JP2012511922A - デュロキセチンアルコールを製造するための改良型生体触媒 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図2
Description
生成する中間体(TACA)(2)は、デヒドロゲナーゼを用いて調製することができる(WO2005/033094)。たとえば、Azoarcus菌種(新規名称Aromatoleum aromaticum)(Hoeffken et al., Biochemistry, vol. 45, No.1, 2006)由来のフェニルエタノールデヒドロゲナーゼEbN1は、Meerwein-Ponndorf還元と同様に、クロロケトン、3-クロロ-1-(チエニル-2-イル)-プロパン-1-オン(1)を、対応するクロロアルコールである(1S)-3-クロロ-1-(チエニル-2-イル)-プロパン-1-オール(2)に還元する。このために、このデヒドロゲナーゼは、必要な還元当量をもたらす補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)を必要とする。この高価な補酵素は、二次的な「犠牲アルコール」(たとえば、2-プロパノールまたは2-ブタノール)の助けを借りることによって再生することが可能であり、その間に対応するケトン(たとえばアセトンまたは2-ブタノン)が生成される。比較的長鎖のアルコールがこの酵素には好ましいが、長鎖の方がやはり相当高価である。こうした理由から、2-ブタノールが犠牲アルコールとして使用される(模式図2を参照されたい)(WO2006/072465)。
野生型酵素EbN1およびその発現のために使用できる発現系は、WO2005/108590およびWO2006/094945に記載されている。
デュロキセチンの調製に使用することができる生体触媒の活性を高めることを本発明の目的とした。
- 反応速度を高めること
- 生成物の収率を高めること
- 生成物阻害の影響を受けにくくすること
- 補酵素再生の向上
- 上記を組み合わせること。
1. 一般的な用語の定義
「フェニルエタノールデヒドロゲナーゼ」(EC No.1.1.1)は、一般に、アセトフェノンからS-1-フェニルエタノールへの、NADH依存性の立体特異的還元を触媒する酵素である。「フェニルエタノールデヒドロゲナーゼ」または「フェニルエタノールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素」は、本発明に関しては特に、一般式Iのケトンから出発して、式IIの光学活性アルコールの酵素合成を触媒するものであって、具体的には3-クロロ-1-(チエニル-2-イル)-プロパン-1-オンと(1S)-3-クロロ-1-(チエニル-2-イル)-プロパン-1-オールとの間の立体特異的平衡反応を触媒する。
ee% = [XA-XB]/[ XA+XB]*100,
式中XAおよびXBはそれぞれ鏡像体AおよびBのモル分率である。
TACA = 3-クロロ-1-チオフェン-2-イル-プロパン-1-オール
TA = 1-チオフェン-2-イル-プロペノン
TAA = 1-チオフェン-2-イル-プロパ-2-エン-1-オール
「低級アルコール」は特にモノオールであって、本明細書によれば低級アルキル基を含むものである。これは特にC1-C8-アルキル基、なかでもC1-C6-アルキル基であって、これらは分岐鎖または特に直鎖で、1から8個までの炭素原子、特に1、2、3、4、5または6個の炭素原子を有する。例としては、C1-C4-アルキル基、たとえばメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、2-ブチル、イソブチルもしくはtert-ブチル;さらに5個以上の炭素原子を有する基、たとえば、ペンチル、1-メチルブチル、2-メチルブチル、3-メチルブチル、2,2-ジメチルプロピル、1-エチルプロピル、1,1-ジメチルプロピル、1,2-ジメチルプロピル、1-メチルペンチル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、4-メチルペンチル、n-ヘキシル、1,1-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、2,3-ジメチルブチル、および3,3-ジメチルブチルなどがある。
