ES2354259T3 - Plantas que tienen producción de semilla incrementada y método para elaborar las mismas. - Google Patents

Abstract

Método para incrementar la producción de semillas de planta bajo condiciones de crecimiento normales, con relación a plantas tipo silvestre que crecen bajo condiciones correspondientes, que comprende: (i) transformar una planta, parte de planta o célula de planta al introducir una construcción genética que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido EFTu que comprende: (i) los siguientes dominios de unión GTP: GXXXXGK y DXXG y NKXD y S/L/K/Q A/G UV/F, en donde X es cualquier aminoácido; y (ii) dominio EFTu ALMANPAIKR o un dominio que tiene por lo menos 75% de identidad con este y/o K D/G EE S/A; (ii) expresar dicho ácido nucleico; y (iii) objetivar el polipéptido en un plástido en la célula de planta, a menos que el ácido nucleico o su variante sea un gen plastídico.

Description

La presente invención se relaciona de manera general con el campo de la biología molecular y se relaciona con un método para incrementar la producción en una planta con relación a plantas tipo 5 silvestre correspondientes. Más específicamente, la presente invención se relaciona con un método para incrementar la producción de semillas bajo condiciones no tensionantes preferiblemente al incrementar la actividad en un plástido de un factor de elongación de traducción (EFTu) o un homólogo del mismo. La presente invención también se relaciona con plantas que tienen preferiblemente actividad incrementada en un plástido de un EFTu o un homólogo del mismo, cuyas 10 plantas tienen producción de semilla incrementada bajo condiciones no tensionantes con relación a plantas tipo silvestre correspondientes que crecen bajo condiciones comparables.

La población mundial en constante aumento y el suministro disminuido de tierra cultivable disponible para investigación de combustibles agrícolas apunta hacia el mejoramiento de la eficiencia de la agricultura. Los medios convencionales para las mejoras hortícolas y de cultivo utilizan técnicas 15 de siembra selectivas para identificar plantas que tienen características deseables. Sin embargo, tales técnicas de siembra selectivas tienen varios inconvenientes, a saber que estas técnicas tienen trabajo típicamente intenso y resulta en plantas que frecuentemente contienen componentes genéticos heterogéneos que no siempre pueden resultar en el rasgo deseable que se pasa desde las plantas progenitoras. Avances en la biología molecular han permitido al hombre modificar el germoplasma de 20 animales y plantas. La ingeniería genética de las plantas presume el aislamiento y manipulación del material genético (típicamente en la forma de ADN o ARN) y la introducción posterior de aquel material genético en una planta. Tal tecnología tiene la capacidad de suministrar cultivos o plantas que tienen varios rasgos hortícolas, agronómicos o económicos mejorados. Un rasgo de interés económico particular es la producción. La producción se define normalmente como la producción medible de 25 valor económico de un cultivo. Esto se puede definir en términos de cantidad y/o calidad. La producción es dependiente directamente de varios factores, por ejemplo, el número y tamaño de los órganos, la arquitectura de la planta (por ejemplo, el número de ramas), la producción de semilla y más. El desarrollo de la raíz, la captación de nutrientes y la tolerancia a la tensión también pueden ser factores importantes para determinar la producción. Por lo tanto la producción de cultivo se puede 30 incrementar al optimizar uno de los factores mencionados anteriormente. La producción de semillas también es un rasgo de interés económico particular con semillas de planta que son una fuente importante de nutrición humana y animal. Los cultivos tal como, maíz, arroz, trigo, canola y soya cuentan para la mitad de la captación calórica humana total, ya sea a través del consumo directo de las semillas en sí mismas o a través del consumo de productos alimenticios que surgen de las semillas 35 procesadas. Ellos también son una fuente de azúcares, aceites y muchos tipos de metabolitos utilizados en los procesos industriales. Las semillas contienen un embrión, la fuente de nuevos retoños y raíces después de germinación, y un endosperma, la fuente de nutrientes para el crecimiento de embriones, durante germinación y el crecimiento temprano de semillas. El desarrollo de una semilla involucra muchos genes, y requiere la transferencia de metabolitos de las raíces, hojas y tallos en el 40 crecimiento de la semilla. El endosperma, en particular, asimila los precursores metabólicos de polímeros de carbohidrato, aceite y proteínas y los sintetiza en macromoléculas de almacenamiento para el relleno del grano. La capacidad de incrementar la producción de semillas de planta, ya sea a través del número de semillas, biomasa de semillas, desarrollo de semillas, relleno de semillas, o cualquier otro rasgo relacionado con las semillas tendría muchas aplicaciones en la agricultura, y aún 45

muchos usos no agrícolas tal como en la producción biotecnológica de sustancias tal como farmacéuticos, anticuerpos o vacunas.

Se ha encontrado ahora que incrementar preferiblemente la actividad en un plástido de un factor de elongación de traducción (EFTu) da plantas que crecen bajo condiciones no tensionantes de producción de semilla incrementada con relación a plantas tipo silvestre correspondientes. 5

En las plantas, la síntesis de la proteína ocurre en tres compartimientos subcelulares, a saber el citoplasma, plástidos y mitocondria. Los mecanismos responsables para la síntesis de la proteína en el citoplasma, plástidos y mitocondria son distintos uno del otro. Las células de planta contienen por lo tanto tres tipos diferentes de ribosomas, tres grupos de ARN de transferencia (tARN), y tres conjuntos de factores auxiliares para la síntesis de proteína. Los plástidos y la mitocondria se 10 considera que han surgido a través de la endosimbiosis de organismos procarióticos antiguos. Consistente con esta teoría, la maquinaria sintética de proteína en los plástidos y la mitocondria se relaciona más cercanamente con sistemas bacterianos que con el aparato de traducción en el citoplasma de célula de planta circundante.

Los factores de elongación de traducción (EFTu) son componentes esenciales para la síntesis 15 de la proteína que juegan un papel en la elongación del polipéptido. El EFTu interactúa con aminoacilo tARN y transporta el tARN específico de codón al sitio aminoacilo en la ribosoma (sitio A ribosomal) durante la etapa de elongación de traducción. El EFTu se codifica en el cloroplasto de eucariotes fotosintéticos inferiores tal como Chlamydomonas y Euglena, aunque en plantas mayores una transferencia evolucionada de estos genes ocurre desde el cloroplasto al núcleo. Varios clones de 20 cADN que codifican el cloroplasto y otros EFTu se han identificado en un número de plantas mayores.

La solicitud de patente Estadounidense publicada US 2003/0044972 A1 a nombre de Ristic et al. describe una proteína de choque térmico con alta homología para el factor EFTA de elongación de cloroplasto y la expresión temporal y espacial de la proteína de choque térmico en un órgano o tejido 25 de la planta para mejorar la tolerancia al calor y sequía en los órganos reproductores femeninos.

Bhadula et al. (Planta (2001) 212: 359-366) muestra la síntesis inducida por tensión al calor de EFTu en una variedad de maíz tolerante al calor.

Aunque es evidente de la técnica anterior que el EFTu tenga un papel protector durante la tensión por calor, no es evidente de la técnica anterior que el EFTu daría cualquier efecto benéfico 30 bajo condiciones de crecimiento normales o no tensionantes.

Ahora se ha encontrado sorprendentemente que incrementar preferiblemente la actividad en un plástido de un EFTu o un homólogo del mismo da plantas que crecen bajo condiciones no tensionantes de la producción incrementada con relación a plantas tipo silvestre que crecen bajo condiciones correspondientes. 35

La referencia aquí a "plantas tipo silvestre" significa cualesquier plantas de control adecuadas, cuya elección estaría dentro de las capacidades de una persona experta en la técnica y puede incluir, por ejemplo, plantas tipo silvestre correspondientes o plantas correspondientes sin el gen de interés. Una "planta de control " o "planta tipo silvestre" como se utiliza aquí no solo se refiere a plantas completas, sino también a partes de plantas, que incluye semillas y partes de semilla. 40

La referencia aquí a "condiciones no tensionantes" significa cultivo/crecimiento de una planta en cualquier etapa en su ciclo de vida (desde la semilla a la planta madura y antes de semilla de nuevo) bajo condiciones de crecimiento normales que incluyen las tensiones leves diarias que encuentra cada planta, pero que no incluyen tensión severa. Las plantas responden típicamente a exposición a la tensión al crecer más lentamente. En condiciones de tensión severa, la planta aún 45

pueden detener el crecimiento completo. De otra parte se define aquí la tensión leve como cualquier tensión a la que se expone una planta que no resulta en el cese del crecimiento de la planta completa sin la capacidad para reanudar el crecimiento. Un ejemplo de una tensión severa que se excluye específicamente es temperaturas por encima de 35°C cuando se mide en la sombra por un termómetro casero en un instrumento shelter que es siempre de materiales que pueden absorber el calor y afectuar 5 una lectura de temperatura de aire exacta. Otro ejemplo de una tensión severa que se excluye específicamente es tensión por sequía, que se define aquí como un incremento continuo en el grado de secado durante un periodo de siete días en comparación con una cantidad "normal" o promedio. Tales cantidades normal o promedio variarán de región a región.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para incrementar la 10 producción de plantas bajo condiciones de crecimiento normales con relación a plantas tipo silvestre correspondientes que crecen bajo condiciones comparables, que comprende las etapas como se define en la reivindicación 1.

Ventajosamente, el desempeño de los métodos de acuerdo con la presente invención resulta en plantas que tienen producción de semilla incrementada, especialmente producción de semilla 15 incrementada.

El término "producción incrementada" como se define aquí significa un incremento en una cualquiera o más de las siguientes obtenidas bajo condiciones no tensionantes, cada una con relación a plantas tipo silvestre correspondientes: (i) biomasa incrementada (peso) de una o más partes de una planta, particularmente partes aéreas (consechables), biomasa de raíz incrementada o biomasa 20 incrementada de cualquier otra parte; (ii) producción de semilla incrementada, que puede resultar de un incremento en biomasa de semilla (peso de semilla) y que puede ser un incremento en el peso de semilla por planta o sobre una base de semilla individual, y cuyo incremento en el peso de semilla puede ser debido a dimensiones de semilla alteradas, tal como longitud de semilla y/o amplitud de semilla y/o área de semilla y/o perímetro de semilla; (iii) número incrementado de flores 25 (florecimientos) por panícula, que se expresa como una relación del número de semillas rellenas sobre el número de panículas primarias; (iv) índice de relleno de semilla incrementado (que es el número de semillas rellenas dividido por el número total de semillas y multiplicado por 100); (v) número incrementado de semillas (rellenas); (vi) tamaño de semilla incrementado; (vii) volumen de semilla incrementado; (viii) índice de cosecha incrementado, que se expresa como una relación de la 30 producción de partes cosechables, tal como semillas, sobre la biomasa total; y (ix) peso incrementado de miles de granos (TKW), que se extrapola del número de semillas rellenas contadas y su peso total; un TKW incrementado puede resultar de un tamaño de semilla incrementado y/o peso de semilla. Un TKW incrementado también puede resultar de un incremento en el tamaño del embrión y/o tamaño del endoesperma. 35

Tomando el maíz como un ejemplo, se puede manifestar una producción incrementada como uno o más de los siguientes: incremento en el número de plantas por hectárea o acre, un incremento en el número de mazorcas por planta, un incremento en el número de surcos, número de granos por surco, peso de grano, peso de miles de granos, longitud/diámetro de mazorcas, entre otros. Tomando el arroz como un ejemplo, se puede manifestar una producción incrementada mediante un incremento 40 en uno o más de los siguientes: número de plantas por hectárea o acre, número de panículas por planta, número de espigas por panícula, número de flores por panícula, incremento en el índice de relleno de semilla, incremento en peso de miles de granos, entre otros. Un incremento en la producción también puede resultar en arquitectura modificada, o puede ocurrir debido a la arquitectura modificada. 45

De acuerdo con la invención, los métodos resultan en plantas que tienen producción de semilla incrementada, tal como se define en (ii) a (ix) anterior. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona a método para incrementar la producción de semillas en una planta que crece bajo condiciones no tensionantes, cuyo método comprende preferiblemente incrementar la actividad en un plástido de un polipéptido EFTu o un homólogo del mismo como se define mediante 5 las etapas de acuerdo con la reivindicación 1.

