CN101056984B - 制备旋光醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备S-丁-2-醇的酶方法；并且涉及用于进行所述方法的酶；涉及编码所述酶的核酸序列，涉及包含所述核酸序列的表达盒、载体和重组宿主。

Description

制备旋光醇的方法
描述
本发明涉及通过在醇脱氢酶存在时还原丁-2-酮来制备(S)-丁-2-醇的方法。
现有技术
已经描述了使用多种生物催化剂将丁-2-酮还原成丁-2-醇[J.Org.Chem.(1992)57：1526，Chemistry Letters(1987)2089，Arch.Biochem Biophys.(1992)292：539]。
但是，这些研究没有报道任何对映选择性。此外，还公开了R-丁-2-醇的制备[J.Am.Chem.Soc.(1986)108：162]。但是在此情形中，得到了只有48％ee的对映选择性。
Nakamura等人[Tetrahedron：Asymmetry(2003)14：2659，Tetrahedron：Asymmetry(2002)13：971]已经阐明了S-丁-2-醇的生物催化合成已经达到了94％ee的对映选择性。在这些研究中，使用干燥的白地霉(Geotrichumcandidum)细胞。但是没有详细描述催化上述反应的酶。
发明目标
目标是提供通过丁-2-酮的对映选择性还原制备(S)-丁-2-醇的方法，所述方法生产了高化学产量的具有最大对映纯度的(S)-丁-2-醇。
发明描述：
本发明涉及通过在醇脱氢酶存在时还原丁-2-酮来制备(S)-丁-2-醇的方法，所述醇脱氢酶
(i)具有多肽序列SEQ ID NO：2，或者
(ii)具有与SEQ ID NO：2的序列有至少80％同一性的多肽序列。
适合于本发明方法的醇脱氢酶(在下文中缩写为ADH)是那些能够在依赖NAD+的反应中氧化2-丙醇以提供2-丙酮的ADH。
另外，适合于本发明方法的ADH具有SEQ ID NO：2的多肽序列或与SEQ ID NO：2的序列有至少80％、优选是至少90％、特别优选是至少95％并且特别是至少97％、98％或99％同一性的序列。
具有SEQ ID NO：2的多肽是可从大肠杆菌(Escherichia coli)中得到的丙醇脱氢酶[Swissprot：基因座ADHP_ECOLI，登录P39451；GenBank ID48994873区：互补序列(1550852到1551892；[Science(1997)277：1453]。在实验部分中描述了此酶的分离。
其它适当的ADH是它们的多肽序列与SEQ ID NO：2有上述一种序列同一性的那些。
为了在本文中描述的目的，通过University of Wisconsin的GeneticsComputer Group(GCG)的“GAP”计算机程序确定序列同一性，所述程序使用版本10.3，使用GCG所建议的标准参数。
从SEQ ID NO：2开始，此类ADH可以通过技术人员已知的特异性或随机诱变方法得到。但是可选地，还可以筛选微生物中的ADH，所述ADH催化2-丙醇的相应的氧化以提供2-丙酮并且它们的氨基酸序列已经与SEQ ID NO：2具有所需序列同一性或者是通过诱变方法得到的，所述的微生物优选是下列属的那些：Alishewanella、交替球菌属(Alterococcus)、Aquamonas、Aranicola、杀雄菌属(Arsenophonus)、Azotivirga、Brenneria、Buchnera(aphid P-endosymbionts)、布戴维采菌属(Budvicia)、布丘氏菌属(Buttiauxella)、Candidatus Phlomobacter、西地西菌(Cedecea)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、Dickeya、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏菌属(Escherichia)、爱文氏菌属(Ewingella)、Grimontella、哈夫尼菌属(Hafnia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、克吕沃尔菌属(Kluyvera)、勒克氏菌属(Leclercia)、勒米诺氏菌属(Leminorella)、米勒氏菌属(Moellerella)、摩根氏菌属(Morganella)、肥杆菌属(Obesumbacterium)、泛菌属(Pantoea)、果胶杆菌属(Pectobacterium)、光杆状菌属(Photorhabdus)、邻单胞菌属(Plesiomonas)、布拉格菌属(Pragia)、变形菌属(Proteus)、普罗威登斯菌属(Providencia)、拉恩氏菌属(Rahnella)、拉乌尔菌属(Raoultella)、沙门氏菌属(Salmonella)、Samsonia、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、Sodalis、塔特姆菌属(Tatumella)、Trabulsiella、Wigglesworthia、致病杆菌属(Xenorhabdus)、耶尔森氏菌属(Yersinia)和预研菌属(Yokenella)。
可以以纯化的或部分纯化的形式，或者以微生物本身的形式来使用ADH。从微生物中回收和纯化脱氢酶的方法是技术人员所充分了解的，例如从K.Nakamura & T.Matsuda，“Reduction of Ketones”in K.Drauz和H.Waldmann，Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002，第III卷，991-1032，Wiley-VCH，Weinheim，Germany中了解。生成脱氢酶的重组方法同样是已知的，例如从W.Hummel，K.Abokitse，K.Drauz，C.Rollmann和H.
