ES2322690T3 - Xiloglucanasas de la familia 44. - Google Patents
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Abstract
Xiloglucanasa de la familia 44, que es seleccionada de uno de (a) un polipéptido codificado por la secuencia de ADN de las posiciones 121-1677 de la SEC ID Nº: 1; (b) un polipéptido producido por cultivo de una célula que comprende la secuencia de la SEC ID Nº: 1 bajo condiciones donde la secuencia de ADN es expresada; (c) una enzima de xiloglucanasa que tiene una secuencia de al menos el 70% de identidad a las posiciones 40- 559 de la SEC ID Nº: 2 cuando la identidad es determinada por GAP proporcionado en el paquete del programa GCG usando una penalización por creación de GAP de 3.0 y penalización por extensión de GAP de 0.1; (d) un polipéptido codificado por una secuencia de ADN que se hibridiza a la secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 1 bajo condiciones de astringencia media, donde las condiciones de astringencia media comprenden hibridación en 5xSSC a 45ºC y lavado en 2xSSC a 60ºC.
Description
Xiloglucanasas de la familia 44.
La presente invención se refiere a
xiloglucanasas de la familia 44 de glicosil hidrolasas,
preferiblemente a enzimas que exponen actividad xiloglucanasa como
su actividad enzimática principal en las gamas de pH alcalino y
neutro; a un método para producir enzimas de este tipo; y a métodos
para usar tales enzimas en las industrias de tratamiento de
textiles, detergentes y fibras de celulosa.
El xiloglucano es un polisacárido estructural
muy importante en la pared celular primaria (en crecimiento) de las
plantas. Estructuralmente, el xiloglucano consiste en un eje de
glucosa tipo celulosa ligado a beta-1,4 que es
sustituido frecuentemente por varias cadenas laterales. Los
xiloglucanos de la mayoría de las plantas dicotiledóneas, algunas
monocotiledóneas y gimnospermas son polisacáridos altamente
ramificados donde aprox. el 75% de los residuos de glucosa en el
eje soportan una cadena lateral glicosílica a O-6.
El residuo glicosílico que está fijado directamente al residuo de
glucosa ramificada es invariablemente
alfa-D-xilosa. Hasta el 50% de las
cadenas laterales en los xiloglucanos contienen más de un residuo
debido a la presencia de fracciones de
beta-D-galactosa o
alfa-L-fucosa-(1-2)-beta-D-galactosa
a O-2 de los residuos de xilosa (C. Ohsumi and T.
Hayashi (1994) Plant and Cell Physiology 35:
963-967; G. J. McDougall and S. C. Fry (1994)
Journal of Plant Physiology 143:591-595; J. L.
Acebes et al. (1993) Phytochemistry
33:1343-1345). En la hidrólisis del ácido, el
xiloglucano extraído de las fibras de algodón produjo glucosa,
xilosa, galactosa y fucosa en la proporción de 50:29:12:7 (Hayashi
et al., 1988).
Los xiloglucanos producidos por plantas
solanáceas son inusuales en el sentido de que normalmente sólo el
40% de los residuos de glucosa unidos por beta-1,4
llevan una cadena lateral glicosílica a O-6. Además,
hasta el 60% de los residuos de xilosa son sustituidos a
O-2 con residuos de
alfa-L-arabinosa y algunas plantas
solanáceas, tales como la patata, también tienen xiloglucanos con
sustituyentes de beta-D-galactosa a
O-2 de algunos residuos de xilosa (York et al
(1996)).
Se considera que el xiloglucano funciona en la
pared primaria de las plantas por entrecruzamiento de fibrillas de
micro-celulosa, formando una red de
celulosa-xiloglucano. Esta red es considerada
necesaria para la integridad estructural de las membranas celulares
primarias (Carpita et al., 1993). Otra función importante
del xiloglucano es hacer de repositorio de las subunidades
oligosacáridas de xiloglucano que son reguladores fisiológicamente
activos del crecimiento de las células vegetales. Las subunidades
de xiloglucano pueden también modular la acción de la xiloglucano
endotransglicosilasa (XET), una enzima asociada a la pared celular
sobre la que se ha hipotetizado que juega un papel importante en el
alargamiento de las paredes celulares vegetales. En consecuencia,
el xiloglucano puede jugar un papel importante en el aflojamiento
de la pared y consecuentemente la expansión de la célula (Fry et
al., 1992).
Las semillas de muchas especies dicotiledóneas
contienen xiloglucano como la reserva principal de almacenamiento
de polisacáridos. Este tipo de xiloglucano, que está localizado en
espesamientos masivos en el interior de la pared celular de la
semilla de cotiledón, está compuesto principalmente de glucosa,
xilosa y galactosa (Rose et al., 1996).
Las semillas del árbol tamarindo Tamarindus
indica llegó a ser una fuente comercial de goma en 1943 cuando
se descubrió que la goma era útil como cola de papel y textiles. El
encolado de yute y algodón con xiloglucano de tamarindo ha sido
extensivamente practicado en Asia debido al coste bajo de la goma y
a sus excelentes propiedades. Las aplicaciones alimentarias de
xiloglucano de tamarindo incluyen el uso en dulces, mermeladas y
gelatinas y como un estabilizador en helado y mayonesa (Whistler
et al., 1993).
La actividad xiloglucanasa no está incluida en
la clasificación de enzimas proporcionada por la Nomenclatura
Enzimática (1992). Hasta ahora, esta actividad enzimática ha sido
simplemente clasificada como actividad glucanasa y ha sido
considerada frecuentemente como idéntica a la actividad celulolítica
(EC 3.2.1.4), es decir, la actividad contra los enlaces
\beta-1,4-glicosídicos en celulosa
o sustratos derivados de celulosa o al menos como una actividad
secundaria en enzimas que tienen actividad celulolítica. Véase por
ejemplo Hansen et al 1992 J Bacteriol. 174,
3522-3531, que describe una
endo-1,4-beta glucanasa que además
de la actividad celolulitíca también tiene actividad contra xilano.
No obstante, una xiloglucanasa real es una enzima específica real
de xiloglucano capaz de catalizar la solubilización de xiloglucano
a oligosacáridos de xiloglucano pero que no expone actividad
celulolítica sustancial, p. ej. actividad contra los sustratos tipo
celulosa usados de forma convencional CMC (carboximetilcelulosa),
HE celulosa y Avicel (celulosa microcristalina). Una xiloglucanasa
corta los enlaces
beta-1,4-glicosídicos en el
esqueleto de
xiloglucano.
xiloglucano.
La actividad de xiloglucanasa se describe en
Vincken et al. (1997) donde están caracterizadas tres
endoglucanasas diferentes EndoI, EndoV y EndoVI de Trichoderma
viride (similar a T. reesei). EndoI, EndoV y EndoVI
pertenecen a la familia 5, 7 y 12 de las glicosil hidrolasas
respectivamente, véase Henrissat, B. et al. (1991,
1993).
La publicación de la patente internacional WO
94/14953 describe una familia 12 de xiloglucanasa (EG II) clonada
del hongo Aspergillus aculeatus y expresada en el hongo
Aspergillus oryzae.
La publicación de la patente internacional WO
99/02663 expone xiloglucanasas clonadas a partir de Bacillus
licheniformis (familia 12) y Bacillus agaradhaerens
(familia 5) y expresadas en Bacillus subtilis.
La publicación de la patente internacional WO
98/38288 describe xiloglucano endotransglicosilasas microbianas
(XETs).
La solicitud de patente europea, EP 0921188,
describe genes termofílicos bacterianos que codifican genes de
varios dominios que contienen combinaciones de actividades
celulasa, xilanasa o celobiohidralasa. En particular el dominio
carboxi-terminal de CeIE es homólogo al dominio
carboxi-terminal de endoglucanasa (glicosil
hidrolasa de la familia 44) de ManA de C. saccharolyticus.
Es un objeto de la presente invención proporcionar una enzima con
una actividad xiloglucanasa elevada a un pH alcalino cuya
xiloglucanasa muestre un rendimiento excelente en las composiciones
de detergentes convencionales.
Los inventores han descubierto ahora enzimas con
actividad xiloglucanasa sustancial, perteneciendo las enzimas a las
glicosil hidrolasas de la familia 44 y que funcionan muy bien en
composiciones de detergentes convencionales, especialmente en
composiciones de detergente líquido.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a una preparación enzimática que comprende una
xiloglucanasa de la familia 44 de glicosil hidrolasas y que muestra
una actividad relativa de al menos el 30% a un pH entre 5.0 y
8.0.
Los inventores también han tenido éxito en la
clonación y expresión de una xiloglucanasa de la familia 44. Por
consiguiente, en otros aspectos la invención se refiere a una
xiloglucanasa de la familia 44 que es (a) un polipéptido codificado
por la secuencia de las posiciones 121-1677 de la
SEC ID Nº: 1, (b) un polipéptido producido por el cultivo de una
célula que comprende la secuencia de SEC ID Nº: 1 bajo condiciones
donde es expresada la secuencia de ADN, (c) una enzima de
xiloglucanasa que tiene una secuencia de al menos el 60% de
identidad para las posiciones 40-559 de la SEC ID
NO:2 donde la identidad es determinada por GAP proporcionado en el
paquete del programa GCG usando una penalización por creación de
GAP de 3.0 y penalización por extensión de GAP de 0.1, o (d) un
polipéptido codificado por una secuencia de ADN que se hibridiza con
la secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 1 bajo condiciones de
astringencia media, donde las condiciones de astringencia media
comprenden la hibridación en 5xSSC a 45ºC y lavando en 2xSSC a
60ºC; o (e) un polipéptido codificado por la parte de codificación
de la xiloglucanasa de la secuencia de ADN obtenible a partir del
plásmido en Escherichia coli DSM 13321; y a una xiloglucanasa
de la familia 44 que es (a) un polipéptido codificado por la
secuencia de ADN de las posiciones 121-1677 de la
SEC ID Nº: 3, (b) un polipéptido producido por el cultivo de una
célula que comprende la secuencia de SEC ID Nº: 3 bajo condiciones
donde es expresada la secuencia de ADN, o
(c) un polipéptido codificado por la parte de
codificación de xiloglucanasa de la secuencia de ADN obtenible del
plásmido en Escherichia coli DSM 13322; y a una
xiloglucanasa de la familia 44 que es (a) un polipéptido codificado
por la secuencia de ADN de las posiciones 121-1677
de la SEC ID Nº: 5, (b) un polipéptido producido por el cultivo de
una célula que comprende la secuencia SEC ID Nº: 5 bajo condiciones
donde es expresada la secuencia de ADN, o (c) un polipéptido
codificado por la xiloglucanasa que codifica parte de la secuencia
de ADN obtenible del plásmido en Escherichia coli DSM 13323;
y a una molécula aislada de polinucleótidos que codifica un
polipéptido que tiene actividad xiloglucanasa cuya molécula
polinucleótida hibridiza a una sonda bicatenaria de ADN
desnaturalizada bajo condiciones de astringencia media, donde la
sonda es seleccionada del grupo que consiste en sondas de ADN que
comprenden la secuencia mostrada en las posiciones
121-1677 de las SEC ID NO: 1, 3 o 5, y sondas de
ADN que comprenden una subsecuencia de las posiciones
121-1677 de la SEC ID Nº: 1, 3 o 5, teniendo la
subsecuencia una longitud de al menos aproximadamente 100 pares de
bases.
En otro aspecto la invención proporciona un
vector de expresión que comprende un segmento de ADN que es p. ej.
una molécula polinucleótida de la invención; una célula que
comprende el segmento de ADN, o el vector de expresión; y un método
para producir una enzima que muestre xiloglucanasa, comprendiendo
el método el cultivo de la célula bajo condiciones que permitan la
producción de la enzima, y la recuperación de la enzima del
cultivo.
En otro aspecto adicional la invención
proporciona una enzima aislada de xiloglucanasa caracterizada por
(i) estar libre de impurezas homólogas y (ii) ser producida por el
método descrito anteriormente.
La enzima nueva de la presente invención es útil
para el tratamiento de material celulósico, especialmente fibra que
contiene celulosa, hilo, tejido tejido o no tejido. El tratamiento
puede ser llevado a cabo durante el procesamiento de material
celulósico en un material listo para la producción de prendas de
vestir o tejidos, p. ej. en la fase de desencolado o de decapado; o
durante el lavado industrial o doméstico de tejidos o prendas de
este tipo.
Por consiguiente, en otros aspectos la presente
invención se refiere a una composición de detergente que comprende
una enzima xiloglucanasa que tiene actividad xiloglucanasa
sustancial en la gama neutra o alcalina; y al uso de la enzima de la
invención para el tratamiento de fibras que contienen celulosa,
fibras, o tejido tejido o no tejido.
La presente invención ha hecho ahora posible
usar una xiloglucanasa en composiciones de detergente para eliminar
o blanquear determinadas suciedades o manchas presentes en ropa
para lavado, especialmente suciedades y máculas que resultan de
alimentos, plantas, y similares que contengan xiloglucano. Además,
se contempla que el tratamiento con composiciones de detergentes que
comprenden la enzima nueva puede prevenir la unión de determinadas
manchas al xiloglucano que queda en el material celulósico.
Para el objetivo de la presente invención el
término "obtenido de" u "obtenible de" como se utiliza en
este caso en relación con una fuente específica, significa que la
enzima es producida o puede ser producida por la fuente específica,
o por una célula donde ha sido insertado un gen desde la fuente.
Está actualmente contemplado que la
xiloglucanasa de la invención puede ser obtenida a partir de una
bacteria gram-positiva perteneciente a una cepa del
género de Bacillus, en particular una cepa de
Paenibacillus.
En una forma de realización preferida, la
xiloglucanasa de la invención es obtenida a partir de la cepa
Paenibacillus polymyxa, ATCC 832, que está públicamente
disponible de American Type Culture Collection (ATCC). Ésta es la
cepa del tipo Paenibacillus polymyxa. Se contempla
actualmente que una secuencia de ADN que codifica una enzima con
una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 60%
respecto a la enzima de la invención puede ser obtenida de otras
cepas del género Paenibacillus.
Además, la cepa Paenibacillus sp. fue
depositada por los inventores según el Tratado de Budapest sobre el
Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los
fines del Procedimiento en Materia de Patentes en la Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Gmbh, Mascheroder Weg
1b, D-38124 Braunschweig, República federal de
Alemania, el 17 Febrero 2000 bajo el número de depósito DSM 13329.
El depósito fue hecho por Novo Nordisk A/S y fue después cedido a
Novozymes A/S.
Un plásmido que comprende una secuencia de ADN
que codifica una xiloglucanasa de la invención ha sido transformado
en una cepa de Escherichia coli que fue depositada por los
inventores según el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento
Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del
Procedimiento en Materia de Patentes en la Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b,
D-38124 Braunschweig, República federal de
Alemania, el 16 de febrero 2000 bajo el número de depósito DSM
13321. El depósito fue hecho por Novo Nordisk A/S y fue cedido
después a Novozymes A/S. Se contempla que la secuencia de ADN de
este plásmido comprende la secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 1.
Un plásmido que comprende una secuencia de ADN
que codifica una xiloglucanasa de la invención ha sido transformada
en una cepa de la Escherichia coli que fue depositada por
los inventores según el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento
Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del
Procedimiento en Materia de Patentes en la Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen Gmbh, Mascheroder Weg 1b,
D-38124 Braunschweig, República federal de
Alemania, el 16 Febrero 2000 bajo el número de depósito DSM 13322.
El depósito fue hecho por Novo Nordisk A/S y fue después cedido a
Novozymes AS. Se contempla que la secuencia de ADN de este plásmido
comprende la secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 3.
Un plásmido que comprende una secuencia de ADN
que codifica una xiloglucanasa de la invención ha sido transformada
en una cepa de Escherichia coli que fue depositada por los
inventores según el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento
Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del
Procedimiento en Materia de Patentes en la Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen.GmbH, Mascheroder Weg 1b,
D-38124 Braunschweig, República federal de
Alemania, el 16 de febrero 2000 bajo el número de depósito DSM
13323. El depósito fue hecho por Novo Nordisk A/S y fue después
cedido a Novozymes A/S. Es contemplado que la secuencia de ADN de
este plásmido comprende la secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 5.
En el contexto presente el término
"preparación enzimática" está destinado bien a ser un producto
de fermentación enzimática convencional, posiblemente aislada y
purificada, a partir de una única especie de un microorganismo,
comprendiendo dicha preparación normalmente varias actividades
enzimáticas diferentes; o una mezcla de enzimas de una sola
molécula, preferiblemente enzimas derivadas de especies bacterianas
o fúngicas usando técnicas convencionales recombinantes, habiendo
sido las enzimas fermentadas y posiblemente aisladas y purificadas
separadamente y pudiendo originarse a partir de distintas especies,
preferiblemente especies fúngicas o bacterianas; o el producto de
fermentación de un microorganismo que actúa como una célula huésped
para la expresión de una xiloglucanasa recombinante, pero
produciendo el microorganismo simultáneamente otras enzimas, p. ej.
xiloglucanasas, proteasas, o celulasas, siendo productos de
fermentación de origen natural del microorganismo, es decir, el
complejo enzimático producido de forma convencional por el
microorganismo correspondiente que se origina de forma natural.
En el contexto presente el término "vector de
expresión" indica una molécula de ADN, lineal o circular, que
comprende un segmento que codifica un polipéptido de interés
enlazado operativamente a segmentos adicionales que proveen su
transcripción. Los segmentos adicionales de este tipo pueden incluir
secuencias promotoras y terminadoras, y pueden opcionalmente
incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores
seleccionables, un intensificador, una señal de poliadenilación, y
similares. Los vectores de expresión son generalmente derivados de
ADN plásmido o vírico, o pueden contener elementos de ambos. El
vector de expresión de la invención puede ser cualquier vector de
expresión que esté sujeto convenientemente a procedimientos de ADN
recombinante, y la elección del vector dependerá frecuentemente de
la célula huésped en la que tiene que ser introducido el vector.
Así, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es
decir, un vector que exista como una entidad extra cromosómica,
cuya replicación sea independiente de la replicación cromosómica,
p. ej. un plásmido. De forma alternativa, el vector puede ser uno
que cuando se introduce en una célula huésped, se integre en el
genoma de la célula huésped y se replique junto con el(los)
cromosoma(s) en el(los) que ha sido integrado.
El término "expresado recombinante" o
"expresado recombinantemente" usado aquí en relación con la
expresión de un polipéptido o proteína es definido según la
definición estándar en la técnica. El uso de un vector de expresión
como se describe inmediatamente arriba generalmente ejecuta la
expresión recombinante de una proteína.
El término "aislado", aplicado a una
molécula polinucleótida, indica que el polinucleótido ha sido
eliminado de su medio genético natural y está por tanto libre de
otras secuencias de codificación extrañas o no deseadas, y tiene por
tanto una forma adecuada para el uso dentro de sistemas de
producción de proteínas creados genéticamente. Las moléculas
aisladas de este tipo son aquellas que son separadas de su medio
natural e incluyen clones de ADNc y genómicos. Las moléculas
aisladas de ADN de la presente invención están libres de otros genes
a los que son asociadas normalmente, pero pueden incluir regiones
no traducidas de origen natural 5' y 3' tales como promotores y
terminadores. La identificación de regiones asociadas será evidente
para un experto en la técnica (véase por ejemplo, Dynan and Tijan,
Nature 316:774-78, 1985). El término "un
polinucleótido aislado" puede ser denominado de forma
alternativa "un polinucleótido clonado".