Ya que las plantas transgénicas tienen producción incrementada, esto significa que estas plantas exhiben un índice de crecimiento incrementado (durante por lo menos parte de su ciclo de vida), con relación al índice de crecimiento de plantas tipo silvestre correspondientes en una etapa correspondiente en su ciclo de vida. El índice de crecimiento incrementado puede ser específico para 10 una o más partes de una planta (que incluye semillas), o puede ser sustancialmente a través de la planta completa. Una planta que tiene un índice de crecimiento incrementado puede aún exhibir florecimiento temprano. El incremento en el índice de crecimiento puede tener lugar en una o más etapas en el ciclo de vida de una planta o durante sustancialmente el ciclo de vida de la planta completa. El índice de crecimiento incrementado durante las etapas tempranas en el ciclo de vida de 15 una planta puede reflejar vigor mejorado. El incremento en el índice de crecimiento puede alterar el ciclo de cosecha de una planta que permite a las plantas ser cosechadas después y/o cosechadas tan pronto que sea de otra forma posible. Si el índice de crecimiento se incrementa suficientemente, este puede permitir la siembra de semillas adicionales de la misma especie de planta (por ejemplo siembra y cosecha de plantas de arroz seguido por siembra y cosecha de plantas de arroz adicionales dentro de 20 un periodo de crecimiento convencional). De forma similar, si el índice de crecimiento se incrementa suficientemente, este puede permitir la siembra de semillas adicionales de diferentes especies de plantas (por ejemplo la siembra y cosecha de plantas de arroz seguido por, por ejemplo, la siembra y cosecha opcional de soya, papa o cualquier otra planta adecuada). También puede ser posibles tiempos de cosecha adicionales del mismo almacenamiento de raíz en el caso de algunas plantas. Alterar el 25 ciclo de cosecha de una planta puede conducir a un incremento en la producción de biomasa anual por acre (debido a un incremento en el número de tiempos (en un año) que cualquier planta particular se puede hacer crecer y cosechar). Un incremento en el índice de crecimiento también puede permitir el cultivo de plantas transgénicas en un área geográfica más amplia que sus contrapartes tipo silvestre, ya que frecuentemente se determinan las limitaciones territoriales para hacer crecer un cultivo mediante 30 condiciones de ambiente adversas en el momento de plantar (estación temprana) o en el tiempo de cosecha (estación tardía). Tales condiciones adversas se pueden evitar si el ciclo de cosecha es más corto. El índice de crecimiento se puede determinar al suministrar varios parámetros de curvas de crecimiento, tales parámetros pueden ser: TMid (tiempo tomado para plantas que alcanzan 50% de su tamaño máximo) y T-90 (tiempo tomado para plantas que alcanzan 90% de su tamaño máximo), entre 35 otros.

El desarrollo de los métodos da plantas que tienen un índice de crecimiento incrementado. Por lo tanto, también se proporciona un método para incrementar el índice de crecimiento de plantas que crecen bajo condiciones no tensionantes, cuyo método comprende preferiblemente incrementar la actividad en un plástido de un polipéptido similar a EFTU o un homólogo del mismo. 40

Las características de crecimiento mencionadas anteriormente se pueden modificar ventajosamente en cualquier planta.

El término "planta" como se utiliza aquí abarca plantas completas, ancestros y progenie de plantas y partes de plantas (tal como células de plantas, semillas, brotes, tallos, hojas, raíces, flores y tubérculos), tejidos y órganos, en donde cada uno de los mencionados anteriormente comprenden el 45

gen/ácido nucleico de interés. El término "planta" también abarca cultivos en suspensión, tejido de callo, embriones, regiones meristemáticas, gametofitos, esporofitos, polen, y microesporas, de nuevo en donde cada uno de los mencionados anteriormente comprenden el gen/ácido nucleico de interés.

Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y 5 plantas dicotiledóneas que incluyen forrajeras leguminosas o forraje, plantas ornamentales, cultivos de alimentos, árboles o arbustos seleccionados de la lista que comprende Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra 10 spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chaenomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Diheteropogon amplectens, 15 Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehrartia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalyptus spp., Euclea schimperi, Eulalia villosa, Fagopyrum spp., Feijoa sellowiana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksii, Geranium thunbergii, Ginkgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemarthia altissima, Heteropogon contortus, Hordeum 20 vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hyperthelia dissoluta, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesii, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago sativa, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., 25 Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativum, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonarthria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys verticillata, Sequoia 30 sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofa, espárragos, brócoli, col de bruselas, repollo, canola, zanahoria, coliflor, cereal, hojas de col, lino, col rizada, lenteja, aceite 35 de semilla de colza, quingombó, cebolla, papa, arroz, soya, caña, remolacha, caña de azúcar, girasol, tomate, calabaza, té y algas, entre otros. De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, la planta es una planta de cultivo tal como soya, girasol, canola, alfalfa, colza, algodón, tomate, papa, tabaco, calabaza, papaya, álamo, leguminosa, lino, lupinus y sorgo. Preferiblemente adicionalmente, la planta es una planta monocotiledónea, tal como caña de azúcar, más 40 preferiblemente la planta es un cereal tal como arroz, maíz, trigo, cebada, sorgo dulce, arroz, sorgo y avena.

La actividad de un polipéptido EFTu se puede incrementar preferiblemente al incrementar los niveles del polipéptido (en un plástido). Alternativamente, la actividad también se puede incrementar cuando no hay cambio en los niveles de EFTu, o aún cuando existe una reducción en los niveles de un 45

polipéptido EFTu. Esto puede ocurrir cuando las propiedades intrínsecas del polipéptido se alteran, por ejemplo, al hacer versiones mutantes que son más activas que el polipéptido tipo natural. La referencia aquí a incrementar "preferiblemente" la actividad significa un incremento objetivo en la actividad en un plástico anterior que se encuentra en plástidos de plantas tipo silvestre bajo condiciones no tensionantes. 5

La actividad se puede incrementar preferiblemente en un plástido utilizando técnicas bien conocidas en el arte, tal como al objetivar la actividad en el plástido utilizando secuencias de péptido transitorias o mediante la transformación de un plástido. La actividad se puede incrementar en cualquier plástido, sin embargo, se prefiere preferiblemente incrementar la actividad en un cloroplasto. 10

El término "EFTu (polipéptido) o un homólogo del mismo" como se define aquí se refiere a un polipéptido que comprende: (i) los siguientes dominios de unión GTP en cualquier orden GXXXXGK y DXXG y NKXD y S/L/K/Q A/G L/V/F, en donde X es cualquier aminoácido; y (ii) dominio EFTu ALMANPAIKR o un dominio que tiene un orden incrementado de preferencia de por lo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad con este y/o K D/G 15 EE S/A.

Un "polipéptido o un homólogo del mismo EFTu" se puede identificar fácilmente utilizando técnicas de rutina bien conocidas en el arte. Los motivos definidos anteriormente son altamente conservados, por lo tanto permiten a una persona experta identificar fácilmente las secuencias EFTu que caben dentro de la definición anterior. 20

La secuencia del polipéptido EFTu de planta representada por la SEQ ID NO: 2, codificada por el ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1, se encuentra en la base de la homología para un factor de transcripción en Drosophila. Ejemplos de polipéptidos derivados de planta que caben bajo la definición de un "EFTu o un homólogo del mismo" incluyen: SEQ ID NO: 4 de Nicotiana tabacum; SEQ ID NO: 6 de Arabidopsis thaliana; SEQ ID NO: 8 de Nicotiana sylvestris; SEQ ID NO: 10 un 25 factor de elongación traduccional de cloroplasto de arroz; SEQ ID NO: 12 un factor de elongación mitocondrial de Arabidopsis thaliana; SEQ ID NO: 14 un factor de elongación mitocondrial de Arabidopsis thaliana; SEQ ID NO: 16 de Oryza sativa; SEQ ID NO: 18 de Zea mays (codificado por un gen nuclear para un producto mitocondrial); SEQ ID NO: 20 de Arabidopsis thaliana; y SEQ ID NO: 22 Synechocystis. 30

La tabla adelante muestra el porcentaje de homología de varias secuencias de polipéptido EFTu comparado con la secuencia de aminoácido representado por la SEQ ID NO: 2 con base en la alineación de secuencia global general. El porcentaje de identidad se calcula utilizando un programa NCBI con parámetros defectuosos.

Tabla 1: Homología de secuencias de proteína como EFTU con la SEQ ID NO: 2 con base en 35 alineación de secuencia global general

Fuente y tipo EFTu

SEQ ID NO:/NCBI Número de acceso Alineación EMBOSS de longitud completa

Tabaco (EFTu B)

SEQ ID NO: 2

Tabaco (EFTu A)

SEQ ID NO: 4 M94204 Identidad: 439/489 (89.8%) # Similitud: 457/489 (93.5%)

Tabaco (EFTu B)

SEQ ID NO: 8 D11470 # Identidad: 485/485 (100.0%) # Similitud: 485/485 (100.0%)

Arabidopsis (EFTu A)

SEQ ID NO: 6 X52256 Identidad: 398/487 (81.7%) # Similitud: 434/487 (89.1%)

arroz (EFTu A)

SEQ ID NO: 10 AF145053

Arabidopsis (radículo sobreregulado EFTu)

S09152 Identidad: 398/487 (81.7%) # Similitud: 434/487 (89.1%)

arroz (EFTu A)

AF327413 Identidad: 367/488 (75.2%) # Similitud: 411/488 (84.2%)

Arabidopsis (tufA)

CAA36498.1 At4g20360 X52256

Arabidopsis (EFTu M-tipo - mitocondrial)

SEQ ID NO: 12 At4g02930 Identidad: 297/494 (60.1%) # Similitud: 346/494 (70.0%)

Arabidopsis (EFTu M-tipo - mitocondrial)

SEQ ID NO: 14 X89227 (cerca a At4g02930) # Identidad: 295/507 (58.2%) # Similitud: 347/507 (68.4%)

arroz (EFTu M-tipo- mitocondrial)

SEQ ID NO: 16 AF327062; XM_470417 Identidad: 287/500 (57.4%) # Similitud: 332/500 (66.4%)

Arabidopsis EFTu M-tipo - mitocondrial)

AL161495, X89227

Maíz (EFTu M-tipo - mitocondrial)

SEQ ID NO: 18 AF264877 Identidad: 280/489 (57.3%) # Similitud: 333/489 (68.1%)

Guisante (EFTu)

CAA74893 Identidad: 405/495 (81.8%) # Similitud: 445/495 (89.9%)

Soya (tuf A)

CAA46864 Identidad: 409/492 (83.1%) # Similitud: 444/492 (90.2%)

Tomate (EFTu)

BT014591 Identidad: 438/486 (90.1%) # Similitud: 456/486 (93.8%)

Soya (EFTu)

CAA61444 Identidad: 411/489 (84.0%) # Similitud: 440/489 (90.0%)

Pelargonio (EFTu)

AAK08141 Identidad: 398/487 (81.7%) # Similitud: 428/487 (87.9%)

También se puede llevar a cabo cualquier ensayo para determinar la actividad EFTu. Una primera etapa se involucraría en el aislamiento de los plástidos (por ejemplo, cloroplastos), luego de obtener EFTA purificado para la determinación de la actividad específica (intercambio GDP). Una persona experta en la técnica fácilmente sería capaz de aislar plástidos utilizando técnicas bien 5 conocidas en el arte. Para un ejemplo de aislamiento de cloroplasto, ver Olsson et al., (J Biol Chem. 2003 Nov 7:278(45): 44439-47). De forma similar, una persona experta en la técnica también fácilmente sería capaz de purificar EFTu. Como un ejemplo, ver Stanzel et al., (Eur J Biochem. 1994 Jan 15:219 (1-2):435-9) para un método para la purificación de EFTA total. Adicionalmente, una persona experta en la técnica también será capaz fácilmente de determinar la actividad específica de 10 EFTu. Ver por ejemplo Zhang et al., (J. Bacteriol. 176, 1184-1187) para un ensayo de intercambio [3H] GDP para la determinación de la actividad de pre-EFTu recombinante.