Figure G200580038467420070514D000031
Adv.Synth.Catal.2003，345，No.1+2，第153-159页已知。
用ADH进行对映选择还原优选在适当的辅因子(也称作共底物)存在时进行。通常用于还原酮的辅因子是NADH和/或NADPH。另外，可以使用ADH作为细胞***，其遗传性包含辅因子或可以添加备选的氧化还原介体(A.Schmidt，F.Hollmann和B.Bühler“Oxidation of Alcohols”in K.Drauz和H.Waldmann，Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002，第III卷，991-1032，Wiley-VCH，Weinheim)。
此外，优选在适当的还原剂存在时用ADH进行对映选择性还原，所述的还原剂再生出在还原期间被氧化的辅因子。适当的还原剂的实例是糖，特别是己糖，如葡萄糖、甘露糖、果糖，和/或可氧化的醇，特别是乙醇、丙醇或异丙醇，以及甲酸、亚磷酸或分子氢。为了氧化还原剂并且与之相联系地再生出辅酶，可以添加另一种脱氢酶，例如如果使用的还原剂是葡萄糖则是葡萄糖脱氢酶，或者如果使用的还原剂是甲酸，则是甲酸脱氢酶。所述另一种脱氢酶可以作为游离酶或固定化酶使用，或以游离细胞或固定化细胞形式使用。它的制备可以分开进行或通过在(重组的)脱氢酶菌株中共表达进行。
所要求的方法的优选实施方案是通过酶***再生辅因子，该酶***中使用另一种脱氢酶，特别优选是葡萄糖脱氢酶。
本发明另外涉及ADH制备(R)-丁-2-醇的用途。在此方法的实施方案中，将外消旋的丁-2-醇与ADH反应，其中(S)-丁-2-醇被选择性氧化以提供丁-2-酮，同时(R)-丁-2-醇仍然未改变。随后，将得到的丁-2-酮和(R)-丁-2-醇混合物通过常规方法例如蒸馏来分级分离，并且因此将(R)-丁-2-醇以纯的形式分离。
用在此实施方案中的优选的辅因子是NAD+和NADP+，其可以用适当的共底物(氧化剂)再次再生。可以用在本文中的优选的共底物是丙酮，它与已经存在的ADH和/或另外使用的脱氢酶一起再生出辅因子并且在此方法中被还原成异丙醇。
“对映选择性”意思是为了本发明目的，按照已知方式，根据
ee(％)＝S-对映异构体-R-对映异构体/(S-对映异构体-R-对映异构体)×100
计算出的S-对映异构体的对映异构体过量ee(以％)至少是80％，优选至少是90％，特别至少是95％并且尤其至少是97％。
根据本发明使用的ADH可以以游离形式或固定化形式使用。固定化酶是指固定到惰性支持体上的酶。适当的支持体材料和固定到其上的酶公开在EP-A-1149849、EP-A-1069183和DE-A 100193773以及在其中引用的参考文献中。在此问题上，完整引用这些出版物的公开。适当的支持体材料的实例是粘土、粘土矿物如高岭石、硅藻土、珍珠岩、二氧化硅、氧化铝、碳酸钠、碳酸钙、纤维素粉、阴离子交换剂材料、合成聚合物如聚苯乙烯、丙烯酸类树脂、酚醛树脂、聚氨基甲酸酯和聚烯烃如聚乙烯和聚丙烯。通常使用细分的微粒形式的支持体材料用于制备受支持的酶，优选是提供多孔形式。支持体材料的颗粒大小通常不大于5mm，特别不大于2mm(筛等级)。类似地，当使用脱氢酶作为全细胞催化剂时，可以选择游离形式或固定化形式。支持体材料的实例是藻酸钙和角叉菜聚糖。酶和细胞还可以直接与戊二醛连接(交联以产生CLEA)。还描述了对应的和其它固定化方法，如在J.Lalonde和A.Margolin“Immobilization of Enzymes”inK.Drauz和H.Waldmann，Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002，第III卷，991-1032，Wiley-VCH，Weinheim中所述。
反应(丁-2-酮还原成丁-2-醇)可以在水性反应介质或非水性反应介质或在2相***或(微)乳液中进行。水性反应介质优选是缓冲的溶液，其通常具有从4到8，优选从5到8的pH。除水外，水性溶剂还包含至少一种醇，例如乙醇或异丙醇或二甲亚砜。
非水性反应介质是指包含少于反应介质总量的1％(重量)，优选少于0.5％(重量)的水的反应介质。反应优选在有机溶剂中进行。
适当的溶剂的实例是优选具有5到8个碳原子的脂族烃，如戊烷、环戊烷、己烷、环己烷、庚烷、辛烷或环辛烷；优选具有1或2个碳原子的卤代脂族烃，如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷或四氯乙烷；芳香烃如苯、甲苯、二甲苯、氯苯或二氯苯；优选具有4到8个碳原子的脂族无环或环状醚或醇，如二***、甲基·叔丁基醚、乙基·叔丁基醚、二丙醚、二异丙醚、二丁醚；四氢呋喃或酯如乙酸乙酯或乙酸正丁酯，或酮如甲基·异丁基酮或二噁烷或其混合物。特别优选是使用上述醚，特别是四氢呋喃。
用ADH的还原优选在水性-有机反应介质中，特别是水性反应介质中进行。
优选在0.1g/l到500g/l(特别优选是从1g/l到50g/l)的浓度下在酶还原中使用丁-2-酮，随后可以将其连续或分批供给。
酶还原通常在低于所使用脱氢酶失活温度并且高于-10℃的反应温度下进行。所述温度特别优选在0到100℃范围之间，特别是从15到60℃并且尤其是从20到40℃，例如大约30℃。
步骤可以包括，例如，最初将丁-2-酮中引入ADH，溶剂，以及辅酶(根据需要)、用于再生辅酶的另一种脱氢酶(根据需要)，和/或另外的还原剂，并且将混合物混合，例如通过搅拌或摇动。但是，还可以将脱氢酶固定到反应器(例如柱)中，并且使包含丁-2-酮和辅酶(根据需要)和/或共底物的混合物穿过反应器。为此目的，混合物可以通过反应器循环直到实现所需转化。在方法中，将丁-2-酮的酮基还原成OH基团，主要产生了醇的(S)-对映异构体。还原通常完成到基于混合物中存在的丁-2-酮，转化率为至少70％，特别优选至少85％并且特别是至少95％。反应的进行(即酮的连续还原)在此可以通过常规方法如气相色谱或高压液相色谱来监控。
本发明还包含具体公开的具有丁-2-醇-脱氢酶活性的酶的“功能等同物”的用途。
对于本发明的目的，具体公开的酶的“功能等同物”或类似物是这样的多肽，其与所述具体公开的酶不同并且另外具有所需的生物学活性如底物特异性。因此，例如“功能等同物”是指这样的酶，其将丁-2-酮还原成相应的S-醇并且具有包含在SEQ ID NO：2下所列出的任意氨基酸序列的酶的活性的至少20％，优选50％，特别优选75％，非常特别优选90％。此外，功能等同物优选在pH4到10之间稳定，并且优选具有在pH5和8之间的最适pH，以及在20℃到80℃范围内的最适温度。
根据本发明，“功能等同物”特别还指这样的突变体，它在上述氨基酸序列的至少一个序列位置中具有不同于具体提到的氨基酸的氨基酸，但是仍然具有上述生物学活性的一种。因此“功能等同物”包含通过一种或多个氨基酸添加、置换、缺失和/或倒位得到的突变体。所述修饰可以发生在任何序列位置，只要它们产生了具有本发明性质模式的突变体。如果突变体和未修饰多肽之间的反应模式质量上对应，即例如同样的底物以不同的速度反应，那么也存在功能等同。
可以在下表中找到适当的氨基酸置换的实例：
原始残基                    置换实例
Ala                         Ser
Arg                         Lys
Asn                         Gln；His
原始残基        置换实例
Asp             Glu
Cys             Ser
Gln             Asn
Glu             Asp
Gly             Pro
His             Asn；Gln
Ile             Leu；Val
Leu             Ile；Val
Lys             Arg；Gln；Glu
Met             Leu；Ile
Phe             Met；Leu；Tyr
Ser             Thr
Thr             Ser
Trp             Tyr
Tyr             Trp；Phe
Val             Ile；Leu
在上述意义中“功能等同物”还是所述多肽的“前体”并且还是“功能衍生物”。
在本上下文中，“前体”是具有或不具有所需生物学活性的多肽的天然或合成前体。
本发明多肽的“功能衍生物”同样可以借助于已知技术在功能性氨基酸侧基或在它们N-末端或C-末端制备。此类衍生物包含，例如羧酸基团的脂族酯、羧酸基团的酰胺，该酰胺是通过与氨或与伯胺或仲胺反应可得到的；游离氨基的N-酰基衍生物，该衍生物是通过与酰基基团反应制备的；或游离羟基基团的O-酰基衍生物，该衍生物是通过与酰基基团反应制备的。