本発明は第1に、配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するAzoarcus菌種のフェニルエタノールデヒドロゲナーゼEbN1に由来する、機能的なフェニルエタノールデヒドロゲナーゼ変異体を提供する。
(1)配列領域142〜153(ループ2とも呼ばれる)および
(2)配列領域190〜211(ヘリックスαFG1とも称される)
から選択される少なくとも1つの配列領域内に、少なくとも1つの変異を有する。
(3)配列領域93〜96(ループ1とも称される)
(4)配列領域241〜249(C末端)
(5)配列領域138〜141(結合ポケットの親水性領域、ループ2とも称される)
(6)Cys61および/またはCys83
から選択されるさらに他の配列領域中に、少なくとももう1つの変異を追加して有する、機能的なフェニルエタノールデヒドロゲナーゼ変異体に関する。
T192、L197、M200、F201、L204、M246、L139、T140、T142、L146、I148、Y151、C61、C83、L186、
これらのアミノ酸はそれぞれ、他の任意の望ましい天然アミノ酸で置換されている。
a)単一変異:
Y151XA、ここでXAはA、R、N、E、Q、G、H、I、L、M、TまたはVである;
T192XB、ここでXBはA、E、G、I、P、S、W、VまたはLである;
b)多重変異:
Y151XA T192XB、ここでXA およびXB は上記の意味を持つ。
(部分配列1) 142-TTYWX1KX2EAX3T-153(改変ループ2)および
(部分配列2) 190-ATX4EASAX5 SAX6X7DVX8PNMLQAI-211(改変ヘリックスαFG1)
これらの配列中、X1 〜X8は、互いに無関係に、任意の望ましいアミノ酸基であるが、基X1 〜X3 およびX4 〜X8の少なくとも1つは、配列番号2に記載の天然型酵素の天然アミノ酸基ではなく、具体的には
X1 はLである、またはI、V、A、M、FもしくはHで置換されている、
X2 はIである、またはL、V、A、M、FもしくはHで置換されている、
X3 はYである、またはA、R、N、E、Q、G、H、I、L、M、TもしくはVで置換されている;
あるいは、
X4 はTである、またはA、E、G、I、P、S、W、VもしくはLで置換されている、
X5 はLである、またはI、V、A、M、FもしくはHで置換されている、
X6 はMである、またはY、W、E、V、S、R、Q、K、I、H、G、F、EもしくはDで置換されている、
X7 はFである、またはG、K、T、Y、M、WもしくはRで置換されている、
X8 はLである、またはI、V、A、M、FもしくはHで置換されている。
いずれの場合も、立体異性体として純粋な状態、または立体異性体の混合物であって、
その方法は、本明細書に記載のフェニルエタノールデヒドロゲナーゼ変異体の存在下で、適宜、特にNADHのような還元当量を添加して、生体触媒(微生物/酵素)により式(I)のケトンを還元することを含むものである。
a)本明細書に記載の生体触媒による方法を用いた、3-クロロ-1-(チエニル-2-イル)-プロパン-1-オン(1)から(1S)-3-クロロ-1-(チエニル-2-イル)-プロパン-1-オール(2)への微生物/酵素による還元;
その方法は、本明細書に記載のフェニルエタノールデヒドロゲナーゼ変異体の存在下で、適宜、特にNAD+のような、酸化当量を添加して、式(II)のアルコールを微生物/酵素により酸化することを含んでおり、
3.1 タンパク質
本発明は、フェニルエタノールデヒドロゲナーゼ活性を有する、具体的に記載されたタンパク質および酵素に限定されることはなく、それと機能的に同等のものにまで及ぶ。
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gln; His
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
Gly Pro
His Asn ; Gln
Ile Leu; Val
Leu Ile; Val
Lys Arg ; Gln ; Glu
Met Leu ; Ile
Phe Met ; Leu ; Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp ; Phe
Val Ile; Leu
記載されたポリペプチドの「前駆体」ならびにそうしたポリペプチドの「機能的誘導体」および「塩」も、上記の意味での「機能的同等物」である。
