ES2327980T3 - Anticuerpo lo- d2a y sus usos para inhibir la activacion y la proli feracion de celulas t. - Google Patents
Anticuerpo lo- d2a y sus usos para inhibir la activacion y la proli feracion de celulas t. Download PDFInfo
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Abstract
Un anticuerpo humanizado que comprende: regiones constantes humanas, las CDR del anticuerpo LO-CD2a, una región marco de cadena ligera obtenida de un anticuerpo humano, en la que los aminoácidos 9, 12, 41, 42, 50, 51 y 82 del marco de cadena ligera humano se sustituyen por los aminoácidos correspondientes del anticuerpo LO-CD2a como se muestra en la figura 31, y una región marco de cadena pesada obtenida de un anticuerpo humano, en la que los aminoácidos 47, 67, 70, 72, 76, 85 y 87 del marco de cadena pesada humano se sustituyen por los aminoácidos correspondientes del anticuerpo LO-CD2a como se muestra en la figura 33, donde el anticuerpo LO-CD2a es producido por la línea celular depositada como ATCC HB11423, donde dicho anticuerpo se une a un epítopo de un antígeno CD2.
Description
Anticuerpo LO-CD2a y sus usos
para inhibir la activación y la proliferación de células T.
Esta invención se refiere a un anticuerpo como
se define en la reivindicación 1 y preferentemente a un anticuerpo
que se une a linfocitos humanos. Más particularmente, esta invención
se refiere a la prevención y/o inhibición de las respuestas inmunes
en curso en un paciente a través de la administración de dicho
anticuerpo (o fragmento o derivado del mismo) a un paciente.
Preferentemente, esta invención se refiere al uso de dicho
anticuerpo para la preparación de un medicamento para prevenir o
inhibir la activación y la proliferación de células T.
La técnica anterior ha descrito la posibilidad
de usar anticuerpos para el antígeno CD2 para inhibir el rechazo
del injerto. En general, la técnica anterior describe el uso de
anticuerpos que se unen al antígeno CD2 cómo posiblemente útiles
para inhibir el rechazo al injerto, véase el documento Ortho
Pharmaceutical Corp., Patentes de Estados Unidos Nº 4.364.973;
4.614.720; 4.515.893; 4.743.681; y 4.798.806.
No se conocía la utilidad de dichos anticuerpos
para inhibir el rechazo del injerto en pacientes humanos o en
primates no humanos. Como se ejemplifica en las siguientes
referencias, J. V. Giorgi et al., Immunosuppressive Effect
and Immunogenicity of OKT11A Monoclonal Antibody in Monkey Allograft
Recipients, Transplantation Proceedings Vol. XV Nº 1, marzo de 1983
y P. J. Thurlow et al., A Monoclonal
Anti-Pan-T-Cell
Antibody, Transplantation, Vol. 36, Nº 3, pág.
293-298.
El documento WO94/20619 describe un anticuerpo
LO-CD2a para prevenir e inhibir la respuesta inmune
en pacientes humanos.
Tinción de dos colores de células mononucleares
de la sangre periférica (PBMC) con LO-CD2a y
Leu-5bPE biotinilados.
Para esta tinción se siguieron los siguientes
parámetros:
PBMC humanas se tiñeron con
LO-CD2a-FITC y a continuación a) se
tiñeron con T11-PE (anticuerpo de Coulter para CD2)
conjugado con ficoeritrina (PE) o b)
Leu-5B-PE (anticuerpo de Becton
Dickinson para CD2) conjugado con ficoeritrina (PE). En ningún caso
la tinción con el segundo anticuerpo estaba alterada por el
pre-tratamiento con LO-CD2a.
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Figuras 3a y
3b
Efectos de LO-CD2a sobre
marcadores de membrana. Se cultivaron PBMC a 2 x 10^{6} células/ml
en ausencia (líneas continuas) o en presencia (líneas discontinuas)
de LO-CD2a (200 ng/ml). A los tiempos indicados en
las figuras, las células se recogieron y se trataron mediante
análisis citofluorimétrico a) y b); las PBMC se marcaron con mAb
anti-CD3
(Leu-4a-FITC),
anti-CD4 (T4-RD), anticuerpos
monoclonales (mAb) anti-antígenos de clase II
(LO-DRa-FITC) o
anti-CD8 (T8-RD). Los controles
negativos para mAb de ratón comerciales eran alícuotas de las
mismas células teñidas con IgG de ratón marcadas con FITC o
Rodamina. Los controles negativos para mAb de rata eran células
incubadas con suero de rata normal seguido de un mAb de ratón
anti-rata marcado con FITC
(MARK-FITC). Los resultados se expresan como
porcentaje de células positivas.
\vskip1.000000\baselineskip
Efectos de LO-CD2a sobre
marcadores de membrana y cultivo de linfocitos de sangre humana con
y sin adición de LO-CD2a. Se marcaron cultivos de
linfocitos a 1 x 10^{6} células/ml con a) mAb
anti-CD2
(Leu-5b-FITC),
anti-CD4 (T4-RD1), o mAb
anti-CD8 (T8-RD) en los tiempos
indicados. Los controles negativos para mAb de ratón comerciales
eran alícuotas de las mismas células teñidas con IgG de ratón
marcadas con FITC o Rodamina. Los controles negativos para mAb de
rata eran células incubadas con suero de rata normal seguido de un
mAb de ratón anti-rata marcado con FITC
(MARK-FITC). Los resultados se expresan como
porcentaje de células positivas.
\vskip1.000000\baselineskip
Figuras 5a y
5b
Efectos de LO-CD2a sobre la
expresión de CD2. Se incubaron PBMC humanas con a)
LO-CD2a (200 ng/ml) o b) Leu-5b
(dializado contra PBS, diluido a 1:2) para los tiempos indicados y
a) se tiñeron para la expresión de CD2
(Leu-5b-FITC y
T11-RD1) y para la unión de LO-CD2a
(Mark-3-FITC) o b) CD2
(LO-CD2a-FITC,
T11-RD1) y para la unión de Leu-5b
de cabra anti-ratón (GAM-FITC).
\vskip1.000000\baselineskip
Efectos de LO-CD2a sobre MLR. a)
inhibición de la MLR [Reacción de linfocitos Mezclados] en
cultivos de linfocitos mezclados incubados durante 6 días en
presencia de concentraciones en aumento de LO-CD2a
añadido a tiempo 0. Los cultivos se recogieron el día 6; b)
inhibición de la MLR en cultivos de linfocitos mezclados incubados
con concentraciones diferentes de LO-CD2a añadido a
tiempo 0. Los cultivos se recogieron a intervalos de 24 h; c)
incorporación (cpm [recuentos por minuto]) de
^{3}H-Timidina (^{3}H-T) por
cultivos de linfocitos mezclados en ausencia (línea continua) o en
presencia (línea discontinua) de LO-CD2a (200
ng/ml); d) inhibición de la MLR por LO-CD2a (200
ng/ml) añadido a diferentes tiempos después del inicio de la
incubación. Los cultivos se recogieron el día 6. Todos los cultivos
se realizaron por triplicado (1 x 10^{6} células de cada
donante/ml) en un volumen final de 200 \mul/pocillo. Se añadió
^{3}H-Timidina 8 h antes de la recogida de los
cultivos. Los resultados en c) se muestran como cpm x 10^{3}
incorporados por pocillo recogido en el tiempo indicado. Los
resultados en a), b) y d) se expresan como porcentaje de inhibición
de la MLR de cultivos por triplicado (Media y Desviación Típica),
en comparación con cultivos de control (sin
LO-CD2a).
\vskip1.000000\baselineskip
Efectos de LO-CD2a sobre
blastocitos durante MLC. Se cultivaron células mononucleares de la
sangre periférica en cultivos de linfocitos mezclados con o sin la
adición de 200 ng/ml de LO-CD2a. A los tiempos
indicados, las células se extrajeron y se analizaron mediante
citometría de flujo después de teñir con anticuerpo para CD2
(Leu5b-FITC). Los blastocitos se seleccionaron
mediante dispersión directa y lateral y la expresión de los
marcadores indicados se cuantificaba en los blastocitos.
\vskip1.000000\baselineskip
Figuras 8a y
8b
Efectos de LO-CD2a sobre células
en reposo durante MLC. Se cultivaron linfocitos humanos con y sin
adición de LO-CD2a (200 ng/ml). A los tiempos
indicados, las células se extrajeron y se tiñeron para CD3 (Leu
4a-FITC), CD4 (T4-RD1) CD8
(T8-RD1) o CD_{25}
(LO-TACT-1-FITC).
Los linfocitos en reposo se identificaron mediante selección
diferencial por tamaño y granularidad y los resultados se expresan
como porcentaje de tinción total de linfocitos en reposo con el
anticuerpo indicado (Figura 8a). El porcentaje de células en reposo
teñidas positivamente por Leu 5b en cultivos con y sin
LO-CD2a se muestra en la figura 8b.
\vskip1.000000\baselineskip
Efectos de LO-CD2a sobre
linfocitos estimulados por mitógeno. Se cultivaron PBMC durante 96 h
en ausencia o en presencia de OKT3 (100 ng/ml),
Con-A (10 \mug/ml) y PHA (1 \mug/ml). En
cultivos paralelos, se añadió LO-CD2a (200 ng/ml) 1
h después de los mitógenos (barras grises) o 1 h antes de los
mitógenos (barras en blanco). Las barras a cuadros representan
cultivos realizados en presencia de LO-CD2a en
solitario. Los cultivos (por triplicado) se marcaron por pulsos con
^{3}H-Timidina durante las últimas 8 h de
incubación.
\vskip1.000000\baselineskip
Efectos de LO-CD2a sobre la
activación controlada por mitógeno de PBMC. Se cultivaron PBMC de
dos donantes durante 96 h en presencia de OKT3 (100 ng/ml),
Con-A (10 \mug/ml) y PHA (1 \mug/ml). En
cultivos paralelos, se añadió LO-CD2a (200 ng/ml)
el Día 0 (0 h) después del inicio del cultivo, Día 1 (24 h) o Día 2
(48 h). El gráfico representa el porcentaje de inhibición por
LO-CD2a de la proliferación inducida por mitógeno en
cada donante.
\vskip1.000000\baselineskip
Figuras 11a y
11b
Inhibición de la actividad de NK mediante
incubación de células efectoras y diana (células K562 marcadas con
^{51}CR) en presencia de LO-CD2a. Se han ensayado
tres concentraciones de LO-CD2a: 5 \mug/ml, 1
\mug/ml y 0,5 \mug/ml. Las células efectoras eran linfocitos de
la sangre periférica de actividad de NK que se expresa como el
porcentaje de lisis de células diana marcadas. Se ensayaron dos
sujetos normales a proporciones de E/D: 200/1, 200/1, 50/1.
\vskip1.000000\baselineskip
Linfocitos totales por \mul de sangre
periférica de mono cynomolgus que recibía 20 mg/día de
LO-CD2a durante 10 días (días
0-9).
\vskip1.000000\baselineskip
PBMC del mono cynomolgus que recibía
LO-CD2a a 20 mg/día durante 10 días (día 0 a 9) se
tiñeron con anticuerpos monoclonales para CD2
(Leu-5b), CD4 (Leu3a), CD8 (Leu 2a), Células
Asesinas Naturales [Natural Killers] (CD8 y CD11b) y células
B (anti-IgM) en los días indicados y se analizaron
mediante citometría de flujo. Los resultados se presentan como el
porcentaje del número total de células teñidas por microlitro de
sangre.
\vskip1.000000\baselineskip
Actividad de NK de un mono cynomolgus que
recibía 20 mg/día de LO-CD2a durante 10 días (días
0-9). La actividad de NK se ensayó los días 11 y 22
y se presentaba como el % de lisis a E/D de 25/1, 50/1 y 100/1.
\vskip1.000000\baselineskip
Concentración en suero de
LO-CD2a de un mono cynomolgus que recibía 20 mg/día
de LO-CD2a durante 10 días (días
0-9). El anticuerpo monoclonal se midió mediante
ELISA como se describe en el texto y se expresa en \mug/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Desarrollo de anticuerpo IgG para
LO-CD2a en un mono cynomolgus que recibía 20 mg/día
de LO-CD2a durante 10 días (días
0-9). El anticuerpo para el anticuerpo monoclonal se
midió en diluciones sucesivas de suero extraído los días indicados
mediante el ELISA en sándwich descrito en el texto y se expresa como
la densidad óptica a 492 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Figuras 17a y
17b
Efecto de LO-CD2a sobre
linfocitos de babuino.
a) En los días indicados se obtuvo sangre del
babuino y las células se tiñeron con los anticuerpos
anti-CD2 T11-RD y
Leu-5b-FITC, LO-CD2a
y MARK3-FITC, un anticuerpo kappa 1b de ratón
anti-rata acoplado a FITC para detectar
LO-CD2a unido.
b) Se evaluaron los niveles de
LO-CD2a en muestras de suero tomadas los días
indicados, mediante ELISA.
\vskip1.000000\baselineskip
Figuras 18a y
18b
Efecto de LO-CD2a sobre
linfocitos de babuino.
En los días indicados, se extrajo sangre y las
células se tiñeron para detectar LO-CD2a unido con
MARK3-FITC y
MARK2b-8-biotina (un anticuerpo
monoclonal IgG2b de ratón anti-rata acoplado a
biotina) detectado con estreptavidina acoplada a PE).
a) Sin pre-tratamiento de
células;
b) Incubación con 2,5 \mug/ml de
LO-CD2a antes de teñir para detectar cualesquiera
puntos no ocupados por el anticuerpo circulante.
\vskip1.000000\baselineskip
Efecto de LO-CD2a sobre
linfocitos de babuino.
En los días indicados, se tomaron muestras de
sangre y se tiñeron con T4-RD1 (CD4);
T8-RD1 (CD8) o MARK3-FITC (unido a
LO-CD2a).
\vskip1.000000\baselineskip
Leucocitos, linfocitos y creatinina en el
paciente Nº 1 tratado con ATG y después con LO-CD2a
para rechazo del aloinjerto.
\vskip1.000000\baselineskip
Niveles en suero de LO-CD2a
durante y después del tratamiento en el paciente Nº 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Creatinina en el paciente Nº 2 antes de, durante
y después del tratamiento con LO-CD2a.
\vskip1.000000\baselineskip
Recuentos de leucocitos y linfocitos en el
paciente Nº 2 antes de, durante y después del tratamiento con
LO-CD2a.
\vskip1.000000\baselineskip
Niveles en suero de LO-CD2a en
el paciente Nº 2, extraído justo antes de y 2,5 horas después de
cada inyección.
\vskip1.000000\baselineskip
Recuento de leucocitos, recuento de linfocitos y
nivel de creatinina en suero en el paciente Nº 3 que recibía
LO-CD2a para el rechazo del aloinjerto renal.
\vskip1.000000\baselineskip
Tinción de dos colores con
LO-CD2a y (2) Leu5b, (3) Leu 4(CD3), (4)
Leu3a(CD4), (5) Leu2b(CD8) y (6) LeuII
(anti-CD16) un marcador para células NK. La unión de
LO-CD2a se detectó con IG-FITC de
cabra anti-rata. La serie superior
(1-6) de histogramas de dos colores muestra la doble
tinción. La serie inferior (7-12) muestra una
tinción sencilla con cada anticuerpo.
\vskip1.000000\baselineskip
Tinción de dos colores de PBL humanos con un
control de isotipo de rata para LO-CD2a (Pharmingen,
IgG2b de rata purificada, kappa) o LO-CD2a y
anticuerpos conjugados a ficoeritrina para CD4 (c, d), Cd8 (e, f),
CD16 (g, h), CD19 (i, j) y CD2 (k, l). LO-CD2a y el
control de isotipo se detectaron con inmunoglobulina anti rata
F(ab')2 purificada por afinidad conjugada con FITC (Southern
Biotechnology). Los anticuerpos para los antígenos CD eran todos
anticuerpos conjugados con ficoeritrina obtenidos de
Becton-Dickinson [CD4 (Leu3a), CD8 (Leu2a), CD16
(Leu-11b), CD19 (Leu 12) y CD2 (Leu5b)]. En cada
caso la tinción con el control de isotipo se muestra en el primer
histograma y el LO-CD2a en el segundo histograma. El
histograma a muestra el patrón con el control de isotipo y el b con
LO-CD2a.
\vskip1.000000\baselineskip
Análisis citofluorográfico de la tinción de
células COS transfectadas con CD2 de tipo silvestre. Los paneles de
la izquierda muestran los histogramas de la tinción de una célula
COS transfectada con el vector de control, que no contiene CD2; el
conjunto de paneles de la derecha, la tinción de una célula COS
transfectada transitoriamente con un vector que contiene la
molécula CD2 completa. En cada conjunto el histograma superior
muestra la tinción con W632 múrido (anticuerpo para la Clase I, que
se sabe que es expresado por células COS) y
76-2-11 (un control de isotipo para
el W632 múrido); el panel central muestra la tinción con Leu5b
(anti-CD2 de Becton Dickinson) y
76-2-11, un control emparejado con
isotipo para la tinción de Leu5b, el panel inferior es tinción con
LO-CD2a y un control emparejado con isotipo de rata
para LO-CD2a.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la
cadena V_{L} de LO-CD2a quimérica.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la
cadena V_{H} de LO-CD2a quimérica.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencias de aminoácidos de la región variable
de cadena ligera de LO-CD2a de rata, HUM5400 humano
y LO-CD2a humanizado.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la
región variable de LO-CD2a humanizado.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencias de aminoácidos de la región variable
de cadena pesada de LO-CD2a de rata,
Amu5-3 humano y LO-CD2a
humanizado.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la
región variable de cadena pesada de LO-CD2a
humanizado.
\vskip1.000000\baselineskip
Unión de LO-CD2a de rata,
LO-CD2a humanizado a células Jurkat.
\vskip1.000000\baselineskip
Inducción de hiposensibilidad in vitro
mediante LO-CD2a de rata, LO-CD2a
humanizado e inmunoglobulinas de rata y humana de control.
\vskip1.000000\baselineskip
Figuras 37A, 37B y
37C
Inhibición de la MLR primaria mediante
LO-CD2a y respuesta de células T cultivadas con
LO-CD2a en una MLR primaria a un antígeno en una
MLR secundaria o a un estimulador de tercera parte en una MLR.