在可能的蛋白质糖基化情形中，本发明的“功能等同物”包括去糖基化形式或糖基化形式的上述类型的蛋白质，并且还包括通过改变糖基化方式得到的修饰形式的上述类型的蛋白质。
“功能等同物”自然还包括可以从其它生物中得到的多肽以及天然存在的变体。例如，可以通过序列比较建立同源序列区的区域，并且可以在本发明具体指导的基础上确定等价酶。
“功能等同物”同样包含本发明多肽的片段，优选单独结构域或序列基序，例如该片段具有所需的生物学功能。
此外，“功能等同物”是融合蛋白质，其包含任意的上述多肽序列或来自其的功能等同物，以及至少一种其它异源序列，所述的异源序列与其功能上不同并且在N末端或C末端功能性连接(即没有融合蛋白质部分的任何实质的相互功能削减)。例如，此类异源序列的非限制性实例是信号肽或酶。
本发明蛋白质的同源物可以通过筛选突变体(例如截短突变体)的组合文库来鉴定。例如，蛋白质变体的多样文库可以通过核酸水平上的组合诱变来生成，例如通过酶促连接合成的寡核苷酸混合物。有大量的方法可以用来从简并的寡核苷酸序列制备潜在同源物文库。简并的基因序列可以在DNA合成仪中化学合成并且之后将合成的基因连接到适当的表达载体中。使用简并集合的基因使得在一种混合物中制备编码所需集合的潜在蛋白质序列的所有序列成为可能。技术人员已知合成简并寡核苷酸的方法(例如Narang，S.A.(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura等人(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等人，(1984)Science 198：1056；Ike等人(1983)Nucleic Acids Res.11：477)。
在现有技术中已知筛选通过点突变或截短制备的组合文库的基因产物和筛选cDNA文库中的具有所选择性质的基因产物的多种方法。可以使这些技术适合于快速筛选通过本发明同源物组合诱变生成的基因文库。筛选进行高通量分析的大基因文库的最常用技术包括：将基因文库克隆到可复制的表达载体中，用得到的载体文库转化适当的细胞，并且在这样的条件下表达组合基因，在所述条件下，所需活性的检测促进了载体的分离，将检测该载体编码的基因的产物。循环总体诱变(REM)，即增加文库中功能性突变体频率的技术，可以与筛选测试组合使用来鉴别同源物(Arkin和Yourvan(1992)PNAS 89：7811-7815；Delgrave等人(1993)ProteinEngineering 6(3)：327-331)。
本发明另外涉及编码具有本发明脱氢酶活性的酶的核酸序列(例如，单链和双链DNA和RNA序列，如cDNA和mRNA)。优选是编码例如SEQID NO：2的氨基酸序列或其特征性部分序列的核酸序列，或包含SEQ IDNO：1的核酸序列或其特征性部分序列的核酸序列。
在本文提到的所有核酸序列可以以本身已知的方式通过从核苷酸构件的化学合成来制备，例如依靠双螺旋的个体重叠的互补核酸构件的片段缩合。例如使用亚磷酰胺方法以已知方式化学合成寡核苷酸(Voet，Voet，第二版，Wiley Press New York，第896-897页)。Sambrook等人(1989)，Molecular Cloning：A laboratory manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress中描述了合成寡核苷酸的装配、借助于DNA聚合酶克列诺(Klenow)片段和连接反应的缺口补平以及一般克隆方法。
本发明还涉及核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列，如cDNA和mRNA)，其编码任一上述多肽和例如通过使用人造核苷酸类似物得到的功能等同物。
本发明涉及编码本发明多肽或蛋白质或其生物学活性部分的分离的核酸分子以及核酸片段，所述核酸片段例如可以用作鉴定或扩增本发明编码核酸的杂交探针或引物。
此外，本发明核酸分子另外包含来自编码基因区的3’和/或5’端的未翻译序列。
本发明另外包含与具体描述的核苷酸序列或其部分互补的核酸分子。
本发明的核苷酸序列使得可能生成探针和引物，所述探针和引物可以用来鉴定和/或克隆在其它细胞类型和生物中的同源序列。此类的探针和引物通常包含核苷酸序列区，其在“严格”条件(见下)下杂交到本发明核酸序列的有义链或相应的反义链的至少约12个，优选至少约25个，例如约40、50或75个连续核苷酸。
将“分离的”核酸分子从在该核酸的天然来源中存在的其它核酸分子中移除，并且此外当该“分离的”核酸分子通过重组技术制备时基本没有其它细胞材料或培养基，或者当它是化学合成时基本没有化学前体或者其它化学品。
本发明的核酸分子可通过标准分子生物学技术和本发明提供的序列信息分离。例如，通过使用一种具体公开的全序列或其部分作为杂交探针并且使用标准杂交技术从适当的cDNA文库中分离出cDNA(如例如在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中所述)。另外，可以通过聚合酶链式反应，基于此类所使用序列构建出的寡核苷酸引物分离出包含任意的公开序列或其部分的核酸分子。可以将以这种方式扩增的核酸克隆到适当的载体中并且通过DNA序列分析表征。还可以使用如自动DNA合成仪通过标准合成方法制备本发明的寡核苷酸。
原则上本发明的核酸序列可以从任何生物中鉴定并且分离出来。优选地，可以从真菌、酵母、古细菌或细菌中分离本发明的核酸序列或其同源物。提到的细菌是革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。本发明核酸优选分离自革兰氏阴性细菌，优选来自α-变形菌门、β-变形菌门或γ-变形菌门，特别优选来自下列目的细菌：酸硫杆状菌目(Acidithiobacillales)、交替单胞菌目(Alteromonadales)、着色菌目(Chromatiales)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、军团菌目(Legionellales)、甲基球菌目(Methylococcales)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)、巴斯德氏菌目(Pasteurellales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、硫发菌目(Thiotrichales)、弧菌目(Vibrionales)、黄色单胞菌目(Xanthomonadales。非常特别优选来自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌。尤其优选来自埃希氏菌属(Escherichia)。尤其优选来自物种Escherichia albertii、蟑螂埃希氏菌(Escherichia blattae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、弗格森埃希氏菌(Escherichia fergusonii)、赫氏埃希氏菌(Escherichia hermannii)、Escherichia senegalensis和伤口埃希氏菌(Escherichia vulneris)。
特别优选是使用来自大肠杆菌的脱氢酶。
例如，通过使用常规杂交方法或PCR技术，例如通过基因组或cDNA文库，从其它生物中分离本发明的核酸序列。这些DNA序列在标准条件下与本发明的序列杂交。对于杂交，优选使用例如来自活性位点的保守区的短寡核苷酸，该保守区可以以技术人员已知的方式通过与本发明脱氢酶比较来鉴定。但是，还可以使用本发明核酸的更长片段或全序列用于杂交。所述标准条件根据所使用核酸(寡核苷酸、更长片段或全序列)或根据哪种核酸类型(DNA或RNA)用于杂交而不同。因此，例如，DNA:DNA杂交体的解链温度比相同长度的DNA:RNA杂交体解链温度低大约10℃。
