KR20050089799A - Ｃ형 간염 바이러스 감염의 치료에 있어 ＣｐＧ올리고뉴클레오티드의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 C형 간염 바이러스에 감염된 대상체를 식별하고 치료하는 방법을 제공한다. 몇몇 경우, 대상체는 비-CpG 치료법에 대해 반응하지 않는 대상체이다. 바람직하게는, 대상체가 세미-소프트 골격을 갖는 C 클래스의 CpG 면역자극성 핵산으로 치료된다.

Description

Ｃ형 간염 바이러스 감염의 치료에 있어 ＣｐＧ 올리고뉴클레오티드의 용도 {Use of CpG Oligonucleotides in the Treatment of Hepatitis C Virus Infection}

본 발명은 C형 간염 바이러스에 만성적으로 감염된 대상체의 치료를 위한 방법 및 생성물을 제공한다.

C형 간염 바이러스 (HCV)는 인간 및 몇몇 다른 영장류의 간세포를 감염시키는 플라비바이러스(Flavivirus) 과의 양성 가닥(positive strand) RNA 바이러스이다. 1989년에 최초로 특징이 규명된 HCV (1)는 3가지 구조 단백질, 즉 코어 및 2가지 막 당단백질 (E1 및 E2) 뿐만 아니라, 바이러스 복제 및 숙주 세포와의 상호작용에 관여하는 여러 비구조 (NS) 단백질을 코딩하는 9.5 kb의 게놈을 갖는다 (2).

HCV는 공중 보건상 심각한 관심의 대상이며, 비경구 비-A, 비-B 간염을 90％ 넘게 유발한다 (1). 캐나다인 약 300,000명을 비롯하여 전세계 인구의 0.4 내지 1.5％가 상기 바이러스에 감염되어 있다 (Health Canada). 대다수의 급성 감염이 잠복성이기 때문에 역학적 통계를 집계하기는 어렵지만, HCV에 감염된 개체의 50 내지 80％가 상기 바이러스를 제거하지 못하며 이들의 대부분은 장기 보균자인 것으로 평가된다. 보균자의 약 50％에서 만성 간염이 발병하고, 이들 중 20％에서는 간 경화증이 발병하며, 이들 중 다수에서는 추후 간세포 암종이 발병하게 될 것이다 (5-9). 미국에서는 연간 8,000명 내지 10,000명이 C형 간염으로 사망하는 것으로 평가된다 (CDC).

미국과 캐나다에서는 C형 간염에 대한 치료법으로 승인된 2가지 상이한 처방, 즉 알파 인터페론을 사용한 단일치료법 및 알파 인터페론과 리바비린(Ribavirin)을 사용한 병용치료법이 행해진다. 병용치료법은 단일치료법보다 비용이 더 들고 관련된 부작용이 더 많지만, 지속 반응을 단일치료법보다 더 높은 비율로 일관되게 나타낸다.

여러 형태의 알파 인터페론 (알파-2a, 알파-2b, 및 컨센서스(consensus) 인터페론 (Alfacon))이 이용가능하다. 이들 인터페론은 전형적으로 주당 3회 피하로 투여된다. PEG화 인터페론, 즉 순환 시간을 증가시키기 위해 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 부가하여 변형한 알파 인터페론은 또다른 인터페론이며, 주당 1회만 투여된다. 이와는 달리, 리바비린은 200 mg 캡슐로 1일 2회 투여되는 경구 항바이러스제이다.

알파 인터페론의 부작용으로는 피로, 근육통, 두통, 오심 및 구토, 주사 부위에서의 피부 자극, 미열, 체중 감소, 과민증, 우울증, 자살, 경미한 골수 억제 및 모발 손상 (가역적)을 들 수 있다. 리바비린의 경우, 부작용으로는 빈혈, 피로 및 과민증, 소양증, 피부 발진, 코막힘, 부비동염 및 기침을 들 수 있다.

인터페론 단독을 사용한 치료 또는 인터페론과 리바비린을 병용한 치료는 환자의 50 내지 75％에서 혈청 ALT 수준을 급격하게 상승시키고, 환자의 30 내지 50％에서 혈청으로부터 검출가능한 HCV RNA를 제거한다. 간 질환에서는 HCV RNA가 치료법 시행 동안 사라지고 치료법 완료 후 6개월 이상 검출되지 않는 경우에만 질환이 장기간 개선된 것으로 보는 것이 일반적이다. 병용치료법은 치료 동안 HCV RNA가 높은 비율로 감소되고 치료 완료시 재발율이 낮다. 그러나, 결과는 바이러스의 유전자형에 크게 의존하며, 유전자형 2 및 3에 대하여 더 우수한 결과 (PEG화 IFN-α 및 리바비린으로 1년간 치료시 지속 반응이 약 90％임)가 얻어지지만, 유전자형 1의 HCV에 대하여는 더 불량한 결과 (지속 반응이 약 40％임)가 얻어진다. 현재 북미에서 대다수의 HCV 만성 보균자는 유전자형 1에 해당한다.

최적 치료 기간은 HCV 유전자형 뿐만 아니라 인터페론 단일치료법 또는 병용치료법 중 어떤 것을 사용할 것인지에 따라 달라진다. 전형적으로, 기간은 6개월 내지 12개월 범위이다.

본 발명 이전까지 HCV에 대한 백신 또는 만성 감염에 대한 고도로 효과적인 치료법은 존재하지 않았다. 따라서, 만성 보균자의 치료에 사용할 수 있는 효과적 치료법이 긴급히 요구되는 실정이다.

<발명의 개요>

본 발명은 부분적으로, CpG 면역자극성 핵산을 사용하여 C형 간염 바이러스 (HCV)에 만성적으로 감염되며 기존에 투여된 비-CpG 치료법에 대해 반응하지 않은 대상체를 치료할 수 있다는 관찰결과를 비롯한 여러 놀라운 발견을 전제로 한다. 또한, 본 발명은 부분적으로, CpG 면역자극성 핵산과 항바이러스제, 예를 들어 IFN-알파의 병용으로부터 상기 대상체에서 상승 반응이 나타날 수 있다는 관찰결과를 전제로 한다.

한 측면으로, 본 발명은 기존의 비-CpG 치료법을 사용하여 성공적으로 치료되지 않은 HCV 감염의 치료를 요하는 대상체에게 감염 치료 유효량의 CpG 면역자극성 핵산을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 비-CpG 치료법은 인터페론-알파를 포함한다. 관련 실시양태에서, 인터페론-알파는 인터페론-알파-2b, 인터페론-알파-2a 또는 컨센서스 인터페론-알파이다. 다른 실시양태에서, 비-CpG 치료법은 인터페론-알파 및 리바비린, 또는 인터페론-알파 및 리바비린 및 에만티딘(emantidine)을 포함한다. 일부 중요한 실시양태에서, 비-CpG 치료법은 PEG화 인터페론-알파 및 항바이러스제, 예를 들어 리바비린을 포함한다.

한 실시양태에서, CpG 면역자극성 핵산은 A 클래스의 CpG 면역자극성 핵산이다. 다른 실시양태에서, CpG 면역자극성 핵산은 B 클래스의 CpG 면역자극성 핵산이다.

또다른 실시양태에서, CpG 면역자극성 핵산은 C 클래스의 CpG 면역자극성 핵산이다.

본 발명의 방법은 대상체에게 항바이러스제, 예를 들어 인터페론-알파를 CpG 면역자극성 핵산과 함께 투여하는 단계를 임의로 포함할 수 있다. 인터페론-알파는 인터페론-알파-2b, 인터페론-알파-2a 또는 컨센서스 인터페론 알파일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 항바이러스제는 CpG 면역자극성 핵산과 실질적으로 동시에 투여된다.

한 실시양태에서, CpG 면역자극성 핵산은 골격 변형(backbone modification)을 포함한다. 관련 실시양태에서, 골격 변형은 포스포로티오에이트 골격 변형이다. 일부 중요한 실시양태에서, CpG 면역자극성 핵산은 세미-소프트(semi-soft) 골격을 포함한다. 다른 중요한 실시양태에서, CpG 면역자극성 핵산은 세미-소프트 골격을 갖는 C 클래스의 면역자극성 핵산이다.

따라서, 다른 측면으로, 기존의 비-CpG 치료법을 사용하여 성공적으로 치료되지 않은 HCV 감염의 치료를 요하는 대상체에게 세미-소프트 골격을 갖는 C 클래스의 CpG 면역자극성 핵산을 감염 치료 유효량 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체의 치료 방법이 제공된다.

또다른 측면으로, 기존의 비-CpG 치료법을 사용하여 성공적으로 치료되지 않은 HCV 감염의 치료를 요하는 대상체로부터의 말초 혈액 단핵 세포를 면역 반응에 대한 자극 유효량의 CpG 면역자극성 핵산과 접촉시키는 단계, 및 상기 세포를 상기 대상체에게 다시 주입하는 단계를 포함하는, 상기 대상체의 치료 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 말초 혈액 단핵 세포는 수상 세포를 포함한다. 다른 실시양태에서, 수상 세포는 형질세포양(plasmacytoid) 수상 세포를 포함한다. 한 실시양태에서, CpG 면역자극성 핵산은 C 클래스의 면역자극성 핵산이다. 관련 실시양태에서, C 클래스의 면역자극성 핵산은 세미-소프트 골격을 갖는다.

다른 측면으로, 본 발명은 HCV 감염의 치료를 요하며 비-CpG 치료법에 대해 반응하지 않을 가능성이 높은 대상체에게 감염 치료 유효량의 CpG 면역자극성 핵산을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체의 치료 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 비-CpG 치료법에 대해 반응하지 않을 가능성이 높은 대상체를 식별하는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 대상체는 수상 세포 당 생성되는 인터페론-알파의 분석을 기초로 하여 반응하지 않을 가능성이 높은 것으로 식별된다. 다른 실시양태에서, 대상체는 HCV 유전자형을 기초로 하여 반응하지 않을 가능성이 높은 것으로 식별된다.

한 실시양태에서, 비-CpG 치료법은 IFN-알파를 포함한다. 관련 실시양태에서, 비-CpG 치료법은 인터페론-알파 및 리바비린을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 대상체에게 항바이러스제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 중요한 실시양태에서, 항바이러스제는 인터페론-알파이다. 인터페론-알파는 인터페론-알파-2b, 인터페론-알파-2a 또는 컨센서스 인터페론 알파일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 인터페론-알파는 치료량 미만으로 투여되며, 임의로 CpG 면역자극성 핵산과 인터페론-알파의 조합은 상승작용성이다.

한 실시양태에서, 대상체의 치료에 사용되는 CpG 면역자극성 핵산은 A 클래스의 CpG 면역자극성 핵산, B 클래스의 CpG 면역자극성 핵산 또는 C 클래스의 CpG 면역자극성 핵산이다.

한 실시양태에서, 대상체가 비-CpG 치료법에 대해 반응하지 않을 가능성이 높은지를 식별하는데 사용되는 CpG 면역자극성 핵산은 A 클래스의 CpG 면역자극성 핵산 또는 C 클래스의 CpG 면역자극성 핵산이다.

한 실시양태에서, 항바이러스제를 CpG 면역자극성 핵산과 실질적으로 동시에 대상체에게 투여한다. 다른 실시양태에서, CpG 면역자극성 핵산을 사용한 치료에 앞서 소정 기간 동안 인터페론-알파를 투여한다.

어떤 실시양태에서, CpG 면역자극성 핵산은 골격 변형을 포함한다. 관련 실시양태에서, 골격 변형은 포스포로티오에이트 골격 변형이다. 일부 바람직한 실시양태에서, CpG 면역자극성 핵산은 세미-소프트 골격을 포함하며, 훨씬 더 바람직한 일부 실시양태에서, CpG 면역자극성 핵산은 세미-소프트 골격을 갖는 C 클래스의 CpG 면역자극성 핵산이다.

다른 측면으로, HCV 감염의 치료를 요하며 비-CpG 치료법에 대해 반응하지 않을 가능성이 높은 대상체에게 세미-소프트 골격을 갖는 C 클래스의 CpG 면역자극성 핵산을 감염 치료 유효량 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체의 치료 방법이 제공된다.

또다른 측면으로, 본 발명은 만성 C형 간염 바이러스 감염의 치료에 유용한 CpG 면역자극성 핵산을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 만성 C형 간염 바이러스에 감염된 대상체로부터의 말초 혈액 단핵 세포를 CpG 면역자극성 핵산과 접촉시키는 단계, 및 혈액 단핵 세포의 노출 후 시험 반응을 측정하는 단계를 포함한다. 말초 혈액 단핵 세포를 얻은 대상체는 기존의 치료법을 이용하여 성공적으로 치료되지 않았던 대상체였다.

한 실시양태에서, 시험 반응은 B 세포 자극, IL-6의 분비, IL-10의 분비, IL-12의 분비, 인터페론-감마의 분비, 제1형 인터페론 (알파 + 베타)의 분비, IP-10의 분비, NK 활성, CD80의 발현, CD86의 발현, CD83의 발현, 및 클래스 II MHC 발현의 상향조절로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다른 실시양태에서, 말초 혈액 단핵 세포는 수상 세포를 포함한다. 관련 실시양태에서, 수상 세포는 형질세포양 수상 세포를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 세포는 수상 세포이며, 시험 반응은 IL-12의 분비, 제1형 인터페론의 분비, CD80의 발현, CD86의 발현, CD83의 발현, 및 클래스 II MHC 발현의 상향조절로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 접촉은 시험관내에서 일어난다. 다른 실시양태에서, 말초 혈액 단핵 세포를 배양한다. 또다른 실시양태에서, CpG 면역자극성 핵산을 배양된 말초 혈액 단핵 세포에 첨가한다.

한 실시양태에서, 기존의 치료법은 비-CpG 치료법이다. 다른 실시양태에서, 비-CpG 치료법은 인터페론-알파를 포함한다. 다른 실시양태에서, 비-CpG 치료법은 리바비린을 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 인터페론-알파는 PEG화 인터페론-알파이다. 한 실시양태에서, 기존은 치료법은 상이한 서열 또는 클래스의 CpG 핵산을 사용한 치료법이다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 정상 대상체 유래의 말초 혈액 단핵 세포로부터의 조절 반응을 자극하는 능력에 대해 CpG 면역자극성 핵산을 스크리닝하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명의 방법은 말초 혈액 단핵 세포를, CpG 면역자극성 핵산과 함께 인터페론-알파에 실질적으로 동시에 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, CpG 면역자극성 핵산은 골격 변형을 포함한다. 관련 실시양태에서, 골격 변형은 포스포로티오에이트 골격 변형이다. 중요한 실시양태에서, CpG 면역자극성 핵산은 세미-소프트 골격을 포함한다. CpG 면역자극성 핵산은 A 클래스의 CpG 면역자극성 핵산, B 클래스의 CpG 면역자극성 핵산 또는 C 클래스의 CpG 면역자극성 핵산일 수 있다. 일부 실시양태에서, CpG 면역자극성 핵산은 C 클래스의 면역자극성 핵산이고, 다른 실시양태에서, CpG 면역자극성 핵산은 세미-소프트 골격을 갖는 C 클래스의 면역자극성 핵산이다.

다른 측면으로, 본 발명은 HCV 감염을 앓으며 비-CpG 치료법에 대해 반응하지 않을 가능성이 높은 대상체를 식별하는 방법을 제공한다. 이 방법은 C형 간염 바이러스에 감염된 대상체로부터 회수한 말초 혈액 단핵 세포를 CpG 면역자극성 핵산에 노출시키는 단계, 상기 세포로부터 생성된 인터페론-알파를 측정하는 단계, 및 수상 세포 당 생성된 인터페론-알파의 양을 측정하는 단계를 포함하며, 이때 1.0 pg/ml 미만의 양은 상기 대상체가 비-CpG 치료법에 대해 반응하지 않을 가능성이 높은 것을 나타내는 지표이다. 한 실시양태에서, 0.5 pg/ml 미만의 양은 대상체가 비-CpG 치료법에 대해 반응하지 않을 가능성이 높은 것을 나타내는 지표이다.

한 실시양태에서, 비-CpG 치료법은 인터페론-알파를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 비-CpG 치료법은 리바비린을 포함한다. 또다른 실시양태에서, IFN-알파는 PEG화된 IFN-알파이다.

몇몇 중요한 실시양태에서, CpG 면역자극성 핵산은 A 클래스 또는 C 클래스의 CpG 면역자극성 핵산이다.

다른 실시양태에서, 말초 혈액 단핵 세포를 항바이러스제 및 CpG 면역자극성 핵산에 추가로 노출시킨다. 항바이러스제는 인터페론-알파일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 인터페론-알파는 인터페론-알파-2b, 인터페론-알파-2a 또는 컨센서스 인터페론 알파이다.

한 실시양태에서, 말초 혈액 단핵 세포는 수상 세포를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 수상 세포는 형질세포양 수상 세포를 포함한다.

또다른 실시양태에서, C형 간염 바이러스 감염은 급성 C형 간염 바이러스 감염이다.

또다른 실시양태에서, 상기 방법은 HCV의 유전자형을 결정하는 단계를 추가로 포함한다.

추가의 측면에서, 본 발명은

C형 간염 바이러스에 감염된 대상체로부터 회수한 말초 혈액 단핵 세포를 A 클래스 또는 C 클래스의 CpG 면역자극성 핵산에 노출시키는 단계,

상기 세포에서 생성된 인터페론-알파를 측정하는 단계, 및

수상 세포 당 생성된 인터페론-알파의 양을 측정하는 단계

를 포함하고, 상기 양이 1.0 pg/ml 미만이면 상기 대상체가 비-CpG 치료법에 대해 반응하지 않을 가능성이 높은 것을 나타내는 지표인, HCV에 감염되고 비-CpG 치료법에 대해 반응하지 않을 가능성이 높은 대상체를 식별하는 방법을 제공한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 상기한 방법에 따라 식별된 대상체에게 C형 간염 바이러스 감염에 대한 치료 유효량의 CpG 면역자극성 핵산 분자를 투여하는 단계를 포함하는, C형 간염 바이러스에 감염된 대상체의 치료 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 상기 방법은 대상체에게 인터페론-알파를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 인터페론-알파는 인터페론-알파-2b, 인터페론-알파-2a 또는 컨센서스 인터페론-알파이다.

한 실시양태에서, 대상체 치료에 사용되는 CpG 면역자극성 핵산은 A 클래스의 CpG 면역자극성 핵산, B 클래스의 CpG 면역자극성 핵산 또는 C 클래스의 CpG 면역자극성 핵산이다.

또다른 실시양태에서, CpG 면역자극성 핵산은 골격 변형을 포함한다. 관련 실시양태에서, 골격 변형은 포스포로티오에이트 골격 변형이다. 또다른 실시양태에서, CpG 면역자극성 핵산은 세미-소프트 골격을 포함한다.

한 실시양태에서, C형 간염 바이러스 감염은 만성 C형 간염 바이러스 감염이다. 또다른 실시양태에서, C형 간염 바이러스 감염은 급성 C형 간염 바이러스 감염이다.

본 발명의 각 제한사항은 본 발명의 다양한 실시양태를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 한 요소 또는 요소의 조합을 포함하는 본 발명의 각 제한사항은 본 발명의 각 측면에 포함될 수 있음이 예측된다.

본 발명의 이러한 측면 및 다른 측면을 하기에서 더욱 상세하게 기재한다.

도 1은 HCV에 감염된 PBMC 및 정상 PBMC를 3가지 클래스의 CpG를 사용하여 자극한 후에 이들로부터 IFN-α 분비가 유도됨을 나타낸다. 정상 대상체 또는 HCV에 감염된 대상체로부터의 PBMC를 여러가지 클래스의 CpG와 함께 사용하여 48시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 상층액을 수집하고 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 IFN-α 분비량에 대해 분석하였다. 정상 대상체 10명 및 HCV에 감염된 대상체 10명에 대한 평균 IFN-α 분비량을 흑색 막대로 나타내었다.

도 2는 만성 HCV 보균자 및 정상 대상체로부터 새로 단리한 PBMC의 유동세포계측 분석을 나타낸다. HCV에 감염된 대상체 및 건강한 정상 공여자의 혈액에서 PBMC를 단리하여 형광 태그가 부착된 항-형질세포양 수상 세포 (pDC) 항체로 면역염색시켰다. 세포를 유동세포계측기로 분석하고 그 결과를 이들 동일 대상체를 CpG로 자극한 경우의 IFN-α 분비 데이타와 비교하였다.

도 3은 C-클래스 및 소프트-C 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PBMC를 자극하면 IFN-α가 유도됨을 나타낸다. 정상 대상체 또는 HCV에 감염된 대상체로부터의 PBMC를 여러가지 클래스의 CpG와 함께 사용하여 48시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 상층액을 수집하고 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 IFN-α 분비량에 대해 분석하였다. 정상 대상체 10명 및 HCV에 감염된 대상체 10명에 대한 평균 IFN-α 분비량을 흑색 막대로 나타내었다.

도 4는 세미-소프트 C-클래스 CpG 패널을 사용하여 자극한 후에 IFN-α가 유도됨을 나타낸다. HCV에 감염된 대상체 5명으로부터 단리한 PBMC를 세미-소프트 C-클래스 올리고뉴클레오티드 패널과 함께 사용하여 48시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 상층액을 수집하고 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 IFN-α 분비량에 대해 분석하였다. HCV에 감염된 대상체 5명에 대한 평균 IFN-α 분비량을 흑색 막대로 나타내었다.

도 5는 3가지 클래스의 CpG를 사용하여 자극한 후에 IFN-γ가 분비됨을 나타낸다. 정상 대상체 또는 HCV에 감염된 대상체로부터의 PBMC를 여러가지 클래스의 CpG와 함께 사용하여 48시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 상층액을 수집하고 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 IFN-γ 분비량에 대해 분석하였다. 정상 대상체 10명 및 HCV에 감염된 대상체 10명에 대한 평균 IFN-γ 분비량을 흑색 막대로 나타내었다.

도 6은 세미-소프트 C-클래스 CpG 패널을 사용하여 자극한 후에 IFN-γ가 유도됨을 나타낸다. HCV에 감염된 대상체 5명으로부터 단리한 PBMC를 세미-소프트 C-클래스 올리고뉴클레오티드 패널과 함께 사용하여 48시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 상층액을 수집하고 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 IFN-γ 분비량에 대해 분석하였다. HCV 대상체 5명에 대한 평균 IFN-γ 분비량을 흑색 막대로 나타내었다.

도 7은 3가지 클래스의 CpG를 사용하여 자극한 후에 IP-10이 분비됨을 나타낸다. 정상 대상체 또는 HCV에 감염된 대상체로부터의 PBMC를 여러가지 클래스의 CpG와 함께 사용하여 48시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 상층액을 수집하고 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 IP-10 분비량에 대해 분석하였다. 정상 대상체 10명 및 HCV에 감염된 대상체 10명에 대한 평균 IP-10 분비량을 흑색 막대로 나타내었다.

도 8은 CpG가 B 세포 증식에 미치는 효과를 나타낸다. HCV에 감염된 공여자 또는 정상 공여자로부터의 PBMC를 클래스 A, B 또는 C의 CpG와 함께 사용하여 5일 동안 인큐베이션하였다. 이어서, ³H-티미딘을 사용하여 세포에 16 내지 18시간 동안 펄스를 제공한 후에 방사성을 측정하였다. 수치는 배지 대조군과 비교한 자극 지수로서 나타낸다 (SI = CpG와 함께 인큐베이션시켰을 때의 cpm/배지만을 단독으로 사용하여 함께 인큐베이션한 세포의 cpm).