\vskip1.000000\baselineskip
Figuras 38A y
38B
Respuesta de células T cultivadas con
LO-CD2a en una MLR primaria a un antígeno en una MLR
secundaria o a toxoide del tétanos en cultivos secundarios.
\vskip1.000000\baselineskip
Efecto del fragmento F(ab')_{2} de
LO-CD2a sobre una MLR.
\vskip1.000000\baselineskip
Comparación de propiedades inhibidoras de
anticuerpo LO-CD2a intacto con el fragmento
F(ab')_{2} de LO-CD2a sobre la
proliferación de PBMC mediante OKT3 soluble.
\vskip1.000000\baselineskip
Efecto de APC sobre propiedades inhibidoras de
LO-CD2a sobre la proliferación inducida por OKT3
unido a placas.
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención, se proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo como
se define en la reivindicación 1 que se une al mismo epítopo en
linfocitos humanos que el anticuerpo monoclonal producido por la
línea celular depositada como el Nº de depósito de ATCC HB 11423. El
anticuerpo que es producido por la línea celular depositada se
denomina en lo sucesivo en este documento en algunas ocasiones
LO-CD2a. La expresión "molécula" o
"anticuerpo que se une al mismo epítopo que
LO-CD2a" incluye LO-CD2a. El
término "LO-CD2a" incluye el anticuerpo
producido por la línea celular depositada ATCC HB 11423 y aquellos
idénticos a éste que pueden producirse, por ejemplo, mediante
tecnología recombinante.
Las moléculas o anticuerpos de la presente
invención inhiben la activación y proliferación de células T humanas
y el Solicitante ha descubierto que dicha inhibición puede
realizarse cuando se añade la molécula o anticuerpo antes o después
de un agente que estimula la activación de células T.
Las moléculas o anticuerpos de la presente
invención tienen la característica de unirse a un epítopo de un
antígeno CD2 (células T humanas positivas para CD2) pero debe
entenderse, sin embargo, que la capacidad de dichas moléculas o
anticuerpos para inhibir la activación o proliferación de células T
puede o no realizarse a través de la unión a células positivas para
CD2, aunque el Solicitante actualmente cree que el mecanismo de
acción implica la unión de la molécula o anticuerpo a células
positivas para CD2.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se proporciona un método de prevención y/o inhibición de
la respuesta inmune en curso en pacientes humanos a través de la
administración al paciente de un anticuerpo como se define en la
reivindicación 1.
Una línea celular que produce
LO-CD2a, se depositó el 28 de julio de 1993, en la
American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, MD 20852, y se le dio el número de acceso (o registro) en
la ATCC HB 11423. Dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal de
rata.
Aunque los solicitantes no desean limitar la
invención a ningún razonamiento teórico, se cree que el mecanismo
que permite al anticuerpo monoclonal de esta invención prevenir o
reducir la gravedad de una respuesta inmune, e inhibir la
activación y proliferación de células T, es el hecho de que el
anticuerpo LO-CD2a reduce la densidad de CD2
expresado en superficies de células T y de este modo reduce el
número de linfocitos T CD2^{-}; y/o afecta a la transducción de
señales. Se cree que estos mecanismos de acción son responsables no
solamente de la prevención de la respuesta inmune, sino también de
la reducción de la gravedad de respuestas inmunes en curso. Además,
el anticuerpo LO-CD2a inhibe la actividad de células
asesinas naturales (NK) in vitro como se ejemplifica en este
documento. Esto es pertinente a la presente invención puesto que se
cree que un mecanismo citotóxico no restringido al MHC tal como la
actividad de células NK estaba implicado en la enfermedad de
injerto contra huésped.
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención se proporciona un proceso para inhibir la activación y
proliferación inicial o posterior de células T en un paciente
humano, administrando al paciente una cantidad eficaz de una
molécula (preferentemente un anticuerpo) que se une al mismo epítopo
(o a cualquier parte del mismo) en linfocitos humanos que el
anticuerpo LO-CD2a. La molécula es una forma
humanizada de LO-CD2a. Dicha molécula contendría,
por ejemplo, la misma región determinante de la complementariedad
(CDR) que el anticuerpo LO-CD2a como se define en
la reivindicación 1.
Con el término "inhibir", como se usa en
todo este documento, el solicitante pretende significar prevención
o inhibición o reducción de la gravedad o la inducción de tolerancia
o inversión del rechazo del injerto. El término "injerto" como
se usa en este documento para fines de esta solicitud significará
todos u cada uno de transplantes, incluyendo aunque sin limitación,
transplante con aloinjerto y xenoinjerto. Dicho transplante puede
incluir por ejemplo, aunque sin limitación, transplante de células,
médula ósea, tejido, órgano sólido, hueso, etc.
La expresión "respuesta(s)
inmune(s)" como se usa en este documento pretende
significar respuestas inmunes dependientes de la activación y
proliferación de células T, que incluye efectos celulares y
anticuerpos dependientes de células T que pueden desencadenarse en
respuesta a, a modo de ejemplo y sin limitación: (i) injertos, (ii)
enfermedad de injerto contra huésped y (iii) autoantígenos que dan
como resultado enfermedades autoinmunes, que, a modo de ejemplo,
incluyen aunque sin limitación artritis reumatoide, lupus sistémico,
esclerosis múltiple, diabetes mellitus, etc.
La molécula empleada en la presente invención es
una que se une al mismo epítopo (o a parte de ese epítopo) que el
anticuerpo monoclonal LO-CD2a. La expresión "se
une al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal
LO-CD2a" pretende describir no solamente al
anticuerpo monoclonal LO-CD2a sino que también
describe otros anticuerpos, fragmentos o derivados del mismo o
moléculas que se unen al mismo dicho epítopo que el anticuerpo
monoclonal LO-CD2a.
Dichos otros anticuerpos incluyen a modo de
ejemplo y sin limitación, anticuerpos de rata, múridos, porcinos,
bovinos, humanos, quiméricos y humanizados o fragmentos o derivados
de los mismos.
El término "derivado" como se usa en este
documento, significa un anticuerpo quimérico o humanizado,
anticuerpo de cadena sencilla, anticuerpo biespecífico u otro
anticuerpo semejante que se une al mismo epítopo (o una porción del
mismo) que el reconocido por el anticuerpo monoclonal
LO-CD2a.
El término "fragmento" como se usa en este
documento, significa una porción de un anticuerpo, a modo de ejemplo
dichas porciones de anticuerpos incluirán aunque sin limitación
CDR, Fab u otras porciones semejantes, que se unen al mismo epítopo
o a cualquier porción del mismo que el reconocido por
LO-CD2a.
El término "anticuerpo" como se usa en este
documento, incluye anticuerpo policlonales y monoclonales así como
fragmentos y derivados de anticuerpo así como anticuerpos preparados
mediante técnicas recombinantes, tales como anticuerpos quiméricos
o humanizados, anticuerpos de cadena sencilla o biespecíficos que se
unen al mismo epítopo o a una porción del mismo que el reconocido
por el anticuerpo monoclonal LO-CD2a. El término
"moléculas" incluye a modo de ejemplo y sin limitación,
péptidos, oligonucleótidos u otros compuestos semejantes obtenidos
de cualquier fuente que imite al anticuerpo o se una al mismo
epítopo o una porción del mismo que el fragmento de anticuerpo o
derivado del mismo.
La presente invención describe el uso para
tratar a un paciente que va a recibir o ha recibido un transplante
de injerto con una cantidad eficaz de al menos un miembro
seleccionado entre el grupo constituido por anticuerpo
LO-CD2a o un anticuerpo o derivado o fragmento del
mismo o moléculas que se unen al mismo epítopo (o una porción del
mismo) que el anticuerpo LO-CD2a. El tratamiento se
realiza preferentemente con el anticuerpo LO-CD2a
completo o intacto.
Un anticuerpo monoclonal de esta invención como
se ha descrito anteriormente en este documento puede producirse
mediante técnicas conocidas en la técnica tales como las descritas
por Kohler y Milstein (Nature 256, pág. 495-497,
1975) así como las técnicas descritas en este documento. La
preparación de un anticuerpo monoclonal LO-CD2a se
describe con más detalle en el ejemplo 1 de esta solicitud. Como se
ha indicado anteriormente en este documento, los anticuerpos
LO-CD2a también pueden producirse mediante técnicas
recombinantes usando procedimientos conocidos en la técnica. El
anticuerpo recombinante también puede estar en forma de un
anticuerpo quimérico en el que las regiones variables de un
anticuerpo LO-CD2a de rata se combinan con la región
constante de un anticuerpo de otra especie. De este modo, por
ejemplo, el anticuerpo monoclonal puede humanizarse combinando las
regiones CDR de un anticuerpo monoclonal LO-CD2a de
rata con la región marco V y regiones constantes de un anticuerpo
humano para proporcionar un anticuerpo monoclonal quimérico
humano-de rata.
En una realización, el anticuerpo es una forma
humanizada de anticuerpo LO-CD2a construido a partir
de las regiones constantes de un anticuerpo humano y las regiones
marco y CDR de las regiones variables de cadena ligera y pesada, en
los que las regiones marco de las regiones variables de cadena
ligera y pesada se obtienen de las regiones marco de la región
variable de cadena ligera y pesada de un anticuerpo humano y las CDR
son las CDR de LO-CD2a de rata. En una realización,
uno o más restos de aminoácidos de las regiones marco de las
regiones variables de cadena ligera y pesada pueden ser restos de
aminoácidos de las regiones marco de LO-CD2a de
rata. Dichos restos de las regiones marco de rata se conservan en el
anticuerpo humanizado puesto que dichos restos pueden conservar la
especificidad de unión de LO-CD2a. De este modo, al
producir un anticuerpo humanizado, de acuerdo con un aspecto
preferido de la invención, las CDR de un anticuerpo humano se
sustituyen por las CDR de LO-CD2a con el factor
añadido de que algunos aminoácidos de la porción variable de cadena
ligera de LO-CD2a en particular de FR1, FR2 y FR3 y
algunos aminoácidos de la porción variable de cadena pesada de
LO-CD2a en particular de FR-2 y
FR-3 se conservan al construir el anticuerpo
humanizado; es decir, los aminoácidos correspondientes del marco
humano se sustituyen por los aminoácidos indicados del marco de
LO-CD2a de rata. Como se indica con respecto a la
figura 31 los aminoácidos 9, 12, 41, 42, 50, 51 y 82 en el marco de
la región variable de cadena ligera de LO-CD2a de
rata se conservan y, como se indica en la figura 33, los aminoácidos
47, 67, 70, 72, 76, 85 y 87 en el marco de la región variable de
cadena pesada de LO-CD2a de rata se conservan en el
anticuerpo humanizado. Una realización específica de la construcción
de dicho anticuerpo humanizado se da en el ejemplo 7 a continuación
en este documento.
En otra realización, se describe un anticuerpo
quimérico constituido por una región constante humana y las
regiones variables de LO-CD2a de rata y sus
usos.
El anticuerpo o molécula de esta invención
preferentemente: (i) se une a todos los linfocitos T y también a
células nulas pero no a linfocitos B como se muestra mediante
tinción con dos colores de linfocitos analizada mediante citometría
de flujo (Figuras 26 y 27); (ii) se une a todas las células T (según
se determinó tiñendo con el anticuerpo anti-CD3
Leu4), todas las células positivas para CD4 y CD8 según se define
mediante anticuerpos Leu3a y Leu2b respectivamente y algunos
linfocitos que son negativos para CD3 (células nulas); (iv) se une
a células nulas según lo corroborado mediante la tinción de células
positivas para CD16 según se detectó con Leu11, un marcador para
células NK (figura 26); No se observó tinción de células B, según se
define mediante unión a anti-CD19, con
LO-CD2a (figura 27). El anticuerpo
LO-CD2a también tiene preferentemente la
característica de que el anticuerpo se une a células nulas humanas
y mediante tinción doble tiene una mayor intensidad de tinción para
células humanas que son CD2+ y CD4+ que para células humanas que son
CD2+ y CD16+, y tiene una mayor intensidad de tinción para células
humanas que son CD2+ y CD8+ que para células humanas que son CD2+ y
CD16+.
Que LO-CD2a se une a CD2 se
confirmó expresando transitoriamente CD2 en células COS. Las células
COS se transfectaron transitoriamente con el plásmido \piH3MCD2
que contiene el gen que codifica la molécula CD2 completa, como se
describe en Peterson A y Seed B., Nature Volumen 329 29/10/87, pág.
842-846.
La transfección se realizó mediante el método de
DEAE-dextrano. Se recogieron y se tiñeron células
con el anticuerpo monoclonal anti-CD2 Leu5b
(Becton-Dickinson) y LO-CD2a, con
W632 múrido un anticuerpo para el MHC de clase I como control
positivo para tinción y con los controles emparejados con isotipo
correspondientes. La especificidad de la reactividad se confirmó
evaluando la unión del mismo panel de anticuerpos monoclonales en
células COS transfectadas con un plásmido irrelevante.
El patrón de tinción de estos anticuerpos
monoclonales en CD2 nativo expresado transitoriamente (figura 28)
indica que la transfección con CD2 conduce a la unión de ambos
anticuerpos, lo que apoya a la capacidad de LO-CD2a
para unirse a CD2.
La preparación de anticuerpo monoclonal
LO-CD2a adecuado para los fines de la presente
invención debe ser evidente para los expertos en la materia a
partir de las enseñanzas en este documento.
Un anticuerpo o fragmento o derivado del mismo o
molécula del tipo descrito anteriormente en este documento puede
administrarse in vivo de acuerdo con la presente invención
para inhibir la activación y la proliferación de células T y
reducir la densidad de la expresión de CD2 en la superficie celular
y de este modo reducir el número de linfocitos T CD2^{-}.
De este modo, por ejemplo, en un procedimiento
in vivo, dichos anticuerpos LO-CD2a se
administran para prevenir y/o inhibir la respuesta inmune y de este
modo inhibir la activación y la proliferación de células T.
Un anticuerpo o fragmento o derivado del mismo o
molécula del tipo descrito anteriormente en este documento puede
administrarse ex vivo de acuerdo con la presente invención
para reducir la densidad de expresión de CD2^{-} en la superficie
celular y de este modo reducir el número de células CD2^{-} de las
células donadoras. A modo de ejemplo y sin limitación, en un
procedimiento ex vivo, dichos anticuerpos o fragmentos o
derivados de los mismos o moléculas se infundirían en la médula
ósea del donante antes del transplante para evitar la aparición de
la enfermedad de injerto contra huésped después del transplante.
En dicha técnica in vivo o ex
vivo, el anticuerpo o fragmento o derivado del mismo o molécula
se administrará en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como
ejemplo representativo de dichos vehículos, pueden mencionarse
solución salina normal, tampones, etc. Dichos vehículos
farmacéuticos se conocen bien en la técnica y se pretende que la
selección de un vehículo adecuado esté dentro del alcance de los
expertos en la materia a partir de las enseñanzas contenidas en
este documento.
El anticuerpo LO-CD2a u otra
molécula de la presente invención puede administrarse in vivo
por vía intravenosa o mediante administración intramuscular,
etc.
Como se ha indicado anteriormente en este
documento, el anticuerpo LO-CD2a u otra molécula de
la presente invención se administra in vivo en una cantidad
eficaz para inhibir el rechazo del injerto. La expresión "una
cantidad eficaz", para fines de esta solicitud, debe significar
esa cantidad de anticuerpo monoclonal capaz de producir el efecto
deseado, es decir la inhibición del rechazo del injerto o la
inhibición de la activación de células T. En general, dicho
anticuerpo se administra en una cantidad de al menos 1 mg. Debe
entenderse que podrían usarse menores cantidades. Además, después
del tratamiento inicial, las cantidades descritas anteriormente en
este documento pueden reducirse para posteriores tratamientos, si
hubiera alguno. De este modo, el alcance de la invención no está
limitado por dichas cantidades.
De acuerdo con la presente invención, dichos
anticuerpos se administran para mantener la inhibición de la
activación de células T y el rechazo del injerto. De este modo, a
modo de ejemplo y no de limitación, el anticuerpo puede
administrarse mediante infusión intravenosa durante un periodo de
una o dos horas en una cantidad de entre aproximadamente 1 mg/dosis
y aproximadamente 50 mg/dosis en una suspensión vehicular
fisiológicamente aceptable una o dos veces al día durante un
periodo de desde aproximadamente ocho días o más, según sea
necesario. Dicho tratamiento para el rechazo del injerto se inicia
preferentemente en el momento de, o inmediatamente antes de, o
justo después del transplante o cuando se produce el rechazo del
injerto. El tratamiento podía administrarse una o dos veces al día
durante como mínimo uno o dos días cuando se inició en el momento
del transplante para inducir un estado hiposensible selectivo al
transplante. Dicho tratamiento para enfermedades autoinmunes con
respecto a la administración del anticuerpo o fragmento o derivado
del mismo o molécula de acuerdo con la presente invención comienza
se inicia cuando el médico a cargo ha determinado que es deseable
inhibir una respuesta inmune patológica.
Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la
presente invención, administrando un anticuerpo de acuerdo con la
invención en el momento del transplante y, en la mayor parte de los
casos, durante un corto periodo a partir de ese momento, puede
inducirse una hiposensibilidad al tejido u órgano transplantado,
para prevenir o inhibir de este modo episodios adicionales de
rechazo.
\newpage
Las técnicas de la presente invención para
inhibir la activación de células T pueden emplearse en solitario o
en combinación con otras técnicas, fármacos o compuestos para
inhibir la activación de células T o inhibir el rechazo del injerto
o la enfermedad de injerto contra huésped.
La invención se describirá adicionalmente con
respecto a los siguientes ejemplos, que son ilustrativos.
Las células, cultivos, mAb y mitógenos usados en
los ejemplos pueden prepararse y usarse mediante procesos y
procedimientos conocidos y puestos en práctica por los expertos en
la materia. El siguiente es un ejemplo de un proceso o
procedimiento que puede usarse para la preparación y uso de las
células, cultivos, mAb y mitógenos usados en los siguientes
ejemplos.