Aplicado a una proteína/polipéptido, el término
"aislado" indica que la proteína es encontrada en otra
condición que su medio nativo. En una forma preferida la proteína
aislada está sustancialmente libre de otras proteínas,
particularmente otras proteínas homólogas (es decir, "impurezas
homólogas" (véase abajo)). Se prefiere proporcionar la proteína
con una pureza superior al 40%, más preferiblemente una pureza
superior al 60%.
Incluso más preferiblemente se prefiere
proporcionar proteína con un grado de pureza muy elevado, es decir,
una pureza superior al 80%, más preferiblemente superior al 95%, e
incluso más preferiblemente una pureza superior al 99%, como está
determinado por SDS-PAGE.
El término "proteína/polipéptido aislado"
puede ser denominado alternativamente "proteína/polipéptido
purificado".
El término "impurezas homólogas" significa
cualquier impureza (p. ej. otro polipéptido que el polipéptido de
la invención), que se origina a partir de la célula homóloga donde
el polipéptido de la invención es obtenido originalmente.
El término "obtenido de" como se utiliza en
este caso en relación con una fuente microbiana específica,
significa el polinucleótido y/o polipéptido producido por la fuente
específica, o por una célula donde ha sido insertado un gen a partir
de la fuente.
El término "ligado operativamente", en
referencia a los segmentos de ADN, denota que los segmentos son
dispuestos de modo que funcionan de acuerdo con los objetivos
destinados, p. ej. la transcripción se inicia en el promotor y
procede a través del segmento de codificación hasta el
terminador.
El término "polinucleótido" indica un
polímero unicatenario o bicatenario de bases desosirribonucleótidas
o ribonucleótidas leídas del extremo 5' al 3'. Los polinucleótidos
incluyen ARN y ADN, y pueden ser aislados de fuentes naturales,
sintetizados in vitro, o preparados a partir una combinación
de moléculas naturales y sintéticas.
El término "complementos de moléculas
polinucleótidas" indica moléculas polinucleótidas que tienen una
secuencia básica complementaria y orientación inversa en
comparación con una secuencia de referencia. Por ejemplo, la
secuencia 5' ATGCACGGG 3' es complementaria a 5' CCCGTGCAT 3'.
El término "secuencia nucleótida
degenerada" indica una secuencia de nucleótidos que incluye uno
o más codones degenerados (en comparación con una molécula
polinucleótida que codifica un polipéptido). Los codones
degenerados contienen diferentes tripletes de nucleótidos, pero
codifican el mismo residuo de aminoácido (es decir, los tripletes
GAU y GAC codifican cada uno Asp).
El término "promotor" indica una parte de
un gen que contiene secuencias de ADN que proporcionan la unión de
la ARN polimerasa y la iniciación de la transcripción. Las
secuencias promotoras se encuentran comúnmente, pero no siempre, en
las regiones 5' no codificantes de los genes.
El término "secuencia señal secretora"
indica una secuencia de ADN que codifica un polipéptido (un
"polipéptido secretor") que, como componente de un polipéptido
mayor, dirige el polipéptido mayor a través de una vía secretora de
una célula donde es sintetizado. El péptido mayor es comúnmente
dividido para eliminar el péptido secretor durante el tránsito a
través de la vía secretora.
Dentro de las formas de realización preferidas
de la invención un polinucleótido aislado de la invención se
hibridizará con regiones dimensionadas de forma similar de las SEC
ID Nº: 1, SEC ID Nº: 3 o SEC ID Nº: 5, o una secuencia
complementaria a éstas, al menos bajo condiciones de astringencia
media.
En particular, los polinucleótidos de la
invención se hibridizarán con una sonda desnaturalizada de ADN
bicatenaria que comprenda o bien la secuencia completa mostrada en
la SEC ID Nº: 1 o la secuencia mostrada en las posiciones
121-1677 a partir de la SEC ID Nº: 1 o la secuencia
completa mostrada en la SEC ID Nº: 3 o la secuencia mostrada en las
posiciones 121-1677 de la SEC ID Nº: 3 o la
secuencia parcial mostrada en la SEC ID Nº: 5 o la secuencia
mostrada en las posiciones 121-1677 de la SEC ID
Nº: 5 o cualquier sonda que comprenda una subsecuencia de la SEC ID
Nº: 5 o SEC ID Nº: 3 o la SEC ID Nº: 1 teniendo una longitud de al
menos aproximadamente 100 pares de bases bajo al menos condiciones
de astringencia media, pero preferiblemente a condiciones de
astringencia alta como se describe con detalle abajo. Condiciones
experimentales adecuadas para determinar la hibridación a
astringencia media o alta entre una sonda nucleótida y una
secuencia homóloga de ADN o ARN implican el prerremojo del filtro
que contiene los fragmentos de ADN o ARN para hibridizar en 5 X SSC
(cloruro sódico/citrato sódico, Sambrook et al. 1989) durante
10 min, y la prehibridación del filtro en una solución de 5 x SSC,
Solución de 5 x Denhardt's (Sambrook et al. 1989), 0,5% de
SDS y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y
sometido a un baño de ultrasonidos (Sambrook et al. 1989),
seguida de la hibridación en la misma solución que contiene una
concentración de 10 ng/ml de una sonda cebada aleatoriamente
(Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem.
132:6-13), etiquetada en 32P-dCTP
(actividad específica superior a 1 X 109 cpm/\mug) durante 12
horas a aproximadamente 45ºC. El filtro es después lavado dos veces
durante 30 minutos en 2 x SSC, 0,5% SDS a al menos 60ºC
(astringencia media), incluso más preferiblemente a al menos 65ºC
(astringencia media/alta), incluso más preferiblemente a al menos
70ºC (astringencia elevada), e incluso más preferiblemente a al
menos 75ºC (astringencia muy elevada).
Las moléculas con las que se hibridiza la sonda
oligonucleótida bajo estas condiciones son detectadas usando una
película de rayos X.
Como se ha observado previamente, los
polinucleótidos aislados de la presente invención incluyen ADN y
ARN. Los métodos para aislar ADN y ARN son bien conocidos en la
técnica. Los genes de interés que codifican ADN y ARN pueden ser
clonados en Bancos de Genes o bibliotecas de ADN mediante métodos
conocidos en la técnica.
Los polinucleótidos que codifican polipéptidos
que tienen actividad de endoglucanasa de la invención son después
identificados y aislados por, por ejemplo, hibridación o PCR.
La presente invención proporciona además
polipéptidos y polinucleótidos homólogos a partir de diferentes
cepas bacterianas (ortólogos o parálogos). De interés particular
son los polipéptidos de xiloglucanasa de cepas
gram-positivas alcalofílicas, que incluyen especies
de Bacillus. De interés especial son los péptidos de
xiloglucanasa a partir de cepas que están muy cercanamente
relacionados con la cepa Paenibacillus polymyxa, ATCC 832,
que es la cepa del tipo Paenibacillus polymyxa.
Especies homólogas de un polipéptido con
actividad xiloglucanasa de la invención pueden ser clonadas usando
la información y composiciones proporcionadas por la presente
invención en combinación con técnicas de clonación convencionales.
Por ejemplo, una secuencia de ADN de la presente invención puede
ser clonada usando ADN cromosómico obtenido a partir de un tipo de
célula que expresa la proteína. Fuentes adecuadas de ADN pueden ser
identificadas evaluando Northern blots con sondas diseñadas a partir
de secuencias descritas aquí. Una biblioteca es preparada después a
partir de ADN cromosómico de una línea celular positiva. Una
secuencia de ADN de la invención que codifica un polipéptido que
tiene actividad xiloglucanasa puede después ser aislada por una
variedad de métodos, tal como utilizando sondas diseñadas a partir
de secuencias descritas en la presente descripción y
reivindicaciones o con uno o más conjuntos de sondas degeneradas
basadas en las secuencias descritas. Una secuencia de ADN de la
invención puede ser clonada también usando la reacción en cadena de
la polimerasa, o PCR (Mullis, U.S. patente 4,683,202)., usando
cebadores diseñados para las secuencias descritas aquí. Dentro de
un método adicional, puede ser utilizada la biblioteca de ADN para
transformar o transfectar células huéspedes, y la expresión del ADN
de interés puede ser detectado con un anticuerpo (monoclonal o
policlonal) dirigido contra la xiloglucanasa clonada de
Paenibacillus polymyxa, p. ej. a partir del tipo de cepa
depositada como ATCC 832, o a partir de Paenibacillus sp.,
DSM 13329, expresada y purificada como se describe en Materiales y
Métodos y Ejemplos 1, 2 y 3, o por una prueba de actividad
referente a un polipéptido que tiene actividad xiloglucanasa.
La secuencia de aminoácidos nos.
40-559 de las SEC ID Nº: 2, 4 y 6, respectivamente,
es una secuencia de xiloglucanasa madura del dominio catalítico
activo. La secuencia de xiloglucanasa madura puede en teoría
iniciarse en la posición 35 ó 36 pero la enzima como tal tiene el
inicio de la secuencia de aminoácidos en la posición 40 debido a la
maduración proteolítica. Además, debe ser observado que los genes
descritos aquí (SEC ID Nº: 1, 3, 5) en total codifican enzimas de
varios dominios, es decir, codifican un dominio de xiloglucanasa
(dominio catalítico activo), un dominio de mananasa (dominio
catalítico activo) y un dominio de unión. No obstante, sólo la
parte de los genes que codifica el dominio de xiloglucanasa es
relevante para la invención presente.
La presente invención también proporciona
polipéptidos de xiloglucanasa que son sustancialmente homólogos al
polipéptido de los aminoácidos nos. 40-559 de la
SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4 o SEC ID Nº: 6 y especies homólogas
(parálogas u ortólogas) de los mismos. El término
"sustancialmente homólogo" se utiliza en este caso para
indicar polipéptidos que tienen el 60%, preferiblemente al menos el
70%, más preferiblemente al menos el 75%, más preferiblemente al
menos el 80%, más preferiblemente al menos el 85%, e incluso más
preferiblemente al menos el 90% de identidad de secuencia a la
secuencia mostrada en los aminoácidos nºs. 40-559
de la SEC ID Nº: 2, 4 o 6 o sus ortólogos o parálogos. Dichos
polipéptidos serán idénticos preferiblemente al menos en un 95%, y
de la forma más preferible en un 98% o más idénticos a la secuencia
mostrada en los aminoácidos nºs. 40-559 de la SEC
ID Nº: 2, 4 o 6 o sus ortólogos o parálogos. El porcentaje de
identidad secuencial es determinado por métodos convencionales,
mediante programas informáticos conocidos en la técnica tal como GAP
proporcionado en el paquete del programa GCG (Program Manual for
the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer
Group, 575 Science Drive, Madison, Wiscosin; USA 53711) como se
describe en Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of
Molecular Biology 48, 443-453, que está incorporada
por la presente por referencia en su totalidad. El GAP es usado con
los siguientes ajustes para comparación de la secuencia de
polipéptidos: penalización por creación de GAP de 3.0 y
penalización por extensión de GAP de 0.1. La siguiente identidad de
secuencia fue encontrada para las SEC ID Nºs: 2, 4, y 6 anexas:
La identidad de secuencia de las moléculas de
polinucleótidos es determinada por métodos similares usando GAP con
los siguientes ajustes para comparación de la secuencia de ADN:
penalización por creación de GAP de 5.0 y penalización por
extensión de GAP de 0.3.
Sustancialmente las proteínas y polipéptidos
homólogos están caracterizados por tener uno o más sustitutos,
deleciones o adiciones de aminoácidos. Estos cambios son
preferiblemente de una naturaleza menor, que son sustitutos de
aminoácido conservativos (véase tabla 2) y otros sustitutos que no
afectan significativamente al doblamiento o actividad de la proteína
o polipéptido; deleciones pequeñas, normalmente desde uno hasta
aproximadamente 30 aminoácidos; y pequeñas extensiones amino o
carboxilo terminales, tal como un residuo
amino-terminal de metionina, un péptido enlazador
pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o
una extensión pequeña que facilite la purificación (un marcador de
afinidad), tal como un tracto de polihistidina, proteína A (Nilsson
et al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods
Enzymol. 198:3, 1991. Véase en general Ford et al., Protein
Expression and Purification 2: 95-107, 1991 que es
incorporado aquí por referencia. Marcadores de afinidad de
codificación de ADNs son disponibles de proveedores comerciales (p.
ej., Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; New England Biolabs,
Beverly, MA).
Beverly, MA).
No obstante, aunque los cambios descritos
anteriormente son preferiblemente de una naturaleza menor, dichos
cambios pueden ser también de una naturaleza mayor, tal como la
fusión de polipéptidos mayores de hasta 300 aminoácidos o más,
ambos como extensiones amino terminales o carboxil terminales a un
polipéptido de la invención que tiene actividad de
xiloglucanasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Además de los 20 aminoácidos estándares,
aminoácidos no estándares (tales como
4-hidroxiprolina, 6-N-metil lisina, ácido de
2-aminoisobutírico, isovalina y
a-metil serina) pueden ser sustituidos por residuos
aminoácidos de un polipéptido según la invención. Un número
limitado de aminoácidos no conservadores, aminoácidos que no son
codificados por el código genético, y aminoácidos no naturales
pueden ser sustituidos por residuos de aminoácidos. "Aminoácidos
no naturales" han sido modificados después de la síntesis de
proteína, y/o tienen una estructura química en su(s)
cadena(s) lateral(es) diferente de los aminoácidos
estándares. Los aminoácidos no naturales pueden ser sintetizados
químicamente, o preferiblemente, están disponibles comercialmente,
e incluyen ácido pipecólico, ácido carboxílico de tiazolidina,
dehidroprolina, 3 y 4-metilprolina, y
3,3-dimetilprolina.
Aminoácidos esenciales en los polipéptidos de
xiloglucanasa de la presente invención pueden ser identificados
según procedimientos conocidos en la técnica, tales como
mutagénesis dirigida o mutagénesis de barrido de alanina
(Cunningham and Wells, Science 244, 1081-1085,
1989). En esta técnica, las mutaciones aisladas de alanina son
introducidas en cada residuo en la molécula, y las moléculas
mutantes resultantes son evaluadas en cuanto a actividad biológica
(es decir, actividad xiloglucanasa) para identificar los residuos de
aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula.
Véase también, Hilton et al., J. Biol. Chem.
271:4699-4708, 1996. El sitio activo de la enzima u
otra interacción biológica puede también ser determinado por el
análisis físico de la estructura, como determinado por las técnicas
tales como la resonancia magnética nuclear, cristalografía,
difracción de electrones o etiquetado de afinidad fotográfica,
conjuntamente con la mutación de aminoácidos de sitio de contacto
putativo. Véase, por ejemplo, de Vos et al., Science
255:306-312, 1992; Smith et al., J. Mol.
Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver et al.,
FEBS Lett 309:59-64, 1992. Las identidades de
aminoácidos esenciales pueden también ser inferidas del análisis de
homologías con polipéptidos, que están relacionados con un
polipéptido según la invención.
Las sustituciones de aminoácidos múltiples
pueden ser hechas y evaluadas usando métodos conocidos de
mutagénesis, recombinación y/o redistribución seguidos de un
procedimiento de selección pertinente, tales como aquellos
descritos por Reidhaar-Olson y Sauer (Science
241:53-57, 1988), Bowie y Sauer (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 86:2152-2156, 1989), WO 95/17413, o WO
95/22625. Brevemente, estos autores describen métodos para
aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido,
o recombinar/reordenar diferentes mutaciones (WO 95/17413, WO
95/22625), seguido de la selección de un polipéptido funcional, y
después la secuenciación de los polipéptidos mutagenizados para
determinar el espectro de sustituciones admisibles en cada
posición. Otros métodos que pueden ser usados incluyen la expresión
en el fago (p. ej., Lowman et al., Biochem. 30,
10832-10837, 1991; Ladner et al., U.S. Patent
No. 5,223,409; Huse, publicación de la OMPI WO 92/06204) y la
mutagénesis dirigida (Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986;
Ner et al., DNA 7:127, 1988).
Métodos de mutagénesis/redistribución como se
describen arriba pueden ser combinados con métodos de selección
automatizados de alto rendimiento, para detectar la actividad de
polipéptidos clonados, mutagenizados en células huéspedes. Las
moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos
pueden ser recuperadas de las células huéspedes y secuenciadas
rápidamente usando un equipamiento moderno. Estos métodos permiten
la determinación rápida de la importancia de residuos de
aminoácidos individuales en un polipéptido de interés, y pueden ser
aplicados a polipéptidos de estructura desconocida.
\newpage
Usando los métodos mencionados anteriormente, un
técnico en la materia puede identificar y/o preparar una variedad
de polipéptidos que son sustancialmente homólogos a los residuos 40
a 559 de la SEC ID Nº: 2, 4 o 6 y retienen la actividad
xiloglucanasa de la proteína tipo salvaje.
La enzima xiloglucanasa de la invención puede,
además del núcleo enzimático que comprende el dominio catalítico,
comprender también un dominio de unión a celulosa (CBD), siendo
operativamente ligados el dominio de unión a celulosa y el núcleo
enzimático (el dominio catalíticamente activo) de la enzima. El
dominio de unión a la celulosa (CBD) puede existir como parte
integral de la enzima codificada, o un CBD de otro origen puede ser
introducido en la xiloglucanasa creando así un híbrido enzimático.
En este contexto el término "dominio de unión a celulosa" se
pretende que sea entendido tal y como se define por Peter Tomme
et al. "Cellulose-Binding Domains:
Classification and Properties" en "Enzymatic Degradation of
Insoluble Carbohydrates", John N. Saddler and Michael H. Penner
(Eds.), ACS Symposium Series, No. 618, 1996. Esta definición
clasifica más de 120 dominios de unión a celulosa en 10 familias
(I-X), y demuestra que los CBDs son encontrados en
varias enzimas tales como celulasas, xilanasas, mananasas,
arabinofuranosidasas, acetil esterasas y quitinasas. Han sido
encontrados CBDs también en algas, p. ej. el alga roja Porphyra
purpurea como una proteína no hidrolítica de unión a
polisacáridos, véase Tomme et al., op.cit. No
obstante, la mayor parte de los CBDs son de celulasas y xilanasas,
los CBDs se encuentran en los terminales N y C de las proteínas o
son internos. Los híbridos enzimáticos son conocidos en la técnica,
véase p. ej. WO 90/00609 y WO 95/16782, y pueden ser preparados por
transformación en una célula huésped de un constructo de ADN que
comprende al menos un fragmento de ADN que codifica el dominio de
unión a celulosa ligado, con o sin un enlazador, a una secuencia de
ADN que codifica la xiloglucanasa y cultivando la célula huésped
para expresar el gen fusionado. Los híbridos enzimáticos pueden ser
descritos por la fórmula siguiente:
CBD-MR-X
donde CBD es la región
N-terminal o C-terminal de una
secuencia de aminoácidos que corresponde al menos al dominio de
unión a celulosa; MR es la región media (el enlazador), y puede ser
un enlace, o un grupo de enlace corto preferiblemente desde
aproximadamente 2 hasta aproximadamente 100 átomos de carbono, más
preferiblemente de 2 a 40 átomos de carbono; o es preferiblemente
desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 100 aminoácidos, más
preferiblemente desde 2 a 40 aminoácidos; y X es una región
N-terminal o C-terminal de un
polipéptido codificado por la molécula polinucleótida de la
invención.
Anticuerpos policlonales, especialmente
anticuerpos policlonales monoespecíficos, para ser usados para
determinar la reactividad cruzada inmunológica pueden ser
preparados usando una enzima xiloglucanolítica purificada. Más
específicamente, el antisuero contra la xiloglucanasa de la
invención puede ser desarrollado inmunizando conejos (u otros
roedores) según el procedimiento descrito por N. Axelsen et
al. en: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis,
Blackwell Scientific Publications, 1973, Capítulo 23, o A.
