ES2319866T3 - Anticuerpos de especificidad dual y metodos de fabricacion y uso. - Google Patents

Abstract

Un método para obtener un anticuerpo de especificidad dual o parte de unión al antígeno del mismo, que se une específicamente a dos proteínas diferentes pero relacionadas estructuralmente, comprendiendo el método: proporcionar un antígeno diseñado sobre la base del corte y empalme de partes solapantes entre sí de las dos proteínas diferentes pero relacionadas estructuralmente para crear un péptido híbrido, donde dicho péptido híbrido tiene una estructura X-Y-Z, en la que Y representa una región de identidad o de fuerte similitud entre las dos proteínas relacionadas, X representa una región de una de las proteínas relacionadas y Z representa una región de la otra de las proteínas relacionadas; exponer un repertorio de anticuerpos al antígeno; y seleccionar del repertorio un anticuerpo que se una específicamente a las dos proteínas diferentes pero relacionadas estructuralmente para obtener de esta manera el anticuerpo de especificidad dual.

Description

Anticuerpos de especificidad dual y métodos de fabricación y uso.

Antecedentes de la invención

El sistema inmunológico de los mamíferos incluye los linfocitos B que, en su totalidad, expresan un repertorio de anticuerpos compuesto por cientos de miles de millones de especificidades de anticuerpo diferentes. Una respuesta inmune normal para un antígeno en particular implica la selección de este repertorio de uno o más anticuerpos que se unen al antígeno específicamente, y el éxito de una respuesta inmune se basa, al menos en parte, en la capacidad de estos anticuerpos para reconocer específicamente (y en última instancia eliminar) el antígeno estimulante e "ignorar" otras moléculas en el entorno de los anticuerpos.

La utilidad de los anticuerpos que reconocen específicamente un antígeno diana en particular conduce al desarrollo de la tecnología de anticuerpos monoclonales. La tecnología del hibridoma convencional permite ahora la preparación de anticuerpos que tienen una especificidad única para un antígeno de interés. Más recientemente, se han desarrollado técnicas de anticuerpos recombinantes, tales como la selección de bibliotecas de anticuerpos in vitro. Estas técnicas también permiten la producción de anticuerpos con una especificidad única para un antígeno de interés.

Los anticuerpos que tienen especificidad para un sólo antígeno diana pueden, al menos en determinadas circunstancias, presentar reactividad cruzada no deseada o una unión de fondo con otros antígenos. Sin embargo, esta reactividad cruzada o unión de fondo, es normalmente imprevisible (es decir, no es posible predecir con que antígeno reaccionará el anticuerpo de forma cruzada). Además, normalmente puede distinguirse de la unión a antígeno específico, ya que típicamente representa solo una parte muy minoritaria de la capacidad de unión del anticuerpo (por ejemplo, el 1% o menos del total de la unión de anticuerpo) y típicamente solo se observa a elevadas concentraciones de anticuerpos (por ejemplo, concentraciones de 1000 veces, o superiores, de las necesarias para observar la unión a antígeno específico). Aunque hay varios antígenos que pueden pertenecer a una familia de proteínas relacionadas estructuralmente, la respuesta de anticuerpo a un miembro de la familia en particular es altamente específica. Además, hay varios ejemplos de miembros de familias de proteínas (por ejemplo, miembros de las familias IL-1 y TNF) que se unen al mismo receptor; componente del receptor o receptores relacionados estructuralmente, aunque los anticuerpos monoclonales generados contra un miembro de la familia no muestran elevada reactividad cruzada hacia otros miembros de la familia. Puede haber dos razones para esta ausencia de reactividad cruzada de MAb hacia diversos miembros de una familia. En primer lugar, en la producción de hibridomas convencional, únicamente se buscan unos pocos anticuerpos de elevada especificidad/afinidad para el antígeno diana y después se comprueba la reactividad cruzada o unión de fondo de los pocos anticuerpos seleccionados. En segundo lugar, aunque dentro de una familia las proteínas están relacionadas estructuralmente, pueden tener epítopos inmunodominantes no solapantes exclusivos. Por lo tanto, los MAb generados usando proteínas de longitud completa no pueden reaccionar de forma cruzada con otras proteínas relacionadas estructuralmente.

Se han descrito anticuerpos de especificidad dual, que se unen a dos proteínas relacionadas estructuralmente, para la interleuquina 1\alpha e interleuquina 1\beta (Luger et al. (1980) Immunobiology 172: 3-5) y para la E-Selectina y L-Selectina (patente de Estados Unidos Nº 5.756.095). Dichos anticuerpos se generaron contra proteínas de longitud completa. También hay ejemplos de anticuerpos monoclonales generados contra un antígeno de una especie que se unirá específicamente al mismo antígeno funcional en otra especie. Por ejemplo, un anticuerpo anti-ratón X puede unirse fácilmente a un antígeno humano X. Esto es porque comparten secuencias significativas y similitudes estructurales aunque no son idénticas. Sin embargo, dichos anticuerpos de especies que presentan reactividad cruzada no constituyen anticuerpos de "especificidad dual", ya que tienen especificidad por el mismo antígeno de especies diferentes.

Por lo tanto, aún son necesarios anticuerpos monoclonales que tengan especificidad dual o múltiple previsible, es decir, anticuerpos que tengan especificidad verdadera para dos o más antígenos diferentes.