3.2.1 核酸
本発明はまた、フェニルエタノールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸配列を提供する。
マルチプルアラインメントパラメーター:
ギャップ開始ペナルティ(Gap opening penalty) 10
ギャップ伸長ペナルティ(Gap extension penalty) 10
ギャップセパレーションペナルティ(Gap separation penalty range) 8
ギャップセパレーションペナルティ(Gap separation penalty) off
アラインメント遅延に関する%同一性(% identity for alignment delay) 40
残基特異的ギャップ(Residue specific gaps) off
親水性残基ギャップ(Hydrophilic residue gap) off
転移計量(Transition weighing) 0
ペアワイズアラインメントパラメーター:
FASTアルゴリズム on
K-タプルサイズ(K-tuple size) 1
ギャップペナルティ(Gap penalty) 3
ウィンドウサイズ(Window size) 5
Number of best diagonals 5
あるいはまた、同一性は、Chenna, Ramu, Sugawara, Hideaki, Koike,Tadashi, Lopez, Rodrigo, Gibson, Toby J, Higgins, Desmond G, Thompson, Julie D. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. (2003) Nucleic Acids Res 31 (13):3497-500にしたがって、インターネットアドレスhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#によって、下記のパラメーターを用いて決定することもできる:
DNAギャップオープンペナルティ(DNA Gap Open Penalty) 15.0
DNAギャップエクステンションペナルティ(DNA Gap Extension Penalty) 6.66
DNAマトリックス(DNA Matrix) Identity
タンパク質ギャップオープンペナルティ(Protein Gap Open Penalty) 10.0
タンパク質ギャップエクステンションペナルティ(Protein Gap Extension Penalty)0.2
タンパク質マトリックス(Protein matrix) Gonnet
タンパク質/DNA ENDGAP(Protein/DNA ENDGAP) -1
タンパク質/DNA GAPDIST(Protein/DNA GAPDIST) 4
さらに、本発明の酵素の機能的変異体を作製する方法が、当業者に知られている。
- 部位特異的変異誘発、この方法では、遺伝子の1つもしくは複数のヌクレオチドを標的化された方法で置き換える(Trower MK (ed.) 1996; In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey);
- 飽和変異誘発、この方法では、遺伝子の任意の望ましい位置で、任意の望ましいアミノ酸に対するコドンを置換または付加することができる(Kegler-Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22:1593; Barettino D, Feigenbutz M, Valcarel R, Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22:541; Barik S (1995) Mol Biotechnol 3:1);
- エラープローンポリメラーゼ連鎖反応(エラープローンPCR)、この方法では、不完全なDNAポリメラーゼによりヌクレオチド配列を変異させる(Eckert KA, Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18:3739);
- SeSaM法(配列飽和法)、この方法では、好ましい置換がポリメラーゼによって妨げられる(Schenk et al., Biospektrum, Vol. 3, 2006, 277-279);
