humana Raji fueron incubadas
con las concentraciones indicadas de CBM-1 durante
48 horas. La toxicidad del compuesto fue estimada mediante
exclusión de yoduro de propidio y citometría de flujo. Las dos
líneas celulares permanecieron con el 100% de viabilidad tras 48 h,
incluso a la dosis más alta de compuesto.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig 9. Comparación de la
secuencia primaria del dominio SH3.1 de Nck\alpha con las del
dominio SH3.1 de Nck\beta, así como con las de los dominios SH3.2
y SH3.3 de
Nck\alpha.
Las posiciones de las láminas \beta y los
bucles conectores en el dominio SH3.1 de Nck\alpha están
indicadas. Las flechas negras indican los residuos fuertemente
desplazados tras la unión del compuesto CBM-1.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores, que desarrollan
el enfoque llevado a cabo para identificar el compuesto de la
invención y comprobar su eficacia.
Con el fin de demostrar la importancia de la
interacción Nck-CD3\varepsilon en la activación
de linfocitos T y validar esta interacción como blanco de agentes
inmunomoduladores, se procedió primero al diseño de péptidos
sintéticos que mimetizaran la secuencia del PRS y que pudieran
bloquear el sitio de unión en Nck a CD3\varepsilon. Se consiguió
un péptido, denominado 11R085, que es 300 veces más potente que un
péptido con la secuencia silvestre en la inhibición de la
interacción de CD3\varepsilon con el dominio SH3.1 de Nck.
Utilizando este péptido, se consiguió inhibir de forma específica la
proliferación de linfocitos T humanos tanto CD4+ como CD8+ en
respuesta a la estimulación con anticuerpos
anti-CD3 con una IC50 de 20 \muM, mientras que la
proliferación de linfocitos T humanos dependiente de un receptor
diferente, el IL2R, no fue prácticamente afectada por el péptido a
concentraciones 3 veces superiores. Esto sugería que el péptido
11R085 inhibe la activación iniciada por el TCR pero no la
activación mediada por otro receptor, y que por lo tanto era
específico del blanco molecular para el que está diseñado. El
péptido 11R085 también inhibió la producción de IL2 y la
proliferación inducida por antígeno en linfocitos primarios de
ratones transgénicos OT-1 con una IC50 de 5 \muM.
Quedaba así validada la interacción
Nck-CD3\varepsilon como blanco molecular para el
desarrollo de inmunosupresores.
\vskip1.000000\baselineskip
Se han utilizado técnicas de modelado molecular
(Fiser, A., Feig, M., Brooks, C.L., 3rd and Sali, A. (2002) Acc
Chem Res., 35, 413-421) para obtener por homología
la estructura del dominio SH3.1 de Nck\alpha basándonos en su
secuencia y en la estructura de unos 50 dominios SH3 conocidos de
otras proteínas. De esta forma se ha llegado a un modelo teórico de
estructura que puede ajustarse con una muy buena fiabilidad a la
estructura real del dominio. Partiendo de esta estructura se hizo un
cribado virtual con software propio de una colección de más de
300.000 compuestos puestos a disposición por la empresa
norteamericana Chembridge y se seleccionaron los diez compuestos
que teóricamente encajaban mejor en un bolsillo hidrofóbico del
SH3.1, supuestamente encargado del reconocimiento de la secuencia
PRS de CD3\varepsilon (ver Fig. 1). Estos compuestos se
utilizaron posteriormente para realizar los ensayos de inhibición
de la proliferación de linfocitos T humanos estimulados con
anticuerpos anti-CD3.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la siguiente ronda de selección de los
compuestos resultantes del cribado virtual con potencial de bloqueo
de la interacción Nck-CD3\varepsilon, se marcaron
PBMNC purificadas de donantes sanos mediante fluorescencia y se
incubaron durante 5 días sobre placas recubiertas del anticuerpo
anti-CD3 OKT3 en presencia de distintas dosis de
dichos compuestos. La proliferación de los linfocitos T se evaluó
por citometría de flujo de acuerdo con la pérdida de fluorescencia
verde (CFSE) dentro de la población CD8+.
Todos los compuestos ensayados tuvieron un
cierto grado de actividad bloqueante de la proliferación de los
linfocitos, pero el mejor y menos tóxico fue el compuesto
denominado CBM-1 (compuesto de formula estructural
(I)), como se muestra en la figura 2 (Fig. 2), donde
CBM-1 está representado por el compuesto
NSI-65.
\vskip1.000000\baselineskip
Se marcaron PBMNC purificadas de donantes sanos
con CFSE y se incubaron durante 5 días sobre placas recubiertas del
anticuerpo anti-CD3 OKT3 en presencia de distintas
dosis de varios compuestos indicados, entre ellos
CBM-1. La proliferación se evaluó por citometría de
flujo de acuerdo con la pérdida de fluorescencia verde (CFSE)
dentro de las poblaciones CD4+ y CD8+. Se realizó en paralelo un
experimento de proliferación de linfoblastos humanos dependiente de
IL2. Se estimularon PBMNC purificadas de donantes sanos con PHA
durante 48 h y se marcaron con CFSE. Posteriormente se cultivaron
por 3 días en presencia de 100 IU/ml de IL2 humana recombinante en
presencia de las concentraciones de los compuestos utilizados,
particularmente de CBM-1.