Johnstone and R. Torpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell
Scientific Publications, 1982 (más específicamente p.
27-31). Las inmunoglobulinas purificadas pueden ser
obtenidas de los antisueros, por ejemplo por precipitación salina
((NH_{4})_{2}SO_{4}), seguida de diálisis y
cromatografía de intercambio iónico, p. ej. en
DEAE-Sephadex. La caracterización inmunoquímica de
proteínas puede ser hecha bien por análisis de difusión doble de
Ouchterlony (O. Ouchterlony en: Handbook of Experimental Immunology
(D.M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific Publications, 1967, pp.
655-706), por inmunoelectrofóresis cruzada (N.
Axelsen et al., supra, Capítulos 3 y 4) o por
inmunoelectrofóresis en cohete (N. Axelsen et al., Capítulo
2).
Un vector recombinante que comprende un
constructo de ADN que codifica la enzima de la invención puede ser
cualquier vector, que pueden ser sometido convenientemente a
procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector
dependerá a menudo de la célula huésped en la que tiene que ser
introducido. Así, el vector puede ser un vector de replicación
autónoma, es decir, un vector que exista como una entidad extra
cromosómica, cuya replicación sea independiente de la replicación
cromosómica, p. ej. un plásmido. De forma alternativa, el vector
puede ser uno que al ser introducido en una célula huésped, sea
integrado en parte en el genoma de la célula huésped o en su
totalidad y replicado con el (los) cromosoma(s) en los que
ha sido integrado.
El vector es preferiblemente un vector de
expresión donde la secuencia de ADN que codifica la enzima de la
invención sea enlazada operativamente a segmentos adicionales
requeridos para la transcripción del ADN. En general, el vector de
expresión es derivado de ADN plásmido o vírico, o puede contener
elementos de ambos. El término, "ligado operativamente" indica
que los segmentos son dispuestos de modo que funcionan en concierto
con sus objetivos destinados, p. ej. la transcripción se inicia en
un promotor y procede a través de la codificación de secuencia de
ADN para la enzima.
El promotor puede ser cualquier secuencia de
ADN, que muestre la actividad transcripcional en la célula huésped
de elección y puede ser derivado de genes que codifican proteínas
bien homólogas o heterólogas a la célula huésped.
Ejemplos de promotores adecuados para el uso en
células huéspedes bacterianas incluyen el promotor del gen de la
amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus, del gen
de la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis,
el gen de la alfa-amilasa de Bacillus
amyloliquefaciens, el gen de la proteasa alcalina de
Bacillus subtilis, o el gen de la xilosidasa de Bacillus
pumilus, o los promotores P_{R} o P_{L} de fago lambda o
los promotores lac, trp o tac de E. coli.
La secuencia de ADN que codifica la enzima de la
invención puede también, si es necesario, ser conectada
operativamente a un terminador adecuado.
El vector recombinante de la invención puede
además comprender una secuencia de ADN que permita al vector
replicar en la célula huésped en cuestión.
El vector puede también comprender un marcador
seleccionable, p. ej. un gen cuyo producto complemente un defecto
en la célula huésped, o un gen que codifique resistencia a p. ej.
antibióticos como kanamicina, cloranfenicol, eritromicina,
tetraciclina, espectinomicina, o similar, o resistencia a metales
pesados o herbicidas.
Para dirigir una enzima de la presente invención
a la vía secretora de las células huéspedes una secuencia señal
secretora (también conocida como una secuencia líder, secuencia
prepro o secuencia pre) puede ser proporcionada en el vector
recombinante. La secuencia señal secretora es unida a la secuencia
de ADN que codifica la enzima en el marco de lectura correcto. Las
secuencias de la señal secretora son posicionadas comúnmente en 5'
a la secuencia de ADN que codifica la enzima. La secuencia señal
secretora puede ser aquella normalmente asociada a la enzima o
puede ser de un gen que codifica otra proteína secretada.
Los procedimientos usados para enlazar las
secuencias de ADN que codifican la enzima presente, el promotor y
opcionalmente el terminador y/o la secuencia señal secretora,
respectivamente, o para ensamblar estas secuencias por esquemas de
amplificación de PCR adecuados, y para insertarlas en vectores
adecuados que contienen la información necesaria para la replicación
o integración, son conocidos por los expertos en la técnica (véase,
por ejemplo, Sambrook et al., op.cit.).
La molécula clonada de ADN introducida en la
célula huésped puede ser bien homóloga o heteróloga al huésped en
cuestión. Si es homóloga a la célula huésped, es decir, producida
por la célula huésped en naturaleza, será normalmente conectada
operativamente a otra secuencia promotora o, si aplicable, otra
secuencia señal secretora y/o secuencia del terminador que aquella
en su medio ambiente natural. El término "homóloga" está
destinado a incluir una secuencia de ADN que codifica una enzima
nativa al organismo huésped en cuestión. El término
"heteróloga" está destinado a incluir una secuencia de ADN no
expresada por la célula huésped en la naturaleza. Así, la secuencia
de ADN puede ser de otro organismo, o puede ser una secuencia
sintética.
La célula huésped en la que es introducida la
molécula de ADN clonada o el vector recombinante de la invención
puede ser cualquier célula, que sea capaz de producir la enzima
deseada e incluye bacterias, levadura, hongos y células
eucarióticas mayores.
Ejemplos de células huéspedes bacterianas que en
cultivo sean capaces de producir la enzima de la invención pueden
ser unas bacterias gram-positivas tales como una
cepa de Bacillus, en particular Bacillus alkalophilus,
Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus lautus,
Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus circulans,
Bacillus coagulans, Bacillus megatherium, Bacillus
stearothermophilus, Bacillus subtilis y Bacillus
thuringiensis, una cepa de Lactobacillus, una cepa de
Streptococcus, una cepa de Streptomyces, en
particular Streptomyces lividans y Streptomyces
murinus, o la célula huésped puede ser una bacteria
gram-negativa tal como una cepa de Escherichia
coli.
La transformación de las bacterias puede ser
efectuada por transformación del protoplasto, electroporación,
conjugación, o usando células competentes de una manera conocida
per se (véase p. ej. Sambrook et al.,
supra).
Al expresar la enzima en bacterias tales como la
Escherichia coli, la enzima puede ser retenida en el
citoplasma, normalmente como gránulos insolubles (conocidos como
cuerpos de inclusión), o puede ser dirigida al espacio periplásmico
por una secuencia de secreción bacteriana. En el caso anterior las
células son lisadas y los gránulos son recuperados y
desnaturalizados después de lo que la enzima es redoblada por
dilución del agente desnaturalizante. En el último caso, la enzima
puede ser recuperada del espacio periplásmico interrumpiendo las
células, p. ej. por sonicación o choque osmótico, para liberar el
contenido del espacio periplásmico y recuperar la enzima.
Al expresar la enzima en bacterias
gram-positivas tales como una cepa de
Bacillus o una cepa de Streptomyces, la enzima puede
ser retenida en el citoplasma, o puede ser dirigida al medio
extracelular por una secuencia de secreción bacteriana.
Ejemplos de células huéspedes fúngicas que en
cultivo son capaces de producir la enzima de la invención son p.
ej. una cepa de Aspergillus o Fusarium, en particular
Aspergillus awamori, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger,
Aspergillus oryzae, y Fusarium oxysporum, y una cepa de
Trichoderma, preferiblemente Trichoderma harzianum,
Trichoderma reesei y Trichoderma viride.
\newpage
Las células fúngicas pueden ser transformadas
por un proceso que implica la formación de protoplastos y la
transformación de los protoplastos seguida de la regeneración de la
pared celular de un modo conocido per se. El uso de una cepa
de Aspergillus como célula huésped está descrito en EP 238
023 (Novo Nordisk A/S), cuyos contenidos están incorporados aquí
por referencia.
Ejemplos de una célula huésped con origen de
levadura que en cultivo sea capaz de producir la enzima de la
invención es p. ej. una cepa de Hansenula sp., una cepa de
Kluyveromices sp., en particular Kluyveromices lactis
y Kluyveromices marcianus, una cepa de Pichia sp.,
una cepa de Saccharomyces, en particular, Saccharomyces
carlsbergensis. Saccharomyces cerevisae, Saccharomyces kluyveri
y Saccharomyces uvarum, una cepa de Schizosaccharomyces
sp., en particular, Schizosaccharomyces pombe, y una
cepa de Yarrowia sp., en particular Yarrowia
lipolytica.
Ejemplos de una célula huésped de origen vegetal
que en cultivo sea capaz de producir la enzima de la invención es
p. ej. una célula vegetal de Solanum tuberosum o
Nicotiana tabacum.
En otro aspecto, la presente invención también
se refiere a un método para producir la preparación enzimática de
la invención, comprendiendo el método el cultivo de un
microorganismo capaz de producir la xiloglucanasa bajo condiciones
que permitan la producción de la enzima, y la recuperación de la
enzima del cultivo. El cultivo puede ser realizado usando técnicas
de fermentación convencionales, p. ej. el cultivo en matraces
vibrantes o fermentadores con agitación para asegurar una aireación
suficiente en un medio de crecimiento que induzca la producción de
la enzima de xiloglucanasa. El medio de crecimiento puede contener
una fuente de N convencional tal como peptona, extracto de levadura
o casaminoácidos, una cantidad reducida de una fuente de C
convencional tal como dextrosa o sacarosa, y un inductor tal como
xiloglucano o sustratos vegetales compuestos tales como salvado de
cereales (p. ej. salvado de trigo o cáscara de arroz). La
recuperación puede ser realizada usando técnicas convencionales p.
ej. la separación de biomasa y el sobrenadante por centrifugado o
filtración, la recuperación del sobrenadante o ruptura de las
células si la enzima de interés es intracelular, quizás seguido de
purificación adicional como se describe en EP 0 406 314 o por
cristalización como se describe en WO 97/15660.
Además, la presente invención proporciona un
método para producir una enzima aislada según la invención, donde
una célula huésped adecuada, que ha sido transformada con una
secuencia de ADN que codifica la enzima, es cultivada bajo
condiciones que permiten la producción de la enzima, y la enzima
resultante sea recuperada del cultivo.
Tal y como se define aquí, un polipéptido
aislado (p. ej. una enzima) es un polipéptido esencialmente libre
de otros polipéptidos, p. ej., al menos aproximadamente de una
pureza del 20%, preferiblemente al menos aproximadamente de una
pureza del 40%, más preferiblemente aproximadamente una pureza del
60%, incluso más preferiblemente aproximadamente una pureza del
80%, de la forma más preferible aproximadamente una pureza del 90%,
e incluso de la forma más preferible aproximadamente una pureza del
95%, según está determinado por SDS-PAGE.
El término "polipéptido aislado" puede ser
denominado de forma alternativa "polipéptido purificado".
Cuando un vector de expresión que comprende una
secuencia de ADN que codifica la enzima es transformado en una
célula huésped heteróloga es posible permitir la producción
heteróloga recombinante de la enzima de la
invención.
invención.
De ese modo es posible hacer una composición
altamente purificada o una composición xiloglucanolítica de una
sola molécula, caracterizada por estar libre de impurezas
homólogas.
En este contexto presente "impurezas
homólogas" significa cualesquiera impurezas (p. ej. otros
polipéptidos distintos de la enzima de la invención), que se
originan a partir de células homólogas donde es obtenida
originalmente la enzima de la invención.
En la presente invención, la célula huésped
homóloga puede ser una cepa de Paenibacillus sp. o
Paenibacillus polymyxa.
El medio usado para el cultivo de las células
huéspedes transformadas puede ser cualquier medio convencional
adecuado para cultivar las células huéspedes en cuestión. La enzima
xiloglucanolítica expresada puede ser segregada convenientemente en
el medio de cultivo y puede ser recuperada del mismo por
procedimientos bien conocidos incluyendo la separación de las
células del medio por centrifugado o filtración, la precipitación
de componentes proteínicos del medio mediante una sal, tal como
sulfato amónico, seguido de procedimientos cromatográficos tales
como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de
afinidad, o similares.
La presente invención también se refiere a una
planta transgénica, parte de la planta o célula vegetal que haya
sido transformada con una secuencia de ADN que codifica la
xiloglucanasa de la invención para expresar y producir esta enzima
en cantidades recuperables. La enzima puede ser recuperada de la
planta o parte de la planta.
La planta transgénica puede ser dicotiledónea o
monocotiledónea, para abreviar, una dicot o monocot. Ejemplos de
plantas monocotiledóneas son hierbas, tales como hierbas gramíneas
(pasto azul, Poa), pasto de forraje, tal como festuca, lolio,
césped templado, tal como Agrostis, y cereales, p. ej. trigo,
avena, centeno, cebada, arroz, sorgo y maíz (grano).
Ejemplos de plantas dicot son tabaco, legumbres,
tales como altramuces, patata, remolacha azucarera, guisante, judía
y semilla de soja, y crucíferas (familia de Brassicaceae), tales
como coliflor, planta de colza y el organismo prototipo muy
relacionado Arabidopsis thaliana.
Ejemplos de partes de la planta son el vástago,
el callo, las hojas, la raíz, las frutas, las semillas, y los
tubérculos. En el contexto presente, también los tejidos
específicos de la planta, tales como cloroplasto, apoplasto,
mitocondria, vacuola, peroxisomas y citoplasma son considerados
como una parte del vegetal. Además, cualquier célula vegetal,
cualquiera que sea el origen del tejido, es considerada como una
parte de la planta.
También incluidas dentro del campo de la
invención están la progenie de dichas plantas, partes de la planta
y células vegetales.
La planta transgénica o célula vegetal que
expresa la enzima de la invención pueden ser construidos conforme a
métodos conocidos en la técnica. En resumidas cuentas la planta o
célula vegetal son construidos incorporando uno o varios
constructos de expresión que codifican la enzima de la invención en
el genoma huésped vegetal y propagando la planta resultante
modificada o la célula vegetal en una planta o célula vegetal
transgénica.
Convenientemente, el constructo de expresión es
un constructo de ADN que comprende un gen que codifica la enzima de
la invención en asociación operable con secuencias reguladoras
apropiadas requeridas para la expresión del gen en la planta o en
la parte de la planta de elección. Además, el constructo de
expresión puede comprender un marcador seleccionable útil para
identificar células huéspedes dentro de las que ha sido integrado
el constructo de expresión y las secuencias de ADN necesarias para
la introducción del constructo en la planta en cuestión (esto
último depende del método de introducción de ADN que vaya a ser
usado).
La elección de secuencias reguladoras, tales
como secuencias del promotor y terminador y opcionalmente
secuencias señal o de tránsito es determinada, p. ej. con base en
cuando, donde y como se desee que sea expresada la enzima. Por
ejemplo, la expresión del gen que codifica la enzima de la
invención puede ser constitutiva o inducible, o puede ser
desarrollable, específica de fase o tejido, y el producto genético
puede ser dirigido a un tejido o parte específica del vegetal,
tales como las semillas o las hojas. Secuencias reguladoras están
descritas p. ej. por Tague et al, Plant, Phys., 86, 506,
1988.
Para la expresión constitutiva puede ser usado
el promotor 35S-CaMV (Franck et al., 1980.
Cell 21, 285-294). Promotores
órgano-específicos pueden ser p. ej. un promotor a
partir de tejidos de sumidero de almacenamiento tales como semillas,
tubérculos de patata, y frutas (Edwards & Coruzzi, 1990. Annu.
Rev. Genet. 24, 275-303), o a partir de tejidos de
sumidero metabólicos tales como meristemas (Ito et al.,
1994. Plant Mol. Biol. 24, 863-878), un promotor
específico de semillas tales como promotor de la glutelina,
prolamina, globulina o albúmina del arroz (Wu et al., Plant
and Cell Physiology Vol. 39, nº. 8 págs. 885-889
(1998), un promotor de Vicia faba de la legúmina B4 y el gen
de proteína de semilla desconocido de Vicia faba descrito
por Conrad U. et al, Journal of Plant Physiology Vol. 152,
nº. 6 pp. 708-711 (1998), un promotor de una
proteína de cuerpo de aceite de semilla (Chen. et Al., Plant
and cell physiology vol. 39, nº. 9 pp. 935-941
(1998), el promotor napA de la proteína de almacenamiento de
Brassica napus, o cualquier otro promotor específico de
semilla conocido en la técnica, p. ej. como se describe en WO
91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico de
las hojas, tal como el promotor rbcs del arroz o del tomate (Kyozuka
et al., Plant Physiology Vol. 102, nº. 3 pp.
991-1000. (1993), el promotor del gen de la adenina
metil transferasa del virus de chlorella (Mitra, A. and Higgins, DW,
Plant Molecular Biology Vol. 26, nº. 1 pp. 85-93
(1994); o el promotor del gen aldP del arroz (Kagaya et al.,
Molecular and General Genetics Vol. 248, nº. 6. pp.
668-674 (1995), o un promotor inducible dañado tal
como el promotor pin2 de la patata (Xu et al, Plant
Molecular Biology Vol. 22 nº. 4 pp. 573-588
(1993).
Un elemento potenciador del promotor puede ser
usado para conseguir una expresión mayor de la enzima en la planta.
Por ejemplo, el elemento potenciador del promotor puede ser un
intrón colocado entre el promotor y la secuencia de nucleótidos que
codifica la enzima. Por ejemplo, Xu et al. op cit describen
el uso del primer intrón del gen de la actina 1 del arroz para
potenciar la expresión.
El gen marcador seleccionable y cualesquiera
otras partes del constructo de expresión pueden ser elegidos de
aquellos disponibles en la técnica.
El constructo de ADN es incorporado en el genoma
vegetal según técnicas convencionales conocidas en la técnica,
incluyendo la transformación mediada por Agrobacterium,
transformación mediada por virus, micro inyección, bombardeo de
partículas, transformación biolística, y electroporación (Gasser
et al, Science, 244, 1293; Potrykus, Bio/Techn. 8, 535,
1990; Shimamoto et al, Nature, 338, 274, 1989).
Actualmente, la transferencia de genes mediada
por Agrobacterium tumefaciens es el método de elección para
generar dicots transgénicas (para revisión Hooykas &
Schilperoort, 1992. Plant Mol. Biol. 19, 15-38), no
obstante, puede ser usado también para transformar monocots, aunque
son generalmente preferidos otros métodos de transformación para
estas plantas. Actualmente, el método de elección para generar
monocots transgénicas es el bombardeo de partículas (oro
microscópico o partículas de tungsteno revestidas con ADN
transfomante) de callos embrionarios o embriones en desarrollo
(Christou, 1992. Plant J. 2, 275-281; Shimamoto,
1994. Curr. Opin. Biotechnol. 5, 158-162; Vasil
et al., 1992. Bio/Technology 10, 667-674).
Un método alternativo para transformación de monocots está basado
en la transformación de los protoplastos como se describe por
Omirulleh S, et al., Plant Molecular biology Vol. 21, nº. 3
pp. 415-428 (1993).
Después de la transformación, los transformantes
que han incorporado el constructo de expresión son seleccionados y
regenerados en plantas enteras según métodos bien conocidos en la
técnica.
En una forma de realización preferida de la
presente invención, la xiloglucanasa tiene una actividad relativa a
una temperatura de 50ºC, preferiblemente de al menos el 60%,
preferiblemente al menos el 70%, en comparación con la actividad a
la temperatura óptima.
En otra forma de realización preferida
adicional, a una temperatura de 60ºC, la actividad relativa de
xiloglucanasa es de al menos el 40%, preferiblemente al menos el
50%; a una temperatura de 70ºC, la actividad relativa de
xiloglucanasa es de al menos el 40%, preferiblemente al menos del
45%, especialmente al menos del 50%.
