ES2322607T3 - Proceso para la preparacion de (s)-butan-2-ol. - Google Patents

Abstract

Método para la preparación de (S)-butan-2-ol mediante la reducción de butan-2-ona en presencia de una alcoholdeshidrogenasa (i) con la secuencia polipeptídica SEQ ID NO:2, o (ii) con una secuencia polipeptídica que presenta al menos un 80% de identidad secuencial con SEQ ID NO:

Description

Proceso para la preparación de (S)-butan-2-ol.

La presente invención se refiere a un proceso para la preparación de (S)-butan-2-ol mediante la reducción de butan-2-ona en presencia de una alcohol-deshidrogenasa.

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Estado de la técnica

Se ha descrito la reducción de butan-2-ona hasta butan-2-ol con diferentes bio-catalizadores [J. Org. Chem. (1992) 57:1526, Chemistry Letters (1987) 2089, Arch. Biochem Biophys. (1992) 292:539].

De hecho, en estos trabajos no se indican enantio-selectividades de ninguna manera. Además, ya se ha publicado la preparación de R-butan-2-ol [J. Am. Chem. Soc. (1986) 108:162]. Aquí se han obtenido solo enantio-selectividades de 48%.

La síntesis biocatalítica de S-butan-2-ol ha sido mostrada por Nakamura et al. [Tetrahedron: Asymmetry (2003) 14:2659, Tetrahedron: Asymmetry (2002) 13:971]. Se lograron enantio-selectividades de 94%. En estos trabajos se trabajó con células secas de Geotrichum candidum. De hecho, la enzima que cataliza la reacción mencionada arriba no se describe en detalle.

El documento VELONIA, K. ET AL.: "Stereospecificity of Hydrogen Transfer by the NAD+-linked Alcohol Dehydrogenase from the Antarctic Psychrophile Moraxella sp. TAE123" (Estereo-especificidad de la transferencia de hidrógeno por la alcohol-deshidrogenasa enlazada a NAD+ a partir de la Psychrophile Moraxella sp. TAE123 antártica (BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, volumen 9, No. 1, enero 1999, páginas 65-68) divulga una alcohol-deshidrogenasa bacterial de Moraxella sp. TAE123 y su uso para la preparación de (S)-butan-2-ol mediante la reducción de butan-2-ona.

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Planteamiento del objetivo

El objetivo consiste en suministrar un proceso para la preparación de (S)-butan-2-ol mediante la reducción enantio-selectiva de butan-2-ona, el cual produce (S)-butan-2-ol con un rendimiento químico alto de enantiómero lo más puro posible.

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Descripción de la invención

La presente invención se refiere a un proceso para la preparación de (S)-butan-2-ol mediante la reducción de butan-2-ona en presencia de una alcohol-deshidrogenasa

(i) con la secuencia polipeptídica SEQ ID NO:2, o

(ii) con una secuencia polipeptídica que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2.

Alcohol-deshidrogenasas adecuadas para el proceso de acuerdo con la invención (en adelante abrviadas ADH) son aquellas ADH que están en capacidad de oxidar 2-propanol en una reacción dependiente de NAD+ hasta 2-propanona.

Las ADH adecuadas para el proceso de acuerdo con la invención también poseen una secuencia polipeptídica según SEQ ID NO:2 o una secuencia polipeptídica que tiene al menos 80%, preferible al menos 90%, particularmente preferible al menos 95% y en especial al menos 97%, 98% o 99% de identidad secuencial con SEQ ID NO:2.

Un polipéptido con la SEQID NO:2 es la propanol-deshidrogenasa que puede obtenerse de Escherichia coli [Swissprot: locus ADHP_ECOLI, accession P39451; Genbank ID 48994873 Region: complement (1550852 hasta 1551892; [Science (1997) 277:1453]. El aislamiento de esta enzima se describe en la parte experimental.

Otras ADH adecuadas son aquellas cuya secuencia polipeptídica con SEQ ID NO:2 tiene una de las identidades de secuencia arriba mencionadas.

La determinación de la identidad de secuencia para los propósitos aquí descritos debe efectuarse mediante el programa de ordenador "GAP" del Genetics Computer Group (GCG) de la Universidad de Wisconsin, y debe emplearse la versión 10.3 usando los parámetros estandarizados recomendados por el GCG.

Tales ADH pueden obtenerse a partir de SEQ ID NO:2 mediante procesos de mutagénesis dirigidos o aleatorios conocidos por la persona técnica en la materia. De manera alternativa, sin embargo, también pueden buscarse ADH en microorganismos, preferiblemente en aquellos de las especies Alishewanella, Alterococcus, Aquamonas, Aranicola, Arsenophonus, Azotivirga, Brenneria, Buchnera (aphid P-endosymbionts), Budvicia, Buttiauxella, Candidatus Phlomobacter, Cedecea, Citrobacter, Dickeya, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Ewingella, Grimontella, Hafnia, Klebsiella, Kluyvera, Leclercia, Leminorella, Moellerella, Morganella, Obesumbacterium, Pantoea, Pectobacterium, Photorhabdus, Plesiomonas, Pragia, Proteus, Providencia, Rahnella, Raoultella, Salmonella, Samsonia, Serratia, Shigella, Sodalis, Tatumella, Trabulsiella, Wigglesworlhia, Xenorhabdus, Yersinia o Yokenella, y dichas ADH catalizan la oxidación correspondiente de 2-propanol hasta 2-propanona y su secuencia de aminoácidos ya tiene la identidad secuencial requerida hacia la SEQ ID NO: 2 o se obtiene mediante procesos de
mutagénesis.

La ADH puede usarse en forma purificada o parcialmente purificada o también en forma del mismo microorganismo. Para la persona técnica en la materia son conocidos procesos para la obtención y purificación de deshidrogenasas a partir de microorganismos, por ejemplo de K. Nakamura & T. Matsuda, "Reduction of Ketones" (Redución de cetonas) en K. Drauz y H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis (Catálisis enzimática en la síntesis orgánica) 2002, Vol.III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim. También son desconocidos procesos recombinantes para la generación de deshidrogenasas, por ejemplo de W. Hummel, K. Abokitse, K. Drauz, C. Rollmann y H. Gröger, Adv. Synth. Catal. 2003, 345, No. 1 + 2, páginas 153-159.

Preferiblemente se efectúa la reducción enantio-selectiva con la AHD en presencia de un co-factor adecuado (también denominado co-sustrato). Como co-factores para la reducción de la cetona sirve habitualmente NADH y/o NADPH. Además de esto pueden emplearse ADH como sistemas celulares que contienen co-factor inherente o se adicionan mediadores redox alternativos (A. Schmidt, F. Hollmann y B. Bühler "Oxidation of Alcohols" (Oxidación de alcoholes) en K. Drauz y H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis (Catálisis enzimática en síntesis orgánica) 2002, Vol. III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim).

La reducción enantioselectiva se efectúa con la ADH preferiblemente además en presencia de un agente reductor adecuado el cual regenera el co-factor oxidado en el transcurso de la reducción. Ejemplos de agentes reductores adecuados son azúcares, en especial hexosas tales como glucosa, manosa, fructosa y/o alcoholes oxidables, en especial etanol, propanol o isopropanol, así como formiato, fosfito o hidrógeno molecular. Para la oxidación del agente de reducción y con esto enlazadao para la regeneración de la co-enzima puede adicionarse una segunda deshidrogenasa como, por ejemplo, glucosa-deshidrogenasa usando glucosa como agente reductor o formiato-deshidrogenasa usando formiato como agente reductor. Esta puede usarse como enzima libre o inmovilizada o en forma de células libres o inmovilizadas. Su preparación puede efectuarse tanto por separado como también mediante co-expresión en una cepa-deshidrogenasa (recombinada).

Una forma de realización preferida del proceso reivindicado es la regeneración de los co-factores mediante un sistema enzimático en el que se usa una segunda deshidrogenasa, particularmente preferible una glucosa-deshidrogenasa.