根据核酸，例如，标准条件是指温度为42和58℃之间，在具有浓度为0.1到5×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH 7.2)的水性缓冲溶液中，或另外存在50％甲酰胺，例如42℃，在5×SSC，50％甲酰胺中。优选地，DNA:DNA杂交体的杂交条件是0.1×SSC，并且温度在大约20℃到45℃之间，优选在大约30℃到45℃之间。对于DNA:RNA杂交体，杂交条件优选是0.1×SSC并且温度在大约30℃到55℃之间，优选在大约45℃到55℃之间。指出的杂交温度是解链温度值，其已经通过例如具有长度大约100个核苷酸并且G+C含量为50％，不存在甲酰胺时来计算。DNA杂交的实验条件在遗传学的专业教科书如Sambrook等人，“Molecular Cloning”，Cold Spring Harbor Laboratory，1989中描述，并且可以使用技术人员已知的公式来计算，例如作为核酸长度、杂交体类型或G+C含量的函数。从下列教科书中，技术人员可以得到杂交的其它信息：Ausubel等人(编著)，1985，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，New York；Hames和Higgins(编著)，1985，Nucleic AcidsHybridization：A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford；Brown(编著)，1991，Essential Molecular Biology：A PracticalApproach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford。
本发明还涉及具体公开的或衍生的核酸序列的衍生物。
因此本发明的其它核酸序列可以来自SEQ ID NO：1并且通过添加、置换、***或缺失单一或两个或更多核苷酸而与之不同，但是仍然编码具有所需性质模式的多肽。
本发明还包含含有“沉默”突变的那些核酸序列，或与具体提到的序列相比，根据具体来源生物或宿主生物的密码子选择已经被改变的那些核酸序列，以及其天然存在的变体，例如剪接变体或等位基因变体。
本发明还涉及通过保守核苷酸置换得到的序列(即所讨论的氨基酸用相同电荷、大小、极性和/或溶解性的氨基酸置换)。
本发明还涉及通过序列多态性来自具体公开的核酸的分子。这些遗传多态性可以在种群中个体间作为天然变异的结果存在。这些天然变异通常在基因的核苷酸序列中引起1到5％的差异。
此外，例如，衍生物意思是与启动子融合。位于指示的核苷酸序列上游的启动子可以通过一个或多个核苷酸置换、***、倒位和/或缺失来改变，但是没有损害启动子的功能和功效。此外，所述启动子的功效可以通过改造它们的序列来增加或可以将启动子用更有活性的启动子(包括来自其它物种生物的那些)完全置换。
衍生物还指这样的变体，在起始密码子上游-1到-1000碱基或从终止密码子下游0到1000碱基的区域中所述变体的核苷酸序列被改变从而改变(优选增加)基因表达和/或蛋白质表达。
本发明另外包含在“严格条件”下与上述编码序列杂交的核酸序列。这些多核苷酸可以通过筛选基因组或cDNA文库找到，并且根据需要，例如通过PCR，使用适当的引物从其中扩增并且之后使用适当的探针分离。另外，本发明的多核苷酸还可以化学合成。此性质是指多核苷酸或寡核苷酸在严格条件下结合几乎互补的序列的能力，但是在这些条件下，在非互补配偶体之间没有形成非特异键。为此目的，序列应当是70-100％，优选是90-100％互补的。能够彼此特异性结合的互补序列的性质用于如RNA或DNA印迹技术中，或用于在PCR或RT-PCR中的引物结合。为此目的，通常使用长度为至少30个碱基对的寡核苷酸。在RNA印迹技术中，例如，严格条件是指使用50-70℃(优选是60-65℃)的洗涤溶液，例如包含0.1％SDS(20×SSC：3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，pH 7.0)的0.1×SSC缓冲液，用于洗脱非特异性杂交的cDNA探针或寡核苷酸。如上所述，仅仅在此仍然彼此结合的核酸是高度互补的那些。严格条件的建立是技术人员已知的并且在例如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中描述。
本发明构建体的实施方案
此外本发明涉及包含受到调节核酸序列遗传调控的编码本发明多肽的核酸序列的表达构建体；并且还涉及包含至少一种这些表达构建体的载体。
本发明的此类构建体优选包含特定编码序列的5’上游启动子和3’下游终止子序列，并且根据需要还包含在每种情形中有效连接编码序列的另外的常规调节元件。
“有效连接”是指启动子、编码序列、终止子，以及根据需要，另外的调节元件以这样的方式的顺序排列，在所述方式中每个调节元件能够实现它在表达编码序列中所需要的功能。有效连接的序列的实例是靶标序列，以及增强子、聚腺苷酸化信号等。其它调节元件包括选择标记、扩增信号、复制起点等。适当的调节序列在例如Goeddel，Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中描述。
本发明核酸构建体特别是指其中将本发明脱氢酶的基因有效或功能性连接到用于调节目的(例如增加基因表达)的一种或多种调节信号的那些。
除了这些调节序列，这些序列的天然调节仍可以存在于实际结构基因的上游，并且根据需要可以以这样的方式被基因改造，在所述方式中关闭了天然调节并且增加了基因表达。但是，核酸构建体还可以有更简单的设计，即在编码序列上游没有***其它调节信号并且天然启动子与其调节一起没有被移除。代替地，以不再有任何调节并且基因表达增加的方式突变天然调节序列。
优选的核酸构建体还有利地包含一种或多种前述增强子序列，其功能性连接到启动子上并且使得核酸序列表达增加。还可以将其它有利的序列如另外的调节元件或终止子***到DNA序列的3’端。本发明的核酸可以以一个或多个拷贝存在于构建体中。根据需要，为了选择所述构建体的目的，构建体还可以包含其它标记如抗生素抗性或增养作用-互补基因。
对于本发明方法有利的调节序列存在于例如启动子中，例如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、λ-PR或λ-PL启动子，将该启动子有利的用在革兰氏阴性细菌中。另外有利的调节序列存在于例如革兰氏阳性启动子amy和SPO2、酵母或真菌启动子ADC1、MFalpha、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。在此背景中例如来自汉逊酵母(Hansenula)的丙酮酸脱羧酶和甲醇氧化酶启动子也是有利的。还可以使用人造启动子用于调节。
为了在宿主生物中表达的目的，将核酸构建体有利地***到载体如质粒或噬菌体中，例如其使得基因能够在宿主中最佳表达。载体是指，除质粒和噬菌体外，还有技术人员已知的任何其它载体，即例如病毒如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒，转座子、IS元件、噬菌粒、黏粒，以及线性或环状DNA。这些载体可以在宿主生物中自主复制或随染色体复制。这些载体构成了本发明另外的实施方案。适当质粒的实例是在大肠杆菌中，pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、lgt11或pBdCI；在链霉菌(Streptomyces)中，pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361；在芽孢杆菌(Bacillus)中，pUB110、pC194或pBD214；在棒杆菌(Corynebacterium)中，pSA77或pAJ667；在真菌中，pALS1、pIL2或pBB116；在酵母中，2αM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23；或在植物中pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。所述质粒是可能质粒的少量选择。其它质粒是技术人员已知的并且可以在例如书籍Cloning Vectors(编著Pouwels P.H.等人Elsevier，Amsterdam-NewYork-Oxford，1985，ISBN 0444904018)中找到。
为了表达存在的其它基因，核酸构建体有利地还包含用于增加表达的3’-端和/或5’端调节序列，其是根据宿主生物和所选择的基因被选择用于最优表达。
这些调节序列用于使基因或蛋白质表达能够特异性表达。根据宿主生物，例如这可以是指基因只有在诱导后表达或过量表达或者它立即表达和/或过量表达。
关于这一点，调节序列或因子可以优选积极影响并且因此增加被引入的基因表达。因此，通过使用强转录信号如启动子和/或增强子，有利地可以在转录水平上增强调节元件。但是，除此之外，例如还可以通过增加mRNA的稳定性来增强翻译。
在载体的另一实施方案中，还可以将包含本发明核酸构建体或本发明核酸的载体以线性DNA的形式有利地引入到微生物中并且通过异源或同源重组整合到宿主生物基因组中。此线性DNA可以由线性载体如质粒组成或仅由本发明的核酸构建体或核酸组成。
为了能够在生物中最佳表达异源基因，有利地根据在生物中使用的特异性密码子选择来改造核酸序列。可以借助于来自所讨论生物的其它已知基因的计算机分析，容易地确定密码子选择。
