CN110628680A - 类芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用 - Google Patents

类芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用 Download PDF

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庄妮莎
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Abstract

本发明涉及类芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用。发明所提供的类芽孢杆菌分离自土壤，保藏编号为KCTC 43073。依据多相分类学方法，该菌株是类芽孢杆菌属的一个新种，其分类地位是Paenibacillus sp.。依本发明所提供的类芽孢杆菌新菌种中温生长(30℃)，易培养。本发明新种类芽孢杆菌的发现和利用丰富了我们的可利用微生物资源，该新种类芽孢杆菌具有有机磷农药残留降解功能，可为农业生产所需的有机磷农药残留提供一种新的微生物降解菌种资源。

Description

类芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及类芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用。
背景技术
类芽孢菌属的分离源十分广泛，分离自根际土壤、空气、水体和食品等环境。1996年，由Heyndrickx等对类芽孢菌属的相关特性做了修正。好氧或兼性厌氧生长，产芽孢，细胞呈杆状，革兰氏阳性细胞壁，以周生鞭毛运动，中温，主要的脂肪酸为反异式饱和脂肪酸C15:0。类芽孢菌属G+C含量范围为39～59mol％。
类芽孢杆菌在膨大胞囊内有椭圆形芽孢，在营养琼脂上无可溶性色素。兼性厌氧或严格好氧。除了幼虫类芽孢杆菌的两个亚种，几乎所有种的接触酶为阳性。氧化酶反应可变。V-P反应(乙酰甲基甲醇产生)可变，V-P液的pH4～6。不产硫化氢。有的种产生吲哚。硝酸盐还原到亚硝酸盐可变。酪朊、淀粉和脲素的水解都可变。酪氨酸分解也可变。pH5.6和50℃的生长也可变，最适pH为7.0，最适的温度28～30℃。马阔里类芽孢杆菌(P.macquariensis)最适生长温度为20-23℃。10％NaCl可抑制生长。有的种在含0.001％溶菌酶中不能生长。模式种为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。
类芽孢菌属的很多微生物可产生多种生物活性物质，如酶和抗菌物质等，作为重要的植物生防细菌和植物根际促生菌在农业领域已得到广泛应用。类芽孢杆菌是具有较强抗逆能力的细菌，可产生高活性的絮凝物质、可降解微囊藻产生的微囊藻毒素，降解油脂等，在环境污染治理方面也具有广泛的应用前景。
农药作为现代化农业必不可少的生产资料，其在减少农作物虫害、增加农产品产量、提高农产品质量等方面发挥着巨大的作用。但是由于在防治农作物病虫害过程中不合理和超剂量使用化学农药，导致农产品中的农药残留量越来越高，造成严重的农产品农药残留，甚至直接污染食品，威胁人类健康，严重污染土壤、水体及大气环境，降低了周围生物种群的多样性，破坏生态***的平衡，同时也影响了人民的健康和农产品的出口，破坏了农业生态环境。
随着我国经济的发展和人民生活水平的日益提高，食品安全问题日益受到人们的关注。近年来食品安全问题层出不穷，其中因农药残留而造成的食品安全问题也呈高发态势，严重威胁人民的生命健康安全，造成不良社会影响。
在各类农药中，有机磷类农药是目前我国使用最为广泛的一类，其占我国农业总产量的30％左右，因其高效高毒的特点，被广泛应用于农作物的病虫害防治。但其残留时间长，易污染环境，对人类健康具有潜在的威胁，其在环境中的残留已广受关注。目前在有机磷农药残留治理方面已有包括物理法、化学法、光催化法和生物法在内的诸多进展：其中，物理法一般使用对农药残留具有吸附能力的各类材料对土壤中的农药残留进行吸附后转移至别处处理，如刘乐等[1]使用镁铁纳米层状双氢氧化物对敌敌畏进行吸附75min后吸附率可达88.16％，但物理法一般只是将污染物进行转移，之后还需要进一步的降解且吸附材料的制备成本相对较高，不利于大规模推广；化学法一般为使用氧化剂对有机磷农药残留进行氧化已将其转化为无害物质，如陈春燕等[2]以自制Fe2O3-Ce O2/γ-Al2O3为催化剂,采用催化湿式过氧化氢氧化法预处理有机磷农药废水，能有效降低废水中有机磷农药浓度，但是废水往往需要用大量水稀释，造成处理装置庞大、负荷低、运行成本高的缺陷，且需要大量氧化剂；光催化法的原理为使用TiO2等催化剂在紫外光的照射下将有机磷农药残留转化为无害物质，如彭延治等[3]研究表明采用UV-TiO2-Fenton光催化体系可以使敌百虫农药的降解率达到92.50％，但光催化法一般需要事先对农药残留进行富集，增加了实际使用成本。