La ADH también puede encontrar uso para la preparación de (R)-butan-2-ol. En este proceso se hace reaccionar butan-2-ol racémico con ADH y se oxida selectivamente el (S)-butan-2-ol hasta butan-2-ona, mientras que el (R)-butan-2-ol permanece invariable. A continuación la mezcla obtenida de butan-2-ona y (R)-butan-2-ol puede separarse mediante procesos habituales, como por ejemplo mediante destilación y de esta manera puede aislarse el (R)-butan-2-ol en forma pura. Aquí se usan preferiblemente NAD+ o bien NADP+ como co-factores que pueden volver a regenerarse con co-sustratos correspondientes (agentes de oxidación). Como co-sustrato puede usarse aquí preferiblemente acetona la cual, con la ya existente ADH y/o una deshidrogenasa usada adicionalmente, regenera el cofactor; la acetona se reduce hasta isopropanol.

"Enantioselectividad" en el contexto de la presente invención significa que el exceso de enantiómeros ee (en %) del enantiómero S, el cual se calcula de una manera conocida según

ee% = (enantiómero\ S - enantiómero\ R)/(enantiómero\ S + enantiómero\ R) x 100

es de al menos 80%, preferiblemente de al menos 90%, en especial de al menos 95% y muy especialmente de al menos 97%.

Las ADH usadas de acuerdo con la invención pueden emplearse libres o inmovilizadas. Por una enzima inmovilizada se entiende una enzima que se fija en un soporte inerte. Materiales soporte adecuados así como enzimas inmovilizadas sobre ellas se conocen de la EP-A-1149849, EP-A-1 069 183 y de la DE-OS-10019377 así como la bibliografía allí citada. La divulgación de estos documentos se incorpora totalmente mediante esta referencia. Los materiales soporte incluyen por ejemplo arcillas, minerales de arcilla como caolinita, tierras de diatomeas, perlita, dióxido de silicio, óxido de aluminio, carbonato de sodio, carbonato de calcio, polvo de celulosa, materiales intercambiadores de aniones, polímeros sintéticos como poliestireno, resinas acrílicas, resinas de fenol-formaldehído, poliuretanos y poliolefinas, como polietileno y polipropileno. Los materiales soporte para la preparación de las enzimas soportadas se emplean habitualmente en una forma de partículas finas; se prefieren formas porosas. El tamaño de partícula del material soporte alcanza habitualmente no más de 5 mm, en especial no más de 2 mm (diagrama de cribado o tamizado). De manera análoga durante el empleo de la deshidrogenasa como catalizador de célula completa se selecciona una forma libre o inmovilizada. Materiales de soporte son, por ejemplo, alginato de Ca y carragenano. Enzimas como también células también pueden integrarse de manera reticulada directamente con glutaraldehído (cross-linking hacia CLEAs). Otros procesos correspondientes de inmovilización se describen, por ejemplo en J. Lalonde y A. Margolin "Immobilization of Enzymes" en K. Drauz y H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis (Catálisis enzimática en síntesis orgánica) 2002, Vol. III, 991-1032, Wiley-VCH,
Weinheim.

La reacción (reducción de la butan-2-ona hasta butan-2-ol) puede efectuarse en medios de reacción acuosas o no acuosas o en sistemas de 2 fases o (micro-)emulsiones. Los medios de reacción acuosos son preferiblemente soluciones amortiguadas (tamponadas) que normalmente tienen un valor pH de 4 hasta 8, preferiblemente de 5 hasta 8. El solvente acuoso, además de agua, puede contener al menos un alcohol, por ejemplo etanol o isopropanol o dimetilsul-
fóxido.

Por medios no acuosos de reacción se entienden medios de reacción que contienen menos de 1% en peso, preferiblemente menos de 0,5% en peso de agua, con respecto al peso total del medio de reacción. La reacción se lleva a cabo en un solvente orgánico.

Solventes adecuados son, por ejemplo, hidrocarburos alifáticos, preferiblemente con 5 hasta 8 átomos de carbono, tales como pentano, ciclopentano, hexano, ciclohexano, heptano, octano o ciclooctano, hidrocarburos alifáticos halogenados, preferiblemente con uno o dos átomos de carbono, como diclorometano, cloroformo, tetracloruro de carbono, dicloroetano o tetracloroetano, hidrocarburos aromáticos, como benceno, tolueno, los xilenos, clorobenceno o diclorobenceno, éteres o alcoholes alifáticos acíclicos o cíclicos, preferiblemente con 4 hasta 8 átomos de carbono, como éter dietilico, éter metil-terc-butílico, éter etil-terc-butílico, éter dipropílico, éter diisopropílico, éter dibutílico, tetrahidrofurano o ésteres tales como acetato de etilo o acetato de n-butilo o cetonas tales como metilisobutilcetona o dioxano o mezclas de éstos. Particularmente se usan de manera preferible los éteres previamente mencionados, en especial tetrahidrofurano.

La reducción se lleva a cabo preferiblemente con la ADH en un medio de reacción acuoso-orgánico, en especial acuoso.

La butan-2-ona se emplea en la reducción enzimática preferiblemente en una concentración de 0,1 g/l hasta 500 g/l, particularmente preferible de 1 g/l hasta 50 g/l y puede continuarse continua o discontinuamente.

La reducción enzimática se efectúa normalmente a una temperatura de reacción por debajo de la temperatura de desactivación de la deshidrogenasa empleada y por encima de -10ºC. De manera particularmente preferible se encuentra en el rango de 0 hasta 100ºC, en especial de 15 hasta 60ºC y muy especialmente de 20 hasta 40ºC, por ejemplo alrededor de 30ºC.

Para la realización puede ponerse, por ejemplo, la butan-2-ona con la ADH con el solvente y opcionalmente las co-enzimas, opcionalmente una segunda deshidrogenasa para la regeneración de la co-enzima y/u otros agentes reductores y mezclar bien, por ejemplo revolviendo o agitando. Pero también es posible inmovilizar la(s) deshidrogenasa(s) en un reactor, por ejemplo en una columna y hacer pasar a través del reactor una mezcla que contiene butan-2-ona y opcionalmente coenzimas y/o co-sustratos. Para tal efecto puede conducirse la mezcla en un circuito a través del reactor hasta que se alcanza la reacción deseada. En tal caso se reduce el grupo cetona de la butan-2-ona hasta un grupo OH, por lo cual se genera esencialmente el (S)-enantiómero del alcohol. Normalmente la reducción se lleva a cabo hasta una conversión de al menos 70%, particularmente preferible de al menos 85% y en especial de al menos 95%, con respecto a la butan-2-ona presente en la mezcla. El progreso de la reacción, es decir la reducción secuencial de la cetona, puede monitorearse aquí mediante métodos habituales tales como la cromatografía de gases o cromatografía líquida a alta presión.

De acuerdo con la invención también está comprendido el uso de "equivalente funcionales" de las enzimas divulgadas específicamente que tienen actividad de deshidrogenasa de butan-2-ol.

"Equivalente funcionales" o análogos de las enzimas divulgadas específicamente son polipéptidos diferentes de las mismas, los cuales poseen también la actividad biológica deseada tal como, por ejemplo, especificidad hacia el sustrato. De esta manera, por "equivalentes funcionales" se entienden, por ejemplo, las enzimas que reducen la butan-2-ona hasta el S-alcohol correspondiente y que tienen al menos 20%, preferible 50%, particularmente preferible 75%, muy particularmente preferible 90% de la actividad de una enzima que comprende una de las secuencias listadas en la SEQ ID NO:2. Además, equivalentes funcionales son estables preferiblemente entre pH 4 hasta 10 y poseen ventajosamente un pH óptimo entre pH 5 y 8 así como una temperatura óptima en el rango de 20ºC hasta
80ºC.

Por "equivalentes funcionales" también se entienden en especial mutantes que tienen en al menos una posición secuencial de las secuencias de aminoácidos arriba mencionadas otro aminoácido diferente de los mencionados concretamente pero, sin embargo, poseen una de las actividades biológicas arriba mencionadas. "Equivalentes funcionales" comprenden de esta manera los mutantes obtenibles por una o varias adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácido; las modificaciones mencionadas pueden presentarse en cualquier posición de la secuencia mientras den lugar a un mutante que tiene el perfil de propiedad. La equivalencia funcional se da también en tal caso si coinciden cualitativamente los modelos de reactividad entre el mutante y el polipéptido inmodificado, es decir, por ejemplo, sustratos iguales reaccionan con diferente velocidad.