通过将适当的启动子融合到适当的编码核苷酸序列和终止子信号或聚腺苷酸化信号上来制备本发明的表达盒。常规重组和克隆技术描述在例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)中以及T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.L.Enquist，Experiments with GeneFusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)中，并且在Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience(1987)中用于本目的。
为了实现在适当的宿主生物中的表达，将重组核酸构建体或基因构建体有利地***到使基因能够在宿主中最优表达的宿主特异性的载体中。载体是技术人员已知的并且可以在例如“Cloning Vectors”(Pouwels P.H.等人，编著，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)中找到。
根据本发明有用的宿主生物
借助于本发明载体或构建体，可以制备重组微生物，例如所述重组微生物用本发明至少一种载体转化并且可以用于产生本发明的多肽。有利地，将本发明的上述重组构建体引入到适当的宿主***中并且表达。关于这一点，优选使用技术人员已知的常见克隆和转染方法如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等，从而引起所述核酸在特定的表达***中表达。适当的***描述在例如Current Protocols in Molecular Biology，F.Ausubel等人，编著，Wiley Interscience，New York 1997，或Sambrook等人Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第二版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中。
根据本发明，还可以制备同源重组微生物。为此目的，制备包含本发明基因或编码序列的至少一部分的载体，在其中，根据需要已经引入了至少一个氨基酸缺失、氨基酸添加或氨基酸置换，从而修饰(例如功能性破坏)本发明序列(敲除载体)。例如，引入的序列还可以是来自相关微生物的同源物或来自哺乳动物、酵母或昆虫来源。可选地，可以以这样的方式设计用于同源重组的载体，在所述方式中，在同源重组情形下，内源基因被突变或改变但是仍然编码功能性蛋白质(例如可以以内源蛋白质表达被因此改变的方式改造上游调节区)。本发明基因的改造部分在同源重组载体中。在例如Thomas，K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell 51：503中描述了适合于同源重组的载体构建。
原则上适合于本发明核酸或核酸构建体的重组宿主生物是任何原核或真核生物。有利地，将微生物如细菌、真菌或酵母用作宿主生物。有利地使用革兰氏阳性菌或革兰氏阴性细菌，优选下列科的细菌：肠杆菌科、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)或诺卡氏菌科(Nocardiaceae)，特别优选下列属的细菌：埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、诺卡氏菌属(Nocardia)、伯克氏菌属(Burkholderia)、沙门氏菌属(Salmonella)、土壤杆菌属(Agrobacterium)或红球菌属(Rhodococcus)。非常特别优选是大肠杆菌属和种。另外，其它有利的细菌在α-变形菌门、β-变形菌门或γ-变形菌门的组中找到。
关于这一点，本发明宿主生物优选包含至少一种在本发明中描述的并且编码具有本发明脱氢酶活性的酶的核酸序列、核酸构建体或载体。
用在本发明方法中的生物取决于以技术人员已知方式生长或培养的宿主生物。微生物通常生长在包含碳源(通常以糖的形式)、氮源(通常以有机氮源如酵母提取物或盐如硫酸铵)、痕量元素如铁盐、锰盐、镁盐以及维生素(根据需要)的液体培养基中，在0℃到100℃，优选10℃到60℃的温度下，同时充入氧气。关于这一点，营养液的pH可以保持或不保持在固定值，即可以在培养期间调节或不调节pH。培养可以分批、半分批或连续进行。可以在发酵开始时引入营养物或随后以半连续方式或连续方式加入。可以将酮直接添加到培养基中，或有利地在培养后添加。可以将酶通过使用在实施例中描述的方法从生物中分离或作为粗提取物直接用于反应。
本发明所用多肽的重组制备
本发明另外涉及用培养的产生多肽的微生物重组制备本发明所使用多肽或其功能性、生物学活性片段的方法，根据需要诱导多肽的表达，并且将所述多肽从培养物中分离。如果需要，多肽还可以在工业规模上这种方式来产生。
可以通过已知方法培养和发酵重组微生物。例如在TB培养基或LB培养基中，在20到40℃温度和6到9的pH下，繁殖细菌。适当的培养条件详细描述在例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1989)中。
如果多肽没有分泌到培养基中，随后通过已知的蛋白质分离方法将细胞破裂并且从裂解液中得到产物。根据需要，细胞可以通过下列方法破裂：通过高频超声、通过高压如在弗氏压碎器中、通过渗透、通过去污剂、水解酶或有机溶剂的作用、通过使用匀浆器或通过组合两种或多种列出的方法。
可以使用已知层析方法如分子筛层析(凝胶过滤)(例如Q琼脂糖层析)、离子交换层析和疏水层析，以及还使用其它常规方法如超滤、结晶、盐析、透析和非变性凝胶电泳来纯化多肽。适当的方法描述在例如Cooper，F.G.，Biochemische Arbeitsmethoden，Verlag Walter de Gruyter，Berlin，New York中或在Scopes，R.，Protein Purification，Springer Verlag，NewYork，Heidelberg，Berlin中。
有利地通过使用这样的载体***或寡核苷酸来分离重组蛋白质，所述的载体***或寡核苷酸通过特定核苷酸序列延伸cDNA并且因此编码用来例如简化纯化的改造的多肽或融合蛋白质。此类适当的修饰实例是作为锚的“标签”，如已知为六组氨酸锚的修饰，或可以作为抗原被抗体识别的表位(例如在Harlow，E.和Lane，D.，1988，Antibodies：A LaboratoryManual.Cold Spring Harbor(N.Y.)Press中描述)。这些锚可以用于将蛋白质附着到固相支持体如聚合物基质上，例如可以将聚合物基质装进层析柱中，或可以在微量滴定板或在另一支持体上使用。
同时，这些锚还可以用于鉴定蛋白质。还可以通过使用常规标记自身或与锚组合来鉴定蛋白质用于衍生所述蛋白质，所述常规标记如荧光染料、在与底物反应后形成可检测反应产物的酶标记或放射性标记物。
进行本发明酶还原方法的其它实施方案
在本发明方法中脱氢酶可以用作游离或固定化酶。
在0℃到95℃之间，优选在10℃到85℃之间，特别优选在15℃到75℃之间的温度下有利地进行本发明的方法。
在本发明方法中，pH有利地保持在大约pH4和12之间，优选在pH4.5和9之间，特别优选在pH5和8之间。
在本发明方法中，对映异构纯或手性产物如丁-2-醇是指表现出对映异构体富集的对映异构体。在本发明方法中优选达到对映异构纯度为至少70％ee，优选至少80％ee，特别优选至少90％ee，非常特别优选至少是98％ee。
可以使用包含本发明核酸、核酸构建体或载体的生长细胞用于本发明的方法。还可以使用静息细胞或破裂的细胞。破裂的细胞是指例如通过用溶剂处理使得通透的细胞，或例如通过用酶处理、机械处理(例如弗氏压碎或超声破碎)或其它方法破碎的细胞。以这种方式得到的粗提取物有利地适合于本发明方法。还可以使用纯化的或部分纯化的酶用于方法。有利地可以应用在反应中的固定化的微生物或酶同样是适当的。
本发明的方法可以分批、半分批或连续操作。
例如在Biotechnology，第3卷，第2版，Rehm等人编著，(1993)，尤其是第II章中描述的，方法可以有利地在生物反应器中进行。
下列实施例用于说明但不限制本发明。在此上下文中，参考附图，其中图1描述了通过用来自大肠杆菌的脱氢酶还原合成(S)-丁-2醇的典型反应模式。
实验部分
实施例1：大肠杆菌丙醇脱氢酶的克隆
大肠杆菌丙醇脱氢酶基因序列存放在数据库中(GenBank ID48994873区：互补序列(1550852到1551892))。根据已知方法用于从大肠杆菌基因组DNA中扩增基因的寡核苷酸来自丙醇脱氢酶基因的核酸序列。得到的序列对应于公开的序列。寡核苷酸的DNA序列在表1中描述。
