ES2324532T3 - Bacteria probiotica: lactobacillus fermentum. - Google Patents

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Abstract

Variante de Lactobacillus fermentum aislada que tiene las siguientes características: (a) es grampositiva, facultativamente un bacilo, (b) fermenta ribosa, galactosa, glucosa, fructosa, manosa, maltosa, lactosa, melibiosa, sacarosa, trehalosa, rafinosa, L-arabinosa y manitol, (c) sobrevive a pH 1,5 durante hasta 4 horas con una pérdida de crecimiento no mayor de 3 unidades logarítmicas, (d) se propaga en presencia de sal biliar al 0,5% a 37ºC, dando como resultado un aumento de densidad óptica de 0,5 a 0,8, (e) es estable cuando se almacena en cápsulas de gelatina a 25ºC, (f) se adhiere a placas de Peyer a más de 5 ufc por mg de tejido, inhibiendo patógenos tanto mediante un efecto antagonista directo como desencadenando una modulación inmunitaria; en la que dicha variante es VRI 003 (número de acceso NM02/31074).

Description

Bacteria probiótica: Lactobacillus fermentum.
Campo técnico
La presente invención se refiere a variantes de la bacteria Lactobacillus fermentum, a formulaciones de la variante y a componentes de la misma y a su uso para prevenir y/o tratar enfermedades en mamíferos y para promover la salud de mamíferos.
Antecedentes
Cualquier reflexión de la técnica anterior a lo largo de la memoria descriptiva no debe considerarse en modo alguno como admisión de que dicha técnica anterior es ampliamente conocida o forma parte del conocimiento general común en el campo.
Las bacterias nativas desempeñan un papel importante en la prevención de ciertas enfermedades bacterianas y fúngicas. Lo hacen mediante un proceso de antagonismo bacteriano, previniendo que otros microbios establezcan una presencia en el cuerpo. Los mecanismos implicados en esta actividad incluyen la competición directa por nutrientes, las alteraciones de la acidez de una zona, haciéndola hostil para otros microbios, producir metabolitos inhibidores y productos químicos antimicrobianos y previniendo que otros microbios se fijen a superficies del hospedador.
La flora nativa influye también en el sistema inmunitario. Los animales criados en entornos exentos de gérmenes exhiben tejidos linfoides subdesarrollados y relativamente indiferenciados, bajos niveles de proteínas inmunitarias y una respuesta primaria a la infección en lugar de una respuesta secundaria pronunciada.
Estos microbios desempeñan un papel importante en la salud del hospedador, produciendo vitaminas y nutrientes esenciales necesarios para los colonocitos, ayudando a la degradación de los nutrientes complejos, protegiendo al hospedador de la invasión por patógenos y estimulando el sistema inmunitario. Además, se ha propuesto que los microbios del intestino contribuyen a la absorción mineral y al metabolismo lipídico debido al pH reducido como resultado de los ácidos grasos de cadena corta producidos por los microbios. Estos ácidos grasos de cadena corta son reguladores de la fisiología del colon y desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la función intestinal normal.
El tracto gastrointestinal superior contiene sólo bacterias tragadas con la saliva y el alimento. Como resultado de la alta acidez de los jugos gástricos, pueden cultivarse pocos organismos, en su mayoría lactobacilos, a partir de estómago normal. El intestino delgado superior contiene números relativamente escasos de lactobacilos y enterococos. La flora del tracto gastrointestinal cambia gradualmente hasta que se vuelve similar a la encontrada en el colon, predominantemente Bacteroides, Bifidobacterium, Fusobacterium, Lactobacillus y Eubacterium.
Esta flora normal del cuerpo es un ecosistema complejo, que se regula mediante la dieta, las interacciones microbianas y factores del hospedador tales como la motilidad del intestino y las secreciones intestinales. Los factores externos tales como estrés, cambios de dieta y medicaciones pueden afectar a la flora normal y alterar los tipos de organismos presentes en su metabolismo. Si se rompe el equilibrio, puede ser perjudicial para el hospedador y puede causar enfermedades.
Sin embargo, a veces se pierde el equilibrio y los patógenos invasores consiguen penetrar las defensas del cuerpo, causando infecciones o desencadenando respuestas inmunitarias inapropiadas. De forma similar, el equilibrio entre hospedador y flora nativa puede comprometerse, conduciendo a una infección por organismos normalmente durmientes, por ejemplos, episodios de estomatomicosis (infección por Candida albicans) o infección por Clostridium difficile después del uso de antibióticos.
De forma decepcionante, las "balas mágicas" que aparentemente ofrecen los antibióticos han perdido parte de su impacto. En los últimos 30 años, un creciente problema de resistencia a antibióticos se ha convertido en un asunto de salud pública importante. Hoy en día, algunos antibióticos son inútiles contra ciertos microbios, mientras que algunas bacterias son resistentes a casi todas las medicaciones antibióticas conocidas.
Además, se acumulan evidencias de que los microbios nativos del intestino grueso pueden estar implicados en el síndrome del intestino irritable (SII), una afección caracterizada por cambios en el tránsito intestinal, defecación alterada y distensión.
Se da a conocer una cepa KLD de Lactobacillus fermentum que se une con preferencia al epitelio asociado a folículo de las placas de Peyer en el intestino delgado de ratón en Plant et al., Immunology 2001, 320-324.
Son claramente necesarios métodos de tratamiento alternativos y quizás complementarios.
Es un objeto de la presente invención superar o mejorar al menos una de las desventajas de la técnica anterior, o proporcionar una alternativa útil.
El documento WO 02/34273 da a conocer la VRI 002 para la inhibición de la secreción de IL-4 asociada a una respuesta de Th2.
Compendio de la invención
Se ha aislado una nueva variante bacteriana probiótica de Lactobacillus fermentum que tiene rasgos ventajosos sorprendentes frente a cepas preexistentes de esta bacteria así como otros microorganismos probióticos. Es particularmente útil en la prevención y/o el tratamiento de trastornos gastrointestinales debido a su ventajosa capacidad de colonizar el tracto gastrointestinal. Además, esta variante tiene efectos inmunomoduladores ventajosos, que aparecen tanto localmente en el intestino como en sitios mucosos por todo el cuerpo mediante el sistema inmunitario mucoso común. Como resultado de la uniformidad del sistema mucoso, la variante puede usarse también en la prevención y/o el tratamiento de otros trastornos de superficies mucosas y afecciones resultantes de alteraciones de la superficie mucosa o alteraciones del sistema inmunitario o del estado de un sujeto.
Según un primer aspecto, se proporciona una variante de Lactobacillus fermentum aislada novedosa que tiene las siguientes características:
(a)
es grampositiva, facultativamente un bacilo,
(b)
fermenta ribosa, galactosa, glucosa, fructosa, manosa, maltosa, lactosa, melibiosa, sacarosa, trehalosa, rafinosa, L-arabinosa y manitol,
(c)
sobrevive a pH 1,5 durante hasta 4 horas con una pérdida de crecimiento no mayor de 3 unidades logarítmicas,
(d)
se propaga en presencia de sales biliares al 0,5% a 37ºC, dando como resultado un aumento de densidad óptica de 0,5 a 0,8,
(e)
es estable cuando se almacena en cápsulas de gelatina a 25ºC,
(f)
se adhiere a placas de Peyer a más de 5 ufc por mg de tejido, inhibiendo patógenos tanto mediante un efecto antagonista directo como desencadenando una modulación inmunitaria;
en la que dicha variante es VRI 003 (número de acceso NM02/31074).
Según un segundo aspecto de la invención, se proporciona una composición que comprende una variante de Lactobacillus fermentum según el primer aspecto y un portador farmacéuticamente aceptable.
En una realización preferida, la composición comprende células vivas de la variante de Lactobacillus fermentum. Sin embargo, resultará evidente para el experto destinatario que la composición puede contener también células muertas de la variante de Lactobacillus.
Preferiblemente, se combina el Lactobacillus fermentum con otros compuestos tales como prebióticos, componentes dietéticos no digeribles, fibra dietética o compuestos farmacéuticamente activos. Más preferiblemente, el prebiótico comprende o consiste en inulina, un almidón resistente, un oligosacárido, una goma o un beta-glucano. Aún más preferiblemente, el prebiótico es un almidón de maíz rico en amilosa no modificado o un beta-glucano.
La composición puede prepararse en forma de comprimido, cápsula, polvo, gel, pasta, formulación líquida, suplemento dietético o producto alimentario y similar. Preferiblemente, la composición se prepara en forma de comprimido o cápsula.
Según un tercer aspecto, la invención proporciona el uso de la variante de Lactobacillus fermentum VRI 003 o una composición que comprende la variante y un compuesto farmacéuticamente activo para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de un trastorno gastrointestinal o un síntoma del mismo. El tratamiento comprende la etapa de administrar una variante de Lactobacillus fermentum según el primer aspecto, o una composición según el segundo aspecto, a un sujeto necesitado de dicho tratamiento.
Los términos "sujeto" e "individuo" se usan intercambiablemente en esta memoria descriptiva y en el contexto de la presente invención incluyen en su alcance cualquier mamífero que pueda desarrollar, o tenga ya, un trastorno gastrointestinal y/o trastornos de las superficies mucosas y/o afecciones resultantes de alteraciones de la superficie mucosa o alteraciones del sistema inmunitario de cualquier causa. Los sujetos preferidos para la administración del tratamiento de la presente invención son seres humanos, mascotas domésticas y animales de granja.
Preferiblemente, el trastorno gastrointestinal es el síndrome del intestino irritable (SII), enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn y/o síntomas de los mismos tales como, por ejemplo, diarrea, meteorismo, flatulencia, cólico, dolor abdominal o estreñimiento. El trastorno gastrointestinal puede estar causado por organismos patogénicos que pueden ser bacterianos, víricos o protozoarios. Sin embargo, puede estar causado también simplemente por la colonización del tracto gastrointestinal con organismos inapropiados o por mecanismos inflamatorios y/o 
\hbox{autoinmunitarios.}
Preferiblemente, la alteración o trastorno es el resultado de la colonización del tracto gastrointestinal del sujeto por un patógeno. Preferiblemente, la alteración o trastorno es el resultado de una carga patogénica alta como se define en la presente memoria. Más preferiblemente, el patógeno es una bacteria, virus o protozoo. Lo más preferiblemente, el patógeno es Salmonella, E. coli, Helicobacter, Vibrio, Pseudomonas, Clostridium, Bacteroides o un virus tal como Norwalk o rotavirus, o un protozoo tal como Cryptosporidium, Entamoeba, Giardia y Dientamoeba.
En el contexto de la presente invención, puede aparecer una "carga patogénica alta" cuando un sujeto (a) se ha sometido al ataque de un patógeno en una cantidad fuera del intervalo normal de su exposición diaria; (b) se ha sometido al ataque de un patógeno virulento; (c) se ha sometido al ataque de un patógeno en un momento en que la resistencia del sujeto está reducida, por ejemplo, en un momento en el que el sistema inmunitario está agotado y/o cuando otros mecanismos de defensa naturales del sujeto no funcionan normalmente. La resistencia del sujeto puede ser baja debido, por ejemplo, al estrés o a tratamiento con antibiótico.
En un cuarto aspecto, la invención proporciona el uso de la variante de Lactobacillus fermentum VRI 003 o una composición que comprende la variante y un compuesto farmacéuticamente activo para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de un trastorno de una superficie mucosa o un síntoma del mismo. El tratamiento comprende la etapa de administrar una variante de Lactobacillus fermentum según el primer aspecto, o una composición según el segundo aspecto, a un sujeto que requiera dicho tratamiento.
Preferiblemente, el trastorno de la superficie mucosa es eccema, rosácea o dermatitis atópica.
En un quinto aspecto, la invención proporciona el uso de la variante de Lactobacillus fermentum VRI 003 o una composición que comprende la variante y un compuesto farmacéuticamente activo para la fabricación de un medicamento para estimular la producción de IL-12 en un sujeto. El tratamiento comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una variante de Lactobacillus fermentum según el primer aspecto, o una composición según el segundo aspecto, a un sujeto necesitado de dicho tratamiento.