Se entiende que las secuencias que caben dentro de la definición de "polipéptido EFTu o su homólogo" no se limitan a las secuencias representadas por la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID 15

NO: 18, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 22, pero que cualquier polipéptido encuentra el criterio de motivos que comprenden: (i) los siguientes dominios de unión GTP en cualquier orden GXXXXGK y DXXG y NKXD y S/L/K/Q A/G L/V/F, en donde X es cualquier aminoácido; y (ii) dominio EFTu ALMANPAIKR o un dominio que tiene 50% de identidad con este y/o K D/G EE S/A puede ser adecuado para uso en los métodos de la invención. 5

El ácido nucleico que codifica un polipéptido EFTu o un homólogo del mismo puede ser cualquier ácido nucleico sintético o natural. Un polipéptido EFTu o un homólogo del mismo como se definió aquí anteriormente es uno que se codifica por un ácido nucleico/gen EFTu. Por lo tanto, el término "ácido nucleico/gen EFTu " como se define aquí es cualquier ácido nucleico/gen que codifica un polipéptido similar a EFTu o un homólogo del mismo como se definió aquí anteriormente. 10 Ejemplos de ácidos nucleicos EFTu incluyen aquellos representados por una cualquiera de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 21. Sus variantes y ácidos nucleicos/genes EFTu pueden ser adecuadas en practicar los métodos de la invención. Los ácidos nucleicos/genes EFTA variantes incluyen porciones de un ácido nucleico/gen EFTu y/o ácidos 15 nucleicos capaces de hibridar con un ácido nucleico/gen EFTu.

El término porción como se define aquí se refiere a una pieza de ADN que comprende por lo menos suficientes nucleótidos para codificar una proteína que comprende: (i) los siguientes dominios de unión GTP en cualquier orden GXXXXGK y DXXG y NKXD y S/L/K/Q A/G L/V/F, en donde X es cualquier aminoácido; y (ii) dominio EFTu ALMANPAIKR o un dominio que tiene 50% de 20 identidad con este y/o K D/G EE S/A. Se puede preparar una porción, por ejemplo, al hacer una o más eliminaciones en un EFTu nucleico agregado. Las porciones se pueden utilizar en forma aislada o ellas se pueden fusionar en otras secuencias codificantes (o no codificantes) con el fin de, por ejemplo, producir una proteína que combina varias actividades. Cuando se fusiona a otras secuencias codificantes, el polipéptido resultante producido luego de traducción puede ser mayor que aquel 25 predicho para el fragmento EFTu. Preferiblemente, la porción funcional es una porción de un ácido nucleico como se representa por una cualquiera de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 21.

Otro ácido nucleico/gen EFTA variante es un ácido nucleico capaz de hibridar bajo 30 condiciones exigentes reducidas, preferiblemente bajo condiciones exigentes, con un ácido nucleico/gen EFTu como se definió aquí anteriormente, cuya secuencia hibridante codifica un polipéptido que comprende: (i) los siguientes dominios de unión GTP en cualquier orden GXXXXGK y DXXG y NKXD y S/L/K/Q A/G L/V/F, en donde X es cualquier aminoácido; y (ii) dominio EFTu ALMANPAIKR o un dominio que tiene 50% de identidad con este y/o K D/G EE S/A. 35 Preferiblemente, la secuencia hibridante es una que es capaz de hibridar a un ácido nucleico como se representa por una cualquiera de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 21 o en una porción de cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente como se definió aquí anteriormente. 40

El término "hibridación" como se define aquí es un proceso en donde las secuencias de nucleótido complementarias sustancialmente homólogas hibridan una a la otra. El procedo de hibridación puede ocurrir completamente en la solución, es decir están en la solución ambos ácidos nucleicos complementarios. El proceso de hibridación también puede ocurrir con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados en una matriz tal como glóbulos magnéticos, glóbulos de 45

Sefarosa o cualquier otra resina. El proceso de hibridación puede ocurrir adicionalmente con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados en un soporte sólido tal como una nitro-celulosa o membrana de nylon o inmovilizado mediante por ejemplo fotolitografía en, por ejemplo, un soporte vítreo silícico (el último conocido como disposición o microdisposición de ácido nucleico o como chips de ácido nucleico). Con el fin de permitir que ocurra la hibridación, las moléculas de ácido 5 nucleico son generalmente térmicamente o químicamente desnaturalizadas para fundir un bicatenario en dos monocatenarios y/o para remover horquillas u otras estructuras secundarias de ácidos nucleicos monocatenarios. La exigencia de hibridación se influencia mediante condiciones tal como temperatura, concentración de sal, resistencia iónica y composición de amortiguador de hibridación.

"Condiciones de hibridación exigentes" y "condiciones de lavado de hibridación exigentes" 10 en el contexto de los experimentos de hibridación de ácido nucleico tal como hibridaciones Southern y Northern son secuencias dependientes y son diferentes bajo diferentes parámetros ambientales. El artesano experto es consciente de varios parámetros que se pueden alterar durante la hibridación y lavado y que mantendrán o cambiarán las condiciones exigentes.

El Tm es la temperatura bajo resistencia iónica definida y pH, en el que 50% de la secuencia 15 objetivo hibrida a una sonda que coincide perfectamente. El Tm es dependiente de las condiciones de solución y la composición base y longitud de la sonda. Por ejemplo, las secuencias más largas hibridan específicamente en temperaturas mayores. El índice máximo de hibridación se obtiene de aproximadamente 16°C hasta 32°C por debajo de Tm. La presencia de cationes monovalentes en la solución de hibridación reduce la repulsión electrostática entre las dos cepas de ácido nucleico que 20 promueven la formación de híbrido; este efecto es visible para concentraciones de sodio de hasta 0.4M. La formamida reduce la temperatura de fusión de dúplex de ADN-ADN y ADN-ARN con 0.6 a 0.7°C para cada porcentaje de formamida, y la adición de 50% de formamida permite la hibridación a ser desarrollada de 30 a 45°C, aunque el índice de hibridación será más bajo. Las coincidencias de par base reducen el índice de hibridación y la estabilidad térmica de los dúplex. En sondas promedio y 25 largas, el Tm reduce aproximadamente 1°C por % de coincidencia base. El Tm se puede calcular utilizando las siguientes ecuaciones, dependiendo de los tipos de híbridos:

1. híbridos ADN-ADN (Meinkoth y Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984):

2. híbridos ADN-ARN o ARN-ARN: 30

3. híbridos oligo-ADN o oligo-ARNd:

Para <20 nucleótidos: Tm= 2 (In)

para 20-35 nucleótidos: Tm= 22 + 1.46 (In)

a o para otro catión monovalente, sino solo exacto en el rango 0.01-0.4 M. 35

b solo exacto para %GC en el rango 30% a 75%.

c L = longitud de dúplex en pares base.

d Oligo, oligonucleótido; In, longitud efectiva del cebador = 2X(no. de G/C)+(no. de A/T).

Nota: para cada 1 % de formamida, el Tm se reduce mediante aproximadamente 0.6 a 0.7°C, aunque la presencia de 6 M urea reduce el Tm mediante aproximadamente 30°C 40

La especificidad de la hibridación es típicamente la función de lavados post-hibridación. Para remover el antecedente resultante de la hibridación no específica, las muestras se lavan con soluciones de sal diluidas. Los factores críticos de tales lavados incluyen resistencia iónica y temperatura de la

solución de lavado final: la concentración de sal inferior y la temperatura de lavado mayor, la exigencia mayor de lavado. Las condiciones de lavado se desarrollan típicamente en o por debajo de la exigencia de hibridación. Generalmente, las condiciones exigentes adecuadas para ensayos de hibridación de ácido nucleico o procedimientos de detección de amplificación de gen son como se estableció anteriormente. Las condiciones de mayor o menor exigencia también se pueden seleccionar. 5 Generalmente, se selecciones condiciones de baja exigencia por ser aproximadamente 50°C menores que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica en una resistencia iónica y pH definido. Las condiciones de exigencia media son cuando la temperatura es 20°C por debajo de Tm, y las condiciones de exigencia altas son cuando la temperatura es 10°C por debajo de Tm. Por ejemplo, las condiciones exigentes son aquellas que son por lo menos tan exigentes como, por ejemplo, 10 condiciones A-L; y las condiciones exigentes reducidas son por lo menos tan exigentes como, por ejemplo, condiciones M-R. Se puede controlar la unión no específica utilizando uno cualquiera de un número de técnicas conocidas tal como, por ejemplo, bloquear la membrana con soluciones que contienen proteína, adiciones de ARN, ADN, y SDS heterólogos para el amortiguador de hibridación, y tratamiento con Rnasa. Ejemplos de hibridación y condiciones de lavado se listan en la Tabla 2 15 adelante.

Tabla 2: Ejemplos de hibridación y condiciones de lavado

Condición exigente

Híbrido polinucleótido ± Longitud de híbrido (bp) ± Temperatura de hibridación y amortiguador ƚ Temperatura de lavado y amortiguadorƚ

A

ADN:ADN > o igual a 50 65°C 1XSSC; o 42°C, 1XSSC y 50% formamida 65°C; 0.3XSSC

B

ADN:ADN <50 Tb*; 1XSSC Tb*; 1XSSC

C

ADN:ARN > o igual a 50 67°C 1XSSC; o 45°C, 1XSSC y 50% formamida 67°C; 0.3XSSC

D

ADN:ARN <50 Td*; 1XSSC Td*; 1XSSC

E

ARN:ARN > o igual a 50 70°C 1XSSC; o 50°C, 1XSSC y 50% formamida 70°C; 0.3XSSC

F

ARN:ARN <50 Tf*; 1XSSC Tf*; 1XSSC

G

ADN:ADN > o igual a 50 65°C 4XSSC; o 45°C, 4XSSC y 50% formamida 65°C; 1XSSC

H

ADN:ADN <50 Th*; 4 XSSC Th*; 4XSSC

I

ADN:ARN > o igual a 50 67°C 4XSSC; o 45°C, 4XSSC y 50% formamida 67°C; 1XSSC

J

ADN:ARN <50 Tj*; 4 XSSC Tj*; 4 XSSC

K

ARN:ARN > o igual a 50 70°C 4XSSC; o 40°C, 6XSSC y 50% formamida 67°C; 1XSSC

L

ARN:ARN <50 Tl*; 2 XSSC Tl*; 2XSSC

M

ADN:ADN > o igual a 50 50°C 4XSSC; o 40°C, 6XSSC y 50% formamida 50°C; 2XSSC

N

ADN:ADN <50 Tn*; 6 XSSC Tn*; 6XSSC

O

ADN:ARN > o igual a 50 55°C 4XSSC; o 42°C, 6XSSC y 50% formamida 55°C; 2XSSC

P

ADN:ARN <50 Tp*; 6 XSSC Tp*; 6XSSC

Q

ARN:ARN > o igual a 50 60°C 4XSSC; o 45°C, 6XSSC y 50% formamida 60°C.; 2XSSC

R

ARN:ARN <50 Tr*; 4 XSSC Tr*; 4XSSC

‡ La “longitud del híbrido” es la longitud anticipada para el ácido nucleico hibridizante. Cuando los ácidos nucleicos de la secuencia conocida se hibridan, se puede determinar la longitud del híbrido para alinear las secuencias e identificar las regiones conservadas descritas aquí. ƚ SSPE (1 X SSPE es 0.15M de NaCl, 10mM de NaH2PO4 y 1.25mM de EDTA, pH 7.4) se puede sustituir por SSC (1XSSC es 0.15M NaCl y 15mM citrato de sodio) en la hibridación y amortiguadores de lavado; los lavados se desarrollan durante 15 minutos después que se completa la hibridación. Las hibridaciones y lavados pueden incluir adicionalmente 5 X reactivo de Denhardt. 5-1.0% SDS, 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado, desnaturalizado, 0.5% de pirofosfato de sodio, y hasta 50% formamida. * Tb-Tr: La temperatura de hibridación para los híbridos se anticipa por ser menos de 50 pares base en longitud debe ser 5-10°C menos que la temperatura de fusión Tm de los híbridos; el Tm se determina de acuerdo con las ecuaciones mencionadas anteriormente. ± También se describe la sustitución de uno cualquiera, o más patrones de híbrido ADN o ARN con un PNA, o un ácido nucleico codificado.

Para los propósitos de definir el nivel de exigencia, se puede hacer referencia a Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3ra Edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York o a Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989).