- ミューテーター株への遺伝子の挿入、この場合、たとえば不完全なDNA修復メカニズムのために、ヌクレオチド配列の変異率の増加が生じる(Greener A, Callahan M, Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique using an E.coli mutator strain. In: Trower MK (ed.) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey);または
- DNAシャフリング、この方法では、近縁遺伝子のプールを作製して消化し、その断片をポリメラーゼ連鎖反応のテンプレートとして使用するが、鎖分離と再アニーリングを繰り返すことによって、最終的に全長のモザイク遺伝子が生成する(Stemmer WPC (1994) Nature 370:389; Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:10747)。
(1) 142〜153(ループ2)および
(2) 190〜211(ヘリックスαFG1)
(3) 93〜96(ループ1)
(4) 241〜249(C末端)
(5) 138〜141(結合ポケットの親水性領域)ならびに
(6) Cys61および/またはCys 83。
さらに、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を調節核酸配列の遺伝的制御下に含有する発現構築物;ならびにこれらの発現構築物の少なくとも1つを含有するベクターを提供する。
文脈に応じて、「微生物」という用語は、野生型の微生物もしくは遺伝的に改変された組換え微生物、またはその両者を意味すると理解することができる。
本発明はさらに、本発明のポリペプチド、もしくは機能的、生物学的に活性のあるその断片を組換え調製する方法を提供するが、その方法はポリペプチド産生微生物を培養すること、必要に応じてポリペプチドの発現を誘導すること、ならびに培養物からポリペプチドを単離することを含んでいる。ポリペプチドは、必要ならば、このようにして工業規模で製造することもできる。
本発明の酵素は、遊離の状態で、または固定化された形で、本明細書に記載の方法に使用することができる。固定化酵素は、不活性担体に固定された酵素を意味すると理解される。適当な担体材料およびそれに固定化される酵素は、EP-A-1149849、EP-A-1 069 183およびDE A 100193773から、ならびにそれらに引用された元の文献から公知である。これに関連して、上記の明細書の記述を全体として参考とする。適当な担体材料には、たとえば、粘土、粘土鉱物、たとえばカオリナイト、珪藻土、パーライト、二酸化ケイ素、酸化アルミニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロース粉末、アニオン交換体、合成ポリマー、たとえばポリスチレン、アクリル樹脂、フェノールホルムアルデヒド樹脂、ポリウレタンおよびポリオレフィン(ポリエチレンおよびポリプロピレンなど)がある。担体材料は、担体に結合した酵素を作製するために、通常、微粉化された粒子の形で使用されるが、多孔質の形状が好ましい。担体材料の粒径は、通常5 mm以下、特に2 mm以下である(粒度曲線)。同様に、デヒドロゲナーゼをホールセル触媒として使用する場合、遊離型もしくは固定化型を使用することができる。担体材料はたとえば、アルギン酸カルシウムおよびカラギーナンである。酵素は、細胞と同様に、グルタルアルデヒドを用いて直接架橋することができる(架橋してCLEAとなる)。対応する固定化法および他の固定化法が、たとえば、K. Drauz and H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, vol. III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheimの中でJ. Lalonde and A. Margolin “Immobilization of Enzymes” に記載されている。本発明の方法を実施するための、生体内変換およびバイオリアクターに関するさらに詳しい情報は、たとえば、Rehm et al (Ed) Biotechology, 2nd edition, vol. 3, chapter 17, VCH, Weinheimにも見いだすことができる。