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Ejemplo de sustituciones adecuadas de aminoácidos pueden encontrarse en la siguiente tabla:

Residuo original

Ejemplos de la sustitución

Ala

Ser

Arg

Lys

Asn

Gln; His

Asp

Glu

Cis

Ser

Gln

Asn

Glu

Asp

Gly

Pro

His

Asn; Gln

Ile

Leu; Val

Leu

Ile; Val

Lys

Arg; Gln; Glu

Met

Leu; Ile

Phe

Met; Leu; Tyr

Ser

Thr

Thr

Ser

Trp

Tyr

Tyr

Trp; Phe

Val

Ile; Leu

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"Equivalentes funcionales" en el sentido de arriba también son "precursores" de los polipétidos descritos así como "derivados funcionales".

"Precursores" en este caso son precursores naturales o sintéticos de los polipéptidos con o sin actividad biológica deseada.

"Derivados funcionales" de los polipéptidos también pueden prepararse en grupos laterales de aminoácido o en sus extremos terminales de N o de C con ayuda de técnicas conocidas. Derivados de este tipo comprenden por ejemplo ésteres alifáticos de grupos de ácido carboxílico, amidas de grupos de ácido carboxílico, obtenibles mediante reacción con amoniaco o con una amina primaria o secundaria; derivados de N-acilo de grupos libres de amina, preparados mediante reacción con grupos acilo; o derivados de O-acilo de grupos libres hidroxilo, preparados mediante reacción con grupos acilo.

En el caso de una posible glicosilación de proteína, los "equivalentes funcionales" comprenden proteínas del tipo arriba designado en forma deglicosilada o glicosilada así como las formas modificadas obtenibles mediante la modificación del patrón de glicosilación.

"Equivalentes funcionales" también comprenden por supuesto polipéptidos que están disponibles de otros organismos, así como variantes que tienen lugar en la naturaleza. Por ejemplo, pueden establecerse áreas de regiones homólogas de secuencia mediante comparación de secuencia y pueden determinarse enzimas equivalentes sobre la base de lineamientos específicos de la invención.

"Equivalentes funcionales" comprenden también fragmentos, preferiblemente dominios individuales o motivos de secuencia de los polipéptidos que tienen la función biológica deseada, por ejemplo.

"Equivalentes funcionales" son además proteínas de fusión que tienen una de las secuencias polipeptídicas arriba mencionadas o equivalentes funcionales derivadas de las mismas y al menos otra secuencia funcionalmente diferente, heteróloga en conexión funcional de las terminales de N o de C (es decir, sin perjuicio funcional recíproco esencial de las partes de la proteína de fusión). Ejemplos no limitantes de secuencias heterólogas de este tipo son péptidos o enzimas de señal.

Homólogos de las proteínas pueden identificarse mediante screening (cribado o tamizaje) de bancos (librerías) combinatorios de mutantes tales como, por ejemplo, mutantes de abreviación. A manera de ejemplo, un banco abigarrado de variantes de proteína puede generarse mediante mutagénesis combinatoria al nivel de ácido nucleico, como por ejemplo mediante ligadura enzimática de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos. Existe un gran número de procesos que pueden usarse para la preparación de bancos de homólogos potenciales a partir de una secuencia oligonucleótida degenerada. La síntesis química de una secuencia genética degenerada puede llevarse a cabo en un sintetizador automático de ADN y el gen sintético puede ligarse en un vector de expresión adecuado. El uso de un conjunto degenerado de genes hace posible el suministro de todas las secuencias en una mezcla las cuales codifican el conjunto deseado de secuencias potenciales de proteína. Para la persona técnica en la materia son conocidos los procesos de síntesis de oligonucleótidos degenerados (por ejemplo Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477).

En el estado de la técnica se conocen varias técnicas para el screening de productos genéticos de bancos combinatorios, que se han producido mediante mutaciones puntuales o abreviación (truncamiento), y para el screening de bancos de cADN para productos genéticos con una propiedad seleccionada. Estas técnicas pueden adaptarse para un screening rápido de los bancos de genes que han sido generados por mutagénesis combinatoria de homólogos de la invención. Las técnicas usadas con mayor frecuencia para el screening de bancos más grandes de genes que se someten a análisis de alto rendimiento comprenden la clonación del banco de genes en vectores de expresión replicables, la transformación de las células adecuadas con el banco resultante de vectores y la expresión de los genes combinatorios en condiciones en las que la detección de la actividad deseada facilite el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto fue detectado. Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM, ó mutagénesis de ensamblaje recursivo), una técnica que aumenta la frecuencia de mutantes funcionales en los bancos y que puede usarse en combinación con las pruebas de screening para identificar homólogos (Arkin y Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331).

Se divulgan secuencias de ácido nucleíco (secuencias de ADN y ARN mono- y bicatenario, como por ejemplo, cDNA y mRNA), que codifican para una enzima con actividad de deshidrogenasa. Se prefieren secuencias de ácido nucleico que codifican por ejemplo para secuencias de aminoácido según SEQ ID NO:2 o secuencias parciales características de las mismas, o comprenden secuencias de ácido nucleico según SEQ ID NO:1 o secuencias parciales características de las mismas.

Todas las secuencias aquí mencionadas pueden prepararse de una manera de por sí conocida mediante síntesis química de unidades estructurales nucleótidas, como por ejemplo mediante condensación fragmentaria de bloques componentes de ácido nucleico individuales complementarios que se solapan de la doble hélice. La síntesis química de oligonucleótidos puede efectuarse de manera conocida, según el método de fosfoamidita, por ejemplo (Voet, Voet, 2ª. Edición, Wiley Press New York, páginas 896-897). La adición de oligonucleótidos y el llenado de sitios vacíos con la ayuda de la polimerasa de ADN y reacciones de ligazón y también métodos generales de clonación se describen en Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual (Clonación molecular: un manual de laboratorio), Cold Spring Harbor Laboratory Press.

También se divulgan secuencias de ácido nucleico (secuencias de ADN y ARN mono- y bicatenario, como por ejemplo cDNA y mRNA), que codifican para uno de los polipéptidos de arriba y sus equivalentes funcionales que están accesibles usando análogos artificiales de nucleótidos, por ejemplo.

Se divulgan tanto moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican para polipéptidos o proteínas o segmentos biológicamente activos de los mismos como también para fragmentos de ácido nucleico que pueden usarse, por ejemplo, como sondas de hibridación o primers para identificar o amplificar ácidos nucleicos codificantes.

Las moléculas de ácido nucleico pueden contener además secuencias no transferidas desde los extremos 3'- y/o 5' de la región codificante del gen.

Se divulgan también las moléculas de ácido nucleico complementarias a las secuencias de nucleótido descritas concretamente o un segmento de las mismas.

Las secuencias de nucleótidos hacen posible la generación de sondas y primers que pueden usarse para la identificación y/o clonación de secuencias homólogas en otros tipos de células y organismos. Aquellas sondas o primers comprenden habitualmente una región de secuencias nucleótidas que hibrida en condiciones "rigurosas" (véase abajo) en al menos aproximadamente 12, preferiblemente al menos aproximadamente 25, como por ejemplo, aproximadamente 40, 50 o 75 nucleótidos de una hebra codificadora (sense strand) de una secuencia de ácido nucleico o de una hebra no codificante (antisense strand) correspondiente.

Una molécula "aislada" de ácida nucleica se separa de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico y pueden estar esencialmente libres de otro material celular o medio de cultivo que se prepara por medio de técnicas recombinantes o libres de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente.

Una molécula de ácido nucleico puede aislarse por medio de técnicas estandarizadas de biología molecular y de la información de secuencia suministrada. A manera de ejemplo, cADN puede aislarse a partir de un banco adecuado de cADN usando una de las secuencias completas divulgadas concretamente o un segmento de las mismas como sonda de hibridación y técnicas estandarizadas de hibridación (tal como se describen, por ejemplo, en Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Además, una molécula de ácido nucleico que comprende cualquiera de las secuencias divulgadas, o un segmento de las mismas, puede aislarse mediante reacción en cadena de polimerasa y se usan los primers (iniciadores) de oligonucleótidos que se han creado sobre la base de esta secuencia. El ácido nucleico amplificado así puede clonarse en un vector adecuado y caracterizarse mediante análisis secuencial de ADN. Además, los oligonucleótidos pueden prepararse mediante procesos de síntesis estandarizados, por ejemplo con un sintetizador automático de ADN.