El ácido nucleico EFTu o su variante se pueden derivar desde cualquier fuente natural o 5 artificial. El ácido nucleico/ gen o su variante se puede aislar de una fuente microbiana, tal como bacteria, levadura u hongo, o de una planta, alga o fuente animal. Este ácido nucleico se puede modificar desde su forma nativa en la composición y/o ambiente genómico a través de la manipulación humana deliberada. El ácido nucleico es preferiblemente de origen de planta, de la misma especie de planta (por ejemplo a una en la que este se introduce) o de una especie de planta 10 diferente. El ácido nucleico se puede aislar de una planta dicotiledónea, preferiblemente de la familia Solanaceae, adicionalmente preferiblemente del género Nicotianae, más preferiblemente de tabaco. Más preferiblemente, el ácido nucleico EFTu aislado del tabaco se representa por la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácido EFTu es como se representa por la SEQ ID NO: 2. El ácido nucleico de origen de planta es preferiblemente un ácido nucleico plastídico (es decir derivado de un plástido). 15 Los ácidos nucleicos plastídicos tienen una relación más cercana a los ácidos nucleicos bacterianos que a los ácidos nucleicos no plastídicos. Por lo tanto, la invención también se puede desarrollar

utilizando ácidos nucleicos bacterianos EFTu o sus variantes. Los ácidos nucleicos bacterianos se objetivan en un plástido, preferiblemente a un cloroplasto. Adicionalmente, la mitocondria también tiene un origen común en los ácidos nucleicos plastídicos y bacterianos y por lo tanto la invención también se puede desarrollar utilizando un ácido nucleico mitocondrial EFTu o su variante que puede ser de origen animal o de hongo. Los ácidos nucleicos mitocondriales se objetivan en un plástido, 5 preferiblemente a un cloroplasto. A pesar que se relaciona menos cercanamente en un ácido nucleico plastídico que el ácido nucleico bacteriano o mitocondrial, un ácido nucleico citosólico también puede ser adecuado para uso en los métodos de la invención siempre y cuando el ácido nucleico se objetiva en un plástido, preferiblemente en un cloroplasto.

Los métodos para objetivar a los plástidos son bien conocidos en la técnica e incluyen el uso 10 de péptidos transitorios. La Tabla 3 adelante muestra ejemplos de péptidos transitorios que se pueden utilizar para objetivar cualquier proteína EFTu en un plástido, cuyo EFTu, en su forma natural, normalmente no se objetiva en un plástido, o cuyo EFTu en su forma natural se objetiva en un plástido por virtud de un péptido transitorio diferente (por ejemplo, su péptido transitorio natural).

Tabla 3: Ejemplos de secuencias de péptido transitorias útiles en objetivar aminoácidos a 15 plástidos

Número de acceso NCBI/SEQ ID NO

Organismo fuente Función de proteína Secuencia de péptido transitoria

SEQ ID NO: P07839

Chlamydomonas Ferredoxin MAMAMRSTFAARVGAKPAVRGARPASRMSCMA

SEQ ID NO: AAR23425

Chlamydomonas Rubisco activasa MQVTMKSSAVSGQRVGGARVATRSVRRAQLQV

SEQ ID NO: CAA56932

Arabidopsis thaliana asp Amino transferasa MASLMLSLGSTSLLPREINKDKLKLGTSASNPFLKAKSFSRVT MTVAVKPSR

SEQ ID NO: CAA31991

Arabidopsis thaliana Proteína portadora acilo 1 MATQFSASVSLQTSCLATTRISFQKPALISNHGKTNLSFNLRRSIPSRRLSVSC

SEQ ID NO: CAB63798

Arabidopsis thaliana Proteína portadora acilo 2 MASIAASASISLQARPRQLAIAASQVKSFSNGRRSSLSFNLRQLPTRLTVSCAAKPETVDKVCAVVRKQL

SEQ ID NO: CAB63799

Arabidopsis thaliana Proteína portadora acilo 3 MASIATSASTSLQARPRQLVIGAKQVKSFSYGSRSNLSFNLR QLPTRLTVYCAAKPETVDKVCAVVRKQLSLKE

La actividad de un polipéptido EFTu o un homólogo del mismo se puede incrementar al introducir una modificación genética (preferiblemente en el sitio de un gen EFTu). El sitio de un gen como se define aquí significa una región genómica, que incluye el gen de interés y 10KB en la 20 dirección 3’ o 5’ de la región codificante.

Se puede introducir la modificación genética, por ejemplo, mediante uno cualquiera (o más) de los siguientes métodos: activación TADN, TILLING, mutagenia dirigida a sitio, evolución dirigida,

recombinación homóloga y al introducir y expresar en una célula de planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido EFTu o un homólogo del mismo (el producto de gen luego se puede objetivar en un plástido en la célula de planta, a menos que el gen que se expresa sea un gen plastídico). Luego de la introducción de la modificación genética, sigue una etapa de seleccionar la actividad incrementada de un polipéptido EFTu, cuyo incremento en la actividad da plantas que tienen 5 producción incrementada.

El objetivo de activación de T-ADN (Hayashi et al. Science (1992) 1350-1353) involucra la inserción de T-ADN que contiene usualmente un promotor (también puede ser un mejorador de traducción o un intrón), en la región genómica del gen de interés o 10KB en la corriente 3’ o 5’ de la región codificante de un gen en una configuración de tal manera que el promotor dirige la expresión 10 del gen objetivo. Típicamente, la regulación de la expresión del gen objetivo mediante su promotor natural se interrumpe y el gen cabe dentro del control del promotor nuevamente introducido. El promotor se embebe típicamente en un T-ADN. Este TADN se inserta aleatoriamente en el genoma de la planta, por ejemplo, a través de la infección de Agrobacterium y conduce a la sobreexpresión de genes cerca al T-ADN insertado. Las plantas transgénicas resultantes muestran fenotipos dominantes 15 debido a la sobreexpresión de dosis de genes en el promotor introducido. El promotor a ser introducido puede ser cualquier promotor capaz de dirigir la expresión de un gen en el organismo deseado, en este caso una planta. Por ejemplo, los promotores constitutivos, inducibles, preferidos de tipo celular y preferidos de tejido son adecuados para uso en la activación de T-ADN. Se prefiere el uso de un promotor específico de semilla, más particularmente un promotor específico de aleron y/o 20 de embrión.

También se puede introducir una modificación genética en el sitio de un gen EFTu utilizando la técnica de TILLING (Lesiones Locales Inducidas por el Objetivo EN Genomas). Esta es una tecnología de mutagenia útil para generar y/o identificar, y eventualmente aislar las variantes mutagenizadas de un ácido nucleico EFTu capaz de exhibir la actividad EFTu. El TILLING también 25 permite la selección de plantas que llevan tales variantes mutantes. Estas variantes mutantes aún pueden exhibir mayor actividad EFTu que aquella exhibida mediante el gen en su forma natural. EL TILLNG combina mutagenia de alta densidad con métodos de detección de alto rendimiento. Las etapas típicamente que siguen en TILLING son: (a) mutagenia EMS (Redei y Koncz, 1992; Feldmann et al., 1994; Lightner and Caspar, 1998); (b) preparación y agrupamiento de ADN de individuos; (c) 30 amplificación de PCR de una región de interés; (d) desnaturalización e hibridación para permitir la formación de heterodúplex; (e) DHPLC, en donde la presencia de un heterodúplex en un grupo se detecta como un pico extra en el cromatograma; (f) identificación del individuo mutante; y (g) secuenciamiento del producto mutante PCR. Los métodos para TILLING son bien conocidos en la técnica (McCallum Nat Biotechnol. 2000 Apr; 18(4):455-7, revisado por Stemple 2004 (TILLING-a 35 high-throughput harvest for functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2004 Feb; 5(2):145-50.)).

Se puede utilizar mutagenia dirigida a sitio para generar variantes de ácidos nucleicos EFTu. Varios métodos están disponibles para alcanzar la mutagenia dirigida a sitio, los métodos con PCR son más comunes (current protocols in Molecular Biology. Wiley Eds. http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html). 40

También se puede utilizar evolución directa (o mezcla génica) para generar variantes de ácidos nucleicos EFTu. Esto consistes de iteraciones de mezcla de ADN seguido por detección apropiada y/o selección para generar e identificar variantes que tienen una actividad biológica modificada (Castle et al., (2004) Science 304(5674): 1151-4; patentes Estadounidenses 5,811,238 y 6,395,547). 45

La activación de TADN, TILLING, mutagenia dirigida a sitio y evolución dirigida son ejemplos de tecnologías que permite la generación de alelos novedosos y variantes EFTu.

La recombinación homóloga permite la introducción en un genoma de un ácido nucleico seleccionado en una posición seleccionada definida. La recombinación homóloga es una tecnología estándar utilizada rutinariamente en ciencias biológicas para organismos inferiores tal como levadura 5 o el musgo physcomitrella. Los métodos para desarrollar la recombinación homóloga en plantas se ha descrito no solo para plantas modelo (Offringa et al. Extrachromosomal homologous recombination and gene targeting in plant cells after Agrobacterium-mediated transformation. 1990 EMBO J. 1990 Oct; 9(10):3077-84) sino también para plantas de cultivo, por ejemplo arroz (Terada R, Urawa H, Inagaki Y, Tsugane K, lida S. Efficient gene targeting by homologous recombination in rice. Nat 10 Biotechnol. 2002. lida and Terada: A tale of two integrations, transgene and T-DNA: gene targeting by homologous recombination in rice. Curr Opin Biotechnol. 2004 Apr; 15(2):132-8). El ácido nucleico a ser objetivado (que puede ser un ácido nucleico EFTu o su variante como se definió aquí anteriormente) no necesita ser objetivado en el sitio de un gen EFTu, sino que se puede introducir en, por ejemplo, regiones de alta expresión. El ácido nucleico a ser objetivada puede ser un alelo 15 mejorado utilizado para reemplazar el gen endógeno o se puede introducir en adición al gen endógeno.

La producción de semillas de planta se puede incrementar en plantas que crecen bajo condiciones no tensionantes al introducir y expresar en una planta, parte de planta o célula de planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido EFTu o un homólogo del mismo. El polipéptido luego se puede objetivar en un plástido en la célula de planta, a menos que el gen a ser expresado sea un gen 20 plastídico. Un polipéptido EFTu o un homólogo del mismo como se mencionó anteriormente es uno que comprende: (i) los siguientes dominios de unión GTP en cualquier orden GXXXXGK y DXXG y NKXD y S/L/K/Q A/G L/V/F, en donde X es cualquier aminoácido; y (ii) dominio EFTu ALMANPAIKR o un dominio que tiene 50% de identidad con este y/o K D/G EE S/A. El ácido nucleico a ser introducido en una planta puede ser un ácido nucleico de longitud completa o puede ser 25 una porción o una secuencia hibridante como se definió aquí anteriormente.

"Homólogos" de una proteína abarca péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácido con relación a la proteína no modificada en cuestión y tienen actividad biológica y funcional como la proteína no modificada de la cual ellos se derivan. Para producir tales homólogos, los aminoácidos de la proteína 30 se pueden reemplazar por otros aminoácidos que tienen propiedades similares (tal como hidrofobicidad, hidrofilicidad, antigenicidad, propensión similar para formar o romper estructuras helicoidales α o estructuras de lámina β). Las tablas de sustitución conservativa son bien conocidas en el arte (ver por ejemplo Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company y Tabla 1 anterior).

De acuerdo con una característica preferida, el homólogo tiene que incrementar el orden de 35 preferencia por lo menos 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad de secuencia para la secuencia de aminoácido mediante la SEQ ID NO: 2. Si un polipéptido tiene por lo menos 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad en el aminoácido representado por la SEQ ID NO: 2 se puede establecer fácilmente mediante la alineación de secuencia. Los métodos para la alineación de secuencia para comparación son bien conocidos en la 40 técnica, tales métodos incluyen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. El GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970) para encontrar la alineación de dos secuencias completas que maximiza el número de coincidencias y minimiza el número de espacios. El algoritmo BLAST calcula el porcentaje de identidad de secuencia y desarrolla un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias. El software para desarrollar análisis BLAST está 45

disponible públicamente a través del Centro Nacional para la Información Biotecnológica. Un polipéptido EFTu o un homólogo del mismo que tiene por lo menos 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad en el aminoácido representado por la SEQ ID NO: 2 se puede identificar fácilmente al alinear una secuencia de consulta (preferiblemente una secuencia de proteína) con secuencias de proteína EFTu conocidas (ver por ejemplo la alineación mostrada en la 5 Figura 1). La secuencia de consulta se puede alinear (con secuencias similares a EFTU conocidas) utilizando, por ejemplo, el programa de alineación múltiple VNTI AlignX, con base en un algoritmo modificado clustal W (InforMax, Bethesda, MD, http: //www.informaxinc.com), con configuración predeterminada para penalidad de espacio abierto de 10 y una extensión de espacios de 0.05.