1.1 分子モデリング
変異体は、酵素フェニルエタノールデヒドロゲナーゼEbN1の結晶構造(図2)を参考にして選択された。
初めに、Y151XおよびT192Xの位置で別々に飽和変異導入を行った(すなわちY151およびT192の位置を他のすべての19アミノ酸と置き換える、permutationとも呼ばれる)後、二重変異体(Y151A-T192X)を作製した。
ebn1H遺伝子断片を増幅するためのPCRを以下のように行った:100μlの反応混合物は、1μlテンプレート(約50 ngのベクターpDHE-ebn1H)、それぞれの場合について1μlオリゴヌクレオチド(20 ng)、2μl dNTPMix(Roche製、終濃度10 mM)、1μl Pfu-Ultra DNAポリメラーゼ(1 U/μl、Stratagene製)、10μl 10X Pfu-Ultraバッファー(Stratagene)、および80μl滅菌水を含有した。
1a) PCRオリゴヌクレオチド1および3 (T192Xについては6)
1b) PCRオリゴヌクレオチド2および4 (T192Xについては5)
2) PCR 1aおよびbから得られた産物をテンプレートとして、PCRオリゴヌクレオチド1および2(オーバーラップエクステンション)。
初めに、ベクターpDHE-ebn1H-Y151XまたはpDHE-ebn1H-T192X(さらに後にpDHE-ebn1H-Y151A-T192X)を、菌株LU12037 (大腸菌派生株TG10 pAgro4 pHSG575 (TG10:大腸菌TG1に由来するRhaA- 派生株(Stratagene);pAgro4:Takeshita, S; M; M; Masahashi, W; T (1987) Gene 61, 63-74;pHSG575:T. Tomoyasu et al (2001), Mol. Microbiol. 40 (2))に形質転換したが、この菌株は、シャペロンGroEL/Sおよびlaclqリプレッサーを同時発現するものであって、Q-trayプレート上に蒔いて培養した。増殖したコロニーを、ピッキングロボット(Qpix)を用いて採取し、マイクロタイタープレート(MTP)内で抗生物質(100μMアンピシリン、20μMクロラムフェニコールおよび100μMスペクチノマイシン)を含有するCG前培養(Circular Growth, Gibco)に接種した。37℃にて200 rpmで5時間増殖させた後、細胞を、抗生物質(上記)および対応するインデューサー(ラムノース0.5 g/lおよびIPTG 0.1 mM)を含有するLB本培養に手作業で移した。16-18時間増殖後、細胞をテストに使用する。
TAC反応産物TACAまたは反応中に形成された二次的成分が、その反応を阻害することが判明している。基質は完全には変換されなかった。この反応は平衡反応であるにもかかわらず、たとえば4時間後に、細胞および/または基質が新たに添加されたが、それでそれ以上の反応は起こらなかった。さらに、結果として生じる2-ブタノンは、平衡をできる限り生成物側にシフトさせるために、蒸留により除去された。これらの方策にもかかわらず、完全な変換は達成されなかった。
ここで、アミノ酸位置ごとのクローンで満たされた2つのマイクロタイタープレート(96ウェル)が選定された。マイクロプレートは完全に配列決定され、値は個々の変異に当てはめられた。
テスト1)NADHを添加してTACからTACAへ還元
798.6μl 脱塩水
50μl 1M NaH2PO4 pH5
50μl NADH(100 mM原液(水溶液))
1.4μl TAC
100μl 振盪フラスコから得られた培養物の10倍濃縮粗抽出物
1000μl 最終容量
テスト2)完全な反応
730μl 脱塩水
50μl 1M NaH2PO4 pH5
20μl NAD 10 mM水溶液
100μl 100 mM TAC(1mlイソプロパノール中14μl)
100μl 振盪フラスコから得られた培養物の10倍濃縮粗抽出物
1000μl 最終容量
テスト3)TACAからTACへの酸化
798.6μl 脱塩水
50μl 1M NaH2PO4 pH5
50μl NAD(10 mM原液)
1.4μl TACA
100μl 振盪フラスコから得られた培養物の10倍濃縮粗抽出物
1000μl 最終容量
上記テストにおいて、テスト温度はいずれの場合も30℃とし、酵素濃度は0.1-10mg/mlとした。