En un sexto aspecto, la invención proporciona el uso de la variante de Lactobacillus fermentum VRI 003 o una composición que comprende la variante y un compuesto farmacéuticamente activo para la fabricación de un medicamento para regular positivamente el IFN-\gamma. El tratamiento comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una variante de Lactobacillus fermentum según el primer aspecto, o una composición según el segundo aspecto, a un sujeto necesitado de dicho tratamiento.
En un séptimo aspecto, la invención proporciona el uso de la variante de Lactobacillus fermentum VRI 003 o una composición que comprende la variante y un compuesto farmacéuticamente activo para la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta de tipo Th 1 en un sujeto. El tratamiento comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una variante de Lactobacillus fermentum según el primer aspecto, o una composición según el segundo aspecto, a un sujeto necesitado de dicho tratamiento.
En un octavo aspecto, la invención proporciona el uso de la variante de Lactobacillus fermentum VRI 003 o una composición que comprende la variante y un compuesto farmacéuticamente activo para la fabricación de un medicamento para inhibir el crecimiento de un patógeno. El tratamiento comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una variante de Lactobacillus fermentum según el primer aspecto, o una composición según el segundo aspecto, a un sujeto necesitado de dicho tratamiento.
En un noveno aspecto, la invención proporciona el uso de la variante de Lactobacillus fermentum VRI 003 o una composición que comprende la variante y un compuesto farmacéuticamente activo para la fabricación de un medicamento para modular microbios nativos del tracto gastrointestinal. El tratamiento comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una variante de Lactobacillus fermentum según el primer aspecto, o una composición según el segundo aspecto, a un sujeto necesitado de dicho tratamiento.
La cantidad de dosificación necesaria variará según la gravedad de la afección a tratar, la causa de la afección, la edad del sujeto y otros parámetros clínicos estándar que pueden determinarse fácilmente mediante procedimientos rutinarios al alcance de los expertos en la técnica.
La variante de Lactobacillus fermentum, o la composición que comprende dicha variante, puede administrarse mediante cualquier medio conocido, pero preferiblemente se administra por vía local.
La variante de Lactobacillus fermentum, o la composición que comprende dicha variante, puede administrarse junto con uno o más agentes farmacéuticamente activos. La variante, o la composición que comprende dicha variante, puede administrarse simultáneamente (coadministrarse) con otros tratamientos o puede administrarse secuencialmente en cualquier orden.
Se prefiere administrar la variante de Lactobacillus fermentum, o una composición que la comprende, diariamente. Puede administrarse varias veces al día, o puede administrarse infrecuentemente (por ejemplo, cada dos o tres días), dependiendo de la progresión del tratamiento de la afección en cuestión, su causa y su gravedad. Estos parámetros pueden determinarse también fácilmente por los expertos en la técnica.
En el contexto de la presente invención, el término "estable" incluye dentro de su alcance una pérdida de viabilidad de hasta un 25% durante seis meses de almacenamiento a 25ºC.
A menos que el contexto requiera claramente otra cosa, a lo largo de la descripción y en las reivindicaciones, las palabras "comprende", "comprendiendo" y similares han de considerarse en el sentido inclusivo en oposición a un sentido exclusivo o exhaustivo, es decir, en el sentido de "incluye pero sin limitación".
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Efecto de diferentes concentraciones de sales biliares sobre el crecimiento y la viabilidad de VRI 003 de L. fermentum.
Figura 2. Efecto del pH bajo sobre la viabilidad del cultivo de VRI 003 in vitro.
Figura 3. Adhesión de Lactobacillus spp. a placas de Peyer de ratón.
Figuras 4 y 5. El análisis bidimensional de las proteínas de pared celular extraídas de células de VRI 003 de L. fermentum en comparación con las paredes celulares de LMG de L. fermentum, que se ha mostrado anteriormente que no se adhieren a placas de Peyer, muestra que la VRI 003 regula positivamente dos proteínas de pared celular y regula negativamente la expresión de una serie de otras proteínas de pared celular (Figura 4) cuando se compara con LMG de L. fermentum (Figura 5).
Figura 6. Efecto de la estimulación de VRI 003 de L. fermentum sobre la producción de citocina por macrófagos.
Figura 7. Potenciación de los niveles de citocina en las placas de Peyer después de la dosificación oral de VRI 003 de L. fermentum.
Figura 8. Efecto de la administración oral de VRI 003 de L. fermentum sobre los niveles de citocina en el bazo después de la dosificación oral de VRI 003 de L. fermentum.
Figura 9. Estabilidad de VRI 003 de L. fermentum en cápsulas de gelatina de tamaño 1 combinada con almidón resistente de baja actividad acuosa y almacenado en paquetes blíster bilaminados a 4ºC, 25ºC y 30ºC.
Figura 10. Cambios en las bacterias de material fecal del sujeto con SII nº 4 durante un ensayo de 8 semanas. Perfiles microbianos monitorizados durante los periodos de valores iniciales, placebo y tratamiento sinbiótico. Resultados expresados como unidades formadoras de colonias (ufc) por ml.
Figura 11. Cambios en las bacterias de material fecal del sujeto con SII nº 5 durante un ensayo de 8 semanas. Perfiles microbianos monitorizados durante los periodos de valores iniciales, placebo y tratamiento sinbiótico. Resultados expresados como unidades formadoras de colonias (ufc) por ml.
Figura 12. Cambios en las bacterias de material fecal del sujeto con SII nº 9 durante un ensayo de 8 semanas. Perfiles microbianos monitorizados durante los periodos de valores iniciales, placebo y tratamiento sinbiótico. Resultados expresados como unidades formadoras de colonias (ufc) por ml.
Figura 13. Cambios en las bacterias de material fecal del sujeto con SII nº 2 durante un ensayo de 8 semanas. Perfiles microbianos monitorizados durante los periodos de valores iniciales, placebo y tratamiento sinbiótico. Resultados expresados como unidades formadoras de colonias (ufc) por ml.
Figura 14. Cambios en las bacterias de material fecal del sujeto con SII nº 3 durante un ensayo de 8 semanas. Perfiles microbianos monitorizados durante los periodos de valores iniciales, placebo y tratamiento sinbiótico. Resultados expresados como unidades formadoras de colonias (ufc) por ml.
Figura 15. Cambios en las bacterias de material fecal del sujeto con SII nº 7 durante un ensayo de 8 semanas. Perfiles microbianos monitorizados durante los periodos de valores iniciales, placebo y tratamiento sinbiótico. Resultados expresados como unidades formadoras de colonias (ufc) por ml.
Figura 16. Cambios en las bacterias de material fecal del sujeto con SII nº 6 durante un ensayo de 8 semanas. Perfiles microbianos monitorizados durante los periodos de valores iniciales, placebo y tratamiento sinbiótico. Resultados expresados como unidades formadoras de colonias (ufc) por ml.
Descripción detallada de la invención
Aunque ha habido diversos intentos de usar probióticos en la prevención y el tratamiento de muchas enfermedades, la evidencia del uso de probióticos en el tratamiento de trastornos gastrointestinales ha sido muy variable. Se ha encontrado ahora que la variante de Lactobacillus fermentum VRI 003 que tiene las siguientes características:
(a)
es grampositiva, facultativamente un bacilo,
(b)
fermenta ribosa, galactosa, glucosa, fructosa, manosa, maltosa, lactosa, melibiosa, sacarosa, trehalosa, rafinosa, L-arabinosa y manitol,
(c)
sobrevive a pH 1,5 durante al menos 4 horas con una pérdida de crecimiento no mayor de 3 unidades logarítmicas,
(d)
se propaga en presencia de sales biliares al 0,5% a 37ºC, dando como resultado un aumento de densidad óptica de 0,5 a 0,8,
(e)
es estable cuando se almacena en cápsulas de gelatina a 25ºC,
(f)
se adhiere a placas de Peyer a más de 5 ufc por mg de tejido, inhibiendo patógenos tanto mediante un efecto antagonista directo como desencadenando una modulación inmunitaria;
es altamente eficaz en la prevención y/o el tratamiento de un trastorno gastrointestinal y/o síntomas del mismo. Preferiblemente, la variante es VRI 003 de Lactobacillus fermentum. La presente invención proporciona también el uso de la variante o una composición que comprende la variante para la preparación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de un trastorno gastrointestinal, comprendiendo el tratamiento la administración de una variante de Lactobacillus fermentum o una composición que comprende la variante a un sujeto. La variante puede combinarse con otros agentes, por ejemplo, un prebiótico, un componente dietético no digerible, fibra dietética o un compuesto farmacéuticamente activo tal como aspirina y estatinas.
Los métodos y composiciones de la presente invención se han desarrollado para aplicaciones humanas y veterinarias en el tratamiento de trastornos gastrointestinales, pero como resultado de la uniformidad del sistema mucoso, los tratamientos pueden aplicarse a otros trastornos de superficies mucosas y afecciones resultantes de alteraciones de la superficie mucosa o alteraciones del sistema inmunitario o del estado de un sujeto. Se use tanto para el tratamiento de seres humanos como de animales domésticos, los principios subyacentes son los mismos y los tratamientos de la presente invención pueden usarse ventajosamente independientemente de la causa de las afecciones descritas anteriormente.
Típicamente, la dosificación diaria eficaz está en el intervalo de aproximadamente 10^{8}-10^{12} bacterias y la frecuencia de administración es de una o dos veces al día. Para ingesta a largo plazo, la cantidad puede ser, por ejemplo, menor que el intervalo anteriormente mencionado, y en otras circunstancias puede usarse a una cantidad por encima del intervalo.
La variante de Lactobacillus fermentum puede formularse mediante medios conocidos, usando portadores, excipientes, disolventes o coadyuvantes farmacéuticamente aceptables convencionales. Dichos procedimientos e ingredientes son bien conocidos y se describen ampliamente en textos y manuales estándar, por ejemplo "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 1995, Mack Publishing Co. Easton, PA 18042, EE.UU., que se incorpora a la presente como referencia.
La variante de Lactobacillus fermentum puede formularse también en un producto alimentario mediante los medios bien conocidos habituales.
La composición que comprende la bacteria incluye bacterias viables, bacterias húmedas, bacterias secas o componentes de la bacteria incluyendo, pero sin limitación, fragmentos celulares, extractos, secreciones y componentes purificados.
El producto alimentario o bebida de la invención contiene al menos uno de la bacteria, un material que contiene la misma y un producto procesado de la misma como ingrediente eficaz.
Puede formularse una composición para ser adecuada para administración oral en una variedad de modos, por ejemplo, en forma de un comprimido, una cápsula, un líquido, un suplemento dietético, una pasta, un gel, un producto alimentario y similares. Otras formulaciones resultarán fácilmente evidentes para un experto en la técnica.
La bacteria puede usarse en productos alimentarios o bebidas o puede usarse en combinación con otros materiales alimentarios y componentes alimentarios apropiadamente de maneras convencionales.
Preferiblemente, la composición se prepara en forma de un producto alimentario lácteo o basado en lácteos con o sin otros componentes que se usan rutinariamente en la producción de dichos productos lácteos.
Las composiciones de la presente invención pueden incluir también antioxidantes, agentes de tamponación y otros agentes conocidos tales como agentes colorantes, aromatizantes, vitaminas o minerales. Pueden añadirse agentes espesantes a las composiciones tales como almidón de maíz, goma guar, goma xantana y similares. Los componentes adicionales preferidos de una composición terapéutica de esta invención pueden incluir prebióticos tales como inulina, componentes dietéticos no digeribles, fibra dietética, compuestos farmacéuticamente aceptables y otros nutrientes. Pueden incluirse también enzimas dietéticas o suplementarias tales como lactasa, amilasa, glucanasa, catalasa y enzimas similares. Los prebióticos preferidos incluyen almidón de maíz rico en amilosa no modificado o beta-glucano.
Se combina la bacteria con un portador que sea fisiológicamente compatible con el tejido gastrointestinal o la superficie mucosa de la especie a la que se administra. Los portadores pueden consistir en materiales secos basados en sólido para formulación en forma de comprimido, cápsula o polvo; o el portador puede consistir en materiales líquidos o basados en gel para formulaciones en forma de líquido o gel. El tipo específico de portador, así como la formulación final, dependen en parte de la(s) vía(s) de administración seleccionada(s).