도 9는 세미-소프트 C-클래스 CpG가 B 세포 증식에 미치는 효과를 나타낸다. HCV에 감염된 대상체 5명으로부터 단리한 PBMC를 클래스 A, B, C 및 세미-소프트 C 클래스의 CpG와 함께 사용하여 5일 동안 인큐베이션하였다. 이어서, ³H-티미딘을 사용하여 세포에 16 내지 18시간 동안 펄스를 제공한 후에 방사성을 측정하였다. 수치는 배지 대조군과 비교한 자극 지수로서 나타낸다 (SI = CpG와 함께 인큐베이션시켰을 때의 cpm/배지만을 단독으로 사용하여 함께 인큐베이션한 세포의 cpm).

도 10은 3가지 클래스의 CpG를 사용하여 자극한 후에 IL-10이 분비됨을 나타낸다. 정상 대상체 또는 HCV에 감염된 대상체로부터의 PBMC를 여러가지 클래스의 CpG와 함께 사용하여 48시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 상층액을 수집하고 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 IL-10 분비량에 대해 분석하였다. 정상 대상체 10명 및 HCV에 감염된 대상체 10명에 대한 평균 IL-10 분비량을 흑색 막대로 나타내었다.

도 11은 HCV에 감염된 세포를 리바비린 및 CpG를 단독으로 사용하여 자극하거나 또는 인트론 A(Intron A)와 함께 사용하여 자극한 후에 IFN-α가 분비됨을 나타낸다. HCV에 감염된 대상체 10명 및 건강한 정상 공여자 10명으로부터의 PBMC를 인트론 A (IFN-α의 정제된 외인성 공급원) 단독과 함께, 또는 인트론 A의 존재 또는 부재하의 리바비린 또는 C-클래스 CpG와 함께 사용하여 48시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 상층액을 수집하고 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 IFN-α 분비량에 대해 분석하였다. 각 대상체에서 인트론 A를 단독으로 사용한 경우에 측정된 IFN-α의 양을 기본값(background)으로 간주하고, 이들 동일 대상체에서 인트론 A, 리바비린 + 인트론 A, 및 C-클래스 + 인트론 A를 사용한 경우의 측정값으로부터 상기 양을 감산한 데이타를 그래프에 포함시켰다. 정상 및 HCV 대상체에 대한 평균 값은 각각 흑색 및 백색 막대로 표시하였다.

도 12는 HCV에 감염된 세포에 의한 IFN-α 분비에 있어서 인트론 A와 병용된 CpG의 상승작용 효과를 나타낸다. HCV에 감염된 대상체 15명으로부터의 PBMC를 C-클래스 CpG 단독과 함께 사용하거나 C-클래스 CpG 및 인트론 A (IFN-α의 정제된 외인성 공급원)와 함께 사용하여 48시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 상층액을 수집하고 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 IFN-α 분비량에 대해 분석하였다. 각 대상체에서 인트론 A를 단독으로 사용한 경우에 측정된 IFN-α의 양을 이들 동일 대상체에서 CpG + 인트론 A를 사용한 경우의 측정값으로부터 감산한 데이타를 그래프에 포함시켰다.

청구한 발명을 실시하는데에는 상기 도면이 필요하지 않다는 것을 이해해야 한다.

본 발명에 따라서, CpG 올리고뉴클레오티드기가 기존의 인터페론-알파(IFN-α) 치료법으로는 실패하였던 환자를 비롯한 HCV 만성 감염 환자로부터의 PBMC를 건강한 대상체로부터의 PBMC와 유사한 방식으로 활성화시킬 수 있음이 발견되었다.

HCV에 감염되면 기능저하가 발생하고 다른 자극에 대한 반응 능력이 저하된다고 여겨지는 형질세포양 수상 세포 (PDC)로부터 내인성 IFN-α 분비가 강력하게 유도된다는 것이 발견되었다. 몇몇 예에서, A 및 C의 CpG 클래스는 건강한 지원자로부터의 PBMC에서 IFN-α를 높은 수준으로 유도하는데, pDC로부터는 IFN-α를 최고 수준으로 유도한다는 것을 알아냈다. 추가로, 세미-소프트 C 클래스의 CpG ODN 역시 이러한 효과에 특히 유용하다는 것이 발견되었다. 이들 ODN은 반복 투여시에도 신장에 축적되지 않기 때문에 몇몇 실시양태에서 바람직할 수 있다.

본 발명에 따라서, 외인성 IFN-α (인트론 A) 또는 리바비린 그 어느 것도 단독으로 사용되거나 함께 사용된 경우에 있어서 정상 대상체 또는 HCV 만성 보균자로부터의 PBMC에 대해 검출가능한 임의의 직접적인 면역 자극 효과를 나타내지 못한다는 것이 추가로 발견되었다. 그러나, 인트론 A와 CpG ODN (예를 들어, B 또는 C 클래스)이 함께 사용되는 경우에는 내인성 IFN-α의 생성에 대한 강력한 상승작용이 관찰된다.

이러한 결과는, CpG ODN의 단독 사용 또는 CpG ODN과 IFN-α의 병용이 만성 HCV 감염 치료에 효과적인 치료법임을 나타낸다. 본 발명은 이러한 발견에 기초하여 HCV 감염의 예방 및 치료 방법 및 그를 위한 생성물을 제공한다.

만성 감염은 적어도 부분적으로는 HCV의 신속한 돌연변이 속도에 의한 것으로 여겨지는데, 이로 인해 면역 감시를 피해갈 수 있는 유사종(quasi-species)이 생성된다 (10, 11). 만성 감염된 개체에서는 체액성 면역 및 세포-매개 면역 (CMI; Cell-Mediated Immunity) 반응 모두가 검출될 수 있다. 중화 항체는 감염에 대한 보호에 중요하지만, 세포-매개 면역 (CMI)은 감염이 일단 수립된 바이러스의 제거시에 주요 역할을 하는 것으로 여겨진다.

한 측면에서, 본 발명은 기존의 비-CpG 치료법으로는 성공적으로 치료되지 못한 C형 간염 바이러스 (HCV) 감염 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 C형 간염 바이러스 (HCV) 감염을 치료할 필요가 있는 비반응성 대상체에게 상기 감염 억제 유효량의 CpG 면역자극성 핵산을 투여하는 단계를 포함한다.

본원에서 사용된 비-CpG 치료법은 CpG 면역자극성 핵산이 아닌 활성 또는 비활성 화합물을 사용하는 치료법이다. 여러가지 실시양태에서, 상기 비-CpG 치료법은 인터페론-알파를 포함한다. PEG화된 IFN-알파는 통상적으로 HCV 대상체 (예를 들어, 인간 HCV 환자)에게 바람직하게는 리바비린 및 임의로는 아만타딘과 병용하여 투여된다. 인터페론-알파는 인터페론-알파-2b, 인터페론-알파-2a 또는 컨센서스 인터페론-알파일 수 있다. 전술한 모든 인터페론-알파 치료법이 비-CpG 치료법의 정의에 속한다.

기존의 비-CpG 치료법으로 성공적으로 치료되지 못한 대상체는 이전의 치료에도 불구하고 치료법을 중단한지 6개월이 지난 후에 혈류 내에 여전히 검출가능한 양의 바이러스를 보유하는 대상체이다. 이들 대상체로는, 기존의 비-CpG 치료법에 반응할 수는 있지만 감염 제어에 실패하고 이후에 다시 검출가능한 양의 바이러스가 발견되는 대상체를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이 또한 간결성을 위해서, 이들 대상체를 "비-반응자"라고 지칭하지만, 상기 용어가 본원에서 정의된 바와 같이 이해되어야 하며 임상 환경(clinical setting)에서 정의된 바와 같이 이해되어서는 안된다. 즉, 임상 환경에서는 "비-반응자"가 치료에 대해 어떠한 반응도 나타내지 않는 극히 일부의 대상체만으로 정의되지만, 본 발명은 기존의 치료에 대해 어느 정도의 수준으로는 반응할 수 있을지라도 여전히 성공적으로 치료되지는 않은, 더 넓은 범주의 대상체에 관한 것이다. 성공적으로 치료된 대상체는 치료를 중단한지 6개월이 지난 후에 혈류 내에 검출가능한 양의 바이러스가 없는 대상체이다. 성공적인 치료란, 치료를 중단하고 적어도 6개월이 지난 후에 혈류 내에 존재하는 바이러스 양이 검출가능하지 않은 수준인 치료를 의미한다. 본원에서 사용된 비-반응자는 또한 HCV의 만성 감염임을 반드시 이해해야 한다.

본원에서 사용된 바와 같이, CpG 핵산을 사용한 치료법을 언급하는 경우에는 상기 방법이 대상체의 성공적인 치료를 위해 사용되는 것이다. CpG 치료법을 이용한 대상체의 성공적인 치료는, 치료법을 중단한지 6개월이 지난 후에 혈류 내의 바이러스 양이 검출가능하지 않은 수준까지 감소되는 것으로 정의된다. 흥미롭게도, CpG 치료 동안이나 CpG 치료 직후에는 바이러스 양이 감소되는 것으로 관찰되지 않을 수 있지만, 치료 후에는 시간에 따라 조금씩 감소되어 궁극적으로는 치료를 중단하고 6개월이 지난 후에 이들 대상체의 혈류 내에 검출가능한 바이러스가 존재하지 않는 결과를 가져올 수 있다. 따라서, 감염 치료란, 대상체 혈류 내의 바이러스의 양을 검출가능하지 않은 수준까지 저하시키고 치료를 중단한 후 6개월 동안 상기 수준을 유지하는 것을 의미한다. 따라서, 유효량의 작용제를 투여하여 이러한 최종 결과를 달성한다. 일부 실시양태에서는, 잠재적 비-반응자를 미리 (즉, 비-CpG 치료법으로 실제로 생체내 치료하기 전에) 식별할 수 있고, 본 발명은 이러한 대상체를 식별하는 것 뿐만 아니라 이들을 치료하는 방법을 제공한다. 잠재적 비-반응자는 이들이 CpG 면역자극성 핵산, 특히 A 클래스 및 C 클래스에 반응하는 능력을 평가함으로써 식별할 수 있다. CpG 면역자극성 핵산에 반응하는 능력은 HCV 감염 대상체에서 pDC 당 생성되는 인터페론-알파의 양에 의해 평가한다. IFN-알파 치료법과 같은 비-CpG 치료법에 반응할 가능성이 거의 없는 HCV 감염 대상체가 상기와 같은 치료를 받기 전에 식별될 수 있다는 것이 본 발명에 따라 발견되었다. 이러한 대상체를 생체내 치료법 수행 전에 식별할 수 있는 능력은 불필요한 치료를 없애며 본 발명의 CpG 면역자극성 핵산을 단독으로 또는 IFN-알파를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 항-HCV 치료법과 병행하여 치료하는데 있어 대상체가 치료학적으로 유리한 위치에 있게 한다. 이들 대상체는 세포독성을 거의 갖지 않으며, 성공적이지 못할 치료를 수행하지 않음으로 인해 바이러스 성장 기간이 감소된다. pDC 당 IFN-알파 유도를 적당 수준 미만으로 갖는 대상체는 IFN-알파로 성공적으로 치료되지 않을 수 있고, 따라서 본원에 제공된 방법을 이용하여 치료해야 한다. IFN-알파 유도 및 pDC 수의 측정은 실시예에 보다 상세히 기재되어 있다.

임의의 치료제 및 본원에서 논의된 방법으로 성공적으로 치료되는 HCV 감염 대상체는 아마도 그의 체내에 여전히 바이러스를 가질 것임을 이해하여야 한다. 그러나, 대상체는 바이러스를 완전히 박멸할 수는 없으나, 바이러스의 양(load)을 (검출불가능한 수준으로) 조절할 수 있다. 임의의 특정 이론에 구속되는 것을 의도하지는 않으나, 상기와 같은 대상체에서 검출불가능한 바이러스의 양 유지에는 바이러스 복제 및 확산을 조절할 수 있는 면역계가 관련된다.

본원에 제공된 교시에 의해 당업자는 대상체가 IFN-알파 치료법에 대해 "비-반응자"일 가능성이 있는지의 여부를 결정할 수 있을 것이다. 일례로, IFN-알파 유도를 실시예에 기재된 배양 조건 하에 서열 1로 지칭되는 핵산과 같은 A 클래스 핵산으로 수행하는 경우, IFN-알파 치료법에 반응하는 능력을 나타내는 정상적 반응이 pDC 당 1 pg/ml 이상이 된다. 상기 양 미만인 경우는 일부 pDC 기능장애를 나타낸다. pDC 당 0.5 pg/ml 미만의 양은 IFN-알파 치료에 대해 반응하지 않을 가능성이 높은 것에 상응한다. 당업자는 분석에 사용되는 특정 유형의 핵산에 대해 이러한 컷오프(cutoff) 값을 결정할 수 있을 것이며, 따라서 이러한 방식으로 IFN-알파 치료법으로 성공적으로 치료되지 않을 것으로 예상되는 대상체를 (적어도) 이러한 대상체를 실제로 치료하기 전에 식별할 수 있을 것이다.

또다른 실시양태에서, 비-CpG 치료법 (예를 들어, IFN-알파 치료법)에 대한 비-반응자일 가능성이 있는 대상체를 식별하는 방법은 또한 HCV 감염자의 HCV 유전자형을 식별하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 유전자형 1의 HCV에 감염된 대상체는 IFN-알파 치료법으로 성공적으로 치료되지 않을 가능성이 보다 클 것이다. 따라서, 이러한 대상체의 DC 당 IFN-알파의 생성을 평가하는데 더하여, (당업계에 공지된 방법을 이용하여) 이들의 HCV 유전자형을 또한 결정할 수 있고, 이러한 정보의 조합을 이용하여 IFN-알파 치료법에 대해 반응하지 않을 가능성이 높은 대상체를 식별할 수 있다.

일부 측면에서, 본 발명은 (대상체를 비-CpG 치료법으로 실제로 치료하지 않으면서) 비-CpG 치료법을 이용하여 성공적으로 치료될 가능성이 없는 대상체를 식별하고, 이어서 상기 대상체를 CpG 면역자극성 핵산을 단독으로 또는 IFN-알파를 포함하나 이에 제한되지는 않는 항바이러스제와 병용하여 치료하는 방법을 제공한다는 것을 또한 이해하여야 한다.

또한, 상기 방법을 이용하여 특정 CpG 면역자극성 핵산에 대한 대상체의 반응에 대해 대상체를 스크리닝할 수 있다.

또다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 이전에 비-CpG 치료법을 받았으나 성공적으로 치료되지 않은 대상체를 식별하는 추가의 단계를 포함할 수 있다. 본원에 제공된 교시에 의해 당업자는 상기와 같은 대상체를 식별할 수 있다. 일례로, 상기와 같은 대상체는 치료 중단 6개월 이후 그의 혈류내에 검출가능한 바이러스의 양을 갖는다.

일부 실시양태에서는, 이들 대상체에서 치료 직후 바이러스의 양 감소가 나타날 수도 있으나, 이러한 감소는 지속되지 않는다.

본 발명은, 특히 CpG 면역자극성 핵산을 단독으로 또는 HCV 감염에 대해 상기에 기재한 바와 같은 다른 활성제와 병용하는, 이전의 비-CpG 치료법으로 성공적으로 치료되지 않은 대상체를 치료하는 것을 의도한다. 넓은 의미에서 CpG 면역자극성 핵산은 적어도 디뉴클레오티드의 C가 메틸화되지 않은 하나 이상의 CpG 디뉴클레오티드 모티프를 갖는 핵산이다. CpG 면역자극성 핵산은, 본원에서, 그리고 본원에 참고로 인용된 특허 및 특허 출원에 보다 상세히 기재되어 있는 A 클래스, B 클래스 및 C 클래스의 CpG 면역자극성 핵산을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. CpG 면역자극성 핵산의 이들 클래스는 상이한 특성 및 활성 프로파일을 갖는다.

중요한 실시양태에서, CpG 면역자극성 핵산은 C 클래스의 면역자극성 핵산이다. 본 발명에 따라 놀랍게도, C 클래스의 면역자극성 핵산이 A 클래스 및 B 클래스의 면역자극성 핵산에 대한 중간적 특성을 갖지만, 일부 실시양태에서 C 클래스의 면역자극성 핵산이 바람직하다는 것이 발견되었다. 본원에 제공된 실시예는, 이전 비-CpG 치료법으로 성공적으로 치료되지 않은 임상적으로 감염된 대상체의 pDC 자체가 HCV에 감염되어 일부 면에서 기능장애를 가져도, 이러한 세포를 CpG 면역자극성 핵산, 특히 C 클래스의 면역자극성 핵산에 노출시킴으로써 이들의 기능이 회복된다는 것을 입증하고 있다. 일부 실시양태에서는, C 클래스의 면역자극성 핵산이 본원에 보다 상세히 기재된 바와 같이 "소프트(soft)" 또는 "세미-소프트(semi-soft)" 변이체인 것이 또한 바람직하다. 일부 바람직한 실시양태에서, CpG 면역자극성 핵산은 세미-소프트 C 클래스 핵산이다.

다른 측면에서는, CpG 면역자극성 핵산을, 바람직하게는 HCV 치료에 대해 상기에 기재한 것들을 포함하는 활성제와 병용한다. CpG 면역자극성 핵산을 인터페론-α (예를 들어, 인트론 A)과 함께 사용하는 것이 특히 중요하다. 본 발명의 CpG 면역자극성 핵산과 병용할 수 있는 인터페론에는, 인터페론-알파-2b, 인터페론-알파-2a 또는 컨센서스 인터페론 알파가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 다른 항바이러스제가 본원에 기재되어 있다. 임의의 CpG 클래스를 이러한 조합에 사용할 수 있다. 일례로, 본 발명에 따라 예상외로, 외부에서 투여된 인터페론-α는 상기와 같은 대상체를 성공적으로 치료하지 못하나, CpG 면역자극성 핵산과 병용하는 경우 치료학적으로 효능을 갖게 된다는 것을 발견하였다. 일부 실시양태에서, CpG 면역자극성 핵산은 C 클래스의 면역자극성 핵산이다. 일부 바람직한 실시양태에, CpG 면역자극성 핵산은 세미-소프트 C 클래스 핵산이다.

CpG 핵산 및 항바이러스제 (예를 들어, 인터페론-알파)의 투여 시간은 대상체 및 감염의 중증도에 따라 달라질 수 있다. CpG 핵산은 CpG 면역자극성 핵산과 실질적으로 동시에 투여할 수 있다. 이것은 두 제제를 투여 전에 조합할 수 있거나, (예를 들어, 두 제제를 모두 대상체의 정맥내 경로로 공급함으로써) 투여 과정 중에 조합할 수 있거나, 또는 대상체에게 두 제제의 투여를 수행하는 일정 시간 (예를 들어, 대상체에게 2회 주사하는 시간)내에 별도로 투여할 수 있음을 의미한다. 제제를 실질적으로 동시에 투여하는지 또는 시차를 두고 투여하는지에 관계 없이, 순서는 변할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서는 CpG 면역자극성 핵산을 IFN-알파와 같은 항바이러스제의 투여 전에 투여할 수 있으나, 다른 실시양태에서는 CpG 면역자극성 핵산을 항바이러스제 투여 후에 투여할 수 있다.

CpG 핵산을 다른 항바이러스제 (예를 들어, IFN-알파)와 함께 사용하는 경우, 이들 화합물은 치료학적으로 유효한 조합된 양으로 투여할 수 있다. 따라서, 둘 중 어느 한 화합물의 양이 치료학적 양 미만 또는 치료학적 양 초과의 양 (즉, 단독으로 투여한 경우의 치료학적 유효량 미만 또는 초과의 양)일 수 있다. 별법으로, 화합물을 각각 치료학적 양으로 투여할 수 있으나, 이들 제제의 병용에 의해 부작용 감소 등의 치료학적 이점이 제공된다. 바람직한 실시양태에서, 항바이러스제가 IFN-알파인 경우, 이것을 치료학적 양으로 투여한다. 실제 투여량에 관계 없이, 제제의 병용은 상승작용적일 수 있다. 상승작용적 반응은 제제의 병용에 의해 기대되는 상가적 반응을 초과하는 반응이다.

또다른 측면에서, 그리고 상기에 기재한 바에 일치되게, 본 발명은 HCV에 임상적으로 감염되었으며, 비-CpG 치료법으로 성공적으로 치료되지 않았거나 비-CpG 치료법에 대해 비-반응자일 가능성이 있는 대상체로부터 단리된 면역 세포를 자극하는 능력에 대해 CpG 핵산을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 상기 스크리닝 방법은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 CpG 면역자극성 핵산과 면역 반응 자극에 충분한 유효량으로 접촉시킴으로써 시험관내에서 수행한다. IFN-알파 생성, B 세포 자극, IL-6, IL-10, IL-12, 인터페론-감마, 제1형 인터페론 (알파 + 베타) 등의 사이토카인 분비, IP-10 등의 케모카인 분비, NK 활성, 공동자극성 분자 (예를 들어, CD80, CD86) 및 성숙 분자 (예를 들어, CD83)의 발현, 및 클래스 II MHC 발현의 상향조절을 비롯한 면역 반응은 임의의 수의 마커에 의해 측정할 수 있다.

일부 중요한 실시양태에서, 면역 세포는 수상 세포이고, 바람직하게는 형질세포양 수상 세포 (pDC)이며, 면역 반응 마커는 이 세포 형태에 대해 특이적이다. 이들은 공동자극성 분자 (예를 들어, CD80 및 CD86)의 발현, 성숙 분자 (예를 들어, CD83)의 발현 및(또는) IL-12 및 제1형 인터페론 (알파 + 베타)의 분비, 및 클래스 II MHC 발현의 상향조절을 포함하나 이들로 한정되지는 않는다. 이들 시험관내 분석은 나머지 PBMC로부터 pDC 등의 수상 세포를 단리시키는 것에 좌우되지 않는다는 것을 이해한다. 반대로 분석은 PBMC의 균질 집단에서 수행될 수 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 CpG 면역자극성 핵산으로 치료할, 만성 C형 간염 바이러스에 감염된 대상체를 식별하는 방법을 제공한다. 이 방법은 만성 C형 간염 바이러스에 감염된 대상체로부터 회수한 말초 혈액 단핵 세포를 i) CpG 면역자극성 핵산, ii) CpG 면역자극성 핵산 및 항바이러스제 (예를 들어, 인터페론-알파)에 노출시킨 후, 말초 혈액 단핵 세포의 반응을 측정하는 것을 포함한다. CpG 면역자극성 핵산에 대한 반응은, 대상체가 비-CpG 치료법에 이어 또는 이를 대신하여 (상기와 동일하나, 비-CpG 치료법에 대해 반응할 가능성이 낮은 대상체를 식별한 후에 행함) CpG 면역자극성 핵산으로 치료될 수 있음에 대한 지표이다. 항바이러스제 (예를 들어, 인터페론-알파)를 함께 갖는 CpG 면역자극성 핵산에 대한 반응은 CpG 면역자극성 핵산 단독에 대한 반응보다 크며, 이러한 반응은 대상체가 상기 조합으로 치료될 수 있음에 대한 지표이다. 본원에 기재된 바와 같이, 항바이러스제는 인터페론-알파-2b, 인터페론-알파-2a 또는 컨센서스 인터페론-알파를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는 인터페론-알파일 수 있다. 바람직하게는, 말초 혈액 단핵 세포는 형질세포양 수상 세포 등의 수상 세포를 포함한다. 본 발명은 스크리닝 분석 결과에 따라, CpG 면역자극성 핵산을 단독으로 또는 항바이러스제 (예를 들어, IFN-알파)와 병용하여, 기재된 바와 같이 식별된 대상체의 치료를 더 포함한다. 임상 전략은 이러한 핵산을 국소 및 전신 생체내 투여하는 것 뿐만 아니라, 비반응성 HCV 감염 대상체로부터 단리시킨 pDC가 시험관내에서 면역자극성 핵산으로 활성화되고, 국소 또는 전신적으로 환자에게 다시 주입되는 생체외 전략도 포함한다. 이들 치료 전략은 다른 성장 인자 (IL-3, GM-CSF, flt3-리간드 등) 뿐만 아니라, 다른 자극제 (초항원, 바이러스 산물)와의 조합물을 포함할 수 있다. 천연 IFN-α는 12개가 넘는 개별 유전자 산물의 족이고, 이들의 각 산물들은 특유한 활성 프로파일을 갖기 때문에, 천연 인터페론의 임상학적 사용은 단일 재조합 IFN-α 유전자로부터 유도된 재조합 IFN-α에 비해 바람직할 수 있다.