Sumario de la invención

Esta invención proporciona métodos para fabricar anticuerpos que tienen especificidad dual para al menos dos antígenos, aunque diferentes, relacionados estructuralmente. El método generalmente implica proveer un antígeno que comprende una característica estructural común de las dos moléculas diferentes pero relacionadas estructuralmente; exponer un repertorio de anticuerpos para el antígeno; y seleccionar del repertorio un anticuerpo que se una específicamente a las dos moléculas diferentes pero relacionadas estructuralmente para obtener de esta manera el anticuerpo de especificidad dual. En contextos clínicos, varios miembros de la misma familia de proteínas pueden aportar diversos síntomas de un proceso patológico. Por lo tanto, el uso de un anticuerpo de especificidad dual de la invención, que se une a miembros de la misma familia de proteínas, para bloquear las funciones de más de un miembro de la familia de proteínas puede ser beneficioso para aliviar los síntomas de la enfermedad o para interrumpir el proceso patológico en sí. Además, dichos anticuerpos de especificidad dual de la invención son útiles para detectar antígenos relacionados estructuralmente, para purificar antígenos relacionados estructuralmente y en ensayos de diagnóstico que implican antígenos relacionados estructuralmente.

En una realización preferida el antígeno se diseña en base a un área de identidad topológica contigua entre las dos moléculas diferentes pero relacionadas estructuralmente. Por ejemplo, las dos moléculas diferentes pero relacionadas estructuralmente pueden ser proteínas y el antígeno puede ser un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de un área de identidad topológica contigua entre las dos proteínas.

En otra realización, el antígeno se diseña en base a mimetizar estructuralmente un bucle de un plegamiento común de las dos moléculas diferentes pero relacionadas estructuralmente. Por ejemplo, el antígeno puede ser un péptido cíclico que mimetiza estructuralmente un bucle de un plegamiento común de dos proteínas diferentes pero relacionadas estructuralmente.

En otra realización, el antígeno se diseña en base al corte y empalme de partes alternantes y/o solapantes entre sí de las dos moléculas diferentes pero relacionadas estructuralmente para crear una molécula híbrida. Por ejemplo, el antígeno puede ser un péptido híbrido formado por corte y empalme de secuencias de aminoácidos alternantes y/o solapantes entre sí de dos proteínas diferentes pero relacionadas estructuralmente.

En otra realización más, el antígeno puede comprender una de las dos moléculas diferentes pero relacionadas estructuralmente y el método implica seleccionar anticuerpos que reconocen específicamente ambas moléculas relacionadas.

En el método de la invención, el repertorio de anticuerpos puede exponerse al antígeno de interés in vivo o in vitro. Por ejemplo, en una realización, la exposición del repertorio para el antígeno implica inmunizar un animal in vivo con el antígeno. Esta estrategia in vivo puede implicar además preparar un panel de hibridomas de linfocitos del animal y seleccionar un hibridoma que secrete un anticuerpo que se una específicamente a las dos moléculas diferentes pero relacionadas estructuralmente. El animal inmunizado puede ser, por ejemplo, un ratón, una rata, un conejo o una cabra o una versión transgénica de cualquiera de los animales anteriores, tal como un ratón que sea transgénico para los genes de inmunoglobulina humana de manera que el ratón fabrique anticuerpos humanos tras la estimulación antigénica. Otros tipos de animales que pueden inmunizarse incluyen ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) que se han reconstituido con células mononucleares de sangre periférica humanas (ratón quimérico hu-PBMC-SCID) o células linfoides o precursoras de las mismas y ratones que se han tratado con irradiación corporal total letal, seguida de radioprotección con células de médula ósea de un ratón con una inmunodeficiencia combinada grave (SCID), seguido de injerto con linfocitos humanos funcionales (el sistema Trimera). Otro tipo de animal más que puede inmunizarse es un animal (por ejemplo, ratón) cuyo genoma se haya "anulado" (por ejemplo, mediante recombinación homóloga) para un gen (o genes) endógeno que codifica el antígeno (o antígenos) de interés, en el que después de la inmunización
con el antígeno (o antígenos) de interés el animal KO (knockout) reconoce el antígeno (o antígenos) como extraño.

En otra realización, el repertorio de anticuerpos se expone al antígeno in vitro explorando una biblioteca de anticuerpos recombinantes con el antígeno. La biblioteca de anticuerpos recombinantes puede expresarse, por ejemplo, en la superficie de bacteriófagos o en la superficie de células de levadura o en la superficie de células bacterianas. En diversas realizaciones, la biblioteca de anticuerpos recombinantes es, por ejemplo, una biblioteca de scFv o una biblioteca de Fab. En otra realización más, las bibliotecas de anticuerpos se expresan como fusión de ARN-proteína.

Otra estrategia para preparar anticuerpos de especificidad dual implica una combinación de estrategias in vivo e in vitro, tales como la exposición del repertorio de anticuerpos al antígeno mediante la inmunización de un animal in vivo con el antígeno, seguida de la exploración in vitro de una biblioteca de anticuerpos recombinantes preparada a partir de células linfoides del animal con el antígeno. Otra estrategia más implica la exposición del repertorio de anticuerpos al antígeno mediante inmunización de un animal in vivo con el antígeno, seguida de maduración de afinidad in vitro de una biblioteca de anticuerpos recombinantes preparada a partir de células linfoides del animal. Otra estrategia más implica la exposición del repertorio de anticuerpos para el antígeno mediante la inmunización de un animal in vivo con el antígeno, seguida de la selección de células productoras de un solo anticuerpo que secreten un anticuerpo de interés, la recuperación de los ADNc de la región variable de las cadenas pesada y ligera de estas células seleccionadas (por ejemplo, mediante PCR) y la expresión de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera in vitro en células hospedadoras de mamíferos (denominado método de anticuerpos de linfocitos seleccionados o SLAM), permitiendo de esta manera una mayor selección y manipulación de las secuencias génicas del anticuerpo de la selección. Todavía adicionalmente, pueden seleccionarse anticuerpos monoclonales por clonación y expresión mediante la expresión de genes de anticuerpos de cadena pesada y ligera en células de mamíferos y selección de las células de mamíferos que secreten un anticuerpo que tenga la especificidad de unión necesaria.

