CN102372767B

CN102372767B - 植物性状相关蛋白及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN102372767B
Application number: CN 201010257362
Authority: CN
Inventors: 白书农; 陈美琴; 王东辉; ***
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2010-08-19
Filing date: 2010-08-19
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2030-08-19
Also published as: CN102372767A

Abstract

本发明公开了一种植物性状相关蛋白及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1自氨基末端第1至450位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物种子大小和/或植株高度和/或开花时间相关的由序列1衍生的蛋白质。过量表达本发明提供的基因的植株表现出植株矮小、种子增大和开花期提前的表型，所以所述基因可用于植物的育种。

Description

植物性状相关蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种植物性状相关蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

核糖体是合成蛋白质的最基本场所，素有蛋白质工厂之称。理解核糖体最基本的工作方式对于科学地理解生命过程是非常重要的。在真核生物中，核糖体的形成主要发生在核仁里，但是后期的成熟过程是在细胞核和细胞质中进行的，而且这个过程直接关系到细胞生长，如细胞***，癌症细胞生成等。在酵母中，Nmd3p蛋白作为一个最基本的输出受体适配器进行了非常详尽的研究。NMD保守的序列从古细菌到人类的基因组中都存在，但只有在真核生物中有出核信号(Ho and Johnson，1999)，Nmd3p的出核信号功能随着真核生物的发生而起源，NMD3可能代表了在核糖体大亚基输出中第一个核输出受体适配器(Lo and Johnson，2009)。在植物中至今为止，还很少有文献报道对核糖体大分子如何从细胞核转运到细胞质的机制研究。对核糖体的工作机制理解的延伸，在未来的研究上，如果能对一些核糖体生物发生过程进行改造，也就是对合成蛋白的“机器”进行改造，会对现在存在的医学问题、生物能源问题的解决具有指导意义。

目前已培育的矮化植株在矮化同时却一般都不能解决种子增大的问题，即不能够提高抗性同时又能够提高产量。

发明内容

本发明的目的是提供植物性状相关蛋白及其编码基因和应用。

本发明提供的蛋白质名称为AtNMD3ΔNES，来源于哥伦比亚生态型拟南芥(Arabidopsis thaliana，Arabidopsis ecotype Col-0)，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1自氨基末端第1至450位氨基酸残基组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物种子大小和/或植株高度和/或开花时间相关的由序列1衍生的蛋白质。

为了使(a)中的AtNMD3ΔNES便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1 标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK

Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的AtNMD3ΔNES可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的AtNMD3ΔNES的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)序列表中序列2自5’末端第99至1448位核苷酸所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码植物种子大小和/或植株高度和/或开花时间相关蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码植物种子大小和/或植株高度和/或开花时间相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜一次。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。

所述重组表达载体可为将所述基因***pCambia2300的多克隆位点得到的重组质粒。所述重组表达载体具体可为按如下方法制备得到的重组质粒：

(1)用EGFP-F-NcoI(序列4)和EGFP-R-BamH(序列5)组成的引物对PCR扩增序列表的序列3所示的EGFP基因，得到PCR扩增产物A；用NMD3-GFP-F2(序列6)和pRTL2-nmd3-450(序列7)组成的引物对PCR扩增序列2自5’末端第99至1448位核苷酸所示的DNA分子，得到PCR扩增产物B；

(2)同时以PCR扩增产物A和PCR扩增产物B为模板，用EGFP-F-NcoI和pRTL2-nmd3-450进行PCR扩增，得到PCR扩增产物C；

(3)将PCR扩增产物C***pRTL2载体的NcoI和Xba I酶切位点间，得到pRTL2-EGFP-AtNMD3ΔNES。

(4)用限制性内切酶Pst酶切pRTL2-EGFP-AtNMDΔNES，回收小片段，将其***pCambia2300载体的Pst位点，得到重组质粒。

扩增所述基因或其反义基因的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到植株矮化和/或种子变大和/或开花期提前的转基因植物。所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。目的植物(被转化的植物宿主)既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。所述双子叶植物可为拟南芥，如哥伦比亚生态型拟南芥。