Los portadores típicos para formulaciones secas incluyen, pero sin limitación: trehalosa, maltodextrina, harina de arroz, celulosa microcristalina (CMC), estearato de magnesio, inositol, FOS, GOS, dextrosa, sacarosa y portadores similares. Pueden añadirse formulaciones secas (por ejemplo, polvos) a suplementos alimentarios comercialmente disponibles (por ejemplo, fórmulas líquidas, productos lácteos o agua). De forma similar, el tipo específico de formulación depende de la vía de administración.
Los portadores líquidos o basados en gel adecuados incluyen, pero sin limitación: agua y disoluciones salinas fisiológicas, urea, alcoholes y derivados (por ejemplo, metanol, etanol, propanol, butanol), glicoles (por ejemplo, etilenglicol, propilenglicol y similares). Preferiblemente, los portadores basados en agua poseen un valor de pH neutro (concretamente, pH 7,0).
Pueden incluirse también conservantes en el portador, incluyendo metilparabeno, propilparabeno, alcohol bencílico y sal tetraacetato de etilendiamina. La composición del portador puede variar a condición de que no interfiera significativamente con la actividad farmacológica de los ingredientes activos.
Los tratamientos en los que se usa el medicamento que comprende la variante comprenden la administración de la variante de Lactobacillus fermentum o componentes de la misma, o una composición que comprende la variante o componentes de la misma, a un ser humano o animal para tratar y/o prevenir un trastorno gastrointestinal o un trastorno de la superficie mucosa y afecciones resultantes de alteraciones de la superficie mucosa o alteraciones del sistema inmunitario o del estado de un sujeto y/o los síntomas asociados a dichos trastornos, por ejemplo, síndrome del intestino irritable (SII), enfermedad inflamatoria intestinal y/o síntomas de los mismos tales como, por ejemplo, diarrea, meteorismo, flatulencia, cólico, dolor abdominal o estreñimiento y eccema o rosácea. Este tratamiento puede dar como resultado la modulación de los microbios nativos del tracto gastrointestinal. La administración se lleva a cabo preferiblemente usando un comprimido, una cápsula, un gel, una formulación líquida, un polvo, una pasta, un suplemento dietético o un producto alimentario y formulaciones similares, todos formulados para contener una composición terapéutica de la presente invención mediante el uso de métodos bien conocidos en la técnica.
Se describirán ahora realizaciones preferidas de la invención sólo a modo de ejemplo.
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Ejemplos Ejemplo 1 Origen e identificación
Se aisló la variante VRI 003 de un sujeto sano. En una serie de experimentos de laboratorio, se encontró que la variante VRI 003 se adhiere al tejido epitelial gastrointestinal. Se mostró también que tiene un efecto demostrable sobre patógenos gastrointestinales humanos y que era resistente a ácidos biliares. La variante VRI 003 sobrevivía también en un entorno de bajo pH y era resistente a pepsina y a condiciones limitadas de nutrientes.
La variante bacteriana VRI 003 puede cultivarse en agar Rogosa (Oxoid). Se incubaron placas a 37ºC en una cámara anaeróbica durante 24 horas. Se purificó la cepa mediante transferencias sucesivas en placas de agar MRS (Oxoid) incubadas a 37ºC en una cámara anaeróbica durante 24 horas, y se almacenó el cultivo final a -70ºC en glicerol al 20% subcultivando en caldo MRS a 37ºC durante 24 horas en condiciones anaeróbicas antes de la adición de glicerol al caldo de cultivo.
La variante VRI 003 era un bacilo grampositivo negativo de catalasa que producía gas cuando crecía anaeróbicamente en caldo de infusión de cerebro-corazón (BHI) (Oxoid) que contenía glucosa. Por lo tanto, se identificó ampliamente como un lactobacilo heterofermentativo y se confirmó que era la cepa de L. fermentum según el kit de carbohidrato API (kit 50 CHL, Biomerieux, base de datos del suministrador y base de datos) con una certeza del 99,9%. En particular, se utilizan los azúcares 5, 10, 11, 12, 13, 25, 28, 29, 30, 31, 32 y 25 por la cepa VRI 003. La célula es un bacilo corto, grampositivo y consistente con la descripción de la morfología de Lactobacillus fermentum.
Se depositó la cepa de Lactobacillus fermentum VRI 003 según las disposiciones del Tratado de Budapest, en los Australian Government Analytical Laboratories, PO BOX 385 Pymble 2073, NSW, Australia, el 27 de Agosto de 2002, y se asignó al depósito el número de acceso NM02/31074.
Ejemplo 2 Características y descripción de la cepa VRI 003 (i) Morfología de la colonia
Cuando se cultiva en agar MRS (Oxoid) en una cámara anaeróbica a 37ºC, las colonias son de aproximadamente 1 mm de diámetro, lustrosas, abombadas, opacas y cuando se tocan con un asa muestran pegajosidad. Esta pegajosidad puede ser debida a la presencia de un polímero extracelular. La incubación de placas similares en condiciones aeróbicas a 37ºC proporciona algunas colonias de apariencia rugosa y borde irregular. El subcultivo de estas colonias rugosas en agar MRS y la incubación a 37ºC en la cámara anaeróbica proporciona colonias lustrosas opacas abombadas que son pegajosas al tacto.
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(ii) Crecimiento en caldo
El cultivo de la variante VRI 003 en caldo MRS (Oxoid), o en diversos otros caldos, da como resultado un caldo viscoso cuando se cultiva a 37ºC en condiciones anaeróbicas.
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(iii) Resistencia a ácidos biliares
Como se muestra en la Figura 1, la cepa VRI 003 crece en presencia de sales biliares al 0,5% y 0,15% cuando se añaden ácidos al caldo MRS (Oxoid) y se incuba la cepa anaeróbicamente a 37ºC durante 8 horas.
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(iv) Supervivencia en entorno de pH bajo
Se hicieron dos veces pasadas de VRI 003 en disolución madre de glicerol por caldo MRS antes de usar para el ensayo. El día del ensayo, se recogieron los cultivos del caldo MRS mediante centrifugación a 4000 x g y se diluyó el sedimento en tampón de Clark y Lubs ajustado a pH 1,5 y 2,0, respectivamente, dando una densidad óptica de 0,4 (correspondiente a 1 x 10^{8} ufc/ml). Se determinó la supervivencia del organismo diluyendo en serie alícuotas tomadas cada hora durante 4 horas y dispersando alícuotas de 100 \mul en placas de agar MRS, que se incubaron después anaeróbicamente a 37ºC durante 24 h. Como se muestra en la Figura 2, la cepa VRI 003 de L. fermentum mostró mejor supervivencia que la cepa VRI 002 de L. fermentum, que se reducía de 8,75 ufc/ml a pH 1,5 a 4,93 ufc/ml al cabo de 4 horas.
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(v) Utilización de carbohidrato
Usando los kits de utilización de carbohidrato API 50CHL para estudiar cuáles carbohidratos podría utilizar la VRI 003 de L. fermentum, se observaron algunas diferencias con la cepa VRI 002 de L. fermentum con el tiempo de incubación. Después de 6 horas de incubación, la VRI 003 era capaz de utilizar los siguientes azúcares, como se define por volver amarillo el medio:
Ribosa
Galactosa
Glucosa
Fructosa
Manosa
Maltosa
Lactosa
Melibiosa
Sacarosa
Trehalosa
Rafinosa
La VRI 002 era capaz de utilizar todos los anteriores en este momento, excepto la manosa.
Después de 6 horas de incubación, ambas cepas eran capaces de utilizar ligeramente gluconato.
Mediante una incubación de 18 horas, se observó un cambio en el área que contiene manosa de la tira, de lo que se dedujo que la VRI 002 estaba utilizando manosa, pero de forma relativamente lenta.
Mediante una incubación de 24 horas, resultó evidente que la VRI 003 estaba utilizando los azúcares L-arabinosa y manitol. La VRI 002, además de estos dos, empezó a utilizar azúcares extra, a saber, ramnosa y N-acetilglucosamina.
Después de una incubación de 48 horas, la cepa VRI 003 había utilizado todo el gluconato, mientras que la cepa VRI 002 tenía sólo una muy ligera utilización.
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(vi) Adhesión de VRI 003 de L. fermentum (a) Adhesión in vitro a placas de Peyer
Se incubó VRI 003 de L. fermentum marcado radiactivamente durante 30 min con placas de Peyer in vitro y se cuantificó el nivel de adhesión. Como se muestra en la Figura 3, la VRI 003 exhibía una unión potenciada a células de placa de Peyer en comparación con otras cepas encontradas en el laboratorio (LA 1-L. acidophilus 1, LA 2-L. acidophilus 2, L. casei y VRI 002), ya que las placas de Peyer actúan como sitio de muestreo para el sistema inmunitario en el intestino. Esta adhesión potenciada de la cepa VRI 003 de L. fermentum a placas de Peyer conducirá a un efecto inmunoestimulante potenciado de esta cepa.
(b) Fijación de VRI 003 de L. fermentum a placas de Peyer mediada por proteína
Para caracterizar el mecanismo de fijación a las placas de Peyer, se pretrataron células de L. fermentum antes del ensayo de adhesión con enzimas proteinasa y metaperyodato para determinar si los polisacáridos o proteínas estaban implicados en la adhesión. Se mostró que el tratamiento con metaperyodato aumentaba la adhesión, y por lo tanto sin estar ligado a teoría alguna, puede concluirse que los polisacáridos extracelulares no estaban implicados en la adhesión y, de hecho, reducían la fijación. El tratamiento de células de L. fermentum con enzimas proteinasa reducía drásticamente la fijación, implicando así a las proteínas de pared celular en la fijación a placas de Peyer. Además, los extractos de superficie celular podían bloquear significativamente la unión cuando se añadían al tejido antes de la adición de las células de L. fermentum enteras, confirmando la presencia de un resto con afinidad por las placas de Peyer en la superficie de la pared celular de VRI 003 de L. fermentum.
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TABLA 1 Efecto de tratamientos químicos y enzimáticos de VRI 003 de L. fermentum y tejidos de placa de Peyer sobre la adherencia
1
Los datos se expresan como medias \pm errores estándar medios. Se pretrataron la VRI 003 de L. fermentum o las placas de Peyer con los diversos tratamientos antes de incluirse en el ensayo de adhesión.
Un análisis bidimensional de las proteínas de pared celular extraídas de células VRI 003 de L. fermentum, y comparadas con las paredes celulares de LMG de L. fermentum, que se ha mostrado anteriormente que no se adhieren a placas de Peyer, muestra que la VRI 003 regula positivamente dos proteínas de pared celular y regula negativamente la expresión de una serie de otras proteínas de pared celular (Figura 4) en comparación con LMG de L. fermentum (Figura 5).
(c) Adhesión a mucosa intestinal humana
Se sometieron a endoscopia sujetos que tomaban L. fermentum en forma de un polvo liofilizado en una cápsula de gelatina (10-11 unidades logarítmicas al día durante 14 días) y se tomó una biopsia de la pared del intestino delgado. Se lavó la biopsia y se homogeneizó antes de diluir en serie y sembrar en agar MRS para aislamiento de los lactobacilos adherentes. Se purificaron los lactobacilos adherentes y se probó que eran VRI 003 de L. fermentum usando anticuerpos específicos de VRI 003.
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(vii) Efecto de VRI 003 de L. fermentum sobre los parámetros de inmunidad (a) Efecto directo de VRI 003 de L. fermentum sobre los macrófagos
Se generaron macrófagos derivados de médula ósea y se estimularon con diferentes concentraciones de VRI 003 de L. fermentum durante 4 horas. Se administró VRI 003 de L. fermentum a alta concentración (multiplicidad de infección (MOI)-260, conc. 1) o a baja concentración (MOI-26, conc. 2).
Como puede observarse en la Figura 6, hay una respuesta de liberación de citocina dependiente de la concentración por los macrófagos. El día 1 después de la estimulación, los macrófagos que se estimularon con la concentración mayor de VRI 002 de L. fermentum o VRI 003 de L. fermentum produjeron significativamente más IL-12 en comparación con los macrófagos que habían recibido la concentración menor. Los niveles de IL-10 producidos por los macrófagos en respuesta a la estimulación por VRI 003 de L. fermentum eran muy bajos en comparación con los niveles de IL-12 producidos.