En aún otro aspecto, la presente invención se
refiere a una composición enzimática que comprende una enzima que
muestra la actividad xiloglucanasa como se ha descrito
anteriormente.
La composición enzimática de la invención puede,
además de la xiloglucanasa de la invención, comprender uno o varios
otros tipos de enzimas, por ejemplo, hemicelulasa tal como xilanasa
y mananasa, celulasa o componentes de
endo-\beta-1,4-glucanasa,
quitinasa, lipasa, esterasa, pectinasa, cutinasa, fitasa,
oxidorreductasa (peroxidasa, haloperoxidasa, oxidasa, lacasa),
proteasa, amilasa, reductasa, fenoloxidasa, ligninasa, pululanasa,
pectato liasa, pectina acetil esterasa, poligalacturonasa,
ramnogalacturonasa, pectina liasa, pectina metilesterasa,
celobiohidrolasa, transglutaminasa; o mezclas derivadas.
La composición enzimática puede ser preparada
conforme a métodos conocidos en la técnica y puede tener forma de
una composición líquida o seca. Por ejemplo, la composición
enzimática puede tener forma de un granulado o microgranulado. La
enzima que debe ser incluida en la composición puede ser
estabilizada conforme a métodos conocidos en la técnica.
Las xiloglucanasas tienen usos potenciales en
muchas industrias y aplicaciones diferentes. Abajo se dan ejemplos
de usos preferidos de la composición enzimática de la invención. La
dosificación de la composición enzimática de la invención y otras
condiciones bajo las que es usada la composición pueden ser
determinadas con base en métodos conocidos en la técnica.
La xiloglucanasa o composición de xiloglucanasa
según la invención puede ser útil para al menos uno de los
siguientes objetivos.
Durante el lavado y el vestido, la materia
colorante se caerá normalmente de los tejidos y prendas teñidas,
que entonces tendrán un aspecto descolorido y gastado. La
eliminación de las fibras superficiales del tejido restaurará
parcialmente los colores originales y apariencias del tejido. El
término "aclaración del color", como se utiliza en este caso,
significa la restauración parcial de los colores iniciales del
tejido o prenda a lo largo de múltiples ciclos de lavado.
El término "desfrisado" indica la
eliminación de las motitas de la superficie del tejido.
El término "solución de remojo" indica una
solución acuosa donde la ropa puede ser sumergida antes de ser
objeto de un proceso de lavado convencional. La solución de lavado
puede contener uno o más ingredientes usados normalmente en un
proceso de lavado o de lavado de la ropa.
El término "solución de lavado" indica una
solución acuosa donde la ropa es sometida a un proceso de lavado,
es decir, normalmente una acción combinada química y mecánica bien
manualmente o bien en una lavadora. Normalmente, la solución de
lavado es una solución acuosa de una composición de detergente en
polvo o líquida.
El término "solución de aclarado" indica
una solución acuosa donde la ropa es sumergida y, tratada
normalmente inmediatamente después de haber sido sometida a un
proceso de lavado, para enjuagar la ropa, es decir, esencialmente
para eliminar la solución de detergente de la ropa. La solución de
aclarado puede contener una composición acondicionadora o
suavizante del tejido.
La ropa sometida al método de la presente
invención puede ser ropa lavable convencional. Preferiblemente, la
mayor parte de la ropa es tejido cosido o sin coser, incluyendo
tricotados, tejidos, telas vaqueras, madejas, y felpa, hecha de
algodón, mezclas de algodón o celulosas naturales o sintéticas (p.
ej. originadas de fibras celulósicas con xilano tal como de pulpa
de madera) o mezclas de las mismas. Ejemplos de mezclas son mezclas
de algodón o rayón/viscosa con uno o más materiales de
acompañamiento tales como lana, fibras sintéticas (p. ej. fibras de
poliamida, fibras acrílicas, fibras de poliéster, fibras de alcohol
polivinílico, fibras de cloruro de polivinilo, fibras de cloruro de
polivinilideno, fibras de poliuretano, fibras de poliurea, fibras de
aramida), y fibras con celulosa (p. ej. rayón/viscosa, ramio, lino,
yute, fibras de acetato de celulosa, lyocell).
Las composiciones del detergente según la
presente invención comprenden un sistema de agentes tensoactivos
donde el agente tensoactivo puede ser seleccionado a partir de
agentes tensoactivos no iónicos y/o aniónicos y/o catiónicos y/o
anfolíticos y/o zwitteriónicos y/o semipolares.
El agente tensoactivo está normalmente presente
a un nivel del 0,1% al 60% en peso.
El agente tensoactivo es preferiblemente
formulado para ser compatible con componentes enzimáticos presentes
en la composición. En composiciones líquidas o de gel el agente
tensoactivo es formulado de la forma más preferible de manera que
promueva, o al menos no degrade la estabilidad de cualquier enzima
en estas composiciones.
Los sistemas preferidos para ser usados según la
presente invención comprenden como agente tensoactivo uno o más de
los agentes tensoactivos no iónicos y/o aniónicos descritos
aquí.
Los condensados de óxido de polietileno, de
polipropileno, y de polibutileno de alquil fenoles son adecuados
para el uso como agentes tensoactivos no-iónicos de
los sistemas de agentes tensoactivos de la presente invención,
siendo preferidos los condensados de óxido de polietileno. Estos
compuestos incluyen los productos de condensación de
alquil-fenoles que tienen un grupo alquilo que
contiene desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 14 átomos de
carbono, preferiblemente desde aproximadamente 8 hasta
aproximadamente 14 átomos de carbono, en bien una configuración de
cadena lineal o de cadena ramificada con el óxido de aiquileno. En
una forma de realización preferida el óxido de etileno está
presente en una cantidad igual a desde aproximadamente 2 hasta
aproximadamente 25 moles, más preferiblemente desde aproximadamente
3 hasta aproximadamente 15 moles, de óxido de etileno por mol de
alquil fenol. Los agentes tensoactivos comercialmente disponibles no
iónicos de este tipo incluyen Igepal^{TM} CO-630,
comercializado por GAF Corporation; y Triton^{TM}
X-45; X-114; X-100
y X-102, todos comercializados por Rohm & Haas
Company. A estos agentes tensoactivos se les hace referencia
comúnmente como alcoxilatos de alquilfenol (p. ej., etoxilatos de
alquilfenol).
Los productos de condensación de alcoholes
alifáticos primarios y secundarios con aproximadamente 1 hasta
aproximadamente 25 moles de óxido de etileno son adecuados para el
uso como agente tensoactivo no iónico de los sistemas de agentes
tensoactivos no iónicos de la presente invención. La cadena de
alquilo del alcohol alifático puede ser recta o ramificada, primaria
o secundaria, y generalmente contiene desde aproximadamente 8 hasta
aproximadamente 22 átomos de carbono. Preferidos son los productos
de condensación de alcoholes con un grupo alquilo que contenga
desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 20 átomos de carbono,
más preferiblemente desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente
18 átomos de carbono, con desde aproximadamente 2 hasta
aproximadamente 10 moles de óxido de etileno por mol de alcohol.
Aproximadamente desde 2 hasta aproximadamente 7 moles de óxido de
etileno y de la forma más preferible desde 2 hasta 5 moles de óxido
de etileno por mol de alcohol están presentes en dichos productos
de condensación. Ejemplos de agentes tensoactivos de este tipo no
iónicos comercialmente disponibles incluyen Tergitol^{TM}
15-S-9 (El producto de condensación
del alcohol lineal C_{11}-C_{15} con 9 moles de
óxido de etileno), Tergitol^{TM}
24-L-6 NMW (El producto de
condensación del alcohol primario C_{12}-C_{14}
con 6 moles de óxido de etileno con una distribución estrecha del
peso molecular), ambos comercializados por Union Carbide
Corporation; Neodol^{TM} 45-9 (el producto de
condensación de alcohol lineal C_{14}-C_{15}
con 9 moles de óxido de etileno), Neodol^{TM} 23-3
(El producto de condensación de alcohol lineal
C_{12}-C_{13} con 3.0 moles de óxido de
etileno), Neodol^{TM} 45-7 (el producto de
condensación de alcohol lineal C_{14}-C_{15} con
7 moles de óxido de etileno), Neodol^{TM} 45-5
(El producto de condensación de alcohol lineal
C_{14}-C_{15} con 5 moles de óxido de etileno)
comercializados por Shell Chemical Company, Kyro^{TM} EOB (El
producto de condensación de alcohol
C_{13}-C_{15} con 9 moles de óxido de etileno),
comercializado por Procter & Gamble Company, y Genapol LA 050
(El producto de condensación de alcohol
C_{12}-C_{14} con 5 moles de óxido de etileno)
comercializado por Hoechst. La gama preferida de HLB en estos
productos es de 8-11 y de la forma más preferida de
8-10.
También útiles como agentes tensoactivos no
iónicos de los sistemas de agentes tensoactivos de la presente
invención son los alquil polisacáridos descritos en US 4,565,647,
que tienen un grupo hidrofóbico que contiene desde aproximadamente
6 hasta aproximadamente 30 átomos de carbono, preferiblemente desde
aproximadamente 10 hasta aproximadamente 16 átomos de carbono y un
polisacárido, p. ej. un poliglucósido, grupo hidrofílico que
contiene desde aproximadamente 1,3 hasta aproximadamente 10,
preferiblemente desde aproximadamente 1,3 hasta aproximadamente 3,
de la forma más preferible desde aproximadamente 1,3 hasta
aproximadamente 2,7 unidades sacáridas. Puede ser usado cualquier
sacárido reductor que contenga 5 o 6 átomos de carbono, p. ej.,
glucosa, galactosa y fracciones de galactosilo pueden ser
sustituidas por fracciones de glucosilo (opcionalmente el grupo
hidrofóbico es unido en las posiciones 2, 3, 4, etc. dando así una
glucosa o galactosa a diferencia de un glucósido o galactósido).
Las uniones intersacáridas pueden estar, p. ej., entre la posición
uno de las unidades sacáridas adicionales y las posiciones 2, 3, 4,
y/o 6 en las unidades sacáridas precedentes.
Los alquil poliglucósidos preferidos tienen la
fórmula.
R^{2}O (C_{n}
H_{2n}O)_{t}(glicosil)_{x}
donde R^{2} es seleccionado del
grupo que consiste en alquilo, alquilfenol, hidroxialquilo,
hidroxialquilfenilo, y sus mezclas derivadas donde los grupos
alquilo contienen desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente
18, preferiblemente desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente
14, átomos de carbono; n es 2 ó 3, preferiblemente 2; t es de 0 a
aproximadamente 10, preferiblemente 0; y x es de aproximadamente
1,3 hasta aproximadamente 10, preferiblemente desde aproximadamente
1,3 hasta aproximadamente 3, de la forma más preferible desde
aproximadamente 1,3 hasta aproximadamente 2,7. El glucosilo es
derivado preferiblemente de glucosa. Para preparar estos
compuestos, el alcohol o alquilpolietoxi alcohol es formado primero
y después reaccionado con glucosa, o una fuente de glucosa, para
formar el glucósido (fijación en la posición-1).
Las unidades de glicosilo adicionales pueden después ser unidas
entre su posición-1 y la posición de las unidades de
glicosilo precedentes 2, 3, 4, y/o 6, preferiblemente
predominantemente la
posición-2.
Los productos de condensación de óxido de
etileno con una base hidrofóbica formada por la condensación de
óxido de propileno con propilenglicol son también adecuados para el
uso como sistemas adicionales de agentes tensoactivos no iónicos de
la presente invención. La parte hidrofóbica de estos compuestos
tendrá preferiblemente un peso molecular desde aproximadamente 1500
hasta aproximadamente 1800 y mostrará insolubilidad al agua. La
adición de fracciones de polioxietileno a esta parte hidrofóbica
tiende a aumentar la solubilidad en agua de la molécula en
conjunto, y el carácter líquido del producto es retenido hasta el
punto donde el contenido de polioxietileno es aproximadamente el
50% del peso total del producto de condensación, que corresponde a
la condensación con hasta aproximadamente 40 moles de óxido de
etileno. Ejemplos de compuestos de este tipo incluyen determinados
agentes tensoactivos comercialmente disponibles Pluronic^{TM},
comercializados por BASF.
También adecuados para el uso como agente
tensoactivo no iónico del sistema de agentes tensoactivos no
iónicos de la presente invención son los productos de condensación
de óxido de etileno con el producto resultante de la reacción de
óxido de propileno y etilendiamina. La fracción hidrofóbica de estos
productos consiste en el producto de reacción de etilendiamina y
óxido de propileno en exceso, y generalmente tiene un peso
molecular de aproximadamente 2500 a aproximadamente 3000. Esta
fracción hidrofóbica es condensada con óxido de etileno hasta tal
punto que el producto de condensación contiene desde
aproximadamente el 40% hasta aproximadamente el 80% en peso de
polioxietileno y tiene un peso molecular de desde aproximadamente
5.000 hasta aproximadamente 11.000. Ejemplos de este tipo de agente
tensoactivo no iónico incluyen determinados compuestos de
Tetronic^{TM}, comercializados por BASF.
Preferidos para el uso como agente tensoactivo
no iónico de los sistemas de agentes tensoactivos de la presente
invención son condensados de óxido de polietileno de alquilfenoles,
productos de condensación de alcoholes alifáticos primarios y
secundarios con desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 25
moles de óxido de etileno, alquil polisacáridos, y mezclas de estos.
Los más preferidos son etoxilatos de alquilfenol
C_{6}-C_{14} que tienen de 3 a 15 grupos etoxi y
etoxilatos de alcohol C_{8}-C_{18}
(preferiblemente C_{10} promedio) que tienen desde 2 hasta 10
grupos etoxi, y sus mezclas derivadas. Agentes tensoactivos no
iónicos muy preferidos son agentes tensoactivos de polihidroxi
amida de ácido graso de la fórmula
donde R^{1} es H, o R^{1} es
C_{1-4} hidrocarbilo,
2-hidroxietilo, 2-hidroxipropilo o
una mezcla de los mismos, R^{2} es C_{5-31}
hidrocarbilo, y Z es un polihidroxi hidrocarbilo que tiene una
cadena lineal de hidrocarbilo con al menos 3 hidróxilos directamente
conectados a la cadena, o un derivado alcoxilado de los mismos.
Preferiblemente, R^{1} es metilo, R^{2} es una cadena recta de
C_{11-15} alquilo o C_{16-18}
alquilo o alquenilo tal como alquilo de coco o mezclas derivadas, y
Z es derivado de un azúcar reductor tal como glucosa, fructosa,
maltosa o lactona, en una reacción de aminación
reductiva.
Agentes tensoactivos aniónicos muy preferidos
incluyen agentes tensoactivos de sulfato alcoxilado de alquilo.
Ejemplos de esto son sales o ácidos hidrosolubles de la fórmula
RO(A)_{m}SO3M donde R es un grupo
C_{10}-C_{24} alquilo o hidroxialquilo
insustituido que tiene un componente
C_{10}-C_{24} alquilo, preferiblemente un
C_{12}-C_{20}alquilo o hidroxialquilo, más
preferiblemente C_{12}-C_{18}alquilo o
hidroxialquilo, A es una unidad etoxi o propoxi, m es mayor que
cero, normalmente entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 6,
más preferiblemente entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 3,
y m es H o un catión que puede ser, por ejemplo, un catión metálico
(p. ej., sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, etc.), catión de
amonio o de amonio sustituido. Aquí están contemplados sulfatos de
alquilo etoxilados al igual que sulfatos de alquilo propoxilados.
Ejemplos específicos de cationes de amonio insustituidos incluyen
cationes de metil, dimetil, trimetil-amonio y
cationes de amonio cuaternario tales como cationes de
tetrametil-amonio y de dimetil piperdinio y
aquellos derivados de alquilaminas tales como etilamina,
dietilamina, trietilamina, mezclas derivadas, y similares que
contengan xiloglucano. Agentes tensoactivos ejemplares son sulfato
(C_{12}-C_{18} E(1.0)M de
C_{12}-C_{18} alquilo polietoxilado (1.0)),
sulfato (C_{12}-C_{18} (2.25)M) de
C_{12}-C_{18} alquilo polietoxilado (2.25), y
sulfato (C_{12}-C_{18} E(3.0)M) de
C_{12}-C_{18} alquilo polietoxilado (3.0), y
sulfato (C_{12}-C_{18} E(4.0) M) de
C_{12}-C_{18} alquilo polietoxilado (4.0)),
donde M es convenientemente seleccionado de sodio y potasio.
Agentes tensoactivos aniónicos adecuados para ser usados son
agentes tensoactivos de sulfonato de éster alquílico que incluyen
ésteres lineales de C_{8}-C_{20} ácidos
carboxílicos (es decir, ácidos grasos), que son, sulfonatados con
SO_{3} gaseoso según "The Journal of the American Oil Chemists
Society", 52 (1975), págs. 323-329. Materias
primas adecuadas incluyen sustancias naturales grasas como
derivadas de sebo, aceite de palma, etc.
Los agentes tensoactivos de sulfonato de éster
alquílico preferido, especialmente para aplicaciones de lavado de
la ropa, comprenden tensoactivos de sulfonato de éster alquílico de
la fórmula estructural:
donde R^{3} es un
C_{8}-C_{20} hidrocarbilo, preferiblemente un
alquilo, o combinación de los mismos R^{4} es un
C_{1}-C_{6} hidrocarbilo, preferiblemente un
alquilo, o combinación de estos, y M es un catión, que forma una
sal hidrosoluble con el sulfonato de éster alquílico. Cationes
adecuados que forman sales incluyen metales tales como sodio,
potasio, y litio, y cationes amónicos sustituidos o insustituidos,
tales como monoetanolamina, dietanolamina, y trietanolamina.
Preferiblemente, R^{3} es C_{10}-C_{15}
alquilo, y R^{4} es metilo, etilo o isopropilo. Especialmente
preferidos son los sulfonatos de éster metílico donde R_{3} es
C_{10}-C_{15}
alquilo.
Otros agentes tensoactivos aniónicos adecuados
incluyen los agentes tensoactivos de sulfato de alquilo que son
sales hidrosolubles o ácidos de la fórmula ROSO_{3}M donde R
preferiblemente es un C_{10}-C_{24}
hidrocarbilo, preferiblemente un alquilo o hidroxialquilo que tiene
un componente de C_{10}-C_{10} alquilo, más
preferiblemente un C_{12}-C_{18}alquilo o
hidroxialquilo, y M es H o un catión, p. ej., un catión de metal
alcalino (p. ej. sodio, potasio, litio), o amonio o amonio
sustituido (p. ej. cationes de metil, dimetil, y trimetil amonio y
cationes de amonio cuaternario tal como
tetrametil-amonio y cationes de dimetil piperdinio y
cationes de amonio cuaternario derivados de alquilaminas, tales
como etilamina, dietilamina, trietilamina, y sus mezclas derivadas,
y similares). Normalmente, cadenas de
C_{12}-C_{16} alquilo son preferidas para las
temperaturas de lavado inferiores (p. ej. por debajo de
aproximadamente 50ºC) y las cadenas de
C_{16}-C_{18} alquilo son preferidas para
temperaturas de lavado más altas (p. ej. aproximadamente por encima
de 50ºC).
Otros agentes tensoactivos aniónicos útiles para
fines detersivos pueden también ser incluidos en las composiciones
de detergente para lavado de la ropa de la presente invención.
Estos pueden incluir sales (incluyendo, por ejemplo, sodio,
potasio, amonio, y sales amónicas sustituidas tales como sales de
mono- di- y trietanolamina) de jabón, alcanosulfonatos
C_{8}-C_{22} primarios o secundarios,
olefinsulfonatos C_{8}-C_{24}, ácidos
sulfonatados policarboxílicos preparados por sulfonación del
producto pirolizado de citratos de metal alcalinotérreo, p. ej.,
como se describe en la descripción de la patente británica nº.