与上述方法相比，微生物在环境中分布广泛，具有降解效率高、代谢途径多、无二次污染的特点，成为目前降解有机磷农药残留的主要手段。大量研究证明，自然界中存在多种微生物可利用有机磷作为碳源和能源，将其降解为小分子低毒或无毒物质，最终转化为CO2、水和矿物质，实现无害化处理。生物修复过程中的微生物主要有3种类型：土著微生物、基因工程菌和外来微生物。已报道的能有效降解农药的微生物包括细菌、放线菌、真菌、藻类等。细菌由于容易诱变和适应性强等特性而在生物修复中占据主导地位。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种类芽孢杆菌属的新菌种。
为实现上述的目的，本发明采用如下技术方案：
一种类芽孢杆菌，其保藏编号为KCTC 43073。
本发明的目的之二在于提供该新菌种的培养方法。该方法的具体步骤为：将类芽孢杆菌接种于培养基中，在20-50℃，pH 5.0-12.0的条件下进行培养。
进一步的，上述的培养基为R2A培养基。
进一步的，上述的培养温度为30℃。
进一步的，上述的pH为7.0-8.0。
进一步的，上述的培养基中还有质量百分比为1％的NaCl。
进一步的，上述的培养在需氧条件下进行。
本发明的目的之三在于提供上述的类芽孢杆菌在有机磷类农药残留降解中的应用。具体的，将上述类芽孢杆菌经发酵培养制成降解菌剂使用。进一步的，发酵培养的培养基成分为葡萄糖0.1wt％、NaCl 1.0wt％、蛋白胨0.5wt％、酵母膏0.25wt％，其余为蒸馏水。
依本发明所提供的类芽孢杆菌新菌种中温生长(30℃)，易培养。本发明新种类芽孢杆菌的发现和利用丰富了我们的可利用微生物资源，该新种类芽孢杆菌具有有机磷农药残留降解功能，可为农业生产所需的有机磷农药残留提供一种新的微生物降解菌种资源。
附图说明
图1是本发明菌株的16S rDNA***发育进化树。
本发明所述的生物材料，其保藏编号为KCTC 43073，分类命名为Paenibacillussp.，名称为XMF-2，已于2019年5月30日保藏于韩国典型培养物保藏中心(简称KCTC，地址：韩国)。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明中所述的室温是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。
实施例1本发明新菌株XMF-2的分离制备
取源自于浙江省温州市某菜地的土壤浸出液，将其稀释涂布于R2A固体培养基中，30℃培养2-3天，挑取单菌落，然后划线纯化得到。
R2A培养基的组成为：酵母浸出粉0.5g/L；蛋白胨0.5g/L；酪蛋白水解物0.5g/L；葡萄糖0.5g/L；可溶性淀粉0.5g/L；磷酸二氢钾0.3g/L；无水硫酸镁0.024g/L；丙酮酸钠0.3g/L；最终pH 7.2±0.2，蒸馏水定容至1000mL。固体培养基添加琼脂。
保藏获得的纯化菌株，其保藏编号为KCTC 43073。
实施例2本发明新菌株XMF-2的表观特征
1.菌落特征
取菌株XMF-2的单菌落，转接到R2A固体培养基上，于30℃恒温培养箱中培养24h、36h和48h，分别观察其菌落的大小、颜色、边缘、凸起、光滑度、粘性、透明度等特点。结果显示，菌株XMF-2在R2A固体培养基上形成边缘整齐，微凸起，光滑，透明，无色的菌落，直径约2-3mm。
2.细胞形态学特征
菌株XMF-2细胞为革兰氏阴性杆菌，顶端圆钝，周生鞭毛；细胞菌体大小为0.9-1.1μm×2.6-4.7μm，单生。
实施例3本发明新菌株XMF-2的生长特性
挑取在R2A固体培养基上培养24h的新鲜培养物，接种到R2A液体培养基，30℃摇床培养20-24h，作为种子。
生长温度：
将所培养的XMF-2种子按2％(v/v)接种量转接新鲜的无菌接种R2A液体培养基中，混匀。分别置于4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、37℃、40℃、45℃、50℃和60℃的水浴培养，每个温度梯度做三个平行，分别在24h和48h时测定其生长情况。得到菌株XMF-2生长温度范围为20～50℃，最适温度30℃。
生长NaCl耐受性：