Esto es como se esperaba, ya que IL-12 e IL-10 se producen de forma mutuamente excluyente entre sí por macrófagos. Se cree que el nivel de IL-12 producido por macrófagos desempeña un papel significativo en la determinación de la respuesta inmunitaria dirigida contra un antígeno. La presencia de IL-12 en el entorno local de células dendríticas del tracto gastrointestinal ceba a linfocitos T hacia una respuesta de tipo Th1. Estos datos sugieren que la dosis mayor de VRI 003 de L. fermentum tiene la capacidad de sesgar al sistema inmunitario hacia una respuesta de Th1, y que esto se hace más eficazmente que por VRI 002 de L. fermentum.
(b) Efecto de VRI 003 de L. fermentum sobre los parámetros inmunitarios in vivo
Se administró a ratones BALB/c por vía oral 1 x 10^{9} ufc/ratón/día de VRI 003 de L. fermentum. Se sacrificaron los ratones en diferentes puntos temporales. Se extrajeron los bazos y placas de Peyer y se midieron los parámetros inmunitarios.
Se administró a ratones BALB/c por vía oral 1 x 10^{9} ufc/ratón/día de VRI 003 de L. fermentum durante 5 días. Los ratones de control recibieron PBS. Se sacrificaron los ratones el día 6. Se extrajeron bazos y placas de Peyer y se midieron los parámetros inmunitarios.
Como se muestra en la Figura 7, la alimentación oral con VRI 003 de L. fermentum durante 5 días conduce a la producción significativamente potenciada de IFN-\gamma e IL-12 por las placas de Peyer en comparación con el grupo de control y con la otra cepa de laboratorio usada en el experimento (otra cepa de L. fermentum, LF1). La Figura 8 muestra que la alimentación con VRI 003 de L. fermentum no parecía afectar a los niveles de citocina del bazo. Los niveles de IL-12 e IFN-\gamma de ratones alimentados con VRI 003 de L. fermentum eran comparables con los ratones de control (que se habían alimentando con PBS). Por lo tanto, la alimentación oral con VRI 003 de L. fermentum en ratones normales en ausencia de una infección activa estimula la inmunidad mucosa, y ceba para causar respuestas óptimas contra patógenos intestinales.
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(viii) Estabilidad del polvo liofilizado de VIR 003 de L. fermentum
La Figura 9 muestra que la VIR 003 es particularmente estable en cápsulas de gelatina cuando se combina con almidón resistente de baja actividad acuosa y se almacena a 25ºC y 30ºC.
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(ix) Adhesión
Aunque la capacidad de colonizar el tracto gastrointestinal humano no es un prerrequisito para la función activa de una cepa probiótica en el tracto digestivo, es una característica deseable. Si la cepa probiótica puede adherirse al epitelio del tracto gastrointestinal, puede colonizarlo, concretamente establecerse y crecer en el tracto, y producir continuamente metabolitos que pueden mediar el efecto beneficioso. La variante VRI 003 coloniza el tracto digestivo humano cuando se administra por vía oral a una serie de seres humanos.
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(x) Efectos antagonistas
A partir de estudios de inhibición patogénica in vitro, resultó evidente que la cepa produce metabolitos que inhiben el crecimiento de una serie de patógenos potenciales, tanto especies gramnegativas como grampositivas, incluyendo numerosas cepas de Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Candida albicans y Staphylococcus aureus.
Sin desear ligarse a mecanismo de acción alguno, para que una cepa probiótica proteja eficazmente al sujeto de patógenos del tracto gastrointestinal, puede necesitar producir algunos metabolitos inhibidores del crecimiento del patógeno. Este efecto inhibidor sobre el crecimiento se designa como un efecto antagonista y los metabolitos antagonistas pueden clasificarse como compuestos de bajo o alto peso molecular. Se han usado tres métodos diferentes para evaluar la capacidad antagonista de la cepa VRI 003 frente a una serie de patógenos humanos, a saber, un ensayo de cocul-
tivo en placa directo, cultivo en caldo de fluido de cultivo agotado de Lactobacillus y un modelo de exposición animal.
El método de placa directo se usó para examinar un gran número de patógenos usando inóculos puntuales de Lactobacillus superpuestos con los patógenos y midiendo el tamaño de la zona de inhibición del crecimiento del patógeno después de la incubación. Para cuantificar adicionalmente el efecto antagonista detectado usando este método, se cocultivó la VRI 003 con el patógeno en medio líquido y se contó el número de células patogénicas viables después de 24 horas. Se usó el tamaño de la zona para cuantificar la extensión de la inhibición.
Se examinó también la actividad inhibidora de la cepa VRI 003 para determinar si los metabolitos de bajo y alto peso molecular del lactobacilo mediaban los efectos inhibidores del crecimiento detectados. Se recogió el fluido de cultivo agotado bacteriano de VRI 003 y se dializó una parte para retener sólo los compuestos con un peso molecular mayor de 8.000. Se estudió el crecimiento de patógenos humanos seleccionados en ausencia y presencia de los retenidos de diálisis y los fluidos de cultivo agotado no dializado. Aunque el fluido de cultivo agotado esterilizado por filtración no
dializado prevenía el crecimiento de patógenos, los dializados exhibían efectos bacteriostáticos así como bactericidas.
A partir de estudios de inhibición patogénica in vitro, resultó evidente que la cepa produce metabolitos que inhiben el crecimiento de una serie de patógenos potenciales, tanto especies gramnegativas como grampositivas. La variante VRI 003 producía tanto metabolitos de bajo como de alto peso molecular que podían inhibir los patógenos y proteger en estudios de exposición en animales. La administración oral de la cepa a ratones expuestos a Salmonella previene la pérdida de peso observada que ocurre en ratones de control que reciben sólo Salmonella y no Lactobacillus.
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Ejemplo 3 Cultivo y formulaciones (i) Crecimiento del cultivo
Se cultiva la variante VRI 003 de Lactobacillus fermentum en un recipiente de fermentación a 37ºC. Se enfría después el recipiente y se concentra el caldo de fermentación, preferiblemente mediante centrifugación. Se seca el cultivo recogido, preferiblemente mediante liofilización y posteriormente se muele. Se combina después el material molido con el excipiente mayoritario para dar el nivel deseado de microbios por gramo de material seco. El nivel a usar depende de la aplicación (intervalo de hasta 11 unidades logarítmicas por gramo). Se usa entonces material estan-
darizado en la formulación mezclando todos los ingredientes en un mezclador (preferiblemente, un mezclador en V).
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(ii) Formulaciones
(a)
Formulación A: Basada en maíz rico en amilosa (formulación sinbiótica)
VRI 003 de Lactobacillus fermentum
100 mg
Maíz Hi 958 (o 1043)
170 mg
Ácido esteárico
hasta 4,5 mg
Dióxido de silicio
hasta 4,5 mg
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(b)
Formulación B: Basada en celulosa microcristalina (CMC)
VRI-003 de Lactobacillus fermentum
100 mg
Avicell Ph 112 (o equivalente)
170 mg
Ácido esteárico
hasta 4,5 mg
Dióxido de silicio
hasta 4,5 mg
(c)
Formulación C: Basada en maíz rico en amilosa o basada en CMC como se describen en A y B, con sílice coloidal (hasta 4,5 mg) en lugar de dióxido de sílice o con dióxido de sílice también (hasta 4,5 mg).
Una de las características deseadas de la VRI 003 es que permanece viable y tiene la capacidad de crecer en el tracto gastrointestinal humano después de la dosificación. Como se expone anteriormente, esta característica era uno de los criterios de selección de una cepa deseable. Sin embargo, esto no es necesariamente esencial para los efectos beneficiosos deseados.
Un factor importante adicional a este respecto es que, aunque la cepa tenga la capacidad de sobrevivir en diversas condiciones en el tracto, la cepa debe retener la viabilidad y las características de cepa deseadas cuando se cultiva a gran escala y se dispensa en forma de producto. Todos los resultados presentados anteriormente se basaron en células VRI 003 recogidas directamente de cultivos de laboratorio en crecimiento activo. El siguiente es un análisis de la viabilidad y características de cepa de VRI 003 después de cultivo a gran escala y liofilización, así como después de encapsulación en cápsulas de gelatina.
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(iii) Viabilidad de VRI 003 liofilizada
Se determinó la viabilidad de VRI 003 después de producción a gran escala y liofilización analizando las unidades formadoras de colonia por gramo (ufc/g) de material seco. Se examinó el polvo seco tanto antes como después de la encapsulación en cápsulas de gelatina. Se determinó el número de células viables para 10 muestras individuales de
1 g de polvo. Se analizaron también individualmente los contenidos de 10 cápsulas.
La VRI 003 mantenía altos niveles de viabilidad a lo largo de la producción y encapsulación. El polvo seco contenía 5,6 x 10^{10} ufc/g y los contenidos de las cápsulas contenían 4,15 x 10^{10} ufc/g, los resultados se expresan como media en la que n = 10.
Cuando se almacenaron las cápsulas en un envase bilaminado, se observó una pérdida de 1,5 unidades logarítmicas, o menos, de viabilidad con almacenamiento a 40ºC y 25ºC durante 6 meses.
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(iv) Características de la variante
Se suspendieron el polvo seco y los contenidos de cápsula en disolución salina tamponada con fosfato (0,1 M, pH 7,2), proporcionando una dilución de 100 veces. Se ensayaron en esta suspensión bacteriana las características de la variante expuestas anteriormente. Para todos los ensayos, se incluyó un cultivo en crecimiento activo de VRI 003 como control interno. Como se detalla a continuación, no se observó una pérdida marcada de las características de la variante para el polvo liofilizado o para los contenidos de cápsula.
Además, el polvo y los contenidos de cápsula mostraron características de adhesión similares a las de cultivos de control cultivados en laboratorio.
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Ejemplo 4 Efecto de la administración de VRI de Lactobacillus fermentum, VRI 003, con o sin un prebiótico, sobre los síntomas del síndrome del intestino irritable (SII) y el perfil de la flora gastrointestinal 
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(i) Diseño experimental Participantes
Participaron en el estudio 7 pacientes con SII (2 hombres y 5 mujeres) después de dar su consentimiento informado por escrito (HREC 99264). Ninguno de los pacientes había tomado antibióticos desde tres meses antes del inicio del estudio. Se examinaron todos los pacientes por un médico antes de la participación en el ensayo para la presentación de los criterios de diagnóstico de SII y la ausencia de enfermedad orgánica. Todos los pacientes eran sintomáticos en el momento del estudio.
Diseño del estudio
El ensayo con placebo con enmascaramiento único se extendió durante 8 semanas, consistente en 3 semanas de tratamiento con placebo seguido de 2 semanas de descanso (sin tratamiento) y concluyendo con 3 semanas de tratamiento sinbiótico, concretamente, tratamiento con una formulación que contiene la variante VRI 003 y un prebiótico. Se trató un grupo menor de pacientes con una formulación que contenía VRI 003 sola.
Las dietas de los pacientes no estaban controladas en el estudio, sin embargo se les recomendó que se abstuvieran de consumir productos lácteos fermentados (por ejemplo, yogur y crema agria). Se solicitaron muestras fecales recientes de los pacientes el día 1 del ensayo para formar el valor de referencia, y después los días 21, 35 y 56 (antes y después de cada periodo de tratamiento). Los pacientes completaron un cuestionario inicial el primer día del ensayo y, después de ello, los pacientes completaron cuestionarios semanales para cada semana del ensayo.
El protocolo de tratamiento típico fue el siguiente (en caso de una formulación sinbiótica, pero se usó un protocolo similar para una formulación con VRI 003 sola).
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Cápsulas y carbohidratos
Se rellenaron manualmente cápsulas vacías. Se efectuó el ensamblaje de cápsulas en una campana de flujo laminar y se esterilizaron los materiales durante 15 min bajo UV antes del uso. Las cápsulas de placebo contenían celulosa microcristalina NF XVIII (Mingtai Chemical Company Ltd., Taiwán), mientras que las cápsulas probióticas consistían en Lactobacillus fermentum (VRI 003) en forma de polvo liofilizado (1,67 x 10^{10} ufc/g, DSM Moorebank, Sydney). Se dispusieron las cápsulas ensambladas en recipientes de especímenes de 120 ml con dos saquitos de gel de sílice.