También se abarca por el término "homólogos" dos formas especiales de homología, que 10 incluyen secuencias ortólogas y secuencias parálogas, que abarcan conceptos evolutivos utilizados para describir la relación ancestral de los genes. El término "parálogos" se relaciona con duplicaciones de gen dentro del genoma de una especie que conduce a genes parálogos. El término "ortólogos" se relaciona con genes homólogos en diferentes organismos debido a especiación.

Los ortólogos en, por ejemplo, especies de plantas monocotiledóneas se pueden encontrar 15 fácilmente al desarrollar una así llamada búsqueda explosión recíproca. Esto se puede hacer mediante primero explosión involucrando la secuencia de consulta blasting (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2) contra cualquier base de datos se secuencia, tal como la base de datos NCBI disponible públicamente que se puede encontrar en: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov. El BLASTN o TBLASTX (utilizando valores estándar por defecto) se puede utilizar cuando se parte de una secuencia de 20 nucleótido y el BLASTP o TBLASTN (utilizando valores estándar por defecto) se puede utilizar cuando se parte de una secuencia de proteína. Los resultados de BLAST se pueden filtrar opcionalmente. Las secuencias de longitud completa de los resultados filtrados o los resultados no filtrados se les hace BLAST nuevamente (segundo BLAST) contra secuencias del organismo del cual se deriva la secuencia de consulta (en donde la secuencia de consulta es la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID 25 NO: 2 el segundo blast por lo tanto estaría contra las secuencias de tabaco). Los resultados del primer y segundo BLAST luego se comparan. Se identifica un parálogo si una coincidencia de alto nivel del segundo blast es de la misma especie como de la cual se deriva la secuencia de consulta; se identifica un ortólogo si un golpe de alto nivel no es de la misma especie como de la cual se deriva la secuencia de consulta. Las coincidencias de alto nivel son aquellos que tienen un valor E inferior. El valor E 30 inferior, la clasificación más significativa (o en otras palabras el cambio inferior que la coincidencia se encuentra mediante cambio). La computación del valor E es bien conocida en el arte. En el caso de familias grandes, se puede utilizar ClustalW, seguido por un árbol vecino unido, para ayudar a visualizar el agrupamiento de los genes relacionados y para identificar ortólogos y parálogos.

Un homólogo puede estar en la forma de una "variante de sustitución" de una proteína, es 35 decir en donde por lo menos un residuo en una secuencia de aminoácido se ha removido y un residuo diferente insertado en su lugar. Las sustituciones de aminoácido son típicamente de residuos únicos, pero se puede agrupar dependiendo de limitaciones funcionales puestas en el polipéptido; las inserciones usualmente serán del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos de aminoácido. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácido comprenden sustituciones de aminoácido 40 conservativas.

Un homólogo también puede estar en la forma de una "variante de inserción" de una proteína, es decir en donde se introducen uno o más residuos de aminoácido en un sitio predeterminado en una proteína. Las inserciones pueden comprender fusiones del Terminal carboxi y/o terminal amino así como también inserciones intra-secuencia de únicos o múltiples aminoácidos. Generalmente, las 45

inserciones dentro de la secuencia de aminoácido serán más pequeñas que las fusiones del terminal amino- o carboxi, del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos. Ejemplos de proteínas o péptidos de fusión de terminal amino- o carboxi incluyen el dominio de unión o dominio de activación de un activador transcripcional cuando se utiliza en el sistema de dos híbridos de la levadura, las proteínas de recubrimiento de fago, etiqueta (histidina)6, etiqueta glutationa Stransferasa, proteína A, proteína 5 de unión maltosa, dihidrofolato reductasa, epítopo de Etiqueta 100, epítopo c-myc, epítopo FLAG®, lacZ, CMP (péptido de unión calmodulin), epítopo HA, epítopo de proteína C y epítopo VSV.

Los homólogos en la forma de "variantes de eliminación" de una proteína se caracterizan por la remoción de uno o más aminoácidos de una proteína.

Las variantes de aminoácido de una proteína se pueden hacer fácilmente utilizando técnicas 10 de péptido sintético bien conocidas en el arte, tal como síntesis de péptido de fase sólida y similares, o mediante manipulaciones de ADN recombinantes. Los métodos para la manipulación de las secuencias de ADN para producir variantes de sustitución, inserción o eliminación de una proteína son bien conocidos en el arte. Por ejemplo, las técnicas para elaborar las mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en ADN son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica e incluyen 15 mutagenia de M13, mutagenia de T7-Gen in vitro (USB, Cleveland, OH), Mutagenia Dirigida a Sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagenia dirigida a sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagenia dirigida a sitio.

El polipéptido EFTu o su homólogo puede ser un derivado. "Derivados" incluyen péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que pueden comprender sustituciones, eliminaciones 20 o adiciones De residuos de aminoácido de ocurrencia natural o no natural comparado con la secuencia de aminoácido de una forma de ocurrencia natural de la proteína, por ejemplo, como se presenta en la SEQ ID NO: 2. "Derivados" de una proteína abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que pueden comprender residuos de aminoácido de ocurrencia no natural, acilados, glucosilados y alterados de ocurrencia natural comparado con la secuencia de aminoácido de una 25 forma de ocurrencia natural del polipéptido. Un derivado también puede comprender uno o más sustituyentes sin aminoácido comparado con la secuencia de aminoácido de la cual este se deriva, por ejemplo una molécula reportera u otro ligando, unido covalentemente o no covalentemente a la secuencia de aminoácido, tal como una molécula reportera que se une para facilitar su detección, y residuos de aminoácido de ocurrencia no natural con relación a la secuencia de aminoácido de una 30 proteína de ocurrencia natural.

El polipéptido EFTu o su homólogo se pueden codificar mediante una variante de división alternativa de un ácido nucleico/gen EFTu. El término "variante de división alternativa" como se utiliza aquí abarca variantes de una secuencia de ácido nucleico en la que los intrones y/o exones seleccionados se han cortado, reemplazado o agregado. Tales variantes serán otras en las que la 35 actividad biológica de la proteína se retiene, que se puede lograr al retener selectivamente segmentos funcionales de la proteína. Tales variantes de división se pueden encontrar en la naturaleza o se puede hacer por el hombre. Los métodos para elaborar tales variantes de división son bien conocidos en la técnica. Las variantes de división preferidas del ácido nucleico se representan por una cualquiera de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ 40 ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 21. Las variantes de división útiles en los métodos de la invención son aquellos que codifican polipéptidos que comprenden: (i) los siguientes dominios de unión GTP en cualquier orden GXXXXGK y DXXG y NKXD y S/L/K/Q A/G L/V/F, en donde X es cualquier aminoácido; y (ii) dominio EFTu ALMANPAIKR o un dominio que tiene 50% de identidad con este y/o K D/G EE S/A. 45

El homólogo también se puede codificar mediante una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un polipéptido EFTu o un homólogo del mismo, preferiblemente una variante alélica del ácido nucleico representada por la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 21. Son útiles en los métodos de la invención las variantes alélicas que codifican 5 polipéptidos que comprende: (i) los siguientes dominios de unión GTP en cualquier orden GXXXXGK y DXXG y NKXD y S/L/K/Q A/G L/V/F, en donde X es cualquier aminoácido; y (ii) dominio EFTu ALMANPAIKR o un dominio que tiene 50% de identidad con este y/o K D/G EE S/A. Las variantes alélicas que existen en la naturaleza y se abarcan dentro de los métodos de la presente invención es el uso de estos alelos naturales. Las variantes alélicas abarcan Polimorfismos de 10 Nucleótido Únicos (SNP), así como también Polimorfismos de Inserción/Eliminación Pequeños (INDEL). El tamaño de los INDEL es usualmente menos de 100 bp. Las SNP y los INDEL forman el conjunto más grande de variantes de secuencia en cepas polimórficas de ocurrencia natural de la mayoría de organismos.

Como se describe, se prevé la expresión incrementada o mejorada del ácido nucleico EFTu o 15 su variante. Los métodos para obtener expresión incrementada o mejorada de genes o productos de gen se documentan bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, sobreexpresión conducida por promotores apropiados, el uso de mejoradores de transcripción o mejoradores de traducción. Los ácidos nucleicos aislados que sirven como elementos promotores o mejoradores se pueden introducir en una posición apropiada (típicamente en la dirección 5’) de una forma no heteróloga de un 20 polinucleótido con el fin de regular por aumento la expresión de un ácido nucleico EFTu o su variante. Por ejemplo, se pueden alterar promotores endógenos in vivo mediante mutación, eliminación, y/o sustitución (ver, Kmiec, Patente Estadounidense No. 5,565,350; Zarling et al., PCT/US93/03868), o se pueden introducir los promotores aislados en una célula de planta en la orientación y distancia apropiada de un gen con el fin de controlar la expresión del gen. 25

Si se desea la expresión del polipéptido, generalmente es deseable incluir una región de poliadenilación en el extremo 3 de una región codificante de polinucleótido. La región de poliadenilación se puede derivar del gen natural, de una variedad de otros genes de planta, o de T-ADN. La secuencia de extremo 3’ a ser agregada se puede derivar de, por ejemplo, los genes de sintasa nopalina o sintasa octopina, o alternativamente de otro gen de planta, o menos preferiblemente 30 de cualquier otro gen eucariótico. Los métodos para incrementar preferiblemente la actividad de un polipéptido EFTu en un plástido se describieron aquí anteriormente.

También se puede agregar la secuencia de intrón en la región no traducida 5’ o la secuencia codificante de la secuencia codificante parcial para incrementar la cantidad de mensaje maduro que se acumula en el citosol. La inclusión de un intrón dividible en la unidad de transcripción en las 35 construcciones de expresión de plantas y animal se ha mostrado que incrementa la expresión de gen de los niveles de mARN y proteína hasta 1000 veces, Buchman y Berg, Mol. Cell biol. 8:4395-4405 (1988); Callis et al., Genes Dev. 1:1183-1200 (1987). Tal mejoramiento de intrón de la expresión de gen es típicamente mayor cuando se coloca cerca al extremo 5’ de la unidad de transcripción. Se conoce en la técnica el uso de los intrones de maíz Adh1-S intrón 1, 2, y 6, el intrón Bronze-1. Ver 40 generalmente, The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling y Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).

También se describen construcciones genéticas y vectores para facilitar la introducción y/o expresión de las secuencias de nucleótido útiles en los métodos de acuerdo con la invención.

Por lo tanto, se proporciona una construcción de gen que comprende:

(i) Un ácido nucleico EFTu o su variante que codifica un polipéptido que comprende: (a) los siguientes dominios de unión GTP en cualquier orden GXXXXGK y DXXG y NKXD y S/UK/Q A/G L/V/F, en donde X es cualquier aminoácido; y (b) dominio EFTu ALMANPAIKR o un dominio que tiene 50% de identidad con este y/o K D/G EE S/A; y 5

(ii) Una o más secuencias de capaces de conducir la expresión de la secuencia de ácido nucleico de (i), preferiblemente en donde la una o más secuencias de control comprenden por lo menos un promotor específico de semilla; y opcionalmente

(iii) Una secuencia de terminación de transcripción.

Las construcciones útiles en los métodos de acuerdo con la presente invención se pueden 10 construir utilizando tecnología de ADN recombinante bien conocidas por las personas expertas en la técnica. Las construcciones de gen se pueden insertar en los vectores, que pueden estar disponibles comercialmente, son adecuados para transformar en plantas y adecuados para la expresión del gen de interés en las células transformadas.