Los métodos de la invención permiten preparar diversos tipos diferentes de anticuerpos de especificidad dual, incluyendo anticuerpos completamente humanos, anticuerpos quiméricos y anticuerpos injertados a CDR y partes de unión al antígeno de los mismos. También se proporcionan anticuerpos de especificidad dual preparados de acuerdo con los métodos de la invención. Un anticuerpo de especificidad dual preferido de la invención es uno que se une específicamente a la interleuquina 1\alpha e interleuquina 1\beta. Dicho anticuerpo de especificidad dual puede usarse en métodos para detectar IL-1\alpha o IL-1\beta que comprenden poner en contacto IL-1\alpha o IL-1\beta con el anticuerpo de especificidad dual o parte de unión al antígeno del mismo, de manera que se detecta IL-1\alpha o IL-1\beta. También puede usarse un anticuerpo de especificidad dual neutralizante en métodos para inhibir la actividad de IL-1\alpha o IL-1\beta que comprenden poner en contacto IL-1\alpha o IL-1\beta con el anticuerpo de especificidad dual, o parte de unión al antígeno del mismo, de manera que se inhibe la actividad de IL-1\alpha o IL-1\beta. Dichos anticuerpos de especificidad dual también pueden usarse en métodos de tratamiento de trastornos relacionados con la interleuquina 1 que comprenden administrar el anticuerpo de especificidad dual o parte de unión al antígeno del mismo, a un sujeto que padece un trastorno relacionado con la interleuquina 1.

Descripción detallada de la invención

Esta invención está relacionada con el diseño y uso de antígenos para generar anticuerpos de especificidad dual, es decir, anticuerpos que tienen especificidad por al menos dos moléculas diferentes pero relacionadas estructuralmente, así como la selección, preparación y uso de dichos anticuerpos de especificidad dual. La relación estructural de los antígenos de la invención puede ser sobre todo el antígeno (por ejemplo proteína) o únicamente en ciertas regiones relacionadas estructuralmente. La invención proporciona un método para obtener un anticuerpo de especificidad dual que se une a dos moléculas diferentes pero relacionadas estructuralmente, en el que el método implica:

proporcionar un antígeno que comprende una característica estructural común de dos moléculas diferentes pero relacionadas estructuralmente; la exposición de un repertorio de anticuerpos para el antígeno y

seleccionar del repertorio un anticuerpo que se una específicamente a las dos moléculas diferentes pero relacionadas estructuralmente para obtener de esta manera el anticuerpo de especificidad dual.

Debe indicarse que aunque la invención se describe en este documento en términos de reconocimiento de dos antígenos diferentes pero relacionados, debe entenderse que la expresión "anticuerpo de especificidad dual" pretende incluir anticuerpos que reconocen específicamente incluso más de dos antígenos diferentes pero relacionados, tales como anticuerpos que reconocen tres, cuatro, cinco o más antígenos distintos pero relacionados estructuralmente. Además, la expresión "antígenos diferentes pero relacionados estructuralmente" pretende incluir antígenos (por ejemplo, proteínas) cuyas estructuras generales están relacionadas así como antígenos (por ejemplo, proteínas) que comparten una o más regiones relacionadas estructuralmente pero que no están relacionadas de otra manera. Por tanto, los antígenos "diferentes pero relacionados estructuralmente" podrían ser, por ejemplo, dos proteínas que son miembros de la misma familia de proteínas que tienen una estructura general común o podrían ser, por ejemplo, dos proteínas cuya estructura general es diferente (no relacionada) pero cada una contiene dominios relacionados estructuralmente.

Pueden usarse diversos tipos de antígenos para obtener los anticuerpos de la invención y pueden aplicarse diversos métodos para fabricar anticuerpos para obtener un anticuerpo de especificidad dual de la invención, como se analiza con más detalle a continuación en las siguientes subsecciones.

I. Antígenos de especificidad dual

Para preparar un antígeno de especificidad dual de la invención, se generan anticuerpos contra un antígeno capaz de producir anticuerpos de especificidad dual. Dichos antígenos generalmente se denominan en este documento antígenos de especificidad dual. Pueden usarse diversos tipos diferentes de antígenos de especificidad dual en la invención y el diseño de los diversos tipos de antígenos de especificidad dual se describe adicionalmente en las siguientes subsecciones.

A. Áreas topológicas contiguas

En una realización, un antígeno de especificidad dual de la invención comprende un área de identidad topológica contigua y/o de similitud entre las dos moléculas diferentes pero relacionadas estructuralmente para las que se va a generar un anticuerpo de especificidad dual. Preferiblemente, el antígeno comprende la mayor (por ejemplo, más larga) área de identidad y/o similitud topológica contigua entre las dos moléculas diferentes pero relacionadas estructuralmente. Preferiblemente, las dos moléculas diferentes pero relacionadas estructuralmente son proteínas y el antígeno de especificidad dual comprende un péptido lineal que corresponde a la mayor (por ejemplo, más larga) área de identidad topológica y/o similitud contigua entre las dos proteínas. La región apropiada de identidad/similitud que se elige es preferiblemente un receptor o una región de unión al ligando, aunque también pueden usarse otras regiones de identidad/similitud.