1,082,179, alquilpoliglicoletersulfatos
C_{8}-C_{24} (que contienen hasta 10 moles de
óxido de etileno); sulfonatos de alquilglicerol, sulfonatos grasos
de acilglicerol, sulfatos grasos de oleil glicerol, sulfatos de
éter de óxido de etileno de alquilfenol, sulfonatos de parafina,
fosfatos de alquilo, isetionatos tales como los isetionatos de
acilo, tauratos de N-acilo, succinamatos de alquilo
y sulfosuccinatos, monoésteres de sulfosuccinatos (especialmente
monoésteres C_{12}-C_{18} saturados e
insaturados) y diésteres de sulfosuccinatos (especialmente
C_{6}-C_{12}diésteres saturados e insaturados),
sarcosinatos de acilo, sulfatos de alquilpolisacáridos tales como
los sulfatos de alquilpoliglucósido (siendo descritos abajo los
compuestos no sulfatados no iónicos) sulfatos de alquilo primarios
ramificados, y alquil polietoxi carboxilatos, tales como aquellos
de la fórmula RO
(CH_{2}CH_{2}O)x-CH_{2}-M+
donde R es un C_{8}-C_{22} alquilo, k es un
número entero de 1 a 10, y M es un catión que forma sal soluble.
Acidos resínicos y ácidos resínicos hidrogenados son también
adecuados, tales como resina, resina hidrogenada, y ácidos resínicos
y ácidos resínicos hidrogenados presentes en o derivados de aceite
de resina.
Sulfonatos de alquilbenceno son altamente
preferidos. Especialmente preferidos son sulfonatos de
alquilbenceno (LAS) de (cadena lineal) lineales donde el grupo
alquilo contiene preferiblemente de 10 a 18 átomos de carbono.
Otros ejemplos son descritos en "Surface
Active Agents and Detergents" (Vol. I y II por Schwartz, Perrry
and Berch). Una variedad de agentes tensoactivos de este tipo son
también generalmente descritos en US 3,929,678, (columna 23, línea
58 a través de columna 29, línea 23, incorporada aquí por
referencia).
Cuando incluidas allí dentro, las composiciones
del detergente para el lavado de la ropa de la presente invención
comprenden normalmente desde aproximadamente el 1% hasta
aproximadamente el 40%, preferiblemente desde aproximadamente el 3%
hasta aproximadamente el 20% en peso de tales agentes tensoactivos
aniónicos.
Las composiciones del detergente para lavado de
la ropa de la presente invención pueden también contener agentes
tensoactivos catiónicos, anfolíticos, zwitteriónicos y semipolares
distintos de aquellos ya descritos aquí.
Agentes tensoactivos detersivos catiónicos
adecuados para el uso en las composiciones de detergente para
lavado de la ropa de la presente invención son aquellas que tienen
un grupo hidrocarbilo de cadena larga. Ejemplos de agentes
tensoactivos catiónicos de este tipo incluyen los agentes
tensioactivos de amonio tales como halogenuros de
alquiltrimetilamonio, teniendo aquellos agentes tensoactivos la
fórmula:
[R^{2}(OR)^{3}{}_{y}]
[R^{4}(OR^{3})_{y}]_{2}R^{5}N+x-
donde R^{2} es un grupo alquilo o
bencilalquilo que tiene desde aproximadamente 8 hasta
aproximadamente 18 átomos de carbono en la cadena de alquilo, siendo
cada R^{3} seleccionado del grupo que consiste en
-CH_{2}CH_{2} CH_{2}CH
(CH_{3})CH_{2}CH(CH_{2}OH)-,
CH_{2}CH_{2}CH_{2}-, y sus mezclas derivadas; siendo cada
R_{4} seleccionado del grupo que consiste en alquilo
C_{1}-C_{4}, hidroxialquilo
C_{1}-C_{4}, estructuras anulares de bencilo
formadas juntando los dos grupos R^{4},
-CH_{2}CHOHCHOHCOR^{6}CHOHCH_{2}OH, donde R^{6} es cualquier
hexosa o polímero de hexosa con un peso molecular menor que
aproximadamente 1000, e hidrógeno donde y no es 0; R^{5} es el
mismo que R^{4} o es una cadena de alquilo, donde el número total
de átomos de carbono o R^{2} más R^{5} no es más que
aproximadamente 18; cada y es desde 0 hasta aproximadamente 10, y
la suma de los valores y es desde aproximadamente 0 hasta 15; y X
es cualquier anión
compatible.
Agentes tensoactivos catiónicos altamente
preferidos son los compuestos de amonio hidrosolubles en la
composición presente que tiene la fórmula:
(i)R_{1}R_{2}R_{3}R_{4}N^{+}X^{-}
donde R^{1} es
C_{8}-C_{16} alquilo, cada uno de R_{2},
R_{3} y R_{4} es independientemente
C_{1}-C_{4} alquilo,
C_{1}-C_{4} hidroxi alquilo, bencilo, y
(C_{2}H_{40})_{x}H donde x tiene un valor de 2 a 5, y
x es un anión. No más de uno de R_{2}, R_{3} o R_{4} debería
ser
bencilo.
La longitud de cadena de alquilo preferida para
R_{1} es C_{12}-C_{15}, particularmente
cuando el grupo alquilo es una mezcla de longitudes de cadena
derivadas de coco o grasa de avellana de palma o es derivado
sintéticamente por desarrollo de olefina o síntesis de OXO
alcoholes.
Grupos preferidos para R_{2} R_{3} y R_{4}
son grupos metilo e hidroxietilo y el anión X puede ser
seleccionado a partir de iones haluro, metosulfato, acetato y
fosfato.
Ejemplos de compuestos de amonio cuaternario
adecuados de las fórmulas (i) para el uso aquí son:
bromuro o cloruro trimetil amónico de coco;
bromuro o cloruro metil dihidroxietil amónico de
coco;
cloruro decil trietil amónico;
bromuro o cloruro decil dimetil hidroxietil
amónico;
bromuro o cloruro
C_{12-15}dimetil hidroxietil amónico;
bromuro o cloruro dimetil hidroxietil amónico de
coco;
metil sulfato miristil trimetil amónico;
bromuro o cloruro amónico de bencil dimetil
lauril;
bromuro o cloruro lauril dimetil bencil
amónico;
bromuro o cloruro lauril dimetil (etenoxi)
amónico;
ésteres de colina (compuestos de la fórmula (i)
donde R_{1} es 100 alquilo y R_{2}R_{3}R_{3}
son metilo);
di-alquil imidazolinas
[compuestos de la fórmula (i)].
\vskip1.000000\baselineskip
Otros agentes tensoactivos catiónicos útiles
aquí son también descritos en US 4,228,044 y en EP 000 224.
Cuando se incluyen allí, las composiciones de
detergente para el lavado de la presente invención comprenden
normalmente 0,2% hasta aproximadamente 25%, preferiblemente desde
aproximadamente 1% hasta aproximadamente 8% en peso de agentes
tensoactivos catiónicos de este tipo.
Los agentes tensoactivos anfolíticos son también
adecuados para el uso en las composiciones de detergente para
lavado de la presente invención. Estos agentes tensoactivos pueden
ser descritos ampliamente como derivados alifáticos de aminas
secundarias o terciarias, o derivados alifáticos de aminas
heterocíclicas secundarias y terciarias donde el radical alifático
puede ser de cadena recta o ramificada. Uno de los sustituyentes
alifáticos contiene al menos aproximadamente 8 átomos de carbono,
normalmente desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 18 átomos
de carbono, y al menos uno contiene un grupo aniónico hidrosoluble,
p. ej. carboxi, sulfonato, sulfato. Véase US 3,929,678 (columna 19,
líneas 18-35) para ejemplos de agentes tensoactivos
anfolíticos.
Cuando se incluyen dentro, las composiciones de
detergente para lavado de la ropa de la presente invención
comprenden normalmente desde el 0,2% hasta aproximadamente el 15%,
preferiblemente desde aproximadamente el 1% a aproximadamente el
10% en peso de agentes tensoactivos anfolíticos de este tipo.
Los agentes tensoactivos zwitteriónicos son
también adecuados para el uso en las composiciones de detergente
para lavado de la ropa. Estos agentes tensoactivos pueden ser
ampliamente descritos como derivados de aminas secundarias y
terciarias, derivados de aminas heterocíclicas secundarias y
terciarias, o derivados de amonio cuaternario, compuestos de
fosfonio cuaternario o sulfonio terciario. Véase US 3,929,678
(columna 19, línea 38 a través de la columna 22, línea 48) para
ejemplos de agentes tensoactivos zwitteriónicos.
Cuando se incluyen allí, las composiciones de
detergente para lavado de la ropa de la presente invención
comprenden normalmente desde el 0,2% hasta aproximadamente el 15%,
preferiblemente desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente
el 10% en peso de tales agentes tensoactivos zwitteriónicos.
Los agentes tensoactivos no iónicos semipolares
son una categoría especial de agentes tensoactivos no iónicos que
incluyen óxidos de amina hidrosolubles que contienen una fracción
de alquilo desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 18 átomos
de carbono y 2 fracciones seleccionadas del grupo que consiste en
grupos alquilo y grupos hidroxialquilo que contienen desde
aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 átomos de carbono; óxidos
de fosfina hidrosolubles que contienen una fracción de alquilo de
desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 18 átomos de carbono
y 2 fracciones seleccionadas del grupo que consiste en grupos
alquilo y grupos hidroxialquilo que contienen desde aproximadamente
1 hasta aproximadamente 3 átomos de carbono; y sulfóxidos
hidrosolubles que contienen una fracción de alquilo desde
aproximadamente 10 hasta aproximadamente 18 átomos de carbono y una
fracción seleccionada del grupo que consiste en fracciones de
alquilo e hidroxialquilo de desde aproximadamente 1 hasta
aproximadamente 3 átomos de carbono.
Los agentes tensoactivos para detergente
no-iónicos semipolares incluyen los agentes
tensoactivos de óxido de amina que tienen la fórmula:
donde R^{3} es un grupo alquilo,
hidroxialquilo, o alquil fenilo o mezclas derivadas que contienen
desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 22 átomos de carbono;
R^{4} es un grupo alquileno o hidroxialquileno que contiene desde
aproximadamente 2 hasta aproximadamente 3 átomos de carbono o
mezclas derivadas; x es desde 0 hasta aproximadamente 3: y cada
R^{5} es un grupo alquilo o hidroxialquilo que contiene desde
aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 átomos de carbono o un
grupo de óxido de polietileno que contiene desde aproximadamente 1
hasta aproximadamente 3 grupos de óxido de etileno. Los grupos
R^{5} pueden ser fijados uno a otro, p. ej., a través de un átomo
de oxígeno o de nitrógeno, para formar una estructura
anular.
Estos agentes tensoactivos de óxido de amina
incluyen en particular óxidos de C_{10}-C_{18}
alquil dimetil amina y óxidos de C_{8}-C_{12}
alcoxi etil dihidroxi etil amina.
Cuando se incluyen allí, las composiciones de
detergente para lavado de la presente invención comprenden
normalmente desde el 0,2% hasta aproximadamente el 15%,
preferiblemente desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente
el 10% en peso de dichos agentes tensoactivos no iónicos
semipolares.
Las composiciones según la presente invención
pueden comprender además un sistema constructor. Cualquier sistema
constructor convencional es adecuado para el uso aquí, incluyendo
materiales de aluminosilicato, silicatos, policarboxilatos y ácidos
grasos, materiales tales como tetraacetato de etilendiamina,
secuestrantes de iones metálicos tales como aminopolifosfonatos,
particularmente ácido etilendiamina tetrametileno fosfónico y ácido
dietilentriamina pentametilenofosfónico. Aunque menos preferidos
por cuestiones medioambientales obvias, los constructores de
fosfato pueden también ser usados aquí.
Constructores adecuados pueden ser un material
de intercambio iónico inorgánico, comúnmente un material de
aluminosilicato inorgánico hidratado, más particularmente una
zeolita hidratada sintética tal como la zeolita hidratada A, X, B,
HS o MAP.
Otro material constructor inorgánico adecuado es
silicato estratificado, p. ej. SKS-6 (Hoechst).
SKS-6 es un silicato estratificado cristalino que
consiste en silicato sódico (Na_{2}Si_{2}O_{5}).
Policarboxilatos adecuados que contienen un
grupo carboxi incluyen ácido láctico, ácido glicólico y derivados
de éter de los mismos como se describe en las patentes belgas Nos.
831,368, 821,369 y 821,370. Los policarboxilatos que contienen dos
grupos carboxi incluyen sales hidrosolubles de ácido succínico,
ácido malónico, ácido (etilenodioxi) diacético, ácido maleico, ácido
diglicólico, ácido tartárico, ácido tartrónico y ácido fumárico, al
igual que los carboxilatos de éter descritos en la solicitud de
patente alemana (Offenlegungsschrift 2,446,686, y 2,446,487, US
3,935,257 y los sulfinil carboxilatos descritos en la patente belga
nº. 840,623. Policarboxilatos que contienen tres grupos carboxi
incluyen, en particular, citratos hidrosolubles, aconitratos y
citraconatos al igual que derivados de succinato tales como los
carboximetiloxisuccinatos descritos en la patente británica nº.
1,379,241, lactoxisuccinatos descritos la Solicitud holandesa
7205873, y los materiales de oxipolicarboxilato tales como
2-oxa-1,1,3-propano
tricarboxilatos descritos en la patente británica nº. 1,387,447.
Policarboxilatos que contienen cuatro grupos
carboxi incluyen oxidisuccinatos descritos en la patente británica
nº. 1,261,829, 1,1,2,2,-etano tetracarboxilatos,
1,1,3,3-propano tetracarboxilatos que contienen
sustituyentes de sulfo incluyen los derivados de sulfosuccinato
descritos en las patentes británicas Nos. 1,398,421 y 1,398,422 y
en US 3,936,448, y los citratos sulfonatados pirolizados descritos
en la patente británica nº. 1,082,179, mientras que los
policarboxilatos que contienen sustituyentes de fosfona están
descritos en la patente británica nº. 1,439,000.
Los policarboxilatos alicíclicos y
heterocíclicos incluyen
ciclopentano-cis,cis-cis-tetracarboxilatos,
ciclopentadienida pentacarboxilatos,
2,3,4,5-tetrahidro-furan-cis,
cis, cis-tetracarboxilatos,
2,5-tetrahidro-furan-cis,
discarboxilatos,
2,2,5,5,-tetrahidrofurano-tetracarboxilatos,
1,2,3,4,5,6-hexano-hexacarboxilatos
y carboximetilo derivados de alcoholes polihídricos tales como
sorbitol, manitol y xilitol. Policarboxilatos aromáticos incluyen
ácido melítico, ácido piromelítico y los derivados de ácido ftálico
descritos en la patente británica nº. 1,425,343.
De los anteriores, los policarboxilatos
preferidos son los hidroxi-carboxilatos que
contienen hasta tres grupos carboxi por molécula, más
particularmente citratos.
Sistemas constructores preferidos para el uso en
las composiciones presentes incluyen una mezcla de un constructor
de alumino-silicato hidrosoluble, tal como zeolita
A o de un silicato estratificado (SKS-6), y un
agente quelante de carboxilato hidrosoluble, tal como el ácido
cítrico.
Un quelante adecuado para la inclusión en las
composiciones de detergente conforme a la invención es el ácido
etilendiamina-N,N'-disuccínico
(EDDS) o el metal alcalino, metal alcalinotérreo, amonio, o sales
amónicas sustituidas de estos, o mezclas derivadas. Compuestos
preferidos de EDDS son la forma ácida libre y la sal sódica o
magnésica de los mismos. Ejemplos de tales sales sódicas preferidas
de EDDS incluyen Na_{2}EDDS y Na_{4}EDDS. Ejemplos de dichas
sales magnésicas de EDDS preferidas incluyen MgEDDS y Mg_{2}EDDS.
Las sales magnésicas son las más preferidas para inclusión en
composiciones conforme a la invención.
Los sistemas de construcción preferidos incluyen
una mezcla de un constructor de aluminosilicato insoluble en agua
tal como zeolita A, y un agente quelante de carboxilato
hidrosoluble tal como el ácido cítrico.
Otros materiales de construcción que pueden
formar parte del sistema de construcción para el uso en
composiciones granulosas incluyen materiales inorgánicos tales como
carbonatos de metal alcalino, bicarbonatos, silicatos, y materiales
orgánicos tales como los fosfonatos orgánicos, fosfonatos de amino
polialquileno y amino policarboxilatos.
Otras sales orgánicas hidrosolubles adecuadas
son los ácidos homo- o co-poliméricos o sus sales,
donde el ácido policarboxílico comprende al menos dos radicales de
carboxilo separados entre si por no más de dos átomos de
carbono.
Los polímeros de este tipo están descritos en
GB-A-1,596,756. Ejemplos de sales
de este tipo son poliacrilatos de PM 2000-5000 y sus
copolímeros con anhídrido maleico, teniendo dichos polímeros un
peso molecular de desde 20.000 hasta 70.000, especialmente
aproximadamente 40.000.
Las sales de construcción de detergencia están
normalmente incluidas en cantidades de desde el 5% al 80% en peso
de la composición. Niveles preferidos de construcción para
detergentes líquidos son desde el 5% hasta el
30%.
30%.
Las composiciones de detergente preferidas,
además de la preparación enzimática de la invención, comprenden
otra(s) enzima(s) que proporcionan rendimiento de
limpieza y/o beneficios en el cuidado del tejido.
Enzimas de este tipo incluyen proteasas,
lipasas, cutinasas, amilasas, celulasas, peroxidasas, oxidasas (p.
ej. lacasas).
Proteasas: puede ser usada cualquier
proteasa adecuada para el uso en soluciones alcalinas. Proteasas
adecuadas incluyen aquellas de origen animal, vegetal o microbiano.
Se prefiere el origen microbiano. Se incluyen mutantes química o
genéticamente modificados. La proteasa puede ser una serina
proteasa, preferiblemente una proteasa alcalina microbiana o una
proteasa tipo tripsina. Ejemplos de proteasas alcalinas son
subtilisinas, especialmente aquellas derivadas de Bacillus,
p. ej., subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309,
subtilisina 147 y subtilisina 168 (descrita en WO 89/06279).
Ejemplos de proteasas tipo tripsina son tripsina (p. ej. de origen
porcino o bovino) y la proteasa Fusarium descrita en WO
89/06270.
Enzimas proteásicas preferidas comercialmente
disponibles incluyen aquellas vendidas bajo los nombres comerciales
Alcalase, Savinase, Primase, Durazym, y Esperase por Novo Nordisk
A/S (Dinamarca), aquellas vendidas bajo el nombre comercial,
Maxatase, Maxacal, Maxapem, Properase, Purafect y Purafect OXP por
Genencor International, y aquellas vendidas bajo el nombre
comercial Opticlean y Optimase por Solvay Enzymes. Enzimas
proteásicas pueden ser incorporadas en las composiciones conforme a
la invención a un nivel del 0,00001% al 2% de proteína enzimática
en peso de la composición, preferiblemente a un nivel del 0,0001%
al 1% de proteína enzimática en peso de la composición, más
preferiblemente a un nivel dei 0,001% al 0,5% de proteína
enzimática en peso de la composición, incluso más preferiblemente a
un nivel de del 0,01% al 0,2% de proteína enzimática en peso de la
composición.
Lipasas: cualquier lipasa adecuada para
el uso en soluciones alcalinas puede ser usada. Lipasas adecuadas
incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen
mutantes modificados química o genéticamente.