본 발명은 C형 간염에 감염된 대상체로부터 pDC를 활성화시키는 방법을 더 제공한다. 본 발명은 이러한 치료를 필요로 하는 대상체로부터 pDC를 단리하고, 단리된 pDC를 시험관내 배양하고, 시험관내에서 pDC를 단리된 면역자극성 핵산의 유효량과 접촉시키고, 접촉시킨 세포를 대상체로 복귀시키는 것을 포함한다. 또한, 세포는 시험관내에서 성장 인자 또는 사이토카인과 접촉할 수 있다. 본 발명의 이 측면에 따라 IFN-α로 치료할 것이 요구되는 면역자극성 핵산 및 조건은 상기와 같다.

IFN-알파 자체는 12개가 넘는 관련된 동종 단백질 (이소형, 하기 표 A 참조)의 족을 나타내며, 각각은 특유한 유전자에 의해 코딩되고 각각 특유한 활성 프로파일을 나타낸다. 바이러스 상에서 상이한 알파-인터페론 종의 활성은 20배 이상 크게 다를 수 있다. 임상학적 사용시 IFN-알파 산물은 재조합 단백질 또는 단일 이소형의 고도로 정제된 천연 단백질이다. 미국에서, IFN-α는 재조합 인간 IFN-α2a (ROFERON-A), 재조합 인간 IFN-α2b (INTRON A) 및 정제된 천연 IFN-αn3 (ALFERON N)으로 입수가능하다. 또한 미국 외에서, IFN-α는 정제된 천연 IFN-αn1 (WELLFERON)으로 입수가능하다.

인간 IFN-α 족

본 발명의 몇몇 방법에는 IFN-α의 존재를 검출하는 것을 비롯한 면역 반응의 측정이 필요하다. IFN-α에 대한 분석은 당업계에 널리 알려져 있다. 이들은 직접 시험법, 예를 들어 1개 이상의 IFN-α에 대해 특이적인 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA) 및 간접 시험법, 예를 들어 NK 세포 활성/세포독성을 포함하는 기능 시험 (문헌 [Trinchieri G Adv Immunol 47:187-376 (1989)]), 및 클래스 I MHC에 대한 형광-활성화 세포 분리 (FACS) 분석에 의한 표현형 분류를 포함한다. 당업계에 알려진 추가의 구체적인 분석 방법은, IFN-α의 국소 농축 또는 국소 존재가 관심의 대상인 경우에 특히 유용할 수 있다. 이들 방법은, 예를 들어 면역 조직 화학, 핵산 혼성화 (예를 들어, 노던 블로팅), 웨스턴 블로팅, 역전사효소/중합효소 연쇄 반응 (RT/PCR) 및 제자리(in situ) RT/PCR을 포함한다. 또한, 유동세포계측 분석을 이용하여 세포내 IFN-α를 검출할 수도 있다.

일부 측면에서 본 발명은 pDC 활성화의 측정을 수반한다. pDC 활성화는 수많은 방식으로 분석될 수 있다. 이들은 IFN-α의 생성, 공동자극성 분자 (예를 들어, CD80 및 CD86)의 발현, 성숙 분자 (예를 들어, CD83)의 발현, IL-12의 발현 및 클래스 II MHC 발현의 상향조절을 포함한다. 외인성 IFN-α의 투여와는 상이하게, pDC의 활성화는 모든 IFN-α의 형태는 아니지만 다양한 형태의 IFN-α 뿐만 아니라, IFN-β와 같은 다른 제I형 IFN의 생성을 유발한다. 따라서, 일부 실시양태에서, pDC는 IFN-α를 비롯한 제I형 인터페론의 생성 능력에 의해 측정되는 바와 같이 활성화된다.

본 발명은 면역자극성 핵산을 수반하는 각종 방법을 제공한다. 면역자극성 핵산은 면역계의 세포와 접촉시 그 자체로서 면역계의 접촉 세포가 증식 및(또는) 활성화되도록 유도할 수 있는 핵산 분자이다. 접촉은 직접 또는 간접일 수 있으며, 예를 들어 면역자극성 핵산은 제1형 면역 세포를 직접 자극하여 소정의 산물을 발현시킬 수 있고, 이것은 다시 면역자극성 핵산에 노출되지 않거나 이에 대해 반응하지 않는 제2형 면역 세포를 자극할 수 있다. 면역자극성 핵산의 면역자극 효과는 면역자극성 핵산의 서열에 의해 코딩될 수 있는 임의의 산물과는 별개이다. 유사하게, 면역자극성 핵산의 면역자극 효과는 안티센스 (antisense) 기작과는 전혀 다르며, 임의의 안티센스 기작에 의해 좌우되지도 않는다.

특정한 핵산만이 면역자극성 핵산이다. 원래는, 특정한 회문구조(palindromic) 서열이 면역자극성이라고 믿었다 (문헌 [Tokunaga T et al. Microbiol Immunol 36:55-66 (1992); Yamamoto T et al. Antisense Res Dev 4:119-22 (1994)]). 추가의 연구로, 비-회문구조 서열도 특정한 서열 내에 CpG 디뉴클레오티드 (CpG 모티프)를 함유한다면 면역자극성이라는 것을 입증하였다 (문헌 [Krieg AM et al. Nature 374:546-9 (1995)]).

면역자극성 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 일반적으로, 이중 가닥 핵산 분자가 생체내에서 더 안정한 반면, 단일 가닥 핵산 분자는 면역 활성이 향상되었다. 따라서, 본 발명의 일부 측면에서는 면역자극성 핵산이 단일 가닥인 것이 바람직하고, 다른 측면에서는 면역자극성 핵산이 이중 가닥인 것이 바람직하다.

본 발명에 따라 제공되는 방법 및 산물은 CpG 올리고뉴클레오티드의 사용과 관련이 있다. CpG ODN은 대부분 (95％ 초과)의 B 세포를 증식시키고, 면역글로불린 (Ig), IL-6 및 IL-12를 분비시키며, 아팝토시스(apoptosis)로부터 보호한다. 또한, CpG ODN은 DC를 숙성시키고, 또한 DC, 단핵구 및 대식세포를 직접 활성화시켜 IFN-α/β, IL-6, IL-12, GM-CSF, 케모카인 및 TNF-α를 분비시킨다. 이들 사이토카인은 천연 킬러 (NK) 세포를 자극하여 IFN-γ를 분비시키고, 용해 활성이 높다. 총괄적으로, CpG는 Th2 사이토카인을 거의 분비하지 않는, IL-12 및 IFN-γ가 대부분인 강한 Th1-유사 사이토카인 생성 패턴을 유도한다.

고유의 면역 반응 유도 이외에도, CpG DNA는 (i) B 세포 항원 수용체를 통해 유발되는 B 세포 신호 전달 경로와 CpG에 의한 B 세포 신호 전달 경로 사이의 강한 상승 작용, (ii) B 세포 및 T 세포 항원-특이적 반응 모두를 증강시키는 항원-특이적 T-조력(T-help)을 대체하거나 증강시키는 Th1-유사 사이토카인, 및 (iii) 세포 반응에 요구되는 공동자극성 분자의 상향조절로 인한 항원-특이적 반응을 증강시킨다.

CpG ODN은 명확한 Th1-유사 반응 (주로 IgG2a 항체 및 강한 CTL)을 나타내는 BALB/c 마우스에서 HBsAg에 대한 효력있는 면역보강제인 것으로 드러났다 (49). CpG ODN은 모노포스포릴 지질 A (MPL, 코릭사사 (Corixa)) 등의 기타 Th1 면역보강제, 또는 인체에 사용하기에는 독성이 지나치게 강한 완전 프로인트(Freund) 면역보강제 (CFA)보다 우수하다는 것이 발견되었다. 다른 각종 항원을 갖는 CpG ODN을 사용하여 유사한 결과를 얻었음이 보고되었다 (47, 50-53). 또한, CpG ODN은 Th2 항원 (즉, 주혈흡충증 표면 항원) (54) 또는 Th2 면역보강제 (즉, 알룸(alum))로의 면역화에 의해 미리 확립된 Th2 반응을 다시 유도한다는 것이 보고되었다.

건강한 인간 PBMC를 자극하는데 효과적인 것으로 나타난 3종 이상의 CpG ODN 기본 클래스가 있다 (표 1). 이들은 CpG ODN이 면역 세포를 자극할 수 있는 상이한 방법과 관련되어 있을 수 있는 차등적인 효과를 나타낸다.

B 클래스의 CpG ODN은 뉴클레아제 내성 포스포로티오에이트 골격으로 합성되고, 일반적으로 B-세포 및 DC의 양호한 활성화로 IL-12 및 항체를 생성하게 하는 것을 특징으로 하지만, NK 세포 활성화는 제한적이다. 이러한 ODN 클래스는 시판되는 B형 간염 백신에 대한 면역보강제로서 이미 상 Ⅰ/Ⅱ 임상 시험용 CpG (상기 클래스의 구성원) (서열 2)에서 증명된 바와 같이, 백신 면역보강제로서 잘 작용한다 (60).

A 클래스의 CpG ODN은 5' 및 3' 말단이 포스포로티오에이트이고, 중앙 CpG 모티프 영역이 포스포디에스테르인 키메라 골격으로 합성된다. 상기 ODN은 NK 세포 및 DC의 양호한 활성화로 IFN-α를 보다 많이 생성하게하는 특징이 있지만, B-세포 활성화는 제한적이다.

C 클래스의 CpG ODN은 포스포로티오에이트 골격으로 합성되고, CpG ODN의 다른 2종의 클래스에 대해 중간 정도의 자극성을 나타낸다 (예를 들어, NK 세포 및 DC의 활성화 뿐만 아니라 B-세포의 활성화에도 양호함).

CpG ODN의 3종의 상이한 클래스에 의해 유도된 시험관내 면역 활성화 패턴
클래스	골격	B-세포	천연 킬러 세포	수상 세포	IFN-α
A	SOS2	+	++++	++++	++++
B	S1	++++	++	++++	+
C	S1	+++	+++	+++	+++
1S-ODN은 포스포로티오에이트 골격으로 이루어져 있다.2SOS-ODN은 중앙 CpG-함유 영역이 포스포디에스테르 결합을 갖고, ODN의 3' 및 5' 말단이 포스포로티오에이트 결합으로 이루어진 키메라 골격으로 이루어져 있다.

본 발명의 방법은 A 클래스, B 클래스 및 C 클래스의 CpG 면역자극성 핵산의 사용을 포함한다. CpG 핵산에 대해서는, CpG 핵산의 상이한 클래스가 있다는 것이 최근에 기술되었다. 하나의 클래스는 B 세포의 활성화에 효능이 있지만, IFN-α 및 NK 세포 활성화의 유도에 상대적으로 약한데; 이 클래스는 B 클래스라고 칭해져 있다. B 클래스의 CpG 핵산은 전형적으로 완전히 안정화되고, 특정 바람직한 염기 서열 내의 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다 (예컨대, 미국 특허 제6,194,388호; 동 제6,207,646호; 동 제6,214,806호; 동 제6,218,371호; 동 제6,239,116호; 및 동 제6,339,068호 참조). 또다른 클래스는 IFN-α 및 NK 세포 활성화를 유도하지만, B 세포 활성화에 상대적으로 약한데; 이 클래스는 A 클래스라 칭해져 있다. A 클래스의 CpG 핵산은 전형적으로 5' 및 3' 말단에서 안정화된 폴리-G 서열 및 6개 이상의 뉴클레오티드의 회문구조 포스포디에스테르 CpG 디뉴클레오티드-함유 서열을 가진다 (예를 들어, 공개된 특허 출원 PCT/US00/26527 (WO 01/22990) 참조). CpG 핵산의 또다른 클래스는 B 세포 및 NK 세포를 활성화시키고, IFN-α를 유도하는데; 이 클래스를 C-클래스라 칭하고 있다. 최초에 특성화된 C-클래스의 CpG 핵산은 전형적으로 완전히 안정화되어 있고, B 클래스-유형 서열 및 GC-풍부 회문구조 또는 거의-회문구조를 포함한다. 이 클래스는 2001년 8월 17일자로 제출한 미국 가출원 제60/313,273호 및 2002년 8월 19일자로 제출한 미국 제10/224,523호에 설명되어 있으며, 이들의 내용 전체는 이 거명을 통해 본원에 참고로 포함된다.

"A 클래스"의 CpG 면역자극성 핵산은 2000년 9월 27일자로 제출한 미국 정식 특허 출원 일련 번호 제09/672,126호 및 공개된 PCT 출원 PCT/US00/26527 (WO 01/22990)에 설명되어 있다. 상기 핵산은 B 세포 활성화에 최소한의 효능을 갖지만, 인터페론-알파의 높은 수준을 유도하는 능력을 특징으로 한다. A 클래스의 CpG 면역자극성 핵산은 야마모또(Yamamoto) 등의 문헌 [Yamamoto S et al. J Immunol 148: 4072-6 (1992)]에 기재된 6개 뉴클레오티드의 회문구조인 GACGTC, AGCGCT 또는 AACGTT를 반드시 함유하는 것은 아니다.

A 클래스의 면역자극성 핵산 서열의 예는 2000년 9월 27일자로 제출한 미국 정식 특허 출원 일련 번호 제09/672,126호 및 공개된 PCT 출원 PCT/US00/26527 (WO 01/22990)에 설명되어 있다.

B 클래스의 CpG 면역자극성 핵산은 인간 B 세포를 강하게 활성화하지만, 인터페론-α를 유도하는 효과는 최소이다. B 클래스의 CpG 면역자극성 핵산은 각각 2001년 2월 27일 및 2001년 5월 29일에 등록된 미국 특허 제6,194,388 B1호 및 동 제6,239,116 B1호에 설명되어 있다.

본 발명의 CpG 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. 하나 이상의 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 메틸화되지 않은 시토신-구아닌 디뉴클레오티드 서열 (즉, 5' 시토신에 뒤따르는 3' 구아닌을 함유하고, 포스페이트 결합에 의해 연결된 "CpG DNA" 또는 DNA)을 함유하고, 면역계를 활성화하는 핵산 분자이다. CpG 올리고뉴클레오티드의 전부 또는 일부가 메틸화되지 않을 수 있지만, 5' CG 3' 중 하나 이상의 C는 메틸화되지 않아야 한다. CpG 올리고뉴클레오티드 또는 CpG 핵산이라는 용어는 본원에서 사용될 때 달리 언급하지 않는 한 면역자극성 CpG 올리고뉴클레오티드 또는 핵산을 나타낸다.

한 실시양태에서, 본 발명은 적어도 하기의 식으로 나타내는 B 클래스의 CpG 올리고뉴클레오티드를 제공한다.

5' X₁X₂CGX₃X₄ 3'

식 중, X₁, X₂, X₃ 및 X₄는 뉴클레오티드이다. 한 실시양태에서, X₂는 아데닌, 구아닌, 또는 티민이다. 다른 실시양태에서, X₃은 시토신, 아데닌, 또는 티민이다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 적어도 하기의 식으로 나타내는 단리된 B 클래스의 CpG 올리고뉴클레오티드를 제공한다.

5' N₁X₁X₂CGX₃X₄N₂ 3'

식 중, X₁, X₂, X₃ 및 X₄는 뉴클레오티드이고, N은 임의의 뉴클레오티드이고, N₁ 및 N₂는 각각 약 0 내지 25 개의 뉴클레오티드로 이루어진 핵산 서열이다. 한 실시양태에서, X₁X₂는 GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, TpT 및 TpG로 이루어진 군으로부터 선택되는 디뉴클레오티드이고, X₃X₄는 TpT, ApT, TpG, ApG, CpG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA 및 CpA로 이루어진 군으로부터 선택되는 디뉴클레오티드이다. 바람직하게는 X₁X₂는 GpA 또는 GpT이고, X₃X₄는 TpT이다. 다른 실시양태에서, X₁ 또는 X₂ 또는 둘 모두는 퓨린이고, X₃ 또는 X₄ 또는 둘 모두는 피리미딘이거나, 또는 X₁X₂는 GpA이고, X₃ 또는 X₄ 또는 둘 모두는 피리미딘이다. 다른 바람직한 실시양태에서, X₁X₂는 TpA, ApA, ApC, ApG 및 GpG로 이루어진 군으로부터 선택되는 디뉴클레오티드이다. 또다른 실시양태에서, X₃X₄는 TpT, TpA, TpG, ApA, ApG, GpA 및 CpA로 이루어진 군으로부터 선택되는 디뉴클레오티드이다. 또다른 실시양태에서, X₁X₂는 TpT, TpG, ApT, GpC, CpC, CpT, TpC, GpT 및 CpG로 이루어진 군으로부터 선택되는 디뉴클레오티드이고, X₃은 A 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드이고, X₄는 뉴클레오티드이지만, 여기서, X₁X₂가 TpC, GpT 또는 CpG일 때, X₃X₄는 TpC, ApT 또는 ApC가 아니다.

또다른 바람직한 실시양태에서, CpG 올리고뉴클레오티드는 서열 5' TCN₁TX₁X₂CGX₃X₄ 3' (서열 26)을 갖는다. 몇몇 실시양태에서 본 발명의 CpG 올리고뉴클레오티드는 GpT, GpG, GpA 및 ApA로 이루어진 군으로부터 선택되는 X₁X₂, 및 TpT, CpT 및 TpC로 이루어진 군으로부터 선택되는 X₃X₄를 포함한다.

본 발명의 B 클래스 CpG 핵산 서열은 상기에서 다양하게 기재된 것들 뿐만 아니라 PCT 공개된 특허 출원 PCT/US95/01570 및 PCT/US97/19791, 및 각각 2001년 2월 27일 및 2001년 5월 29일에 등록된 미국 특허 제6,194,388 B1호 및 동 제6,239,116 B1호에서 개시된 것들이 있다. 서열의 예로 이들 출원 및 특허에 개시된 것들을 들 수 있지만, 여기에만 제한되지는 않는다.

C 클래스의 면역자극성 핵산은 면역계 세포에 대해 독특하고 바람직한 자극 효능을 갖는 2종 이상의 구별되는 모티프를 함유한다. 이들 ODN 중 몇몇은 고전적인 "자극성" CpG 서열 및 "GC-풍부" 또는 "B-세포 중화" 모티프 둘 모두를 갖는다. 상기의 조합 모티프 핵산은, B 세포 활성화 및 수상 세포 (DC) 활성화의 강력한 유도인자인 고전적인 "클래스 B"의 CpG ODN과 관련한 효능과, IFN-α 및 천연 킬러 (NK) 세포 활성화의 강력한 유도인자이지만 B-세포 및 DC 활성화에는 상대적으로 불량한 유도인자인 보다 최근에 기재된 면역자극성 핵산 클래스 ("클래스 A"의 CpG ODN)와 관련한 효능 사이에 속하는 감소된 면역 자극 효능을 갖는다 [Krieg AM et al. (1995) Nature 374: 546-9; Ballas ZK et al. (1996) J Immunol 157: 1840-5; Yamamoto S et al. (1992) J. Immunol 148: 4072-6]. 바람직한 클래스 B의 CpG ODN은 종종 포스포로티오에이트 골격을 갖고, 바람직한 클래스 A의 CpG ODN은 혼합된 또는 키메라 골격을 갖지만, 조합 모티프 면역자극성 핵산의 C 클래스는 안정화된, 예컨대 포스포로티오에이트, 키메라, 또는 포스포디에스테르 골격을 가질 수 있고, 일부 바람직한 실시양태에서는 세미-소프트 골격을 갖는다.

한 측면에서, 본 발명은 이러한 새로운 유형의 조합 모티프 면역-자극성 핵산에 속하는 면역 자극성 핵산을 제공한다. B 세포 자극성 도메인은 식 5' X₁DCGHX₂ 3'으로 정의된다. D는 C 이외의 뉴클레오티드이다. C는 시토신이다. G는 구아닌이다. H는 G 이외의 뉴클레오티드이다.

X₁ 및 X₂는 길이가 0 내지 10개의 뉴클레오티드인 임의의 핵산 서열이다. X₁은 CG를 포함할 수 있으며, 이 경우 바람직하게는 이 CG의 바로 앞에 T가 존재한다. 일부 실시양태에서, DCG는 TCG이다. X₁의 길이는 바람직하게는 0 내지 6개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, X₂는 폴리 G 또는 폴리 A 모티프 중 어느 것도 함유하지 않는다. 다른 실시양태에서, 면역자극성 핵산은 5' 말단 또는 3' 말단에서 폴리-T 서열을 갖는다. 본원에서 사용된 "폴리-A" 또는 "폴리-T"는 각각 4개 이상의 연속적인 A 또는 T의 스트레치, 예를 들어 5' AAAA 3' 또는 5' TTTT 3'을 의미한다.

본원에서 사용된 "폴리-G 말단"은 4개 이상의 연속적인 G의 스트레치, 예를 들어 5' GGGG 3'을 의미하는데, 이는 핵산의 5' 말단 또는 3' 말단에 존재한다. 본원에서 사용된 "폴리-G 핵산"은 식 5' X₁X₂GGGX₃X₄ 3'을 갖는 핵산을 의미하며, 여기서 X₁, X₂, X₃ 및 X₄는 뉴클레오티드이고 바람직하게는 X₃ 및 X₄ 중 하나 이상이 G이다.

상기 식 하에 B 세포 자극성 도메인에 대한 바람직한 특정 디자인은 TTTTTCG, TCG, TTCG, TTTCG, TTTTCG, TCGT, TTCGT, TTTCGT 및 TCGTCGT를 포함한다.

핵산의 제2 모티프는 P 또는 N으로 지칭하며, X₁에 대해 바로 5'측 또는 X₂에 대해 바로 3'측에 위치한다.