Las secuencias de ácido nucleico pueden identificarse y aislarse por principio de todos los organismos. Ventajosamente pueden aislarse las secuencias de ácido nucleico o los homólogos de las mismas a partir de hongos, levaduras, archeae o bacterias. Como bacterias pueden nombrarse las bacterias gram-negativas y gram-positivas. Se prefieren los ácidos nucleico de bacterias gram-negativas ventajosamente de \alpha-proteobacterias, \beta-proteobacterias o \gamma-proteobacterias, particularmente se prefieren de bacterias de los órdenes de las Acidithiobacillales, Alteromonadales, Chromatiales, Enterobacteriales, Legionellales, Metilococcales, Oceanospirillales, Pasteurellales; Pseudomonadales, Thiotrichales, Vibrionales, Xanthomonadales. Muy particularmente se prefieren de bacterias de la familia de las Enterobacteriaceae. En especial se prefieren del género Escherichia. En especial se prefieren de los tipos Escherichia albertii, Escherichia blattae, Escherichia coli, Escherichia fergusonii, Escherichia hermannii, Escherichia senegalensis y Escherichia vulneris.

Se usan de manera particularmente preferible deshidrogenasas de Escherichia coli.

Pueden aislarse secuencias de ácido nucleico de otros organismos, por ejemplo con procesos usuales de hibridación o la técnica PCR, por ejemplo por medio de bancos genómicos o de cADN. Estas secuencias de ADN hibridan en condiciones estándar con las secuencias. Para la hibridación se usan de manera ventajosa oligonucleótidos cortos de las regiones conservadas por ejemplo del centro activo las cuales pueden determinarse de una manera conocida para la persona técnica en la materia por medio de comparaciones con una deshidrogenasa. Sin embargo, para la hibridación también pueden usarse fragmentos más largos de los ácidos nucleicos o las secuencias completas. Según el ácido nucleico usado (oligonucleótido, fragmento más largo o secuencia completa) o según cuál tipo de ácido nucleico ADN o ARN se usa para la hibridación, varían las condiciones estándar. Así, por ejemplo, las temperaturas de fusión para híbridos DNA:híbridos de DNA son de aproximadamente 10ºC más bajas que para ADN:híbridos de ARN de igual longitud.

Por condiciones estándar deben entenderse por ejemplo, dependiendo del ácido nucleico, temperaturas entre 42 y 58ºC en una solución acuosa de amortiguador (tampón) con una concentración entre 0,1 hasta 5 x SSC (1 X SSC = NaCl de 0,15 M, citrato de sodio de 15 mM, pH 7,2) o adicionalmente en presencia de formamida al 50%, como por ejemplo 42ºC en 5 x SSC, formamida al 50%. DE manera ventajosa, las condiciones de hibridación para ADN:híbridos de ADN se encuentran en 0,1 x SSC y temperaturas entre alrededor de 20ºC hasta 45ºC, preferible entre alrededor de 30ºC hasta 45ºC. Para ADN: híbridos de ARN las condiciones de hibridación se encuentran de manera ventajosa en 0,1 x SSC y temperaturas entre alrededor de 30ºC hasta 55ºC, preferible entre alrededor de 45ºC hasta 55ºC. Estas temperaturas indicadas para la hibridación son valores calculados a manera de ejemplo de la temperatura de fusión para un ácido nucleico con una longitud de alrededor de 100 nucleótidos y un contenido G + C de 50% en ausencia de formamida. Las condiciones experimentales para la hibridación de ADN se describen en los manuales de consulta sobre genética, como por ejemplo Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, y pueden calcularse según fórmlas conocidas por la persona técnica en la materia, dependiendo por ejemplo de la longitud de los ácidos nucleicos, del tipo de híbrido o del contenido G + C. La persona técnica en la materia puede tomar más información sobre hibridación de los siguientes manuales: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hibridation: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press,
Oxford.

Se divulgan también derivados de las secuencias de ácido nucleico concretamente divulgadas o derivables.

Así, otras secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO:1 pueden derivarse y distinguirse de las mismas mediante adición, sustitución, inserción o deleción de uno o de varios nucleótidos pero que también codifican para polipéptidos con el perfil de propiedades deseado.

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También se divulgan aquellas secuencias de ácido nucleico que comprenden las llamadas mutaciones mudas o han sido modificadas comparadas con una secuencia mencionada específicamente de acuerdo con la utilidad de codón de un organismo fuente u organismo huésped específico, como también variantes que ocurren de manera natural, tales como por ejemplo, variantes de empalme o variantes de alelos.

Así mismo se divulgan secuencias que se obtienen mediante sustituciones nucleótidas de conservación (es decir, el aminoácido en cuestión se reemplaza por un aminoácido de igual carga, tamaño, polaridad y/o solubilidad).

También se divulgan las moléculas que se derivan de ácidos nucleicos divulgados concretamente mediante los polimorfismos de secuencia. Estos polimorfismos genéticos pueden existir entre individuos dentro de una población debido a una variación natural. Esas variaciones naturales ejercen usualmente una varianza de 1 hasta 5% en la secuencia nucleótida de un gen.

Además por derivados deben entenderse, por ejemplo, fusiones con promotores. Los promotores que están ubicados antes de las secuencias nucleótidas indicadas pueden modificarse mediante uno o varios intercambios, inserciones, inversiones y/o deleciones de nucleótidos, pero sin que se perjudique la funcionalidad o la efectividad de los promotores. Además, la efectividad de los promotores puede elevarse mediante la modificación de su secuencia o los promotores pueden reemplazarse completamente con más promotores activos, incluyendo aquellos de los organismos de otras especies.

Por derivados deben entenderse también variantes cuya secuencia de nucleótidos en la región de -1 hasta -1000 bases hacia delante antes de codón de inicio ó 0 hasta 1000 bases hacia atrás después del codón de detención se modificaron de tal manera que se modifica, preferiblemente se eleva, la expresión del gen y/o la expresión de
proteína.

Se divulgan también secuencias de ácido nucleico que hibridan con secuencias arriba mencionadas que codifican en "condiciones rigurosos". Estos polinucleótidos pueden encontrarse mediante screening de bancos genómicos o de cADN y, opcionalmente, amplificarse a partir de los mismos por medio de PCR usando primers adecuados y luego aislarse usando sondas adecuadas, por ejemplo. Además, los polinucleótidos también pueden sintetizarse de manera química. Por esta propiedad se entiende la capacidad de un poli- u oligonucleótido en condiciones rigurosas de enlazarse a una secuencia casi complementaria, mientras que en estas condiciones no tienen lugar enlaces no específicos entre partes no complementarias. Para este propósito las secuencias deben ser complementarias hasta en 70-100%, preferiblemente hasta 90-100%. La propiedad de secuencias complementarias de poder enlazarse unas a otras se utiliza, por ejemplo, en la técnica de Northern- o Southern-Blot o para enlaces de primers en PCR o RT-PCR. Para este propósito, usualmente se emplean oligonucleótidos desde una longitud de 30 pares de bases. Por condiciones rigurosas en la técnica de Northern blot se entiende, por ejemplo, el uso de una solución de lavado caliente a 50 - 70ºC, preferiblemente 60 - 65ºC de un búfer 0,1x SSC con 0.1% SDS (20x SSC: NaCl de 3M, citrato de Na de 0,3M, pH 7,0), por ejemplo, para la elución de sondas de cADN u oligonucleótidos vueltos híbridos de manera no específica. En este caso, como se mencionó arriba, los únicos ácidos nucleicos en quedar enlazados unos con otros son aquellos que son complementarios en gran medida. El establecimiento de condiciones rigurosas ya se conoce por parte de la persona técnica en la materia y se describe, por ejemplo en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.

Conformación de los constructos

Se divulgan además constructos de expresión que contienen bajo el control genético de las secuencias nucleicas regulatorias una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido; y vectores que comprenden al menos uno de estos constructos de expresión.

Tales constructos comprenden preferiblemente un promotor 5'-corriente arriba de la secuencia que codifica y una secuencia de terminación 3'-corriente abajo así como opcionalmente otros elementos regulatorios usuales, y que de hecho se enlazan respectivamente con la secuencia que codifica.

Por "enlace operativo" se entiende la disposición secuencial del promotor, secuencia que codifica, de terminación y, opcionalmente, otros elementos regulatorios de tal manera que cada uno de los elementos regulatorios es capaz de desempeñar su función tal como se requiere al expresar la secuencia que codifica. Ejemplos de secuencias que pueden enlazarse de manera operativa son secuencias marcadas (targeting sequences) así como potenciadores (enhancer), señales de poliadenilación y similares. Otros elementos regulatorios comprenden marcadores seleccionables, señales de amplificación, orígenes de replicación y similares. Secuencias regulatorias adecuadas se describen, por ejemplo en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA
(1990).