Las plantas se transforman con un vector que comprende la secuencia de interés (es decir, un 15 ácido nucleico EFTu o su variante). La secuencia de interés se liga operablemente a una o más secuencias de control (por lo menos en un promotor). Los términos "elemento regulador", "secuencia de control" y "promotor" se utilizan intercambiablemente aquí y se toman en un contexto amplio para referirse a secuencias de ácido nucleico reguladoras capaces de afectar la expresión de las secuencias a las que ellas se ligan. Se abarcan por los términos mencionados anteriormente las secuencias 20 reguladoras transcripcionales derivadas de un gen genómico eucariótico clásico (que incluye el cuadro TATA que se requiere para el inicio de transcripción exacto, con o sin una secuencia de cuadro CCAAT) y elementos reguladores adicionales (es decir secuencias activadas en la dirección 5’, mejoradores e inactivadores) que alteran la expresión de gen en respuesta al estímulo externo y/o de desarrollo, o en una forma específica de tejido. También se incluye dentro del término una secuencia 25 reguladora transcripcional de un gen procariótico clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja -35 y/o secuencias reguladores transcripcionales de caja -10. El término "elemento regulador" también abarca una molécula de fusión sintética o derivado que confiere, activa o mejora la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano. El término "ligado operablemente" como se utiliza aquí se refiere a un ligado funcional entre la secuencia promotora y el gen de interés, 30 de tal manera que la secuencia promotora es capaz de iniciar la transcripción del gen de interés.

Ventajosamente, se puede utilizar cualquier tipo de promotor para conducir la expresión de la secuencia de ácido nucleico, sin embargo nuestros estudios han revelado que los promotores superan otros en los métodos de la invención. El promotor es preferiblemente un promotor específico de tejido, es decir uno que es capaz de iniciar predominantemente la transcripción en ciertos tejidos, tal 35 como tejido de las hojas, raíces, semillas etc., sustancialmente para la exclusión de iniciar la transcripción en la planta, pero mientras se permite aún la expresión residual en otras partes de una planta debido a promotores débiles.

Nuestros estudios han revelado que el uso de promotores específicos de semilla, más particularmente promotores específicos de embrión y/o específicos de alerón, se desarrollan mejor en 40 los métodos de la invención (es decir da plantas que tienen mejor producción) que los promotores constitutivos en los mismos métodos. Se prefiere por lo tanto que el ácido nucleico EFTu o su variante se ligue operablemente a un promotor específico de semilla. Un promotor específico de semilla es predominantemente activo transcripcionalmente en el tejido de semilla, pero no es exclusivamente necesario en el tejido de semilla (en el caso de expresión débil). Los promotores específicos de semilla 45

son bien conocidos en la técnica. Preferiblemente, el promotor específico de semilla es un promotor específico de embrión y/o específico de aleurón, más preferiblemente un promotor oleosina (ver por ejemplo, SEQ ID NO: 29 que representa la secuencia del promotor oleosina del arroz). Debe ser claro que la aplicabilidad del método descrito no se restringe al ácido nucleico similar a eFTA representado por la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 5 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 21, ni es la aplicabilidad del método restringido para la expresión de un ácido nucleico EFTu cuando se conduce por un promotor oleosina.

Opcionalmente, también se pueden utilizar una o más secuencias terminadoras en la construcción introducida en una planta. El término "terminador" abarca una secuencia de control que 10 es una secuencia de ADN en el extremo de una unidad transcripcional que señala el procesamiento y la poliadenilación de 3’ de un transcripto primario y la terminación de la transcripción. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir mejoradores transcripcionales así como también mejoradores traduccionales. Aquellos expertos en la técnica tendrán en cuenta el terminador y secuencias mejoradoras que pueden ser adecuadas para uso en desarrollar la invención. Tales secuencias se 15 conocerían o se pueden obtener fácilmente por una persona experta en la técnica.

Las construcciones genéticas de la invención pueden incluir adicionalmente un origen de secuencia de replicación que se requiere para mantenimiento y/o replicación en un tipo de célula específica. Un ejemplo es cuando se requiere una construcción genética para ser mantenida en una célula bacteriana como un elemento genético episomal (por ejemplo molécula de plásmido o 20 cósmido). Los orígenes preferidos de replicación incluyen, pero no se limitan a, el f1-ori y colE1.

La construcción genética puede comprender opcionalmente un gen marcador seleccionable. Como se utiliza aquí, el término "gen marcador seleccionable" incluye cualquier gen que confiere un fenotipo en una célula en la que este se expresa para facilitar la identificación y/o selección de células que se transfectan o se transforman con una construcción de ácido nucleico de la invención. Se pueden 25 seleccionar marcadores adecuados de marcadores que confieren resistencia herbicida o antibiótica, que introduce un nuevo rasgo metabólico o que permite selección visual. Ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen genes que confieren resistencia a los antibióticas (tal como nptll que fosforila la neomicina y canamicina, o hpt, que fosforila la higromicina), a los herbicidas (por ejemplo bar que proporciona resistencia a Basta; aroA o gox que proporciona resistencia contra el 30 glifosato), o genes que proporcionan un rasgo metabólico (tal como manA que permite a las plantas utilizar manosa como única fuente de carbón). La expresión de genes marcadores visuales resulta en la formación de color (por ejemplo β-glucuronidasa, GUS), luminescencia (tal como luciferasa) o fluorescencia (Proteína Fluorescente Verde, GFP, y sus derivados).

Se describen adicionalmente plantas y partes de plantas que se pueden obtener por los 35 métodos de acuerdo con la presente invención cuyas plantas o partes de plantas comprenden un ácido nucleico EFTu o su variante (transgen).

La invención también proporciona un método para la producción de plantas transgénicas que tienen producción de semilla incrementada bajo condiciones no tensionantes, que comprende introducción y expresión en una planta o parte de planta (que incluye célula de planta) de un ácido 40 nucleico EFTu o su variante como se define en la reivindicación 1. La expresión del producto de gen del ácido nucleico se objetiva en un plástido en una célula de planta si esta todavía no está en el plástido.

Más específicamente, la presente invención proporciona un método para la producción de plantas transgénicas que tienen producción de semilla incrementada bajo condiciones no tensionantes, cuyo método comprende:

(i) introducir y expresar en una planta o parte de planta (que incluye célula de planta) un ácido nucleico EFTu o su variante que codifica un polipéptido que comprende: (a) 5 los siguientes dominios de unión GTP en cualquier orden GXXXXGK y DXXG y NKXD y S/L/K/Q A/G L/V/F, en donde X es cualquier aminoácido; y (b) dominio EFTu ALMANPAIKR o un dominio que tiene 50% de identidad con este y/o K D/G EE S/A, cuyo polipéptido se objetiva en un plástido en una célula de planta si esta todavía no está en el plástido; y 10

(ii) cultivar la planta o parte de planta bajo condiciones de crecimiento no tensionantes que promueve el crecimiento y desarrollo de la planta.

El ácido nucleico se puede introducir directamente en una célula de planta o en la planta en sí misma (que incluye introducción en un tejido (tal como un plástido), órgano o cualquier otra parte de una planta mediante transformación. 15

El término "transformación" como se refiere aquí abarca la transferencia de un polinucleótido exógeno en una célula anfitriona, independiente del método utilizado para transferencia. El tejido de planta capaz de propagación clonal posterior, mediante organogenia o embriogenia, se puede transformar con una construcción genética de la presente invención y una planta completa regenerada allí. El tejido particular seleccionado variará dependiendo de los sistemas de propagación clónicos 20 disponibles para, y mejor adecuados para, las especies particulares a ser transformados. Los objetivos de tejido de ejemplo incluyen discos de hoja, polen, embriones, cotiledóneas, hipocotiledóneas, megagametofitos, tejido de callo, existente en tejido meristemático (por ejemplo, meristema apical, yemas axilares, y meristemas de raíz), e induce tejido meristemático (por ejemplo, meristema cotiledóneo y meristema hipocotiledóneo). El polinucleótido se puede introducir establemente o 25 transitoriamente en una célula anfitriona y se puede mantener no integrado, por ejemplo, como un plásmido. Alternativamente, se puede integrar en el genoma anfitrión. La célula de planta transformada resultante luego se puede utilizar para regenerar una planta transformada en una forma conocida por las personas expertas en la técnica.

La transformación de especies de planta es ahora una técnica rutinaria. Ventajosamente, 30 cualesquier varios métodos de transformación se pueden utilizar para introducir el gen de interés en una célula antecesora adecuada. Los métodos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, químicos que incrementan la captación de ADN libre, inyección del ADN directamente en la planta, bombardeo con pistola de partículas, transformación utilizando virus o polen y microproyección. Se pueden seleccionar métodos del método de calcio/polietilenglicol para 35 protoplastos (Krens, F.A. et al., 1882, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., Junio 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373); electroporación de protoplastos (Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol 3, 1099-1102); microinyección en material de planta (Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen Genet 202, 179-185); bombardeo de partícula recubierto con ADN o ARN (Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70) infección con virus (no integradores) y similares. Las plantas de arroz transgénicas que expresan un 40 ácido nucleico EFTu/gen se producen preferiblemente por medio de la transformación mediada por Agrobacterium utilizando cualquiera de los métodos bien conocidos para la transformación de arroz, tal como se describe en cualquiera de los siguientes: solicitud de patente Europea publicada EP 1198985 A1, Aldemita y Hodges (Plant, 199, 612-617, 1996); Chan et al. (Plant Mol. Biol. 22 (3) 491-506, 1993), Hiei et al. (Plant J. 6 (2) 271-282, 1994), cuyas descripciones se incorporan aquí 45

como referencia como se establecen completamente. En el caso de la transformación del maíz, el método preferido es como el descrito en Ishida et al. (Nat. Biotechnol. 1996 Jun; 14(6): 745-50) o Frame et al. (Plant Physiol. 2002 May; 129(1): 13-22), cuyas descripciones se incorporan aquí como referencia como se establece completamente.

Generalmente después de transformación, las células de plantas o grupos de células se 5 seleccionan para la presencia de uno o más marcadores que se codifican por los genes que se pueden expresar en la planta cotransfectados con el gen de interés, luego de lo cual el material transformado se regenera en una planta completa.

Luego de transferencia y regeneración de ADN, se pueden evaluar plantas putativamente transformadas, por ejemplo utilizando análisis Southern, para la presencia del gen de interés, número 10 de copia y/o organización genómica. Alternativamente o adicionalmente, los niveles de expfresión del ADn nuevamente introducido se puede monitorear utilizando análisis Northern y/o Western, ambas técnicas son bien conocidas por personas que son medianamente expertas en el arte.

Las plantas transformadas generadas se pueden propagar mediante una variedad de medios, tal como mediante propagación clonal o técnicas de siembra clásicas. Por ejemplo, una primera 15 generación (o T1) de planta transformada se puede autofecundar para dar los segundos transformantes de generación homozigota (o T2), y las plantas T2 propagadas adicionalmente a través de técnicas de siembra clásicas.

Los organismos transformados generados puede tomar una variedad de formas. Por ejemplo, ellos pueden ser quimeras de células transformadas y células no transformadas; transformantes 20 clonales (por ejemplo, todas las células transformadas por contener el casete de expresión); injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas, un injerto de rizoma transformado en un descendiente no transformado).

La presente invención, se relaciona con cualquier célula de planta o planta producida por cualquiera de los métodos descritos aquí, y con todas las partes de plantas y sus propágulos. La 25 presente invención se relaciona con abarcar la progenie de una célula primaria transformada o transfectada, tejido, órgano o planta completa que se ha producido por cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, solo el requerimiento que la progenie exhibe las mismas características genotípicas y/o fenotípicas como aquellas producidas en el progenitor por los métodos de acuerdo con la invención. La invención también se relaciona con células anfitrionas que contienen un ácido 30 nucleico EFTu aislado o su variante. Las células anfitrionas preferidas de acuerdo con la invención son células de plantas.

La invención se relaciona con partes consechables de una planta, tal como pero no limitado a semillas, hojas, frutos, flores, cultivos de tallo, rizomas, tubérculos y bulbos. La invención se relaciona adicionalmente con productos derivados (preferiblemente directamente) de una parte 35 consechable de tal como una planta, tales productos que incluyen glóbulos o polvos secos, aceite, grasa y ácidos grasos, almidón o proteínas.