N은 CGG 트리뉴클레오티드로 시작하는 B-세포 중화 서열로서 그 길이는 10개 이상의 뉴클레오티드이다. B-세포 중화 모티프는 CG가 C의 뒤 또는 G의 앞에 있는 1개 이상의 CpG 서열을 포함하거나 [Krieg AM et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:12631-12636], 또는 CG 중 C가 메틸화된 CG 함유 DNA 서열이다. 본원에서 사용된 "CpG"는 5' 시토신 (C) 뒤에 3' 구아닌 (G)이 존재하여 인산 결합에 의해 연결되어 있는 것을 의미한다. 5' CG 3' 중 1개 이상의 C는 메틸화되지 않아야 한다. 중화 모티프는, 다른 비자극 모티프 중에 존재하는 경우에는 어느 정도의 면역자극 능력을 가지나, 다른 면역자극성 모티프 중에 존재하는 경우에는 그 모티프들의 면역자극 잠재력을 감소시키는 기능을 하는 모티프이다.

P는 길이가 10개 이상의 뉴클레오티드인 서열을 함유하는 GC-풍부 회문구조이다. 본원에서 사용된 "회문구조" 및 동등하게는 "회문구조 서열"은 역반복, 즉 ABCDEE'D'C'B'A' 등의 서열을 의미하며, 여기서 A와 A', B와 B' 등은 일반적인 왓슨-크릭 염기쌍을 형성할 수 있는 염기이다.

본원에서 사용된 "GC-풍부 회문구조"는 2/3 이상이 G 및 C인 염기 조성을 갖는 회문구조를 의미한다. 일부 실시양태에서, GC-풍부 도메인은 바람직하게는 "B 세포 자극성 도메인"에 대해 3'측에 있다. 10-염기 길이의 GC-풍부 회문구조의 경우, 회문구조는 8개 이상의 G 및 C를 함유한다. 12-염기 길이의 GC-풍부 회문구조의 경우, 회문구조는 또한 8개 이상의 G 및 C를 함유한다. 14-머 GC-풍부 회문구조의 경우, 회문구조 중 10개 이상의 염기가 G 및 C이다. 일부 실시양태에서, GC-풍부 회문구조는 G와 C로만 이루어진다.

일부 실시양태에서, GC-풍부 회문구조는 81％ 이상이 G 및 C인 염기 조성을 갖는다. 10-염기 길이의 GC-풍부 회문구조의 경우, 회문구조는 G와 C로만 이루어진다. 12-염기 길이의 GC-풍부 회문구조의 경우, 바람직하게는 회문구조 중 10개 이상의 염기 (83％)가 G 및 C이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 12-염기 길이의 GC-풍부 회문구조는 G 및 C로만 이루어진다. 14-머 GC-풍부 회문구조의 경우, 회문구조 중 12개 이상의 염기 (86％)가 G 및 C이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 14-염기 길이의 GC-풍부 회문구조는 G와 C로만 이루어진다. GC-풍부 회문구조 중 C는 메틸화되지 않거나 메틸화될 수 있다.

일반적으로, 이러한 도메인은 각각 3개 이상, 보다 바람직하게는 각각 4개, 가장 바람직하게는 각각 5개 이상의 C 및 G를 갖는다. 이러한 도메인에서 C 및 G의 개수는 동일할 필요가 없다. C 및 G는 이들이 자기상보적 이중나선 또는 회문구조, 예를 들어 CCGCGCGG를 형성할 수 있도록 배열되는 것이 바람직하다. 이는 A 또는 T에 의해 개재될 수 있으나, 자기상보성이 모티프 CGACGTTCGTCG (서열 __) 또는 CGGCGCCGTGCCG (서열 __) 등에서와 같이 적어도 부분적으로 보존되는 것이 바람직하다. 상보성이 보존되지 않는 경우, 비상보적 염기쌍으로는 TG가 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 회문구조의 일부가 아닌 연속적인 염기는 3개 이하, 바람직하게는 2개 이하, 가장 바람직하게는 오직 1개로 존재한다. 일부 실시양태에서, GC-풍부 회문구조는 1개 이상의 CGG 트리머, 1개 이상의 CCG 트리머 또는 1개 이상의 CGCG 테트라머를 포함한다. 다른 실시양태에서, GC-풍부 회문구조는 CCCCCCGGGGGG (서열 __) 또는 GGGGGGCCCCCC (서열 __), CCCCCGGGGG (서열 __) 또는 GGGGGCCCCC (서열 __)가 아니다.

GC 풍부 영역 중 1개 이상의 G가 이노신 (I)으로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, P는 1개 이상의 I를 포함한다.

특정 실시양태에서, 면역자극성 핵산은 하기 식 중 하나를 갖는다: 5' NX₁DCGHX₂ 3', 5' X₁DCGHX₂N 3', 5' PX₁DCGHX₂ 3', 5' X₁DCGHX₂P 3', 5' X₁DCGHX₂PX₃ 3', 5' X₁DCGHPX₃ 3', 5' DCGHX₂PX₃ 3', 5' TCGHX₂PX₃ 3', 5' DCGHPX₃ 3' 또는 5' DCGHP 3'.

다른 측면에서, 본 발명은 식 5' N₁PyGN₂P 3'으로 정의되는 면역 자극성 핵산을 제공한다. N₁은 길이가 1 내지 6개의 뉴클레오티드인 임의의 서열이다. Py는 피리미딘이다. G는 구아닌이다. N₂는 길이가 0 내지 30개의 뉴클레오티드인 임의의 서열이다. P는 길이가 10개 이상의 뉴클레오티드인 서열을 함유하는 GC-풍부 회문구조이다.

N₁ 및 N₂는 50％ 이상의 피리미딘, 보다 바람직하게는 50％ 이상의 T를 함유할 수 있다. N₁은 CG를 포함할 수 있으며, 이 경우 바람직하게는 이 CG의 바로 앞에 T가 존재한다. 일부 실시양태에서, N₁PyG는 TCG (예를 들어, 5' TCGG를 갖는 ODN 5376), 가장 바람직하게는 N₂가 G가 아닌 TCGN₂이다.

N₁PyGN₂P는 1개 이상의 이노신 (I) 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. N₁ 중 C 또는 G는 이노신으로 치환될 수 있으나, CpI가 IpG보다 바람직하다. IpG 등의 이노신 치환에 대해서는 "세미-소프트" 또는 키메라 골격을 사용함으로써 광학 활성이 달성될 수 있으며, 이때 IG 또는 CI간 결합은 포스포디에스테르이다. N₁은 1개 이상의 CI, TCI, IG 또는 TIG 모티프를 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, N₁PyGN₂는 TTTTTCG, TCG, TTCG, TTTCG, TTTTCG, TCGT, TTCGT, TTTCGT 및 TCGTCGT로 구성된 군으로부터 선택되는 서열이다.

C-클래스 핵산의 일부 비제한적인 예로는 하기 서열이 포함된다:

세포로의 흡수를 촉진하기 위해, CpG-함유 올리고뉴클레오티드를 비롯한 면역자극성 핵산의 길이는 8 내지 100개의 염기의 범위인 것이 바람직하다. 그러나, 보다 큰 핵산은 세포 내부에서 올리고뉴클레오티드로 분해되기 때문에 충분한 면역자극성 모티프가 존재한다면, 8개의 뉴클레오티드보다 큰 임의의 크기 (심지어 수 kb의 길이)의 핵산이라도 본 발명에 따른 면역 반응을 유도할 수 있다. 면역자극성 핵산의 길이는 바람직하게는 8 내지 100개의 뉴클레오티드이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 면역자극성 핵산의 길이는 12 내지 40개의 뉴클레오티드이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 면역자극성 핵산의 길이는 8 내지 30개의 뉴클레오티드이다. 가장 바람직한 실시양태에서, 면역자극성 핵산의 길이는 8 내지 24개의 뉴클레오티드이다.

"회문구조 서열"은 역반복, 즉 ABCDEE'D'C'B'A' 등의 서열을 의미하며, 여기서 A와 A', B와 B', C와 C', D와 D', 및 E와 E'는 일반적인 왓슨-크릭 염기쌍을 형성할 수 있는 염기이다. 생체내에서, 이러한 회문구조 서열은 이중-나선 구조를 형성할 수 있다. 한 실시양태에서, CpG 올리고뉴클레오티드는 회문구조 서열을 함유한다. 본 발명에서 사용되는 회문구조 서열은 CpG가 회문구조의 일부, 바람직하게는 회문구조의 중심인 회문구조를 의미한다. 다른 실시양태에서, CpG 올리고뉴클레오티드에는 회문구조가 없다. 회문구조가 없는 CpG 올리고뉴클레오티드는 CpG 디뉴클레오티드가 회문구조의 일부분이 아닌 CpG 올리고뉴클레오티드이다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 CpG가 회문구조의 중심이 아닌 회문구조를 포함할 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 "CpG 디뉴클레오티드"인 면역자극성 모티프를 포함한다. CpG 디뉴클레오티드는 메틸화되거나 메틸화되지 않을 수 있다. 1개 이상의 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는 면역자극성 핵산은 메틸화되지 않은 시토신-구아닌 디뉴클레오티드 서열 (즉, 메틸화되지 않은 5' 시티딘 뒤에 3' 구아노신이 존재하며, 인산 결합에 의해 연결됨)을 함유하며 면역계를 활성화시키는 핵산 분자이며; 이러한 면역자극성 핵산은 CpG 핵산이다. CpG 핵산은 미국 특허 제6,194,388호; 동 제6,207,646호; 동 제6,214,806호; 동 제6,218,371호; 동 제6,239,116호; 및 동 제6,339,068호를 비롯한 다수의 허여된 특허, 공개 특허 출원 및 기타 공보에 기재되어 있다. 1개 이상의 메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는 면역자극성 핵산은 메틸화된 시토신-구아닌 디뉴클레오티드 서열 (즉, 메틸화된 5' 시티딘 뒤에 3' 구아노신이 존재하며, 인산 결합에 의해 연결됨)을 함유하며 면역계를 활성화시키는 핵산이다. 다른 실시양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드에는 CpG 디뉴클레오티드가 없다. CpG 디뉴클레오티드가 없는 이러한 올리고뉴클레오티드는 비-CpG 올리고뉴클레오티드로 지칭하고, 이들은 비-CpG 면역자극 모티프를 갖는다. 따라서, 본 발명은 또한, 메틸화되거나 메틸화되지 않을 수 있는 다른 유형의 면역자극성 모티프를 갖는 핵산을 포함한다. 또한, 본 발명의 면역자극 올리고뉴클레오티드는 메틸화되거나 메틸화되지 않은 CpG 및 비-CpG 면역자극 모티프의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.

면역자극성 핵산 분자는 키메라 골격을 가질 수 있다. 본 발명의 목적상, 키메라 골격은 부분적으로 안정화된 골격을 의미하며, 여기서 1개 이상의 뉴클레오티드간(internucleotide) 결합은 포스포디에스테르 결합 또는 포스포디에스테르-유사 결합이며, 1개 이상의 다른 뉴클레오티드간 결합은 안정화된 뉴클레오티드간 결합이고, 상기 1개 이상의 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 결합과 상기 1개 이상의 안정화된 결합은 상이하다. 보라노포스포네이트 결합이 포스포디에스테르 결합에 비해 안정하다고 보고되어 왔기 때문에, 골격의 키메라 특성상 보라노포스포네이트 결합을 상황에 따라 포스포디에스테르-유사 결합 또는 안정화된 결합으로 분류할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 키메라 골격은 한 실시양태에서 1개 이상의 포스포디에스테르 (포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사) 결합 및 1개 이상의 보라노포스포네이트 (안정화된) 결합을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 키메라 골격은 보라노포스포네이트 (포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사) 및 포스포로티오에이트 (안정화된) 결합을 포함할 수 있다. "안정화된 뉴클레오티드간 결합"은 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 결합에 비해 (예를 들어, 엑소- 또는 엔도-뉴클레아제를 통한) 생체내 분해에 대해 비교적 내성인 뉴클레오티드간 결합을 의미한다. 바람직한 안정화된 뉴클레오티드간 결합으로는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트 및 메틸포스포로티오에이트가 비제한적으로 포함된다. 다른 안정화된 뉴클레오티드간 결합으로는 펩티드, 알킬, 데포스포 및 상기 기재된 기타의 것이 비제한적으로 포함된다.

포스포로티오에이트 등의 변형 골격은 포스포라미데이트 또는 H-포스포네이트 화학을 이용하는 자동화 기술을 이용하여 합성될 수 있다. 아릴- 및 알킬-포스포네이트는 예를 들어, 미국 특허 제4,469,863호에 기재된 바와 같이 제조될 수 있고; (미국 특허 제5,023,243호 및 유럽 특허 제092,574호에 기재된 바와 같이, 하전된 산소 잔기가 알킬화되어 있는) 알킬포스포트리에스테르는 시판되는 시약을 사용하는 자동화 고상 합성에 의해 제조될 수 있다. DNA 골격의 또다른 변형 및 치환 방법은 문헌 [Uhlmann E et al. (1990) Chem Rev 90:544; Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1:165]에 기재되어 있다. 키메라 올리고뉴클레오티드의 제조 방법 또한 공지되어 있다. 예를 들어, 울만 (Uhlmann) 등에게 허여된 특허에 이러한 기술들이 기재되어 있다.

혼합된 골격 변형 ODN은 시판되는 DNA 합성기 및 표준 포스포라미다이트 화학을 사용하여 합성될 수 있다 [F. E. Eckstein, "Oligonucleotides and Analogues-A Practical Approach" IRL Press, Oxford, UK, 1991] 및 [M. D. Matteucci and M. H. Caruthers, Tetrahedron Lett. 21, 719 (1980)]. 커플링 후, 보카쥬 (Beaucage) 시약 [R. P. Iyer, W. Egan, J. B. Regan and S. L. Beaucage, J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990)] (아세토니트릴 중 0.075 M) 또는 페닐 아세틸 디술피드 (PADS)를 사용하여 황화시킨 후에 아세트산 무수물, 테트라히드로푸란 중 2,6-루티딘 (1:1:8; v:v:v) 및 N-메틸이미다졸 (테트라히드로푸란 중 16％)로 캡핑함으로써 PS 결합을 도입한다. 포스포로티오에이트 결합이 있어야 하는 위치에서 바람직하지 않은 포스포디에스테르 (PO) 결합이 형성되는 것을 최소화시키기 위해 이러한 캡핑 단계를 황화 반응 후에 수행한다. 포스포디에스테르 결합을 도입하는 경우, 예를 들어 CpG 디뉴클레오티드에서 중간체 3가 인을 물/피리딘 중 요오드의 용액으로 처리하여 산화시킨다. 고형 지지체로부터 분해시키고 (15 시간 동안 50 ℃에서) 진한 암모니아로 처리하여 최종적으로 탈보호한 후, ODN을 NaCl-구배 (예를 들어, 완충액 A: 아세토니트릴/물 (1:4/v:v) 중 10 mM NaH₂PO₄, pH 6.8; 완충액 B: 아세토니트릴/물 (1:4/v:v) 중 1.5 M NaCl 및 10 mM NaH₂PO₄; 30 분간 1 ml/분으로 5 내지 60％ B)를 사용하는 젠-팩 팩스 (Gen-Pak Fax) 컬럼 (밀리포어-워터스사 (Millipore-Waters) 제품) 상에서 HPLC에 의해, 또는 모세관 겔 전기영동에 의해 분석한다. ODN은 소스 (Source) 고성능 컬럼 (아머샴 파마시아사 (Amersham Pharmacia) 제품) 상에서 HPLC 또는 FPLC에 의해 정제될 수 있다. HPLC-균일 분획을 합하여 C18 컬럼을 통해 또는 한외여과에 의해 탈염한다. MALDI-TOF 질량 분석에 의해 ODN을 분석하여 계산된 질량을 확인하였다.

본 발명의 핵산은 또한 다른 변형을 포함할 수 있다. 이들은 비이온성 DNA 유사체, 예를 들어 (하전된 포스포네이트 산소가 알킬기 또는 아릴기에 의해 치환되는) 알킬- 및 아릴-포스페이트, 및 하전된 산소 잔기가 알킬화되는 포스포디에스테르 및 알킬포스포트리에스테르를 포함한다. 두 말단 중 하나 또는 모두에서 테트라에틸렌글리콜 또는 헥사에틸렌글리콜 등의 디올을 함유하는 핵산은 또한 뉴클레아제 분해에 대해 실질적으로 내성인 것으로 나타났다.

일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 소프트 또는 세미-소프트 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 소프트 올리고뉴클레오티드는 부분적으로 안정화된 골격을 갖는 면역자극성 올리고뉴클레오티드이며, 이때 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 결합은 1개 이상의 내부 피리미딘-퓨린 디뉴클레오티드 (YZ)의 내부에 및 바로 인접해서만 존재한다. 바람직하게는, YZ는 YG, 즉 피리미딘-구아노신 (YG) 디뉴클레오티드이다. 1개 이상의 내부 YZ 디뉴클레오티드 그 자체는 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 결합을 갖는다. 1개 이상의 내부 YZ 디뉴클레오티드에 바로 근접하여 존재하는 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 결합은 1개 이상의 내부 YZ 디뉴클레오티드에 대해 5'측, 3'측, 또는 5'측 및 3'측 모두일 수 있다.

특히, 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 결합은 "내부 디뉴클레오티드"를 포함한다. 내부 디뉴클레오티드는 일반적으로 뉴클레오티드간 결합에 의해 연결된 인접한 뉴클레오티드들의 임의의 쌍을 의미하는데, 이때 뉴클레오티드의 쌍 중 어떠한 것도 말단 뉴클레오티드가 아니며, 즉 뉴클레오티드의 쌍 중 어떠한 것도 올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단을 한정하는 뉴클레오티드가 아니다. 따라서, 길이가 n개의 뉴클레오티드인 선형 올리고뉴클레오티드는 총 n-1개의 디뉴클레오티드 및 오직 n-3개의 내부 디뉴클레오티드를 갖는다. 내부 디뉴클레오티드 중 각각의 뉴클레오티드간 결합은 내부 뉴클레오티드간 결합이다. 따라서, 길이가 n개의 뉴클레오티드인 선형 올리고뉴클레오티드는 총 n-1개의 뉴클레오티드간 결합 및 오직 n-3개의 내부 뉴클레오티드간 결합을 갖는다. 따라서, 전략적으로 배치된 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 결합은 핵산 서열 중 뉴클레오티드의 임의의 쌍 사이에 위치한 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 결합을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 결합은 5' 또는 3' 말단에 가장 근접한 뉴클레오티드의 어느 쌍 사이에도 위치하지 않는다.

바람직하게는, 1개 이상의 내부 YZ 디뉴클레오티드에 바로 인접하여 존재하는 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 결합은 그 자체로 내부 뉴클레오티드간 결합이다. 따라서, N₁ 및 N₂가 각각 서로 독립적으로 임의의 단일 뉴클레오티드인 서열 N₁ YZ N₂의 경우, YZ 디뉴클레오티드는 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 결합을 갖고, 또한 (a) N₁이 내부 뉴클레오티드인 경우, N₁ 및 Y가 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 결합에 의해 연결되거나, (b) N₂가 내부 뉴클레오티드인 경우, Z 및 N₂가 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 결합에 의해 결합되거나, 또는 (c) N₁이 내부 뉴클레오티드인 경우, N₁ 및 Y가 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 결합에 의해 연결되고, N₂가 내부 뉴클레오티드인 경우, Z 및 N₂가 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 결합에 의해 연결된다.

본 발명에 따른 소프트 올리고뉴클레오티드는 완전히 안정화된 올리고뉴클레오티드에 비해 뉴클레아제 절단에 대해 비교적 민감하다고 생각된다. 특정 이론 또는 메카니즘으로 제한되기를 의도하는 것은 아니나, 본 발명의 소프트 올리고뉴클레오티드는 전장 소프트 올리고뉴클레오티드에 비해 면역자극 활성이 감소되었거나 없는 단편으로 절단가능하다고 생각된다. 특히 올리고뉴클레오티드의 중간 근처에 1개 이상의 뉴클레아제-민감성 뉴클레오티드간 결합을 도입함으로써, 올리고뉴클레오티드의 약동학을 변경시켜 올리고뉴클레오티드의 최대 면역자극 활성의 지속 기간을 감소시키는 "오프 스위치 (off switch)"가 제공된다고 생각된다. 이는 만성적인 국소 염증 또는 면역자극과 관련된 손상을 없애는 것이 바람직한 조직 및 임상 용도에서 (예를 들어, 신장) 특히 중요할 수 있다.

세미-소프트 올리고뉴클레오티드는 부분적으로 안정화된 골격을 갖는 면역자극성 올리고뉴클레오티드이며, 이때 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 결합은 1개 이상의 내부 피리미딘-퓨린 (YZ) 디뉴클레오티드의 내부에만 존재한다. 일반적으로, 세미-소프트 올리고뉴클레오티드는 상응하는 완전히 안정화된 면역자극성 올리고뉴클레오티드에 비해 향상된 면역자극 효능을 갖는다. 세미-소프트 올리고뉴클레오티드의 효능이 더 우수하기 때문에, 세미-소프트 올리고뉴클레오티드는 어떤 경우 원하는 생물학적 효과를 달성하기 위해 통상적인 완전히 안정화된 면역자극성 올리고뉴클레오티드보다 더 낮은 유효 농도에서 사용되고 더 낮은 유효량을 가질 수 있다.

내부 YZ 디뉴클레오티드를 포함하는 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 결합의 "용량"이 증가함에 따라 세미-소프트 올리고뉴클레오티드의 상기 특성이 일반적으로 증가된다고 생각된다. 따라서, 예를 들어 일반적으로 5개의 내부 YZ 디뉴클레오티드를 갖는 소정의 올리고뉴클레오티드 서열의 경우, 5개의 내부 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 YZ 뉴클레오티드간 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드가 4개의 내부 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 YG 뉴클레오티드간 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드보다 더 면역자극성이고, 4개의 내부 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 YG 뉴클레오티드간 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드가 또한 3개의 내부 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 YG 뉴클레오티드간 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드보다 더 면역자극성이고, 3개의 내부 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 YG 뉴클레오티드간 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드가 또한 2개의 내부 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 YG 뉴클레오티드간 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드보다 더 면역자극성이고, 2개의 내부 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 YG 뉴클레오티드간 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드가 또한 1개의 내부 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 YG 뉴클레오티드간 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드보다 더 면역자극성인 것으로 생각된다. 중요하게는, 내부 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 YZ 뉴클레오티드간 결합을 1개라도 포함하는 것이 내부 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 YZ 뉴클레오티드간 결합이 없는 것보다는 유리하다고 생각된다. 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 결합의 개수 이외에도 핵산의 길이에 따른 위치 또한 효능에 영향을 줄 수 있다.

소프트 및 세미-소프트 올리고뉴클레오티드는 바람직한 내부 위치에서 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 결합 이외에도 분해에 대해 내성인 5' 및 3' 말단을 일반적으로 포함할 것이다. 이러한 분해-내성 말단은 상응하는 비변형 말단보다 엑소뉴클레아제 절단에 대한 내성을 더 증가시키는 임의의 적합한 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 5' 및 3' 말단은 골격의 1개 이상의 포스페이트 변형을 포함함으로써 안정화될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 각 말단에서의 골격의 1개 이상의 포스페이트 변형은 독립적으로 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트 또는 메틸포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합이다. 다른 실시양태에서, 분해-내성 말단은 3' 말단에서의 펩티드 또는 아미드 결합에 의해 연결된 1개 이상의 뉴클레오티드 단위를 포함한다.