表1用于制备合成的大肠杆菌丙醇脱氢酶基因的寡核苷酸
  #1   GGGAATTCATATGCAGAACATCATCCGAAAAG
  #2   CCCAAGCTTAGTGACGGAAATCAATC
PCR条件：
2μl     10×Pfu-Ultra缓冲液
Figure G200580038467420070514D000191
100ng    引物#1(参看表1)
100ng     引物#2(参看表1)
1μl      dNTP(每种10mM)
大约30ng  大肠杆菌染色体DNA
1U        Pfu-Ultra DNA聚合酶
添加到20μl H2O
温度程序：
10分钟，72℃，
∞，10℃
将PCR产物(大约1050bp)用限制性内切酶NdeI和HindIII消化并且克隆到已经相应地切开的pDHE19.2载体中(克隆按照在DE 19848129中描述的进行)。将连接混合物转化到大肠杆菌XL1 Blue
Figure G200580038467420070514D000202
中。
将得到的质粒pDHE-PDH-L转化到大肠杆菌菌株TG10 pAgro4pHSG575(TG10：大肠杆菌TG1
Figure G200580038467420070514D000203
的RhaA-衍生物；pAgro4：Takeshita，S；Sato，M；Toba，M；Masahashi，W；Hashimoto-Gotoh，T(1987)Gene 61，63-74；pHSG575：T.Tomoyasu等人(2001)，Mol.Microbiol.40(2)，397-413)。得到的重组大肠杆菌克隆称作大肠杆菌LU12418。
实施例2：重组丙醇脱氢酶的提供
将大肠杆菌LU12418在100ml锥形瓶(挡板)中的20mlLB-Amp/Spec/Cm(100μg/l氨苄青霉素；100μg/l壮观霉素；20μg/l氯霉素)，0.1mM IPTG，0.5g/l鼠李糖中37℃下生长18小时，以5000＊g离心10分钟，用10mM TRIS＊HCl，pH 7.0洗涤一次并且重悬在2ml同样的缓冲液中。
通过在振动粉碎机中用0.7ml的玻璃珠(d＝0.5mm)破碎大肠杆菌LU12418细胞糊(3×5分钟，立即在冰上冷却)，来制备无细胞的蛋白质粗提取物。
实施例3：大肠杆菌LU12418重组脱氢酶活性的测定
在每种情形中，将6个转化体在100ml锥形瓶(挡板)中的20mlLBAmp/Spec/Cm(100μg/lAmp；100mg/lSpec；20μg/lCm)，0.1mM IPTG，0.5g/l鼠李糖中37℃下生长18小时，以5000＊g离心10分钟，用10mMTRIS/HCl，pH 7.0洗涤一次并且重悬在2ml同样的缓冲液中。
通过在振动粉碎机中用0.7ml的玻璃珠(d＝0.5mm)破碎细胞(3×5分钟，立即在冰上冷却)，来得到大肠杆菌LU12418无细胞粗提取物。
可以在340nm下在光度计中监测酮还原过程中还原的共底物的消耗。10μl稀释的无细胞粗提取物(≈10μg蛋白质)，10μmol正丙醇和250nmolNADH或NADPH在1ml的50mM KPi、1mM MgCl2，pH 6.5中，30℃下温育。1单位(1U)对应了在1分钟内还原1μmol正丁醇的酶量。
实施例4：丁-2-醇的分析
可以通过GC测定丁-2-酮和丁-2-醇的浓度。还可以根据固定相和流动相的选择来确定除浓度外的ee值。
a)非手性分析
使用下列***定量反应：
固定相：Chromoltih SpeedROD RP18，50×4，6μm，Merck
(Darmstadt，Germany)，加热到45℃
流动相：洗脱液A：10mM KH2PO4，pH 2.5
洗脱液B：乙腈
梯度：  0-0.5分钟，35％B；0.5-1.0min 35到80％B；1.0-1.2
分钟80％B；1.2-1.3分钟80％-35％B；1.3-2.0分钟
35％B；
流速：  1.5ml/分钟
检测：    在230和260nm下UV检测
存留时间：丁-2-酮：大约1.6分钟
丁-2-醇：大约1.3分钟
使用可靠材料，产生了校准系列，在其基础上可以确定未知样品的浓度。
b)手性分析：
固定相：Chiracel OD-H，250×4，6μm，Daicel，加热到40℃
流动相：洗脱液A：正己烷
洗脱液B：异丙醇
用2.5％B等度
流速：1.0ml/分钟
检测：在230和260nm下的UV检测
存留时间：丁-2-酮：大约9.5min
(1S)-丁-2-醇：大约16.6min
(1R)-丁-2-醇：大约18.3min
使用可靠材料，产生了校准系列，在其基础上可以确定未知样品的浓度。
实施例5：用于辅因子再生的葡萄糖脱氢酶的提供和用葡萄糖脱氢酶的辅因子再生(酶偶联)
葡萄糖脱氢酶可以用于辅因子再生。酶是可商购的(例如Jülich FineChemicals，货号22.10或19.10)。下面，使用枯草杆菌(Bacillus subtilis)葡萄糖脱氢酶基因(GenBank Acc.No.M12276)并且将其克隆到大肠杆菌XL10Gold克隆中的Puc19质粒中。将此构建体称作大肠杆菌LU11293。
制备下列培养基用于大肠杆菌LU11293的发酵：
  560g   酵母提取物(65％)
  448g   胰蛋白胨(Difco)
  42g   KH2PO4
  84g Na2HPO4
  644g 甘油(99％)
  100ml SL4溶液(5×)
  1g Tegosipon 3062
用水将培养基稀释到13.5l，将pH调节到7.0，
之后移出大约300ml用于预培养
在122℃下灭菌30分钟
加入无菌盐溶液＊(预先移除摇瓶的盐溶液，见方案)。
＊盐溶液：2.1g CaCl2＊2H2O
3.5g MgSO4＊7H2O
14g NH4Cl
14ml氨苄青霉素溶液(100mg/ml)
溶解在500ml水中并且过滤灭菌。
在每种情形中，将150ml培养基在2个1升锥形瓶中灭菌并且用5ml无菌盐溶液使其完全。在从LB氨苄青霉素琼脂平板中接种后，将预培养物在37℃和200rpm(转/分钟)下孵育12小时并且添加到发酵培养基中。发酵开始于37℃，内部压力0.1巴，pH7.0(用20％磷酸和25％NaOH调节)，充气速度为7.5l/分钟和300rpm(用10-20l/分钟进气和500-1500rpm调节pO2在20和50％之间)。2小时后，添加0.1Mm IPTG用于诱导并且在总时间13小时后停止发酵。在收获和洗涤细胞(1.3kg)后，将细胞储存在-20℃直到使用(在反应混合物中2-20g/l)。
将等摩尔量的葡萄糖和丁-2-酮与1-30U/ml葡萄糖脱氢酶粗提取物和1-30U/ml丙醇脱氢酶粗提取物混合。将0.02-1mmol/l NAD或NADP或者0.02-1mmol/l NADH或NADPH溶解在缓冲液中并且在10-60℃下温育。通过自动添加碱将pH维持在恒定水平。
实施例6：用丙醇脱氢酶再生辅因子(底物偶联)
还可以通过丙醇脱氢酶本身再生辅因子。在此情形中，不需要添加单独的再生酶。丙醇脱氢酶接受多种一元醇作为还原剂。氧化它们成对应的羰基化合物。适合于用丙醇脱氢酶再生NADH或NADPH的一元醇是异丙醇。
实施例7：用甲酸脱氢酶再生辅因子(酶偶联)
可以使用甲酸脱氢酶用于辅因子再生。酶可以商购(例如Jülich FineChemicals货号09.11、24.11或25.10)。与实施例5类似地，因此辅因子也可以用甲酸脱氢酶再生。这包括使用等摩尔量的甲酸和丁-2-酮与1-30U/ml甲酸脱氢酶粗提取物和1-30U/ml丙醇脱氢酶粗提取物。将0.02-1mmol/l NAD或NADP或者0.02-1mmol/l NADH或NADPH溶解在缓冲液中并且在10-60℃下温育。通过自动添加酸将pH维持在恒定水平。
实施例8：使用大肠杆菌的重组丙醇脱氢酶制备(S)-丁-2-醇
根据实施例2培养、收获和破碎大肠杆菌LU12418。
将270g(1.5mol)的D-葡萄糖、135ml(1.5mol)的丁-2-酮、63ml的GDH粗提取物(≈30.5kU)、95ml的PDH粗提取物(≈20kU)和400mg(0.6mmol)的NAD或NADP或者NADH或NADPH溶解在KPi缓冲液(50mMKPi，1mM MgCl2，pH 6.5)中并且在30℃下温育。反应混合物起始体积是3升。通过自动添加2MNaOH将pH维持在恒定水平。图1描述了典型的反应模式。
序列表
<110>巴斯福股份公司
 
<120>制备旋光醇的方法
 
<130>PF 56053
 
<160>2
 
<170>PatentIn版本3.1
 
<210>1
<211>1041
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
 
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1041)