También se describen ácidos nucleicos EFTu o sus variantes y el uso de polipéptidos EFTu y sus homólogos en producción de semillas incrementada, en plantas que crecen bajo condiciones no tensionantes. La producción de semillas es como se definió aquí anteriormente. 40

Los ácidos nucleicos EFTu o sus variantes, o polipéptidos EFTu o sus homólogos pueden encontrar uso en programas de siembra en los que se identifica un marcador de ADN que se puede ligar genéticamente a un gen EFTu o su variante. Los ácidos nucleicos / genes EFTu o sus variantes, o polipéptidos EFTu o sus homólogos se pueden utilizar para definir un marcador molecular. Este marcador de ADN o proteína luego se puede utilizar en programas de siembra para seleccionar plantas 45

que tienen producción incrementada. El gen EFTu o su variante puede ser, por ejemplo, un ácido nucleico como se representa por una cualquiera de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 21.

Las variantes alélicas de un ácido nucleico /gen EFTu también pueden encontrar uso en 5 programas de siembra asistidos por marcador. Tales programas de siembra que requieren algunas veces la introducción de la variación alélica mediante tratamiento mutagénico de las plantas, utilizando por ejemplo mutagenia EMS; alternativamente, el programa puede partir con una colección de las variantes alélicas del origen así llamado "natural" no originado intencionalmente. La identificación de las variantes alélicas luego tiene lugar, por ejemplo, PCR. Esto se sigue mediante 10 una etapa de selección de variantes alélicas superiores de la secuencia en cuestión y que da producción incrementada de plantas. La selección típicamente se lleva a cabo al monitorear el desarrollo de crecimiento de plantas que contienen diferentes variantes alélicas de la secuencia en cuestión, por ejemplo, diferentes variantes alélicas de una cualquiera de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID 15 NO: 17, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 21. Se puede monitorear el desarrollo de crecimiento en un invernadero o en el campo. Las etapas opcionales adicionales incluyen plantas cruzadas, en las que la variante alélica superior se identifica, con otra planta. Esto se puede utilizar, por ejemplo, para hacer una combinación de características fenotípicas interesantes.

Un ácido nucleico EFTu o su variante también se pueden utilizar como sondas físicamente o 20 genéticamente para mapear los genes que son una parte de, y como marcadores de rasgos ligados a aquellos genes. Tal información puede ser útil en siembra de plantas con el fin de desarrollar líneas con fenotipos deseados. Tal uso de ácidos nucleicos EFTu o sus variantes requiere solo una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 15 nucleótidos en longitud. Los ácidos nucleicos EFTu o sus variantes se pueden utilizar como marcadores de polimorfismo de longitud de fragmento de 25 restricción (RFLP). Los southern blots (Maniatis) de ADN denómico de plantas que digieren la restricción se puede probar con los ácidos nucleicos EFTu o sus variantes. Los patrones Bandung resultantes luego se pueden someter a análisis genético utilizando programas de computador tal como MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1:174-181) con el fin de construir un mapa genético. Adicionalmente, los ácidos nucleicos se pueden utilizar para probar Southern blots que contienen 30 ADN genómicos tratados con endonudeasa de restricción de un conjunto de individuos que representan el progenitor y la progenie de un cruce genético definido. La segregación de los polimorfismos de ADN se nota y se utiliza para calcular la posición del ácido nucleico EFTu o su variante en el mapa genético previamente obtenido utilizando esta población (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32:314-331). 35

La producción y uso de sondas derivadas de gen de planta para uso en mapeo genético se describe en Bematzky y Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4:37-41. Numerosas publicaciones describen mapeo genético de clones de cADN específicos utilizando la metodología destacada anteriormente o sus variaciones. Por ejemplo, poblaciones intercruzadas F2, poblaciones de retrocruzamiento, poblaciones apareadas aleatoriamente, líneas casi isogénicas, y otros conjuntos de 40 individuos se pueden utilizar para mapeo. Tales metodologías son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica.

Las sondas de ácido nucleico también se pueden utilizar para mapeo físico (es decir, reemplazo de secuencias en mapas físicos; ver Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, pp. 319-346, y las referencias citadas aquí). 45

Se pueden utilizar sondas de ácido nucleico en mapeo de hibridación de fluorescencia directa in situ (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7:149-154). Aunque los métodos actuales de mapeo FISH de uso favorable de clones grandes (varios a varios cientos KB; ver Laan et al. (1995) Genome Res. 5:13-20), las mejoras en la sensibilidad pueden permitir el desarrollo de mapeo FISH utilizando sondas cortas. 5

Una variedad de métodos con base en amplificación de ácido nucleico para mapeo genético y físico se puede llevar a cabo utilizando los ácido nucleicos. Ejemplos incluyen amplificación específica de alelo (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11:95-96), polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16:325-332), ligación específica de alelo (Landegren et al. (1988) Science 241:1077-1080), reacciones de extensión de nucleótido 10 (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18:3671), Mapeo de Híbrido de Radiación (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7:22-28) y Happy Mapping (Dear y Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17:6795-6807). Para estos métodos, la secuencia de un ácido nucleico se utiliza para diseñar y producir pares cebadores para uso en la reacción de amplificación o en reacciones de extensión de cebador. El diseño de tales cebadores se conoce bien por aquellos expertos en la técnica. En los métodos que emplean mapeo 15 genético con base en PCR, puede ser necesario identificar las diferencias de secuencia de ADN entre los progenitores del cruce de mapeo en la región que corresponde a la secuencia de ácido nucleico actual. Esto, sin embargo, no es generalmente necesario para métodos de mapeo.

El desarrollo de métodos de acuerdo con la presente invención resulta en plantas que tienen producción de semilla incrementada. El rasgo de producción de semilla incrementada se puede 20 combinar con otros rasgos económicamente ventajosos, tal como rasgos adicionales que mejoran la producción, tolerancia a varias tensiones, rasgos que modifican varias características arquitectónicas y/o características bioquímicas y/o fisiológicas.

Descripción de las figuras

La presente invención ahora se describirá con referencia a las siguientes figuras en las que: 25

Fig. 1 muestra una alineación múltiple CLUSTAL W de varios polipéptidos de planta EFTu. El motivo EFTu se representa por

un motivo EFTu adicional se representa por

30

un motivo de unión GTP se representa por

Fig. 2 muestra un vector binario para la expresión en Oryza sativa de un tabaco EFTu bajo el control de un promotor oleosina.

Fig. 3 detalla ejemplos de secuencias útiles en desarrollar los métodos de acuerdo 35 con la presente invención.

Ejemplos

La presente invención ahora se describirá con referencia a los siguientes ejemplos, que son por vía solo de ilustración.

Manipulación de ADN: a menos que se indique otra cosa, las técnicas de ADN recombinante 40 se desarrollan de acuerdo con protocolos estándar descritos en (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3ra Edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) o en Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Los materiales estándar y métodos para trabajo molecular de planta se describen en Plant Molecular

Biology Labfase (1993) por R.D.D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) y Blackwell Scientific Publications (UK).

Ejemplo 1: Clonación de Gen

Un gen que codifica una proteína EFTA se identifica primero como una etiqueta de secuencia expresada de células de Tabaco BY2 y se aísla como una secuencia parcial en un experimento CADN-5 AFLP desarrollado con cADN hecho de un cultivo celular de tabaco BY2 sincronizado (Nicotiniana tabacum L. cv. Bright Yellow-2). Con base en este experimento cADN-AFLP, las etiquetas BY2 que son ciclo celular se identifican y se seleccionan para clonación adicional. Las etiquetas de secuencia expresadas se utilizan para detectar una colección de cADN de Tabaco y para aislar el cADN de longitud completa. 10

Sincronización de células BY2

Se sincroniza la suspensión celular de cultivo de tabaco BY2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow-2) mediante células de bloqueo en fase S temprana con apidicolina como sigue. Una suspensión celular cultivada de Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2 se mantiene como se describe (Nagata et al. Int. Rev. Cytol. 132, 1-30, 1992). Para sincronización, se diluye un cultivo 15 estacionario de 7 días de edad 10 veces en medio fresco complementado con afidicolina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 5 mg/l), un fármaco que inhibe α polimerasa de ADN. Después de 24 h, las células se liberan del bloque mediante varios lavados con medio fresco y ellos resumen la progresión de su ciclo celular.

Extracción de ARN y síntesis de cADN 20

Se prepara ARN total utilizando precipitación LiCl (Sambrook et al., 2001) y se extrae el ARN poli(A+) de 500 pg de ARN total utilizando columnas Oligotex (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Partiendo de 1 µg de ARN poli(A+), se sintetiza cADM de la primera cepa mediante transcripción inversa con un cebador biotinilado oligodT25 (Genset, Paris, Francia) y Superscript II (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Se hace síntesis de segunda 25 cepa mediante desplazamiento de cepa con ligasa Escherichia coli (Life Technologies), polimerasa I de ADN (USB, Cleveland, OH) y ARNsa-H (USB).

Análisis de cADN-AFLP

Se utiliza quinientos ng de cADN bicatenario para análisis AFLP como se describe (Vos et al., Nucleic Acids Res. 23 (21) 4407-4414, 1995; Bachem et al., Plant J. 9 (5) 745-53, 1996) con 30 modificaciones. Las enzimas de restricción utilizadas son BstYI y MseI (Biolabs) y se hace digestión en dos etapas separadas. Después de la primera digestión de restricción con una de las enzimas, los fragmentos de extremo 3’ se recolectan en glóbulos Dyna (Dynal, Oslo, Noruega) por medio de su cola biotinilada, aunque se lavan los otros fragmentos. Después de digestión con la segunda enzima, los fragmentos de restricción liberados se recolectan y se utilizan como plantillas en las etapas AFLP 35 posteriores. Para preamplificaciones, un cebador MseI sin nucleótidos selectivos se combina con un cebador BstYI que contiene un T o un C como la mayoría de nucleótidos 3’. Las condiciones PCR son como se describe (Vos et al., 1995). Las mezclas de amplificación obtenidas se diluyen 600- veces y se utiliza 5 µl para amplificaciones selectivas utilizando un cebador BstYI marcado P33 y la polimerasa Amplitaq-Gold (Roche Diagnostics, Brussels, Bélgica). Se separan productos de 40 amplificación en geles de 5% de poliacrilamida utilizando el sistema Sequigel (Biorad). Los geles secos se exponen a películas Kodak Biomax así como también se exploran en fosfolmager (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK).

Caracterización de fragmentos AFLP

Las bandas que corresponden a los transcriptos diferencialmente expresados, entre los cuales es el transcripto que corresponde a la SEQ ID NO 1, se aíslan del gel y el ADN eluido se reamplifica bajo las mismas condiciones para amplificación selectiva. Se obtiene la información de secuencia mediante secuenciamiento directo del producto de reacción de cadena polimerasa reamplificada con el cebador selectivo BstYI o después de clonar los fragmentos en pGEM-T fácil (Promega, Madison, 5 WI) o al secuenciar clones individuales. Las secuencias obtenidas se comparan contra secuencias de nucleótido y proteína presentes en las bases de datos disponibles públicamente mediante alineaciones de secuencia BLAST (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25 (17) 3389-3402 1997). Cuando están disponibles, las secuencias de etiqueta se reemplazan con EST mayor o secuencias de cADN aisladas para incrementar el cambio de homología significativa encontrada. El clon de cADN físico que 10 corresponde a la SEQ ID NO 1 se amplifica posteriormente de una colección comercial de cADN de Tabaco como sigue.

Clonación de gen

Una colección de c-ADN con insertos promedio de 1,400 bp se hace con poli(A+) aislado de células de tabaco BY2 no sincronizadas, activamente divididas. Estos insertos de colección se clonan 15 en el vector pCMVSPORT6.0, que comprende un casete Gateway attB (Life Technologies). De esta colección se seleccionan 46,000 clones, se colocan en matrices en placas de microtítulo de 384 pozos, y se manchan posteriormente en duplicado en filtros de nylon. Los clones en matrices se detectan al utilizar grupos de varios cientos de etiquetas marcadas radioactivamente como sondas (entre las cuales es la etiqueta BY2 que corresponde a la secuencia de la SEQ ID NO 1). Se aíslan clones positivos 20 (entre los cuales el clon que reacciona con la etiqueta BY2 corresponde a la secuencia de la SEQ ID NO 1), secuenciados, y alineados con la secuencia de etiqueta. En casos en donde falla la hibridación con la etiqueta, el cADN de longitud completa que corresponde a la etiqueta se selecciona mediante amplificación de PCR como sigue. Los cebadores específicos a etiqueta se diseñan utilizando el programa de cebador 3 (http://www-genome.wi.mit.edu/genome_software/other/primer3.html) y se 25 utilizan en combinación con el cebador de vector común para amplificar los insertos de cADN parciales. Se utilizan grupos de clones de nADN de ADN, de 50,000, 100,000, 150,000, y 300,000 como plantillas en amplificaciones PCR. Se aíslan los productos de amplificación de geles de agarosa, se clonan, se secuencian y se alinean con las etiquetas.