Se obtuvieron PBMC mediante sedimentación en
Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Suecia) de sangre
heparinizada obtenida del Centro de Donación de Sangre local. Se
resuspendieron PBMC aislados en medio enriquecido: medio RPMI 1640
(Gibco, Bélgica), suplementado con 100 U/ml de penicilina, 100
\mug/ml de estreptomicina, L-Glutamina 20 mM y
suero AB humano mezclado al 20% o suero fetal de ternero
termoinactivado al 15%. Se cultivaron PBMC a 1 x 10^{5}
células/pocillo en microplacas de 96 pocillos en forma de U (Falcon)
en un volumen final de 200 \mul de medio de cultivo/pocillo. Se
realizaron MLC bidireccionales con 1 x 10^{5} células de cada
donante/pocillo en el mismo volumen de medio de cultivo que se ha
indicado anteriormente. Todos los cultivos se realizaron por
triplicado. Ocho horas antes de los tiempos indicados en los
resultados, los cultivos se marcaron mediante pulsos con 2,0
\muCi/pocillo de ^{3}H-T (Amersham, Bélgica;
247,9 GBq/mmol; 6,7 Ci/mmol) y el radioisótopo incorporado en los
cultivos se cuantificó mediante centelleo líquido en un contador
Beta (Beckman L5 6000 SE). El porcentaje de inhibición se calculó
de la siguiente manera: % de inhibición = [1 - (cpm medio del
cultivo ensayado/cpm medio del cultivo de control)] x 100. Todos los
resultados se expresan como la media de tres cultivos
independientes. La desviación típica era siempre menor del 15% de la
media, excepto para aquellos casos en los que estos valores se
indican en los gráficos.
Se realizaron análisis fluorocitométricos usando
un citofluorógrafo FACScan (Becton Dickinson) con hardware
Hewlett-Packard equipado con el programa Consort 30.
El análisis independiente de la tinción de linfocitos y blastocitos
era posible usando selección diferencial según se define mediante
tamaño y granularidad, se analizaron 25.000 sucesos para cada
muestra. En estos experimentos, la concentración final de
LO-CD2a era de 200 ng/ml, excepto cuando se
indicaba otra cosa.
LO-DRA y
LO-Tact-1 (ambos marcados con FITC)
son mAb de rata producidos en nuestro laboratorio (op. cit. H.
Bazin (Ed) 1990 p. 287). LO-Tact-1
se dirige contra la cadena p55 del receptor IL-2
(op. cit. H. Bazin Immunol. 1984 y Janszen, M., Buck, D y Maino,
V.C. en Leucocyte Typing IV White Cell Differentiation Antigens, W.
Knapp (ED), Oxford University Press, 1989, p. 403). MAb de ratón
anti-CD2 humano y anti-CD3
(Leu-5b y Leu-4a marcados con FITC)
se obtuvieron de Becton Dickinson (Bélgica). MAb de ratón
anti-CD4 humano o anti-CD8 humano
(marcados con ficoeritrina) e IgG de ratón marcada con FITC o con
ficoeritrina (controles negativos) se obtuvieron de Coulter. Se usó
OKT3 (Ortho-Cilag, Bélgica) a una concentración
final de 100 ng/ml. Fitohemaglutinina A (PHA; Wellcome Labs, Reino
Unido) y Concanavalina A (Con A; Calbiochem Co., EEUU) se usaron a
una concentración final de 1 y 10 \mug/ml respectivamente.
La concentración de LO-CD2a
purificado se ajustó a 1 mg/ml en tampón bicarbonato sódico 0,1 M,
pH 8,4. NHS-biotina (Boehringer Mannheim 1008 960)
se disolvió en DMSO a una concentración de 1,5 mg/ml. Para cada
MAb, se añadieron 0,1 ml de solución de NHS-biotina.
La mezcla se agitó durante 2 h a temperatura ambiente. La reacción
se completó añadiendo 0,1 ml de tris-HCl 2 M, pH 8,0
por cada ml de anticuerpo (10 minutos a temperatura ambiente),
seguido de 1 ml de BSA al 1% en solución salina tamponada con
fosfato (PBS) por cada ml de anticuerpo. Para retirar la biotina
libre, la solución se dializó durante una noche a 4ºC en 1000
volúmenes de PBS. Tanto la reacción de biotinilación como el mAb
conjugado se protegían de la luz cubriéndolos con papel de
aluminio.
Se extrajeron RBC de sangre completa mediante
lisis con cloruro de amonio. Se preparó una solución madre 10x que
constaba de 90 g de NH_{4}Cl, 10 g de KHCO_{3}, 370 mg de EDTA y
H_{2}O hasta un volumen de 100 ml. Se añadieron cuarenta ml de 1x
cloruro de amonio a cada 10 ml de sangre y se incubó durante 10
minutos a temperatura ambiente. La mezcla se centrifugó a
continuación a 1200 rpm durante 10 minutos y el sedimento se
resuspendió en 10 ml de PBS con azida al 0,1%.
La tinción se realizó en placas agrupadas de 96
pocillos de fondo redondo (Costar Nº 3790) a 4ºC. Para la tinción
de único color, diez \mul de mAb se diluyeron apropiadamente en
PBS que contenía 0,2 mg de inmunoglobulina humana y se añadieron a
cada pocillo. Sangre agotada en glóbulos rojos se distribuyó en
placas a un volumen de 90 \mul por pocillo. Las células y los mAb
se mezclaron agitando suavemente y se incubaron 30 minutos.
Cincuenta \mul de PBS frío se añadieron a cada pocillo y las
placas se centrifugaron a 1900 rmp durante 2 minutos. El
sobrenadante se descartó mediante inversión y sacudiendo suavemente
la placa. Las células se dispersaron golpeando la placa en el
contador. El procedimiento de lavado se repitió dos veces añadiendo
20 \mul de PBS fría. Diez \mul de una dilución 1/20 de 1 g de
F(ab')_{2} de cabra
anti-rata-FITC se añadieron a las
células dispersadas en cada pocillo y se incubó durante 30 minutos
en la oscuridad. Las células se lavaron mediante la adición de 180
\mul de PBS frío a cada pocillo seguida de centrifugado a 1900
rpm durante 2 minutos. El sobrenadante se descartó, las células se
dispersaron y se añadieron 200 \mul de paraformaldehído al 0,5%
frío a cada pocillo. Las células se transfirieron a tubos (Falcon
Nº 2054) y se diluyeron a aproximadamente 0,5 ml con
paraformaldehído al 0,5%. Las muestras se evaluaron en una máquina
FACScan de Becton-Dickinson usando software LYSIS
II.
La tinción con dos colores se realizó mediante
un protocolo similar. Después de incubar las células con el mAb
primario y el reactivo anti-rata conjugado con FITC,
una dilución a 1/5 de suero normal de ratón se añadió para bloquear
cualesquiera puntos restantes en el reactivo
anti-rata. Después de una incubación de 15 minutos
(sin lavado), se añadieron 20 \mul de un mAb marcado con PE
específico para un determinante CD conocido y se incubó durante 30
minutos. Las células se lavaron y se fijaron como se ha descrito
para la tinción única.
\vskip1.000000\baselineskip
LO-CD2a es un anticuerpo
monoclonal anti-CD2 (IgG2b-Kappa) de
rata producido y caracterizado en nuestro laboratorio como se ha
indicado en cualquier otra parte (Véase las siguientes referencias:
Xia, H., Ravoet, A.M., Latinne, D., Ninnane, J., De Bruyere, M.,
Sokal, G. y Bazin, H., en H. Bazin (Ed), Rat Hybridomas and Rat
Monoclonal Antibodies, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida 1990,
p. 309 y Ravoet, A.M., Latinne, D., Seghers, J. Manouvriez, P.,
Ninanne, J., DeBruyere, M., Bazin, H. y Sokal, G.- en H. Bazin (Ed),
Rat Hybridomas and Rat Monoclonal Antibodies, CRC Press, Inc., Boca
Raton, Florida 1990, p. 287). Se purificó LO-CD2a a
partir de fluido ascítico mediante cromatografía de inmunoafinidad
aprovechando la diferencia alotípica que existe entre las
inmunoglobulinas de la rata que recibe el hibridoma productor y el
mAb secretado por éste último (Bazin, H., Cormont F. y DeClercq, L.
J. Immunol. Method., 1984, 71: 9). Éste reconoce a la población
total teñida con el mAb de ratón Leu-5b (marcado
con FITC) Figura 1 y aproximadamente al 90% de la población marcada
mediante el mAb T11 (marcado con rodamina) de ratón (no se muestran
los datos). El epítopo reconocido por LO-CD2a en la
molécula de CD2 es diferente de los epítopos reconocidos por los
mAb anti-CD2 de ratón Leu-5b y T11
(figura 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar los efectos del mAb de rata
LO-CD2a sobre linfocitos en reposo, se incubaron
PBMC en presencia de concentraciones en aumento de este mAb. Como
puede observarse en el Apéndice 1, las PBMC incubadas durante 6
días en presencia de LO-CD2a no muestran variaciones
significativas en la velocidad de incorporación de
^{3}H-T en comparación con cultivos de control. La
viabilidad celular al final de este periodo era variable, pero
promediaba aproximadamente el 80% según lo evaluado mediante
exclusión con azul de tripano. Cuando se incubaban PBMC en reposo
en presencia de LO-CD2a, no había variación
significativa en la expresión fenotípica de varios marcadores de
membrana, según se evaluó mediante citometría de flujo. Los
marcadores celulares de células T maduras en reposo (tales como
CD3, CD4 y CD8) muestran el mismo patrón de variación durante 6 días
de cultivo en presencia o en ausencia de LO-CD2a y
moléculas de activación tales como CD25 (IL-2R/p55)
no se expresan en estas condiciones experimentales o no son
modificadas por LO-CD2a, como en el caso de
determinantes antigénicos DR (figura 3).
Cuando se incubaron PBMC durante 6 días en
presencia de LO-CD2a, se observó una reducción
significativa en el porcentaje de linfocitos seleccionados
Leu-5b+ (figura 4). El porcentaje de linfocitos con
CD4 y CD8 no resulta afectado durante un periodo de 6 días de
cultivo por la presencia de LO-CD2a, lo que indica
que la reducción observada de linfocitos portadores de CD2 no puede
atribuirse a la eliminación de estas células sino a la desaparición
de la molécula CD2 o a un cambio conformacional en esta
glicoproteína producido por la unión de
LO-CD2a.
Para verificar si la reducción observada en
linfocitos con Leu-5b se debía a un cambio
conformacional de CD2 o a una desaparición (internalización o
liberación) de esta molécula después de la unión de
LO-CD2a, se cultivaron PBMC en presencia de 500
ng/ml de LO-CD2a y se analizaron durante 6 días en
citometría de flujo usando Leu-5b (marcado con
FITC), T11-RD1 (marcado con rodamina) y
MARK-3 (marcado con FITC). Como se muestra en la
figura 5a, los mAb Leu-5b o T11 no son capaces de
unirse a PBMC después de 2 a 4 días de cultivo en presencia de
LO-CD2a. En estas condiciones, el mAb de cadena
kappa de ratón anti-rata MARK-3
marcaba el 50% de las células el día 6 de cultivo lo que indicaba
que solamente el 35% de las células originales portadoras de CD2 no
mostraban LO-CD2a en su superficie, pero la tinción
con Leu-5b-FITC y
T11-RD1 se redujo marcadamente el día 2. Esto
sugiere que una alteración conformacional de CD2 que hace al epítopo
de Leu5b y T11 no disponible para la unión, se produce en respuesta
a LO-CD2a.
El análisis de la fluorescencia media de células
CD2+ indicaba que la densidad de expresión de este marcador se
reducía con el tiempo en presencia de LO-CD2a. El
mismo fenómeno se observaba si se usaban Leu-5b
marcado con FITC o LO-CD2a (revelado mediante
MARK-1 marcado con FITC) para detectar los
linfocitos CD2+. Se cultivaron en paralelo alícuotas de las mismas
PBMC en presencia de Leu-5b (mAb disponible en el
mercado, dializado contra PBS, dilución final 1:2 en medio de
cultivo). Como se muestra en la figura 5b, en esas condiciones
experimentales todas las células portadoras de CD2 están
recubiertas por el mAb Leu-5b (según se revela
mediante anti-ratón de cabra-FITC).
La tinción con T11-RD1 se reducía marcadamente,
mientras que una menor y más lenta reducción se observaba en el
porcentaje de células que presentan el epítopo reconocido por el mAb
LO-CD2a-FITC. Tomados
conjuntamente, estos resultados indican que las moléculas de CD2 han
cambiado parcialmente su conformación en respuesta a
LO-CD2a y que se produce una lenta modulación de
CD2/LO-CD2a.
Cuando se realizaron MLC (durante un periodo de
6 días) en presencia de concentraciones en aumento de mAb de rata,
se observó una reducción significativa de la MLR (según lo medido
mediante incorporación de ^{3}H-Timidina
(^{3}H-T)) a concentraciones de mAb de cómo mínimo
125 ng/ml. En la figura 6a, se muestra un ejemplo típico de curva
de respuesta a la dosis de inhibición de MLR por
LO-CD2a. Como puede observarse en esta figura 6a,
LO-CD2a induce un 80% de inhibición de MLR (6 días
de cultivo) a 250 ng/ml y este porcentaje de inhibición permanece
casi constante o superior al 80% en un amplio intervalo de
concentraciones (0,25 a 0,5 \mug/ml de mAb). La figura 6b muestra
una evolución temporal de los efectos inhibidores de diferentes
concentraciones de LO-CD2a sobre la MLR desde el
día 0 al día 6 de cultivo. Un ejemplo típico de incorporación de
^{3}H-T en MLC (en presencia o en ausencia de
LO-CD2a) se muestra en la figura 6c, donde se añadió
LO-CD2a a una concentración final de 200 ng/ml.
En la figura 6d, se muestran los efectos de
LO-CD2a sobre la MLR, cuando este mAb (a 200 ng/ml)
se añade a tiempos variables después del inicio del MLC. Más del
90% de inhibición de la MLR (según lo medido mediante incorporación
de H-T) se obtiene cuando este mAb se añade el día 0
y este efecto inhibidor sigue estando presente (45% de inhibición
en este ejemplo) cuando se añade LO-CD2a 4 días
después del inicio del MLC. Se obtuvieron resultados similares (no
se muestran) con concentraciones más altas (desde 0,20 a 5,0
\mug/ml) de LO-CD2a.
Cuando se realizaron análisis citofluorográficos
en el subconjunto de linfoblastos de un MLC (figura 7a y b), se
realizaron las siguientes observaciones: a) el número de blastocitos
(aproximadamente 300-500 blastocitos de 25.000
sucesos analizados) ya presentes al inicio del MLC creció
bruscamente desde el día 4 al día 6 en cultivos de control (más de
1200 blastocitos de 25000 sucesos analizados); b) en MLC realizados
en presencia de LO-CD2a, no había variación
significativa en el número de blastocitos durante todo el periodo de
cultivo y el día 6 el número de blastocitos siempre es inferior o
casi igual que el número inicial de blastocitos el día 0 (figura
7a); c) el porcentaje de blastos con CD25 creció bruscamente entre
células incubadas sin LO-CD2a (figura 7b); d) este
porcentaje permanece por debajo del 20% en el pequeño número de
blastos del MLC incubado en presencia de mAb (figura 7b) y la
fluorescencia media (como una medición de expresión de CD25) se
redujo un 75% en comparación con los blastos presentes en cultivos
de control (no se muestran los resultados); e) en ausencia de mAb
el porcentaje de blastos con CD3 permanece constante durante los 4
primeros días de cultivo (figura 7b) y el día 6 el porcentaje de
células con CD3 aumentaba hasta el 90%, mientras que en presencia
de LO-CD2a el porcentaje de CD3 aumenta lentamente
hasta alcanzar solamente aproximadamente el 45% el día 6. Estos
resultados indican que la presencia de LO-CD2a
inhibe la entrada de estas células en la ruta de activación
caracterizada por la expresión de receptor IL-2
(CD25). El número de blastos CD2+ permanece constante o disminuye
en presencia de LO-CD2a y la densidad de expresión
de este marcador de membrana se reduce fuertemente en estas
condiciones (no se muestran los datos).
Cuando se realizaron análisis fenotípicos
durante 6 días en el subconjunto de linfocitos en reposo
(sin blastos) del MLC, se obtuvieron resultados similares a
los descritos en la figura 3: en presencia de
LO-CD2a, no se podía detectar ninguna variación
significativa en el porcentaje de linfocitos CD3+, CD4+ o CD8+, en
comparación con cultivos de control; no se podía detectar expresión
de CD25 (marcador de activación) ya fuera en presencia o en
ausencia de LO-CD2a durante 6 días de cultivo
(figura 8a). Estos resultados sugieren que LO-CD2a
tiene un efecto muy débil, si tiene alguno, sobre el subconjunto en
reposo de linfocitos T en el MLC; es decir, en células T no
comprometidas en el proceso de activación. Al mismo tiempo, como se
muestra en la figura 8b, LO-CD2a induce una
reducción significativa del porcentaje de linfocitos CD2+ durante el
MLC. Estos resultados sugieren que tanto en cultivos no estimulados
(figura 5) como en el MLC, el efecto de LO-CD2a es
reducir la expresión de CD2 y/o inducir un cambio conformacional en
su estructura.
LO-CD2a puede bloquear las rutas
de activación de células T dependientes del complejo TcR/CD3 o de
receptores de mitógeno.
Cuando se añadía LO-CD2a a PBMC
activadas por mitógeno, se observaba una inhibición significativa de
la incorporación de ^{3}H-T. En uno de tres
experimentos de PBMC incubadas con mitógenos (OKT3, ConA y PHA) en
presencia o en ausencia de LO-CD2a añadido a tiempo
0 ó 1 hora después del inicio de los cultivos. En el primer caso,
los mitógenos se añadían 1 hora más tarde. Cuando se añadía
LO-CD2a 1 hora después del inicio del cultivo, los
mitógenos se añadían a tiempo 0. Esto se realizaba para saber si la
preincubación de PBMC con mitógenos o LO-CD2a podía
desencadenar sucesos que pudieran resultar afectados por la adición
del segundo reactivo. Los cultivos se recogieron a las 96 h,
después de un marcado por pulsos (6 h) con
^{3}H-T. Se observó más del 50% de inhibición de
la incorporación de ^{3}H-T en presencia de
LO-CD2a, ya se añadiera antes o después de los
mitógenos (figura 9). El mismo efecto se observaba cuando se
recogían células 4 días después del inicio del MLC y se exponían a
mitógenos (no se muestran los resultados). Una reducción drástica de
la incorporación de ^{1}H-T se observaba dos días
después del inicio del MLC, en aquellos cultivos que recibían el
mitógeno y LO-CD2a, en comparación con los mismos
cultivos que recibían solamente mitógeno (no se muestran los
resultados). La preincubación del MLC con LO-CD2a
antes de la adición de mitógeno, rebajaba la captación a valores
comparables con MLC sin OKT3.