TACA = 1.283分 (230 nm)
TAA = 0.910分 (230 nm)
TA = 1.168分 (260 nm)
TAC = 1.540分 (260 nm)
実験結果を次項にまとめる。
図6Aは、変異体T192LおよびT192Gが対照のLU11558よりも速やかにTACを減少させることを示す。しかしながら、完全な反応(図6B)を考えると野生型の方が活性が高く、それは他の変異体が同じように補酵素を再生することができないためである。
図7Aにおいて、変異体Y151AおよびY151Hは補因子TACを、野生型(LU11558)より約4-5倍早く減少させることが分かる。しかしながら、完全な反応である、犠牲アルコール(ここでは2-プロパノール)を用いた補酵素再生を伴うTACからTACAへの還元を考えると、変異体Y151Aだけがなお活性がある(図7B)。全体を通しての活性は、対照の場合よりいくぶん低い。結合ポケットを大きくした結果として、「小さい」イソプロパノールは、反応器内で使用される2-ブタノールほど酸化反応をしない可能性がある。変異体Y151AおよびY151Hは、野生型より良好にTACAを酸化することができる(図7C)。
変異体Y151Aが野生型より優れているので、この変異体を基に、第2の飽和変異導入をT192Xの位置で行った。
上記スクリーニングに由来する活性の高い変異体Y151Aは、21 lスケールで数回発酵させた。ラージスケールで対照LU11558と比較するために、一連の標準的な反応器バッチを実行した。
攪拌機および冷却器を取り付けた加熱可能な4 l反応器内で、初めに2 lの2-ブタノールを20 mM KH2PO4 バッファーpH 5.0に入れた。0.2 mM NAD (0.5 g) および400 mM TAC (275 g) もしくは 600 mM (420 g)を添加した。生体触媒(450 ml、7.0 g/l BTM)をホールセル(未処理の発酵産物)の形で添加することによって、反応をスタートさせた。発酵培地中の細胞を添加した時点で、pHは6に上昇した。二相反応混合物は、40℃にて減圧(100 mbar)下で攪拌した。ここで、2-ブタノール、2-ブタノンおよび水の混合物を、一段階で留去した。同時に、同量の、69%2-ブタノールおよび31%H2Oからなる溶液(2-ブタノンは別として蒸留物の組成に相当する)をフィードとして添加した。pH測定装置を用いてpHをチェックし、約5.5-6.0の間で一定に維持した。1時間ごとにサンプルを採取し、濃塩酸で反応を止め、HPLC(LJ31366)により分析した。8時間後、反応混合物を取り出した。
変異体がより大量の生成物/二次的成分に耐えられるかどうかをみるために、初めに、400 mM(70 g/l)TACとともに、次に600 mM(105 g/l)TACとともに、変異体について数回4 l反応器を運転した。
合理的な計画によって、野生型より15-20%活性が高く、しかもデュロキセチンアルコールの中間体の調製中に、より大量のTACAおよび/またはTAに耐えられる変異体Y151A(LU14759)見いだすことができた。
2.1 ロボット設備のテスト開発
ランダム変異導入により作製される多数のサンプルを処理するために、(生成物を直接検出する)実験室におけるこれまでのHPLC分析の代わりに、ロボット生産ラインのための光度測定法を開発する必要があった。
細胞は上記のように培養した後破壊した。MTPにカバーを付けて、ロボット装置内の15℃のインキュベーターに入れた。Multidropにおいて、ウェルあたり100μlの水を、その後Packardにおいて細胞を再懸濁するために添加した。その後Multidropにおいて、基質溶液(終濃度:2 mM TAC、0.2 mM NADH、50 mM NaH2PO4 pH 5.0)を加え、NADHの減少を光度計で340nmにて測定した。
細胞を培養した後破壊した。MTPにカバーを付けて、ロボット装置内の15℃のインキュベーターに入れた。Multidropにおいて、ウェルあたり100μlの水を、次に細胞を再懸濁するために添加した。これらから、細胞懸濁液20μl/ウェル(補酵素再生アッセイ用)もしくは70μl/ウェル(TAC還元アッセイ用)の2つの娘プレートが作製された。基質溶液(終濃度:還元:2 mM TAC、0.2 mM NADH、50 mM NaH2PO4 pH 5.0;再生: 100 mM 2-ブタノール、1.75 mM NAD、80 mM TrisHCl pH 8.0)を加え、NADHの生成を光度計で340nmにて測定した。