Para determinar áreas de identidad topológica contiguas entre dos moléculas (por ejemplo, proteínas), las dos moléculas (por ejemplo, proteínas) se comparan (por ejemplo, por modelado por homología, información estructural o alineamiento) y se identifican regiones idénticas o similares. Para las proteínas, puede usarse un algoritmo de alineamiento para crear el alineamiento óptimo e identificar la mayor (por ejemplo, más larga) área de identidad y/o similitud topológica contigua entre las dos proteínas. Un ejemplo preferido, no limitante, de un algoritmo matemático utilizado para comparar dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-68, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-77. Dicho algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. Para obtener alineamientos con huecos con fines comparativos, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Research 25 (17): 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Un algoritmo matemático alternativo que puede usarse es el usado en el programa ALIGN descrito en Myers y Miller (1988) Comput. Appl. Biosci. 4: 11-17.

Cuando se elige una región de identidad/similitud apropiada, el antígeno de especificidad dual correspondiente a la región puede sintetizarse químicamente. Por ejemplo, para antígenos peptídicos, el péptido puede sintetizarse por métodos de síntesis de péptidos convencionales. En una realización, el antígeno peptídico comprende aminoácidos L. En otras realizaciones, el antígeno peptídico puede estar compuesto parcialmente o completamente por aminoácidos D. Un ejemplo de diseño de un antígeno de especificidad dual basado en un área de identidad y/o de similitud topológica contigua entre dos proteínas diferentes pero relacionadas estructuralmente se describe con detalle en el Ejemplo 1.

B. Péptidos cíclicos que mimetizan un bucle estructural

En otra realización, un antígeno de especificidad dual de la invención comprende una molécula cíclica, preferiblemente un péptido cíclico, que mimetiza estructuralmente un bucle clave de un plegamiento común de las dos moléculas diferentes pero relacionadas estructuralmente (por ejemplo, proteínas) para el que se van a generar anticuerpos de especificidad dual. Para preparar este tipo de antígeno, se comparan las estructuras de las dos moléculas relacionadas y se identifica un bucle de un plegamiento común que se encuentra en las dos moléculas. Para ayudar en la identificación de dichos bucles y plegamientos comunes puede usarse modelado molecular convencional y análisis cristalográfico. Se identifican regiones idénticas y similares (por ejemplo, secuencias de aminoácidos entre dos proteínas) y puede diseñarse una secuencia consenso para regiones similares pero no idénticas. Una molécula lineal, por ejemplo, un péptido lineal, se diseña en base a estas regiones similares e idénticas y después esta molécula lineal puede hacerse cíclica, por medios químicos conocidos, para crear un antígeno que mimetice el bucle clave. Por ejemplo, puede añadirse una prolina y una glicina en el extremo de un péptido lineal para permitir la ciclación del péptido. Un ejemplo de diseño de un antígeno de especificidad dual basado en un péptido cíclico que mimetiza un bucle estructural compartido por dos proteínas diferentes pero relacionadas estructuralmente se describe con detalle en el Ejemplo 2.

C. Moléculas híbridas

En otra realización, un antígeno de especificidad dual de la invención comprende una molécula híbrida, preferiblemente un péptido híbrido, que incluye regiones alternantes y/o solapantes de las dos moléculas diferentes pero relacionadas estructuralmente (por ejemplo, proteínas) para el que se van a generar anticuerpos de especificidad dual. Para preparar este tipo de antígenos, se comparan las estructuras de las dos moléculas y se identifican las regiones solapantes (es decir, las regiones de identidad), así como las regiones no idénticas entre las dos moléculas. Se prepara una molécula híbrida (por ejemplo, un péptido híbrido, cuando las dos moléculas relacionadas son proteínas) que preferiblemente comprende regiones alternantes (por ejemplo, secuencias de aminoácidos) de cada una de las dos moléculas, así como una región solapante que es común a ambas moléculas. Esquemáticamente, dicha molécula híbrida puede describirse como: X-Y-Z, en la que Y representa una región de identidad o de fuerte similitud entre las dos moléculas relacionadas (es decir, una región solapante), X representa una región de una de las moléculas relacionadas y Z representa una región de la otra de las moléculas relacionadas. Un ejemplo de diseño de un antígeno de especificidad dual basado en un péptido híbrido compuesto por secuencias de dos proteínas diferentes pero relacionadas estructuralmente se describe con detalle en el Ejemplo 3.

Otro tipo de molécula híbrida es una en la que se ha introducido un péptido en una proteína de longitud completa (denominada proteína "diana"). Se seleccionan péptidos que representen regiones funcionales de dos proteínas diferentes pero relacionadas estructuralmente, por ejemplo, regiones de interacción con el receptor. Dichos péptidos se denominan en este documento péptidos funcionales. Un péptido funcional de una de las proteínas relacionadas se introduce después en la proteína de longitud completa de la otra proteína relacionada o, de manera alternativa, en una proteína no relacionada. Por ejemplo, se identifica un péptido de IL-1\alpha correspondiente a una región de interacción con el receptor de IL-1\alpha y este péptido funcional de IL-1\alpha se introduce en la proteína de longitud completa IL-1\beta para crear una molécula híbrida IL-1\alpha/IL-1\beta. De forma similar, se identifica un péptido de IL-1\beta correspondiente a una región de interacción con el receptor de IL-1\beta y este péptido funcional de IL-1\beta se introduce en la proteína de longitud completa IL-1\alpha para crear una molécula híbrida IL-1\alpha/IL-1\beta. Esta introducción del péptido funcional en la proteína de longitud completa relacionada restringe al péptido funcional en ambos extremos y mantiene la estructura plegada del péptido funcional.