Por constructo de ácido nucleico deben entenderse en especial aquellos en los que el gen para una deshidrogenasa se ha enlazado de manera operativa o funcional a una o más señales regulatorias con el propósito de dirigir, incrementando por ejemplo, la expresión del gen de manera operativa o funcional.

Adicionalmente a estas secuencias de regulación, la regulación natural de estas secuencias aún puede estar presente corriente arriba de los genes estructurales propios y opcionalmente puede haberse modificado genéticamente de modo que la regulación natural se haya desconectado y la expresión de los genes se haya aumentado. Pero el constructo de ácido nucleico puede tener también un diseño más simple, es decir que no se hayan insertado señales regulatorias corriente arriba de la secuencia codificante y no se haya retirado el promotor natural junto con su regulación. En lugar de esto, la secuencia regulatoria natural se muta de tal manera que no se efectúe regulación alguna y se incremente la expresión del gen.

Un constructo preferido de ácido nucleico contiene también ventajosamente una o más de las secuencias de "enhancer" (potenciador) previamente mencionadas las cuales están enlazadas de manera funcional al promotor y las cuales permiten que se incremente la expresión del la secuencia de ácido nucleico. Secuencias ventajosas adicionales tales como otros elementos regulatorios o terminadores más también pueden insertarse en el extremo 3' de las secuencias de ADN. Los ácidos nucleicos de la invención pueden estar presentes en el constructo en una o más copias. El constructo también puede contener marcadores adicionales tales como resistencias a antibióticos o genes que complementan auxotrofias, opcionalmente para la selección de dicho constructo.

Secuencias de regulación ventajosas para el proceso de acuerdo con la invención se encuentran presentes, por ejemplo, en promotores tales como cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-,
rhaP (rhaPBAD)SP6-, lambda-Pro en el promotor lambda-P_{L}, los cuales se usan ventajosamente en bacterias gram-negativas. Otras más secuencias ventajosas de regulación se encuentran presentes, por ejemplo, en los promotores gram-positivos amy y SPO2, en los promotores de levaduras o de hongos ADC1, MFalpha, AC, P-60, CIC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. En conexión con esto, también son ventajosos los promotores de la piruvato-carboxilasa y de la metanoloxidasa, de la Hansenula por ejemplo. También es posible usar promotores artificiales para
regulación.

Para la expresión en un organismo huésped, el constructo de ácido nucleico se inserta ventajosamente a un vector tal como una plásmido o un fago, por ejemplo, que permite que los genes se expresen óptimamente en el huésped. Por vectores se entienden, adicionalmente a los plásmidos o fagos, también cualesquiera otros vectores conocidos por la persona técnica en la materia; es decir, por ejemplo, virases tales como SV40, CMV, baculovirus y adenovirus, transposones, elementos IS, fasmidas, cosmidas, y ADN lineales o circulares. Estos vectores pueden replicarse en organismos huéspedes de manera autónoma o replicarse de manera cromosomática. Estos vectores representan un realización más de la invención. Plásmidos adecuados son, por ejemplo, en E. coli pLG338, pACIC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, Igt11 o pBdC1, en streptomyces pIJ101, plJ364, pIJ702 o plJ361, en bacilo pUB110, pC194 o pBD214, en corynebacterium pSA77 o pAJ667, en hongos pALS1, plL2 o pBB116, en levaduras 2alphaM, pAG-1, YEp6, YEp13 o pEMBLYe23 o en vegetales pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 o pDH51. Los plásmidos nombrados representan una pequeña selección de los plásmidos posible. Otros plásmidos son bien conocidos para la persona técnica en la materia y pueden encontrarse, por ejemplo, en el libro Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018).

Para la expresión de otros genes contenidos, el constructo de ácido nucleico contiene ventajosamente de manera adicional secuencias regulatorias 3' y 5'-terminales para el incremento de la expresión los cuales se seleccionan para expresión óptima dependiendo del organismo huésped y del gen o de los genes seleccionados.

Estas secuencias regulatorias deben permitir que los genes y la expresión de proteína se expresen específicamente. Dependiendo del organismo huésped esto puede significar que, por ejemplo, el gen se expresa o se sobre expresa solo después de inducción o que se expresa y/o se sobre expresa inmediatamente.

Las secuencias o factores regulatorios pueden en tal caso influir de manera positiva preferiblemente la expresión genética del gen introducido y de esa manera elevarla. Así, los elementos regulatorios pueden potenciarse ventajosamente al nivel de transcripción usando señales fuertes de transcripción tales como promotores y/o "enhancers" (potenciadores). Sin embargo, junto con esto también es posible un refuerzo de la traducción mejorando la estabilidad del mARN, por ejemplo.

En una forma más de realización del vector, el vector que contiene el constructo de ácido nucleico o el ácido nucleico también puede introducirse ventajosamente a los microorganismos en forma de un ADN lineal e integrarse al genoma del organismo huésped por medio de recombinación heteróloga u homóloga. Este ADN lineal puede consistir en un vector linealizado tal como un plásmido o solo en un constructo de ácido nucleico o el ácido
nucleico.

Para una expresión óptima de genes heterólogos en organismos es ventajoso alterar las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con el "codon usage" (uso de codón) específico empleado en el organismo. El "codon usage" puede determinarse fácilmente con la ayuda de análisis computacional de otros genes conocidos a partir del organismo involucrado.

La preparación de un cassette de expresión se efectúa mediante fusión de un promotor adecuado con una secuencia nucleótida codificante adecuada así como con una señal de terminación o de poliadenilación. Para este propósito se usan técnicas comunes de recombinación y clonación, tal como se describen, por ejemplo, en T. Maniatis, E.F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman y L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y en Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987).

Para la expresión en un organismo huésped adecuado el constructo recombinante de ácido nucleico o de gen se inserta ventajosamente en un vector específico para el huésped lo cual permite que los genes se expresen óptimamente en el huésped. Para la persona técnica en la materia los vectores son bien conocidos y pueden encontrarse, por ejemplo, en "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).

Organismos huéspedes útiles

Con ayuda de los vectores o constructos es posible preparar los microorganismos recombinantes que se transforman, por ejemplo, con al menos un vector y pueden emplearse para la producción de polipéptidos. De manera ventajosa, los constructos recombinantes arriba descritos se introducen a un sistema huésped recombinante y se expresan. En este caso, para lograr que dichos ácidos nucleicos se expresen en el sistema respectivo de expresión se usan preferiblemente métodos familiares de clonación y transfección conocidos para la persona técnica en la materia tales como, por ejemplo, coprecipitación, fusión de protoplasto, electroporación, transfección retroviral y similares. Sistemas adecuados se describen, por ejemplo, en Current Protocols en Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, o Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,
1989.

También es posible preparar microorganismos recombinados homólogamente. Para este propósito se prepara un vector que contiene al menos un segmento de un gen o de una secuencia codificante en donde opcionalmente se han introducido al menos una deleción, adición o sustitución de aminoácido para modificar la secuencia, por ejemplo para romperla funcionalmente (vector de "knockout"). La secuencia introducida también puede ser un homólogo de un microorganismo relacionado o derivarse de una fuente de mamífero, levadura o insecto. El vector empleado para recombinación homóloga puede conformarse alternativamente de tal manera que el gen endógeno muta o se modifica de otra manera en la recombinación homóloga aunque aún codifica la proteína funcional (por ejemplo, la región regulatoria puesta corriente arriba puede modificarse de tal manera que la expresión de la proteína se modifica de esta forma). El segmento modificado del gen está en el vector homólogo de recombinación. La construcción de vectores adecuados para la recombinación homóloga se describe, por ejemplo, en Thomas, K.R. y Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503.

En calidad de organismos huéspedes recombinantes adecuados para el ácido nucleico o el constructo de ácido nucleico pueden tomarse en consideración por principio todos los organismos procarióticos o eucarióticos. De manera ventajosa se usan como organismos huéspedes recombinantes microorganismos tales como bacterias, hongos o levaduras. Ventajosamente se usan bacterias gram-positivas o gram-negativas, preferiblemente bacterias de las familias enterobacteriaceae, pseudomonadaceae, rhizobiaceae, streptomycetaceae o Nocardiaceae, particularmente preferible de los géneros escherichia, pseudomonas, streptomyces, nocardia, burkholderia, salmonella, agrobacteria o rhodococcus. Muy particularmente se prefiere el género y tipo Escherichia coli. Otras bacterias ventajosas se encuentran además en el grupo de las alfa-proteobacterias, beta-proteobacterias o gamma-proteobacterias.