LO-CD2a también era capaz de
inhibir la proliferación inducida por mitógeno si se añadía un día
después del inicio de la proliferación inducida por mitógeno. Los
resultados de experimentos realizados con dos donantes se muestran
en la figura 10. Las PBMC se incubaron junto con mitógenos (OKT3,
ConA y PHA). En estos experimentos, se añadió
LO-CD2a a tiempo 0 (Día 0), 24 h (Día 1) o 48 h (Día
2) después del inicio de los cultivos. La inhibición de la
proliferación en respuesta a OKT3 y ConA mediante
LO-CD2a era significativa si se añadía 24 horas
después de la adición de mitógeno a tiempo 0.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aislaron PBMC de sangre heparinizada mediante
sedimentación con Ficoll Hypaque. Después del lavado, las células
efectoras, suspendidas en medio enriquecido, se incubaron durante
una noche a concentraciones de 1 x 10^{6}/ml en una placa Falcon
para eliminar los monocitos (mediante adherencia).
Las células diana (línea celular K562) se
marcaron mediante incubación durante una noche con ^{51}cromo
^{51}Cr (0,9 ml de una suspensión celular a 3 x 10^{6}/ml + 0,02
ml de una solución de 3 mCi/ml de ^{51}Cr, Amersham).
Después de una incubación de 16 horas, las
células efectoras y diana se lavaron cuatro veces, se contaron y se
incubaron en una microplaca de 96 pocillos de fondo en V a
diferentes proporciones de E/D: 200/1 (10 \mul de una suspensión
de 4 x 10º/ml de células efectoras con 100 \mul de 2 x 10^{4}/ml
de células diana) 100/1, 50/1 y 25/1.
Después de una incubación de cuatro horas, se
midió la liberación de ^{51}Cr contando 100 \mul de sobrenadante
de cada pocillo en un contador gamma.
La liberación máxima (células diana + HCLIN) y
espontánea (células diana + medio enriquecido) se usaron para
calcular la lisis específica:
La inclusión de LO-CD2a a 5, 1 y
0,5 \mug/ml en el ensayo de NK con dos donantes normales (figuras
10a y 10b) condujo a una inhibición de citotoxicidad de
aproximadamente el 50% con todas las concentraciones ensayadas de
anticuerpo y en todas las proporciones de E/D ensayadas. Esto es en
comparación con la inhibición esencialmente completa de la
proliferación en la MLR a dosis de o por encima de 0,25
\mug/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
MARK3-FITC es un mAb de ratón
dirigido contra el alotipo kappa 1b de Ig de rata conjugado con
FITC. MARG2b-biotina es un mAb de inmunoglobulina
IgG2b de ratón anti-rata conjugado con biotina.
Estos dos mAb se produjeron y se marcaron en nuestro laboratorio.
Para ensayos de inmunofluorescencia, se usaron a una concentración
final de 2,5 \mug/ml. Leu-5b-FITC
(Becton-Dickinson) y T11 Rodamina (COULTER) son dos
mAb de ratón anti-CD2 humano. Los marcados con
Rodamina T4 y T8 (COULTER) son mAb de ratón anti-CD4
y CD8 humano, respectivamente.
Se añadieron mAb anti-células T
humanas (anti-CD2, -CD4, -CD8, véase anteriormente)
a muestras de 100 \mul de sangre completa y se incubaron a 4ºC
durante 45 minutos. Se lisaron glóbulos rojos con tampón de lisis
de cloruro de amonio tamponado con Tris (NH_{4}Cl 144 mM/Tris 17
mM, pH 7,2) y se lavaron los linfocitos con PBS/FCS al 2%/NaN_{3}
al 0,2%. Para la detección de mAb no marcados, se añadió un segundo
mAb (conjugado con FITC o con biotina) a una concentración final de
2,5 \mug/ml. Después de 45 minutos de incubación a 4ºC, las
células se lavaron con PBS/FCS/NaN_{3}. Para mAb biotinilados, se
realizó una incubación adicional (15 minutos) con conjugado de
estreptavidina-ficoeritrina. Se resuspendieron
linfocitos humanos o de mono marcados en una solución de formalina
al 2% y se analizaron en un citofluorómetro FACScan
(Becton-Dickinson) equipado con el programa Lysis
II para seleccionar poblaciones de linfocitos en función de tamaño
frente a granularidad. Como control para la tinción no específica,
se incubaron alícuotas de células con Ig de ratón conjugadas con
FITC o ficoeritrina (Coulter).
El LO-CD2a en suero se
cuantificó mediante ELISA usando un mAb IgG2b de ratón
anti-rata (MARG2b-8 producido en
nuestro laboratorio) como primera capa (recubrimiento) y un mAb de
cadena kappa de ratón anti-rata
(MARK-3) acoplado a peroxidasa de rábano rusticano
para detección. En resumen, placas de microvaloración (Falcon) se
incubaron durante una noche con 100 \mul/pocillo de
MARG2b-8 (5 \mug/ml) y los puntos no ocupados en
el plástico se saturaron con PBS que contenía leche en polvo
(bovina) al 5%. Después de 1 h de incubación a temperatura
ambiente, las placas se lavaron con PBS con el 0,1% de
Tween-20 y se incubaron 1 h con 100 \mul/pocillo
de suero de mono o humano diluido. Después de retirar lavando el
material no unido, las placas se incubaron 1 h con 100
\mul/pocillo de MARK3-peroxidasa (2 \mug/ml en
PBS). Después de lavar de nuevo, las placas se incubaron con OPD
(diclorhidrato de o-fenilendiamina, 0,4 mg/l, Sigma
Chemical), en tampón citrato-fosfato que contenía
el 0,33% de H_{2}O_{2}. El producto de reacción coloreado se
detectó a 492 nm. Se realizó una curva patrón en paralelo con una
concentración conocida de LO-CD2a purificado diluido
sucesivamente en una mezcla de suero de mono o humano de
control.
La detección de anticuerpos anti
LO-CD2a de mono o humanos se realizó mediante ELISA
usando placas de microvaloración de 96 pocillos recubiertas con
LO-CD2a (5 \mug/ml). Los anticuerpos humanos o de
mono anti-LO-CD2a unidos a las
placas, se revelaron mediante mAb IgM
(LO-HM-7) o IgG
(LO-HG-22) de rata
anti-humanos marcados con peroxidasa de rábano
rusticano.
\vskip1.000000\baselineskip
Un mono cynomolgus recibió 10 mg/día de
LO-CD2a durante tres días consecutivos. El
anticuerpo monoclonal era bien tolerado.
Se observó el agotamiento de linfocitos después
de la primera inyección pero se obtuvo un muy pequeño agotamiento
adicional después de las 2ª y 3ª inyecciones.
El segundo mono recibió 20 mg/d durante 10 días.
El mAb también era bien tolerado. No se observaron efectos
secundarios después de la dosificación, ya que los animales estaban
activos, alerta, comían bien sin dar señales de nauseas o
alteración gastrointestinal.
Los recuentos de linfocitos y poblaciones
celulares en el segundo mono se resumen en las figuras 12 y 13. La
actividad de NK se redujo ligeramente después de las 10 inyecciones
(figura 14). Los niveles circulantes de mAb eran muy altos (figura
15) y la inmunización se producía al final del tratamiento (figura
16).
\vskip1.000000\baselineskip
El experimento descrito en este apartado se
realizó para determinar la tolerancia de un babuino a
LO-CD2a, para analizar los efectos de este mAb
sobre algunos de los marcadores de membrana de linfocitos de babuino
y para determinar la semi-vida de
LO-CD2a en el suero.
La tinción de células de babuino con
LO-CD2a da como resultado < 20% de células
positivas a una intensidad de fluorescencia media
significativamente más baja que la de células humanas teñidas. Este
patrón de tinción puede reflejar reactividad cruzada o unión
débiles mediante interacción de Fc con células de babuino.
El estudio se realizó en un babuino macho (Papio
mormon) de 8,8 kg de peso. Antes de cada inyección de
LO-CD2a el mono era anestesiado; la primera vez con
Ketaler (2 ml) y Prazine (0,5 ml), la segunda vez solamente con
Ketaler y las veces posteriores con ketaler y Prazine (0,3 ml). Se
inyecto LO-CD2a por vía intravenosa (i.v. en 10
minutos), diluido en 10 ml de solución salina fisiológica. Para el
análisis fenotípico de linfocitos y la medición de los anticuerpos
circulantes (LO-CD2a inyectado, anticuerpos
anti-LO-CD2a recién formados y
anticuerpos anti-LO-CD2a de
reactividad cruzada de babuino pre-existentes), se
extrajeron muestras de sangre (10 ml) en dos tubos. El tubo para la
tipificación de linfocitos contenía EDTA. Las muestras se extrajeron
antes del primer tratamiento para determinar los niveles de
referencia.
La primera dosis (10 mg) de
LO-CD2a se administró el día 0 del estudio; las
cuatro dosis siguientes (10 mg/dosis) se administraron los días 7,
8, 9 y 10. Se extrajeron muestras de sangre unos pocos minutos
después de cada dosis de LO-CD2a. Los días 7 y 9
también se extrajo una muestra de sangre suplementaria (en un tubo
que contenía EDTA) antes de las inyecciones de
LO-CD2a. Se extrajeron muestras de sangre los días
1, 2, 11, 12, 13, 16 y 24.
No se observaron reacciones anormales en la
actividad o hábitos alimentarios durante las inyecciones de
LO-CD2a o durante el periodo de estudio. El peso
del animal permanecía alrededor de 8,8 kg medido el día 0 (véase la
tabla a continuación).
La tinción con fluorescencia de estos linfocitos
de la sangre periférica de babuino mostró algunas características
interesantes:
- a)
- Bajo el efecto de LO-CD2a, el subconjunto de linfocitos positivos para CD2 se reducía significativamente (según se revela mediante dos mAb anti-CD2 diferentes) al final de la 5ª dosis de LO-CD2a, es decir en el momento de la máxima acumulación de mAb en la sangre (véase las figuras 17a y 17b). Dado que los subconjuntos de linfocitos CD4+ y CD8^{-} no se reducen durante este periodo (figura 19) y puesto que las células CD4+ y CD8+ comprenden la mayor parte de los linfocitos portadores de CD2, la reducción de células CD2^{-} indica que es la expresión del marcador de membrana la que se está reduciendo o su conformación se está alterando, en lugar de los linfocitos.
- Como puede observarse en la figura 17a, una ligera reducción de linfocitos positivos CD2+ (Leu-5b^{-} o T11^{-}) se observa después de la primera dosis de LO-CD2a. Dos días después de esta primera dosis, el nivel de células positivas para CD2 (Leu-5b^{-} o T11^{-}) aumentó hasta los valores de partida.
- Al final de las cuatro dosis separadas por 24 horas de LO-CD2a (días 7-10) el porcentaje de células positivas para CD2 (Leu-5b^{-} o T11^{-}) se redujo bruscamente y comenzó a aumentar lentamente 3 días después del final de la administración de LO-CD2a.
- b)
- Al mismo tiempo, el porcentaje de células positivas para LO-CD2a, es decir, el porcentaje de células a las que se unía el mAb circulante subió al 22% después de la 2ª dosis de LO-CD2a (día 7) y después se redujo, al igual que las células CD2^{-} reveladas mediante los mAb anti-CD2 Leu-5b y T11 (figura 17). La reducción de células LO-CD2a+ se revelaba mediante el mAb MARK-3FITC (figura 18).
- La reducción de células LO-CD2a+ se determinó mediante la detección del LO-CD2a presente en células según se detecto mediante los mAb conjugados MARK-FITC o MARG2b-8-biotina (figura 18a). El mismo fenómeno se observaba si las células se incubaban en primer lugar con LO-CD2a a 2,5 \mug/ml para saturar todos los puntos no ocupados por mAb circulante. LO-CD2a se detectó mediante MARK-FITC o MARG2b-8-biotina (figura 18).
- c)
- Como puede observarse en la figura 19, el subconjunto positivo para T4 de linfocitos de babuino mostraba un aumento moderado durante los días 9 a 12 después del cual el porcentaje de linfocitos T4^{-} volvía a su valor inicial. De forma concomitante con el aumento de células T4^{-}, el porcentaje de linfocitos positivos para T8 aumento desde el día 9 al día 11. Después de ese día este porcentaje volvió a valores iniciales.
- d)
- Los niveles de mAb circulante LO-CD2a se reducían a valores de fondo 3 días después de la primera inyección (véase la figura 17b). Cuando se aplicaba LO-CD2a en cuatro dosis separadas por poco tiempo (días 7 a 10), los niveles de LO-CD2a en suero (aproximadamente 3,7 mg/ml, valor máximo en este periodo) se reducían lentamente después de la última dosis (días 10 a 16), lo que indicaba una semi-vida relativamente larga del Ab en este modelo animal. No se detectaron anticuerpos anti- LO-CD2a de babuino en las muestras de sangre recogidas los días 11, 12, 13, 16 y 24.
LO-CD2a parece ser bien tolerado
por primates no humanos, según se demuestra mediante la ausencia de
reacciones evidentes en babuino mono cynomolgus.
LO-CD2a parece tener una semi-vida
relativamente larga en el babuino. Veinticuatro horas después de la
primera dosis de LO-CD2a (día 1 en la figura 24b),
el 50% del nivel máximo detectable de mAb seguía estando presente
en el suero. Tres días después de la última dosis de
LO-CD2a (día 13 en la figura 24b), el 50% del nivel
máximo detectable de mAb seguía estando presente en el suero.
Aunque el patrón de tinción en primates no
humanos no es coherente con el observado para CD2 en células
humanas, la reducción del porcentaje de linfocitos positivos para
CD2 seguida de un lento aumento de este porcentaje de células, es
similar a lo observado en células mononucleares PBMC cultivadas en
presencia de LO-CD2a.
\vskip1.000000\baselineskip
Éste era un paciente hembra con pielonefritis
crónica, que se trató con un aloinjerto renal para insuficiencia
renal en fase terminal. Se produjo una crisis de rechazo y se trató
con 10 días de administración de OKT3. El nivel de creatinina cayó
de 2 a 1,4 mg/dl. Aproximadamente cuatro (4) meses después, se
diagnosticó una crisis de rechazo mediante un nivel de creatinina
de 2 mg/dl y una biopsia que indicaba rechazo moderado. El paciente
se trató con 1,5 g de Solumedrol y un tratamiento de ATG durante los
siguientes ocho (8) días, momento en el cual el nivel de creatinina
era de 1,65 mg/dl. Siete días después del tratamiento se realizó
una biopsia e indicaba rechazo celular y rechazo vascular moderado.
Dos días después de la biopsia (día 0) el paciente era anúrico con
un nivel de creatinina de 2,4 mg/dl. Ese mismo día el paciente
recibió 10 mg de LO-CD2a, 1,5 g del corticoide
Solumedrol, más 1 g de Polarimina (una
anti-histamina) y 1 g de Dafalgan (acetaminofeno).
El tratamiento con el corticoide, dexclorfeniramina y acetaminofeno
es denominado por la comunidad de transplantes como
"cobertura". No se observaron efectos secundarios. Al final de
las 23 horas, el paciente producía 700 ml de orina y la creatinina
era de 2,72 mg/dl. Durante los próximos 9 días, recibió 10 mg/día de
LO-CD2a. El paciente abandonó el hospital sin una
biopsia de seguimiento en ese momento, Día 11.
Las mediciones del nivel de creatinina en suero
durante el tratamiento con ATG y durante el siguiente tratamiento
con LO-CD2a indicaban que el nivel de creatinina
aumentaba a pesar del tratamiento con ATG y caía y se estabilizaba
con LO-CD2a (figura 27).
El recuento de leucocitos caía desde un máximo
de 10000 a 2000 durante el tratamiento con LO-CD2a y
seguía cayendo hasta la última medición el día 21 (figura 20). El
recuento de linfocitos era bajo y variable durante el periodo de
observación.
Los niveles en suero de LO-CD2a
aumentaron hasta máximos de 2,0-3,0 \mug/ml
inmediatamente después de cada tratamiento y caían hasta mínimos de
aproximadamente 1,0 \mug/ml entre cada tratamiento (figura 21).
Con el último tratamiento el día 9, el nivel caía un 50% en 24
horas y a 0 el día 14. Este paciente volvió a la consulta el día
40.
El nivel de creatinina del paciente era de 2,27
el día 40, 2,48 el día 50 y subió a 3,11 el día 66, momento en el
cual se obtuvo una biopsia, con el informe inicial coherente con
rechazo celular grave y hemorragia intersticial (véase a
continuación). El paciente se trató con 150 R de irradiación al
riñón, 3 x 125 mg de Solumedrol, mientras se continuaba con la
terapia de mantenimiento y ciclosporina más 12,5 mg/día de
esteroides. Este nivel de creatinina seguía subiendo durante el
periodo posterior. El día 70 el nivel de creatinina era de 3,3: día
80, 5,63; día 84, 8,35. El día 86 el nivel de creatinina era de 10,8
y se realizó una nefrectomía de transplante el día 88. Este
cumplimiento del paciente con el mantenimiento de la inmunosupresión
durante el periodo entre su descarga el día 10 y su biopsia el día
66 es cuestionado y la pérdida del riñón a pesar del evidentemente
exitoso rescate debe ser un factor a tener en cuenta en el incierto
cumplimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
El paciente era un hombre de 38 años de edad que
era hepatitis C^{-}. Había recibido un aloinjerto renal para el
tratamiento de insuficiencia renal en fase terminal debido a
nefropatía intersticial crónica. Un año y tres meses después, se
sometió a una nefrectomía de transplante debida a rechazo celular y
vascular agudo resistente a un tratamiento con OKT3.