Posteriormente, el cADN de longitud completa que corresponde a la SEQ ID NO 1 se clona 30 del vector de colección pCMVsport6.0 en un vector de expresión de planta adecuado por medio de una reacción Gateway LR.

Reacción Gateway LR para clonar el gen en un vector de expresión de planta

Se utiliza posteriormente el pCMV Sport 6.0 en una reacción LR con un vector de destinación Gateway adecuado para la transformación del arroz. Este vector contiene como elementos 35 funcionales dentro de los límites de T-ADN de un marcador seleccionable de planta y un casete Gateway destinado para recombinación LR in vivo con la secuencia de interés ya clonada en el vector donante. La dirección 5’ del casete Gateway es el promotor oleosina para la expresión específica de semilla del gen.

Después de la etapa de recombinación, el vector de expresión resultante (ver Fig. 2) se 40 transforma en la cepa Agrobacterium LBA4404 y posteriormente en plantas de arroz.

Ejemplo 3: Evaluación y Resultados

Se generan aproximadamente 15 a 20 transformantes de arroz T0 independientes. Los transformantes primarios se transfieren de una cámara de cultivo de tejido en un invernadero para hacer crecer y cosechar semillas T1. Se retienen 5 eventos, de los que la progenie T1 segrega 3:1 para 45

la presencia/ausencia del transgen. Para cada uno de estos eventos, aproximadamente 10 semillas T1 que contienen el transgen (hetero- y homo-zigotos) y aproximadamente 10 semillas T1 que carecen del transgen (nulizigotos) se seleccionan al monitorear la expresión del marcador visual. Se evalúan adicionalmente los eventos T1 en la generación de T2 luego del mismo procedimiento de evaluación para la generación de T1 pero con más individuos por evento. 5

Análisis estadístico: prueba F

Se utiliza dos factores ANOVA (análisis de variantes) como un modelo estadístico para la evaluación general de las características fenotípicas de planta. Se lleva a cabo la prueba F en todos los parámetros medidos de todas las plantas de todos los eventos transformados con el gen de la presente invención. Se lleva a cabo la prueba F para revisar un efecto del gen sobre todos los eventos de 10 transformación y para verificar un efecto general del gen, también conocido como efecto de gen global. El umbral para significancia de un efecto de gen global verdadero se establece una probabilidad de 5% para la prueba F. Un punto de valor de prueba F significativo, significa que no solo la presencia o posición del gen que origina las diferencias en el fenotipo.

3.1 Mediciones del parámetro relacionado con semilla 15

Se cosechan panículas primarias maduras, se colocan en bolsas, se marcan con código de barras y luego se secan durante tres días en un horno a 37°C. Luego las panículas se trillan y se recolectan y se cuentan todas las semillas. Las cáscaras llenas se separan de las vacías utilizando un dispositivo de soplado de aire. Las cáscaras vacías se descargan y la fracción restante se cuenta de nuevo. Las cáscaras llenas se pesan en una balanza analítica. El número de semillas rellenas se 20 determina al contar el número de cáscaras llenas que permanecen después de la etapa de separación. La producción de semillas total (peso de semilla) se mide al pesar todas las cáscaras llenas cosechadas de una planta. El número de semillas total por planta se mide al contar el número de cáscaras cosechado de una planta. El índice de cosecha en la presente invención se define como la relación de la producción de semillas total y el área de tierra anterior (mm2) multiplicado por un factor 106. 25

3.2 Área aérea

El área aérea de la planta (o área max) se determina al contar el número total de pixeles de partes aéreas de planta discriminadas del fondo. Este valor se promedia para los dibujos tomados en el mismo punto de tiempo de los diferentes ángulos y se convierte a su valor de superficie física expresado en mm cuadrados mediante calibración. Los experimentos muestran que el área aérea de 30 planta medida de esta forma se correlaciona con la biomasa de partes aéreas de plantas.

La Tabla de los resultados adelante muestran los valores p de la prueba F para las evaluaciones T1 y T2. El porcentaje de diferencia entre los nulizigotos transgénicos y los nulizigotos correspondientes también se muestra. Por ejemplo, en el caso del número de semillas rellenas, 2 líneas en la generación T1 da una diferencia mayor de 59% en el número de semillas rellenas obtenidas de 35 plantas transgénicas comparado con el número de semillas rellenas obtenidas de nulizigotos correspondientes; el valor p de la prueba F para estos dos líneas es menos 0.12. En general, se evalúan 5 líneas para el número de semillas rellenas que da un porcentaje de diferencia de 19% para el número de semillas rellenas de plantas transgénicas comparado con el número de semillas reheléenlas de nulizigotos correspondientes; un valor p de la prueba F para estas 5 líneas da un valor de 0.05. De 40 forma similar, en la generación de T2, 1 línea da una diferencia de 23% para el número de semillas rellenas obtenidas de plantas transgénicas comparado con el número de semillas rellenas obtenidas de nulizigotos correspondientes; el valor p de la prueba F para esta línea es 0.08. En general, en la generación de T2, se evalúan 3 líneas para el número de semillas rellenas dando un porcentaje de diferencia entre el número de semillas rellenas de plantas transgénicas comparado con el número de 45

semillas rellenas de nulizigotos correspondientes de 11 %; un valor p de la prueba F para estas 3 líneas da un valor de 0.08.

EFTu: fenotipo pOleosina medido

Generación T1 % de diferencia Valor p de la prueba F Generación T2 % de diferencia Valor p de la prueba F

Área max

2 líneas >17% <0.1 / / /

No. semillas rellenas

2 líneas >59% <0.12 1 línea 23% 0.08

general 5 líneas 19% 0.05 general 3 líneas 11% 0.097

Semillas de Peso Total

1 línea 62% 0.091 1 línea 22% 0.094

general 5 líneas 15% 0.15 general 3 líneas 11% 0.123

Índice de cosecha

1 línea 46% 0.019 1 línea 24% 0.043

general 5 líneas 16% 0.05 general 3 líneas 10% 0.1

LISTADO DE SECUENCIAS 5

<110> CropDesign N.V.

<120> Plantas que tienen producción incrementada y método para elaborar la misma

<130> CD-127-PCT

<150> EP 04106984.0

<151> 2004-01-24 10

<150> US 60/641,657

<151> 2005-01-06

<160> 29

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1 15

<211> 1860

<212> ADN

<213> Nicotiana tabacum

<400> 1

<210> 2

<211> 485

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum 5

<400> 2

<210> 3

<211> 2342

<212> ADN

<213> Nicotiana tabacum 5

<400> 3

<210> 4

<211> 478

<212> PRT

<213> Nicotiana tabacum 5

<400> 4

<210> 5

<211> 1758

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 5

5

<210> 6

<211> 476

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 6 10

<210> 7

<211> 3675

<212> ADN

<213> Nicotiana sylvestris 5

<400> 7

<210> 8

<211> 485

<212> PRT

<213> Nicotiana sylvestris 5

<400> 8

<210> 9

<211> 1678

<212> ADN

<213> Oryza sativa 5

<400> 9

<210> 10

<211> 467

<212> PRT 10

<213> Oryza sativa

<400> 10

<210> 11

<211> 1365

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana 5

<400> 11

<210> 12

<211> 454

<212> PRT 10

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 12

<210> 13

<211> 1425

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana 5

<400> 13

<210> 14

<211> 471

<212> PRT 10

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 14

<210> 15

<211> 1725

<212> ADN

<213> Oryza sativa 5

<400> 15

<210> 16

<211> 453

<212> PRT

<213> Oryza sativa 5

<400> 16

<210> 17

<211> 5993

<212> ADN

<213> Zea mays 5

<400> 17

<210> 18

<211> 452

<212> PRT

<213> Zea mays 5

<400> 18

<210> 19

<211> 1350

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana 5

<400> 19

<210> 20

<211> 449

<212> PRT 10

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 20

<210> 21

<211> 1200

<212> ADN

<213> Synechocystis 5

<400> 21

<210> 22

<211> 399

<212> PRT 10

<213> Synechocystis

<400> 22

<210> 23

<211> 32

<212> PRT

<213> Chlamydomonas

<400> 23 5

<210> 24

<211> 32

<212> PRT

<213> Chlamydomonas 10

<400> 24

<210> 25

<211> 52

<212> PRT 15

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 25

<210> 26

<211> 54 20

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 26

<210> 27

<211> 70

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana 5

<400> 27

<210> 28

<211> 74

<212> PRT 10

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 28

<210> 29

<211> 1236 15

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 29

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método para incrementar la producción de semillas de planta bajo condiciones de crecimiento normales, con relación a plantas tipo silvestre que crecen bajo condiciones correspondientes, que comprende:

   (i) transformar una planta, parte de planta o célula de planta al introducir una 5 construcción genética que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido EFTu que comprende: (i) los siguientes dominios de unión GTP: GXXXXGK y DXXG y NKXD y S/L/K/Q A/G UV/F, en donde X es cualquier aminoácido; y (ii) dominio EFTu ALMANPAIKR o un dominio que tiene por lo menos 75% de identidad con este y/o K D/G EE S/A; 10

   (ii) expresar dicho ácido nucleico; y

   (iii) objetivar el polipéptido en un plástido en la célula de planta, a menos que el ácido nucleico o su variante sea un gen plastídico.
2. 2. Método de acuerdo con la reivindicación anterior, en donde dicho ácido nucleico EFTu se sobreexpresa en una planta. 15
3. 3. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho ácido nucleico EFTu es de origen de planta, preferiblemente de una planta dicotiledónea, adicionalmente preferiblemente de la familia Solanaceae, más preferiblemente del género Nicotianae.
4. 4. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho 20 ácido nucleico EFTu se liga operablemente a un promotor específico de semilla, preferiblemente a un promotor específico de alerón y/o específico de embrión.
5. 5. Método de acuerdo con la reivindicación anterior, en donde dicho promotor es un promotor oleosina.
6. 6. Método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde dicha producción de 25 semilla incrementada se selecciona de una cualquiera o más de (i) biomasa de semilla incrementada; (ii) número incrementado de semillas (rellenas); (iii) tamaño de semilla incrementado; (iv) volumen de semilla incrementado; (v) índice de cosecha incrementado; y (vi) peso incrementado de miles de granos (TKW).
7. 7. Método para la producción de una planta transgénica que tiene producción de semilla 30 incrementada bajo condiciones de crecimiento normales con relación a la producción de plantas tipo silvestre correspondientes que crecen bajo condiciones correspondientes, cuyo método comprende:

   (i) transformar una planta o parte de planta (que incluye célula de planta) con una construcción genética que comprende un ácido nucleico que codifica un 35 polipéptido EFTu que comprende: (a) los siguientes dominios de unión GTP GXXXXGK y DXXG y NKXD y S/L/K/Q A/G L/V/F, en donde X es cualquier aminoácido; y (b) dominio EFTu ALMANPAIKR o un dominio que tiene por lo menos 75% de identidad con este y/o K D/G EE S/A, cuyo polipéptido se objetiva en un plástido en una célula de planta si ésta todavía no está en el 40 plástido;

   (ii) expresar dicho ácido nucleico; y

   (iii) cultivar la planta o parte de planta bajo condiciones que promueven el crecimiento y desarrollo de la planta.
8. 8. Uso de una construcción genética que comprende dicho ácido nucleico/gen EFTu como se define en la reivindicación 1 en producción de semillas incrementada, en plantas que crecen bajo condiciones de crecimiento normales.
9. 9. Uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicha producción de semillas incluye uno o más de los siguientes: número incrementado de semillas (rellenas), peso de 5 semilla incrementado, índice de cosecha incrementado y TKW incrementado.