过量表达本发明提供的基因的植株表现出植株矮小、种子增大和开花期提前的表型，所以所述基因可用于植物的育种。

附图说明

图1为AtNMD3和AtNMDΔNES在拟南芥原生质体细胞中定位；Bar为10um。

图2为AtNMD3过表达植株中AtNMD3的RNA水平鉴定。

图3为AtNMDΔNES过表达植株中AtNMDΔNES的RNA水平鉴定。

图4为AtNMDΔNES过表达拟南芥和野生型拟南芥的表型(萌发后24天)；A：AtNMDΔNES过表达植株；B：野生型植株。

图5为AtNMDΔNES过表达拟南芥和野生型拟南芥的植株表型(萌发后80天)；A：哥伦比亚生态型拟南芥；B：AtNMDΔNES过表达植株；B的顶部为过表达植株开花部位的局部放大图。

图6为AtNMDΔNES过表达拟南芥和野生型拟南芥的种子比较。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。哥伦比亚生态型拟南芥(Arabidopsisecotype Col-0)：购自Arabidopsis Biological ResourceCenter，USA。

实施例1、AtNMD3蛋白及其编码基因的生物学信息分析

在拟南芥中与酵母Nmd3p同源蛋白的序列号为AT2G03820，编码nonsense-mediated mRNA decay family protein，以下简写为AtNMD3蛋白，全长516个氨基酸，分子量为59.29kd，等电点为5.56，与酵母Nmd3p蛋白同源性为36.98％(http://www.arabidopsis.org，http://www.tigr.orgAtNMD3的同源序列比对)。AtNMD3蛋白的氨基酸序列如序列表的序列1所示，其编码基因AtNMD3的编码区的核苷酸序列如序列表的序列2所示。

通过NCBI蛋白序列blast，选取了有代表性的22个物种(16个来自植物界包括绿藻，水稻，杨树等)的同源序列进行进化上的分析。用Neighbor joining tree建树法，取了NMD3的N端402AA进行比对。结果表明：在植物界的不同物种中都存在NMD3，其N-末端包含的4个半胱氨酸富集区CXXC在所有物种中进化都是非常保守的。

NES序列分析：用NetNES 1.1 Server对AtNMD3全长蛋白进行的出核信号分析，在第491-500AA位置上有很强的出核信号，而且同时在460AA左右也有微弱的出核信号；进一步把序列和已知的酵母、人中的NMD3出核序号比对，在相对的位置上拟南芥序列和酵母中非常保守富亮氨酸区域的出核信号区域是一致的，而且其上有460bp序列左右的第二出核信号区也是保守的；同时把AtNMD3中出核信号序列与已知的保守的出核信号序列比对表明，AtNMD3中出核信号序列与IkB-a类的出核信号最相似。

NLS序列分析：把拟南芥序列和已知的酵母、人中的NMD3核定位信号(NLS)比对，在396-428AA间有非常保守的NLS信号。

通过以上对AtNMD3生物学信息分析，结果表明：植物中都存在NMD3蛋白，而且AtNMD3在N端有保守的富CXXC区域，在C端在396-428AA区域具有保守核定位信号，在453-472AA区域有较弱的出核信号，同时在481-500AA区域有很强的保守出核信号。所有这些结果表明AtNMD3功能序列在进化上都是保守的。

去除出核信号后的AtNMD3基因即本发明保护的DNA片段(AtNMDΔNES)，其核苷酸序列如序列2自5’末端第99至1448位核苷酸所示。AtNMDΔNES编码450个氨基酸残基组成的蛋白(AtNMDΔNES)，如序列表的序列1自氨基末端第1至450个氨基酸残基所示。

实施例2、NMD3蛋白的核定位和核输出功能

一、重组质粒pRTL2-EGFP-AtNMD3ΔNES(AtNMD3ΔNES)的构建

1、制备EGFP基因

合成序列表的序列3所示的EGFP基因。用EGFP-F-NcoI和EGFP-R-BamH进行PCR扩增，以引入酶切位点。

EGFP-F-NcoI：5’-TATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT-3’(序列4)；

EGFP-R-BamH：5’-CGGGATCC cttgtac agctcgtcca tgccgaga-3’(序列5)。

2、制备AtNMD3ΔNES

提取哥伦比亚生态型拟南芥莲座叶的RNA，反转录为cDNA。将cDNA作为模板，用NMD3-GFP-F2和pRTL2-nmd3-450进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(AtNMD3ΔNES)。PCR扩增产物的除两端酶切位点以外的核苷酸序列如序列表的序列2自5’末端第99至1448位核苷酸所示。