Se utilizaron maltodextrina (Fieldstar^{TM}, Goodman Fielder, Sydney) y almidón resistente (Culture Pro^{TM} 958, Penfold, Australia) como carbohidratos de placebo y prebiótico, respectivamente. Se dispusieron los carbohidratos bajo UV durante 15 min en una campana de flujo laminar antes de pesar las muestras (20 g) y disponer en recipientes de especímenes de 70 ml que se almacenaron en una sala limpia.
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Cuestionarios
Se usó un cuestionario inicial para establecer los síntomas previos y presentes del paciente antes del inicio del ensayo. Se pidió a los pacientes que evaluaran la gravedad de sus síntomas, incluyendo diarrea, estreñimiento, diarrea y estreñimiento alternados, flatulencia, meteorismo y dolor abdominal de tipo cólico en una escala de 0 (ausente) a 10 (extremo). Se preguntaron también otras cuestiones respecto a las causas y el alivio de alteraciones intestinales y alergias alimentarias.
Se solicitó a los pacientes que completaran un cuestionario semanal al final de cada semana durante el ensayo en el que de nuevo se les pidió evaluar la gravedad de sus síntomas y también la naturaleza de cualquier alteración intestinal. Además, se preguntaron también cuestiones respecto al consumo y los efectos aparentes de las cápsulas y carbohidratos.
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Preparación de material fecal
Se recogió el inóculo fecal de sujetos con SII que no habían tomados antibióticos desde 3 meses antes del inicio del ensayo. Se recogieron las heces en un envase de plástico limpio y se transfirieron a una cámara anaeróbica a su llegada. Se homogeneizó una parte de heces con tres partes de caldo Wilkin-Chalgrens (WC) semiconcentrado (Oxoid CM 643) en una bolsa Stomacher Seward.
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Recuento de bacterias
Se efectuó una dilución en serie de 10 veces en caldo Wilkin-Chalgrens (WC) semiconcentrado (Oxoid, CM643) en tubos de microcentrífuga estériles, después de los cual se sembraron por goteo por triplicado alícuotas de 10 \mul sobre diversos medios (Tabla 1) para evaluar el número de grupos microbianos importantes presentes en las muestras fecales. Se prepararon los medios según las recomendaciones del fabricante. Se calentaron en primer lugar a 90ºC durante 10 min muestras sembradas sobre placas RCA.
TABLA 1 Poblaciones bacterianas contadas en fermentación
2
(ii) Efectos de la administración de VRI 003 de L. fermentum sola o en combinación con un prebiótico - Compendio de resultados 
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TABLA 2 Efectos de la cepa VRI 003 de L. fermentum sobre la gravedad de los síntomas de SII cuando se administra sola o junto con un prebiótico (almidón de maíz rico en amilosa) (almidón resistente = AR). Los resultados se expresan como "-" que corresponde a sin síntomas a "+" hasta "+++", en que los síntomas más graves se presentan como "+++".
3
La administración de VRI 003 era eficaz incluso cuando se administraba sola. Sin embargo, la combinación de VRI 003 con almidón de maíz rico en amilosa elevaba los niveles de bacterias VRI 003 y reducía los niveles de ciertas bacterias tales como Salmonella y Clostridium en comparación con el probiótico solo o el beta-glucano solo.
Ejemplo 5 Cambios en los perfiles microbianos fecales usando material de sujetos con SII durante el ensayo
Se han obtenido resultados de los cambios en las aeróbicas totales, bacterias entéricas, anaeróbicas totales, anaeróbicas gramnegativas, lactobacilos, clostridios y bifidobacterias durante el ensayo. Los puntos temporales exhibidos en la gráfica son representativos del perfil microbiano fecal al inicio del ensayo (valor inicial), al final del tratamiento con placebo, al final del periodo de descanso y al final del tratamiento sinbiótico. Con respecto a los resultados, se separaron los sujetos en los subgrupos con predominio de diarrea, estreñimiento y diarrea y estreñimiento alternados, según los síntomas que experimentan normalmente con la afección. Este subagrupamiento permite evaluar apropiadamente a los sujetos debido a la amplia variabilidad de los síntomas experimentados por los afectados por la condición (Akehurst y Kaltenhaler, 2001). Sin embargo, un sujeto no se ajustó a ninguno de los tres subgrupos y se ha dispuesto en un grupo separado para predominio de flatulencia, meteorismo y dolor abdominal de tipo cólico.
Sujetos con predominio de diarrea
Se muestran los cambios en el perfil microbiano fecal de sujetos con predominio de diarrea en la figura 10 (sujeto 4), Figura 11 (sujeto 5) y Figura 12 (sujeto 9).
Sujeto 4 (Figura 10): Las aeróbicas totales permanecieron a un nivel constante de 1 x 10^{5} ufc/ml, excepto durante el periodo de descanso, en el que las aeróbicas totales aumentaron en una unidad logarítmica. Los números de bacterias entéricas que se detectaron inicialmente a 1 x 10^{5} ufc/ml se redujeron en 1,5 unidades logarítmicas al final del periodo de tratamiento sinbiótico, aunque las bacterias entéricas empezaron a exhibir una disparidad creciente en comparación con los números de aeróbicas totales al final del periodo de descanso. Tanto las anaeróbicas totales como las anaeróbicas gramnegativas, que empezaron a 5 x 10^{8} ufc/ml, exhibieron un aumento de 1 unidad logarítmica al final del periodo de tratamiento sinbiótico. Los lactobacilos se detectaron inicialmente a 1 x 10^{7} ufc/ml, y exhibieron una reducción de 2 unidades logarítmicas al final de los periodos de tratamiento con placebo y sinbiótico, que repuntaron de nuevo entremedias, durante el periodo de descanso. Los clostridios permanecieron indetectables a lo largo del ensayo, mientras que los números de bifidobacterias, que empezaron a 5 x 10^{7} ufc/ml, aumentaron en 1 unidad logarítmica durante el periodo de tratamiento sinbiótico.
Sujeto 5 (Figura 11): Las aeróbicas totales, que se detectaron inicialmente a 5 x 10^{5} ufc/ml, aumentaron en 1 unidad logarítmica durante los periodos de descanso y tratamiento sinbiótico. Las bacterias entéricas permanecieron a niveles similares a los de aeróbicas totales (5 x 10^{5} ufc/ml) durante todos los puntos temporales, excepto al final del periodo de tratamiento con placebo, en que los números de bacterias entéricas se redujeron en 2 unidades logarítmicas. Los números de anaeróbicas totales y anaeróbicas gramnegativas continuaron a lo largo del ensayo a un nivel constante de 1 x 10^{9} ufc/ml, aunque se redujeron en 1 a 1,5 unidades logarítmicas al final del periodo de tratamiento con placebo. Los lactobacilos, que empezaron a 1 x 10^{6} ufc/ml, se redujeron en 1 unidad logarítmica al final del periodo de tratamiento con placebo, pero aumentaron en 3 unidades logarítmicas al final del periodo de descanso, sólo para reducirse de nuevo en 1 unidad logarítmica al final del periodo de tratamiento sinbiótico. Se detectaron clostridios al inicio del ensayo a 1 x 10^{3} ufc/ml y permanecieron indetectables a lo largo del resto del ensayo. Las bifiodobacterias, que empezaron a 5 x 10^{8} ufc/ml, se redujeron en 1 unidad logarítmica al final del periodo de tratamiento con placebo y de tratamiento sinbiótico, pero aumentaron en 1 unidad logarítmica entremedias durante el periodo de descanso.
Sujeto 9 (Figura 12): Las aeróbicas totales y bacterias entéricas se detectaron a 1 x 10^{7} ufc/ml en los valores iniciales y procedieron a reducirse lentamente en 1,5 unidades logarítmicas al final del periodo de tratamiento sinbiótico. Las anaeróbicas totales y anaeróbicas gramnegativas se detectaron a 5 x 10^{8} ufc/ml en los valores iniciales, aumentaron en 1 unidad logarítmica al final del periodo de tratamiento con placebo y permanecieron a un nivel constante durante el resto del estudio. Los lactobacilos se detectaron a 5 x 10^{5} ufc/ml en los valores iniciales, sin embargo, se volvieron indetectables durante el periodo de tratamiento con placebo. Se detectaron de nuevo los lactobacilos a 5 x 10^{3} ufc/ml al final del periodo de descanso y aumentaron en 1 unidad logarítmica al final del periodo de tratamiento sinbiótico. Los clostridios estuvieron ausentes durante el ensayo. Las bifidobacterias empezaron a 5 x 10^{7} ufc/ml, se redujeron en 1,5 unidades logarítmicas al final del periodo de tratamiento con placebo, sin embargo aumentaron de nuevo a 5 x 10^{8} ufc/ml al final del periodo de descanso y permanecieron a este nivel hasta el final del periodo de tratamiento sinbiótico.
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Sujetos con predominio de estreñimiento
Se muestran los cambios en los perfiles microbianos fecales de sujetos con predominio de estreñimiento en la Figura 13 (sujeto 2) y la Figura 14 (sujeto 3).
Sujeto 2 (Figura 13): Las aeróbicas totales y bacterias entéricas se detectaron inicialmente a 1 x 10^{7} ufc/ml y permanecieron a niveles similares a lo largo del ensayo, excepto al final del periodo de tratamiento con placebo, en que los números de bacterias entéricas aumentaron en 1 unidad logarítmica. Los números de anaeróbicas totales y anaeróbicas gramnegativas permanecieron a niveles similares de 1 x 10^{8} ufc/ml a lo largo del ensayo, con un aumento de 1 unidad logarítmica al final del periodo de tratamiento con placebo, que se redujo en 0,5 unidades logarítmicas al final del periodo de tratamiento sinbiótico. Los lactobacilos, que empezaron a 1 x 10^{3} ufc/ml, aumentaron en 1 unidad logarítmica al final del periodo de tratamiento con placebo, pero se volvieron indetectables al final del periodo de descanso y aumentaron de nuevo en tres unidades logarítmicas al final del periodo de tratamiento sinbiótico. Los clostridios estaban presentes sólo al inicio del ensayo a 1 x 10^{3} ufc/ml y permanecieron indetectables a lo largo del resto del estudio. Las bifidobacterias se detectaron inicialmente a 1 x 10^{7} ufc/ml y se redujeron en 1,5 unidades logarítmicas al final del periodo de tratamiento con placebo, y se volvieron entonces indetectables durante el resto del ensayo.
Sujeto 3 (Figura 14): Las aeróbicas totales y bacterias entéricas permanecieron a niveles similares de 5 x 10^{-4} ufc/ml durante el ensayo y aumentaron en 2 unidades logarítmicas al final del periodo de tratamiento con placebo, aunque se redujeron en 1 unidad logarítmica al final del periodo de tratamiento sinbiótico. Las anaeróbicas totales y anaeróbicas gramnegativas empezaron a 1 x 10^{4} ufc/ml y siguió un aumento constante de 2 unidades logarítmicas al final del periodo de tratamiento sinbiótico. Los lactobacilos se detectaron al inicio del ensayo a 1 x 10^{4} ufc/ml, pero se volvieron después indetectables al final del periodo de tratamiento con placebo. Sin embargo, se mostró que los lactobacilos aumentaban en 4,5 unidades logarítmicas al final del periodo de descanso y se reducían de nuevo en 0,5 unidades logarítmicas al final del periodo de tratamiento sinbiótico. Los clostridios se detectaron sólo al final del periodo de tratamiento con placebo a 1 x 10^{4} ufc/ml y permanecieron indetectables durante el resto del ensayo. Las bifidobacterias, que empezaron a 1 x 10^{7} ufc/ml, no pudieron detectarse al final del periodo de tratamiento con placebo, aunque se volvieron detectables de nuevo al final del periodo de descanso y aumentaron en 4,5 unidades logarítmicas al final del periodo de tratamiento sinbiótico.
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Sujeto con predominio de diarrea y estreñimiento alternados
Se muestran los cambios en el perfil microbiano fecal de un sujeto con predominio de diarrea y estreñimiento alternados en la Figura 15 (sujeto 7).