ロボットスクリーニングにおいて、NADHの生成/減少(還元/酸化)は光度計で測定した。このために、いずれの場合も、10個の測定値を10分間にわたって確認した。これらの値から増加を計算することによって、デヒドロゲナーゼの初発の活性を測定した。
予備的な実験は、反応中に形成される生成物TACAまたは二次的成分が反応を阻害することを示した。基質は完全には変換されなかった。
デヒドロゲナーゼをコードする配列内に変異を生じさせるために、エラープローンPCR反応を、MnCl2を添加して実施した。MnCl2とともに使用されたTaq-DNAポリメラーゼの特異性は低下したので、その結果として、MnCl2濃度が上昇すると、より多くの間違ったヌクレオチドが組み込まれ、したがってより多くの変異が生じる。
50μl PCRバッチ中:デヒドロゲナーゼ遺伝子を有する50 ngプラスミドDNA(pDHE-ebn1H)、それぞれの場合ごとに120 ngオリゴヌクレオチド、GCリッチ反応バッファー1x (Roche)、1/5容 GCリッチレゾリューション (Roche)、それぞれの場合ごとに0.2 mM dATP、dTTP、dCTP、dGTP、1 U Taq DNAポリメラーゼ。
上記の表1は、ロボットテストから選択されたクローンの概要を示す。これらのクローンは検証プレートから得られ、完全に配列決定された。これらをラージスケールで培養し、始めにエッペンドルフでテストした。しかしながら、変異体の大半の活性は、野生型と同程度であった。活性の高い変異体、たとえば、K114TおよびM200V F201Lは、21 lスケールで発酵培養し、0.5 l反応器でテストした。
追加して標的化された、選択された位置で、検討済みの単一変異(「部位特異的変異導入」)または飽和変異導入を実施した。
酵素の基質結合ポケットは、ループ1、2およびヘリックスαFG1(図2)により形成される。大半の変異がこの領域から選択されたのは、これらのアミノ酸が基質結合および/または酵素活性に直接影響を及ぼすことが予想されるからである。
始めに、DNA変異のそれぞれの位置について、望ましいDNA配列に対応する2つの相補的オリゴヌクレオチド(表2)を選択した。それに加えて、遺伝子全体に隣接するオリゴヌクレオチドをさらに2つ選択した(Mke123およびMke124、配列番号5および6)。部位特異的変異導入のクローニングストラテジーを図12に示す。
図13Aは、NADHを添加したTACからTACAへの還元、ならびに再生を伴う全体としての反応(黒い棒グラフ)の両者を2.2項に記載のように検討した活性テストから得られた結果を示す。図13Bでは、再生を伴う全体反応のみ調べた。
Claims (27)
- 配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するAzoarcus菌種のフェニルエタノールデヒドロゲナーゼEbN1に由来する、機能的なフェニルエタノールデヒドロゲナーゼ変異体。
- 配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するAzoarcus菌種のフェニルエタノールデヒドロゲナーゼEbN1に由来する、機能的なフェニルエタノールデヒドロゲナーゼ変異体であって、その変異体が明細書の表1に記載の変異体から選択される、前記変異体。
- 配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するAzoarcus菌種のフェニルエタノールデヒドロゲナーゼEbN1に由来する、機能的なフェニルエタノールデヒドロゲナーゼ変異体であって、その変異体が、
(1) 142〜153(ループ2)および
(2) 190〜211(ヘリックスαFG1)
から選択される少なくとも1つの配列領域内に、少なくとも1つの変異を有する、前記変異体。 - (3) 93〜96(ループ1)
(4) 241〜249(C末端)
(5) 138〜141(結合ポケットの親水性領域)および
(6) Cys61および/またはCys 83
から選択されるもう1つの配列領域内に、少なくとももう1つの変異を追加して有する、請求項2に記載の変異体。 - 下記の基:T192、L197、M200、F201、L204、M246、L139、T140、T142、L146、I148、Y151、C61、C83、L186、のうち少なくとも1つが変異しており、そのそれぞれのアミノ酸が任意の望ましい他の天然アミノ酸で置き換えられている、請求項3または4に記載の変異体。