Un año y diez meses después de la nefrectomía de
transplante, recibió un segundo aloinjerto renal. Tres días
después, su nivel de creatinina era de 1,4 mg/dl. Tres días después
recibió 500 mg de Solumedrol; la creatinina del paciente después de
ese día era de 1,8 mg/ml. Al día siguiente recibió 500 mg de
Solumedrol; la creatinina era de 3,25 mg/ml. Al día siguiente
recibió 500 mg de Solumedrol; su creatinina era 2,95 mg/dl. Tres
días después su nivel de creatinina era de 2,3 mg/dl y se sometió a
una biopsia que demostró rechazo celular de grado 3 en adelante.
Tres días después recibió 10 mg de LO-CD2a, más 200
mg de Solumedrol Polaramina y Dalgafan. Los efectos secundarios
observados se limitaban a somnolencia; no se observaron hipertermia
o hipertensión. Durante los siguientes 9 días, recibió tratamientos
diarios de 10 mg de LO-CD2a. El día después del
final de dicho tratamiento una biopsia no mostraba signos de
rechazo.
El paciente toleraba bien el tratamiento con
LO-CD2a sin señales de efectos secundarios clínicos,
incluyendo sin fiebre ni hipertensión con ninguna dosis. Ensayos
químicos de laboratorio hematológicos y clínicos rutinarios
(incluyendo LFT [Ensayos de la Función Renal]) obtenidos
durante el curso del tratamiento no demostraron alteraciones
atribuibles a la administración del anticuerpo, excepto por una
reducción del recuento de linfocitos de 290/mm cúbico a un mínimo
de 100/mm cúbico y la reducción del nivel de creatinina asociada con
la resolución de la crisis de rechazo (de 2,7 mg/dl al inicio del
tratamiento con LO-CD2a hasta 1,10 al final de
tratamiento).
La figura 22 muestra el nivel de creatinina en
suero de este paciente, que cae desde 2,5 hasta aproximadamente 1,0
los días después del tratamiento con LO-CD2a. El
paciente era linfopénico antes y durante el tratamiento y el
recuento de leucocitos no mostraba alteración drástica con el
tratamiento (figura 23). En este paciente los niveles en suero de
LO-CD2a no subieron por encima de 2,0 \mug/ml
después de cada tratamiento y cayeron a mínimos de 1,0 a menos de
0,25 \mug/ml (figura 24). Ocho meses después del primer
tratamiento con LO-CD2a el paciente se comportaba
bien con función renal normal y sin señales de rechazo
recurrente.
La biopsia contenida aproximadamente 20
glomérulos que son normales. Había un escaso infiltrado mononuclear
con un grado menor de edema intersticial. Solamente se encontraron
grados menores de invasión tubular y no se encontraron lesiones
vasculares. Estos descubrimientos son insuficientes para el
diagnóstico de rechazo celular agudo. Había células mononucleares
poco frecuentes en pequeñas arterias, que resultaban sospechosas,
pero que no cumplían los criterios para el diagnóstico de
rechazo.
La biopsia parecía similar a la biopsia anterior
y contenía aproximadamente 10 glomérulos. El infiltrado era muy
escaso y no se identificaron lesiones vasculares.
\vskip1.000000\baselineskip
El paciente era un individuo de 19 años de edad
con enfermedad de von Willebrand que recibió un aloinjerto renal
para el tratamiento de insuficiencia renal en fase terminal debido a
pielonefritis crónica. El transplante se retiró 17 días después
debido a rechazo vascular agudo con hipertensión secundaria después
del fallo de un tratamiento de 6 días con OKT3.
Cinco meses y medio después recibió un segundo
aloinjerto renal. Tres días después su nivel de creatinina era de 6
mg/dl. Al día siguiente el nivel de creatinina era de 7 mg/dl y una
biopsia indicaba rechazo celular de grado 3 en adelante y rechazo
vascular (endoarteritis proliferativa sin necrosis ni trombosis).
Este mismo día recibió 10 mg de LO-CD2a, 40 mg de
Solumedrol y Polaramina y Dafalgan. No se observaron efectos
secundarios. Durante los siguientes 9 días recibió tratamientos
diarios de 10 mg de LO-CD2a, sin otros fármacos ni
efectos secundarios. Dos días después de la finalización del
tratamiento, su nivel de creatinina era de 1,75 mg/ml y una biopsia
no indicaba signos de rechazo agudo, con necrosis intersticial y un
punto focal de rechazo crónico.
No se observaron efectos secundarios (alteración
de la BP [Presión Sanguínea] o temperatura). Ensayos
químicos de laboratorio hematológicos y clínicos rutinarios
(incluyendo LFT) no demostraron alteraciones atribuibles a la
administración del anticuerpo, excepto la reducción del nivel de
creatinina asociada con la resolución de la crisis de rechazo (de
7,10 mg/dl al inicio del tratamiento con LO-CD2a
hasta 1,75 mg/dl al final del tratamiento de 10 días). El recuento
de linfocitos era de 340/mm cúbico antes del tratamiento y cayó
hasta un mínimo de 220/mm cúbico durante el tratamiento, subió
hasta 690/mm cúbico 9 días después del cese del tratamiento con
LO-CD2a y había subido hasta 1000/mm cúbico 23 días
después del final del tratamiento.
El recuento de leucocitos en este paciente no
era alterado significativamente por el tratamiento (figura 25). El
nivel de creatinina en suero cayó drásticamente con el tratamiento
(figura 25). Siete meses después del primer tratamiento con
LO-CD2a, el paciente se comportaba bien con función
renal normal y sin señales de rechazo recurrente.
Una arteria arcuata evaluada mostraba una
marcada infiltración mononuclear de la íntima con rotura de la
elástica. Había una escasa infiltración en el intersticio, con
invasión ocasional de los túbulos. El intersticio mostraba un edema
difuso, intersticial leve. Aproximadamente 7 glomérulos estaban
presentes. Estos muestran hipercelularidad con células
mononucleares e hinchazón endotelial. En conjunto, este patrón se
diagnosticó como rechazo celular agudo grave.
La biopsia mostraba varias pequeñas arterias,
que muestran fibrosis intimal en algunos casos con un material
mucoide pero un infiltrado celular muy escaso. El intersticio
mostraba una fina fibrosis difusa y un mínimo infiltrado
mononuclear. Los túbulos eran localmente atróficos pero por lo demás
normales. No había pruebas de rechazo celular activo.
No se han descrito posteriores episodios de
rechazo durante los 28 meses de seguimiento del segundo y tercer
pacientes que continuaron cumpliendo con su terapia
inmunosupresora.
El paciente, que padecía enfermedad de injerto
contra huésped grave (toxicidad grave de piel, intestino, renal y
del SNC, resistente a alta dosis de prednisona) después de un
transplante de médula ósea alogénica recibió 12 días de
administración de LO-CD2a a 10 mg/día. Sus síntomas
mejoraron; la función renal volvió a la normalidad, la diarrea
cesó, la piel mejoró y se resolvió la confusión. Cuatro días después
de la interrupción de administración del anticuerpo, los síntomas
reaparecieron y el paciente murió a pesar del inicio de un segundo
curso de tratamiento con anticuerpo.
Por lo tanto, podía usarse
LO-CD2a para invertir respuestas inmunes en curso a
tejidos extraños (alogénicos y xenogénicos, puesto que inhibe la
xeno-MLR así como la alo-MLR). El
anticuerpo podría administrarse mediante infusión i.v. una o dos
veces al día durante de 10 días a 14 días. También puede usarse
profilácticamente para impedir la activación de células T como
parte del protocolo de inducción inmediatamente posterior a un
transplante de órgano.
En un segundo experimento, se inició un ensayo
clínico farmacocinético y de búsqueda del intervalo de dosis, de
seguridad de Fase I, en receptores de aloinjertos renales que se
sometieron a una biopsia inicial que demostró un episodio de
rechazo agudo. La preparación de anticuerpo usada en este ensayo es
LO-CD2a, producido en cultivo celular.
El uso compasivo del anticuerpo no mostraba
efectos secundarios y sugería eficacia en la inversión del rechazo
agudo del injerto a una dosis de 10 mg/día durante 10 días. Los
estudios preclínicos con chimpancés sugerían que se observaron
efectos in vivo similares con dosis equivalentes a dosis
humanas que variaban entre 0,1-100 mg/día sin
efectos secundarios obvios. Por lo tanto, un objetivo de este ensayo
de Fase I era investigar niveles de dosis descendentes de
LO-CD2a comenzando a partir de 10 mg/día durante
diez días (con una prolongación opcional de cinco días adicionales)
para obtener indicaciones de la dosis eficaz mínima. Puesto que no
se habían observado efectos secundarios con "cobertura" con
esteroides en los pacientes de uso compasivo descritos
anteriormente, se decidió administrar el anticuerpo sin cobertura de
esteroides y con solamente un mínimo
pre-tratamiento con analgésicos y
anti-histamínicos. Esto se realizó para caracterizar
de forma predecible los efectos secundarios inducidos por
LO-CD2a.
Once pacientes se han enrolado en este protocolo
hasta la fecha. Cuatro pacientes se trataron con 10 mg/día, cinco
pacientes se trataron a 5 mg/día y dos pacientes se trataron con 2,5
mg/día.
Entre los once pacientes enrolados, nueve
pacientes experimentaron inversión o inversión parcial de rechazo
agudo confirmado por biopsia: los cuatro pacientes tratados con
LO-CD2a a 10 mg/día, tres de los pacientes tratados
con 5 mg/día y ambos pacientes tratados con 2,5 mg/día. Uno de los
pacientes tratado con 5 mg/día (Paciente 8, véase a continuación)
abandonó el estudio voluntariamente después de la primera dosis y un
segundo paciente tratado con 5 mg (Paciente 9) mostraba una mala
respuesta.
La tabla 1 resume los resultados obtenidos con
pacientes de rechazo renal tratados con LO-CD2a en
este protocolo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los sucesos adversos observados durante el
tratamiento con LO-CD2a sin cobertura con esteroides
incluían nauseas, vómitos, fiebre, escalofríos e hipertensión,
posiblemente como resultado de una liberación transitoria de
citoquinas. La mayoría (más del 70%) de estos sucesos se observaron
durante la administración de la primera dosis y eran de alcance y
duración limitados. Por ejemplo, no se observaron fiebres de más de
40ºC y la mayor parte de los sucesos se resolvían a las pocas horas
después de la aparición. No se observó hipotensión o diarrea grave.
No existía una clara relación entre la intensidad y la incidencia de
estos sucesos y la dosis de anticuerpo. A pesar de la obvia
incomodidad de estos síntomas, ningún suceso requirió medidas de
reanimación de emergencia.
En un tercer experimento, diez pacientes con
rechazo agudo de aloinjerto renal se trataron en una base compasiva
sin cobertura con esteroides con LO-CD2a de la
siguiente manera:
Dos se trataron con 10 mg/día, cuatro se
trataron con 5 mg/día y cuatro se trataron con 2,5 mg/día. Todos
los pacientes de uso compasivo tratados con 10 mg/día y 5 mg/día y
todos menos uno de los tratados con 2,5 mg/día mostraban señales de
resolución completa o parcial del rechazo mediante biopsia y otros
signos clínicos. El perfil del suceso adverso con estos pacientes
de uso compasivo se parecía al observado anteriormente en este
documento predominantemente con síntomas de primera dosis de
duración y alcance limitados.
En un cuarto experimento, seis pacientes con
enfermedad de injerto contra huésped resistente y un receptor de
transplante de hígado han recibido LO-CD2a en una
base de uso compasivo. No se describieron sucesos adversos para
estos pacientes. A continuación se proporcionan breves descripciones
narrativas para estos pacientes.
Los seis pacientes de GvHD (injerto contra
huésped) se trataron mediante 10 dosis diarias consecutivas de
10 mg de LO-CD2a, administradas por vía intravenosa
durante una hora. De forma concomitante, se continuó con
ciclosporina y esteroides. Todos los pacientes excepto uno mostraban
una mejoría de sus síntomas de GvHD. La resolución de los síntomas
de GvHD se inició el día 3-6 después del inicio de
la terapia con el mAb. Un avance de los signos de GvHD hepática en
terapia de mAb se ha observado en dos pacientes. La reaparición de
los signos de GvHD se observó en 2 de 3 pacientes evaluables.
Un séptimo paciente había recibido un hígado de
un donante, pero desafortunadamente había desarrollado sepsis como
resultado de una complicación quirúrgica acompañada por una
insuficiencia renal debida a la toxicidad de ciclosporina y función
de la médula ósea gravemente deprimida. Debido a su afección, el
cirujano no quiso poner en riesgo al paciente o a un segundo hígado
que se le había asignado, mediante el uso de agentes
inmunosupresores disponibles actualmente (OKT3, Mofetil, FK506,
ciclosporina y ATG), para la inducción. El paciente recibió el
transplante de hígado y tratamiento con LO-CD2a
durante siete días a 5 mg/día con la primera dosis infundida
durante la cirugía comenzando antes del despinzado del órgano
transplantado. Las posteriores dosis se administraron con
esteroides a dosis baja. Durante el periodo de tratamiento, la
función renal del paciente mejoró suficientemente para que se
iniciara un régimen inmunosupresor convencional. El paciente no
mostraba ningún signo de rechazo a las ocho semanas después del
transplante.
Aunque la presente invención, en una realización
preferida, se refiere a la inhibición del rechazo del injerto, debe
entenderse que el alcance de la invención no se limita a ésta y es
generalmente útil para la inhibición de la activación de células T
para todos y cada uno de los fines.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló ARN total de la línea celular
LO-CD2a (ATCC HB 11423) de acuerdo con el método de
Chirgwin (Biochemistry, 18: 5294, 1979). A continuación se preparó
ARNm usando el kit de ARNm oligotex-dT (Qiagen,
Chatsworth, CA). Aproximadamente 200-300 ng de ARNm
se transcribieron de forma inversa usando el kit de
ARN-PCR de Perkin-Elmer Cetus
(Norwalk, CT). La reacción se realizó a 42ºC durante 1 hora. Los
cebadores de oligonucleótidos necesarios parra la amplificación de
genes de V_{H} y V_{L} se seleccionaron usando las siguientes
referencias: 1) Sequences of Proteins of Immunological Interest,
Kabat et al., 5ª ed., 1991, 2) Orlandi et al., Proc.
Natl. Acad. Sci., (EEUU) 86: 3833-3837 (1989).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los números se refieren a restos de aminoácidos,
como se muestra en Kabat et al., 1991.
Se realizaron reacciones en cadena de la
polimerasa (PCR) en un termociclador de ADN 480 de
Perkin-Elmer usando las siguientes condiciones: 5
minutos a 94ºC, 30 ciclos que constan de 1 minuto a 94ºC, 2 minutos
a 60ºC y 2 minutos a 72ºC. A esto le seguían 5 minutos a 72ºC. Se
purificaron en gel fragmentos de ADN a partir de agarosa al 1%
usando el kit de extracción en gel Qiaex (Qiagen, Chatsworth, CA). A
continuación, se hicieron romos los extremos de los fragmentos de
acuerdo con el método de Kanugo y Pandey, BioTechniques, 14:
912-913 (1993) y se ligaron en el punto de Sma I de
Bluescript KSII^{-} (Stratagene, La Jolla, CA). Se secuenciaron
múltiples clones mediante el método de terminación de cadena
didesoxi usando el kit de T7 Polimerasa Sequenase^{TM} (U.S.
Biochemical, Cleveland, OH).
Debido a la potencial tasa de error inherente en
PCR, se realizaron al menos tres reacciones diferentes. Las
secuencias más habitualmente observadas para genes de V_{L} y
V_{H} de LO-CD2a se muestran en las figuras 29 y
30, donde la figura 29 muestra las secuencias de nucleótidos y
aminoácidos de la cadena V_{L} de LO-CD2a
incluyendo la secuencia líder nativa. La figura 30 muestra las
secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la cadena V_{H} de
LO-CD2a incluyendo la secuencia líder nativa.
Como se muestra en la figura 29, la secuencia
líder es desde los restos de aminoácidos -20 a -1. El marco 1 es
desde los restos de aminoácidos 1 a 23. La CDR1 es desde los restos
de aminoácidos 24 a 39. El marco 2 es desde los restos de
aminoácidos 40 a 54. La CDR2 es desde los restos de aminoácidos 55 a
61. El marco 3 es desde los restos de aminoácidos 62 a 93. La CDR3
es desde los restos de aminoácidos 94 a 102. El marco 4 es desde
los restos de aminoácidos 103 a 112.
Como se muestra en la figura 30, la secuencia
líder es desde los restos de aminoácidos -19 a -1. El marco 1 es
desde los restos de aminoácidos 1 a 30. La CDR1 es desde los restos
de aminoácidos 31 a 35. El marco 2 es desde los restos de
aminoácidos 36 a 49. La CDR2 es desde los restos de aminoácidos 50 a
66. El marco 3 es desde los restos de aminoácidos 67 a 98. La CDR3
es desde los restos de aminoácidos 99 a 107. El marco 4 es desde
los restos de aminoácidos 108 a 118.
Se autorizaron dos vectores por parte del
Medical Research Council (MRC) en Londres para la expresión de
cadenas ligeras y pesadas quiméricas de LO-CD2a
respectivamente. El vector de cadena ligera de 9,2 Kb
(hcmv-vllys-kr-neo)
contiene el clon genómico de la región constante kappa humana y el
dominio V_{L} humanizado de anti-lisozima como
fragmento Hind III-Bam HI. El vector de cadena
pesada de 8,6 Kb
(hcmv-VhLys-gammal-neo)
contiene el clon genómico de la región constante \gamma1 humana y
el dominio V_{H} humanizado de anti-lisozima como
fragmento Hind III-Bam HI. Los vectores se
describen más completamente en Maeda et al., Hum. Antibod.
Hybridomas 2: 124-134, (1991).
Puesto que fragmentos de ADN que contienen los
péptidos señal nativos no estaban disponibles, las regiones V de
LO-CD2a se clonaron tras las señales ya presentes en
los vectores del MRC. La región V de cadena ligera con fragmento
señal se construyó a partir de dos fragmentos, cada uno obtenido de
una reacción de PCR diferente de la siguiente manera:
Reacción 1: La plantilla de ADN era el
vector de cadena ligera del MRC. El fragmento amplificado contenía
el péptido señal más una porción del marco (FR)1. Los dos
oligonucleótidos usados eran:
El cebador antisentido contenía la secuencia de
FR 1 de LO-CD2a, no la descubierta en el vector del
MRC para anti-lisozima.