Ejemplos de lipasas útiles incluyen una lipasa
de Humicola lanuginosa, p. ej., como se describe en EP 258
068 y EP 305 216, una lipasa de Rhizomucor miehei, p. ej.,
como se describe en EP 238 023, una lipasa de Candida, tal
como una lipasa de C. antarctica, p. ej., la lipasa A o B de
C. antarctica descrita en EP 214 761, una lipasa de
Pseudomonas tal como una lipasa de P. alcalipenes y
P. pseudoalcaligenes, p. ej., como se describe en EP 218
272, una lipasa de P. cepacia, p. ej., como se describe en
EP 331 376, una lipasa de P. stutzeri, p. ej., como descrita
en GB 1,372,034, una lipasa de P. fluorescens, una lipasa de
Bacillus, p. ej., una lipasa de B. subtilis (Dartois
et al., (1993), Biochemica et Biophysica acta 1131,
253-260), una lipasa de B.
stearo-thermophilus (JP 64/744992) y una lipasa
de B. pumilus (WO 91/16422).
Además, pueden ser útiles varias lipasas
clonadas, incluyendo la lipasa de Penicillium camembertii
descrita por Yamaguchi et al., (1991), Gene 103,
61-67), la lipasa de Geotricum candidum
(Schimada, Y. et Al., (1989), J. Biochem., 106,
383-388), y varias lipasas de Rhizopus tales
como una lipasa de R. delemar (Hass, M.J et al.,
(1991), Gene 109, 117-113), una lipasa de R.
niveus (Kugimiya et al., (1992), Biosci. Biotech.
Biochem. 56, 716-719) y una lipasa de R.
oryzae.
Otros tipos de enzimas lipolíticas tales como
las cutinasas pueden también ser útiles, p. ej., una cutinasa
derivada de Pseudomonas mendocina como se describe en WO
88/09367, o una cutinasa derivada de Fusarium solani pisi (p.
ej. descrita en WO 90/09446).
Lipasas especialmente adecuadas son lipasas
tales como la M1 Lipase^{TM}, Luma fast^{TM} y Lipomax^{TM}
(Genencor), Lipolase^{TM} y Lipolase Ultra^{TM} (Novo Nordisk
A/S), y Lipase P "Amano" (Amano Pharmaceutical Co. Ltd.).
Las lipasas son incorporadas normalmente en la
composición del detergente a un nivel del 0,00001% al 2% de
proteína enzimática en peso de la composición, preferiblemente a un
nivel del 0,0001% al 1% en peso de proteínas enzimáticas de la
composición, más preferiblemente a un nivel del 0,001% al 0,5% de
proteína enzimática en peso de la composición, incluso más
preferiblemente a un nivel del 0,01% al 0,2% de proteína enzimática
en peso de la composición.
Amilasas: puede ser usada cualquier
amilasa (a y/o b) adecuada para el uso en soluciones alcalinas.
Amilasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o
fúngico. Se incluyen mutantes modificados química o genéticamente.
Las amilasas incluyen, por ejemplo, a-amilasas
obtenidas de una cepa especial de B. licheniformis, descrita
en más detalle en GB 1,296,839. Amilasas comercialmente disponibles
son Duramyl^{TM}, Termamyl^{TM}, Fungamyl^{TM} y BAN^{TM}
(disponibles de Novo Nordisk A/S) y Rapidase^{TM} y Maxamyl
P^{TM} (disponibles de Genencor).
Las amilasas son normalmente incorporadas en la
composición de detergente a un nivel del 0,00001% al 2% de proteína
enzimática en peso de la composición, preferiblemente a un nivel
del 0,0001% al 1% de proteína enzimática en peso de la composición,
más preferiblemente a un nivel del 0,001% al 0,5% de proteína
enzimática en peso de la composición, incluso más preferiblemente a
un nivel del 0,01% al 0,2% de proteína enzimática en peso de la
composición.
Celulasas: puede ser usada cualquier
celulasa adecuada para el uso en soluciones alcalinas. Celulasas
adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Son
incluidos mutantes química o genéticamente modificados. Celulasas
adecuadas son descritas en US 4,435,307 y WO 91/17244 que describen
celulasas fúngicas producidas a partir de Humicola insolens,
en WO 96/34108 y WO 96/34092 que describen celulasas bacterianas
alcalofílicas (BCE 103) de Bacillus, en WO 91/10732 que
describe una celulasa bacteriana a partir de la cepa de Bacillus
spp., NCIMB 40250 y en WO 94/21801, 5,475,101 y US 5,419,778
que describen por ejemplo celulasas EG III a partir de
Trichoderma. Celulasas especialmente adecuadas son las
celulasas que tienen beneficios en cuanto al cuidado del color.
Ejemplos de celulasas de este tipo son las celulasas descritas en
la solicitud de patente europea nº. 0 495 257. Celulasas
comercialmente disponibles incluyen Celluzyme^{TM} y
Carezyme^{TM} producidas por una cepa de Humicola insolens
(Novo Nordisk A/S), KAC-500(B)^{TM}
(Kao Corporation), y Puradax^{TM} (Genencor Internacional).
Celulasas son normalmente incorporadas en la
composición del detergente a un nivel del 0,00001% al 2% de
proteína enzimática en peso de la composición, preferiblemente a un
nivel del 0,0001% al 1% de proteína enzimática en peso de la
composición, más preferiblemente a un nivel del 0,001% al 0,5% de
proteína enzimática en peso de la composición, incluso más
preferiblemente a un nivel del 0,01% al 0,2% de proteína enzimática
en peso de la composición.
Peroxidasas/oxidasas: las enzimas
peroxidasas son usadas en combinación con peróxido de hidrógeno o
una fuente del mismo (p. ej. un percarbonato, perborato o
persulfato). Las enzimas oxidasas son usadas en combinación con
oxígeno. Ambos tipos de enzimas son usados para "blanquear
soluciones", es decir, para prevenir el paso de un tinte textil
de un tejido teñido a otro tejido cuando dichos tejidos son lavados
juntos en una solución para lavado, preferiblemente junto con un
agente intensificador como se describe en p. ej. WO 94/12621 y WO
95/01426. Peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen aquellas de
origen vegetal, bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes química o
genéticamente modificados.
Las enzimas peroxidasas y/o oxidasas son
normalmente incorporadas en la composición de detergente a un nivel
del 0,00001% al 2% de proteína enzimática en peso de la
composición, preferiblemente a un nivel del 0,0001% al 1% de
proteína enzimática en peso de la composición, más preferiblemente a
un nivel del 0,001% al 0,5% de proteína enzimática en peso de la
composición, incluso más preferiblemente a un nivel del 0,01% al
0,2% de proteína enzimática en peso de la composición.
Mezclas de las enzimas anteriormente mencionadas
están comprendidas aquí, en particular, una mezcla de una proteasa,
una amilasa, una lipasa y/o una celulasa.
La enzima de la invención, o cualquier otra
enzima incorporada en la composición de detergente, es incorporada
normalmente en la composición de detergente a un nivel del 0,00001%
al 2% de proteína enzimática en peso de la composición,
preferiblemente a un nivel del 0,0001% al 1% de proteína enzimática
en peso de la composición, más preferiblemente a un nivel del 0,001%
al 0,5% de proteína enzimática en peso de la composición, incluso
más preferiblemente a un nivel del 0,01% al 0,2% de proteína
enzimática en peso de la composición.
Ingredientes del detergente adicionales
opcionales que pueden ser incluidos en las composiciones del
detergente de la presente invención incluyen blanqueadores tales
como PB1, PB4 y percarbonato con un tamaño de partícula de
400-800 micras. Estos componentes blanqueadores
pueden incluir uno o más blanqueadores de oxígeno y, dependiendo
del blanqueador elegido, uno o más activadores del blanqueamiento.
Cuando están presentes los compuestos blanqueadores de oxígeno,
estarán normalmente presentes a niveles de aproximadamente el 1%
hasta aproximadamente el 25%. En general, los compuestos
blanqueadores son componentes opcionales añadidos en formulaciones
no líquidas, p. ej. detergentes granulosos.
El componente blanqueador para el uso aquí puede
ser cualquier blanqueador útil para las composiciones de detergente
incluyendo blanqueadores de oxígeno al igual que otros conocidos en
la técnica.
El blanqueador adecuado para la presente
invención puede ser un blanqueador activado o no activado.
Una categoría de agente blanqueador oxigenado
que puede ser usado comprende blanqueadores de ácido percarboxílico
y sales derivadas. Ejemplos adecuados de esta clase de agentes
incluyen monoperoxiftalato hexahidrato magnésico, sal magnésica de
ácido perbenzoico de meta-cloro, ácido
4-nonilamino-4-xoperoxibutírico
y ácido diperoxidodecanodioico. Blanqueadores de este tipo son
descritos en US 4,483,781, 740,446, EP 0 133 354 y US 4,412,934.
Blanqueadores altamente preferidos también incluyen ácido
6-nonilamino-6-oxoperoxicaproico
como se describe en US 4,634,551.
Otra categoría de blanqueadores que pueden ser
usados comprenden los agentes blanqueadores halogenados. Ejemplos
de agentes blanqueadores de hipohalita, por ejemplo, incluyen ácido
de tricloro isocianúrico y dicloroisocianuratos de sodio y potasio
y N-cloro y N-bromo alcano
sulfonamidas. Materiales de este tipo son normalmente añadidos al
0,5-10% en peso del producto acabado,
preferiblemente 1-5% en peso.
Los agentes de liberación de peróxido de
hidrógeno pueden ser usados en combinación con activadores del
blanqueamiento tales como
terra-acetiletilenodiamina, (TAED)
nonanoiloxibencenosulfonato (NOBS, descrito en US 4,412,934),
3,5-trimetil-hexsanoloxibencenosulfonato
(ISONOBS, descrito en EP 120 591) o pentaacetilglucosa
(PAG), que son perhidrolizadas para formar un perácido como especies de blanqueamiento activo, conduciendo a efectos blanqueadores mejorados. Además, muy adecuados son los activadores del blanqueamiento C8(6-octanamido-caproil) oxibenceno-sulfonato, C9(6-nonanamido caproil) oxibencenosulfonato y C10 (6-decanamido caproil) oxibencenosulfonato o mezclas derivadas. Activadores también adecuados son ésteres de citrato acilado tales como los descritos en la solicitud de patente europea nº. 91870207.7.
(PAG), que son perhidrolizadas para formar un perácido como especies de blanqueamiento activo, conduciendo a efectos blanqueadores mejorados. Además, muy adecuados son los activadores del blanqueamiento C8(6-octanamido-caproil) oxibenceno-sulfonato, C9(6-nonanamido caproil) oxibencenosulfonato y C10 (6-decanamido caproil) oxibencenosulfonato o mezclas derivadas. Activadores también adecuados son ésteres de citrato acilado tales como los descritos en la solicitud de patente europea nº. 91870207.7.
Blanqueadores útiles, incluyendo peroxiácidos y
sistemas blanqueadores que comprenden activadores del
blanqueamiento y compuestos blanqueadores de peroxígeno para el uso
en composiciones de limpieza según la invención son descritos en la
solicitud US 08/136,626.
El peróxido de hidrógeno puede estar también
presente añadiendo un sistema enzimático (es decir, una enzima y un
sustrato por lo tanto) que sea capaz de la generación de peróxido
de hidrógeno al principio o durante el proceso de lavado y/o
aclarado. Los sistemas enzimáticos de este tipo están descritos en
la solicitud de patente europea EP 0 537 381.
Blanqueadores distintos de los blanqueadores con
oxígeno son también conocidos en la técnica y pueden ser utilizados
aquí. Un tipo de blanqueador sin oxígeno de interés particular
incluye blanqueadores fotoactivados tales como el zinc sulfonatado
y/o ftalocianinas de aluminio. Estos materiales pueden ser
depositados sobre el sustrato durante el proceso de lavado. Sobre la
irradiación con luz, en presencia de oxígeno, tal como colgando la
ropa fuera a la luz diurna, es activada la ftalocianina de zinc
sulfonatada y, consecuentemente, el sustrato es blanqueado. La
ftalocianina de zinc preferida y un proceso de blanqueamiento
fotoactivado están descritos en US 4,033,718. Normalmente, la
composición de detergente contendrá aproximadamente del 0,025%
hasta aproximadamente el 1,25%, en peso, de ftalocianina de zinc
sulfonatada.
Los blanqueadores pueden también comprender un
catalizador de manganeso. El catalizador de manganeso puede, p.
ej., ser uno de los compuestos descritos en "Efficient manganese
catalysts for low-temperature bleaching" Nature
369, 1994, pp. 637 639.
Otro ingrediente opcional es un supresor de
espuma, ejemplificado por siliconas, y mezclas de silicona de
sílice. Las siliconas pueden ser representadas generalmente por
materiales de polisiloxano alquilatado, mientras que el sílice es
usado normalmente en formas finamente divididas ejemplificadas por
aerogeles y xerogeles de sílice y sílices hidrofóbicos de varios
tipos. Estos materiales pueden ser incorporados como fracciones,
donde el supresor de espuma es incorporado ventajosamente de forma
móvil en un portador impermeable de detergente hidrosoluble o
hidrodispersable, sustancialmente no tensoactivo. De forma
alternativa el supresor de espuma puede ser disuelto o disperso en
un portador líquido y aplicado pulverizándolo a uno o más de los
otros componentes.
Un agente controlador de espuma de silicona
preferido se describe en US 3,933,672. Otros supresores de espuma
particularmente útiles son los supresores de espuma de silicona
autoemulsionante, descritos en la solicitud de patente alemana DTOS
2,646,126. Un ejemplo de tal compuesto es DC-544,
comercialmente disponible de Dow Corning, que es un copolímero de
siloxano-glicol. Agente especialmente preferido
para el control de espuma es el sistema supresor de espuma que
comprende una mezcla de aceites de silicona y
2-alquil-alcanoles.
2-alquil-alcanoles adecuados son
2-butil-octanol que están
comercialmente disponibles bajo el nombre comercial Isofol 12 R.
Dichos sistemas supresores de espuma están
descritos en la solicitud de patente europea EP 0 593 841.
Agentes controladores de espuma de silicona
especialmente preferidos están descritos en la solicitud de patente
europea nº. 92201649.8. Dichas composiciones pueden comprender una
mezcla de silicona/sílice en combinación con sílice ahumado no
poroso tal como Aerosil®.
Los supresores de espuma descritos anteriormente
son empleados normalmente a niveles del 0,001% al 2% en peso de la
composición, preferiblemente del 0,01% al 1% en peso.
Pueden ser empleados otros componentes usados en
composiciones de detergente tales como agentes de supensión de
suciedad, agentes de liberación de suciedad, blanqueadores ópticos,
abrasivos, bactericidas, inhibidores de decoloración, agentes
colorantes; y/o perfumes encapsulados o no encapsulados.
Materiales de encapsulación especialmente
adecuados son cápsulas hidrosolubles que consisten en una matriz de
polisacárido y compuestos de polihidroxi tales como los descritos
en GB 1,464,616.
Otros materiales de encapsulación hidrosolubles
adecuados comprenden dextrinas derivadas de ésteres no
gelatinizados de ácido de almidón de ácidos dicarboxílicos
sustituidos tales como los descritos en US 3,455,838. Estas
dextrinas de ácido-éster son, preferiblemente, obtenidas a partir de
almidones de este tipo como maíz céreo, sorgo céreo, sagú, tapioca
y patata. Ejemplos adecuados de dichos materiales de encapsulación
incluyen N-Lok fabricados por National Starch. El
material de encapsulación N-Lok consiste en un
almidón de maíz modificado y glucosa. El almidón es modificado
añadiendo grupos monofuncionales sustituidos tales como anhídrido
de ácido octenil
succínico.
succínico.
Agentes de antirredeposición y de suspensión de
suciedad adecuados aquí incluyen derivados de celulosa, tales como
metilcelulosa, carboximetilcelulosa e hidroxietilcelulosa, y homo-
o co-poliméricos policarboxílicos o sus sales. Los
polímeros de este tipo incluyen los poliacrilatos y copolímeros de
ácido maléico acrílico, previamente mencionados como constructores,
al igual que copolímeros de anhídrido maléico con etileno,
metilvinil éter o ácido metacrílico, constituyendo el anhídrido
maléico al menos 20 moles en porcentaje del copolímero. Estos
materiales son normalmente usados a niveles del 0,5% al 10% en peso,
más preferiblemente del 0,75% al 8%, de la forma más preferible del
1% al 6% en peso de la composición.
Los abrillantadores ópticos preferidos son
aniónicos en carácter, cuyos ejemplos son disodio
4,4'-bis-(2-dietanolamino-4-anilino-s-triazina-6-ilamino)estilbeno-2:2'-disulfonato,
disodio
4,4'-bis-(2-morfolino-4-anilino-s-triazin-6-ilamino-estilbeno-2:2'-disulfonato,
disodio
4,4'-bis-(2,4-dianilino-s-triazin-6-ilamino)estilbeno-2:2'-disulfonato,
monosodio
4',4''-bis-(2,4-dianilino-s-triazin-6-ilamino)estilbeno-2-sulfonato,
disodio
4,4'-bis-2-anilino-4-(N-metil-N-2-hidroxietilamino)-s-triazina-6-ilamino)estilbeno-2,2'-disulfonato,
di-sodio
4,4'–bis-(4-fenil-2,1,3-triazol-2-il)-estilbeno-2,2'-disulfonato,
di-sodio
4,4'bis-(2-anilino-4-(1-metil-2-hidroxietilamino)-s-triazina-6-ilamino)estilbeno-2,2'-disulfonato,
sodio
2(estilbil-4''-(nafto-1',2':4,5)-1,2,3,-triazol-2''-sulfonato
y
4,4'-bis(2-sulfostiril)bifenil.
Otros materiales poliméricos útiles son los
politileno glicoles, particularmente aquellos de peso molecular
1000-10000, más particularmente 2000 a 8000 y de la
forma más preferible aproximadamente 4000. Estos son usados a
niveles del 0,20% al 5% más preferiblemente del 0,25% al 2,5% en
peso. Estos polímeros y las sales previamente mencionadas homo- o
co-poliméricas de poli-carboxilato
son valiosas para mejorar el mantenimiento de la blancura,
deposición de ceniza en el tejido, y los resultados de limpieza de
manchas de arcillas, proteínicas y oxidables en presencia de
impurezas de metales de transición.
Agentes de liberación de suciedad útiles en
composiciones de la presente invención son normalmente copolímeros
o terpolímeros de ácido tereftálico con unidades de etilenglicol
y/o propilenoglicol en varios dispositivos. Ejemplos de polímeros
de este tipo están descritos en US 4,116,885 y 4,711,730 y EP 0 272
033. Un polímero particular preferido conforme a EP 0 272 033 tiene
la fórmula:
(CH_{3}(PEG)_{43})_{0
. 75}(POH)_{0 . 25}[T-Po)_{2\cdot 8}
(T \ PEG)_{0 . 4}]T(POH)_{0 .
25}((PEG)_{43}CH_{3})_{0 .
75}
donde PEG es -(OC_{2}H_{4}) 0-,
PO es (OC_{3}H_{6}O) y T es
(pOOC_{6}H_{4}CO).