포스포디에스테르 뉴클레오티드간 결합은 자연에서 발견되는 핵산의 특징적인 결합 유형이다. 도 20에 제시된 바와 같이, 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 결합은 2개의 가교 산소 원자의 측면에 위치하면서 2개의 추가 산소 원자 (하나는 하전되어 있고, 다른 하나는 하전되어 있지 않음)에 의해 결합된 인 원자를 포함한다. 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 결합은 올리고뉴클레오티드의조직 반감기를 감소시키는 것이 중요한 경우에 특히 바람직하다.

포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 결합은 포스포디에스테르와 화학적으로 및(또는) 부분입체이성질체적으로 유사한 인-함유 가교기이다. 포스포디에스테르와의 유사성에 대한 척도로는 뉴클레아제 절단에 대한 민감성 및 RNAse H의 활성화능이 포함된다. 따라서, 예를 들어 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 모두가 RNAse H를 활성화시키지만, (포스포로티오에이트를 제외한) 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드만 뉴클레아제 절단에 대해 민감성이다. 바람직한 실시양태에서, 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 결합은 보라노포스페이트 (또는 동등하게는 보라노포스포네이트) 결합이다. 미국 특허 제5,177,198호; 동 제5,859,231호; 동 제6,160,109호; 동 제6,207,819호; 문헌 [Sergueev et al., (1998) J Am Chem Soc 120:9417-27]. 다른 바람직한 실시양태에서, 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 결합은 부분입체이성질체적으로 순수한 Rp 포스포로티오에이트이다. 부분입체이성질체적으로 순수한 Rp 포스포로티오에이트는 혼합되거나 부분입체이성질체적으로 순수한 Sp 포스포로티오에이트보다 뉴클레아제 절단에 대해 보다 민감성이고, RNAse H의 활성화에 보다 우수하다고 생각된다. CpG 올리고뉴클레오티드의 입체이성질체는 동시 계류중인 1999년 7월 27일자로 출원한 미국 특허 출원 제09/361,575호 및 공개된 PCT 출원 제PCT/US99/17100호 (WO 제00/06588호)의 주제이다. 본 발명의 목적상, 용어 "포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 결합"은 포스포로디티오에이트 및 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 결합을 특별히 배제한다는 점을 주목해야 한다.

상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 소프트 및 세미-소프트 올리고뉴클레오티드는 C와 G 사이에 포스포디에스테르 유사 결합을 가질 수 있다. 포스포디에스테르-유사 결합의 한 예로는 Rp 형태의 포스포로티오에이트 결합이 있다. 올리고뉴클레오티드 p-키랄성은 활성의 측정 시간대에 따라 CpG 올리고뉴클레오티드의 면역 활성에 뚜렷한 역효과를 줄 수 있다. 초기 시간대인 40분 경, 포스포로티오에이트 CpG 올리고뉴클레오티드의 Rp (Sp는 아님) 입체이성질체는 마우스 비장 세포에서의 JNK 인산화를 유도한다. 반대로, 후기 시간대인 44 시간 경에 분석한 경우, Sp (Rp는 아님) 입체이성질체는 비장 세포 증식을 자극하는 활성이 있다. Rp 및 Sp 입체이성질체간 역학 및 생활성의 차이는 세포 흡수에서의 특정한 차이로부터 비롯된 것이라기보다는 p-키랄성의 상반되는 두 생물학적 역할이 원인일 가능성이 가장 높다. 우선, 초기 시간대에서는 Sp에 비해 Rp 입체이성질체가 면역 세포의 자극을 위한 활성이 크다는 점은, Rp가 CpG 수용체인 TLR9와의 상호작용이나 하향 신호 전달 경로의 유도에 보다 효과적일 수 있음을 나타낸다. 한편, 후기 시간대에 시험하는 경우에는 Sp에 비해 Rp PS-올리고뉴클레오티드가 보다 빨리 분해되어 신호 전달의 지속 기간이 매우 단축되므로, Sp PS-올리고뉴클레오티드가 보다 생물학적으로 활성인 것으로 보인다.

CpG 디뉴클레오티드 자체에서의 p-키랄성에 의해 놀랍도록 강력한 효과가 달성된다. 입체-무작위 CpG 올리고뉴클레오티드와 비교하여, 단일 CpG 디뉴클레오티드가 Rp 중에 연결된 동질체는 약간 더 활성이지만, Sp 결합을 함유하는 동질체는 비장 세포 증식의 유도에 있어서 거의 불활성이다.

면역자극성 올리고뉴클레오티드의 크기 (즉, 핵산의 길이에 따른 뉴클레오티드 잔기의 수) 또한 올리고뉴클레오티드의 자극 활성에 기여할 수 있다. 세포로의 흡수를 촉진하기 위해, 면역자극성 올리고뉴클레오디드의 최소 길이는 바람직하게는 6개의 뉴클레오티드 잔기이다. 보다 큰 핵산은 세포의 내부에서 분해되기 때문에 충분한 면역자극성 모티프가 존재한다면, 6개의 뉴클레오티드보다 큰 임의의 크기 (심지어 수 kb의 길이)의 핵산이라도 본 발명에 따른 면역 반응을 유도할 수 있다. 본 발명자들은 4개의 뉴클레오티드 만큼 짧은 세미-소프트 올리고뉴클레오티드가 세포 내부로 운반될 수 있다면, 이들도 면역자극성일 수 있다고 생각한다. 본 발명에 따른 특정 바람직한 실시양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드의 길이는 4 내지 100개의 뉴클레오티드이다. 전형적인 실시양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드의 길이는 6 내지 40개의 뉴클레오티드이다. 본 발명에 따른 특정 바람직한 실시양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드의 길이는 6 내지 19개의 뉴클레오티드이다.

면역자극성 올리고뉴클레오티드의 길이는 일반적으로 4 내지 100개, 일부 실시양태에서는 10 내지 40개이다. 길이는 16 내지 24개의 뉴클레오티드일 수 있다.

용어 "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"는 또한, 염기 및(또는) 당 등에서 치환 또는 변형된 핵산 또는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 이들은, 2' 위치에서 히드록실기 이외의 저분자량의 유기기 및 5' 위치에서 포스페이트기 또는 히드록시기 이외의 저분자량의 유기기에 공유결합으로 부착되어 있는 골격 당을 갖는 핵산을 포함한다. 따라서, 변형 핵산은 2'-O-알킬화 리보스기를 포함할 수 있다. 또한, 변형 핵산은 리보스 대신에 당, 예를 들어 아라비노스 또는 2'-플루오로아라비노스를 포함할 수 있다. 따라서, 핵산은 골격 조성이 불균일해져 서로 연결된 중합체 단위들의 임의의 가능한 조합물, 예를 들어 (핵산 염기를 갖는 아미노산 골격을 갖는) 펩티드-핵산을 함유할 수 있다.

핵산은 또한, 치환 퓨린 및 피리미딘, 예를 들어 C-5 프로핀 피리미딘 및 7-데아자-7-치환 퓨린 변형 염기를 포함한다 [Wagner R W et al. (1996) Nat Biotechnol 14:840-4]. 퓨린 및 피리미딘은 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민, 5-메틸시토신, 5-히드록시시토신, 5-플루오로시토신, 2-아미노퓨린, 2-아미노-6-클로로퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 히포크산틴, 다른 천연 및 비천연 뉴클레오염기, 및 치환 및 비치환 방향족 잔기를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 기타 이러한 변형은 당업자에게 공지되어 있다.

본 발명의 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 천연 RNA 및 DNA와 비교하여, 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 가교, β-D-리보스 단위 및(또는) 천연 뉴클레오티드 염기 (아데닌, 구아닌, 시토신, 티민, 우라실)를 비롯한 다양한 화학적 변형 및 치환을 포함할 수 있다. 화학적 변형의 예는 당업자들에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Uhlmann E et al. (1990) Chem Rev 90:543; "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties ＆ Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, USA 1993; Crooke ST et al. (1996) Annu Rev Pharmacol Toxicol 36:107-129; 및 Hunziker J et al. (1995) Mod Synth Methods 7:331-417]에 기재되어 있다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 1개 이상의 변형을 가질 수 있으며, 이때 각 변형은 천연 DNA 또는 RNA로 이루어진 동일한 서열의 올리고뉴클레오티드와 비교하여, 특정한 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 가교 및(또는) 특정한 β-D-리보스 단위 및(또는) 특정한 천연 뉴클레오티드 염기 위치에 있다.

예를 들어, 본 발명은 1개 이상의 변형을 포함할 수 있는 올리고뉴클레오티드에 관한 것으로서, 이때 각 변형은

a) 변형 뉴클레오티드간 가교에 의한 뉴클레오티드의 3' 및(또는) 5' 말단에 위치한 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 가교의 치환,

b) 데포스포 가교에 의한 뉴클레오티드의 3' 및(또는) 5' 말단에 위치한 포스포디에스테르 가교의 치환,

c) 당 포스페이트 골격으로부터의 당 포스페이트 단위의 다른 단위에 의한 치환,

d) 변형 당 단위에 의한 β-D-리보스 단위의 치환, 및

e) 변형 뉴클레오티드 염기에 의한 천연 뉴클레오티드 염기의 치환

으로부터 독립적으로 선택된다.

올리고뉴클레오티드의 화학적 변형에 대한 더 자세한 예는 다음과 같다.

뉴클레오티드의 3' 및(또는) 5' 말단에 위치한 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 가교는 변형 뉴클레오티드간 가교에 의해 치환될 수 있으며, 여기서 변형 뉴클레오티드간 가교는 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, NR¹R²-포스포라미데이트, 보라노포스페이트, α-히드록시벤질 포스포네이트, 포스페이트-(C₁-C₂₁)-O-알킬 에스테르, 포스페이트-[(C₆-C₁₂)아릴-(C₁-C₂₁)-O-알킬]에스테르, (C₁-C₈)알킬포스포네이트 및(또는) (C₆-C₁₂)아릴포스포네이트 가교, (C₇-C₁₂)-α-히드록시메틸-아릴 (WO 제95/01363호 등에 개시되어 있음)로부터 선택되며, 여기서 (C₆-C₁₂)아릴, (C₆-C₂₀)아릴 및 (C₆-C₁₄)아릴은 할로겐, 알킬, 알콕시, 니트로, 시아노에 의해 임의로 치환되고, R¹ 및 R²는 서로 독립적으로 수소, (C₁-C₁₈)-알킬, (C₆-C₂₀)-아릴, (C₆-C₁₄)-아릴-(C₁-C₈)-알킬, 바람직하게는 수소, (C₁-C₈)-알킬, 바람직하게는 (C₁-C₄)-알킬 및(또는) 메톡시에틸이거나, 또는 R¹ 및 R²는 이들을 운반하는 질소 원자와 함께 O, S 및 N의 군으로부터의 추가 헤테로원자를 추가로 함유할 수 있는 5 내지 6원 헤테로시클릭 고리를 형성한다.

뉴클레오티드의 3' 및(또는) 5' 말단에 위치한 포스포디에스테르 가교는 데포스포 가교에 의해 치환되며 (데포스포 가교는 문헌 [Uhlmann E and Peyman A in "Method in Molecular Biology", Vol. 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 1993, Chapter 16, pp. 355 ff] 등에 기재되어 있음), 여기서 데포스포 가교는 예를 들어, 데포스포 가교 포름아세탈, 3'-티오포름아세탈, 메틸히드록실아민, 옥심, 메틸렌디메틸-히드라조, 디메틸렌술폰 및(또는) 실릴 기로부터 선택된다.

당 포스페이트 골격으로부터의 당 포스페이트 단위 (즉, 당 포스페이트 단위를 함께 형성하는 β-D-리보스 및 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 가교; 즉, 당 포스페이트 골격은 당 포스페이트 단위로 구성됨)는 또다른 단위에 의해 치환되는데, 이때 이 단위는 예를 들어, (문헌 [Stirchak EP et al. (1989) Nucleic Acids Res 17:6129-41] 등에 기재된 바와 같이) "모르폴리노-유도체" 올리고머를 형성하는데 적합하거나 (즉, 모르폴리노-유도체 단위에 의한 치환 등); 또는 (문헌 [Nielsen PE et al. (1994) Bioconjug Chem 5:3-7] 등에 기재된 바와 같이) 폴리아미드 핵산 ("PNA")을 형성하기에 적합하다 (즉, 2-아미노에틸글리신 등의 PNA 골격 단위에 의한 치환 등).

β-리보스 단위 또는 β-D-2'-데옥시리보스 단위는 변형 당 단위에 의해 치환될 수 있으며, 여기서 그 변형 당 단위는 예를 들어, β-D-리보스, α-D-2'-데옥시리보스, L-2'-데옥시리보스, 2'-F-2'-데옥시리보스, 2'-F-아라비노스, 2'-O-(C₁-C₆)알킬-리보스 (바람직하게는 2'-O-(C₁-C₆)알킬-리보스는 2'-O-메틸리보스임), 2'-O-(C₂-C₆)알케닐-리보스, 2'-[O-(C₁-C₆)알킬-O-(C₁-C₆)알킬]-리보스, 2'-NH₂-2'-데옥시리보스, β-D-크실로-푸라노스, α-아라비노푸라노스, 2,4-디데옥시-β-D-에리트로-헥소-피라노스, 및 (문헌 [Froehler J (1992) Am Chem Soc 114:8320] 등에 기재되어 있는) 카르보시클릭 당 유사체 및(또는) (문헌 [Vandendriessche et al. (1993) Tetrahedron 49:7223] 등에 기재되어 있는) 개방 쇄 당 유사체 및(또는) (문헌 [Tarkov M et al. (1993) Helv Chim Acta 76:481] 등에 기재되어 있는) 비시클로당 유사체로부터 선택된다.

일부 바람직한 실시양태에서, 당은 특히 포스포디에스테르 또는 포스포디에스테르-유사 뉴클레오티드간 결합에 의해 연결된 하나 또는 모두의 뉴클레오티드에 대해 2'-O-메틸리보스이다.

핵산은 또한 치환된 퓨린 및 피리미딘, 예컨대 C-5 프로핀 피리미딘 및 7-데아자-7-치환된 퓨린 변형 염기를 포함한다 [Wagner RW et al. (1996) Nat Biotechnol 14: 840-4]. 퓨린 및 피리미딘은 아데닌, 시토신, 구아닌 및 티민, 및 다른 자연 및 비-자연 발생 뉴클레오염기, 치환 및 비치환된 방향족 잔기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

변형된 염기는 DNA 및 RNA에서 전형적으로 발견되는 자연 발생 염기, 예컨대 T, C, G, A 및 U와 화학적으로 구별되는 임의의 염기이지만, 이들 자연 발생 염기가 갖는 기본 화학 구조를 가진다. 상기 변형된 뉴클레오티드 염기는 예를 들면 히포크산틴, 우라실, 디히드로우라실, 슈도우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-아미노우라실, 5-(C₁-C₆)-알킬우라실, 5-(C₂-C₆)-알케닐우라실, 5-(C₂-C₆)-알키닐우라실, 5-(히드록시메틸)우라실, 5-클로로우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-히드록시시토신, 5-(C₁-C₆)-알킬시토신, 5-(C₂-C₆)-알케닐시토신, 5-(C₂-C₆)-알키닐시토신, 5-클로로시토신, 5-플루오로시토신, 5-브로모시토신, N²-디메틸구아닌, 2,4-디아미노-퓨린, 8-아자퓨린, 치환된 7-데아자퓨린, 바람직하게는 7-데아자-7-치환 및(또는) 7-데아자-8-치환된 퓨린, 5-히드록시메틸시토신, N4-알킬시토신, 예컨대 N4-에틸시토신, 5-히드록시데옥시시티딘, 5-히드록시메틸데옥시시티딘, N4-알킬데옥시시티딘, 예컨대 N4-에틸데옥시시티딘, 6-티오데옥시구아노신, 및 니트로피롤의 데옥시리보뉴클레오티드, C5-프로피닐피리미딘, 및 디아미노퓨린, 예컨대 2,6-디아미노퓨린, 이노신, 5-메틸시토신, 2-아미노퓨린, 2-아미노-6-클로로퓨린, 히포크산틴 또는 천연 뉴클레오티드 염기의 다른 변형체로부터 선택될 수 있다. 이 목록은 실례를 의미하고, 제한하는 것으로 이해되지는 않아야 한다.

본원에 기재된 특정 식에서 변형된 염기의 세트가 정의된다. 예를 들면, 문자 Y는 시토신 또는 변형된 시토신을 함유한 뉴클레오티드를 칭하는데 사용된다. 본원에 사용된 변형된 시토신은 올리고뉴클레오티드의 면역자극 활성의 손상 없이 이 염기를 치환할 수 있는 시토신의 자연 발생 또는 비-자연 발생 피리미딘 염기 유사체이다. 변형된 시토신은 5-치환된 시토신 (예컨대, 5-메틸-시토신, 5-플루오로-시토신, 5-클로로-시토신, 5-브로모-시토신, 5-요오도-시토신, 5-히드록시-시토신, 5-히드록시메틸-시토신, 5-디플루오로메틸-시토신, 및 비치환된 또는 치환된 5-알키닐-시토신), 6-치환된 시토신, N4-치환된 시토신 (예컨대, N4-에틸-시토신), 5-아자-시토신, 2-메르캅토-시토신, 이소시토신, 슈도-이소시토신, 시토신 유사체 (축합된 고리계를 가짐) (예컨대, N, N'-프로필렌 시토신 또는 페녹사진), 및 우라실 및 그의 유도체 (예컨대, 5-플루오로-우라실, 5-브로모-우라실, 5-브로모비닐-우라실, 4-티오-우라실, 5-히드록시-우라실, 5-프로피닐-우라실)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 시토신의 일부는 5-메틸-시토신, 5-플루오로-시토신, 5-히드록시-시토신, 5-히드록시메틸-시토신 및 N4-에틸-시토신을 포함한다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, 시토신 염기는 보편적인 염기 (예컨대, 3-니트로피롤, P-염기), 방향족 고리계 (예컨대, 플루오로벤젠 또는 디플루오로벤젠) 또는 수소 원자 (dSpacer)에 의해 치환된다.

문자 Z는 구아닌 또는 변형된 구아닌 염기를 칭하는데 사용된다. 본원에 사용된 변형된 구아닌은 올리고뉴클레오티드의 면역자극 활성의 손상 없이 이 염기를 치환할 수 있는 구아닌의 자연 발생 또는 비-자연 발생 퓨린 염기 유사체이다. 변형된 구아닌은 7-데아자구아닌, 7-데아자-7-치환된 구아닌 (예컨대, 7-데아자-7-(C₂-C₆)알키닐구아닌), 7-데아자-8-치환된 구아닌, 히포크산틴, N2-치환된 구아닌 (예컨대, N2-메틸-구아닌), 5-아미노-3-메틸-3H,6H-티아졸로[4,5-d]피리미딘-2,7-디온, 2,6-디아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 퓨린, 인돌, 아데닌, 치환된 아데닌 (예컨대, N6-메틸-아데닌, 8-옥소-아데닌) 8-치환된 구아닌 (예컨대, 8-히드록시구아닌 및 8-브로모구아닌), 및 6-티오구아닌을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, 구아닌 염기는 보편적인 염기 (예컨대, 4-메틸-인돌, 5-니트로-인돌 및 K-염기), 방향족 고리계 (예컨대, 벤즈이미다졸 또는 디클로로-벤즈이미다졸, 1-메틸-1H-[1,2,4]트리아졸-3-카르복실산 아미드) 또는 수소 원자 (dSpacer)에 의해 치환된다.

올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 접근가능 5' 말단을 가질 수 있다. 2개의 이러한 5' 말단을 갖는 변형된 올리고뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 이는 예를 들면 3'-3' 결합을 통해 2개의 올리고뉴클레오티드를 부착하여 1 또는 2개의 접근가능 5' 말단을 갖는 올리고뉴클레오티드를 생성함으로써 달성될 수 있다. 3'3'-결합은 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 또는 임의의 다른 변형된 뉴클레오티드간 가교일 수 있다. 이러한 결합을 달성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 이러한 결합은 문헌 [Seliger, H.; et al., Oligonucleotide analogs with terminal 3'-3'- and 5'-5'-internucleotidic linkages as antisense inhibitors of viral gene expression, Nucleotides ＆ Nucleotides (1991), 10 (1-3), 469-77] 및 [Jiang, et al., Pseudo-cyclic oligonucleotides: in vitro and in vivo properties, Bioorganic ＆ Medicinal Chemistry (1999), 7 (12), 2727-2735]에 기재되어 있다.

또한, 3'-말단 뉴클레오티드 사이의 결합이 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 또는 다른 변형된 가교가 아닌 3'3'-결합된 핵산은 추가 스페이스, 예컨대 트리- 또는 테트라-에틸렌글리콜 포스페이트 잔기 ([Durand, M. et al, Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one (dA) 12 and two (dT) 12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains, Biochemistry (1992), 31 (38), 9197-204], 미국 특허 제5658738호, 및 동 제5668265호)를 사용하여 제조할 수 있다. 별법으로는, 비-뉴클레오티드 링커는 표준 포스포라미다이트 화학을 사용하여 에탄디올, 프로판디올, 또는 어베이직 (abasic) 데옥시리보스 (dSpacer) 단위로부터 유도될 수 있다 ([Fontanel, Marie Laurence et al., Sterical recognition by T4 polynucleotide kinase of non-nucleosidic moieties 5'-attached to oligonucleotides; Nucleic Acids Research (1994), 22 (11), 2022-7]). 비-뉴클레오티드 링커는 1회 또는 수회, 또는 연결될 2개의 ODN의 3'-말단 사이의 임의의 바람직한 거리에 허용되는 각각의 다른 것과 조합하여 삽입될 수 있다.

본 발명에 사용하기 위해, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 당업계에 잘 공지된 다수의 임의의 방법을 사용하여 새롭게 합성할 수 있다. 예컨대 b-시아노에틸 포스포르아미다이트법 ([Beaucage, S. L., and Caruthers, M. H., Tet. Let. 22: 1859, 1981]); 및 뉴클레오티드 H-포스포네이트법 ([Garegg et al., Tet. Let. 27: 4051-4054, 1986]; [Froehler et al., Nucl. Acid. Res. 14: 5399-5407, 1986]; [Garegg et al., Tet. Let. 27: 4055-4058, 1986, Gaffney et al., Tet. Let. 29: 2619-2622, 1988])이 있다. 이들 화학반응은 시판되는 다양한 자동화 핵산 합성기로 수행할 수 있다. 이들 올리고뉴클레오티드를 합성 올리고뉴클레오티드라 칭한다. 단리된 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 자연 상태에서라면 보통 결합되어 있을 성분들로부터 분리되어 있는 올리고뉴클레오티드를 말한다. 예로서, 단리된 올리고뉴클레오티드는 세포, 핵, 미토콘드리아 또는 염색질로부터 분리되어 있는 것일 수 있다.