所培养的XMF-2种子按2％(v/v)接种量转接氯化钠质量浓度分别为0.0％、2.0％、5.0％、7.0％、9％、10.0％、11.0％和12.0％的R2A培养基，30℃培养，分别于24h和48h时对生长状态做记录。结果显示菌株XMF-2的最适生长NaCl浓度为1％。
生长pH范围：
用无菌的1mol/L HCl和1mol/L NaOH将灭好菌的R2A培养基调至pH值分别为3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、8.5、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0，将所培养的XMF-2种子按2％接种量接入，30℃培养，分别于24h和48h的生长状态做记录。得到菌株XMF-2生长的pH范围为5.0～12.0，最适pH为7.0～8.0。
实施例4本发明新菌株XMF-2的生理生化特性
利用API ZYM和API20E鉴定***及常规的生理生化测定方法对菌株XMF-2进行生理生化特征鉴定。
鉴定结果如下表：
实施例5本发明新菌株XMF-2的16S rDNA基因的PCR扩增和序列测定
1.基因组DNA的提取
将XMF-2接种于R2A培养基，与30℃条件下培养24h，离心收集菌体，使用生理盐水重悬菌体以除去残留培养基。后再次离心收集菌体，使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株XMF-2的基因组DNA。
2. 16S rDNA基因的PCR扩增及测序
用于PCR扩增的正向引物为5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(nt 8-27)，反向引物为5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’(nt 1541-1557)，分别对应于大肠杆菌的16S rDNA基因的8-27和1541-1557碱基。
反应体系如下：
反应程序如下：
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后进行测序。
测序结果表明，菌株XMF-2的16S rDNA序列(SEQ ID NO：1)与类芽孢杆菌属物种有较高相似度，其中与Paenibacillus Contaminans相似度最高，故可将其归类于类芽孢杆菌属。16S rDNA序列进化树分析见图1。
实施例6DNA分子杂交
菌株XMF-2同遗传亲缘关系最相似的菌种Paenibacillus Contaminans strainCKOBP-6进行杂交试验。
步骤如下：
DNA样品处理：提取待试菌株的DNA，实验前需先置冰浴中用超声波40W处理24分钟(设定为：打3秒/停3秒；DNA样品浓度为OD260nm2.0，将DNA样品剪切为2-5×105道尔顿的片段。
将待测DNA样品分别用0.1×SSC精确配制成为OD260nm1.8～2.0，且两者OD260nm值一致(精确到0.001)；
进入控制程序，设置页来设定合适的测定参数。测定波长为260nm，总测定时间设定为30分钟。
将比色杯的温度稳定在最适复性温度。
取两株菌种DNA样品各400μL分别装在两个离心管中，再取两株菌种DNA样品各200μL装在同一个离心管中为混合样品；
单一DNA样品和混合DNA样品测试前分别通过控温***设置100℃变性15min，然后降温至最适复性温度。记录OD260nm值，待反应进行到30min时，停止读数，全部过程样品的温度都不得低于TOR，最终得到一条随时间延长，光吸收值逐渐减小的直线；
根据实验结果利用计算机软件得到同源杂交率。
结果显示，菌株XMF-2同Paenibacillus Contaminans strain CKOBP-6的DNA同源性为40％，根据《伯杰氏细菌鉴定手册》，在最适的条件下，DNA同源性在70％以上是属于同一种的，在20％以上是属于同一属的，由此判断菌株XMF-2属于类芽孢杆菌属的一个新种。
实施例7本发明新微生物的用途
菌株XMF-2对有机磷类农药残留的降解效果：
在R2A培养基中降解菌株XMF-2对有机磷类农药降解特性测定：挑取XMF-2单菌落于50mL R2A液体培养基中，30℃、200rpm振荡培养24h，获得新鲜菌液。将3mL培养好的新鲜菌液经6000rpm离心5min，弃去上清液，加入10mL无菌水重悬，为离心悬浮后的种子液，种子液的菌体量达为6×107CFU/mL以上。
在R2A培养基中加入终浓度为100mg/L的氰氟草酯，按3％体积比的接种量接入菌株XMF-2的种子液；同时在无机盐培养基中加入终浓度为100mg/L的氰氟草酯，按3％体积比的接种量接入灭活的菌株XMF-2种子液作为对照，30℃恒温摇床中培养24h，采用高效液相色谱法检测菌株XMF-2对乙羧氟草醚的降解情况，并计算降解率，菌株XMF-2在24h内对乙羧氟草醚降解率可以达到90％。