\vskip1.000000\baselineskip
También son muy útiles los poliésteres
modificados como copolímeros aleatorios de dimetil tereftalato,
dimetil sulfoisoftalato, etilenglicol y
1,2-propanodiol, consistiendo los grupos finales
principalmente en sulfobenzoato y secundariamente en monoésteres de
etilenglicol y/o 1,2-propanodiol. El objetivo es
obtener un polímero cubierto en ambos extremos por grupos de
sulfobenzoato, "principalmente", en el contexto presente
siendo la mayor parte de dichos copolímeros cubiertos en los
extremos por grupos de sulfobenzoato. No obstante, algunos
copolímeros estarán cubiertos menos que completamente, y en
consecuencia sus grupos terminales pueden consistir en monoéster de
etilenglicol y/o 1,2-propanodiol, de los que
consisten "secundariamente" en especies de este tipo.
Los poliésteres seleccionados aquí contienen
aproximadamente el 46% en peso de ácido dimetil tereftálico,
aproximadamente el 16% en peso de 1,2-propanodiol,
aproximadamente el 10% en peso de etilenglicol, aproximadamente el
13% en peso de ácido dimetil sulfobenzoico y aproximadamente el 15%
en peso de ácido sulfoisoftálico, y tienen un peso molecular de
aproximadamente 3.000. Los poliésteres y su método de preparación
están descritos con detalle en EP 311 342.
Agentes suavizantes de tejidos pueden ser
incorporados también a las composiciones de detergente para lavado
de la ropa conforme a la presente invención. Estos agentes pueden
ser inorgánicos u orgánicos en tipo. Agentes suavizantes
inorgánicos son ejemplificados por las arcillas de esmectita
descritas en GB-A-1 400898 y en US
5,019,292. Agentes suavizantes de tejidos orgánicos incluyen las
aminas terciarias insolubles en agua como se describen en
GB-A1 514 276 y EP 0 011 340 y su combinación con
sales mono C_{12}-C_{14} cuaternarias amónicas
están descritas en EP-B-0 026 528 y
amidas de cadena larga como se describen en EP 0 242 919. Otros
ingredientes orgánicos útiles de sistemas suavizantes de tejidos
incluyen materiales de óxido de polietileno de peso molecular alto
como se describen en EP 0 299 575 y 0 313 146.
\newpage
Los niveles de arcilla de esmectita están
normalmente en la gama del 5% al 15%, más preferiblemente del 8% al
12% en peso, siendo añadido el material como un componente seco
mezclado al resto de la formulación. Los agentes suavizantes
orgánicos de tejidos tales como las aminas terciarias insolubles en
agua o materiales de amida de cadena larga son incorporados a
niveles del 0,5% al 5% en peso, normalmente del 1% al 3% en peso
mientras que los materiales de óxido de polietileno de peso
molecular elevado y los materiales catiónicos hidrosolubles son
agregados a niveles del 0,1% al 2%, normalmente del 0,15% al 1,5%
en peso. Estos materiales son añadidos normalmente a la parte seca
de la pulverización de la composición, aunque en algunos ejemplos
puede ser más conveniente añadirlos como un particulado seco
mezclado, o pulverizarlos como líquido fundido sobre los otros
componentes sólidos de la composición.
Las composiciones de detergente según la
presente invención pueden también comprender del 0,001% al 10%,
preferiblemente del 0,01% al 2%, más preferiblemente del 0,05% al
1% en peso de agentes poliméricos inhibidores de la transferencia
del color. Dichos agentes poliméricos inhibidores de la
transferencia del color son incorporados normalmente a las
composiciones de detergentes para inhibir la transferencia de
colores desde los tejidos teñidos a los tejidos lavados con éstas.
Estos polímeros tienen la capacidad de complexar o absorber los
colores fugaces sacados de los tejidos teñidos antes de que los
colores tengan la oportunidad de adherirse a otros artículos en el
lavado.
Agentes poliméricos que inhiben la transferencia
del color especialmente adecuados son polímeros de poliamina
N-óxido, copolímeros de N-vinilpirrolidona y
N-vinilimidazol, polímeros de polivinilpirrolidona,
poliviniloxazolidonas y polivinilimidazoles o mezclas
derivadas.
La adición de tales polímeros también aumenta el
rendimiento de las enzimas según la invención.
La composición de detergente según la invención
puede ser en forma líquida, pasta, geles, barras o granulosa.
Los granulados no pulverulentos pueden ser
producidos, p. ej., como se describe en US 4,106,991 y 4,661,452
(ambos para Novo Industri A/S) y pueden opcionalmente ser
revestidos por métodos conocidos en la técnica. Ejemplos de
materiales de revestimiento ceroso son productos de
poli(etileno óxido) (polietilenglicol, PEG) con pesos
moleculares medios de 1000 a 20000; nonilfenoles etoxilados que
tienen de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes
etoxilados grasos donde el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de
carbono y en el cual hay 15 a 80 unidades de óxido de etileno;
alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono- y di- y triglicéridos de
ácidos grasos. Ejemplos de materiales de revestimiento que forman
películas adecuadas para la aplicación por técnicas de lecho
fluidificado están provistos en GB 1483591.
Composiciones granulosas según la presente
invención pueden también estar en "forma compacta", es decir
éstas pueden tener una densidad relativamente más alta que los
detergentes granulosos convencionales, es decir formar 550 a 950
g/l; en este caso, las composiciones de detergentes granulosas
según la presente invención contienen una cantidad inferior de
"sal inorgánica de relleno", en comparación con detergentes
granulosos convencionales; sales de relleno típicas son sales de
metal alcalinotérreo de sulfatos y cloruros, normalmente sulfato de
sodio; detergente "Compacto" no comprende normalmente más del
10% de sal de relleno. Las composiciones líquidas según la presente
invención pueden también estar en "forma concentrada", en este
caso, las composiciones de detergente líquido según la presente
invención contienen una cantidad inferior de agua, en comparación
con detergentes líquidos convencionales. Normalmente, el contenido
de agua del detergente líquido concentrado es inferior al 30%, más
preferiblemente inferior al 20%, de la forma más preferible
inferior al 10% en peso de las composiciones de detergentes.
Las composiciones de la invención pueden por
ejemplo, ser formuladas como composiciones de detergente para el
lavado de la ropa a mano o a máquina incluyendo composiciones de
aditivos de lavandería y composiciones adecuadas para el uso en el
pretratamiento de tejidos teñidos, composiciones de suavizante de
tejidos añadidas al enjuague, y composiciones para el uso en
operaciones de limpieza doméstica en general de superficies duras y
operaciones de lavado de la vajilla.
Los ejemplos siguientes pretenden ejemplificar
composiciones para la presente invención, pero no pretenden
necesariamente limitar o por el contrario definir el ámbito de la
invención. En las composiciones de detergentes, las
identificaciones de componente abreviadas tienen los significados
siguientes:
- LAS:
- C_{12} alquil benceno sulfonato lineal de sodio.
- TAS:
- Alquil sulfato sódico de sebo
- XYAS:
- C_{1x}-C_{1y} alquil sulfato sódico
- SS:
- Agente tensoactivo de jabón secundario de fórmula ácido 2-butil octanoico
- 25EY:
- Un alcohol primario C_{12}-C_{15} predominantemente lineal condensado con un promedio de Y moles de óxido de etileno
- 45EY:
- Un alcohol primario C_{14}-C_{15} predominantemente lineal condensado con un promedio de Y moles de óxido de etileno
- XYEZS:
- C_{1x}-C_{1y} alquil sulfato sódico condensado con un promedio de Z Moles de óxido de etileno por mol
- No iónico:
- Alcohol graso C_{13}-C_{15} mezclado etoxilado/propoxilado con un grado promedio de etoxilación de 3.8 y un grado promedio de propoxilación de 4.5 vendido bajo el nombre comercial Plurafax LF404 por BASF Gmbh
- TFAA:
- C_{12}-C_{14} alquil N-metil glucamida
- TFAA:
- C_{16}-C_{18} alquil N-metil glucamida
- Silicato:
- Silicato sódico amorfo (SiO_{2}: Na_{2}O proporción = 2.0)
- NaSKS-6:
- Silicato estratificado cristalino de fórmula d-Na_{2}Si_{2}O_{5}
- Carbonato:
- Carbonato sódico anhidro
- Fosfato:
- Tripolifosfato de sodio
- MA/AA:
- Copolímero de 1:4 ácido maléico/acrílico, peso molecular promedio aproximadamente 80.000
- Poliacrilato:
- Homopolímero de poliacrilato con un peso molecular promedio de 8.000 vendido bajo el nombre comercial PA30 por BASF Gmbh
- Zeolita A:
- Aluminosilicato de sodio hidratado de fórmula Na_{12} (AlO_{2}SiO_{2})_{12}.27H_{2}O que tiene un tamaño de partícula primario en la gama de 1 a 10 micrómetros
- Citrato:
- Citrato dihidrato trisódico
- Cítrico:
- Ácido cítrico
- Perborato:
- Lejía de perborato sódico anhidro monohidrato, fórmula empírica NaBO_{2}.H_{2}O_{2}
- PB4:
- Perborato sódico anhidro tetrahidrato
- Percarbonato:
- Lejía de percarbonato de sodio anhidro de fórmula empírica 2Na_{2}CO_{3}.3H_{3}O_{2}
- TAED:
- Tetraacetil etilendiamina
- CMC:
- Carboximetilcelulosa de sodio
- DETPMP:
- Dietilentriamina penta (ácido metileno fosfónico), comercializado por Monsanto bajo el nombre comercial Dequest 2060
- PVP:
- Polímero de polivinilpirrolidona
- EDDS:
- ácido etilendiamina-N,N'-disuccínico, [S,S] isómero en forma del supresor de espuma de sal sódica: 25% cera de parafina p.f. 50ºC, 17% sílice hidrofóbico, 58% aceite de parafina
- supresor de espuma granuloso:
- 12% Silicona/sílice, 18% alcohol estearílico, 70% de almidón en Sulfato en forma granulosa: sulfato de sodio anhidro
- HMWPEO:
- óxido de polietileno de peso molecular alto
- TAE 25:
- Alcohol de sebo etoxilado (25)
\newpage
Una composición granulosa para la limpieza de
tejidos conforme a la invención puede ser preparada como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
Una composición granulosa compacta para la
limpieza de tejidos (densidad 800 g/l) según la invención puede ser
preparada como sigue:
Composiciones granulosas para la limpieza de
tejidos conforme a la invención que son especialmente útiles en el
lavado de tejidos de color fueron preparadas como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Composiciones granulosas para la limpieza de
tejidos conforme a la invención que proporcionan capacidad de
"suavizar mediante el lavado" pueden ser preparadas como
sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Composiciones líquidas para la limpieza de
tejidos de gran resistencia conforme a la invención pueden ser
preparadas como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Además de lo anteriormente mencionado sobre el
xiloglucano debe ser observado que el xiloglucano de semillas
tamarindas suministrado por Megazyme, Irlanda tiene una estructura
ramificada compleja con glucosa, xilosa galactosa y arabinosa en la
proporción de 45:36:16:3. Por consiguiente, se cree fuertemente que
una enzima que muestra actividad catalítica en este xiloglucano
también tiene actividad catalítica en otras estructuras de
xiloglucano de distintas fuentes (angiospermas o gimnospermas).
El xiloglucano del cultivo en suspensión de
algodón PM 100,000 kDa fue obtenido por el Profesor A. Mort de la
Universidad del Estado de Oklahoma. 1H RMN (D20, 80ºC) de
xiloglucanos fue usado para comparar la composición monosacárida de
muestras de diferente origen. Las integrales de las señales
anoméricas de la muestra comercial concuerdan completamente con la
composición dada por Megazyme. No obstante, el xiloglucano de
algodón parece tener una estructura diferente. Aquí parece haber
mucha menos galactosa y aproximadamente la mitad de residuos de
galactosa son fucosilados. Además, la proporción molar entre xilosa
y glucosa es más pequeña (0,63 en comparación con 0,77 para el
tamarindo), que sugiere una estructura más abierta de xiloglucano
de algodón. Estas conclusiones concuerdan con los resultados
obtenidos con xiloglucano de células de algodón (Buchala et
al, Acta Bot. Neerl. 42, 1993, 213-219).
- a No puedo ser detectado en RMN
\vskip1.000000\baselineskip
Paenibacillus polymyxa, p. ej.
Paenibacillus polymyxa, ATCC 832, y Paenibacillus
sp., DSM 13329, comprenden una secuencia de ADN que codifica
una xiloglucanasa de la invención.
Huéspedes de E. coli: cepas de E.
coli XLI-Blue MRF^{-} y XLOLR fueron
proporcionadas por Stratagene Inc. (EEUU) y usados según las
instrucciones del fabricante.
B. subtilis PL1885. (Diderichsen et
al., (1990)).
B. subtilis PL1801. Esta cepa es la
DN1885 de B. subtilis donde las dos proteasas más
importantes han sido inactivadas (Diderichsen et Al.,
(1990)).
Células competentes fueron preparadas y
transformadas como se describe por Yasbin et al. (1975).
\vskip1.000000\baselineskip
pBK CaMV: Stratagene Inc. La Jolla CA.,
EEUU.
Bacteriófago ZAP Express: Stratagene Inc. La
Jolla CA., EEUU.
pMOL944. Este plásmido es un derivado de pUB110
esencialmente conteniendo elementos que hacen al plásmido
propagable en Bacillus subtilis, gen de resistencia a la
kanamicina y con un promotor fuerte y péptido señal clonado del gen
amyL de B. licheniformis ATCC 14580. El péptido señal
contiene un sitio SacII haciéndolo conveniente para clonar el ADN
que codifica la parte madura de una proteína
en-fusión con el péptido señal. Esto resulta en la
expresión de una Preproteína, que es dirigida hacia el exterior de
la célula.
El plásmido fue construido mediante ingeniería
genética común y está brevemente descrito a continuación.
El plásmido pUB110 (McKenzie, T. et al.,
1986) fue digerido con la única enzima de restricción Ncil. Un
fragmento de PCR amplificado del promotor amyL codificado en el
plásmido pDN1981 (Jørgensen et Al., 1990) fue digerido con
NciI e insertado en el pUB110 digerido por NciI para dar el
plásmido pSJ2624.
Los dos cebadores de la PCR usados tienen las
secuencias siguientes:
El cebador #LWN5494 inserta un sitio NotI en el
plásmido.
El plásmido pSJ2624 fue luego digerido con SacI
y NotI y un fragmento de PCR nuevo amplificado en promotor amyL
codificado en el pDN1981 fue digerido con SacI y NotI y este
fragmento de ADN fue insertado en el pSJ2624 digerido con
SacI-NotI para dar el plásmido pSJ2670.
Esta clonación reemplaza la primera clonación
del promotor amyL con el mismo promotor pero en la dirección
opuesta. Los dos cebadores usados para amplificación de PCR tienen
las secuencias siguientes:
El plásmido pSJ2670 fue digerido con las enzimas
de restricción PstI y BclI y un fragmento amplificado por PCR de
una secuencia de ADN clonada que codifica la amilasa alcalina SP722
(solicitud de patente Internacional publicada como WO95/26397 que
está incorporada en la presente por referencia) fue digerida con
PstI y BclI e insertada para dar el plásmido pMOL944. Los dos
cebadores usados para la amplificación de PCR tienen la secuencia
siguiente:
El cebador #LWN7901 inserta un sitio Sacll en el
plásmido. pPL3143: este plásmido es un derivado pMol944 donde un
terminador ha sido insertado entre el sitio SaclI y NotI en
pMOL944. Al mismo tiempo ha sido insertado un sitio de restricción
nuevo para clonar AscI.
El plásmido fue construido mediante ingeniería
genética común y está brevemente descrito a continuación.
Construcción de pPL3143: el plásmido pMOL944 fue
digerido, con SacII y NotI. Un fragmento de PCR que generaba un
terminador fue hecho usando los dos cebadores catalogados abajo y
el plásmido pMOL944 como molde. Este fragmento fue digerido con
EagI y SacII e insertado entre el sitio SacII y NotI en PMOL944
para crear el plásmido pPL3143.
TY (como se describe en Ausubel, F. M. et
al. 1995).
LB agar (como se describe en Ausubel, F.
M. et al, 1995).
LBPG es LB agar suplementado con 0,5%
glucosa y 0,05 M de fosfato potásico, pH 7.0
AZCL-Xiloglucano se añade
a LBPG-agar al 0,5%.
AZCL-Xiloglucano es de Megazyme, Irlanda.
Medios BPX están descritos en EP 0 506
780 (WO 91/09129).
NZY agar (por litro) 5 g de NaCl, 2 g de
MgSO4, 5 g de extracto de levadura, 10 g de NZ amina (hidrolizado
de caseína), 15 g de agar; añadir agua desionizada hasta 1 litro,
ajustar pH con NaOH hasta pH 7.5 y autoclave
Caldo NZY (por litro) 5 g de NaCl, 2 g de
MgSO4, 5 g de extracto de levadura, 10 g de NZ amina (hidrolizado
de caseína); añadir agua desionizada hasta 1 litro, ajustar pH con
NaOH hasta pH 7.5 y autoclave
NZY Top agar (por litro) 5 g de NaCl, 2 g
de MgSO4 5 g de extracto de levadura, 10 g de NZ amina (hidrolizado
de caseína), 0,7% (p/v) agarosa; añadir agua desionizada hasta 1
litro, ajustar pH con NaOH hasta pH 7.5 y autoclave.
La actividad de xiloglucanasa es medida usando
AZCL-xiloglucano de Megazyme, Irlanda,
(http://www.
megazyme.com/purchase/index.html) como sustrato.
megazyme.com/purchase/index.html) como sustrato.
Una solución del 0,2% del sustrato azul es
suspendida en un 0,1 M de tampón fosfato pH 7.5 bajo agitación. La
solución es distribuida bajo agitación a 1,5 ml de tubos Eppendorf
(0,75 ml para cada uno), se añaden 50 \mul de solución enzimática
y éstas son incubadas en un termomezciador Eppendorp modelo 5436
durante 20 minutos a 40ºC con una mezcla de 1200 r.p.m. Tras la
incubación la solución coloreada es separada del sólido por
centrifugación de 4 minutos a 14.000 r.p.m. y la absorbencia del
sobrenadante es medida a 600 nm.
Una unidad XyloU es definida como la cantidad de
enzima dando como resultado una absorbencia de 0.24 en una cubeta
de 1 cm a 600 nm.
Manipulaciones de ADN y transformaciones fueron
realizadas usando métodos estándares de biología molecular
(Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory
manual, Cold Spring Harbor lab. Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F.
M. et al. (eds.) "Current protocols in Molecular
Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., and
Cutting, S. M. (eds.) "Molecular Biological Methods for
Bacillus". John Wiley and Sons, 1990).
Enzimas para manipulaciones de ADN fueron usadas
según las especificaciones de los proveedores.
Los ejemplos siguientes ilustran la
invención.
Cepas de Paenibacillus polymyxa, incluida
Paenibacillus polymyxa, ATCC 842, y la cepa
Paenibacillus sp., DSM 13329, respectivamente, fueron
propagadas en medio TY líquido. Después de 16 horas de incubación a
30ºC y 300 r.p.m., las células fueron cosechadas, y ADN genómico
aislado por el método descrito por Pitcher et al.
(1989).
Bibliotecas de Lambda ZAP fueron preparadas a
partir de ADN genómico de las cepas Paenibacillus polymyxa,
Paenibacillus polymyxa, ATCC 842, Paenibacillus sp., DSM
13329. El kit de clonación ZAP Express usado fue digerido con BamHI
y brazos desfosforilados de Stratagene. El ADN aislado fue
parcialmente digerido con Sau3A y el tamaño fraccionado en un gel de
agarosa al 1%. ADN fue cortado del gel de agarosa entre 3 y 10 kb y
purificado usando el procedimiento de purificación de fragmentos de
ADN Qiaspin (Qiagen Gmbh). 100 ng de ADN purificado, fraccionado
fue ligado con 1 \mug de brazos de vector ZAPexpress
desfosforilados con BamHI (4 grados durante toda la noche). La
reacción de ligadura fue envasada directamente con GigaPackIII Gold
según las instrucciones del fabricante (Stratagene). Bibliotecas
fágicas fueron concentradas con XLlblue MRF^{-} (Stratagene).