En el caso de un híbrido IL-1\alpha/IL-1\beta, el péptido funcional preferiblemente se inserta (sustituye los aminoácidos naturales) en un área diana que represente estructuras de plegamiento comunes de IL-1\alpha e IL-1\beta. Dichas áreas pueden encontrarse a lo largo de la longitud completa de la proteína (por ejemplo, en la región N-terminal, en el centro de la proteína, en la región C-terminal). Además, los péptidos funcionales que representan las estructuras de plegamiento IL-1\alpha/IL-1\beta comunes también pueden insertarse en una proteína irrelevante, tal como albúmina o alguna otra proteína de origen natural. En este caso, el lugar de inserción preferido para el péptido es una región que permita al péptido mantener la estructura plegada deseada. Por lo tanto, los lugares de inserción pueden ser en el extremo N-terminal, en el centro, o en el extremo C-terminal de la proteína. La situación del péptido en cualquier proteína diana de origen natural se selecciona para mimetizar las restricciones estructurales situadas sobre ella por la proteína nativa de la que procede. Aunque el péptido funcional puede insertarse simplemente en la proteína diana de manera que los aminoácidos del péptido funcional se añadan a la proteína diana, preferiblemente los aminoácidos del péptido funcional sustituyen una parte de la proteína diana en la cual se inserta.

Como ejemplo no limitante, se construye una molécula híbrida para usar como un antígeno de especificidad dual para obtener anticuerpos de especificidad dual para IL-1\alpha e IL-1\beta en la que un péptido funcional correspondiente a un elemento estructural específico de IL-1\alpha o IL-1\beta se introduce en IL-1\beta o IL-1\alpha de longitud completa en la posición estructural equivalente. La molécula híbrida elegida sustituye los restos 160-176 de IL-1\beta con los restos 168-184 de IL-1\alpha. La molécula resultante posee la siguiente secuencia de aminoácidos, en la que se subrayan las secuencias IL-1\alpha sustituidas (restos 168-184):

\quad

APVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVFSMGAYKSSKDDAKITVILGLKEKN LYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRVFFNKIEINNKLEFESAQFPNWYISTSQAENMPVFL GGTKGGQDIFDFTMQFVSS \hskip1cm (SEC ID Nº:4)

Esta molécula puede prepararse usando técnicas de biología molecular convencionales (por ejemplo, clonación, reacción en cadena de la polimerasa) usando secuencias de ADNc de IL-1\alpha o IL-1\beta disponibles públicamente y técnicas de expresión de proteínas recombinantes. Puede prepararse un ADNc híbrido, introducido en un vector de expresión apropiado y el polipéptido puede expresarse introduciendo el vector de expresión en una célula hospedadora apropiada.

D. Péptidos basados en representaciones de hidrofobicidad

En otra realización, se selecciona un antígeno de especificidad dual de la invención en base a representaciones de hidrofobicidad para seleccionar péptidos que se prediga que son altamente antigénicos. Por ejemplo, los índices antigénicos de péptidos pueden calcularse usando programas informáticos como los descritos por Jameson y Wolf (CABIOS, 4 (1), 181-186 (1988)). Pueden elegirse regiones de interés para la unión de anticuerpos para maximizar la probabilidad de antigenicidad.

E. Inmunización con células transfectadas con antígenos

En otra realización, se prepara un anticuerpo de especificidad dual de la invención por inmunización con células transfectadas con antígenos (es decir, los antígenos de especificidad dual de la invención pueden ser células transfectadas con antígenos). Pueden generarse líneas celulares que expresen de forma estable los dos antígenos diferentes pero relacionados estructuralmente, o una molécula híbrida de los mismos. Por ejemplo, pueden generarse líneas celulares que expresen de forma estable IL-1\alpha o IL-1\beta o una molécula híbrida de IL (por ejemplo, SEC ID Nº:4). Las moléculas de interés pueden secretarse desde las células (en caso de proteínas solubles) o pueden expresarse en la superficie celular (en caso de receptores, enzimas). El suministro de genes en las células hospedadoras para permitir la expresión de los antígenos por las células hospedadoras puede llevarse a cabo por varios medios convencionales, que incluyen pero sin limitación, transfección, electroporación, fusión celular, lipofección, bombardeo de partículas, microinyección o infección vírica. Las líneas celulares que expresan los antígenos de interés pueden transplantarse después mediante una o más vías diversas (intraperitoneal, subcutánea, intramuscular y similares) en un animal de interés para la producción de anticuerpos. Las células sirven entonces como fuente de liberación lenta del antígeno de interés. Preferiblemente las células expresan las proteínas de longitud completa. Sin embargo, también pueden expresarse fragmentos antigénicos. Para las proteínas solubles, las proteínas preferiblemente se secretan por las células. Para generar un anticuerpo de especificidad dual para el domino extracelular de dos receptores estrechamente relacionados, los receptores preferiblemente se expresan en la superficie celular.