El organismo huésped o los organismos huéspedes contiene en tal caso preferiblemente al menos una de las secuencias descritas de ácido nucleico, constructo de ácido nucleico o vectores, los cuales codifican para una enzima con actividad de deshidrogenasa.

Los organismos usados en el proceso de acuerdo con la invención se crían o se cultivan de una manera conocida para la persona técnica en la materia dependiendo del organismo huésped. Los microorganismos se cultivan usualmente en un medio líquido que contiene una fuente de carbono, la mayoría de las veces en forma de azúcar, una fuente de nitrógeno, la mayoría de las veces en forma de fuentes orgánicas de nitrógeno como extracto de levadura o sales como sulfato de amonio, oligoelementos tales como sales de hierro, sales de manganeso, sales de magnesio y, opcionalmente, vitaminas a temperaturas de entre 0ºC y 100ºC, preferiblemente entre 10ºC y 60ºC, mientras que se gasea con oxígeno. En este contexto, el pH del nutriente líquido puede mantenerse o puede no mantenerse a un valor fijo, es decir que puede regularse o no regularse durante el cultivo. El cultivo puede llevarse a cabo discontinuamente ("batch"), semicontinuamente ("semi batch") o continuamente. Los nutrientes pueden introducirse al inicio de la fermentación o alimentarse a continuación de manera semi-continua o continua. La cetona puede adicionarse directamente al cultivo o, ventajosamente, después del cultivo. Las enzimas pueden aislarse de los organismos usando el proceso descrito en los ejemplos o usarse para la reacción como un extracto crudo.

Preparación recombinante de los polipéptidos usados de acuerdo con la invención

Se divulgan además procesos para la preparación recombinante de los polipéptidos usados de acuerdo con la invención o fragmentos funcionales, biológicamente activos de los mismos; se cultiva un microorganismo que produce polipéptido, se induce opcionalmente la expresión de los polipéptidos y éstos se aíslan del cultivo. Los polipéptidos también pueden producirse e escala industrial si se desea.

El microorganismo recombinante puede cultivarse y fermentarse de acuerdo con métodos conocidos. Las bacterias pueden multiplicarse, por ejemplo, en medio TB o LB y a una temperatura de 20 hasta 40ºC y un valor de pH de 6 hasta 9. Específicamente se describen condiciones adecuadas de cultivo, por ejemplo en T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).

Cuando los polipéptidos no se secretan al medio de cultivo entonces las células se abren y se obtiene el producto a partir del lisado según métodos conocidos de aislamiento de proteína. Las células pueden abrirse, si se desea, por medio de ultrasonido de alta frecuencia, mediante alta presión, como por ejemplo, en una célula francesa de presión, mediante osmólisis, por la acción de detergentes, enzimas líticas o solventes orgánicos o por una combinación de dos o más de los procesos listados.

Los polipéptidos pueden purificarse usando métodos cromatográficos conocidos tales como cromatografía de tamices moleculares (filtración de gel), por ejemplo cromatografía de Q Sepharosa, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía hidrofóbica, y también usando otros métodos habituales tales como ultrafiltración, cristalización, separación por salado, diálisis y gel-electroforesis nativa. Métodos adecuados se describen, por ejemplo, en Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden (Métodos bioquímicos de trabajo), Verlag Walter de Gruyter (editorial), Berlin, New York o en Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag (editorial), New York, Heidelberg,
Berlín.

Puede ser ventajoso aislar la proteína recombinante usando sistemas de vectores u olinucleótidos que extienden el cADN por secuencias nucleótidos particulares y de esta manera codifican para polipéptidos alterados o proteínas de fusión que se usan, por ejemplo, para purificar la purificación. Ejemplos de modificaciones adecuadas de este tipo son los llamados "tags" que actúan como anclas, tales como la modificación conocida como ancla de hexahistidina, o epítopes que pueden reconocer como antígenos por anticuerpos (descritos, por ejemplo, en Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). Estas anclas pueden usarse para pegar las proteínas a un soporte sólido tal como una matriz polimérica, por ejemplo, que puede empacarse en una columna cromatográfica, por ejemplo, o puede usarse sobre una placa de microtitulación o en otro soporte.

Simultáneamente, estas anclas pueden usarse para identificar las proteínas. Las proteínas también pueden identificarse usando marcadores habituales tales como colorantes fluorescentes, marcadores de enzima que, después de reaccionar con un sustrato, forman un producto de reacción detectable, o marcadores radiactivos, ya sea por sí mismos o en combinación con las anclas, para derivatizar dichas proteínas.

Otras conformaciones para realizar el proceso de reducción enzimática de acuerdo con la invención

Las deshidrogenasas pueden usarse en el proceso de acuerdo con la invención como enzima libre o inmovilizada.

El método según la invención se lleva a cabo ventajosamente a una temperatura entre 0ºC hasta 95ºC, preferible entre 10ºC hasta 85ºC, particularmente preferible entre 15ºC hasta 75ºC.

El valor de pH en el proceso de acuerdo con la invención se mantiene ventajosamente en el proceso de acuerdo con la invención entre pH 4 y 12, preferiblemente entre pH 4,5 y 9, particularmente preferible entre pH 5 y 8.

Por productos enantiméricos puros o quirales, tales como butan-2-ol, en el proceso de acuerdo con la invención se entienden enantiómeros que muestran un enriquecimiento en enantiómero. En el proceso se logran purezas de enantiómero de al menos 70%ee, preferible de min. 80%ee, particularmente preferible de min. 90%ee, muy particularmente preferible de min. 98%ee.

Para el proceso de acuerdo con la invención pueden usarse células que crecen las cuales contienen los ácidos nucleicos, constructos de ácido nucleico o vectores. También pueden usarse células en reposo o abiertas. Por células abiertas se entienden, por ejemplo, células que se han hecho permeables mediante un tratamiento con solventes, por ejemplo, o células que se rompieron por un tratamiento enzimático o por un tratamiento mecánico (por ejemplo French Press o ultrasonido) o por otros métodos. Los extractos crudos obtenidos son adecuados ventajosamente para el método de acuerdo con la invención. También son adecuadas enzimas purificadas o parcialmente purificadas para el proceso. También son adecuados microorganismos inmovilizados o enzimas inmovilizadas que pueden aplicarse ventajosamente en la reacción.

El proceso de la invención puede operarse discontinuamente, por lotes, semi-continuamente o continuamente.

El proceso puede llevarse a cabo ventajosamente en bioreactores tal como se describe, por ejemplo en Biotechnology, volumen 3, 2a edición, Rehm et al Hrsg., (1993) en especial capítulo II.

Los siguientes ejemplos deben ilustrar la invención. En este contexto se hace referencia a las figuras anexas en las que se muestra:

Figura 1 muestra un proceso típico de reacción de una síntesis de (S)-butan-2-ol por reducción con una deshidrogenasa a partir de Escherichia coli.

Parte experimental

Ejemplo 1

Clonación de la propanol-deshidrogenasa a partir de Escherichia coli

La secuencia del gen de la propanol-deshidrogenasa a partir de Escherichia coli está depositada en bancos de datos (Genbank ID 48994873 región: complemento (1550852 hasta 1551892)). Los oligonucleótidos que se usaron para amplificar el gen del ADN genómico de Escherichia coli de acuerdo con procesos conocidos se derivaron a partir de la secuencia de ácido nucleico de la propanol-deshidrogenasa. La secuencia obtenida corresponde a la seceuncia publicada. La secuencia de ADN de los oligonucleótidos se representa en la tabla 1.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1

1

\vskip1.000000\baselineskip

Condiciones PCR

\quad

2 mL 10*Pfu-Ultra regulador (Stratagene®)

\quad

100 ng Primer #1 (compárese tabla 1)

\quad

100 ng Primer #2 (compárese tabla 1)

\quad

1 mL dNTP (cada 10 mM)

\quad

Cerca de 30 ng de ADN cromosomático DNA de Escherichia coli

\quad

1 U Pfu-Ultra DNA Polimerasa

\quad

ad 20 mL H_{2}O.