La reacción de PCR producía un fragmento Hind
III-Tth III de 0,15 Kb.
Reacción 2: La plantilla de ADN era el
clon de V_{L} de LO-CD2a en Bluescript. El
fragmento amplificado incluía el FR 1 de LO-CD2a (a
partir del punto ThT III) hasta el extremo del FR 4. La región 3' no
traducida descubierta en el vector de cadena ligera del MRC se
añadía al extremo 3' de LO-CD2a usando el
oligonucleótido antisentido. Los dos oligonucleótidos usados eran:
5'V_{L} LO-CD2a (sentido):
Esta reacción producía un fragmento
TthIII-Bam HI de 0,35 Kb. Ambos productos de PCR se
purificaron en gel usando Qiaex y se restringieron con las enzimas
apropiadas. El fragmento Hind III-Tth III más el
fragmento Tth III-Bam HI se ligaron a continuación
entre los puntos Hind III y Bam HI de Bluescript en un ligamiento
de tres puntos. Esta construcción que contiene toda la región
V_{L} de LO-CD2a más el péptido señal del MLC se
secuenció a continuación.
La construcción de región V de
LO-CD2a de cadena pesada contienen la secuencia
señal del MRC en su extremo 5' y la región no traducida larga 3',
también obtenida del vector de cadena H del MRC. La construcción
final se realizó a partir de 3 reacciones de PCR diferentes de la
siguiente manera:
Reacción 1: la plantilla de ADN era el
vector de cadena H del MRC. Puesto que los genes de V_{L} y
V_{H} de anti-lisozima usan la misma señal, el
cebador sentido era el mismo que el usado para la construcción
V_{L} de LO-CD2a, es decir 5' V_{L}
lyssig. El cebador antisentido era 3' V_{H} lyssig:
La reacción producía un fragmento Hind
III-Pst I de 0,16 Kb que contenía la señal del MRC
más una porción del FR 1 de LO-CD2a. El fragmento
se purificaba en gel, se restringía y se ligaba en Bluescript
cortado con Hind III-Pst I para secuenciación.
Reacción 2: la plantilla de ADN era la
región V_{H} de LO-CD2a en Bluescript. Esta
reacción producía un fragmento Pst I-Sty I de 0,3
Kb que contenía la mayor parte de la región V_{H}. Puesto que
había un punto Pst I interno en el FR 3 de LO-CD2a,
el fragmento Pst I-Sty I debía construirse a partir
de 2 reacciones de PCR de la siguiente manera:
La plantilla de ADN mostrada anteriormente es el
clon 82-8, V_{H} de LO-CD2a en
Bluescript.
Reacción A: Produce un fragmento de 0,2
Kb, usando oligonucleótidos, también denominados oligos 1 y 2, como
cebadores:
El oligo 2 es: 3'int. Pst I
(antisentido): 5'CGATGTATCAGCTGTCAGTGTGGC3'
Reacción B: produce un fragmento de 0,1
Kb, usando los oligos 3 y 4 como cebadores. El oligo 3 es 5'int.
Pst I (sentido): 5'GCCACACTGACAGCTGATACATCG3'
Los oligos 2 y 3 anteriores contienen cambios en
la secuencia de nucleótidos que eliminan el punto Pst I interno sin
cambiar la secuencia de aminoácidos de LO-CD2a. Se
combinaron alícuotas (2-5 \mul) de los productos
solapantes de las reacciones A y B anteriores y sirvieron como
plantillas para una tercera reacción de PCR. Los cebadores de
oligonucleótidos para esta reacción eran los números 1 y 4 del
diagrama anterior. El producto de 0,3 Kb se purificó en gel
mediante Qiaex y se restringió con Pst I y Sty I. Puesto que el
fragmento permanecía intacto, el punto Pst I interno había mutado
con éxito.
Reacción 3: el fragmento de V_{H} final
se produjo usando el vector de cadena pesada del MRC como plantilla.
Este fragmento Sty I-Bam HI de 0,23 Kb contenía una
porción del FR4 de LO-CD2a y toda la región 3' no
traducida del vector del MRC. Los cebadores usados eran:
El fragmento resultante se purificó con gel y se
restringió con Sty I y Bam HI. A continuación, los fragmentos Pst
I-Sty I y Sty I-Bam HI se ligaron en
Bluescript cortado con Pst I-Bam HI para
secuenciación.
Todos los oligonucleótidos se sintetizaron en un
sintetizador de Applied Biosystems. Todas las reacciones de
secuenciación se realizaron usando el Kit de T7 polimerasa
Sequenase^{TM} (U.S. Biochemical, Cleveland, OH). Todas las PCR
se realizaron usando el siguiente protocolo: 5 minutos a 95ºC, 35
ciclos que constaban de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 50ºC, 2 minutos
a 72ºC, una extensión final de 5 minutos a 72ºC.
Fragmentos V_{L} y V_{H} de
LO-CD2a que contenían las secuencias correctas se
extrajeron de Bluescript y se clonaron entre los puntos Hind III y
Bam HI de los vectores de cadena ligera y pesada del MRC,
respectivamente. Para la cadena H, el fragmento 5' Hind
III-Pst I se unía en primer lugar con el resto de la
construcción (PstI-Bam HI) en Bluescript; a
continuación se clonaba todo el fragmento Hind
III-Bam HI en el vector del MRC.
Se realizó el análisis
N-terminal de secuencias de aminoácidos por el
Harvard Microchemistry Laboratory en Cambridge, MA en muestras de
cadenas pesadas y ligeras de LO-CD2a para confirmar
las secuencias obtenidas usando ARN-PCR. Las
muestras se prepararon de la siguiente manera:
200 \mug de LO-CD2a se
aplicaron en un gel de SDS poliacrilamida al 12% corrido en
presencia de B-mercaptoetanol. Después de la
electroforesis, la proteína se transfirió a una membrana de PVDF
usando un aparato de transferencia de Western. La membrana se tiñó
brevemente con Ponceau S, se destiñó en ácido acético al 1% y las
bandas de cadena ligera y pesada se secaron al vacío y se enviaron
para su análisis de aminoácidos y secuenciación
N-terminal.
La secuencia de aminoácidos de los primeros 20
restos de V_{H} de LO-CD2a concordaba
completamente con la secuencia clonada; sin embargo, la secuencia
de V_{L} indicaba que los restos 2, 3 y 7 en el FR1 eran
diferentes de los codificados por los genes clonados. Estas
diferencias residen todas en el cebador de PCR usado para fines de
clonación, en base a una mejor secuencia inferida obtenida de la
bibliografía mencionada anteriormente.
Para corregir esta secuencia y simultáneamente
clonar los péptidos señal nativos de V_{L} y V_{H} de
LO-CD2a, se empleó RACE-PCR
(Amplificación Rápida de Extremos de ADNc): ARNm de células de
LO-CD2a se transcribió de forma inversa y al ADNc
resultante se le añadió una cola de G en su extremo 3' usando
transferasa terminal en presencia de dGTP. El ADNc se amplificó a
continuación usando un oligonucleótido 3' específico y un
oligonucleótido 5' complementario a la cola de G. Para simplificar
la subclonación, se añadió un punto de restricción adecuado al
extremo 5' de cada oligonucleótido.
Los oligonucleótidos usados para la preparación
de ADNc eran los siguientes:
Los oligonucleótidos para
RACE-PCR eran los siguientes:
Las reacciones de RACE-PCR se
realizaron usando el siguiente protocolo: 5 minutos a 94ºC, 40
ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 50ºC y 50 segundos a
72ºC, seguido de una extensión de 5 minutos a 72ºC.
Los productos de PCR obtenidos para V_{L} y
V_{H} de LO-CD2a se extrajeron en gel usando
Qiaex. El fragmento V_{H} se restringió con Xho I y Stu I y se
ligo en Bluescript cortado con Xho I-Sma I. El
fragmento V_{L} se arromó en los extremos y se ligó en Bluescript
cortado con Sma I. Varios clones se secuenciaron para las regiones
V de cadena ligera y pesada y se identificaron las secuencias
señal.
Puesto que las secuencias señal descubiertas en
genes de inmunoglobulina generalmente tienen intrones, éstas puede
ser importantes para la expresión. También se identificaron clones
genómicos que contienen las secuencias líder de V_{L} y V_{H}.
El ADN genómico se preparó de la siguiente manera: 4 x 10^{7}
células de LO-CD2a se centrifugaron, se lavaron en
PBS fría, se centrifugaron y se lavaron de nuevo con PBS. Las
células se resuspendieron en 0,4 ml de tampón de digestión (con
proteinasa K recién añadida). Esta mezcla se incubó con agitación a
50ºC durante 12-15 horas, se extrajo con un volumen
igual de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y se centrifugó a 1700
x g. La fase acuosa se transfirió a un tubo limpio y se añadieron ½
volumen de acetato de amonio 7,5 M y 2 volúmenes de etanol al 95%.
El ADN se sedimentó centrifugando 2 minutos, 1700 x g. El sedimento
se lavó con etanol al 70% y se secó al aire. El sedimento se
resuspendió en 80 ml de TE, pH 8,0.
Usando ADN genómico obtenido de la línea celular
LO-CD2a como plantilla, se designaron los siguientes
oligonucleótidos para amplificar Las secuencias líder genómicas de
V_{L} y V_{H} así como porciones de las regiones marco que
terminan en puntos de restricción únicos (Sph I para V_{L}, Pst
para V_{H}).
LVL Nº 430
TGCAAGCTTCATGATGAGTCCTGTCCAGTC
Líder de V_{L} sentido/Hind III
LVH Nº 429
AGTAAGCTTCATGAAATGCAGGTGGATC
Líder de V_{H} sentido/Hind III
PVHA Nº 428 GGGAGATTGCTGCAGCTGGACTTC
V_{H} antisentido/Pst I
\vskip1.000000\baselineskip
Las reacciones de PCR se realizaron de la
siguiente manera: 100 ng de ADN genómico de células
LO-CD2a, 200 pmoles de cada uno de los oligos LVL y
BKA (para el fragmento V_{L}) o 200 pmoles de cada uno de LVH y
PVHA (para el fragmento V_{H}), 10 \mul de dNTP 1 mm, 10 \mul
de tampón 10 x Pfu, 1 \mul (2,5 unidades) de Pfu ADN polimerasa
(Stratagene, LA Jolla, CA) agua desionizada hasta 100 \mul. Se usó
Pfu debido a su mayor precisión que Taq polimerasa.
Las condiciones de la reacción eran las
siguientes: 5 minutos a 94ºC, 5 minutos a 50ºC, 35 ciclos de 1
minuto a 94ºC, 1 minuto a 50ºC, 1 minuto a 72ºC, seguido de 5
minutos a 72ºC. Los productos de PCR se purificaron en gel, se
restringieron y se ligaron en Bluescript para secuenciación. Una vez
identificados los clones que contenían la secuencia correcta, se
cortaron vectores Bluescript que contenían estos clones con Hind III
y Sph I (V_{L}) o Hind III y Pst I (V_{H}) y los fragmentos se
aislaron en gel. El fragmento Hind III-Sph I de
0,75 Kb se ligó a continuación en Bluescript que contenía la
construcción de V_{L} de LO-CD2a original de la
que el fragmento Hind III-Sph I se había eliminado.
La nueva construcción contenía la señal de LO-CD2a
nativa más intrón y una secuencia de FR1 corregida (en concordancia
con la secuencia N-terminal). El fragmento Hind
III-Pst I de 0,16 Kb se ligó en Bluescript que
contenía la construcción de V_{H} de LO-CD2a
original de la que el fragmento Hind III-Pst I se
había eliminado. La nueva construcción contenía la señal nativa +
intrón. Los fragmentos V_{L} y V_{H} recién construidos se
retiraron a continuación de Bluescript mediante digestión con Hind
III y Bam HI y se clonaron en los vectores de cadena ligera y pesada
del MRC, respectivamente, para su expresión en células COS.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron células COS 7 de la ATCC (Nº de
acceso CRL-1651) y se cultivaron en Medio Mínimo
Esencial de Dulbecco (DMEM) con suero fetal bovino (FBS) al 10%. La
transfección óptima se alcanzó a aproximadamente el 50% de
confluencia de células adherentes. En la preparación para la
transfección, se añadió ADN del plásmido a DMEM que contenía Suero
Nu y DEAE dextrano/bifosfato de cloroquina. Se retiró el medio de
células COS, se añadió la mezcla de ADN y las células se incubaron
durante 3 horas a 37ºC. Este medio se retiró a continuación y se
añadió DMSO al 10% en PBS a las células durante 2 minutos y después
se retiró. Se añadió DMEM con FBS al 10% a las células. Después de
incubación durante una noche, el medio se sustituyó y las células
se incubaron durante 2 días a 37ºC. Los sobrenadantes se recogieron
para ensayar mediante ELISA la secreción de anticuerpo
quimérico.
\vskip1.000000\baselineskip
La secreción de anticuerpo quimérico se confirmó
mediante ensayo de sobrenadantes de células COS transfectadas en un
ELISA diseñado para detectar la presencia de anticuerpo humano (o
una porción del mismo). Se diluyó IgG de cabra
anti-humana (H+L) en solución salina tamponada con
fosfato (PBS) a una concentración de 5 \mug/ml y se unió a los
pocillos de placas de microvaloración de ELISA mediante incubación
durante una noche a 4ºC. Las placas se lavaron 3 veces usando un
lavador de placas de ELISA.
Los restantes puntos libres se bloquearon
mediante la adición de 200 \mul de PBS que contenía el 1% de
albúmina de suero bovino (PBS-BSA) durante ½ hora a
temperatura ambiente. Se prepararon diluciones de dos veces en
PBS-BSA de los sobrenadantes y de un patrón de
referencia de control positivo (IgGIk humana purificada). Los
medios en solitario y/o PBS-BSA en solitario
constituían controles negativos. Se añadieron diluciones de
anticuerpo y controles a los pocillos y se incubaron a temperatura
ambiente durante ½ hora. A continuación, se lavaron las placas 3
veces con un lavador de placas en PBS que contenía Tween20 al 0,05%.
La dilución apropiada de un anticuerpo conjugado IgG de cabra
anti-humana (específica de cadena
gamma)-peroxidasa de rábano rusticano (HRP) o
anticuerpo conjugado de cadena ligera kappa anti
humana-HRP se añadió a cada pocillo y se incubó a
temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron con
PBS-Tween20 como se ha descrito anteriormente,
después de lo cual se añadió el sustrato de revelado (ABTS) que
contenía peróxido de hidrógeno. El anticuerpo unido se detecto
leyendo la absorbancia a una longitud de onda de 405 nm.
La especificidad de unión del anticuerpo
quimérico se evaluó mediante análisis de citometría de flujo de la
unión del anticuerpo a la línea celular de Jurkat mutante que
expresa CD2, JRT3-T3-5. El perfil de
unión del anticuerpo quimérico (IgG1 humana) se comparó con los del
anticuerpo de rata nativo (IgG2b) y los Mab de control emparejado
con isotipo (IgG1 humana e IgG2b de rata) que muestran
especificidades de unión irrelevantes (no por CD2).
Preparación de la línea celular
JRT3-T3-5 (Jurkat). La línea
celular Jurkat se obtuvo de la ATTC (Nº de acceso
TIB-153) y se propagó en DMEM que contenía suero
fetal bovino al 10% (FBS), suplemento de aminoácido al 10% (NCTC) y
L-glutamina 6 mM (medio completo). Las células se
mantuvieron a 37ºC con CO_{2} al 10% y se pasaron tres veces por
semana a una proporción de 1:4 (siendo la concentración celular en
el pase de aproximadamente 3 x 10^{6}/ml). Las células Jurkat se
recogieron, se centrifugaron para retirar el medio agotado y se
lavaron en DMEM. Las células se resuspendieron a continuación en
solución salina tamponada con fosfato (PBS) con azida sódica (NaAz)
al 0,1% y se extrajo una alícuota para cuantificación celular. El
número de células viables se determinó mediante exclusión con azul
de tripano.
Tinción indirecta de células Jurkat. La
tinción de la superficie celular se realizó en una placa de
microvaloración de fondo en forma de U de 96 pocillos.
Aproximadamente 6 x 10^{5} células en un volumen de 90 \mul se
distribuyeron en cada pocillo de la placa de microvaloración. Se
prepararon diluciones de los anticuerpos a ensayar en PBS con NaAz
al 0,1% y se distribuyeron en los pocillos apropiados en un volumen
de 10 \mul. Las células se incubaron con anticuerpo durante 15
minutos a temperatura ambiente, después de lo cual las células se
lavaron 3 veces añadiendo PBS con NaAz al 0,1% a cada pocillo y
centrifugando durante 2 minutos a 1900 rpm (Sorvall RT6000D). La
resuspensión de las células se consiguió golpeando suavemente las
placas. Se añadieron alícuotas de diez \mul del anticuerpo
secundario (Ig anti-humana o Ig
anti-rata) conjugado a isotiocianato de
fluoresceína (FITC) apropiado, a los pocillos apropiados y se
incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos en la
oscuridad. Las placas se lavaron 3 veces en PBS con NaAz al 0,1%
como se ha descrito anteriormente. Las células teñidas se fijaron
mediante la adición de 200 \mul de paraformaldehído al 0,5% en
PBS y se almacenaron a 4ºC (hasta 1 semana).
Análisis citométrico de flujo de células
Jurkat teñidas. Las células teñidas se transfirieron a tubos de
poliestireno de 12 x 17 mm para la adquisición de datos usando un
FACScan de Becton Dickinson. La adquisición de datos y el análisis
se realizaron usando software LYSIS II. Las células Jurkat que
expresaban CD2 se incubaron con el MAB LO-CD2a
(IgG2b de rata), la versión quimérica de LO-CD2a
(IgG1 humana) y los controles emparejados con isotipos
correspondientes. El anticuerpo unido se detectó usando el
anticuerpo secundario conjugado a FITC apropiado de acuerdo con el
protocolo descrito anteriormente. El análisis muestra patrones de
unión similares del LO-CD2a de rata nativo y el
LO-CD2a quimérico humano-rata.