F. Inmunización con una de las moléculas relacionadas estructuralmente

En otra realización, el antígeno de especificidad dual es simplemente una de las dos moléculas diferentes pero relacionadas estructuralmente para la que se generan anticuerpos de especificidad dual. Una de las dos moléculas relacionadas se usa como agente de inmunización y después el repertorio de anticuerpos resultante se explora para determinar anticuerpos que se unan, y más preferiblemente neutralicen ambas dos moléculas diferentes pero relacionadas estructuralmente. Por ejemplo, se puede inmunizar con IL-1\alpha o con IL-1\beta y después explorar para aglutinantes \alpha/\beta, y más preferiblemente neutralizantes. Como se usa en esta realización, el término "inmunizar" está destinado a incluir ampliamente la exposición de un repertorio de anticuerpos para el antígeno, tal como IL-1\alpha o IL-1\beta, in vivo o in vitro. Por lo tanto, esta realización incluye inmunizar un animal con IL-1\alpha o IL-1\beta o y explorar los anticuerpos resultantes generados para seleccionar los anticuerpos que se unan tanto a IL-1\alpha como a IL-1\beta, así como explorar una biblioteca de anticuerpos recombinantes in vitro con IL-1\alpha o IL-1\beta y después seleccionar anticuerpos recombinantes que se unan tanto a IL-1\alpha como a IL-1\beta.

II. Métodos para fabricar anticuerpos de especificidad dual

Para preparar un anticuerpo de especificidad dual de la invención, se expone (in vivo o in vitro) un repertorio de anticuerpos a un antígeno de especificidad dual, preparado como se ha descrito en la sección anterior, y se selecciona del repertorio un anticuerpo de especificidad dual apropiado. Los dos elementos de reconocimiento de anticuerpos de un antígeno son el reconocimiento estructural y la maduración de afinidad en base a interacciones moleculares específicas. Durante una respuesta inmune natural, los anticuerpos de baja afinidad que reconocen motivos estructurales (por ejemplo el reconocimiento de un antígeno mediante ciertos receptores de reconocimiento de patrones) se desarrollan fácilmente, y de forma temprana en la respuesta inmune natural esto se sigue de mutaciones somáticas para aumentar la afinidad de unos pocos clones. Se han desarrollado diversos procesos in vivo e in vitro para mimetizar este fenómeno natural. Pueden generarse anticuerpos de especificidad dual de baja afinidad por cualquiera de los métodos in vivo e in vitro descritos en este documento y pueden prepararse MAb de especificidad dual de mayor afinidad mediante los métodos de mutagénesis somática descritos en este documento. Además, para optimizar los Mab de especificidad dual de alta afinidad, pueden generarse estructuras co-cristalinas de los Mab de baja afinidad con los antígenos deseados. La información estructural obtenida puede servir de guía para aumentos de afinidad adicionales modificando (mutando) restos de contacto específicos de los MAb para potenciar interacciones moleculares específicas, como se ha descrito en este documento.

Los métodos para fabricar anticuerpos de especificidad dual usando estrategias in vivo, estrategias in vitro o una combinación de ambas, se describen con más detalle en las siguientes subsecciones.

A. Estrategias in vivo

Una estrategia in vivo convencional para preparar anticuerpos es inmunizando un sujeto animal apropiado con un antígeno para exponer de esta manera el repertorio de anticuerpos in vivo al antígeno, seguido por la recuperación de un anticuerpo o anticuerpos de interés del animal. Dicha estrategia puede adaptarse para la preparación de anticuerpos de especificidad dual mediante el uso de un antígeno de especificidad dual y la selección de anticuerpos que reconozcan específicamente las dos moléculas de interés relacionadas estructuralmente. Pueden prepararse anticuerpos de especificidad dual inmunizando a un sujeto adecuado (por ejemplo, conejo, cabra, ratón u otro mamífero, incluyendo versiones transgénicas y knockout de dichos mamíferos) con una preparación inmunogénica de un antígeno de especificidad dual. Una preparación inmunogénica apropiada puede contener, por ejemplo, un antígeno de especificidad dual sintetizado químicamente o expresado de forma recombinante. La preparación puede incluir además un adyuvante, tal como adyuvante completo o incompleto de Freund, o compuestos inmunoestimulantes similares. Además, cuando se usa para generar anticuerpos, en particular por inmunización in vivo, un antígeno de especificidad dual de la invención puede usarse en solitario, o más preferiblemente se usa como un conjugado con una proteína transportadora. Dicha estrategia para potenciar las respuestas de anticuerpos es bien conocida en la técnica. Los ejemplos de proteínas transportadoras adecuadas con las que puede conjugarse un antígeno de especificidad dual incluyen hemocianina de lapa californiana (KLH) y albúmina.