NMD3-GFP-F2：5’-GGACGAGCTGTACAAG ATGTCAGTAA TGGATG-3’(序列6)；

pRTL2-nmd3-450：5’-GCTCTAGA g aaactcttcg tattctttgt ctgt-3’(序列7)。

3、融合基因EGFP-AtNMD3ΔNES的制备

同时以步骤1的PCR产物和步骤2的PCR产物为模板，用EGFP-F-NcoI和pRTL2-nmd3-450进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即融合基因EGFP-AtNMD32ΔNES。融合基因EGFP-AtNMD3ΔNES即将序列表的序列3自5’末端第1至717位核苷酸所示DNA和序列表的序列2自5’末端第99至1448位核苷酸所示DNA连接得到的DNA。

4、pRTL2-EGFP-A tNMD3ΔNES(AtNMD3ΔNES)的构建

①用NcoI和Xba I酶切步骤3获得的融合基因，回收酶切产物；

②用NcoI和Xba I酶切pRTL2载体(购自Biovector Science Lab)，回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接，得到pRTL2-EGFP-AtNMD3ΔNES。

二、重组质粒pRTL2-EGFP-AtNMD3(AtNMD3)的构建

1、制备EGFP基因

同步骤一的1。

2、制备AtNMD3

提取哥伦比亚生态型拟南芥莲座叶的RNA，反转录为cDNA。将cDNA作为模板，用NMD3-GFP-F2和pRTL2-nmd3-R进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(AtNMD3)。PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列2自5’末端第99至1646位核苷酸所示。

NMD3-GFP-F2：5’-GGACGAGCTGTACAAGATGTCAGTAA TGGATG-3’；

pRTL2-nmd3-R：5’-GCTCTAGAgTTCAGCAGCCATGTCGTCCTCGTCA-3’。

3、融合基因EGFP-AtNMD3的制备

同时以步骤1的PCR产物和步骤2的PCR产物为模板，用EGFP-F-NcoI和pRTL2-nmd3-R进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即融合基因EGFP-AtMD3。融合基因EGFP-AtNMD3即将序列表的序列3自5’末端第1至717位核苷酸所示DNA和序列表的序列2自5’末端第99至1646位核苷酸所示DNA连接得到的DNA。

4、pRTL2-EGFP-AtNMD3(AtNMD3)的构建

①用NcoI和Xba I酶切步骤3获得的融合基因，回收酶切产物；

②用NcoI和Xba I酶切pRTL2载体，回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接，得到pRTL2-EGFP-AtNMD3。

三、荧光显微镜下观察

AtNMD3-EGFP和AtNMDΔNES-EGFP分别瞬时转化拟南芥原生质体，36hrs后加入DAPI，10分钟后在倒置荧光显微镜下观察，分别在明场，GFP荧光，UV下拍照。见图1。全长AtNMD3，在细胞核内和细胞质内都均匀分布。去除出核信号的AtNMD3蛋白非常明显的定位于细胞核内。

实施例3、过表达植株的获得和鉴定

一、过表达植株的获得

1、AtNMD3过表达植株的获得

用限制性内切酶Pst酶切实施例2构建的pRTL2-EGFP-AtNMD3，回收3.5kb DNA片段(包括35S启动子和融合基因EGFP-AtNMD3)，将回收的DNA片段***pCambia2300载体(购买于Biovector Science Lab)的Pst位点，得到重组表达载体甲。

用重组表达载体甲转化农杆菌GV3101(购自北京天为时代科技有限公司)，然后通过花序浸泡法转化哥伦比亚生态型拟南芥(Col)，经过抗性筛选得到T1代阳性植株。对得到的阳性植株提取莲座叶RNA进行实时定量PCR检测(引物为NMD415-F：5’-GTTAGGGATAATCTGTGCGAGTC-3’；NMD521-R：5’-AAGAAAGTCCTCCTATGCGAAAC-3’)。

以UBQ基因的表达量为1(UBQ基因，AT4G0532010；目标条带153bp；qPCR引物：Ubq s5’-GTACTTTGGCGGATTACAACATC-3’，Ubq a5’-GAATACCTCCTTGTCCTGGATCT-3’)。