올리고뉴클레오티드는 분해에 부분적으로 내성이다 (예컨대, 안정화됨). "안정화된 올리고뉴클레오티드 분자"는 생체내 분해 (예를 들어, 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제를 통해)에 대해 비교적 내성인 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 핵산 안정화는 골격 변형을 통해 달성될 수 있다. 포스포로티오에이트 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드는 최대 활성을 제공하고, 세포내 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제에 의한 분해로부터 올리고뉴클레오티드를 보호한다. 다른 변형된 올리고뉴클레오티드는 포스포디에스테르 변형 핵산, 포스포디에스테르 핵산과 포스포로티오에이트 핵산의 조합물, 메틸포스포네이트, 메틸포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, p-에톡시, 및 이들의 조합물을 포함한다.

포스포로티오에이트와 같은 변형 골격은 포스포라미데이트 또는 H-포스포네이트 화학물질을 사용하는 자동화 기술을 이용하여 합성할 수 있다. 아릴- 및 알킬-포스포네이트는 예를 들어, 미국 특허 제4,469,863호에 기재된 바와 같이 제조할 수 있고; 알킬포스포트리에스테르 (하전된 산소 잔기가 미국 특허 제5,023,243호 및 유럽 특허 제092,574호에 기재된 바와 같이 알킬화되어 있음)는 상업적으로 입수가능한 시약을 사용하여 자동화 고상 합성에 의해 제조할 수 있다. 다른 DNA 골격 변형체 및 치환체를 제조하는 방법은 문헌 (예컨대, 문헌 [Uhlmann, E. and Peyman, A., Chem. Rev. 90: 544, 1990; Goodchild, J., Bioconjugate Chem. 1: 165, 1990])에 기재되어 있다.

다른 안정화된 올리고뉴클레오티드는 비이온성 DNA 유사체, 예컨대 알킬- 및 아릴-포스페이트 (여기서, 하전된 포스포네이트 산소는 알킬 또는 아릴 기에 의해 치환됨), 포스포디에스테르 및 알킬포스포트리에스테르 (하전된 산소 잔기는 알킬화됨)를 포함한다. 두 말단 중 하나 또는 모두에서 디올, 예컨대 테트라에틸렌글리콜 또는 헥사에틸렌글리콜을 함유하는 핵산은 또한 뉴클레아제 분해에 실질적으로 내성인 것으로 나타났다.

면역자극성 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드-유사 잔기 사이에 하나 이상의 일반적이지 않은 결합을 함유할 수 있다. 일반적인 뉴클레오시드간 결합은 3'5'-결합이다. 그밖의 모든 결합은 일반적이지 않는 뉴클레오시드간 결합, 예컨대 2'5'-, 5'5'-, 3'3'-, 2'2'-, 2'3'-결합으로서 간주된다. 여기서, 명명법 2' 내지 5'는 리보스의 탄소 원자에 따라 선택된다. 그러나, 비천연 당 잔기, 예컨대 고리-확장된 당 유사체 (예를 들어, 헥사노스, 시클로헥센 또는 피라노스) 또는 비- 또는 트리시클릭 당 유사체를 사용하는 경우, 이 명명법은 단량체의 명명법에 따라 변한다. 3'-데옥시-β-D-리보피라노스 유사체 (p-DNA로도 불림)에서, 모노뉴클레오티드는 예를 들어 4'2'-결합을 통해 연결된다.

뉴클레오티드가 하나의 3'3'-결합을 함유하는 경우, 이 올리고뉴클레오티드 유사체는 2개의 연결되지 않은 5'-말단을 가질 것이다. 유사하게, 뉴클레오티드가 하나의 5'5'-결합을 함유하는 경우, 이 올리고뉴클레오티드 유사체는 2개의 연결되지 않은 3'-말단을 가질 것이다. 뉴클레오티드의 연결되지 않은 말단의 접근가능성은 이들의 수용체에 의해 보다 접근가능해질 것이다. 일반적이지 않은 결합의 두 형태 (3'3'- 및 5'5') 모두는 문헌 [Ramalho Ortigao et al. (Antisense Research and Development (1992) 2, 129-46)]에 기재되어 있고, 여기서 3'3'-결합을 갖는 올리고뉴클레이티드가 뉴클레아제에 의한 절단에 대해 향상된 안정성을 나타낸다는 것이 보고되어 있다.

상이한 유형의 결합이 올리고머를 분지화시킬 수 있는 하나의 분자와 합해질 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 한 부분이 3'3'-결합을 통해 3'-말단에서 올리고뉴클레오티드 제2 부분과 연결되고, 2'3'-결합을 통해 2'-말단에서 분자의 제3 부분과 연결되는 경우, 이는 예를 들어 3개의 5'-말단 (3'3'-, 2'3'-분지됨)을 갖는 분지된 올리고뉴클레오티드를 생성한다.

원리적으로, 올리고뉴클레오티드의 상이한 일부 사이 또는 상이한 올리고뉴클레오티드 사이의 결합은 이의 수용체에 의한 인식을 부정적으로 방해하지 않는 한, 각각 분자의 모든 일부를 통해 일어날 수 있다. 핵산의 특성에 따라, 결합은 당 잔기 (Su), 헤테로시클릭 뉴클레오염기 (Ba) 또는 인산 골격 (Ph)를 포함할 수 있다. 따라서, Su-Su, Su-Ph, Su-Ba, Ba-Ba, Ba-Su, Ba-Ph, Ph-Ph, Ph-Su 및 Ph-Ba 유형의 결합이 가능하다. 올리고뉴클레오티드가 특정한 비-뉴클레오티드 치환기에 의해 추가 변형되는 경우, 결합은 또한 올리고뉴클레오티드의 변형된 부분을 통해 일어날 수 있다. 또한, 이들 변형은 변형된 핵산, 예를 들어 PNA, LNA 또는 모르폴리노 올리고뉴클레오티드 (Morpholino Oligonucleotide) 유사체를 포함한다.

상기 결합은 바람직하게는 C, H, N, O, S, B, P 및 할로겐으로 구성되고, 3 내지 300개의 원자를 함유한다. 3개의 원자를 갖는 결합의 예는, 예를 들어 제1 뉴클레오티드의 3'-히드록시기가 제2 올리고뉴클레오티드의 3'-히드록시기에 연결된 아세탈 결합 (ODN1-3'-O-CH₂-O-3'-ODN2; 프뢸러 (Froehler) 및 매튜씨 (Matteucci))이다. 약 300개의 원자를 갖는 결합의 예는 PEG-40 (테트라콘타 폴리에틸렌글리콜)이다. 바람직한 결합은 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 보라노포스포네이트, 아미드, 에테르, 티오에테르, 아세탈, 티오아세탈, 우레아, 티오우레아, 술폰아미드, 쉬프 (Schiff) 염기 및 디술피드 결합이다. 또한, 솔루링크 바이오콘쥬게이션 시스템 (Solulink BioConjugation System; www.trilinkbiotech.com)을 사용할 수도 있다.

올리고뉴클레오티드가 2개 이상의 서열 부분으로 구성된다면, 이들 부분은 동일 또는 상이할 수 있다. 따라서, 3'3'-결합을 갖는 올리고뉴클레오티드에서, 서열은 동일 (5'-ODN1-3'3'-ODN1-5') 또는 상이 (5'-ODN1-3'3'-ODN2-5')할 수 있다. 또한, 다양한 올리고뉴클레오티드 부분 뿐만 아니라 그들을 연결하는 링커의 화학적 변형은 상이할 수 있다. 단쇄 올리고뉴클레오티드의 흡수는 장쇄 올리고뉴클레오티드의 흡수에 비해 덜 효율적인 것으로 여겨지기 때문에, 2개 이상의 단쇄 서열을 연결하면 면역 자극이 개선된다. 단쇄 올리고뉴클레오티드의 길이는 바람직하게는 2 내지 20개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 3 내지 16개의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 5 내지 10개의 뉴클레오티드이다. 결합되지 않은 2개 이상의 5'-말단을 갖는 결합된 올리고뉴클레오티드가 바람직하다.

올리고뉴클레오티드의 부분 서열은 또한 비뉴클레오티드 링커, 특히 어베이직 링커 (dSpacers), 트리에틸렌 글리콜 유닛 또는 헥사에틸렌 글리콜 유닛에 의해 결합될 수 있다. 추가로 바람직한 링커는 알킬아미노 링커, 예컨대 C3, C6, C12 아미노 링커, 및 알킬티올 링커, 예컨대 C3 또는 C6 티올 링커이다. 올리고뉴클레오티드는 또한 알킬기 또는 치환된 알킬기에 의해 더 치환될 수 있는 방향족 잔기에 의해 결합될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 더블러 (Doubler) 또는 트레블러 (Trebler) 유닛을 함유할 수 있고 (www.glenres.com), 특히 3'3'-결합을 갖는 이러한 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 다중 더블러, 트레블러, 또는 다른 멀티플러 유닛에 의한 올리고뉴클레오티드의 분지화는 본 발명의 추가의 실시양태인 덴드리머로 이어진다. 올리고뉴클레오티드는 또한 펩티드 변형 시약 또는 올리고뉴클레오티드 변형 시약으로부터 생성된 링커 유닛을 함유할 수 있다 (www.glenres.com). 또한, 이는 펩티드 (아미드) 결합에 의해 연결된 하나 이상의 천연 또는 비천연 아미노산 잔기를 함유할 수 있다.

올리고뉴클레오티드는 또한 헤테로시클릭 염기의 가교를 통해 결합될 수도 있다 (문헌 [Verma and Eckstein; Annu. Rev. Biochem. (1998) 67: 99-134; page 124]). 또한, 한 서열 부분의 당 잔기를 또다른 서열 부분의 헤테로시클릭 염기에 결합시킬 수도 있다 (문헌 [Iyer et al. Curr. Opin. Mol. Therapeutics (1999) 1: 344-358; page 352]).

상이한 올리고뉴클레오티드는 정립된 방법에 의해 합성되어, 고상 합성 동안에 온라인으로 함께 결합될 수 있다. 별법으로, 이들은 개별적인 부분 서열의 합성 후에 함께 결합될 수 있다.

"대상체"는 인간이거나, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양, 염소, 닭, 인간이 아닌 영장류 (예를 들어, 원숭이), 어류 (양식종, 예를 들어 연어), 토끼, 래트 및 마우스를 비롯한 척추 동물이다.

"바이러스에 감염된 대상체"는 바이러스에 노출되어 신체에서 급성 또는 만성 증후, 또는 감지가능한 수준의 바이러스를 갖는 대상체이다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 대상체는 만성 바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 만성 C형 간염 감염을 갖는 것이다. 본 발명의 중요한 측면으로, 대상체는 C형 간염 감염에 대한 기존의 치료법에 반응하지 않는다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 반응하지 않은 대상체는 이전에, 예를 들어 IFN-α (예를 들어, 인트론 A)를 이용하여 C형 간염 감염에 대해 치료받은 적이 있으나, 이러한 치료가 성공적이지 않았던 것이다. 본 발명은 반응하지 않은 대상체를 치료하는 것으로, 일부 예에서는 효과적인 치료법을 선별하기 위해 반응하지 않은 대상체를 식별하는 것으로 의도된다.

면역자극성 핵산은 임의의 척추 동물에서 효과적일 수 있다. 포유동물의 종에 따라 상이한 면역자극성 핵산은 최적의 면역 자극을 일으킬 수 있다. 따라서, 인간에서 최적의 자극 또는 억제를 일으키는 면역자극성 핵산은 마우스에서는 최적의 자극 또는 억제를 일으킬 수 없고, 또 그 반대일 수 있다. 당업자는 본원에 기재된(되거나) 당분야에 공지된 일반적인 분석법을 이용하여 본원에 제공된 지침에 따라 해당하는 특정한 종의 포유동물에 유용한 가장 적절한 면역자극성 핵산을 확인할 수 있다.

면역자극성 핵산은 대상체에게 직접 투여되거나, 핵산 전달 복합체와 함께 투여될 수 있다. "핵산 전달 복합체"는 표적화 수단 (예를 들어, 표적 세포 (예를 들어, pDCs 또는 B 세포)에 대한 높은 결합 친화성 및(또는) 표적 세포에 의한 세포 흡수 증가의 결과를 나타내는 분자)과 회합된 (예를 들어, 이온 결합되거나, 공유 결합되거나, 캡슐화된) 핵산 분자를 의미한다. 핵산 전달 복합체의 예로는 스테롤 (예를 들어, 콜레스테롤), 지질 (예를 들어, 양이온성 지질, 바이로좀(virosome) 또는 리포좀), 또는 표적 세포 특이적 결합제 (예를 들어, 표적 세포 특이적 수용체에 의해 인식되는 리간드)와 회합된 핵산을 들 수 있다. 바람직한 복합체는 생체내에서 충분히 안정하여서, 표적 세포에 의해 내재화되기 전의 유의한 탈커플링을 방지할 수 있다. 그러나, 복합체는 핵산이 기능적 형태로 방출되도록 세포 내에서 적절한 조건하에 분할될 수 있다.

면역자극성 핵산 또는 다른 치료제는 단독으로 (예를 들어, 염수 또는 완충액 중에서), 또는 당업계에 공지된 임의의 전달 비히클을 이용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 코크리트(cochleate); 에멀좀(emulsome); ISCOM; 리포좀; 살아있는 박테리아 벡터 (예를 들어, 살모넬라 (Salmonella), 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 바실러스 칼메테-구에린 (Bacillus Calmette-Guerin), 시겔라 (Shigella), 락토바실러스 (lactobacillus)); 살아있는 바이러스 벡터 (예를 들어, 백시니아 (Vaccinia), 아데노바이러스 (adenovirus), 허피스 심플렉스 (Herpes Simplex)); 마이크로스피어(microsphere); 핵산 백신; 중합체 (예를 들어, 카르복시메틸셀룰로스, 키토산); 중합체 고리; 프로테오좀(proteosome); 불화나트륨; 유전자도입 식물; 바이로좀; 바이러스-유사 입자와 같은 전달 비히클을 들 수 있다. 당업자라면 당업계에 공지된 다른 전달 비히클 또한 사용될 수 있다는 것을 알 것이다.

다양한 활성 화합물 중에서 선택하고, 효능, 상대적 생체 이용률, 환자 체중, 불리한 부작용의 중증도 및 바람직한 투여 방식과 같은 인자를 계측함으로써, 본원에 제공된 교시들과 조합하면, 실질적인 독성을 일으키지 않고 여전히 본원에 기재된 바와 같이 특정 대상체를 치료하는데 전적으로 효과적인 치료법이 계획될 수 있다. 임의의 특정한 적용을 위한 효과적인 양은 치료될 질병 또는 증상, 투여될 특정 면역자극성 핵산 (예를 들어, CpG 면역자극성 핵산의 클래스, 비메틸화된 CpG 모티프의 수 또는 상기 핵산의 위치, 올리고뉴클레오티드에 대한 키랄성의 정도 등), 또한 항원이 투여되는지 여부 및 이러한 항원의 종류, 대상체의 크기, 또는 질병 또는 증상의 중증도와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 당업자라면 특정 면역자극성 핵산의 효과적인 양 및(또는) 다른 치료제를 과도한 실험을 거치지 않고도 경험적으로 결정할 수 있다.

성인 인간 대상체의 경우, 본원에 기재된 면역자극성 핵산 화합물의 투여량은 전형적으로 약 50 ㎍/투여 내지 20 mg/투여, 더욱 전형적으로 약 80 ㎍/투여 내지 8 mg/투여, 가장 전형적으로 약 800 ㎍/투여 내지 4 mg/투여이다. 대상체 체중의 면에서 전형적인 투여량은 약 0.5 내지 500 ㎍/kg/투여, 더욱 전형적으로 약 1 내지 100 ㎍/kg/투여, 가장 전형적으로 약 10 내지 50 ㎍/kg/투여이다. 투여량은 투여 경로를 비롯한 인자에 따라 좌우될 것이며, 예를 들어 경구 투여의 경우에는 피하 투여의 경우보다 실질적으로 보다 많은 양이 필요할 수 있다.

본 발명의 제제는 제약상 허용되는 농도의 염, 완충제, 보존제, 상용성 담체, 보존제, 및 임의로 다른 치료 성분을 통상적으로 함유할 수 있는 제약상 허용되는 용액으로 투여된다.

면역자극성 핵산은 바이러스 감염의 치료에 유용한 것으로 당업계에 공지된 다른 제제와 함께 제공될 수 있다. 특히 중요한 것은 실시예 부분에서 입증된 바와 같이 면역자극성 핵산과 항바이러스제 (예컨대 IFN-α)의 조합으로 상승효과적인 반응을 제공하는 것이다. 면역자극성 핵산은 현재 IFN-α와 함께 투여되는 리바비린에 대한 대용물로서 사용될 수 있다. IFN-α와 조합되어 현재 사용되고 있거나 연구 중에 있는 이러한 다른 제제의 예로는 아만타딘 및 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-10, IL-12, 및 IFN-γ를 들 수 있다.

항바이러스제는 바이러스에 의한 세포 감염 또는 세포 내에서 바이러스의 복제를 방지하는 화합물이다. 바이러스 복제 과정이 숙주 세포 내에서 DNA 복제와 매우 밀접하게 관련되어 있고, 비특이적 항바이러스제가 대개 숙주에 대해 독성이기 때문에, 항박테리아 약물에 비해 항바이러스 약물이 훨씬 적다. 바이러스 감염의 과정 중 여러 단계가 항바이러스제에 의해 차단되거나 억제될 수 있다. 이러한 단계로는 숙주 세포로 바이러스의 부착 (면역글로불린 또는 결합 펩티드), 바이러스의 탈코팅 (예를 들어, 아만타딘), 번역 개시를 비롯한 바이러스 mRNA의 합성 또는 번역 (예를 들어, 인터페론, 안티센스, 및 리보자임), 바이러스 효소 (예를 들어, 비구조성 세린 프로테아제, RNA 중합효소, 역전사효소 및 헬리카제), 바이러스 RNA 또는 DNA의 복제 (예를 들어, 뉴클레오시드 유사체), 새로운 바이러스 단백질의 성숙 (예를 들어, 프로테아제 억제제, 예컨대 세린 프로테아제 억제제 BILN2061ZW (뵈링거 잉겔하임 (Boehringer Ingelheim)), 항산화제, 예컨대 리브핏 (Livfit; 미국 특허 제6,136,316호), 및 바이러스의 출아 및 방출을 들 수 있다. 다른 항바이러스제는 미국 특허 제6,130,326호 및 동 제6,440,985호, 및 공개된 미국 특허 출원 20020095033에 기재되어 있다. 리바비린 유사체는 또한 본 발명에 포함되는 항바이러스제이다.

뉴클레오티드 유사체는 뉴클레오티드와 유사하나 불완전한 또는 비정상적인 데옥시리보스기 또는 리보스기를 갖는 합성 화합물이다. 뉴클레오티드 유사체가 세포 내에 존재하면, 이들은 포스포릴화되어 바이러스 DNA 또는 RNA으로의 도입을 위해 정상 뉴클레오티드와 경쟁하는 트리포스페이트를 형성한다. 뉴클레오티드 유사체의 트리포스페이트 형태가 성장하고 있는 핵산 쇄에 도입되면, 이는 바이러스 중합효소와 비가역적으로 회합되어 쇄 종결을 일으킨다.

면역글로불린 치료법은 전형적으로 바이러스 감염의 예방에 이용되나, 순환 바이러스의 수준을 감소시키고 새로 형성된 세포가 감염되는 것을 방지하는 데에도 이용될 수 있다. 바이러스 감염에 대한 면역글로불린 치료법은 항원-특이적이라기 보다는, 세포외 비리온에 결합하여 이들 비리온이 바이러스 감염에 민감한 세포에 부착하고 그 세포 내에 들어가는 것을 방지함으로써 작용하기 때문에, 바이러스 감염에 대한 면역글로불린 치료법은 박테리아 감염의 치료법과는 상이하다. 상기 치료법은 항체가 숙주 내에 존재하는 시간 동안 바이러스혈증을 경감시키는데 유용하다. 일반적으로, 정상 면역글로불린 치료법 및 과면역글로불린 치료법의 2가지 유형의 면역글로불린 치료법이 있다. 정상 면역글로불린 치료법은 정상 혈액 공여자의 혈청으로부터 제조되어 모아진 항체 생성물을 이용한다. 이렇게 모아진 생성물은 A형 간염, 파르보바이러스, 엔테로바이러스 (특히, 신생아에서)와 같은 광범위한 인간 바이러스에 대해 낮은 역가의 항체를 함유한다. HCV에 대한 정상 면역글로불린 치료법을 이용하기 위해서는, HCV에 이미 감염되었으나 자동적으로 또는 일부 형태의 치료법에 의해 성공적으로 치유된 사람으로부터 혈청을 입수해야 한다. 과면역글로불린 치료법은 특정 바이러스에 대해 높은 역가의 항체를 갖는 개체의 혈청으로부터 제조된 항체를 이용한다. 그 후, 이들 항체는 특이적 바이러스에 대해 사용된다. HCV의 경우, 과면역글로불린은 재조합 HCV 단백질을 갖는 지원자를 백신 처리하여 C형 간염 면역글로불린을 형성함으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 방법에 적합한 다른 항바이러스는 트라이앵글 파마슈티컬즈, 인크. (Triangle Pharmaceuticals, Inc.), 길리드 (Gilead), ICN, 프록더 앤드 갬블 (Procter and Gamble) 및 비로파마 인코포레이티드 (ViroPharma Incorporated)에 의해 제작된다.

치료법에 사용되는 경우, 유효량의 면역자극성 핵산은 면역자극성 핵산을 목적하는 표면, 예를 들어 점막, 전신으로 전달하는 임의 방식에 의해 대상체에 투여될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물의 "투여"는 당업자에게 알려진 임의 방법에 의해 달성될 수 있다. 바람직한 투여 경로에는 경구, 비경구, 병변내, 국소, 경피, 근육내, 비강내, 기관내, 흡입, 안내, 질내 및 직장내 투여가 포함되지만 이에 한정되지 않는다.

경구 투여의 경우, 화합물 (즉, 면역자극성 핵산, 항원 및 다른 치료제)은 당업계에 공지된 제약상 허용되는 담체와 함께 배합하여 용이하게 제제화할 수 있다. 처치될 대상체에 경구용으로 사용하기 위해, 이러한 담체는 본 발명의 화합물이 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제 및 현탁액제 등으로 제제화되도록 할 수 있다. 경구 사용을 위한 제약 제제는, 임의로 생성 혼합물을 분쇄하고, 원한다면 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의정 코어를 얻음으로써 고상 부형제로서 얻을 수 있다. 적합한 부형제로는 특히, 락토스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨을 비롯한 당; 예를 들어 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트래거캔스 고무, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸-셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 및(또는) 폴리비닐피롤리돈 (PVP)과 같은 셀룰로스 제제 등의 충전제가 있다. 원한다면, 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 아가, 또는 알긴산 또는 이들의 염, 예를 들어 알긴산나트륨과 같은 붕해제를 첨가할 수 있다. 임의로, 경구 제제는 내부의 산성 상태를 중화하는 염수 또는 완충액 중에 배합되거나 임의 담체 없이 투여될 수도 있다.