Pueden obtenerse células productoras de anticuerpos del sujeto y usarse para preparar anticuerpos monoclonales mediante técnicas convencionales, tales como la técnica del hibridoma descrita originalmente por Kohler y Milstein (1975, Nature 256: 495-497) (véase también, Brown et al. (1981) J. Immunol 127: 539-46; Brown et al. (1980) J. Biol Chem 255: 4980-83; Yeh et al. (1976) PNAS 76: 2927-31 y Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29: 269-75). La tecnología para producir hibridomas de anticuerpos monoclonales se conoce bien (véase en general R. H. Kenneth, en Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., Nueva York, NuevaYork (1980); E. A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med, 54: 387-402; M. L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet., 3: 231-36). En resumen, una línea celular inmortal (típicamente un mieloma) se fusiona con linfocitos (típicamente esplenocitos o células de ganglios linfáticos o linfocitos de sangre periférica) de un mamífero inmunizado con un inmunógeno de especificidad dual como se ha descrito anteriormente, y los sobrenadantes del cultivo de las células del hibridoma resultante se exploran para identificar un hibridoma que produzca un anticuerpo monoclonal con especificidad dual para las dos moléculas diferentes pero relacionadas estructuralmente de interés. Puede aplicarse cualquiera de los muchos protocolos bien conocidos usados para fusionar linfocitos y líneas celulares inmortalizadas con el propósito de generar anticuerpos monoclonales de especificidad dual (véase, por ejemplo, G. Galfre et al. (1977) Nature 266: 550-52; Gefter et al. Somatic Cell Genet., citado anteriormente; Lerner, Yale J. Biol. Med., citado anteriormente; Kenneth, Monoclonal Antibodies, citado anteriormente). Además, los especialistas apreciarán que hay muchas variaciones de dichos métodos, que también serían útiles. Típicamente, la línea celular inmortal (por ejemplo, una línea celular de mieloma) procede de la misma especie de mamífero que los linfocitos. Por ejemplo, los hibridomas murinos pueden fabricarse fusionando linfocitos de un ratón inmunizado con una preparación inmunogénica de la presente invención con una línea celular de ratón inmortalizada. Las líneas celulares inmortales preferidas son líneas celulares de mieloma de ratón que son sensibles al medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"). Puede usarse cualquiera de varias líneas celulares de mieloma como un compañero de fusión de acuerdo con las técnicas convencionales, por ejemplo, las líneas de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 o Sp2/O-Ag14. Estas líneas de mieloma están disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Rockville, Md. Típicamente, las células de mieloma de ratón sensibles a HAT se fusionan a esplenocitos de ratón usando polietilenglicol ("PEG"). Las células del hibridoma que son el resultado de la fusión se seleccionan después usando el medio HAT, que destruye las células de mieloma no fusionadas y fusionadas de forma improductiva (los esplenocitos no fusionados mueren después de varios días porque no están transformados). Las células de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente las dos moléculas de interés relacionadas estructuralmente se identifican explorando los sobrenadantes de cultivo de hibridoma para dichos anticuerpos, por ejemplo, usando un ensayo de ELISA convencional, para seleccionar los anticuerpos que pueden unirse específicamente a las dos moléculas relacionadas.

Dependiendo del tipo de anticuerpo deseado, pueden usarse diversos animales hospedadores para la inmunización in vivo. Puede usarse un hospedador que exprese en sí una versión endógena del antígeno (o antígenos) de interés o, como alternativa, puede usarse un hospedador que se ha vuelto deficiente en una versión endógena del antígeno (o antígenos) de interés. Por ejemplo, se ha demostrado que los ratones que se han vuelto deficientes para una proteína endógena particular por recombinación homóloga en el gen endógeno correspondiente (es decir, ratones "knockout") provocan una respuesta humoral para la proteína cuando se inmunizan con la misma y por lo tanto pueden usarse para la producción de anticuerpos monoclonales de elevada afinidad para la proteína (véase por ejemplo, Roes, J. et al. (1995) J. Immunol. Methods 183: 231-237; Lunn, M. P. et al. (2000) J. Neurochem. 75: 404-412.

Para la producción de anticuerpos no humanos (por ejemplo, contra un antígeno de especificidad dual humano), diversos mamíferos no humanos son adecuados como hospedadores para la producción de anticuerpos, incluyendo pero sin limitación ratones, ratas, conejos y cabras (y versiones knockout de los mismos), aunque se prefieren ratones para la producción de hibridomas. Además, para la producción de anticuerpos totalmente humanos contra un antígeno de especificidad dual humano, puede usarse un animal hospedador no humano que exprese un repertorio de anticuerpos humanos. Dichos animales no humanos incluyen animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que llevan transgenes de inmunoglobulina humana, ratones quiméricos hu-PBMC-SCID y quimeras por radiación de humano/ratón, cada uno de las cuales se analiza más adelante.

De este modo, en una realización, el animal que se inmuniza con un antígeno de especificidad dual es un mamífero no humano, preferiblemente un ratón, que es transgénico para los genes de inmunoglobulina humana de manera que el mamífero no humano (por ejemplo, ratón) fabrica anticuerpos humanos tras la estimulación antigénica. Típicamente, en dichos animales, se introducen transgenes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera en configuración de línea germinal humana en los animales que se han manipulado por ingeniería genética de manera que sus loci endógenos de cadena pesada y ligera son inactivos. Después de la estimulación antigénica de dichos animales (por ejemplo, con un antígeno humano), se producen anticuerpos derivados de las secuencias de inmunoglobulina humana (es decir, anticuerpos humanos) y pueden fabricarse anticuerpos monoclonales humanos a partir de linfocitos de dichos animales mediante tecnología de hibridoma convencional. Para una descripción adicional de ratones transgénicos de inmunoglobulina humana y su uso en la producción de anticuerpos humanos véase por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 5.939.598, publicación PCT Nº WO 96/33735, publicación PCT Nº WO 96/34096, publicación PCT Nº WO 98/24893 y publicación PCT Nº WO 99/53049 para Abgenix Inc., y patentes de Estados Unidos Nº 5.545.806, Nº 5.569.825, Nº 5.625.126, Nº 5.633.425, Nº 5.770.429, Nº 5.814.318, Nº 5.877.397 y publicación PCT WO 99/45962 para Genpharm Inc. Véase también MacQuitty, J. J. y Kay, R. M. (1992) Science 257: 1188; Taylor, L. D. et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 6287-6295; Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368: 856-859; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Int. Rev. Immunol. 13: 65-93; Harding, F.A. y Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764: 536-546; Fishwild, D. M. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; Mendez, M. J. et al. (1997) Nature Genetics 15: 146-156; Green, L. L. y Jakobovits, A. (1998) J. Exp. Med. 188:483-495; Green, L. L. (1999) J. Immunol Methods 231: 11-23; Yang, X. D. et al. (1999) J. Leukoc. Biol. 66: 401-410; Gallo, M. L. et al. (2000) Eur. J. Immunol. 30: 534-540.