Para expresar el anticuerpo quimérico en un
transfectante estable, se obtuvo el sistema de amplificación génica
de glutamina sintetasa de Celltech Limited (Berkshire, UK). Este
sistema se describe en Bebbington, et al., Biotechnology,
Vol. 10, págs. 169-175 (1992). Los vectores de
expresión usados eran pEE6hCMV-B y pEE12. Dichos
vectores se describen las solicitudes PCT publicadas Nº WO86/05807,
WO87/04462, WO89/01036 y WO89/10404. Puesto que ninguno de estos
vectores contiene C kappa o C gamma 1, los clones genómicos de estos
genes se obtuvieron de los vectores de cadena ligera y pesada del
MRC, respectivamente. Ambos clones de región constante se
secuenciaron para obtener mapas de restricción. Se realizaron dos
construcciones en pEE12: la primera contenía la cadena ligera (V+C)
en posición 5' respecto a la cadena pesada (V+C); la segunda
construcción contenía la cadena pesada en posición 5' con respecto
a la cadena ligera.
\vskip1.000000\baselineskip
La estrategia que implicaba a la cadena ligera
era la siguiente:
- 1.
- pEE6hCMV-B y pEE12 se digirieron cada uno con Xma I y Ecor RI.
- 2.
- La porción 5' de 1,93 Kb se la cadena ligera quimérica se retiró del vector del MRC usando Hind III y Ecor RI. Este fragmento se usó como plantilla para mutagénesis por PCR de la siguiente manera:
- Oligos de PCR
- LC 5' Xma I:
- 5'-GATCCCCGGGCCACCATGATGAGTCCTGTCCAG-3'
- LC 3' Msc 1:
-
1000
- Los puntos de restricción están subrayados.
- La PCR se realizó para cambiar el punto de restricción 5' de Hind III a Xma I y para añadir una secuencia consenso de Kozak en el extremo 5' de la construcción. Esto es esencial para una traducción eficaz (Kozak, M. J. Cell. Biol. 108: 229, 1989). El oligo de PCR 3' se usa para retirar puntos de Bam HI y Eco RI internos que podrían impedir posteriores etapas de clonación. El producto final de la mutagénesis por PCR es un fragmento Xma I-Msc I de 0,85 Kb. Las PCR se realizaron siguiendo las instrucciones suministradas en el kit de clonación TA (invitrogen, Dan Diego, CA). Se usaron las siguientes condiciones para la PCR: 2 minutos a 94ºC seguidos de 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 2 minutos a 55ºC y 2 minutos a 72ºC. A esto le seguía una extensión de 5 minutos a 72ºC. Los ligamientos y las transformaciones se realizaron de acuerdo con las instrucciones del kit. Se secuenciaron varios clones mediante el método de terminación de cadena didesoxi, como se ha descrito anteriormente. Un clon correcto se retiró del vector de clonación TA mediante digestión con Xma I y Msc I. Este fragmento se purificó en gel usando Qiaex.
- 3.
- El fragmento C kappa de 2,7 Kb se retiró del vector del MRC mediante digestión con Msc I y Eco RI. El fragmento se purificó en gel usando Qiaex.
Usando dos ligamientos de tres puntos
diferentes, toda la cadena ligera quimérica, es decir fragmento Xma
I/Msc I de 0,85 Kb + fragmento Msc I/Eco RI de 2,7 Kb se ligó en
pEE6hCMV-B y pEE12, cada uno de los cuales se cortó
con Xma I/Eco RI.
La estrategia que implicaba a la cadena pesada
era la siguiente:
- 1.
- pEE6hCMV-B y pEE12 se transfectaron en la cepa DM1 de E. coli. Ambos vectores se digirieron con Eco RI y Bell (BCII solamente cortará si los plásmido se propagan en bacterias metilasa negativas).
- 2.
- La cadena pesada quimérica se retiró del vector del MRC mediante digestión con Hind III y Eco RI. El fragmento de 2,7 Kb resultante se purificó en gel usando Qiaex. Este fragmento se digirió con Nhe I y BgI II. Esto produce un fragmento HindIII/Nhe I de 0,7 Kb y un fragmento Nhe I/BgI II de 2 Kb. Ambos fragmentos se purificaron en gel. El fragmento de 0,7 Kb se usó a continuación como plantilla para mutagénesis por PCR.
- Oligos de PCR
- HC 5' Eco RI:
- 5'-GATCGAATTCGCCACCATGAAATGCAGGTGGATC-3'
- HC 3' Nhe I:
- 5'-CCAGAAAGCTAGCTTGCCATCCCTATAAATCTCTGGC-3'
Los puntos de restricción están subrayados.
Esta PCR se realiza para cambiar el punto de
restricción 5' de Hind III a Eco RI y para añadir una secuencia
consenso de Kozak. El oligo 3' se usa para retirar un punto Bam HI
interno que impediría posteriores etapas de clonación. Las PCR,
ligamientos y transformaciones se realizaron como se ha descrito
anteriormente.
Usando dos ligamientos de tres puntos
diferentes, toda la cadena pesada quimérica, es decir fragmento Eco
RI/Nhe I de 0,7 Kb + fragmento Nhe I/BgI II de 2,0 Kb se ligó en
pEE6hCMV-B y pEE12, cada uno de los cuales se cortó
con Eco RI/ Bcl I.
(BcI I y BgI II son puntos de restricción
compatibles)
La construcción final en pEE12, que contenía las
cadenas ligera y pesada quiméricas era de la siguiente manera:
Cadena ligera en posición 5' con respecto a
la cadena pesada: pEE6hCMV-B, que porta la
cadena pesada quimérica, se digirió con Bgl I/Bam HI. El fragmento
de 5,1 Kb que contenía la cadena pesada más el promotor hCMV, se
purificó en gel y se ligó en el punto Bam HI de pEE12 que contiene
la cadena ligera quimérica. La orientación correcta se comprobó
mediante digestión con SaI I/Bam HI. La presencia de un fragmento de
0,28 Kb indica orientación correcta.
Cadena pesada en posición 5' con respecto a
la cadena ligera: pEE6hCMV-B, que porta la
cadena ligera quimérica, se digirió con Bgl I/Bam HI. El fragmento
de 5,9 Kb que contenía la cadena ligera más el promotor hCMV, se
purificó en gel y se ligó en el punto Bam HI de pEE12 que contiene
la cadena pesada quimérica. La orientación correcta se comprobó
mediante digestión con SaI I/Bam HI, como se ha indicado
anteriormente.
Células NS/O (Galfre, et al., Meth. In
Enzymol., Vol. 73(B) pág. 3-46 (1981) y
depositadas en la European Collection of Animal Cell
Cultures como Nº de Catálogo ECACC 85110503, se transfectaron
mediante electroporación. Las células transfectadas se
seleccionaron mediante cultivo en medio libre de glutamina. La
producción de anticuerpos y la actividad de unión en células Jurkat
que expresan CD2 se confirmaron como se ha descrito
anteriormente.
El análisis funcional del anticuerpo quimérico
humano-rata muestra que sus propiedades funcionales
son similares a las del anticuerpo LO-CD2a de rata.
Ambos inhiben una reacción de leucocitos mezclados primaria (MLR)
cuando se añaden cantidades de nanogramos de anticuerpo hasta 120
ng/ml al cultivo. Además, la adición del anticuerpo quimérico a una
MLR primaria induce un estado de hipersensibilidad en la población
que responde a la estimulación con el aloantígeno original o con un
aloantígeno de una tercera parte. La hipersensibilidad es específica
de aloantígeno ya que la estimulación con mitógeno o toxoide del
tétanos desencadena una respuesta proliferativa.
\vskip1.000000\baselineskip
Las regiones marco de un gen V kappa humano
denominado HUM5400 (acceso EMBL X55400), que comparte homología con
LO-CD2a, se seleccionaron para la humanización de la
región V de cadena ligera. A continuación, se proporciona una
comparación entre los marcos de LO-CD2a y
HUM5400:
Marco 1
\vskip1.000000\baselineskip
Marco 2
\vskip1.000000\baselineskip
Marco 3
\vskip1.000000\baselineskip
Marco 4
Una comparación de las secuencias de región
variable de cadena ligera del LO-CD2a de rata, la
región variable humana homóloga, HUM5400 y LO-CD2a
humanizado se muestra en la figura 31. Se proporciona la secuencia
de aminoácidos completa para la región variable de
LO-CD2a y los restos se numeran de acuerdo con la
secuencia de rata. Los restos idénticos a los de la rata en
posiciones correspondientes en las secuencias humanizada y HUM5400
se indican mediante líneas discontinuas horizontales, mientras que
los restos no idénticos se dan mediante el código de una letra. La
región variable de cadena ligera de LO-CD2a
humanizado consta de las regiones marco de HUM5400, las CDR de
LO-CD2a de rata (subrayadas) y siete restos marco de
LO-CD2a de rata (designados mediante un * sobre la
secuencia de rata) que se seleccionaron debido a que dichos restos
pueden ser relevantes para el mantenimiento de la especificidad de
unión de LO-CD2a.
Como se muestra en la figura 31, el marco 1 va
desde los restos aminoácidos 1 a 23. La CDR1 va desde los restos de
aminoácidos 24 a 29. El marco 2 va desde los restos de aminoácidos
40 a 54. La CDR2 va desde los restos de aminoácidos 55 a 61. El
marco 3 va desde los restos de aminoácidos 62 a 93. La CDR3 va desde
los restos de aminoácidos 94 a 102. El marco 4 va desde los restos
de aminoácidos 103 a 112. La secuencia líder va desde los restos de
aminoácidos -20 a -1 (figura 32). Los restos de aminoácidos de rata
que se conservan en las regiones marco son los restos de
aminoácidos 9 y 12 en el marco 1; restos de aminoácidos 41, 42, 50 y
51 en el marco 2; y resto de aminoácido 82 en el marco 3.
Se construyó una cadena ligera humanizada que
contiene las CDR de LO-CD2a y los marcos de región
variable de HUM5400 excepto 7 restos poco habituales (*) que se
conservaron de los marcos de LO-CD2a. La región 5'
se tomó de la construcción de cadena ligera quimérica. Este
fragmento Hind III/Hph I de 0,43 Kb contiene la señal nativa más
intrón y la secuencia que codifica los tres primeros restos de
aminoácidos del marco 1 que son idénticos en los marcos de rata y
humanos. El resto (es decir, el extremo 3) de la construcción (0,37
Kb), que contiene los nucleótidos que codifican todos excepto los
tres primeros aminoácidos de la región variable, se sintetizó
mediante PCR a partir de 7 oligonucleótidos solapantes, cuyo tamaño
variaba entre 63-81 nucleótidos. Estos largos
oligonucleótidos servían como plantillas para oligonucleótidos de
PCR más cortos (21-26 nucleótidos de longitud) con
el extremo 3' y 5' externo. En todos los casos, se usaron 5 pmoles
de plantilla junto con 100 pmoles de cada oligonucleótido de PCR
externo. Todas las PCR se realizaron usando Pfu polimerasa para
conseguir una mayor fidelidad. El procedimiento era el siguiente: 5
minutos a 95ºC, seguido de 25 ciclos que incluían 2 minutos a 94ºC,
2 minutos a 55ºC y 2 minutos a 72ºC. A esto le seguía una extensión
adicional de 5 minutos a 72ºC. Toda la síntesis se realizaba en 4
etapas. En la primera etapa, el primer oligonucleótido largo se
añadía al fragmento Hind III-Hph I de 0,43 Kb. Los
siguientes 3 conjuntos de oligonucleótidos solapantes se añadieron
después secuencialmente usando PCR. Una vez que la síntesis de toda
la construcción de 0,8 Kb estaba completa, ésta se purificaba en
gel usando Qiaex, se restringía con Hind III y Bam HI, se purificaba
en gel de nuevo con Qiaex y se ligaba a Bluescript KS II cortado
con Hind III/Bam HI. Se secuenciaron varios clones hasta que se
obtuvo una versión correcta. El clon se retiró a continuación de la
digestión de Bluescript con Hind III y Bam HI. El fragmento
resultante se purificó en gel usando Qiaex y se ligó en el vector de
cadena ligera del MRC que se había cortado con Hind III/Bam HI. Las
secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región V de cadena
ligera de LO-CD2a humanizado se muestran en la
figura 32.
A continuación se proporcionan los nucleótidos
solapantes usados en la síntesis de la cadena ligera humanizada y
una descripción de su uso:
Oligonucleótido Nº 1:
Oligonucleótido Nº 2:
Oligonucleótido Nº 3:
Oligonucleótido Nº 4:
Oligonucleótido Nº 5:
Oligonucleótido Nº 6:
Oligonucleótido Nº 7:
Los oligonucleótidos 1, 3, 5 y 7 son secuencias
complementarias inversas.
Los oligonucleótidos 2, 4 y 6 son secuencias de
cadena sentido.
\vskip1.000000\baselineskip
El oligonucleótido Nº 1 se solapa con el
fragmento Hind III/Hph I de 0,43 Kb obtenido de la construcción de
cadena ligera quimérica. Este oligonucleótido se añadió al fragmento
de 0,43 Kb mediante PCR, usando los siguientes oligos de PCR:
(5') PCR 1A (sentido):
5'GATCAAGCTTCATGATGAGTCCT3'
(3') PCR 1A (complemento inverso):
5'GCAAGAGATGGAAGCTGGTTG3'
\vskip1.000000\baselineskip
De manera similar, los oligonucleótidos Nº 2 y
Nº 3 se unieron mediante PCR usando los siguientes oligos de
PCR:
5' PCR 2B (sentido):
5'CAACCAGCTTCCATCTCTTGC3'
3' PCR 2B' (complemento inverso):
5'AGATTCCAGTTTGGATACCAA3'.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la PCR ambos productos se purificaron
en gel usando Qiaex y después se unieron usando una tercera PCR. La
tercera PCR requería los siguientes oligos:
(5') PCR 1A
(3') PCR 2B'.
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento resultante se purificó en gel
mediante Qiaex. Los oligonucleótidos Nº 4 y Nº 5 se unieron a
continuación mediante PCR usando los siguientes oligos:
(5') PCR 3C (sentido):
5'TTGGTATCCAAACTGGAATCTGGG3'
(3') PCR 3C' (complemento inverso):
5'ATGGGTAAATTGCATGCAGTAATA3'
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento se purificó en gel y se añadió a la
construcción anterior usando los oligos de PCR:
(5') PCR 1A
(3') PCR 3C'
\vskip1.000000\baselineskip
La pieza final se construyó usando los
oligonucleótidos Nº 6 y Nº 7 y los oligos de PCR:
(5') PCR 4D (sentido):
5'TACTGCATGCAATTTACCCATTAT3'
(3') PCR 4D' (complemento inverso):
5'GATCGGATCCAACTGAGGAAGCAAAG3'
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la purificación en gel, este
fragmento se añadió al resto de la construcción de cadena ligera
humanizada mediante PCR usando los oligos:
(5') PCR 1A
(3') PCR 4D'.
\vskip1.000000\baselineskip
Las regiones marco del clon del anticuerpo
humano Amu 5-3 (Número de acceso del Genbank U00562)
se usaron para la generación de la cadena pesada humanizada. A
continuación se proporciona una comparación entre los marcos de
LO-CD2a y los de Amu 5-3:
Marco 1
Marco 2
Marco 3
Marco 4
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 33 muestra las secuencias de la región
variable de cadena pesada del LO-CD2a de rata, la
región variable humana homóloga, Amu5-3 y el
LO-CD2a humanizado (Vh humanizada). Se proporciona
la secuencia de aminoácidos completa para LO-CD2a y
los restos de aminoácidos se numeran de acuerdo con la secuencia de
rata. Los restos idénticos a los de la rata en posiciones
correspondientes en las secuencias humanizada y
Amu5-3 se indican mediante líneas discontinuas
horizontales, mientras que los restos no idénticos se dan mediante
el código de una letra. La Vh de LO-CD2a humanizada
consta de las regiones marco de Amu5-3, las CDR de
LO-CD2a de rata y siete restos marco de
LO-CD2a de rata (designados mediante un * sobre el
resto de rata) que se seleccionaron porque pueden ser relevantes
para el mantenimiento de la especificidad de unión de
LO-CD2a. Las líneas verticales en la CDR3 de las
secuencias de rata y humanizada representan espacios que eran
necesarios para alinear las tres secuencias puesto que
Amu5-3 tiene una CDR3 más larga que las regiones de
rata y humanizada.
Como se muestra en la figura 33, el marco 1 va
desde los restos de aminoácidos 1 a 30. La CDR1 va desde los restos
de aminoácidos 31 a 35. El marco 2 va desde los restos de
aminoácidos 36 a 49. La CDR2 va desde los restos de aminoácidos 50
a 66. El marco 3 va desde los restos de aminoácidos 67 a 98. La CDR3
va desde los restos de aminoácidos 99 a 107. El marco 4 va desde
los restos de aminoácidos 108 a 118. La secuencia líder va desde
los restos de aminoácidos -19 a -1 (figura 34).
Los restos de aminoácidos de
LO-CD2a de rata que se conservan en las regiones
marco son el resto de aminoácido 47 en el marco 2; y los restos de
aminoácidos 67, 70, 72, 76, 85 y 87 en el marco 3.
Se realizó una única construcción de cadena
pesada humanizada. Esta construcción contienen las CDR de
LO-CD2a y los marcos de Amu 5-3,
con la excepción de 7 restos (*) conservados de
LO-CD2a. Esta construcción se produjo de manera
similar a la de la cadena ligera humanizada. En este caso, había 12
oligonucleótidos plantilla solapantes, cuyo tamaño variaba entre
69-88 nucleótidos. Los 12 oligonucleótidos de PCR
externos variaban en tamaño entre 21-26. La
síntesis se realizó en 6 etapas, añadiendo un par de
oligonucleótidos plantilla solapantes en cada etapa. La
construcción final (0,7 Kb) se purificó en gel usando Qiaex, se
digirió con Hind III y Bam HI, se purificó en gel de nuevo y se
ligó en Bluescript para la secuenciación, como se ha descrito
anteriormente. Cuando se identificaba un clon correcto, éste se
retiraba del Bluescript mediante restricción con Hind III/Bam HI y
a continuación se ligaba en el vector de cadena pesada del MRC que
se había digerido con las mismas enzimas. Las secuencias de
nucleótidos y aminoácidos de la región V de cadena pesada de
LO-CD2a humanizado se muestran en la figura 34.