Sujeto 7 (Figura 15): Las aeróbicas totales y bacterias anaeróbicas se detectaron inicialmente a 5 x 10^{5} ufc/ml, aumentaron en 2 unidades logarítmicas al final del periodo de descanso, sin embargo se redujeron en 1 unidad logarítmica al final del periodo de tratamiento sinbiótico. Las anaeróbicas totales y anaeróbicas gramnegativas empezaron a 5 x 10^{8} ufc/ml y permanecieron a un nivel constante a lo largo del estudio, hasta el periodo de tratamiento sinbiótico, en que las anaeróbicas totales se redujeron en 1 unidad logarítmica mientras que las anaeróbicas gramnegativas se redujeron en 2 unidades logarítmicas. Los lactobacilos no se detectaron durante la mayor parte del estudio, excepto al final del periodo de tratamiento sinbiótico a 5 a 10^{3} ufc/ml. En contraposición, los clostridios se detectaron sólo al inicio del ensayo a 1 x 10^{3} ufc/ml. Las bifidobacterias se detectaron inicialmente a 5 x 10^{6} ufc/ml, sin embargo se volvieron indetectables durante el periodo de tratamiento con placebo, sólo para detectarse de nuevo durante el periodo de descanso a 5 x 10^{7} ufc/ml, y aumentaron en 0,5 unidades logarítmicas al final del periodo de tratamiento sinbiótico.
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Otros: Sujeto con predominio de flatulencia, meteorismo y dolor abdominal de tipo cólico
Se muestran los cambios en el perfil microbiano fecal de un sujeto con predominio de flatulencia, meteorismo y dolor abdominal de tipo cólico en la Figura 16 (sujeto 6).
Sujeto 6 (Figura 16): Las aeróbicas totales y bacterias entéricas se detectaron inicialmente a 5 x 10^{5} ufc/ml y permanecieron constantes hasta el periodo de tratamiento sinbiótico, que observó un aumento de 2 unidades logarítmicas de aeróbicas totales y bacterias entéricas. Las anaeróbicas totales y anaeróbicas gramnegativas se detectaron a 1 x 10^{8} ufc/ml en los valores iniciales y aumentaron en 1 unidad logarítmica al final del periodo de tratamiento con placebo, después de lo cual permanecieron a este nivel durante el resto del estudio. Los lactobacilos permanecieron a un nivel relativamente estable de 1 x 10^{4} ufc/ml durante el estudio. Los clostridios no se detectaron durante el estudio, excepto al final del periodo de tratamiento sinbiótico a 5 x 10^{3} ufc/ml. Las bifidobacterias empezaron a 1 x 10^{7} ufc/ml y se redujeron en 3 unidades logarítmicas al final del periodo de tratamiento con placebo, sólo para aumentar de nuevo a 1 x 10^{7} ufc/ml durante el periodo de descanso y se redujeron finalmente en 3 unidades logarítmicas al final del periodo de tratamiento sinbiótico.
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Ejemplo 6 Cambios en la gravedad de los síntomas de sujetos de SII durante el ensayo
Se han obtenido resultados de los cambios en la gravedad de los síntomas incluyendo diarrea, estreñimiento, diarrea y estreñimiento alternados, flatulencia, meteorismo y dolor abdominal de tipo cólico. Cada síntoma se gradúa en una escala de 0 a 10, con 0 indicando ausencia del síntoma y 10 indicando gravedad extrema del síntoma. Se exhiben los resultados en una escala de 1 a 5, con 1 indicando gravedad leve del síntoma y 5 indicando gravedad extrema del síntoma. Se monitorizaron los cambios en la gravedad de los síntomas cada semana en todos los sujetos, sin embargo, los resultados exhibirán sólo puntos temporales que representan los valores iniciales (inicio del ensayo), el periodo de tratamiento con placebo, el periodo de descanso y el periodo de tratamiento sinbiótico. Se separaron de nuevo los sujetos en subgrupos de predominio de diarrea, estreñimiento y diarrea y estreñimiento alternados según los síntomas que experimentan normalmente con la afección.
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Sujetos con predominio de diarrea
Se muestran los cambios en la gravedad de los síntomas de sujetos con predominio de diarrea en la Tabla 3 (sujeto 4), Tabla 4 (sujeto 5) y Tabla 5 (sujeto 9).
Sujeto 4 (Tabla 3): La gravedad de la diarrea en los valores iniciales era extremadamente alta, sin embargo, ésta se redujo a la mitad de gravedad al final del periodo de tratamiento con placebo, que se redujo adicionalmente a gravedad baja al final del periodo de tratamiento sinbiótico. La flatulencia y meteorismo estaban a una gravedad media (3) en los valores iniciales y eventualmente se redujeron a una gravedad baja (1) al final del periodo de tratamiento sinbiótico. El dolor abdominal de tipo cólico era también bajo (2) al inicio de los valores iniciales y se redujo adicionalmente de gravedad hasta 1 al final del periodo de tratamiento sinbiótico.
TABLA 3 Cambios en la gravedad de los síntomas del sujeto nº 4 durante un ensayo de 8 semanas. Se monitorizó la gravedad de los síntomas durante los periodos de valores iniciales, placebo, descanso y tratamiento sinbiótico. Los resultados se expresan como + (gravedad baja) a +++++ (gravedad extrema)
4 
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Sujeto 5 (Tabla 4): La gravedad de la diarrea en los valores iniciales era extremadamente alta y se redujo sólo ligeramente a 4 en el periodo de tratamiento con placebo, después del cual permaneció con gravedad alta. La flatulencia era baja en los valores iniciales, ausente durante el periodo de tratamiento con placebo, pero aumentó de nuevo durante los periodos de descanso y tratamiento sinbiótico en 1 y 2, respectivamente. La gravedad del dolor abdominal de tipo cólico permaneció al mismo nivel de 3 a lo largo del ensayo, pero se redujo un poco en 1 durante el periodo de descanso. Los síntomas de flatulencia y meteorismo permanecieron ausentes a lo largo del ensayo.
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TABLA 4 Cambios en la gravedad de los síntomas del sujeto nº 5 durante un ensayo de 8 semanas. Se monitorizó la gravedad de los síntomas durante los periodos de valores iniciales, placebo, descanso y tratamiento sinbiótico. Los resultados se expresan como + (gravedad baja) a +++++ (gravedad extrema)
5 
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Sujeto 9 (Tabla 5): La diarrea empezaba a un valor medio (3) en los valores iniciales y continuaba a esta gravedad hasta el periodo de tratamiento sinbiótico, en que se redujo en 2 hasta gravedad baja. El estreñimiento estaba ausente durante el ensayo, aparte del periodo de tratamiento con placebo, en el que aumentó en 1. La flatulencia estaba también ausente durante el ensayo, sin embargo aumentó en 3 durante el periodo de descanso. El meteorismo, que era de gravedad media (3) en los valores iniciales, se redujo en 1 durante el periodo de tratamiento con placebo. Sin embargo, éste aumentó de nuevo en 1 durante el periodo de descanso y después cayó a gravedad baja (1) durante el periodo de tratamiento probiótico. El dolor abdominal de tipo cólico estaba ausente a lo largo del ensayo.
TABLA 5 Cambios en la gravedad de los síntomas del sujeto nº 9 durante un ensayo de 8 semanas. Se monitorizó la gravedad de los síntomas durante los periodos de valores iniciales, placebo, descanso y tratamiento sinbiótico. Los resultados se expresan como + (gravedad baja) a +++++ (gravedad extrema)
6 
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Sujetos con predominio de estreñimiento
Se muestran los cambios en la gravedad de los síntomas de sujetos con predominio de estreñimiento en la Tabla 6 (sujeto 2) y Tabla 7 (sujeto 3).
Sujeto 2 (Tabla 6): La diarrea, que estaba ausente en los valores iniciales y durante la mayor parte del ensayo, aumentó en 1 durante el periodo de tratamiento sinbiótico. El estreñimiento, flatulencia y meteorismo permanecieron con gravedad alta (5) en los valores iniciales y durante los periodos de placebo y descanso, aunque se redujeron en 1 durante el periodo de tratamiento sinbiótico. El dolor abdominal de tipo cólico era de gravedad alta (4) en los valores iniciales y durante el periodo de tratamiento con placebo, sin embargo, se redujo en 3 hasta gravedad baja durante el descanso y el periodo de tratamiento sinbiótico.
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TABLA 6 Cambios en la gravedad de los síntomas del sujeto nº 2 durante un ensayo de 8 semanas. Se monitorizó la gravedad de los síntomas durante los periodos de valores iniciales, placebo, descanso y tratamiento sinbiótico. Los resultados se expresan como + (gravedad baja) a +++++ (gravedad extrema)
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Sujeto 3 (Tabla 7): El estreñimiento empezó con gravedad baja (2) en los valores iniciales y continuó a este nivel durante el periodo de tratamiento con placebo, sin embargo, desapareció durante los periodos de descanso y tratamiento sinbiótico. La flatulencia empezó con una gravedad muy alta (5) en los valores iniciales, se redujo a 3 durante el periodo de tratamiento con placebo y se redujo adicionalmente hasta gravedad baja (2) durante los periodos de descanso y tratamiento sinbiótico. El meteorismo empezó también con muy alta gravedad en los valores iniciales y pudo reducirse también en gravedad durante los periodos de placebo, descanso y tratamiento sinbiótico a 4, 3 y 3 respectivamente. El dolor abdominal de tipo cólico empezó con gravedad alta (4) en los valores iniciales y se redujo a gravedad baja (1) durante el periodo de tratamiento con placebo, después de lo cual desapareció durante el resto del ensayo. La diarrea estuvo ausente durante el ensayo.
TABLA 7 Cambios en la gravedad de los síntomas del sujeto nº 3 durante un ensayo de 8 semanas. Se monitorizó la gravedad de los síntomas durante los periodos de valores iniciales, placebo, descanso y tratamiento sinbiótico. Los resultados se expresan como + (gravedad baja) a +++++ (gravedad extrema)
8 
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Sujeto con predominio de diarrea y estreñimiento alternados
Se muestran los cambios en la gravedad de los síntomas de un sujeto con predominio de diarrea y estreñimiento en la Tabla 8 (sujeto 7).
Sujeto 7 (Tabla 8): La diarrea empezó con gravedad baja (1) en los valores iniciales pero aumentó a 2 durante los periodos de descanso y tratamiento sinbiótico. El estreñimiento, que era de gravedad baja (2) en los valores iniciales, se redujo en 1 durante los periodos de placebo y descanso, pero aumentó a 3 durante el periodo de tratamiento sinbiótico. La flatulencia empezó con gravedad baja (1) en los valores iniciales y permaneció baja durante la mayor parte del ensayo, sin embargo aumentó a 3 durante el periodo de tratamiento sinbiótico. El meteorismo empezó con gravedad baja (2) y se redujo a 1 durante el periodo de tratamiento con placebo, sin embargo siguió aumentando durante los periodos de descanso y tratamiento sinbiótico a 3 y 4, respectivamente. El dolor abdominal de tipo cólico estaba ausente durante el ensayo, excepto durante el periodo de tratamiento sinbiótico, cuando aumentó a una gravedad media (3).
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TABLA 8 Cambios en la gravedad de los síntomas del sujeto nº 7 durante un ensayo de 8 semanas. Se monitorizó la gravedad de los síntomas durante los periodos de valores iniciales, placebo, descanso y tratamiento sinbiótico. Los resultados se expresan como + (gravedad baja) a +++++ (gravedad extrema)
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Otros: Sujeto con predominio de flatulencia, meteorismo y dolor abdominal de tipo cólico
Se muestran los cambios en la gravedad de los síntomas de un sujeto con predominio de flatulencia, meteorismo y dolor abdominal de tipo cólico en la Tabla 9 (sujeto 6).