- 下記の変異:
a)単一変異:
Y151XA、このXAはA、R、N、E、Q、G、H、I、L、M、TまたはVである;
T192XB、このXBはA、E、G、I、P、S、W、VまたはLである;
b)多重変異:
Y151XA T192XB、このXA およびXB は上記の意味を持つ;
のうち少なくとも1つを有する変異体から選択される、請求項1〜5のいずれか1つに記載の変異体。 - 下記の改変された部分配列:
(1) 142-TTYWX1KX2EAX3T-153(改変ループ2)および
(2) 190-ATX4EASAX5 SAX6X7DVX8PNMLQAI-211(改変ヘリックスαFG1)
のうち少なくとも1つによって特徴付けられる、請求項1〜6のいずれか1つに記載の変異体であって、
これらの配列中、X1 〜X8は、互いに無関係に、任意の望ましいアミノ酸基であるが、基X1 〜X3 およびX4 〜X8の少なくとも1つは、配列番号2に記載の天然型酵素の天然アミノ酸基ではない、前記変異体。 - X1 はLである、またはI、V、A、M、FもしくはHで置換されている、
X2 はIである、またはL、V、A、M、FもしくはHで置換されている、
X3 はYである、またはA、R、N、E、Q、G、H、I、L、M、TもしくはVで置換されている;
あるいは、
X4 はTである、またはA、E、G、I、P、S、W、VもしくはLで置換されている、
X5 はLである、またはI、V、A、M、FもしくはHで置換されている、
X6 はMである、またはY、W、E、V、S、R、Q、K、I、H、G、F、EもしくはDで置換されている、
X7 はFである、またはG、K、T、Y、M、WもしくはRで置換されている、
X8 はLである、またはI、V、A、M、FもしくはHで置換されている、
請求項7に記載の変異体。 - 配列番号2のデヒドロゲナーゼの酵素活性の、すくなくとも約50%を依然として有する、請求項1〜8のいずれか1つに記載の変異体。
- 配列番号2に対して少なくとも約70%の配列同一性を有する、請求項1〜9のいずれか1つに記載の変異体。
- 上記領域(1)〜(6)における少なくとも1つの変異に加えて、アミノ酸基の25%までが、配列番号2と比較して、付加、欠失、挿入、置換、逆位もしくはそれらの組み合わせにより改変されている、請求項1〜10のいずれか1つに記載の変異体。
- 請求項1〜12のいずれか1つに記載の変異体をコードする核酸配列。
- 少なくとも1つの調節核酸配列に機能的に連結された、請求項13に記載の少なくとも1つの核酸配列を含んでなる、発現カセット。
- 請求項14に記載の少なくとも1つの発現カセットを含んでなるベクター。
- 少なくとも1つの、請求項13に記載の核酸配列、請求項14に記載の発現カセット、または請求項15に記載のベクターを含んでなる、組換え微生物。
- 請求項1〜12のいずれか1つに記載の変異体を製造する方法であって、請求項16に記載の組換え微生物を培養すること、その変異体をコードする核酸配列を発現させること、ならびに、必要に応じて発現産物を単離することを含んでなる、前記方法。
- C1〜C6一価アルコールを犠牲アルコールとして使用して、還元当量再生条件下で反応が行われる、請求項18に記載の方法。
- Cycがヘテロ環基、特にチエニル基である、請求項18または19に記載の方法。
- 基本的に鏡像体として純粋な式(II)のアルコール、特に(S)-鏡像異性体が与えられる、請求項18〜20のいずれか1つに記載の方法。
- 変異体が単離された状態で使用され、その結果、変異体は、適宜、固体担体に固定化されている;または、適宜、固体担体に固定化された微生物細胞内で発現される、請求項18〜21のいずれか1つに記載の方法。
- 犠牲ケトンとしてC1〜C6一価アルカノンを用いて、酸化当量再生条件下で反応が行われる、請求項24に記載の方法。
- 変異体が単離された状態で使用され、その結果、変異体は、適宜、固体担体に固定化されている;または、適宜、固体担体に固定化された微生物細胞内で発現される、請求項24または25に記載の方法。
- デュロキセチンアルコールおよび/またはデュロキセチンの調製における、請求項1〜12のいずれか1つに記載の変異体の使用。
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