<223>
<400>1
atg cag aac atc atc cga aaa gga gga act atg aag gct gca gtt gtt     48
Met Gln Asn Ile Ile Arg Lys Gly Gly Thr Met Lys A1a Ala Val Val
1               5                   10                  15
acg aag gat cat cat gtt gac gtt acg tat aaa aca ctg cgc tca ctg     96
Thr Lys Asp His His Val Asp Val Thr Tyr Lys Thr Leu Arg Ser Leu
            20                  25                  30
aaa cat ggc gaa gcc ctg ctg aaa atg gag tgt tgt ggt gta tgt cat    144
Lys His Gly Glu Ala Leu Leu Lys Met Glu Cys Cys Gly Val Cys His
        35                  40                  45
acc gat ctt cat gtt aag aat ggc gat ttt ggt gac aaa acc ggc gta    192
Thr Asp Leu His Val Lys Asn Gly Asp Phe Gly Asp Lys Thr Gly Val
    50                  55                  60
att ctg ggc cat gaa ggc atc ggt gtg gtg gca gaa gtg ggt cca ggt    240
Ile Leu Gly His Glu Gly Ile Gly Val Val Ala Glu Val Gly Pro Gly
65                  70                  75                  80
gtc acc tca tta aaa cca ggc gat cgt gcc agc gtg gcg tgg ttc tac    288
Val Thr Ser Leu Lys Pro Gly Asp Arg Ala Ser Val Ala Trp Phe Tyr
                85                  90                  95
gaa gga tgc ggt cat tgc gaa tac tgt aac agt ggt aac gaa acg ctc    336
Glu Gly Cys Gly His Cys Glu Tyr Cys Asn Ser Gly Asn Glu Thr Leu
            100                 105                 110
tgc cgt tca gtt aaa aat gcc gga tac agc gtt gat ggc ggg atg gcg    384
Cys Arg Ser Val Lys Asn Ala Gly Tyr Ser Val Asp Gly Gly Met Ala
        115                 120                 125
gaa gag tgc atc gtg gtc gcc gat tac gcg gta aaa gtg cca gat ggt    432
Glu Glu Cys Ile Val Val Ala Asp Tyr Ala Val Lys Val Pro Asp Gly
    130                 135                 140
ctg gac tcg gcg gcg gcc agc agc att acc tgt gcg gga gtc acc acc    480
Leu Asp Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ile Thr Cys Ala Gly Val Thr Thr
145                 150                 155                 160
tac aaa gcc gtt aag ctg tca aaa att cgt cca ggg cag tgg att gct    528
Tyr Lys Ala Val Lys Leu Ser Lys Ile Arg Pro Gly Gln Trp Ile Ala
                165                 170                 175
atc tac ggt ctt ggc ggt ctg ggt aac ctc gcc ctg caa tac gcg aag    576
Ile Tyr Gly Leu Gly Gly Leu Gly Asn Leu Ala Leu Gln Tyr Ala Lys
            180                 185                 190
aat gtc ttt aac gcc aaa gtg atc gcc att gat gtc aat gat gag cag    624
Asn Val Phe Asn Ala Lys Val Ile Ala Ile Asp Val Asn Asp Glu Gln
        195                 200                 205
tta aaa ctg gca acc gaa atg ggc gca gat tta gcg att aac tca cac    672
Leu Lys Leu Ala Thr Glu Met Gly Ala Asp Leu Ala Ile Asn Ser His
    210                 215                 220
acc gaa gac gcc gcc aaa att gtg cag gag aaa act ggt ggc gct cac    720
Thr Glu Asp Ala Ala Lys Ile Val Gln Glu Lys Thr Gly Gly Ala His
225                 230                 235                 240
gct gcg gtg gta aca gcg gta gct aaa gct gcg ttt aac tcg gca gtt    768
Ala Ala Val Val Thr Ala Val Ala Lys Ala Ala Phe Asn Ser Ala Val
                245                 250                 255
gat gct gtc cgt gca ggc ggt cgt gtt gtg gct gtc ggt cta ccg ccg    816
Asp Ala Val Arg Ala Gly Gly Arg Val Val Ala Val Gly Leu Pro Pro
            260                 265                 270
gag tct atg agc ctg gat atc cca cgt ctt gtg ctg gat ggt att gaa    864
Glu Ser Met Ser Leu Asp Ile Pro Arg Leu Val Leu Asp Gly Ile Glu
        275                 280                 285
gtg gtc ggt tcg ctg gtc ggc acg cgc cag gat tta act gaa gcc ttc    912
Val Val Gly Ser Leu Val Gly Thr Arg Gln Asp Leu Thr Glu Ala Phe
    290                 295                 300
cag ttt gcc gcc gaa ggt aaa gtg gtg ccg aaa gtc gcc ctg cgt ccg    960
Gln Phe Ala Ala Glu Gly Lys Val Val Pro Lys Val Ala Leu Arg Pro