Sujeto 6 (Tabla 9): La diarrea estaba ausente durante la mayoría del ensayo, excepto durante el periodo de tratamiento sinbiótico, en el que aumentó en 1 a gravedad baja. La flatulencia empezó con gravedad media (3) en los valores iniciales y se redujo a gravedad baja (1) durante los periodos de placebo y descanso, sin embargo aumentó hasta gravedad media (3) de nuevo durante el periodo de tratamiento sinbiótico. El meteorismo empezó también con gravedad media (3) en los valores iniciales y desapareció durante el periodo de tratamiento con placebo, sin embargo, aumentó de nuevo durante los periodos de descanso y tratamiento sinbiótico a 1 y 3, respectivamente. El dolor abdominal de tipo cólico empezó con gravedad baja (2) en los valores iniciales, desapareció durante el periodo de tratamiento con placebo, pero aumentó en 1 y 3 durante los periodos de descanso y tratamiento sinbiótico, respectivamente. El estreñimiento permaneció ausente durante el ensayo.
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TABLA 9 Cambios en la gravedad de los síntomas del sujeto nº 6 durante un ensayo de 8 semanas. Se monitorizó la gravedad de los síntomas durante los periodos de valores iniciales, placebo, descanso y tratamiento sinbiótico. Los resultados se expresan como + (gravedad baja) a +++++ (gravedad extrema)
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Exposición Correlaciones entre los cambios en el perfil microbiano fecal usando material de sujetos con SII y la gravedad de los síntomas durante el ensayo
El ensayo clínico duró un total de 8 semanas, implicando las 3 primeras semanas el tratamiento con placebo consistente en cápsulas de maltodextrina y celulosa. Este fue seguido por un periodo de descanso de 2 semanas en el que no se tomó tratamiento. Las últimas 3 semanas implicaban un tratamiento sinbiótico consistente en cápsulas de VRI 003 y AR. Se recogieron muestras fecales al inicio del ensayo para establecer unos valores iniciales, después de los cuales se tomaron muestras adicionales antes y después de cada periodo de tratamiento. Además, cada paciente completó también cuestionarios semanales para monitorizar los cambios en la gravedad de sus síntomas mediante un sistema de puntuación graduado de 0 a 10, siendo 0 la ausencia del síntoma y siendo 10 la más grave. Se convirtieron después los resultados a una escala de 1 a 5 por conveniencia y se muestran para los periodos de valores iniciales, placebo, descanso y tratamiento sinbiótico.
Se agruparon los pacientes en 3 subgrupos según la predominancia de sus síntomas, como se muestra por Akehurst et al. y Weston et al. (Akehurst y Kaltenhaler, 2001; Weston et al., 1993). Separar los pacientes en subgrupos con predominancia de diarrea, estreñimiento o diarrea y estreñimiento alternados permite evaluar en consecuencia los cambios en los síntomas particulares, debido a la amplia variabilidad entre diferentes pacientes en los síntomas que normalmente experimentan con la afección. Un sujeto en particular (nº 6) exhibía síntomas distintos de los experimentados por cualquiera de los demás pacientes de los 3 subgrupos, y se agrupó por tanto en un grupo de otros para síntomas predominantes de flatulencia, meteorismo y dolor abdominal de tipo cólico.
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Sujetos con predominio de diarrea
El sujeto 4 exhibía una reducción general de la gravedad de todos los síntomas (Tabla 3) al final del periodo de tratamiento sinbiótico, en particular de diarrea, que empezó con gravedad alta en los valores iniciales y prosiguió después a gravedad baja al final del periodo de tratamiento sinbiótico. Puede observarse una posible correlación con este síntoma en la lenta reducción de bacterias entéricas (Figura 10) desde 1 x 10^{5} ufc/ml en los valores iniciales hasta 5 x 10^{3} ufc/ml al final del periodo de tratamiento sinbiótico. Los números de lactobacilos no parecen correlacionarse con ninguno de los síntomas exhibidos por el sujeto 4, sin embargo, se observó que las bifidobacterias aumentaban en 1 unidad logarítmica durante el periodo de tratamiento sinbiótico, lo que se correlaciona con la exposición anterior de que las bifidobacterias son capaces de utilizar AR. Sin embargo, es improbable que el aumento en bifidobacterias diera como resultado la reducción de la diarrea, ya que la reducción en la gravedad de este síntoma empezó durante el periodo de placebo, así que puede ser que en este sujeto las bacterias entéricas puedan tener más efecto sobre la gravedad de la diarrea.
El sujeto 5 no parecía exhibir una reducción global de la gravedad de ningún síntoma (Tabla 4) durante el ensayo. Sin embargo, puede observarse que durante el periodo de tratamiento con placebo se observó ausencia de flatulencia, lo que puede relacionarse con una reducción de 2 unidades logarítmicas en los números de bacterias entéricas (Figura 11). La visión general de este sujeto indicaría que el tratamiento sinbiótico no parecía promover ningún efecto beneficioso sobre el individuo, sino que en lugar de ello el tratamiento con placebo puede haber tenido cierto efecto beneficioso sobre la gravedad de los síntomas. Los números de lactobacilos aumentaron en 3 unidades logarítmicas durante el periodo de descanso, aunque se redujeron en 1 unidad logarítmica al final del periodo de tratamiento sinbiótico. El gran aumento de lactobacilos durante el periodo de descanso puede relacionarse también con la reducción de dolor abdominal de tipo cólico exhibida por el sujeto durante este tiempo, que aumentó después en gravedad al final del periodo de tratamiento sinbiótico, junto con un aumento menor de los lactobacilos durante este periodo. La observación de un aumento de lactobacilos asociado a una reducción del dolor abdominal de tipo cólico puede relacionarse también con el descubrimiento de Nobaek et al., que observaron que la administración de Lactobacillus plantarum reducía el dolor y la flatulencia en pacientes con SII (Nobaek et al., 2000). Se observó también 1 unidad logarítmica de aumento de bifidobacterias durante el periodo de descanso, que se correlaciona también con un aumento de lactobacilos, ya que se establece la hipótesis de que las bifidobacterias promueven indirectamente el crecimiento de lactobacilos. Aunque los síntomas no parecían mejorar durante el periodo de tratamiento sinbiótico en este sujeto, los comentarios en los cuestionarios semanales indican que los síntomas permanecieron iguales durante el tratamiento, en lugar de aumentar de gravedad.
El sujeto 9 exhibía una mejora global de la gravedad de todos los síntomas (Tabla 5) al final del ensayo, particularmente de diarrea y meteorismo, que se había reducido desde gravedad media hasta gravedad baja al final del periodo de tratamiento sinbiótico. La reducción de estos síntomas puede estar relacionada con una reducción de 2 unidades logarítmicas de bacterias entéricas desde los valores iniciales hasta el final del periodo de tratamiento sinbiótico. Se observó también que las bifidobacterias aumentaban en 3 unidades logarítmicas después del periodo de tratamiento con placebo. Sin embargo, este aumento empezó durante el periodo de descanso cuando los síntomas seguían a gravedad media, de modo que los números de bifidobacterias pueden no haber tenido efecto sobre la reducción de los síntomas durante el periodo de tratamiento sinbiótico. Se observó también que los números de lactobacilos aumentaban (1 unidad logarítmica) al final del periodo de tratamiento sinbiótico, lo que puede correlacionarse con la reducción de la gravedad de los síntomas. El aumento de bifidobacterias y lactobacilos puede asociarse también con la administración de AR, que se ha mostrado que promueve el crecimiento de bifidobacterias y por tanto lactobacilos (Brown et al., 2000).
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Sujetos con predominio de estreñimiento
El sujeto 2 no parecía exhibir una mejora de la mayoría de los síntomas (Tabla 6), aparte del dolor abdominal de tipo cólico, que se redujo en gran medida durante el periodo de descanso y de tratamiento sinbiótico. Los resultados del perfil microbiano fecal (Figura 13) muestran que, durante el periodo de tratamiento sinbiótico, las bifidobacterias no pudieron detectarse y se observó una reducción (1 unidad logarítmica) de aeróbicas totales y bacterias entéricas durante este tiempo. Esto indicaría que la reducción de bacterias entéricas puede reducir los síntomas de dolor abdominal de tipo cólico, sin embargo puede especularse sólo que la ausencia de bifidobacterias pueda estar relacionada también con una reducción del síntoma, ya que las bifidobacterias se percibe que son beneficiosas en el intestino humano. El perfil microbiano fecal del sujeto 2 muestra también que los lactobacilos no se promovieron a altos números durante el periodo de tratamiento sinbiótico. Esto puede ser debido a los bajos números de partida de los lactobacilos en el intestino del sujeto, que pueden requerir un periodo de tiempo más largo para estimular números mayores. Aunque el sujeto no mostraba una mejora global de los síntomas, los cuestionarios semanales indican que los síntomas que se experimentaron durante el ensayo permanecieron constantes y no aumentaron en gravedad.
El sujeto 3 exhibía una mejora general global en la gravedad de los síntomas (Tabla 7), particularmente de estreñimiento y dolor abdominal de tipo cólico, que remitieron al final del periodo de descanso y tratamiento sinbiótico. La mejora de estos síntomas puede estar correlacionada con el gran aumento (4 unidades logarítmicas) del número de bifidobacterias (Figura 5) al final del periodo de tratamiento sinbiótico. El aumento de bifidobacterias indica que la administración de AR durante el periodo de tratamiento sinbiótico ha estimulado el crecimiento de bifidobacterias. Se ha mostrado también que la administración de fibra dietética (por ejemplo, AR) reduce los síntomas de estreñimiento mediante voluminización fecal (Lambert, et al., 1991; Phillips, et al., 1995). Aunque los números de lactobacilos permanecían bajos en comparación con las bifidobacterias durante el ensayo, es posible que si el ensayo se extendiera durante un periodo de tiempo más largo, los lactobacilos podrían aumentar en número en mayor medida. Las bacterias entéricas se redujeron también (1 unidad logarítmica) al final del periodo de tratamiento sinbiótico y, aunque sólo es una reducción menor, puede haber contribuido también a la reducción de la gravedad de los síntomas.
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Sujeto con predominio de diarrea y estreñimiento alternados
El sujeto 7 exhibe una mejora de todos los síntomas (Tabla 6) durante el periodo de tratamiento con placebo, mientras que exhibe un aumento de la gravedad de los síntomas durante el periodo de tratamiento sinbiótico. Se observó un aumento gradual del número de bacterias entéricas (Figura 15) durante el ensayo, lo que sugiere que un aumento de las bacterias entéricas puede estar relacionado con un aumento de síntomas tales como meteorismo y diarrea. Sin embargo, es una nota importante a considerar que la administración de prebióticos, tales como AR, es probable que aumente los síntomas de meteorismo y flatulencia, incluso en pacientes sanos (Cummings et al., 2001; Munster et al., 1994), de modo que no es improbable un aumento de estos síntomas experimentados por un sujeto con SII. Se observó también un aumento en el número de bifidobacterias durante el periodo de descanso, aunque no se pudieron detectar durante el periodo de tratamiento con placebo, implicando que un aumento de las bifidobacterias puede estar quizás relacionado con un aumento de la gravedad de estos síntomas. Se observó también que las bifidobacterias se detectaban en muy altos números en medios RB y se ha observado que pueden detectarse otras especies de bacterias aparte de bifidobacterias en estas placas, tales como especies de lactobacilos (Hartemink et al., 1996). Por tanto, pueden tener que efectuarse ensayos bioquímicos en las colonias que crecen en medio RB para confirmar que eran todas especies de bifidobacterias.
Aunque los síntomas parecían aumentar en gravedad durante el periodo de tratamiento sinbiótico, los comentarios en los cuestionarios semanales indican que la experiencia de estos síntomas fue normal con respecto a los valores iniciales.