采用相同的方法测试精恶唑禾草灵、精吡氟禾草灵、精喹禾灵、炔草酯等芳氧苯氧羧酸酯类农药的降解情况，反应48h后精恶唑禾草灵、精吡氟禾草灵、精喹禾灵、炔草酯的降解率都较好的降解效果。
菌株XMF-2对有机磷类农药的降解效果如下表所示。
表1菌株XMF-2对有机磷类农药的降解效果
实施例8菌株XMF-2降解菌剂的制备
1)将实施例1分离筛选的降解菌株XMF-2接种到含3mL的R2A培养基的试管中培养到对数期，将试管液按0.5％体积比的接种量接种于100mL发酵培养基中，30℃，150rpm振荡培养至对数期，制得发酵菌种；
2)将上述制得发酵菌种按10％(v/v，以培养基体积为基准)的接种量接种于装液量为70％(以发酵罐体积为基准，下同)的500升种子罐的培养基中培养(培养基已经121℃高压湿热灭菌，冷却)，培养至对数生长期，培养过程中每分钟无菌空气的通气量为1:1(培养基与无菌空气体积比)，搅拌速度为150rpm，培养温度为30℃；制得种子液；
3)将种子液按10％(v/v，以培养基体积为基准)的接种量接入装液量为70％的5000升生产罐的培养基中培养发酵(生产罐培养基已经在1.1kg/cm2的压力下，121℃高压湿热灭菌，冷却)，培养发酵过程中每分钟无菌空气的通气量为1:1(培养基与无菌空气体积比)，搅拌速度为180rpm，培养温度为30℃，培养时间为30小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型即为降解菌剂。
其中，发酵培养基、种子罐的培养基、生产罐的培养基配方相同，均为葡萄糖0.1wt％、NaCl 1.0wt％、蛋白胨0.5wt％、酵母膏0.25wt％，溶剂为蒸馏水，pH7.2-7.5。
所述降解菌剂使用方法为：在温度利于微生物生长时，按100mL/m2的用量，将菌剂均匀喷洒于土壤表面并翻耕将菌剂与待处理土壤混合均匀。待微生物生长并降解农药残留3～4天后即可检测降解效果。
制备的菌剂对含有机磷类农药的土壤降解效果如下表2所示。
表2菌剂对土壤中有机磷类农药的降解效果
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 类芽孢杆菌新菌种及其培养方法和应用
<130> xb19101101
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1455
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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ctttcccgaa ggaaagatcc gctcgacttg catgtattag gcacgccgcc agcgatcgtc 1440
ctgagccagg atcaa 1455

Claims (10)

1.一种类芽孢杆菌，其特征在于，其保藏编号为KCTC 43073。
2.一种培养权利要求1所述的类芽孢杆菌的方法，其特征在于，该方法的步骤为：将类芽孢杆菌接种于培养基中，在20-50℃，pH 5.0-12.0的条件下培养。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养基为R2A培养基。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养的温度为30℃。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养的pH为7.0-8.0。
6.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的培养基中还有质量百分比为1％的NaCl。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养在需氧条件下进行。
8.权利要求1所述的类芽孢杆菌在有机磷类农药残留降解中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将权利要求1所述类芽孢杆菌经发酵培养制得降解菌剂使用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，发酵培养的培养基成分为葡萄糖0.1wt％、NaCl1.0wt％、蛋白胨0.5wt％、酵母膏0.25wt％，其余为蒸馏水。
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