计算阳性植株和哥伦比亚生态型拟南芥中AtNMD3表达量，结果见图2。阳性植株中，AtNMD3的RNA表达水平显著高于野生型植株。同时将阳性植株进行GFP荧光检测，阳性植株中的确过量表达GFP。结果表明，得到的阳性植株确实为AtNMD3过表达植株。

2、AtNMDΔNES过表达植株的获得

用限制性内切酶Pst酶切实施例2构建的pRTL2-EGFP-AtNMDΔNES，回收3.2kb DNA片段(包括35S启动子和融合基因EGFP-AtNMD3ΔNES)，将回收的DNA片段***pCambia2300载体的Pst位点，得到重组表达载体乙。

用重组表达载体乙转化农杆菌GV3101，然后通过花序浸泡法转化哥伦比亚生态型拟南芥(Col)，经过抗性筛选得到T1代阳性植株。对得到的阳性植株提取莲座叶RNA进行实时定量PCR检测(引物为NMD415-F和NMD521-R)。以UBQ表达量为1，计算阳性植株和哥伦比亚生态型拟南芥中AtNMDΔNES表达量，结果见图3。阳性植株中，AtNMDΔNES的RNA表达水平显著高于野生型植株。同时将阳性植株进行GFP荧光检测，阳性植株中的确过量表达GFP。结果表明，得到的阳性植株确实为AtNMDΔNES过表达植株。

T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。

三、过表达植株的鉴定

1、开花时间统计及开花时莲座叶数统计

分别将T3代AtNMDΔNES过表达植株和哥伦比亚生态型拟南芥(野生型植株)的种子播种，萌发后置于16小时光照/8小时黑暗条件下培养，萌发开始第24天拍照、统计进入开花期的植株的比例并计算进入开花期的植株的莲座叶数。见图4和表2。

表2 过表达植株和野生型植株的开花时间及莲座叶数统计

	野生型植株	AtNMDΔNES过表达植株
			植株数	114株	22株
开花植株数	37株	21株
			开花植株比例	32.43％	95.24％
开花植株的平均莲座叶数(每株)	11.71±1.74	7.1±0.79
			萌发至开花平均所需天数	40天	24天

AtNMDΔNES过表达植株比野生型提前两个星期左右，具有早花表型。

2、株高统计

分别将T3代AtNMD过表达植株、T3代AtNMDΔNES过表达植株和哥伦比亚生态型拟南芥的种子(各50粒种子)播种，萌发后置于12h光照/12h黑暗下培养80天，拍照并统计株高平均值。

照片见图5。AtNMDΔNES过表达植株的平均株高为7.17cm，哥伦比亚生态型拟南芥的平均株高为36.43cm。AtNMDΔNES过表达植株的株高只有野生型植株的三分之一。AtNMD过表达植株的株高与野生型植株的株高没有显著差异，显著高于AtNMDΔNES过表达植株。

3、种子大小统计

观察T3代AtNMDΔNES过表达植株和哥伦比亚生态型拟南芥的种子。照片见图6。可见AtNMDΔNES过表达植株种子显著比野生型的种子大。

Claims

1.一种蛋白质，是由序列表中序列1自氨基末端第1至450位氨基酸残基组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是序列表中序列2自5’末端第99至1448位核苷酸所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因或其反义基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为按如下方法制备得到的重组质粒：

(1)用序列表的序列4和序列5所示DNA组成的引物对PCR扩增序列表的序列3所示的EGFP基因，得到PCR扩增产物A；用序列表的序列6和序列7所示DNA组成的引物对PCR扩增序列2自5’末端第99至1448位核苷酸所示的DNA分子，得到PCR扩增产物B；

(2)同时以PCR扩增产物A和PCR扩增产物B为模板，用序列表的序列4和序列7所示DNA组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物C；

(3)将PCR扩增产物C***pRTL2载体的NcoI和Xba I酶切位点间，得到重组载体；

(4)用限制性内切酶Pst酶切(3)得到的重组载体，回收小片段，将其***pCambia2300载体的Pst位点，得到重组质粒。

6.一种培育植株矮化、种子变大和开花期提前的转基因拟南芥的方法，是将权利要求2或3所述基因导入野生型拟南芥中，得到与所述野生型拟南芥相比具有植株矮化、种子变大和开花期提前性状的转基因拟南芥。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法是将权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5所述重组表达载体导入所述野生型拟南芥中。

8.权利要求2或3所述基因在植物育种中的应用。