\newpage
El compuesto CBM-1 inhibió la
proliferación inducida por anti-CD3 de linfocitos
CD4+ con una IC50 de 2 \muM y la de linfocitos CD8+ con una IC50
de 3 \muM (Fig. 3). El efecto inhibidor de otros de los compuestos
fue ligeramente inferior. CBM-1 no inhibió sin
embargo significativamente la proliferación de linfoblastos humanos
dependiente de IL2 a concentraciones de 20 \muM, indicando que su
especificidad frente a la proliferación dependiente de la
activación de TCR pero no frenta a la dependiente de IL2R. Este
dato apoya un mecanismo de acción selectivo sobre el TCR.
\vskip1.000000\baselineskip
El efecto del compuesto CBM-1
sobre la producción de citoquinas fue medido en un ensayo en que
PBMNC humanas fueron estimuladas con anticuerpos
anti-CD3. El sobrenadante de estas células fue
recogido a las 72 h y se midieron varias citoquinas simultáneamente
por un ensayo de citometría de flujo. Estos experimentos
demostraron que el compuesto tuvo un potente efecto inhibidor sobre
citoquinas Th1 como IFN\gamma (IC50 de 0,3 \muM), TNF\beta
(IC50 de 0,2 \muM) e IL10 (IC50 de 0,2 \muM) y no tuvo efecto
sobre la producción de IL5 e IL6 hasta concentraciones de 30 \muM
(Fig 4). Los datos indican por lo tanto que CBM-1
inhibe selectivamente la producción de algunas citoquinas por
linfocitos T, pero no de otras. Es decir, CBM-1
muestra un grado de selectividad en la inhibición de rutas
intracelulares de transmisión de señales.
\vskip1.000000\baselineskip
Para demostrar si los inhibidores previenen la
diferenciación de linfocitos Th0 a Th1, se realizaron ensayos de
diferenciación in vitro. Se estimularon células de bazo de
ratones C57BL/6 con anticuerpos anti-CD3 +
anti-CD28 durante 48 h en presencia de las
concentraciones de CBM-1 indicadas y se incubaron 6
horas más con brefeldina A, encontrándose que CBM-1
inhibe la generación de linfocitos Th1 secretores de IFN\gamma
con una IC50 de 0,8 \muM. Las células se tiñeron primero con
CD4-PE y después de fijar y permeabilizar se
tiñeron con anticuerpo anti-IFN\gamma. En la
gráfica (Fig. 5) se muestra la expresión de IFN\gamma
intracelular (como producto del porcentaje de células positivas y
de la fluorescencia media) en función de la concentración de
CBM-1.
\vskip1.000000\baselineskip
En paralelo, se determinó por RMN (en
colaboración con el laboratorio de los Prof. María Angeles Jiménez
y Manuel Rico, del Instituto de Química-Física
Rocasolano, CSIC, Madrid), la estructura tridimensional del dominio
SH3.1 de Nck\alpha con y sin el péptido 11R085 (Fig. 6). Esto
permitió validar la predicción del modelo de estructura in silico
utilizado para el cribado virtual. Además, permitió medir los
desplazamientos químicos ocasionados en la estructura por el
compuesto CBM-1 (Fig. 7).
Los resultados indican que el compuesto
CBM-1 interacciona estructuralmente con la proteína
aproximadamente en la forma predicha por los estudios
bioinformáticos. El compuesto se une en un bolsillo hidrofóbico en
el que participan los residuos Trp41 y Tyr50/Phe53, provocando una
distorsión y desplazamiento de la lámina \beta2 y de residuos en
el bucle distal (Fig. 7 y Fig. 9). Los desplazamientos de residuos
en el dominio SH3.1 validan la predicción sobre la interacción del
dominio SH3.1 con CBM-1 a nivel molecular y son
consecuentes con el modelo.
Claims (9)
1. Compuesto de fórmula (I):
y cualquiera de sus derivados para
su uso como
medicamento.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Uso del compuesto según reivindicación 1 para
preparar un medicamento.
3. Uso del compuesto según reivindicación 2 para
preparar un medicamento para el tratamiento y/o prevención de
enfermedades que cursen con la activación de linfocitos T ó con la
hiperproliferación o proliferación anormal de los mismos.
4. Uso del compuesto según reivindicación 3,
donde las enfermedades que cursan con la activación de linfocitos T
son enfermedades autoinmunes.
5. Uso del compuesto según reivindicación 4
donde las enfermedades autoinmunes se seleccionan de la lista que
comprende: esclerosis múltiple y sus variedades, lupus eritematoso
sistémico, psoriasis, vitíligo, artritis reumatoide, asma,
psoriasis, hepatitis autoinmune, diabetes de tipo I, miastenia
gravis, espondilitis anquilosante y enfermedad de Crohn.
6. Uso del compuesto según reivindicación 3
donde las enfermedades que cursan con la activación de linfocitos
T, son enfermedades que cursan con rechazo de alotransplantes ó
xenotransplantes de órganos ó tejidos.
7. Uso del compuesto según reivindicación 3
donde las enfermedades que cursan con la activación de linfocitos
T, son linfomas o leucemias T.
8. Composición farmacéutica que comprende el
compuesto según reivindicación 1 y un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
9. Uso de la composición farmacéutica según
reivindicación 6 como inmunosupresor.
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