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Otros: Sujeto con predominio de flatulencia, meteorismo y dolor abdominal de tipo cólico
Los cambios en la gravedad de los síntomas observados para el sujeto 6 (Tabla 9) muestran que este sujeto experimentó una reducción de la gravedad de los síntomas durante el periodo de tratamiento con placebo, mientras que el periodo de tratamiento sinbiótico parecía tener un efecto adverso sobre los síntomas. Se observó que los números de bifidobacterias, y en una menor medida de lactobacilos, se redujeron (figura 16) durante el periodo de tratamiento con placebo. Las bifidobacterias se redujeron en número en 3 unidades logarítmicas durante el periodo de tratamiento con placebo, correspondiente a una reducción de flatulencia y ausencia de meteorismo y dolor abdominal de tipo cólico. Sin embargo, sólo puede sugerirse que las bifidobacterias pueden estar relacionadas con un aumento de estos síntomas, ya que se considera que son bacterias beneficiosas. Debe tomarse también en cuenta que la administración de prebióticos, particularmente AR, se ha mostrado que aumenta los síntomas de meteorismo y flatulencia (Cummings et al., 2001; Munster et al., 1994), que eran síntomas exhibidos por el sujeto 6 durante la administración de AR durante el periodo de tratamiento sinbiótico. La mejora general de la gravedad de los síntomas durante el periodo de tratamiento con placebo puede atribuirse también al posible efecto voluminizador causado por la celulosa y por tanto la facilidad de defecación. Los cuestionarios semanales indican también que el sujeto consumió una pequeña cantidad de alcohol durante el periodo de descanso, lo que puede haber agravado un aumento de los síntomas. Además, se observó que este sujeto experimentaba estrés durante el periodo de tratamiento sinbiótico, lo que puede haber aumentado también la gravedad de los síntomas, como se observa en otros (Lidbeck y Nord, 1994; Longstreth y Wolde-Tsadik,
1993).
Los resultados del ensayo de perfiles microbianos fecales indican una reducción general del número de bacterias entéricas correlacionada con una reducción de la gravedad de los síntomas. Un aumento del número de lactobacilos se ha asociado también con una mejora de algunos síntomas, tales como una reducción de la flatulencia (sujeto nº 5). Sin embargo, los lactobacilos no parecen ejercer un efecto muy destacado en términos de mejora de los síntomas. En comparación, los aumentos de bifidobacterias puede parecer que tienen cierta correlación con la gravedad de los síntomas, aunque puede ser mixta. Puede observarse que un aumento de bifidobacterias está relacionado con una reducción del estreñimiento y el dolor abdominal de tipo cólico (sujeto nº 3), sin embargo, los aumentos de bifidobacterias pueden estar también asociados a un aumento de la flatulencia y el dolor abdominal de tipo cólico (sujeto nº 7). Quizás, diferentes especies de bifidobacterias puedan estar implicadas en los aumentos o reducciones de la gravedad de los síntomas, o puede ser que diferentes pacientes estén afectados por la colonización de diferentes microorganismos intestinales, lo que afecta a los niveles de bifidobacterias en el tracto gastrointestinal.
El ensayo ha proporcionado resultados preliminares que demuestran cambios favorables en los perfiles microbianos fecales y en la gravedad de los síntomas de pacientes con SII cuando se les administra una formulación sinbiótica que contiene VRI 003 y AR, o VRI 003 sola.
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Ejemplo 7 Tratamiento de eccema
Una paciente de 21 años presentaba eccema grave diagnosticado clínicamente manifestado por un sarpullido extendido por todo el cuerpo y capilares dilatados en las mejillas. La piel es muy seca y se siente tirante debido a la sequedad. El tratamiento en la presentación incluía cremas con cortisona e hidratante diariamente.
El tratamiento con VRI 003 de L. fermentum empezó con 3 cápsulas por la mañana con las comidas y 3 cápsulas por la tarde con comida diariamente, cada cápsula contenía 4,2 x 10^{10} ufc. Se aplicaron hidratantes y cremas de cortisona como de costumbre. Después de 2 semanas de administración oral de L. fermentum, se redujo la gravedad del eccema en 2 unidades usando una escala analógica visual (VAS, escala 1-10 con 1 = bajo y 10 = grave), se redujo el enrojecimiento de la piel, se redujo la alergia en 2 unidades usando VAS y la textura de la piel mejoró ligeramente. Se redujo también el prurito y se observó menos descamación. Globalmente, hubo una mejora de la calidad de vida de la paciente.
Ejemplo 8 Paciente con eccema con alteraciones intestinales
Un paciente de 33 años presentaba eccema diagnosticado clínicamente en forma de piel inflamada, con prurito y seca y con llagas abiertas. El tratamiento previo incluía ungüentos de esteroides. Después de una apendectomía, el sujeto experimentó también problemas intestinales.
El tratamiento con VRI 003 de L. fermentum comenzó con 3 cápsulas por la mañana con las comidas y 3 cápsulas por la tarde con comida diariamente, cada cápsula contenía 4,2 x 10^{10} ufc. Después de 2 semanas de tomar VRI 003 de L. fermentum, el sujeto reseñó reducción del prurito asociado a su eccema. Igualmente, experimentó una mejora de su salud gastrointestinal, concretamente, las visitas al baño se redujeron considerablemente.
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Ejemplo 9 Enfermedad de Crohn con fatiga crónica y mala absorción/disponibilidad de minerales y vitaminas
Una mujer de 35-40 años con enfermedad de Crohn durante más de 10 años consumió 3 cápsulas cada mañana y noche con comida (cada cápsula contenía 4 x 10^{10} ufc de VRI 003 de L. fermentum) y después de una semana los síntomas de diarrea, cólico, dolor abdominal, fatiga constante y retención de líquidos se redujeron drásticamente. Las heces se volvieron formadas. Los niveles de hierro y vitamina B12 eran excelentes, confirmando así que la presencia de VRI 003 de L. fermentum en el intestino mejoraba la absorción y/o biodisponibilidad de hierro y vitamina B12.
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Ejemplo 10 Efectos de probiótico VRI 003 de L. fermentum sobre pacientes con el síndrome del intestino irritable (SII)
Se realizó un ensayo aleatorizado multicéntrico cruzado en pacientes de SII para ver los efectos de VRI 003 de L. fermentum probiótico en la reducción de la gravedad de las alteraciones gastrointestinales observadas en SII. Se llevó a cabo el estudio durante un total de 18 semanas (2 semanas de seguimiento después de la terminación del estudio) en las que los sujetos recibieron un tratamiento activo y con placebo. Los detalles del esquema de tratamiento probiótico son los siguientes:
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Este estudio se orientó a sujetos que pertenecían al grupo de edad de 17-74 años de edad que satisfacían los criterios IBS Rome, verificados por un asistente médico. Sin embargo, el estudio excluyó a pacientes que experimentaban infecciones gastrointestinales y cualquier otro tipo de enfermedad orgánica (por ejemplo, enfermedad hepática, etc.). Se aconsejó también vivamente a los voluntarios que no tomaran ninguna otra clase de probióticos durante la participación en el estudio.
Historial del paciente: Una mujer blanca de 54 años que tenía SII desde su adolescencia. Los síntomas de SII activos incluyen diarrea y meteorismo, especialmente por la tarde. Los síntomas del sujeto 1 se agravan cuando come alimentos ricos en contenido de azúcar tales como tartas, pastas y chocolate.
Tratamiento: Se tomó 1 cápsula de VRI 003 de L. fermentum por la mañana y por la tarde con comida. Cada cápsula contenía 3 x 10^{10} VRI 003/cápsula.
Evaluación de los síntomas: Tomar 1 cápsula de VRI 003 de L. fermentum por la mañana y por la tarde dio como resultado un movimiento intestinal regular. Las heces se volvieron más firmes y consistentes y hubo una reducción de la intensidad del meteorismo. Sin embargo, la VRI 003 de L. fermentum no minimizaba los síntomas cuando se tomaba comida rica en azúcar en la dieta ni empeoró los síntomas.
Ejemplo 11 Beneficios de VRI 003 de L. fermentum para síntomas de rosácea
Un hombre de 45-55 años de edad con SII activo y rosácea en la cara se había tratado durante años por su dermatólogo por el enrojecimiento y lesiones que son manifestaciones de la afección rosácea. Mientras se trataba por SII con VRI 003 de L. fermentum (10-11 unidades logarítmicas de ufc al día en una cápsula de gelatina), el paciente experimentó una reducción extrema del enrojecimiento y las lesiones de su cara debidas a rosácea y pudo dejar de usar cremas antibióticas y cremas con esteroides. La afección de su cara se mantuvo en remisión mientras tomaba VRI 003 de L. fermentum.
Aunque la invención se ha descrito con referencia a estos ejemplos específicos, se apreciará por los expertos en la técnica que la invención puede realizarse de muchas otras formas.

Claims (25)

1. Variante de Lactobacillus fermentum aislada que tiene las siguientes características:
(a)
es grampositiva, facultativamente un bacilo,
(b)
fermenta ribosa, galactosa, glucosa, fructosa, manosa, maltosa, lactosa, melibiosa, sacarosa, trehalosa, rafinosa, L-arabinosa y manitol,
(c)
sobrevive a pH 1,5 durante hasta 4 horas con una pérdida de crecimiento no mayor de 3 unidades logarítmicas,
(d)
se propaga en presencia de sal biliar al 0,5% a 37ºC, dando como resultado un aumento de densidad óptica de 0,5 a 0,8,
(e)
es estable cuando se almacena en cápsulas de gelatina a 25ºC,
(f)
se adhiere a placas de Peyer a más de 5 ufc por mg de tejido, inhibiendo patógenos tanto mediante un efecto antagonista directo como desencadenando una modulación inmunitaria;
en la que dicha variante es VRI 003 (número de acceso NM02/31074).
2. Composición que comprende una variante de Lactobacillus fermentum según la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.
3. Composición según la reivindicación 2, que comprende adicionalmente un prebiótico, un componente dietético no digerible, fibra dietética o un compuesto farmacéuticamente activo.
4. Composición según la reivindicación 3, en la que el prebiótico es inulina, un almidón resistente, un oligosacárido, una goma o un beta-glucano.
5. Composición según la reivindicación 4, en la que dicho prebiótico es almidón rico en amilosa no modificado o beta-glucano.
6. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en la que dicha composición comprende células vivas de la variante de Lactobacillus fermentum.
7. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en la que dicha composición comprende células muertas de la variante de Lactobacillus fermentum.
8. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en forma de un comprimido, cápsula, polvo, pasta, gel, formulación líquida, suplemento dietético o producto alimentario.
9. Composición según la reivindicación 8, en la que dicha composición está en forma de un comprimido.
10. Composición según la reivindicación 8, en la que dicha composición está en forma de un producto alimentario.
11. Composición según la reivindicación 10, en la que dicho producto alimentario es un producto alimentario lácteo o basado en lácteos.
12. Composición según la reivindicación 8, en la que dicha composición está en forma de una formulación líquida.
13. Composición según la reivindicación 8, en la que dicha composición está en forma de un suplemento dietético.
14. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13 en forma de un medicamento.
15. Uso de una variante de Lactobacillus fermentum según la reivindicación 1 o una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13 para la fabricación de un medicamento para prevenir y/o tratar un trastorno gastrointestinal o síntomas del mismo.
16. Uso según la reivindicación 15, en el que dicho medicamento se administra por vía oral.
17. Uso según la reivindicación 15 ó 16, en el que dicho trastorno gastrointestinal es síndrome del intestino irritable, enfermedad inflamatoria intestinal, diarrea, meteorismo, flatulencia, cólicos, dolor abdominal, estreñimiento o enfermedad de Crohn.
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18. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que dicho trastorno gastrointestinal está causado por un patógeno.
19. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en el que dicho trastorno gastrointestinal está causado por una bacteria, virus o protozoo.
20. Uso según la reivindicación 19, en el que dicha bacteria es Salmonella, Escherichia coli, Helicobacter, Vibrio, Pseudomonas, Clostridium o Bacteroides.
21. Uso según la reivindicación 19, en el que dicho virus es un Norwalk o rotavirus.
22. Uso según la reivindicación 19, en el que dicho protozoo es Cryptosporidium, Entamoeba, Giardia o Dientamoeba.
23. Uso de una variante de Lactobacillus fermentum según la reivindicación 1 o una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13 para la fabricación de un medicamento para prevenir y/o tratar un trastorno de una superficie mucosa y/o síntomas del mismo.
24. Uso según la reivindicación 23, en el que dicho trastorno es eccema, dermatitis atópica o rosácea.
25. Uso de una variante de Lactobacillus fermentum según la reivindicación 1 o una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13 para la fabricación de un medicamento para estimular la producción de IL-12, regular positivamente IFN-\gamma, inducir una respuesta de tipo Th1, inhibir el crecimiento de un patógeno o modular microbios nativos del tracto gastrointestinal de un sujeto.
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