305                 310                 315                 320
tta gcg gac atc aac acc atc ttt act gag atg gaa gaa ggc aaa atc   1008
Leu Ala Asp Ile Asn Thr Ile Phe Thr Glu Met Glu Glu Gly Lys Ile
                325                 330                 335
cgt ggc cgc atg gtg att gat ttc cgt cac taa                       1041
Arg Gly Arg Met Val Ile Asp Phe Arg His
            340                 345
<210>2
<211>346
<212>PRT
<213>大肠杆菌
 
<400>2
Met Gln Asn Ile Ile Arg Lys Gly Gly Thr Met Lys Ala Ala Val Val
1               5                   10                  15
Thr Lys Asp His His Val Asp Val Thr Tyr Lys Thr Leu Arg Ser Leu
            20                  25                  30
Lys His Gly Glu Ala Leu Leu Lys Met Glu Cys Cys Gly Val Cys His
        35                  40                  45
Thr Asp Leu His Val Lys Asn Gly Asp Phe Gly Asp Lys Thr Gly Val
    50                  55                  60
Ile Leu Gly His Glu Gly Ile Gly Val Val Ala Glu Val Gly Pro Gly
65                  70                  75                  80
Val Thr Ser Leu Lys Pro Gly Asp Arg Ala Ser Val Ala Trp Phe Tyr
                85                  90                  95
Glu Gly Cys Gly His Cys Glu Tyr Cys Asn Ser Gly Asn Glu Thr Leu
            100                 105                 110
Cys Arg Ser Val Lys Asn Ala Gly Tyr Ser Val Asp Gly Gly Met Ala
        115                 120                 125
Glu Glu Cys Ile Val Val Ala Asp Tyr Ala Val Lys Val Pro Asp Gly
    130                 135                 140
Leu Asp Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ile Thr Cys Ala Gly Val Thr Thr
145                 150                 155                 160
Tyr Lys Ala Val Lys Leu Ser Lys Ile Arg Pro Gly Gln Trp Ile Ala
                165                 170                 175
Ile Tyr Gly Leu Gly Gly Leu Gly Asn Leu Ala Leu Gln Tyr Ala Lys
            180                 185                 190
Asn Val Phe Asn Ala Lys Val Ile Ala Ile Asp Val Asn Asp Glu Gln
        195                 200                 205
Leu Lys Leu Ala Thr Glu Met Gly Ala Asp Leu Ala Ile Asn Ser His
    210                 215                 220
Thr Glu Asp Ala Ala Lys Ile Val Gln Glu Lys Thr Gly Gly Ala His
225                 230                 235                 240
Ala Ala Val Val Thr Ala Val Ala Lys Ala Ala Phe Asn Ser Ala Val
                245                 250                 255
Asp Ala Val Arg Ala Gly Gly Arg Val Val Ala Val Gly Leu Pro Pro
            260                 265                 270
Glu Ser Met Ser Leu Asp Ile Pro Arg Leu Val Leu Asp Gly Ile Glu
        275                 280                 285
Val Val Gly Ser Leu Val Gly Thr Arg Gln Asp Leu Thr Glu Ala Phe
    290                 295                 300
Gln Phe Ala Ala Glu Gly Lys Val Val Pro Lys Val Ala Leu Arg Pro
305                 310                 315                 320
Leu Ala Asp Ile Asn Thr Ile Phe Thr Glu Met Glu Glu Gly Lys Ile
                325                 330                 335
Arg Gly Arg Met Val Ile Asp Phe Arg His
            340                 345

Claims (8)

1.在醇脱氢酶存在下通过还原丁-2-酮制备(S)-丁-2-醇的方法，其中所述醇脱氢酶具有多肽序列SEQ ID NO：2，其中使用NADH或NADPH作为辅因子进行还原。
2.根据权利要求1的方法，其中使用NADH作为辅因子进行还原。
3.根据权利要求1的方法，其中酶促再生所使用的辅因子。
4.根据权利要求1的方法，其中通过葡萄糖脱氢酶再生所述辅因子。
5.根据权利要求1的方法，其中在水性***中进行还原。
6.根据权利要求1的方法，其中醇脱氢酶以固定化形式存在。
7.根据权利要求1的方法，其中所使用的醇脱氢酶在大肠杆菌中表达。
8.醇脱氢酶在通过还原丁-2-酮制备(S)-丁-2-醇的方法中的用途，其中所述醇脱氢酶具有SEQ ID NO：2的多肽序列，其中所用的辅因子是NADH或NADPH。
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VELONIA K等.Stereospecificity of hydrogen transfer by the NAD<+>-linked alcohol dehydrogenase from the antarctic Psychrophile Moraxella sp. TAE123.BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS第9卷 第1期.1999,第65-68页,尤其第66-67页. *

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