적합한 코팅을 갖는 당의정제 코어를 제공한다. 이를 위해, 농축된 당 용액을 사용할 수 있는데, 이는 임의로 아라비아 고무, 활석, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 및(또는) 이산화티탄, 래커 용액 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있다. 염료 물질 또는 안료는 확인을 위해 또는 활성 화합물 투여량의 여러가지 조합을 특성화하기 위해 정제 또는 당의정 코팅제에 첨가될 수 있다.

경구적으로 사용될 수 있는 제약 제제로는 젤라틴 소재의 푸쉬-핏 (push-fit) 캡슐제 뿐만 아니라 젤라틴 및 가소제, 예를 들어 글리세롤 또는 소르비톨 소재의 연질의 밀봉 캡슐제가 포함된다. 푸쉬-핏 캡슐제는 활성 성분을 충전제, 예를 들어 락토스, 결합제, 예를 들어 전분, 및(또는) 윤활제, 예를 들어 활석 또는 스테아르산마그네슘 및, 임의로 안정화제와 혼합하여 함유할 수 있다. 연질 캡슐제에서, 활성 화합물은 적합한 액체, 예를 들어 지방 오일, 액상 파라핀, 또는 액상 폴리에틸렌 글리콜 중에 용해시키거나 또는 현탁시킬 수 있다. 또한, 안정화제를 첨가할 수 있다. 경구 투여용으로 제제화된 마이크로스피어를 사용할 수도 있다. 이러한 마이크로스피어는 당업계에 잘 정의되어 있다. 경구 투여용의 모든 제제는 이러한 투여에 적합한 투여량이어야 한다.

경구 투여의 경우, 조성물은 통상의 방식으로 제제화된 정제 또는 로젠지 형태일 수 있다.

흡입에 의한 투여의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은, 적합한 추진제, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압된 팩으로부터 에어로졸 분무 제공 형태 또는 분무기 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압된 에어로졸의 경우, 투여 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용하는, 예를 들어 젤라틴의 캡슐 및 카트리지가 화합물 및 적합한 분말 베이스, 예를 들어 락토스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하도록 제제화할 수 있다.

전신으로 전달할 필요가 있는 화합물은 주사, 예를 들어 볼루스(bolus) 주사 또는 지속적 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제제화될 수 있다. 주사용 제제는 단위 투여 형태, 예를 들어 앰플, 또는 다중-투여용 용기로, 첨가된 보존제와 함께 제공될 수 있다. 조성물은 오일 또는 수성 비히클 중 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있으며, 현탁제, 안정화제 및(또는) 분산제와 같은 제제화 물질을 함유할 수 있다.

비경구 투여를 위한 제약 제제로는 수용성 형태의 활성 화합물 수용액이 포함된다. 또한, 활성 화합물의 현탁액은 적합한 오일 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 지질친화성 용매 또는 비히클로는 지방 오일, 예를 들어 참기름, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트 또는 트리글리세라이드, 또는 리포좀이 포함된다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예를 들어 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 임의로, 현탁액은 화합물의 용해도를 증가시켜 고도로 농축된 용액의 제조를 가능케 하는 적합한 안정화제 또는 제제를 함유할 수도 있다.

또는, 활성 화합물은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균 발열물질-무함유 물을 사용하여 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다.

화합물은 직장 또는 질 조성물, 예를 들어 좌제, 또는 예를 들어 코코아 버터 또는 기타 글리세라이드와 같은 통상의 좌약 베이스를 함유하는 보유 관장제로 제제화할 수 있다.

상기 기술된 제제 이외에, 화합물은 데포(depot) 제제로 제제화할 수도 있다. 이러한 장기 작용성 제제는 적합한 고분자 또는 소수성 물질 (예를 들어, 허용가능한 오일 중 에멀젼으로서) 또는 이온교환수지와 함께, 또는 예를 들어 난용성 염과 같이 난용성 유도체로서 제제화될 수 있다.

제약 조성물은 또한 적합한 고체 또는 겔 상 담체 또는 부형제를 포함할 수도 있다. 이러한 담체 또는 부형제의 예로는 탄산칼슘, 인산칼슘, 각종 당, 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체가 포함되지만 이에 한정되지 않는다.

적합한 액상 또는 고상 제약 제제 형태로는, 예를 들어 흡입용 수용액 또는 염수 용액 형태, 미세캡슐화 형태, 코크리트 형태, 미세한 금 입자상에 코팅된 형태, 리포좀내에 함유된 형태, 분무 에어로졸 형태, 피부에 이식되는 펠렛 형태, 또는 피부로 스크래치되는 날카로운 물건상에 건조된 형태가 있다. 제약 조성물은 또한 활성 화합물을 연장 방출시키는 과립제, 산제, 정제, 코팅 정제, (미세)캡슐제, 좌제, 시럽제, 에멀젼제, 현탁액제, 크림제, 적제 또는 제제를 포함하며, 제제 중에 부형제 및 첨가제 및(또는) 보조제, 예를 들어 붕해제, 결합제, 코팅제, 팽윤화제, 윤활제, 향미제, 감미제 또는 가용화제를 상기 설명된 바와 같이 통상적으로 사용한다. 제약 조성물은 다양한 약물 전달 시스템에 사용하기에 적합하다. 약물 전달 방법에 대한 개략적인 검토를 위해서는, 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Langer, Science 249: 1527 (1990)]을 참조한다.

면역자극성 핵산은 그 자체로 (순수) 또는 제약상 허용되는 염 형태로 투여될 수 있다. 의료에서 사용되는 경우, 염은 제약상 허용되는 것이어야 하지만, 제약상 허용되지 않는 염도 통상적으로 그의 제약상 허용되는 염을 제조하는데 사용될 수 있다. 이러한 염으로는 하기 산으로부터 제조되는 것들이 포함되지만 이에 한정되지 않는다: 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 말산, 아세트산, 살리실산, p-톨루엔 술폰산, 타르타르산, 시트르산, 메탄술폰산, 포름산, 말론산, 숙신산, 나프탈렌-2-술폰산, 및 벤젠술폰산. 이러한 염은 알칼리금속염 또는 알칼리토금속염, 예를 들어 카르복실산기의 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염으로 제조할 수 있다.

적합한 완충제로는 다음의 것들이 포함된다: 아세트산 및 그의 염 (1 내지 27 중량/부피％); 시트르산 및 그의 염 (1 내지 3 중량/부피％); 붕산 및 그의 염 (0.5 내지 2.5 중량/부피％); 및 인산 및 그의 염 (0.8 내지 2 중량/부피％). 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드 (0.003 내지 0.03 중량/부피％); 클로로부탄올 (0.3 내지 0.9 중량/부피％); 파라벤 (0.01 내지 0.25 중량/부피％) 및 티메로살 (0.004 내지 0.02 중량/부피％)이 포함된다.

본 발명의 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체를 함유한다. "제약상 허용되는 담체"라는 용어에는 인간 또는 다른 척추동물에 투여하기에 적합한 한 가지 이상의 상용성 고상 또는 액상 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 의미한다. "담체"라는 용어는 활성 성분이 배합되어 투여가 촉진되는 천연 또는 합성의 유기 또는 무기 성분을 의미한다. 제약 조성물의 성분은 또한 목적하는 약제 효능에 실질적으로 손상을 주는 상호작용이 없도록 하는 방식으로 본 발명의 화합물과 서로 혼합될 수 있다.

다양한 투여 경로를 이용할 수 있다. 선택되는 구체적인 방식은 물론 선택되는 특정 면역보강제 또는 항원, 치료될 특정 증상 및 치료 효능에 요구되는 투여량에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 방법은 일반적으로 의학적으로 허용되는 임의 투여 방식을 이용하여 수행될 수 있으며, 이는 임상적으로 허용되지 않는 역효과를 일으키지 않는 효과적인 수준의 면역 반응을 나타내는 어떠한 방식을 의미한다. 바람직한 투여 방식은 상기에 기술되어 있다.

조성물은 편리하게는 단위 투여 형태로 제공될 수 있으며, 제약 분야에 잘 알려진 임의 방법에 의해 제조할 수 있다. 모든 방법은 화합물을 1종 이상의 부가 성분을 구성하는 담체와 함께 혼합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 조성물은 화합물을 액상 담체, 미분된 고상 담체, 또는 둘 다와 균일하게 잘 혼합한 다음, 필요하다면 생성물을 성형하여 제조한다. 액체 투여 단위는 바이알 또는 앰플이다. 고체 투여 단위는 정제, 캡슐제 및 좌제이다. 대상을 치료하는 경우, 화합물의 활성, 투여 방식, 면역화 목적 (즉, 예방 또는 치료), 질환의 특성 및 중증도, 대상의 연령 및 체중에 따라, 다른 투여량이 필요할 수 있다. 주어진 양의 투여는 개별 투여 단위로 또는 이보다 작은 투여 단위들의 형태 둘 다로 수행할 수 있다.

다른 전달 시스템으로는 시간에 따른 방출, 지연 방출 또는 지속적 방출 전달 시스템이 포함될 수 있다. 이러한 시스템에 의해 화합물의 반복적인 투여를 회피할 수 있어서, 환자 및 의사에 대한 편의를 증가시킨다. 많은 유형의 방출 전달 시스템을 이용할 수 있으며, 이는 당업자에게 공지되어 있다. 그 예로는 중합체 기재 시스템, 예를 들어 폴리(락티드-글리코시드), 코폴리옥살레이트, 폴리카프롤락톤, 폴리에스테라미드, 폴리오르토에스테르, 폴리히드록시부티르산, 및 폴리안히드라이드가 포함된다. 약물을 함유하는 상기 중합체의 미세캡슐제는 예를 들어 미국 특허 제5,075,109호에 기재되어 있다. 전달 시스템은 또한 다음과 같은 비-중합체 시스템을 포함한다: 스테롤, 예를 들어 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르 및 지방산 또는 중성 지방, 예를 들어 모노-, 디- 및 트리-글리세라이드를 비롯한 지질; 히드로겔 방출 시스템; 실라스틱 (silastic) 시스템; 펩티드 기재의 시스템; 왁스 코팅; 통상의 결합제 및 부형제를 사용한 압착 정제; 및 부분적으로 융합된 이식물 등이 포함된다. 구체적인 예로는 다음과 같은 것들이 포함되지만 이에 한정되지 않는다: (a) 본 발명의 제제가 미국 특허 제4,452,775호, 동 제4,675,189호, 및 동 제5,736,152호에 기재된 바와 같은 매트릭스내 형태에 포함되어 있는 침식 (erosional) 시스템; 및 (b) 활성 성분이 미국 특허 제3,854,480호, 동 제5,133,974호 및 동 제5,407,686호에 기재된 바와 같은 중합체로부터 조절된 속도로 투과되는 확산 시스템. 또한, 몇몇이 이식에 적합한 펌프 기재의 하드웨어 전달 시스템을 사용할 수 있다.

일부 실시양태에서, 면역자극성 핵산은 변형된다. 특정 실시양태에서, 면역자극성 핵산은 하나 이상의 뉴클레아제-내성 뉴클레오티드간 결합을 갖는 변형된 골격을 가진다. 뉴클레아제-내성 뉴클레오티드간 결합은 포스포로티오에이트 결합, 포스포로디티오에이트 결합, 메틸포스포네이트 결합, 및 펩티드 결합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 면역자극성 핵산은 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체 또는 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 특정 실시양태에서 면역자극성 핵산은 회문구조인 반면에, 다른 실시양태에서는 면역자극성 핵산이 회문구조가 아니다. 일부 바람직한 실시양태에서, 면역자극성 핵산의 길이는 8 내지 100 개의 뉴클레오티드인 반면에, 다른 바람직한 실시양태에서는 면역자극성 핵산의 길이가 12 내지 40 개의 뉴클레오티드이다. 바람직한 크기, 서열 및 변형은 하기에 더 상세히 기재된다.

하기 실시예는 설명을 위해 포함되지만, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.

본 연구의 목적은 상이한 클래스의 CpG ODN이 HCV 만성 보균자로부터 PBMC를 자극하는 능력을 평가하기 위한 것이었다. 정상적인 건강한 지원자와 HCV 만성 보균자로부터 수집한 전체 혈액에서 PBMC를 단리하고, 상이한 클래스의 CpG ODN 뿐만 아니라 소프트 및 세미-소프트 분자가 B 세포 증식, 사이토카인 분비 (IFN-γ, TNF-α, IL-10 및 IFN-α) 및 케모카인 분비 (IP-10)를 자극하는 능력을 시험관내에서 평가하였다.

또한, 외인성 IFN-α-2b (인트론 A) 및 리바비린이 단독으로, 각각이 함께, 또는 CpG ODN (B 및 C 클래스)과 함께 나타내는 면역 자극 효과도 평가하였다.

<재료 및 방법>

올리고뉴클레오티드

모든 올리고뉴클레오티드 원액은 pH 8.0의 TE 완충액 (OmniPer®; EM Science, Gibbstown, NJ)에 재현탁하였다. 열로 불활성화된 정상인의 10％ AB 혈청 (Wisent Inc, St. Bruno, QC) 및 1％ 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco BRL, Grand Island, NY)을 함유하는 RPMI 1640 완전 배지 (Gibco BRL, Grand Island, NY) 중에서 다양한 ODN 희석액을 세포 분석법에 사용하기 직전에 제조하였다. 외인성 IFN-α 상승효과 실험의 경우, 인트론 A (인터페론 알파-2b, DIN 02223406, Schering Canada Inc., Pointe-Claire, Quebec, Canada)를 최종 농도가 125 또는 1000 IU/ml이 되도록 ODN 용액에 첨가하였다. 리바비린 (CAS 36791-04-5, Calbiochem, CN Biosciences Inc., La Jolla, CA, USA)을 멸균 증류수로 재구성하여 500 μM의 원액을 제조하고, 이를 각 웰에 5 μM의 최종 농도가 되도록 상기 기재된 바와 같이 희석하였다. 세포를 5％ CO₂가 공급되는 37℃에서 배양하였다. 48시간 후, 각 웰로부터 세포 상층액을 수집하여 -80℃에서 동결시켰다.

실험에 사용된 ODN을 하기 표에 나타내었다.

PBMC의 단리

10명의 정상적인 건강한 성인 대상체와 임상적으로 HCV 감염된 15명의 성인 대상체 (이전 6개월 동안 IFN-α 기초의 치료법을 받았으나, 치료에 실패하거나 재발한 반응자임)로부터 전체 혈액 (200 ml)을 정맥 천공에 의해 수집하여, 헤파린이 처리된 녹색 뚜껑의 진공용기에 넣었다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 피콜-하이파크 (Ficoll-Hypaque; Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 상에서 400 xg로 35분 동안 원심분리하여 정제하였다. 10％ 정상인 AB 혈청 (열에 의해 불활성화됨) 및 1％ 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 완전 배지 중에 10×10⁶개/ml의 농도로 세포를 재현탁하였다.

B-세포 증식

상기 기재된 바와 같이 세포를 단리하고, 완전 RPMI 배지 중에 1×10⁶개/ml로 재현탁하여, 이 세포 100 ㎕를 둥근 바닥 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. ODN 용액 (100 ㎕)을 선택된 범위의 최종 농도 (1, 3, 6 ㎍/ml)가 되도록 각 웰에 첨가하였다. 세포를 5일 동안 배양한 후, ³H-티미딘 (1 μCi/웰)으로 18시간 동안 펄스를 제공하고 나서, 방사성을 측정하기 위해 여과지에 수집하였다. 결과는 미처리 배지 대조군에 대한 자극 지수 (SI; stimulation index)로서 기록하였다.

사이토카인 분석

새로이 단리된 PBMC를 1×10⁶개/ml (최종 농도의 2배)로 재현탁하고, 이 세포 100 ㎕를 동일한 부피의 ODN 용액 (원하는 최종 농도의 2배)을 함유하는 96웰 편평 바닥 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 소정 범위의 농도 (1, 3, 6 ㎍/ml)를 각 ODN에 대해 시험하였다. 세포를 5％ CO₂가 공급되는 37℃에서 배양하였다. 48시간 후, 각 웰로부터 세포 상층액을 수집하여 분석할 때까지 -80℃에서 동결시켰다.

상층액 중 IFN-α, IP-10, IL-10 및 IFN-γ의 수준은 시판되는 ELISA 키트 (R＆D Systems, Minneapolis, MN, USA; IP-10: Cat# DIP 100, IL-10: Cat# D1000, IFN-γ: Cat# DIF50; 또는 PBL Biomedical; IFN-α: Cat# 4110S)를 이용하여 측정하였다. 측정된 ELISA 값이 제조자가 규정한 키트의 검출 한계 미만인 경우, 검출가능한 가장 낮은 한계값과 동등한 값을 데이타 표에 입력하였다.

결과

임상적으로 HCV 감염된 15명의 대상체와 10명의 정상적인 건강한 지원자로부터 단리한 PBMC를 상이한 클래스의 CpG (예를 들어, 클래스 A, B, C, 소프트 C, 세미-소프트 B 및 세미-소프트 C)와 함께 37℃에서 배양하고, 배양 기간 동안의 사이토카인 분비에 대한 지표인 사이토카인 존재에 대해 평가하였다. 이 실험의 결과는 이하에 제시하였다.

PBMC에 의한 IFN-α 분비의 유도

정상 지원자로부터의 PBMC에서 3가지 클래스의 CpG ODN을 시험했을 때, A 클래스 (CpG 서열 1)에 의해서는 매우 높은 수준의 IFN-α가 생성되었고, C 클래스 (CpG 서열 4)에 의해서는 대체로 높은 수준의 IFN-α가 생성되었으며, B 클래스 (CpG 서열 2)에 의해서는 단지 적은 수준의 IFN-α가 유도되었다 (도 1). IFN-α의 주요 세포성 공급원은 pDC이다.

HCV 만성 보균자로부터 수득한 PBMC에 있어서는, 모든 2가지 클래스의 CpG가 IFN-α의 분비를 유도할 수 있었다. B 및 C 클래스에 의한 수준은 정상 PBMC에 대해 수득된 수준과 동일하였다. 이와 반대로, A 클래스는 정상 수준의 약 50％만을 유도하였으며 (도 1), 이는 HCV에 감염된 pDC가 A 클래스의 CpG가 IFN-α를 유도하는 효능에는 영향을 미치지만, C 클래스에 대해서는 그렇지 않음을 시사한다. 따라서, A 또는 C 클래스의 CpG가 HCV 만성 보균자의 치료에 사용될 수는 있지만, 몇몇 경우에 C 클래스가 바람직할 수 있다.

pDC의 개수를 FACS 분석에 의해 측정하였다. A 및 C 클래스의 CpG ODN 중 어느 하나에 의해 분비된 IFN-α의 양과 비교하여 pDC의 개수에 대한 선형 회귀 분석을 수행한 결과, 정상 대상체에 대한 합당한 상관관계 (예를 들어, R은 각각 0.43 및 0.58)가 밝혀졌다. 또한, 이러한 상관관계는 C 클래스의 ODN에 대해 약간 더 우수하다는 것도 밝혀졌다. 이와는 반대로, HCV에 감염된 대상체에 대해 분비된 IFN-α의 양과 pDC의 개수 사이에는 상관관계가 나타나지 않았다 (R은 각각 0.02 및 0.08; 도 3). HCV에 감염된 DC는 그럼에도 불구하고 CpG ODN에 반응하여 IFN-α를 분비할 수 있다.

이들 ODS가 소프트 및 세미-소프트로 변경되는 효과도 분석하였다. 분자의 중앙 영역에 포스포디에스테르 결합이 일렬로 배열된 소프트 분자를 합성하였다. CpG 모티프의 시토신과 구아닌 뉴클레오티드 사이에 하나 이상의 개별 포스포디에스테르 결합을 갖는 세미-소프트 분자를 합성하였다. 소프트 (도 3) 및 세미-소프트 (도 4) C 클래스의 CpG ODN 둘 다가, 원래의 C 클래스 CpG ODN과 유사한 방식으로 정상 또는 HCV PBMC로부터의 IFN-α 분비를 자극할 수 있었다. 세미-소프트 C 클래스의 CpG ODN 중 몇몇은 보통의 C 클래스 CpG (서열 4)보다 훨씬 더 강력하였다 (도 4). 이는 이 분자가 여전히 최대 면역 자극을 나타낼 정도로 충분히 안정하여 CpG 모티프의 중앙에 있는 포스포디에스테르가 그의 활성을 증가시키기 때문일 것이다.

PBMC에 의한 IFN-γ 분비의 유도

도 5는 상이한 클래스의 CpG가 Th1 사이토카인인 IFN-γ의 분비를 유도하는 능력을 비교한 것이다. 클래스 A는 낮은 수준의 IFN-γ를 유도하는 반면, 클래스 B는 적당한 양으로 생성하였고, 클래스 C의 CpG는 높은 농도의 IFN-γ를 자극하였다. HCV에 감염된 PBMC와 정상 PBMC 둘 다가 모든 3가지 클래스의 CpG에 대해 유사한 Th1 반응을 나타냈다. 세미-소프트 클래스 C의 CpG ODN에 대해서 유사한 결과를 수득하였다 (도 6).

PBMC에 의한 IP-10 분비의 유도

제1형 및 제2형 인터페론의 생성과 관련된 케모카인인 IP-10도 CpG ODN에 의해 유도되었다. 가장 높은 수준은 A 클래스의 CpG ODN에 의해 유도되었고, 그 다음으로 높은 수준은 C 클래스의 CpG ODN에 의해 유도되었으며, 가장 낮은 수준은 B 클래스의 CpG ODN에 의해 유도되었다. 정상 대상체 및 HCV 만성 보균자로부터의 PBMC에서는 CpG ODN의 클래스와 무관하게 유사한 수준의 IP-10이 유도되었다 (도 7).

CpG ODN에 의한 B 세포 자극

B 세포 자극에 대한 CpG의 효과도 조사하였다. 도 8 및 9에 나타낸 바와 같이, CpG 클래스 A는 HCV에 감염된 집단과 정상 집단 둘 다에서 B 세포의 자극이 불량했다. 이와는 반대로, 클래스 B, C 및 세미-소프트 C의 CpG는 B 세포를 강력하게 활성화시켰다. 정상 대상체와 HCV에 감염된 대상체로부터의 PBMC 사이에는 전혀 차이가 없었다.

CpG ODN으로의 자극 후에 PBMC로부터의 IL-10 분비

CpG로의 자극에 따른 사이토카인 IL-10의 생성도 평가하였으며, 그 결과는 도 10에 나타내었다. HCV에 감염된 대상체와 정상 대상체 둘 다에 대해, 모든 클래스의 CpG가 상당량의 IL-10 분비를 유도하였으며, 정상 지원자와 HCV 만성 보균자로부터의 PBMC 사이에는 전혀 차이가 없었다. 몇몇 세포형은 CpG와의 배양 후에 IL-10을 생성할 수 있으나, B 세포는 이 사이토카인의 주요 생산자이기 때문에, IL-10의 생성을 B 세포 활성화 수준에 대한 지표로 이용할 수는 없다.

인트론 A 및 리바비린의 효과

리바비린 및 외인성 IFN-α (인트론 A)가 단독으로, 또는 CpG와 함께 나타내는 시험관내 효과를 HCV에 감염된 세포에서 시험하였다. 리바비린과 인트론 A 둘 다는 단독이든 CpG와 함께든 HCV에 감염된 PBMC에 의해 IFN-α의 분비를 유도하였다 (도 11).