\vskip1.000000\baselineskip

Programa de temperatura

\quad

5 min, 95ºC,

\quad

45 sec, 40ºC,

\quad

1,5 min, 72ºC, (30 ciclos)

\quad

45 sec, 95ºC,

\quad

10 min, 72ºC,

\quad

\infty, 10ºC10 min, 72ºC,

\quad

\infty, 10ºC.

\vskip1.000000\baselineskip

El producto PCR (cerca de 1050bp) se digirió con endonucleasas de restricción NdeI y HindIII y clonado en el vector pDHE19.2 que había sido cortado de manera correspondiente (la clonación se llevó a cabo tal como se describe en DE 19848129). Las mezclas de ligazón se transformaron en E. coli XL1 Blue (Stratagene®).

El plásmido obtenido pDHE-PDH-L se transformó en la cepa E.coli TG10 pAgro4 pHSG575 (TG10: un derivado de RhaA de E. coli TG1 (Stratagene®); pAgro4: Takeshita, S; Sato, M; Toba, M; Masahashi, W; Hashimoto-Gotoh, T (1987) Gene 61, 63-74; pHSG575: T. Tomoyasu et al (2001), Mol. Microbiol. 40(2), 397-413). El clon recombinante de E. coli se denominó E. coli LU12418.

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Ejemplo 2

Suministro de propanol-deshidrogenasa recombinante

Se cultivaron E. coli LU12418 en 20 mL LB-Amp/Spec/Cm (100 mg/l de ampicilina; 100 mg/l de espectinomycina; 20 mg/l de cloroamfenicol), 0,1 mM IPTG, 0,5 g/L ramnosa en recipientes Erlenmeyer de 100 mL (deflectores) 18 h a 37ºC, se centrifugó 5000* g/10 min, se lavó una vez con 10 mM TRIS*HCl, pH7,0 y se re-suspendió en 2 mL del mismo búfer.

Se preparó extracto crudo de proteína libre de células abriendo la pasta de células de E. coli LU12418 0,7 ml de esferas de vidrio (d=0,5 mm) en un molino vibratorio (3x 5 min con refrigeración intermedia sobre hielo).

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Ejemplo 3

Determinación de actividad de la deshidrogenasa recombinante a partir de E. coli LU12418

En cada caso se cultivaron 6 transformantes en 20 mL de LBAmp/Spec/Cm (100 mg/l Amp; 100 mg/ISpec; 20 mg/ICm) 0,1 mM IPTG 0,5 g/L Rhamnose en recipientes Erlenmeyer de 100 mL (deflectores) 18 h a 37ºC, se centrifugó a 5000*g/10 min, se lavó una vez con 10 mM de Tris/HCl pH7,0 y se resuspendió en 2 mL del mismo búfer. Se obtuvo extracto crudo, libre de células, de E. coli LU12418 con 0,7 ml de esferas de vidrio (d=0,5 mm) en in molino vibratorio (3 x 5 min con enfriamiento intermedio sobre hielo).

El consumo de co-sustratos reducidos durante la reducción de cetonas puede monitorearse en un fotómetro a 340 nm. Se incubaron en 1 mL 50 mM KPi, 1 mM M9Cl2, pH 6.5, a 30ºC 10 \muL de extracto crudo diluido, libre de células, (=10 mg de proteína), 10 mmol de n-propanal y 250 nmol de NADH o NADF. 1 unidad (1 U) corresponde a la cantidad de enzima que reduce 1 \mumol de n-propanal en i min.

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Ejemplo 4

Analítica de nutan-2-ol

Las concentraciones de butan-2-ona y butan-2-ol pueden determinarse por medio de GC. Según la selección de la fase estacionario y móvil, puede determinarse además de la concentración también su valor ee.

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a) Análisis aquiral

La cuantificación de la traducción se realizó con el siguiente sistema:

Fase estacionaria: Chromoltih SpeedROD RP18, 50*4, 6 \mum, Merck (Darmstadt) calentado a 45ºC.

Fase móvil: eluente A: 10 mM KH_{2}PO_{4}, pH 2.5.

Eluente B: Acetonitrilo.

Gradiente: 0-0.5 min, 35% B; 0.5-1.0 min 35 auf 80% B; 1.0-1.2 min 80% B; 1.2-1.3 min 80% -35%B; 1.3-2.0 min 35% B;

Rata (velocidad) de flujo: 1.5 ml/min.

Detección: Detección de UV a 230 y 260 nm.

Tiempos de retención: butan-2-ona: cerca de 1.6 min.

Butan-2-ol: cerca de 1.3 min.

Con material auténtico se produce una serie de calibración con base en lo cual puede determinarse la concentración de muestras desconocidas.

\vskip1.000000\baselineskip

b) Análisis quiral

Fase estacionaria: Chiracel OD-H, 250*4, 6 \mum, Daicel, calentada a 40ºC.

Fase móvil: Eluente A: n-hexano.

Eluente B: iso-propanol.

Isocrático con 2.5% B.

Rata de flujo: 1.0 ml/min.

Detección: Detección de UV a 230 y 260 nm.

Tiempos de retención butan-2-ona: cerca de 9.5 min.

(1S)-Butan-2-ol: cerca de 16.6 min.

(1R)-Butan-2-ol: cerca de 18.3 min.

Con material auténtico se produce una serie de calibración con base en la cual puede determinarse la concentración de muestras desconocidas.

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Ejemplo 5

Suministro de glucosa-deshidrogenasa para regeneramiento de co-factor y regeneración de cofactor con glucosa-deshidrogenasa Acoplamiento de enzima

Para la regeneración de cofactor puede usarse glucosa-deshidrogenasa. La enzima puede conseguirse comercialmente (por ejemplo Jülich Fine Chemicals, orden No. 22.10 ó 19.10). En lo siguiente se usó el gen de la glucosa-deshidrogenasa a partir de Bacillus subtilis (Banco de genes - Acc.No. M12276), que se clonó en una E. coli XL10 Gold Klon en el plásmido pUC19. Este constructo lleva la denominación E. coli LU11293.

Para la fermentación de E. coli LU11293 se empleó el siguiente medio:

560 g Extracto de levadura (65%).

448 g Trypton (Difco).

42 g KH_{2}PO_{4}.

84 g Na_{2}HPO_{4}.

644 g Glicerina (99%).

100 mL de solución SL4 (5 veces).

1 g Tegosipona 3062.

Se diluye el medio con agua hasta 13,5 L, se ajusta pH a 7,0, se retiran aproximadamente 300 mL para el pre-cultivo, luego se esteriliza a 122ºC por 30 minutos. Se adiciona solución estéril de sal* (previamente se retira la solución de sal para los recipientes de agitación, véase el protocolo).

*Solución de sal

2,1 g CaCl_{2} * 2 H_{2}O.

3,5 g MgSO_{4} * 7 H_{2}O.

14 g NH_{4}Cl.

Se disuelven 14 mL de solución de ampicilina (100 mg/mL) en 500 mL de agua y se esterilizan por filtración.

En cada caso se esterilizaron 150 mL de medio en dos recipientes Erlenmeyer y se completó con 5 mL de solución estéril de sal. Después de inocular desde una placa de LB-ampicilina-agar se incubaron los pre-cultivos por 12 horas a 37ºC y 200 rpm y se adicionó al medio de fermentación. La fermentación se inició a 37ºC, 0,1 bar de presión interna, pH 7,0 (regulación con 20% de ácido fosfórico y 25% NaOH) con una rata de gaseado de 7,5 L/min y 300 rpm (regulación de pO_{2} entre 20 y 50% con 10-20 L/min de entrada de aire y 500-1500 rpm). Después de 2 h se adicionaron 0,1 mM IPTG para inducción y se paró la fermentación después de un tiempo total de 13 h. Después de cosechar y lavar las células (1,3 kg), estas últimas se almacenaron a - 20ºC hasta el uso (2-20 g/L en la mezcla de reacción).

Se mezclaron cantidades equimolares de glucosa y butan-2-ona con 1-30 U/ml de extracto crudo de glucosa-deshidrogenasa y 1-30 U/ml de extracto crudo de propanol-deshidrogenasa. 0.02-1 mmol/L de NAD o de NADP o de NADH o de NADPH se disolvieron en búfer y se incubaron a 10-60ºC. El pH se mantuvo constante por medio de asición automática de base.