Aproximadamente 10.000 unidades formadoras de
placas (Pfu) de la biblioteca genómica fueron colocadas en placas
de NZY-agar conteniendo 0,1% de
AZCL-xiloglucano, (Megazyme, Irlanda), usando E.
coli XL1-Blue MRF' (Stratagene, EEUU) como un
huésped, seguido de la incubación de las placas a 37ºC durante 24
horas. Clones lambda xiloglucanasa positivos fueron identificados
por la formación de halos de hidrólisis azules alrededor de los
clones de fagos positivos. Estos fueron recuperados de las placas
de selección por solidificación de las rebanadas de
TOP-agar que contienen las placas de interés en 500
\mul de tampón SM y 20 \mul de cloroformo. Los clones
lambdaZAPExpress positivos de xiloglucanasa fueron purificados de
las placas colocando en placas una alícuota de la reserva
solidificada del fago en placas de NZY conteniendo el 0,1% de
AZCL-xiloglucano como arriba. Clones lambda únicos
de xiloglucanasa positivos fueron solidificados en 500 \mul de
tampón SM y 20 \mul de cloroformo, y purificados por otra ronda
en placa como se ha descrito anteriormente.
Células XL1-Blue de E.
coli (Stratagene, la Jolla Ca.) fueron preparadas y
resuspendidas en 10 mM de MgSO_{4} según está recomendado por
Stratagene (La Jolla, EEUU). Partes alícuotas de 250 \mul de las
reservas de fago puro de los clones positivo de xiloglucanasas
fueron combinadas en tubos Falcon 2059 con 200 \mul de células
XL1-Blue MRF' (OD600=1.0) y >10^{6} Pfu/ml del
ExAssist M13 fago auxiliar (Stratagene), y las mezclas fueron
incubadas a 37ºC durante 15 minutos. 3 ml de caldo NZY fueron
añadidos a cada tubo y los tubos fueron incubados a 37ºC durante
2.5 horas. Los tubos fueron calentados a 65ºC durante 20 minutos
para matar las células de E. coli y el bacteriófago lambda;
los fagémidos siendo resistentes al calentamiento. Los tubos fueron
centrifugados a 3000 r.p.m. durante 15 minutos para eliminar el
detrito celular y los sobrenadantes fueron decantados en tubos
Halcon 2059 limpios. Partes alícuotas de los sobrenadantes que
contenían los fagémidos cortados monocatenarios fueron usados para
infectar 200 \mul de células XLOLR de E. coli (Stratagene,
OD600=1.0 en 10 mM MgSO4) por incubación a 37ºC durante 15 minutos.
350 \mul de Caldo NZY fue añadido a las células y los tubos
fueron incubados durante 45 min a 37ºC. Partes alícuotas de las
células fueron colocadas en placas de LB agar con kanamicina e
incubadas durante 24 horas a 37ºC. Cinco colonias individuales
cortadas fueron realineadas sobre placas de LB agar con kanamicina
conteniendo 0.1% de xiloglucano de AZCL, (MegaZyme, Australia). Los
clones fagémidos positivos en xiloglucanasa fueron caracterizados
por la formación de halos de hidrólisis azules alrededor de las
colonias positivas. Estos fueron adicionalmente analizados por
digestiones de enzimas de restricción del ADN del fagémido aislado
(QiaSpin kit, Qiagen EEUU) con EcoRI, pstI,
EcoRI-PstI, y HindIII seguido de electroforesis en
gel de agarosa.
La secuencia de nucleótidos de los clones de
xiloglucanasa genómica fueron determinados de ambas cadenas por el
método didesoxi o de terminación en cadena (Sanger et al.
(1977)) usando 500 ng de molde purificado con Qiaspin, (Qiagen
EEUU), el equipo de secuenciación en ciclos Taq
desoxi-terminal (Perkin-Elmer,
EEUU), terminadores fluorescentes marcados y 5 pmol de sea
pBK-CMV cebadores poliligadores (Stratagene, EEUU)
o sea cebadores oligonucleótidos sintéticos adaptados. El
ensamblaje de secuencias de ADN fue realizado con el paquete DNA
Star (www.DNASTAR.com).
\vskip1.000000\baselineskip
Para expresar la parte del núcleo de la enzima
xiloglucanasa de XYG1006 multidominio, se siguió el siguiente
esquema de clonación por PCR. Esta clonación hace una fusión
traduccional entre el péptido señal de amilasa en pPL3143 y la
parte madura de la enzima de XYG1006 multidominio. Al mismo tiempo
crea un codón de detención traduccional artificial correspondiente
al número de aminoácido 560 en el gen XYG1006 multidominio.
La secuencia de ADN codificante de XYG1006 fue
amplificada por PCR usando el conjunto de cebador de PCR que
consiste en estos dos oligonucleótidos:
Los sitios de restricción PstI y AscI están
subrayados.
El ADN plásmido de pXYG1006 de B. coli,
DSM 13321, fue usado como molde en una reacción de PCR usando
Amplitaq DNA-polimerasa (Perkin Elmer) según las
instrucciones del fabricante. La reacción de PCR fue ajustada en un
tampón para PCR (10 mM de tris-HCl, pH 8.3, 50 mM de
KCl, 1,5' mM de MgCl_{2}, 0,01% (p/v) gelatina) conteniendo 200
\muM de cada dNTP, 2,5 unidades de Amplitaq polimerasa
(Perkin-Elmer, Cetus, EEUU) y 100 pmol de cada
cebador.
La reacción de PCR fue realizada usando un
variador térmico de ADN (Landgraf, Alemania). Una incubación a 94ºC
durante 1 min seguida de treinta ciclos de PCR realizada usando un
perfil de ciclo de desnaturalización a 94ºC durante 30 seg,
anillamiento a 60ºC durante 1 min, y extensión a 72ºC durante 2
min. Partes alícuotas de cinco-\mul del producto
de amplificación fueron analizadas por electroforesis en 0,7% de
geles de agarosa (NuSieve, FMC). La apariencia de un tamaño de
fragmento de ADN de 1,6 kb indicó una amplificación apropiada del
segmento de gen.
Partes alícuotas de cuarenta y cinco \mul de
los productos PCR generados como se ha descrito anteriormente
fueron purificados usando el kit de purificación por PCR QIAquick,
(Qiagen EEUU) según las instrucciones del fabricante. El ADN
purificado fue eluido en 50 \mul de 10 mM de
Tris-HCl, pH 8.5.
5 \mug de pPL3143 y
veinticinco-\mul del fragmento de PCR purificado
fue digerido con PstI y AscI, sometido a electroforesis en 0,8% de
geles de agarosa de temperatura de gelificación baja (SeaPlaque,
gTG FMC), los fragmentos pertinentes fueron cortados de los geles,
y purificados usando el kit de extracción en gel QIAquick.(Qiagen,
EEUU) según las instrucciones del fabricante. El fragmento aislado
de ADN de PCR fue después ligado al pPL3143 digerido y purificado
con PstI-AscI. La ligadura fue realizada durante
toda la noche a 16ºC usando 0,5 \mug de cada fragmento de ADN, 1
U de T4 ADN-ligasa y tampón T4 ligasa (Boehringer
Mannheim, Alemania).
La mezcla de ligadura fue usada para transformar
células PL1801 competentes de B. subtilis. Las células
transformadas fueron colocadas sobre placas de LBPG agar
conteniendo 10 \mug/ml de kanamicina y 0,2% de
AZCL-Xiloglucano (Megazyme). Después de 18 horas de
incubación a 37ºC se vieron colonias en las placas. Diferentes
clones que muestran un halo azul alrededor de la colonia fueron
analizados aislando ADN plásmido del caldo de cultivo durante toda
la noche.
\global\parskip0.930000\baselineskip
Tal clon positivo fue realineado varias veces en
placas con agar como se ha usado arriba, este clon fue llamado
PL3344. El clon PL3344 fue crecido durante toda la noche en
TY-10 \mug/ml de kanamicina a 37ºC. Al día
siguiente, 1 ml de células fueron usadas para aislar el plásmido de
las células usando el Qiaprep Spin Plasmid Miniprep Kit #27106
según las recomendaciones del fabricante para preparaciones del
plásmido de B. subtilis. Este ADN fue ADN secuenciado y
reveló la secuencia de ADN correspondiente a la parte madura del
dominio de codificación de xiloglucanasa de Paenibacillus
polymyxa correctamente insertado en el vector de clonación
pPL3143 (Dominio 1-1680 de la SEC ID Nº: 1. La cepa
PL3344 de Bacillus subtilis está por lo tanto conteniendo un
plásmido que permite la expresión del dominio de xiloglucanasa del
gen XYG1006 multidominio. El producto de la traducción es por lo
tanto el aminoácido número 1 a 559(SEC ID Nº: 2) que después
del seccionamiento del péptido señal está previsto que sea
segregado de B. subtilis como una proteína que se extiende
desde el aminoácido 36 a 559(SEC ID Nº: 2).
PL3344 fue crecido en 25 x 200 ml de medios BPX
con 10 \mug/ml de kanamicina en dos 500 ml de frascos de
agitación con deflección durante 5 días a 37ºC a 300 r.p.m.
\vskip1.000000\baselineskip
El clon XYG1006 obtenido como se describe en el
ejemplo 2 (PL3344 expresado en B. Subtilis) fue incubado en
4500 ml de PS-1 conteniendo mg/ml kanamicina de
frascos de agitación con un pH final de 5.5.
El medio de fermentación fue floculado usando
agente de floculación catiónico C521 (10% solución) y 0,1% solución
de agente aniónico A130: a 4500 ml de caldo, 200 ml de C521 fue
añadida (10%) simultáneamente con 400 ml de A130 (0,1%) bajo
agitación constante a la temperatura ambiente. El material
floculado fue separado por centrifugado usando un centrifugador
Sorval RC 3B a 4.500 r.p.m. durante 30 minutos. El sobrenadante fue
ajustado a pH 7.0 usando hidróxido sódico y luego tratado de forma
discontinua con 300 g de HPQ Sepharose equilibrada con 50 mM de tris
pH 7.0, y el material no unido fue esterilizado por filtro a través
de un filtro de 0,7 \mum.
El líquido fue concentrado en 550 ml usando
ultrafiltración por filtron con un corte de PM de 10 kDa. El
concentrado fue después diluido a 900 ml y pasado sobre una columna
de S-Sepharose equilibrada con 25 mM de acetato
sódico pH 5.0, y el material no unido fue concentrado a 390 ml.
Para obtener una enzima pura se aplicó 2 ml de
esta enzima parcial pura a una columna de cromatografía por tamaños
(Superdex 75) equilibrada con 0,1 M de acetato sódico pH 6.0. La
xiloglucanasa eluida como un único pico con un PM de 58 kDa en
SDS-PAGE y con una actividad específica de 255
unidades XyloU por mg de proteína.
La xiloglucanasa clonada de la invención fue
usada para desarrollar antisuero de conejo.
Después de la electrotransferencia de esta banda
el N-terminal fue determinado como:
TAKTITIKVDTFKDRK
\vskip1.000000\baselineskip
Esto está conforme con la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 2 deducida de la secuencia de
ADN mostrada en la SEC ID NO: 1 con una secuencia pro de 40
aminoácidos. El PM calculado de la secuencia deducida fue 58 kDa y
el pl calculado fue 5,7. El coeficiente de extinción molar a 280 nm
fue 105.640.
La enzima se derritió en el DSC (calorímetro de
barrido diferencial) a 61,8ºC a pH 6.0.
La xiloglucanasa mostró actividad óptima a 50ºC
a pH 7.5 usando el ensayo de xilounidades (XyloU) a temperaturas
diferentes.
La xiloglucanasa fue activa en más del 30% entre
pH 5.0 y 8.0.
Se realizaron determinaciones cinéticas usando
xiloglucano de goma tamarinda soluble a pH 7.5 y a 40ºC, tiempo de
incubación de 20 minutos y medición de la formación de extremos de
reducción. Se determinó el kcat de 220 por seg. El kM fue 0.2 g/l.
Los valores cinéticos de Michaelis-Menten podrían
ser determinados.
\vskip1.000000\baselineskip
La xiloglucanasa caracterizada en el Ejemplo 3
fue completamente estable entre pH 5 y 10 a la temperatura
ambiente, y tuvo una vida media superior a 50 días cuando se incubó
en un detergente líquido americano completo formulado como US Tide
a 30ºC. La xiloglucanasa fue completamente activa en el detergente
líquido americano comercial de marca Tide líquido y en el detergente
líquido comercial europeo de marca Ariel líquido, usando 20 min. de
incubación a 40ºC.
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del lector. No forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u
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\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> NOVO NORDISK A/S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> XILOGLUCANASAS DE LA FAMILIA 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 10017
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4059
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paenibacillus polymyxa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1352
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paenibacillus polymyxa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4056
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paenibacillus polymyxa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1350
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paenibacillus polymyxa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2141
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paenibacillus pabuli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 695
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paenibacillus pabuli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (18)
1. Xiloglucanasa de la familia 44, que es
seleccionada de uno de
(a) un polipéptido codificado por la secuencia
de ADN de las posiciones 121-1677 de la SEC ID Nº:
1;
(b) un polipéptido producido por cultivo de una
célula que comprende la secuencia de la SEC ID Nº: 1 bajo
condiciones donde la secuencia de ADN es expresada;
(c) una enzima de xiloglucanasa que tiene una
secuencia de al menos el 70% de identidad a las posiciones
40-559 de la SEC ID Nº: 2 cuando la identidad es
determinada por GAP proporcionado en el paquete del programa GCG
usando una penalización por creación de GAP de 3.0 y penalización
por extensión de GAP de 0.1;
(d) un polipéptido codificado por una secuencia
de ADN que se hibridiza a la secuencia de ADN de la SEC ID Nº: 1
bajo condiciones de astringencia media, donde las condiciones de
astringencia media comprenden hibridación en 5xSSC a 45ºC y lavado
en 2xSSC a 60ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Xiloglucanasa según la reivindicación 1 que
es obtenida a partir de una cepa de Paenibacillus Polymyxa,
ATCC 832.
3. Xiloglucanasa de la familia 44, que es
seleccionada de uno de
(a) un polipéptido codificado por la secuencia
de ADN de las posiciones 121-1677 de la SEC ID Nº:
3;
(b) un polipéptido producido por cultivo de una
célula que comprende la secuencia de la SEC ID Nº: 3 bajo
condiciones donde la secuencia de ADN es expresada;
(c) un polipéptido codificado por una secuencia
de ADN que se hibridiza a la secuencia de ADN de las posiciones
121-1677 de la SEC ID Nº: 3 bajo condiciones de
astringencia media, donde las condiciones de astringencia media
comprenden hibridación en 5xSSC a 45ºC y lavado en 2xSSC a
60ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Xiloglucanasa según la reivindicación 3 que
es obtenida a partir de una cepa de Paenibacillus polymyxa,
ATCC 832.
5. Xiloglucanasa de la familia 44, que es
seleccionada de uno de
(a) un polipéptido codificado por la secuencia
de ADN de las posiciones 121-1677 de la SEC ID Nº:
5;
(b) un polipéptido producido por cultivo de una
célula que comprende la secuencia de la SEC ID Nº: 5 bajo
condiciones donde la secuencia de ADN es expresada; o
(c) un polipéptido codificado por una secuencia
de ADN que se hibridiza a la secuencia de ADN de las posiciones
121-1677 de la SEC ID Nº: 5 bajo condiciones de
astringencia media, donde las condiciones de astringencia media
comprenden hibridación en 5xSSC a 45ºC y lavado en 2xSSC a
60ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Xiloglucanasa según la reivindicación 5, que
es obtenida a partir de una cepa de Paenibacillus sp., DSM
13329.
7. Una enzima de xiloglucanasa aislada, donde la
enzima está (i) libre de impurezas homólogas, y (ii) producida por
cultivo de una célula que comprende la secuencia de ADN de las
posiciones 121-1677 de la SEC ID Nº: 1, 3 o 5,
donde la enzima es producida y aislada.
8. Preparación enzimática que comprende la
enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 o 5, y
productos de relleno convencionales.
9. Preparación según la reivindicación 8 que
además comprende una o más enzimas seleccionadas del grupo que
consiste en proteasas, celulasas (endoglucanasas),
\beta-glucanasas, hemicelulasas, lipasas,
peroxidasas, lacasas, \alpha-amilasas,
glucoamilasas, cutinasas, pectinasas, reductasas, oxidasas,
fenoloxidasas, ligninasas, pululanasas, pectato liasas,
xiloglucanasas, xilanasas, pectina acetil esterasas,
poligalacturonasas, ramnogalacturonasas, pectina liasas, mananasas,
pectina metil-esterasas, celobiohidrolasas,
transglutaminasas; o mezclas derivadas.
10. Molécula de polinucleótido aislada que
codifica un polipéptido con actividad xiloglucanasa dicha molécula
de polinucleótido se hibridiza a una sonda de ADN bicatenario
desnaturalizada bajo condiciones de astringencia media, donde la
sonda es seleccionada del grupo que consiste en sondas de ADN que
comprenden la secuencia mostrada en las posiciones
121-1677 de la SEC ID NO: 1, 3 o 5.
11. Vector de expresión que comprende los
elementos siguientes operativamente enlazados: un promotor de
transcripción; un segmento de ADN seleccionado del grupo que
consiste en (a) moléculas de polinucleótido que codifican un
polipéptido con actividad xiloglucanasa que comprende una secuencia
de nucleótidos como se muestra en la SEC ID Nº: 1, 3 o 5 del
nucleótido 121 al nucleótido 1677, (b) moléculas de polinucleótido
que codifican un polipéptido con actividad xiloglucanasa que es
idéntica al menos al 70% a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID
NO: 2 de residuo de aminoácido 40 al residuo de aminoácido 559, y
(c) degenerar secuencias de nucleótidos de (a) o (b); y un
terminador de la transcripción.
12. Célula cultivada en la que ha sido
introducido un vector de expresión según la reivindicación 11,
donde dicha célula expresa el polipéptido codificado por el
segmento de ADN.
13. Método para producir un polipéptido con
actividad xiloglucanasa, dicho método comprendiendo el cultivo de
una célula en la que ha sido introducido un vector de expresión
según la reivindicación 11, por el cual dicha célula expresa un
polipéptido codificado por el segmento de ADN; y recuperación del
polipéptido.
14. Composición de detergente que comprende la
preparación enzimática según la reivindicación 8 o la enzima según
cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 y 5.
15. Proceso para tratamiento a máquina de
tejidos dicho proceso comprende el tratamiento del tejido durante
un ciclo de lavado de un proceso de lavado a máquina con una
solución de lavado conteniendo la preparación enzimática según la
reivindicación 8 o la enzima según cualquiera de las
reivindicaciones 1, 3 y 5.
16. Uso de la preparación enzimática según la
reivindicación 8 o la enzima según cualquiera de las
reivindicaciones 1, 3 y 5 en la industria textil para mejorar las
propiedades de fibras celulósicas, hilo, tejido tejido o no
tejido.
17. Uso según la reivindicación 16, donde la
preparación enzimática o la enzima se usa en una fase de proceso de
lavado textil.
18. Uso de la preparación enzimática según la
reivindicación 8 o la enzima según cualquiera de las
reivindicaciones 1, 3 y 5 en la industria del tratamiento de fibras
de celulosa para el tratamiento de fibras seleccionadas del grupo
que consiste en cáñamo, yute y lino.
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