상기 논의한 바와 같이, A 및 C 클래스의 CpG ODN은 정상 대상체 및 HCV에 감염된 대상체로부터의 pDC에서 IFN-α의 분비를 강력하게 유도하였다. 또한, CpG 및 인트론 A가 함께 사용되는 경우에는 대부분 (60％)의 대상체에 대해 상승효과적인 반응이 나타났다 (도 12).

논의

CpG ODN은 만성적으로 HCV 감염된 환자로부터 DC를 유도하여 IFN-α를 분비할 수 있고, 이 경우 클래스 A 및 C의 CpG를 사용할 때 보다 높은 수준으로 분비되고, 클래스 B의 CpG ODN을 사용할 때 보다 낮은 수준으로 분비된다. 분비된 IFN-α의 수준은 정상적인 건강한 지원자로부터의 세포에 대해 관찰되는 양과 필적할만하다. 또한, IP-10은 자극된 HCV PBMC로부터 유도되며, 이는 추가로 Th1 유형의 면역 활성화를 나타낸다.

HCV 항원에 특이적인 면역 반응은 만성적으로 HCV 감염된 사람에게 이미 존재한다. 이 면역 반응은 Th2에 편향된 것이며, 따라서 HCV에 감염된 세포를 제거할 수 없다. 바이러스의 제거에는 Th1 유형의 반응이 필요할 것이다. 추가의 항원없이 전신의 Th1 사이토카인 수준이 증가하면, HCV로 만성 감염된 사람에게서 바이러스 제거의 수단인 Th1 유형의 HCV-특이적 면역 반응을 유발시킨다. 모든 클래스의 CpG (A, B 및 C)는 Th1 유형의 반응을 도출할 수 있다. 이러한 Th1 유형의 반응은 HCV 만성 감염의 장기간 제거에 필수적이지만, 직접적인 항-바이러스 효과를 나타내지만 면역계에는 직접적인 효과를 나타내지 못하는 외인성 IFN-α 치료법으로는 이러한 반응이 유도되기 어렵다. 따라서, HCV 만성 보균자를 치료하기 위해서는 CpG ODN을 외인성 IFN-α와 함께 사용할 수 있다.

별법으로, CpG ODN을 단독으로 사용할 수도 있다. IFN-α 및 IFN-γ와 같은 사이토카인의 유도능으로 인하여, CpG ODN 그 자체는 Th1 유형의 HCV-특이적 면역 반응의 유도 뿐만 아니라 직접적인 항-바이러스 효과도 나타낸다. 몇몇 경우, A 및 C 클래스의 분자가 바람직한데, 이는 이들이 보다 높은 수준의 IFN을 유도하기 때문이다. 이들의 특징적인 서열에 따라, CpG ODN은 pDC의 기능인 성숙 및 제I형 IFN 생성을 우선적으로 자극할 수 있다 (Krug, A et al., Eur J Immunol, 2001; 31:2154-2163). 본 발명에 따르면 2가지 클래스의 CpG ODN이 IFN-α의 생성에 보다 우수한 효과를 나타내기는 했지만, 어떠한 CpG ODN이라도 골격 또는 CpG 서열과 무관하게 만성 HCV의 치료에 사용될 수 있다. 생체내에서 특이적 CpG ODN에 의한 상이한 제I형 IFN 이소형의 제어된 방출은, 단일 서브타입 (예를 들어, 인트론 A가 유일한 IFN-α 2b임)인 재조합 제I형 IFN을 전신 투여하는 경우에 보다 우수하다. 소프트 및 세미-소프트 형태의 CpG ODN은 이들의 모 분자와 유사한 수준의 IFN-α 자극이 가능하다. 소프트 또는 세미-소프트 형태의 CpG ODN (특히, C 클래스)은 보다 용이하게 분해되어 기관 (특히, 간, 비장 및 신장)에 축적되지 않을 것이기 때문에 HCV의 만성 치료에 우선적으로 사용될 것이다.

그러나, 외인성 IFN-α 치료법에 대해 반응하지 않은 HCV 환자 중 50％ 이상에서, CpG ODN (특히, A 및 C 클래스)은 모든 대상체에게서 정상적인 건강한 지원자와 필적할만한 수준의 시험관내 IFN-α 분비를 유도할 수 없었다. 따라서, CpG ODN은 IFN이 PEG화되는지의 여부 및 치료법이 리바비린도 포함하는지의 여부와 무관하게 외인성 IFN-α 치료법에 대해 반응하지 않은 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 높은 수준으로 IFN-α를 유도할 수 있는 클래스의 CpG ODN이 바람직할 것이며, 장기간의 치료를 위해 보다 더 바람직한 것은 세미-소프트 형태일 것이다.

시판되는 인트론 A (IFN-α-2b)와 리바비린 둘 다는, 단독으로든 조합해서든 시험관내에서 정상 대상체 또는 HCV 감염 대상체로부터의 PBMC에서 IFN-α 분비를 유도할 수 없었다. 그러나, CpG ODN을 인트론 A와 함께 사용했을 때에는 HCV에 감염된 대상체로부터의 PBMC에서 IFN-α 분비에 대한 상승효과가 관찰되었다. C 클래스의 ODN이 외인성 IFN-α와의 상승작용을 나타냈지만, 시판되는 알파-인터페론과 함께 어떠한 클래스의 CpG ODN을 사용하더라도 치료 효과가 나타날 것이다. 상기 언급한 바와 같이, CpG ODN의 세미-소프트 형태는 상대적으로 용이하게 비-자극성 대사물질로 분해될 수 있기 때문에, 신장과 같은 최종 기관에 축적된다는 두려움없이 만성 치료에 사용될 수 있다.

리바비린이 Th1 효과를 나타내는 것으로 주장되고 있지만, 본 연구에서는 인간 PBMC에 대한 면역자극 활성을 나타내지 못했다. 인트론 A와 함께 사용하더라도, 리바비린은 내인성 IFN-α 생성을 증대시키지 못했다. 따라서, HCV의 병용 치료법에서 리바비린을 CpG ODN으로 대체하면, 지속적인 바이러스 반응의 비율이 증가할 것이다. CpG ODN과 병용하는 경우, 리바비린은 CpG의 효능을 감소시켰다. 따라서, CpG ODN은 리바비린의 부재하에 알파-인터페론과 병용되어야 한다.

CpG ODN은 인간 대상체에게 IM, SC 및 IV로 투여되어 왔으며, 매우 허용도가 높고 안전한 것으로 결정되었다 (임상 연구 진행중임). SC, IM, IV, 흡입 등과 같은 임의의 효과적인 투여 경로가 허용될 수 있지만, 피하 투여가 선택될 것이다. CpG ODN은 TE 완충액 중에 희석되어 PBMC에 추가되었지만, CpG ODN은 생체접착성 중합체 (Sha et al., 1999), 코크리트 (Gould-Fogerite et al., 1994, 1996), 덴드리머(dendrimer) (Kukowska-Latallo et al., 1996; Qin et al., 1998), 장용피 캡슐 (Czerlcinsky et al., 1987; Levine et al., 1987), 에멀좀 (Vancott et al., 1998; Lowell et al., 1997), ISCOM (Mowat et al., 1993; Morein et al., 1999; Hu et al., 1998; Carlsson et al., 1991), 리포좀 (Childers et al., 1999; Michalek et al., 1989, 1992), 마이크로스피어 (Gupta et al., 1998; Maloy et al., 1994; Eldridge et al., 1989), 나노스피어(nanosphere) (Roy et al., 1999), 중합체 고리 (Wyatt et al., 1998), 프로테오좀 (Lowell et al., 1988, 1996) 및 바이로좀 (Gluck et al., 1992; Mengiardi et al., 1995; Cryz et al., 1998)과 같은 전달 시스템 중에 제제화될 수도 있다.

HCV 만성 보균자를 치료하기 위해, CpG ODN은 1일 1회에서 1개월 1회까지 반복하여 투여될 수 있지만, 바람직하게는 3 내지 10일에 1회, 가장 바람직하게는 1주일에 1회로 장기간 투여된다. 이 기간은 1개월에서 2년까지일 수 있지만, 바람직하게는 3 내지 12개월, 가장 바람직하게는 6개월이다. 따라서, 가장 최적의 치료법은 1주일에 2회 또는 1주일에 1회로 6개월 동안 투여하는 것이다. 이는, 유도기 동안에는 보다 빈번하게 (처음 1 내지 3개월 동안 1일 1회, 2일 1회, 1주일에 2회, 또는 1주일에 1회) 투여한 후, 유지기에는 보다 덜 빈번하게 (이후 수개월 동안 1주일에 1회, 2주일에 1회, 또는 1개월에 1회) 투여할 수도 있다.

병용 치료법의 경우, CpG 및 알파-인터페론 (PEG화되거나 되지 않음)은 잠재적으로 (i) 함께 혼합되어 동일한 경로 (피하)에 의해 동시에 투여되거나, (ii) 혼합되지 않고 동시에 동일한 경로로 투여되거나, (iii) 다른 경로 (예를 들어, 알파-인터페론은 SC 투여되고, CpG는 IV, IM, ID, 경구 또는 국소 투여될 수 있음)에 의해 동시에 투여되거나, (iv) 동일하거나 다른 경로로 서로 다른 시간에 투여되거나, (v) 연속적으로 투여될 수 있다. 상기 마지막의 경우, IFN-α를 먼저 투여하여 바이러스의 양을 감소시킨 후에, 나중에 CpG ODN을 투여함으로써 Th1 유형의 적응성 면역을 유도하여 장기간의 제어를 위해 지속시키는 것이 바람직하다.

참고문헌

등가물

본원에 개시된 실시양태에 대한 다양한 변형이 가능함이 이해될 것이다. 따라서, 상기 설명은 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안되며, 단지 바람직한 실시양태를 예시하는 것으로 해석되어야 한다. 당업자는 본 명세서에 첨부된 청구의 범위 내에서 다른 변형도 예상할 수 있을 것이다.

본원에 개시된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 이들의 전문이 본원에 참고로 포함된 것으로 간주한다.

<110> COLEY PHARMACEUTICAL GROUP LTD COLEY PHARMACEUTICAL GmbH <120> METHODS AND PRODUCTS RELATED TO TREATMENT AND PREVENTION OF HEPATITIS C VIRUS INFECTION <130> C1037.70035US00 <140> NOT YET ASSIGNED <141> 2003-10-29 <150> US 60/421,987 <151> 2002-10-29 <160> 26 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 1 ggggacgacg tcgtgggggg g 21 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 2 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 3 tgctgctttt tgctggcttt tt 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 4 tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 5 tcgtcgtttc gtcgttttgt cgtt 24 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 6 tcgtcgtttt tcgtgcgttt tt 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 7 tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 8 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 9 tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 10 tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 11 tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 12 tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 13 tcgtcgtttt acggcgccgt gccg 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 14 tcgtcgtttt acggcgccgt gccg 24 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 15 tcgtcgtttt acggcgccgt gccg 24 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 16 tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 17 tcgcgtcgtt cggcgcgcgc cg 22 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 18 tcgtcgacgt tcggcgcgcg ccg 23 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 19 tcggacgttc ggcgcgcgcc g 21 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 20 tcggacgttc ggcgcgccg 19 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 21 tcgcgtcgtt cggcgcgccg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 22 tcgacgttcg gcgcgcgccg 20 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 23 tcgacgttcg gcgcgccg 18 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 24 tcgcgtcgtt cggcgccg 18 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 25 tcgcgacgtt cggcgcgcgc cg 22 <210> 26 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> n is selected from GpT, GpG, GpA, or ApA <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is selected from TpT, CpT, or TpC <400> 26 tcntnncgnn 10

Claims (71)

1. HCV 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에게 상기 감염에 대한 치료 유효량의 CpG 면역자극성 핵산을 투여하는 것을 포함하는, 기존의 비-CpG 치료법을 이용하여 성공적으로 치료될 수 없었던 HCV 감염 대상체를 치료하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 비-CpG 치료법이 인터페론-알파를 포함하는 것인 방법.
3. 제2항에 있어서, 인터페론-알파가 인터페론-알파-2b, 인터페론-알파-2a 또는 컨센서스(consensus) 인터페론-알파인 방법.
4. 제2항에 있어서, 비-CpG 치료법이 인터페론-알파 및 리바비린(Ribavirin)을 포함하는 것인 방법.
5. 제2항에 있어서, 비-CpG 치료법이 PEG화 인터페론-알파 및 리바비린을 포함하는 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, CpG 면역자극성 핵산이 A 클래스의 CpG 면역자극성 핵산인 방법.
7. 제1항에 있어서, CpG 면역자극성 핵산이 B 클래스의 CpG 면역자극성 핵산인 방법.
8. 제1항에 있어서, CpG 면역자극성 핵산이 C 클래스의 CpG 면역자극성 핵산인 방법.
9. 제1항에 있어서, 인터페론-알파를 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 인터페론-알파가 인터페론-알파-2b, 인터페론-알파-2a 또는 컨센서스 인터페론-알파인 방법.
11. 제9항에 있어서, 인터페론-알파를 CpG 면역자극성 핵산과 실질적으로 동시에 투여하는 방법.
12. 제1항에 있어서, CpG 면역자극성 핵산이 골격 변형(backbone modification)을 포함하는 것인 방법.
13. 제12항에 있어서, 골격 변형이 포스포로티오에이트 골격 변형인 방법.
14. 제1항에 있어서, CpG 면역자극성 핵산이 세미-소프트(semi-soft) 골격을 포함하는 것인 방법.
15. HCV 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에게 상기 감염에 대한 치료 유효량의 CpG 면역자극성 핵산을 투여하는 것을 포함하는, 비-CpG 치료법에 대해 반응하지 않을 가능성이 높은 HCV 감염 대상체를 치료하는 방법.
16. 제15항에 있어서, 비-CpG 치료법에 대해 반응하지 않을 가능성이 높은 대상체의 식별 단계를 더 포함하는 방법.
17. 제16항에 있어서, 대상체를, 수상 세포 당 생성된 인터페론-알파의 분석법에 기초하여 반응하지 않을 가능성이 높은 대상체로 식별하는 것인 방법.
18. 제16항에 있어서, 대상체를, HCV 유전자형에 기초하여 반응하지 않을 가능성이 높은 대상체로 식별하는 것인 방법.
19. 제15항에 있어서, 비-CpG 치료법이 인터페론-알파를 포함하는 것인 방법.
20. 제15항에 있어서, 비-CpG 치료법이 인터페론-알파 및 리바비린을 포함하는 것인 방법.
21. 제20항에 있어서, 항-바이러스제를 대상체에게 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
22. 제21항에 있어서, 항-바이러스제가 인터페론-알파인 방법.
23. 제22항에 있어서, 인터페론-알파가 인터페론-알파-2b, 인터페론-알파-2a 또는 컨센서스 인터페론-알파인 방법.
24. 제21항에 있어서, 인터페론-알파를 치료량 이하로 투여하는 것인 방법.
25. 제15항에 있어서, CpG 면역자극성 핵산이 C 클래스의 CpG 면역자극성 핵산인 방법.
26. 제15항에 있어서, CpG 면역자극성 핵산이 세미-소프트 골격을 포함하는 것인 방법.
27. 만성 C형 간염 바이러스에 감염된 대상체로부터의 말초 혈액 단핵 세포를 CpG 면역자극성 핵산과 접촉시키는 단계, 및

    혈액 단핵 세포의 노출 후 시험 반응을 측정하는 단계

    를 포함하는, 기존의 치료법을 이용하여 성공적으로 치료될 수 없었던 만성 C형 간염 바이러스 감염의 치료에 유용한 CpG 면역자극성 핵산을 스크리닝하는 방법.
28. 제27항에 있어서, 시험 반응이 B 세포 자극, IL-6의 분비, IL-10의 분비, IL-12의 분비, 인터페론-감마의 분비, 제1형 인터페론 (알파 + 베타)의 분비, IP-10의 분비, NK 활성, CD80의 발현, CD86의 발현, CD83의 발현, 및 클래스 II MHC 발현의 상향조절로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
29. 제27항에 있어서, 말초 혈액 단핵 세포가 수상 세포를 포함하는 것인 방법.
30. 제29항에 있어서, 수상 세포가 형질세포양(plasmacytoid) 수상 세포를 포함하는 것인 방법.
31. 제29항에 있어서, 시험 반응이 IL-12의 분비, 제1형 인터페론의 분비, CD80의 발현, CD86의 발현, CD83의 발현, 및 클래스 II MHC 발현의 상향조절로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
32. 제29항에 있어서, 접촉이 시험관내에서 일어나는 방법.
33. 제32항에 있어서, 말초 혈액 단핵 세포가 배양되는 것인 방법.
34. 제33항에 있어서, CpG 면역자극성 핵산이 배양된 말초 혈액 단핵 세포에 첨가되는 것인 방법.
35. 제29항에 있어서, 기존의 치료법이 비-CpG 치료법인 방법.
36. 제29항에 있어서, 기존의 치료법이 상이한 서열 또는 클래스의 CpG 핵산을 사용한 치료법인 방법.
37. 제29항에 있어서, 정상 대상체 유래의 말초 혈액 단핵 세포로부터의 조절 반응을 자극하는 능력에 대해 CpG 면역자극성 핵산을 스크리닝하는 것을 더 포함하는 방법.
38. 제29항에 있어서, 말초 혈액 단핵 세포를 CpG 면역자극성 핵산과 함께 인터페론-알파에 실질적으로 동시에 접촉시키는 것을 더 포함하는 방법.
39. 제29항에 있어서, CpG 면역자극성 핵산이 C 클래스의 CpG 면역자극성 핵산인 방법.
40. C형 간염 바이러스에 감염된 대상체로부터 회수한 말초 혈액 단핵 세포를 CpG 면역자극성 핵산에 노출시키는 단계,

    상기 세포로부터 생성된 인터페론-알파를 측정하는 단계, 및

    수상 세포 당 생성된 인터페론-알파의 양을 측정하는 단계

    를 포함하며, 1.0 pg/ml 미만의 양은 대상체가 비-CpG 치료법에 대해 반응하지 않을 가능성이 높은 것을 나타내는 지표인, 비-CpG 치료법에 대해 반응하지 않을 가능성이 높은 HCV 감염 대상체를 식별하는 방법.
41. 제40항에 있어서, 0.5 pg/ml 미만의 양이 대상체가 비-CpG 치료법에 대해 반응하지 않을 가능성이 높은 것을 나타내는 지표인 방법.
42. 제40항에 있어서, 비-CpG 치료법이 인터페론-알파를 포함하는 것인 방법.
43. 제42항에 있어서, 비-CpG 치료법이 리바비린을 포함하는 것인 방법.
44. 제42항에 있어서, IFN-알파가 PEG화 인터페론-알파인 방법.
45. 제40항에 있어서, CpG 면역자극성 핵산이 A 클래스 또는 C 클래스의 CpG 면역자극성 핵산인 방법.
46. 제40항에 있어서, 말초 혈액 단핵 세포가 CpG 면역자극성 핵산과 함께 항-바이러스제에 추가로 노출되는 것인 방법.
47. 제46항에 있어서, 항-바이러스제가 인터페론-알파인 방법.
48. 제47항에 있어서, 인터페론-알파가 인터페론-알파-2b, 인터페론-알파-2a 또는 컨센서스 인터페론-알파인 방법.
49. 제40항에 있어서, 말초 혈액 단핵 세포가 수상 세포를 포함하는 것인 방법.
50. 제49항에 있어서, 수상 세포가 형질세포양 수상 세포를 포함하는 것인 방법.
51. 제40항에 있어서, C형 간염 바이러스 감염이 급성 C형 간염 바이러스 감염인 방법.
52. 제40항에 있어서, HCV의 유전자형을 측정하는 것을 더 포함하는 방법.
53. 제40항의 방법에 따라 식별된 대상체에게 C형 간염 바이러스 감염에 대한 치료 유효량의 CpG 면역자극성 핵산 분자를 투여하는 것을 포함하는, C형 간염 바이러스에 감염된 대상체를 치료하는 방법.
54. 제53항에 있어서, 인터페론-알파를 대상체에게 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
55. 제54항에 있어서, 인터페론-알파가 인터페론-알파-2b, 인터페론-알파-2a 또는 컨센서스 인터페론-알파인 방법.
56. 제53항에 있어서, CpG 면역자극성 핵산이 A 클래스의 CpG 면역자극성 핵산인 방법.
57. 제53항에 있어서, CpG 면역자극성 핵산이 B 클래스의 CpG 면역자극성 핵산인 방법.
58. 제53항에 있어서, CpG 면역자극성 핵산이 C 클래스의 CpG 면역자극성 핵산인 방법.
59. 제53항에 있어서, CpG 면역자극성 핵산이 골격 변형을 포함하는 것인 방법.
60. 제59항에 있어서, 골격 변형이 포스포로티오에이트 골격 변형인 방법.
61. 제53항에 있어서, CpG 면역자극성 핵산이 세미-소프트 골격을 포함하는 것인 방법.
62. 제53항에 있어서, C형 간염 바이러스 감염이 만성 C형 간염 바이러스 감염인 방법.
63. 제53항에 있어서, C형 간염 바이러스 감염이 급성 C형 간염 바이러스 감염인 방법.
64. HCV 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에게 세미-소프트 골격을 갖는 클래스 C의 CpG 면역자극성 핵산을 상기 감염에 대한 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 기존의 비-CpG 치료법을 이용하여 성공적으로 치료될 수 없었던 HCV 감염 대상체를 치료하는 방법.
65. HCV 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에게 세미-소프트 골격을 갖는 클래스 C의 CpG 면역자극성 핵산을 상기 감염에 대한 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 비-CpG 치료법에 대해 반응하지 않을 가능성이 높은 HCV 감염 대상체를 치료하는 방법.
66. C형 간염 바이러스에 감염된 대상체로부터 회수한 말초 혈액 단핵 세포를 A 클래스 또는 C 클래스의 CpG 면역자극성 핵산에 노출시키는 단계,

    상기 세포로부터 생성된 인터페론-알파를 측정하는 단계, 및

    수상 세포 당 생성된 인터페론-알파의 양을 측정하는 단계

    를 포함하며, 1.0 pg/ml 미만의 양은 대상체가 비-CpG 치료법에 대해 반응하지 않을 가능성이 높은 것을 나타내는 지표인, 비-CpG 치료법에 대해 반응하지 않을 가능성이 높은 HCV 감염 대상체를 식별하는 방법.
67. HCV 감염의 치료를 필요로 하는 대상체로부터의 말초 혈액 단핵 세포를, 면역 반응에 대한 자극 유효량의 CpG 면역자극성 핵산과 접촉시키는 단계, 및

    상기 세포를 상기 대상체에게 다시 주입하는 단계

    를 포함하는, 기존의 비-CpG 치료법을 이용하여 성공적으로 치료될 수 없었던 HCV 감염 대상체를 치료하는 방법.
68. 제67항에 있어서, 말초 혈액 단핵 세포가 수상 세포를 포함하는 것인 방법.
69. 제68항에 있어서, 수상 세포가 형질세포양 수상 세포를 포함하는 것인 방법.
70. 제67항에 있어서, CpG 면역자극성 핵산이 C 클래스의 CpG 면역자극성 핵산인 방법.
71. 제70항에 있어서, C 클래스의 CpG 면역자극성 핵산이 세미-소프트 골격을 갖는 것인 방법.