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Ejemplo 6

Regeneración de co-factor con propanol-deshidrogenasa (acoplamiento de sustrato)

La regeneración del co-factor también puede realizarse mediante la propanol-deshidrogenasa misma. En este caso no se requiere la adición de un sistema de regeneración por separado. La propanol-deshidrogenasa acepta diferentes alcoholes monohídricos como agentes reductores. Se oxidan hasta los compuestos de alcohol correspondientes. Un alcohol monohídrico adecuado para regenerar NADH o NADPH con propanol-deshidrogenasa es iso-
Propanol.

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Ejemplo 7

Regeneración de co-factor con formiato-deshidrogenasa (acoplamiento de enzima)

Para la regeneración de co-factor puede usarse formiat-deshidrogenasa. La enzima puede obtenerse comercialmente (por ejemplo Jülich Fine Chemicals No. de orden 09.11, 24.11 ó 25.10). De manera análoga al ejemplo 5, los co-factores pueden regenerarse de esta menra con formiato-deshidrogenasa. Esto incluye usar cantidades equimolares de formato y butan-2-ona con 1-30 U/ml de extracto crudo de formiato-deshidrogenasa y 1-30 U/ml de extracto crudo de propanol-deshidrogenasa. Se disuelven 0.02-1 mmol/L NAD o bien de NADP o de NADH o bien de NADPH en búfer y se incuba a 10-60ºC. El valor de pH se mantiene constante mediante adición automática de ácido.

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Ejemplo 8

Preparación de (S)-butan-2-ol con la propanol-deshidrogenasa recombinante de Escherichia coli

Se cultivaron E. coli LU12418 de manera correspondiente al ejemplo 2, se cosecharon y se abrieron.

270 g (1.5 mol) de D-glucosa, 135 mL (1.5 mol) de butan-2-ona, 63 mL de extracto crudo de GDH-Rohextrakt (= 30.5 kU), 95 mL de extracto crudo de PDH (= 20 kU) y 400 mg (0.6 mmol) de NAD o NADP o NADH o de NADPH se disolvieron en búfer de KPi (KPi de 50 mM, MgCl_{2} de 1 mM, pH 6.5) y se incubaron a 30ºC. El volumen inicial de la mezcla de reacción fue de tres litros. El valor de pH se mantuvo constante mediante adición automática de NaOH de 2M. La figura 1 muestra un perfil de reacción típico.

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Documentos indicados en la descripción

Esta lista de documentos indicados por el solicitante se registró exclusivamente para la información del lector y no es parte componente del documento europeo de patente. Se compiló con el mayor esmero; La OEP no asume ninguna responsabilidad por errores u omisiones que se encontraren.

Documentos de patentes indicados en la descripción

\bullet EP 1149849 A [0020]

\bullet EP 1069183 A [0020]

\bullet DE OS10019377 A [0020]

\bullet DE 19848129 [0099]

Documentos que no son patentes indicados en la descripción

\bulletJ. Org. Chem, 1992, vol. 57, 1526 [0002]

\bulletChemistry Letters, 1987, 2089 [0002]

\bulletArch. Biochem Biophis., 1992, vol. 292, 539 [0002]

\bulletJ. Am. Chem. Soc, 1986, vol. 108, 162 [0003]

\bulletNAKAMURA et al. Tetrahedron: Asymmetry, 2003, vol. 14, 2659 [0004]

\bulletTetrahedron: Asymmetry, 2002, vol. 13, 971 [0004]

\bulletVELONIA, K. et al. Stereospecificity of Hidrogen Transfer by the NAD+-linked Alcohol Deshidrogenasa from the Antarctic Psychrofile Moraxella sp. TAE123. BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, 1999, vol. 9 (1), 65-68 [0005]

\bulletScience, 1997, vol. 277, 1453 [0010]

\bullet Reduction of Ketones. K. NAKAMURA; T. MATSUDA. Enzimas Catalysis in Organic Synthesis. Wiley-VCH, 2002, vol. III, 991-1032 [0014]

\bullet W. HUMMEL; K. ABOKITSE; K. DRAUZ; C. ROLLMANN; H. GRÖGER. Adv. Synth. Catal., 2003, vol. 345 (1, 2), 153-159 [0014]

\bullet Oxidation of Alcohols. A. SCHMIDT; F. HOLLMANN; B. BÜHLER; K. DRAUZ; H. WALDMANN. Enzimas Catalysis in Organic Synthesis. Wiley-VCH, 2002, vol. III, 991-1032 [0015]

\bullet Immobilization of Enzimass. J. LALONDE; A. MARGOLIN. Enzimas Catalysis in Organic Synthesis. Wiley-VCH, 2002, vol. III, 991-1032 [0020]

\bulletNARANG, S. A. Tetrahedron, 1983, vol. 39, 3 [0039]

\bulletITAKURA et al. Annu. Rev. Biochem., 1984, vol. 53,323 [0039]

\bulletITAKURA et al. Science, 1984, vol. 198, 1056 [0039]

\bulletIKE et al. Nucleic Acids Res., 1983, vol. 11, 477 [0039]

\bulletARKIN; YOURVAN. PNAS, 1992, vol. 89, 7811-7815 [0040]

\bulletDELGRAVE et al. Protein Engineering, 1993, vol. 6 (3), 327-331 [0040]

\bulletSAMBROOK et al. Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 [0042]

\bulletSAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F.; MANIATIS, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 [0049]

\bulletSAMBROOK et al. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 [0053]

\bullet Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, 1985 [0053]

\bullet Nucleic Acids Hibridation: A Practical Approach. IRL Press at Oxford University Press, 1985 [0053]

\bullet Essential Molecular Biology: A Practical Approach. IRL Press at Oxford University Press, 1991 [0053]

\bulletAUSUBEL et al. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, 1989 [0061]

\bulletGOEDDEL. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology. Academic Press, 1990, vol. 185 [0064]

\bullet Buch Cloning Vectors. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985 [0069]

\bullet T. MANIATIS; E. F. FRITSCH; J. SAMBROOK. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 [0075] [0083]

\bullet T. J. SILHAVY; M. L. BERMAN; L. W. ENQUIST. Experiments with Gene Fusions. Cold Spring Harbor Laboratory, 1984 [0075]

\bulletAUSUBEL, F. M. et al. Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, 1987 [0075]

\bulletPOUWELS P. H. et al. Cloning Vectors. Elsevier, 1985 [0076]

\bullet F. AUSUBEL et al. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, 1997 [0077]

\bulletSAMBROOK et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 [0077]

\bulletTHOMAS, K. R.; CAPECCHI, M. R. Cell, 1987, vol. 51, 503 [0078]

\bulletHARLOW, E.; LANE, D. Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press, 1988 [0086]

\bulletBiotechnology. 1993, vol. 3 [0094]

<110> BASF Aktiengesellschaft

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<120> Verfahren zur Herstelllung de (S)-Butan-2-ol

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<130> PF 56053

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<160> 2

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 1041

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<212> DNA

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<213> Escherichia coli

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1041)

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<223>

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<400> 1

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\hskip0,8cm

2

\hskip0,8cm

3

\hskip0,8cm

4

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<210> 2

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<211> 346

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<212> PRT

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<213> Escherichia coli

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<400> 2

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5

Claims (8)

1. Método para la preparación de (S)-butan-2-ol mediante la reducción de butan-2-ona en presencia de una alcohol-deshidrogenasa

(i) con la secuencia polipeptídica SEQ ID NO:2, o

(ii) con una secuencia polipeptídica que presenta al menos un 80% de identidad secuencial con SEQ ID NO:2.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la reducción se efectúa con NADH como co-factor.

3. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el co-factor utilizado se regenera enzimáticamente.

4. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque La regeneración del co-factor se efectúa mediante glucosa-deshidrogenasa.

5. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la reducción se realiza en sistema acuoso.

6. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la alcohol-deshidrogenasa se presenta inmovilizada.

7. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la alcohol-deshidrogenasa utilizada se expresa en E. coli.

8. Uso de una alcohol-deshidrogenasa

(iii) con la secuencia polipeptídica SEQ ID NO:2, o

(iv) con una secuencia polipeptídica que presenta al menos un 80% de identidad secuencial con SEQ ID NO:2,

en un método para la preparación de (S)-butan-2-ol mediante la reducción de butan-2-ona.