A continuación se proporcionan los
oligonucleótidos solapantes usados en la síntesis de la cadena
pesada humanizada y una descripción de su uso:
Oligonucleótido Nº 1 (sentido):
Oligonucleótido Nº 2 (antisentido):
Oligonucleótido Nº 3 (sentido):
Oligonucleótido Nº 4 (antisentido):
Oligonucleótido Nº 5 (sentido):
Oligonucleótido Nº 6 (antisentido):
Oligonucleótido Nº 7 (sentido):
Oligonucleótido Nº 8 (antisentido):
Oligonucleótido Nº 9 (sentido):
Oligonucleótido Nº 10 (antisentido):
Oligonucleótido Nº 11 (sentido):
Oligonucleótido Nº 12 (antisentido):
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos solapantes Nº 1 y Nº 2 se
unieron mediante PCR usando los siguientes oligos de PCR:
(5') PCR 4H (sentido):
5'GATCAAGCTTCATGAAATGCAGGTG3'
(3') PCR 4H' (antisentido):
5'CACCTGTGAGTTGACCCCTGTTG3'
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento resultante se purificó en gel.
Los oligonucleótidos solapantes Nº 3 y Nº 4 se
unieron mediante PCR usando los siguientes oligos de PCR:
(5') PCR 1E (sentido):
5'ACAGGGGTCAACTCACAGGTG3'
(3') PCR 1E' (antisentido):
5'GGCCTGTCGCACCCAGTACAT3'
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento se purificó en gel.
Los oligonucleótidos Nº 5 y Nº 6 se unieron
mediante PCR usando los siguientes oligos de PCR:
(5') PCR 2F (sentido):
5'ATGTACTGGGTGCGACAGGCC3'
(3') PCR 2F' (antisentido):
5'TGTGCTAGAGGACGTGTCAGC3'.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la purificación en gel, este
fragmento se unió al fragmento producido por los oligonucleótidos
Nº 3 y Nº 4 mediante PCR con los siguientes oligos:
(5') PCR 1E (sentido)
(3') PCR 2F' (antisentido).
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento resultante se purificó en gel.
Los oligonucleótidos Nº 7 y Nº 8 se unieron
mediante PCR usando los siguientes oligos de PCR:
(5') PCR 3G (sentido):
5'GCTGACACGTCCTCTAGCACA3'
(3') PCR 3G' (antisentido):
5'GGACTCACCTGAGGACACGGT3'
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento resultante se purificó en gel y se
añadió a la construcción realizada uniendo los oligonucleótidos Nº
3 a Nº 6. Esto se realizó usando los oligos de PCR.
(5') PCR 1E (sentido)
(3') PCR 3G' (antisentido).
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento resultante, realizado uniendo los
oligonucleótidos Nº 3 a Nº 8, se purificó en gel. El extremo 5' de
la construcción (oligonucleótidos Nº 1 + Nº 2) se añadió después
usando los oligos de PCR.
(5') PCR 4H (sentido)
(3') PCR 3G'.
\vskip1.000000\baselineskip
Este fragmento se purificó en gel y la siguiente
pieza (3') se añadió usando los oligonucleótidos Nº 9 y Nº 10.
Los oligonucleótidos Nº 9 y Nº 10 se unieron
mediante PCR usando los siguientes oligos de PCR:
(5') PRC 5I (sentido):
5'ACCGTCTCCTCAGGTGAGTCC3'
(3') PCR 5I' (antisentido):
5'CCTAGTCCTTCATGACCTGAA3'.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la purificación en gel, esta pieza 3'
se añadió al resto de la construcción usando los oligos de PCR.
(5') PCR 4H (sentido)
(3') PCR 5I' (antisentido).
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento resultante se purificó en gel y se
unió al resto de la construcción.
Los oligonucleótidos Nº 11 y Nº 12 se unieron
mediante PCR usando los siguientes oligos de PCR:
(5') PRC 6J (sentido): 5'TTCAGGTCATGAACGACTAGG3'
y
(3') PCR 6J' (antisentido):
5'GATCGGATCCCTATAAATCTCTGGCC3'
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la purificación en gel, este
fragmento final 3' se añadió al resto de la construcción usando los
oligos (5') PCR4H (sentido) y (3') PCR6J' (antisentido). La
construcción final de 0,7 Kb resultante se purificó en gel y se
clonó en el vector de cadena pesada del MRC, como se ha indicado
anteriormente.
La expresión transitoria en células COS y la
detección de anticuerpo secretado se realizaron como se ha descrito
anteriormente para el anticuerpo quimérico. El anticuerpo humanizado
se purificó mediante cromatografía de afinidad (Proteína A). Los
estudios de unión en células Jurkat demuestran patrones de unión
similares entre las formas humanizada y de rata de
LO-CD2a (figura 35). La línea celular de Jurkat, que
expresa CD2, se tiñó con LO-CD2a de rata, el
LO-CD2a humanizado (LO-CD2aHu) o
controles de IgG2b de rata o IgG humana. La concentración de
anticuerpo variaba entre 0 y 4 \mug/ml. Las formas de rata y
humanizadas de LO-CD2a se unen a células Jurkat con
patrones de unión similares, mientras que los anticuerpos de control
de isotipo de rata y humano no. Los anticuerpos unidos se
detectaron con un antisuero conjugado a FITC específico de isotipo.
Los resultados mostrados en la figura 35 se expresan como el
porcentaje de células teñidas positivamente por los anticuerpos en
el intervalo de concentraciones mencionado anteriormente en este
documento. Estudios funcionales indican que el anticuerpo
humanizado también es capaz de inhibir una MLR primaria. Se
añadieron cantidades de nanogramos de LO-CD2a,
LO-CD2aHu, control de IgG2b de rata o control de
IgG1 humana a pocillos de cultivo que contenían cantidades
equivalentes de células mononucleares de la sangre periférica (PBMC)
de una llamada respondedora y estimuladora (células irradiadas).
Los pocillos de control no contenían anticuerpo. Los cultivos se
incubaron durante 5 días, después se pulsaron durante una noche con
timidina tritiada. (^{3}HT). La proliferación se detecta mediante
la captación de ^{3}HT. Los resultados, como se dan en la Tabla 2
a continuación se expresan como el CPM medio según se registra
mediante un lector de placas Beta.
El anticuerpo humanizado también induce un
estado hiposensible a la estimulación con aloantígeno en células T
(según se mide mediante la captación de ^{3}Ht como CPM medio)
cuando esas células se cultivan en una MLR primaria en presencia de
aloantígeno y LO-CD2a humanizado, pero no cuando un
control de isotipo (con especificidad irrelevante) se sustituye por
el anticuerpo humanizado (figura 36). Las propiedades funcionales
del anticuerpo humanizado son similares a las del
LO-CD2a de rata.
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinó la capacidad de las células T para
reconocer a un aloantígeno en una MLR secundaria después de la
adición de LO-CD2a solamente al cultivo primario.
Los cultivos de MLR primaria contenían células respondedoras y
células estimuladoras irradiadas en presencia de
LO-CD2a, anticuerpo de control
(LO-DNP11, Biotranplant, Inc., Charlestown, MA) o
sin anticuerpo y se incubaban durante 7 días. A continuación, las
células se lavaban y permanecían en medio en solitario durante 3
días adicionales. Después del periodo de reposo, los cultivos
celulares se estimularon de nuevo con las células estimuladoras
originales o células obtenidas de un donante diferente (células de
una "tercera parte").
Los resultados de un experimento representativo
de estos estudios se ilustran en la figura 37. En el panel A, se
observó una respuesta primaria cuando las células respondedoras se
cultivaban en presencia de anticuerpo de control a 200 ng/ml, pero
cuando las células se cultivaban en presencia de
LO-CD2a a 200 ng/ml, no se observó respuesta, lo
que es coherente con los datos presentados anteriormente. La
cinética de la respuesta se determinó recogiendo cultivos los días
3, 5 y 7. Los datos se presentaron como valores medios de pocillos
por triplicado realizados en cada punto temporal en el que el cpm
de los pocillos individuales estaba en el intervalo del 10% de la
media.
Como se representa en la figura 37B, las células
respondedoras de cultivos tratados con LO-CD2a o
anticuerpo de control se estimularon de nuevo con células
estimuladoras portadoras de aloantígeno a una proporción 1:1 sin
ningún anticuerpo presente en la MLR secundaria. La cinética de la
respuesta se determinó recogiendo cultivos los días 3, 5 y 7. La
respuesta de las células cultivadas en MLR primaria con
LO-CD2a o anticuerpo de control se incluía como
control. Los datos se presentan como valores medios de pocillos por
triplicado realizados en cada punto temporal en el que el cpm de
los pocillos individuales estaba en el intervalo del 10% de la
media. Los datos son del mismo experimento representado en la figura
37A.
Como se muestra en la figura 37C, las células
estimuladas en una MLR primaria con un aloantígeno específico en
presencia de LO-CD2a o anticuerpo de control se
estimularon a continuación con células portadoras de aloantígeno de
un donante de tercera parte a una proporción de 1:1 sin ningún
anticuerpo presente en el cultivo secundario. La cinética de la
respuesta se determinó recogiendo cultivos los días 3, 5 y 7. La
respuesta de las células a células estimuladoras autólogas
cultivadas en la MLR primaria con anticuerpo de control o
LO-CD2a se incluye como control. Los datos se
presentan como valores medios de pocillos por triplicado realizados
en cada punto temporal en el que el cpm de los pocillos
individuales estaba en el intervalo del 10% de la media. Los datos
son del mismo experimento representado en las figuras 37A y B.
Las células cultivadas en presencia de
anticuerpo de control en el cultivo primario eran sensibles a la
estimulación de nuevo por las mismas células estimuladoras
alogénicas que las del cultivo primario (panel B) y también eran
sensibles a la estimulación por células de una tercera parte (panel
C). Por el contrario, las células cultivadas en presencia de
LO-CD2a durante la MLR primaria no eran sensibles a
la estimulación de nuevo con las células estimuladoras alogénicas
primarias (panel B) ni con células estimuladoras de una tercera
parte (panel C). Las células en los cultivos que contenían
LO-CD2a eran viables y sensibles a estímulos
diferentes del aloantígeno. Por ejemplo, la estimulación mediante
PHA u OKT3 soluble provocaba respuestas proliferativas equivalentes
en células cultivadas con anticuerpo de control
LO-CD2a o con PBMC autólogas frescas (no se muestran
los datos). El análisis citométrico de flujo de estas células
después del reposo no consiguió detectar LO-CD2a en
la superficie celular (no se muestran los datos). Por lo tanto,
estos datos indican que la exposición a LO-CD2a y
aloantígeno puede inducir un estado de posterior hiposensibilidad al
aloantígeno, es decir tolerancia.
Para estudiar la aparente especificidad por
aloantígeno de la hiposensibilidad inducida por
LO-CD2a durante la estimulación con aloantígeno,
las células obtenidas de cultivos después de la estimulación con
aloantígeno se estimularon para responder al antígeno de proteína
soluble, toxoide del tétanos. Las respuestas al antígeno soluble
requieren la presencia de células que presentan antígeno viables
(APC), que se agotan en cultivos estimulados con aloantígeno
después de 7 días. Por lo tanto, en estos estudios, se proporcionó
una nueva fuente de APC a las células cultivadas añadiendo PBMC
irradiadas autólogas al cultivo de ensayo secundario. Como se
representa en la figura 38A, las células respondedoras de cultivos
tratados con LO-CD2a o anticuerpo de control se
estimularon de nuevo con células estimuladoras portadoras de
aloantígeno a una proporción de 1:1 sin ningún anticuerpo presente
en la MLR secundaria. La cinética de la respuesta se determinó
recogiendo cultivos los días 3, 5 y 7. La respuesta de las células
a células estimuladoras autólogas cultivadas en la MLR primaria con
LO-CD2a o anticuerpo de control también se incluye
como control. Los datos se presentan como valores medios de
pocillos por triplicado realizados en cada punto temporal en el que
el cpm de los pocillos individuales estaba en el intervalo del 10%
de la media.
Como se representa en la figura 38B, las células
respondedoras de cultivos tratados con LO-CD2a o
anticuerpo de control se estimularon de nuevo con 7,5 \mug/ml de
toxoide del tétanos sin ningún anticuerpo presente en cultivos
secundarios. La cinética de la respuesta se determinó recogiendo
cultivos los días 3, 5 y 7. La respuesta de células cultivadas en
cultivos primarios sin ningún anticuerpo y células estimuladoras
autólogas servía como control para la respuesta a toxoide del
tétanos.
Los resultados mostrados en las figuras 38A y B
demuestran que, aunque las células cultivadas con
LO-CD2a más aloantígeno en una MLR primaria eran
hiposensibles al aloantígeno en una MLR secundaria, las células eran
sensibles al toxoide del tétanos cuando era presentado por APC
recién añadidas.
\vskip1.000000\baselineskip
Para estudiar el papel de la porción Fc de
LO-CD2a, se realizaron estudios para comparar los
efectos funcionales del fragmento F(ab')_{2} con el
anticuerpo completo.
Como se muestra en la figura 39, se cultivaron
PBMC durante 6 días con línea celular B transformada con Virus
Epstein-Barr (EBV) a una proporción 2:1 de
respondedora con respecto a estimuladora a dosis en aumento de
LO-CD2a o su fragmento F(ab')_{2}. El
gráfico representa el efecto del fragmento F(ab')_{2} sobre
la respuesta de cuatro donantes diferentes y cada punto es un valor
medio de pocillos por triplicado realizados en cada punto de los
datos. Los resultados se presentan como un porcentaje de respuesta
de control. Por motivos de claridad en el gráfico, los datos de la
adición del anticuerpo LO-CD2a completo no se
muestran. A una dosis de 30 ng/ml de LO-CD2a
completo, las respuestas de los donantes eran: donante
1-18%; donante 2-6,6%; donante
3-3,7%; y donante 4-12% del control.
Las respuestas celulares sin anticuerpo presente de los individuos
ensayados tenían valores medios que variaban entre 56.690 y 404.843
cpm y el cpm de los pocillos individuales estaba en el intervalo
del 10% de la media.
Para evaluar adicionalmente las propiedades
inhibidoras potenciales del fragmento F(ab')_{2}, se añadió
una valoración de dosis del fragmento F(ab')_{2} a PBMC no
fraccionadas estimuladas con OKT3 soluble (una respuesta
dependiente de APC). Como se representa en la figura 40, las PBMC se
estimularon con OKT3 soluble (100 ng/ml) durante 3 días. El
anticuerpo intacto o el fragmento F(ab')_{2} de
LO-CD2a se añadió el día 0 a dosis en aumento. Los
resultados se expresan como porcentaje de la respuesta proliferativa
de las células a OKT3 en presencia de un anticuerpo monoclonal de
control emparejado con isotipo. Cada punto de los datos es una
media de pocillos por triplicado en los que el cpm de los pocillos
individuales estaba en el intervalo del 10% de la media. El cpm
medio para PBMC estimuladas sin anticuerpo era de 60.117.
Los resultados de la figura 40 muestran que la
proliferación de células T para OKT3 no se inhibía cuando se usaba
el fragmento F(ab')_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
Para estudiar la cuestión del papel de las APC
en las propiedades inhibidoras de LO-CD2a, la
población de células T de las PBMC se agotó en células positivas
para CD14, CD56, CD19 y HLA-DR mediante selección
inmunomagnética. El análisis mediante técnicas citométricas de
flujo de las células purificadas demostraba que la población de APC
estaba agotada en > 95% (no se muestran los datos). La
proliferación de estas células T purificadas para OKT3 soluble (una
respuesta dependiente de APC) se redujo a < 1% de la
proliferación de PBMC no fraccionadas mediante este agotamiento (no
se muestran los datos). Las células T purificadas o PBMC no
fraccionadas se estimularon mediante OKT3 unido a placas (un método
de estimulación de células T independiente de APC) en presencia o
en ausencia de LO-CD2a. La capacidad de
LO-CD2a para inhibir la activación de células T se
eliminaba cuando se retiraban APC (figura 41). Como se muestra en
la figura 41, PBMC o PBMC agotadas en APC mediante técnicas
inmunomagnéticas se colocaron en placas de 96 pocillos recubiertas
con OKT3 (10 \mug/ml) y se cultivaron durante 3 días. Se añadió
LO-CD2a al inicio de los cultivos. Los resultados se
expresan como un porcentaje de la respuesta proliferativa de las
células a OKT3 en presencia de un anticuerpo monoclonal de control
emparejado con isotipo. Los datos representados son representativos
de tres experimentos, donde cada punto de los datos es la media de
pocillos por triplicado en los que el cpm de los pocillos
individuales estaba en el intervalo del 10% de la media.
Claims (4)
1. Un anticuerpo humanizado que comprende:
- \quad
- regiones constantes humanas,
- \quad
- las CDR del anticuerpo LO-CD2a,
- \quad
- una región marco de cadena ligera obtenida de un anticuerpo humano, en la que los aminoácidos 9, 12, 41, 42, 50, 51 y 82 del marco de cadena ligera humano se sustituyen por los aminoácidos correspondientes del anticuerpo LO-CD2a como se muestra en la figura 31, y
- \quad
- una región marco de cadena pesada obtenida de un anticuerpo humano, en la que los aminoácidos 47, 67, 70, 72, 76, 85 y 87 del marco de cadena pesada humano se sustituyen por los aminoácidos correspondientes del anticuerpo LO-CD2a como se muestra en la figura 33,
donde el anticuerpo LO-CD2a es
producido por la línea celular depositada como ATCC HB11423,
donde dicho anticuerpo se une a un epítopo de un
antígeno CD2.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El anticuerpo humanizado de la reivindicación
1, en el que la región variable de cadena ligera tiene la secuencia
que se proporciona en la figura 31 y la región variable de cadena
pesada tiene la secuencia que se proporciona en la figura 33.
3. Uso del anticuerpo de acuerdo con las
reivindicaciones 1 ó 2, para la preparación de un medicamento para
inhibir una activación y una proliferación inicial o posterior de
células T en un paciente, en el que el medicamento comprende el
anticuerpo en una cantidad eficaz para inhibir la activación y la
proliferación inicial o posterior de células T, en el que el
medicamento es eficaz para tratar el rechazo del injerto.
4. Uso del anticuerpo de acuerdo con las
reivindicaciones 1 ó 2, para la preparación de un medicamento para
inhibir una respuesta inmune.
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