En otra realización, el animal que se inmuniza con un antígeno de especificidad dual es un ratón con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) que se ha reconstituido con células mononucleares de sangre periférica humanas o células linfoides o precursoras de las mismas. Se ha demostrado que, dichos ratones denominados ratones quiméricos hu-PBMC-SCID, producen respuestas de inmunoglobulinas humanas tras la estimulación antigénica. Para una descripción adicional de estos ratones y su uso en la generación de anticuerpos, véase por ejemplo, Leader, K. A. et al. (1992) Immunology 76: 229-234; Bombil, F. et al. (1996) Immunobiol. 195: 360-375; Murphy, W. J. et al. (1996) Semin. Immunol. 8: 233-241; Herz, U. et al. (1997) Int. Arch. Allergy Immunol. 113: 150-152; Albert, S. E. et al (1997) J. Immunol. 159: 1393-1403; Nguyen, H. et al. (1997) Microbiol. Immunol. 41: 901-907; Arai, K. et al. (1998) J. Immunol. Methods 217: 79-85; Yoshinari, K. y Arai, K. (1998) Hybridoma 17: 41-45; Hutchins, W. A. et al. (1999) Hybridoma 18: 121-129; Murphy, W. J. et al. (1999) Clin. Immunol. 90: 22-27; Smithson, S. L. et al. (1999) Mol. Immunol. 36: 113:124; Chamat, S. et al. (1999) J. Infect Diseases 180: 268-277 y Heard, C. et al. (1999) Molec. Med. 5: 35-45.

En otra realización, el animal que se inmuniza con un antígeno de especificidad dual es un ratón que se ha tratado con irradiación corporal total letal, seguida de radioprotección con células de médula ósea de un ratón con inmunodeficiencia combinada grave (SCID), seguida de injertos con linfocitos humanos funcionales. Este tipo de quimera, denominado sistema Trimera, se ha usado para producir anticuerpos monoclonales humanos inmunizando al ratón con un antígeno de interés seguido de la preparación de anticuerpos monoclonales usando la tecnología del hibridoma convencional. Para una descripción adicional de estos ratones y su uso en la generación de anticuerpos, véase por ejemplo Eren, R. et al. (1998) Immunology 93: 154-161; Reisner, Y y Dagan, S. (1998) Trends Biotechnol. 16: 242-246; IIan, E. et al. (1999) Hepatology 29: 553-562 y Bocher, W. O. et al (1999) Immunology 96: 634-641.

B. Estrategias in vitro

Como alternativa a preparar anticuerpos de especificidad dual por inmunización y selección in vivo, puede identificarse y aislarse un anticuerpo de especificidad dual de la invención mediante la exploración de una biblioteca de inmunoglobulina combinatoria recombinante (por ejemplo, una biblioteca de presentación en fagos de anticuerpos) con un antígeno de especificidad dual, para aislar de esta manera miembros de la biblioteca de inmunoglobulinas que se unan específicamente a las dos moléculas de interés relacionadas estructuralmente aunque diferentes. Están disponibles en el mercado kits para generar y explorar bibliotecas de presentación en fagos (por ejemplo, el Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Nº Catálogo 27-9400-01; y el Stratagene SurfZAP^{TM} Phage Display Kit, Nº Catálogo 240612). En diversas realizaciones, la biblioteca de presentación en fagos es una biblioteca de scFv o una biblioteca de Fab. La técnica de presentación en fagos para explorar bibliotecas de anticuerpos recombinantes se ha descrito ampliamente en la técnica. Pueden encontrarse ejemplos de métodos y compuestos particularmente adecuados para usar en la generación y exploración de bibliotecas de presentación de anticuerpos, por ejemplo, en McCafferty et al. Publicación Internacional Nº WO 92/0147, patente de Estados Unidos Nº 5.969.108 y EP 589.877 (que describe en particular la presentación del scFv), Ladner et al. patente de Estados Unidos Nº 5.223.409, Nº 5.403.484, Nº 5.571.698, Nº 5.837.500 y EP 436.597 8 (que describe, por ejemplo, la fusión pIII); Dower et al. Publicación Internacional Nº WO 91/17271, patente de Estados Unidos Nº 5.427.908, patente de Estados Unidos Nº 5.580.717 y EP 527.839 (que describe en particular la presentación de Fab); Winter et al. Publicación Internacional WO 92/20791 y EP 368.684 (que describe en particular la clonación de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina); Griffiths et al. patente de Estados Unidos Nº 5.885.793 y documento EP 589.877 (que describe en particular el aislamiento de anticuerpos humanos para antígenos humanos usando bibliotecas recombinantes); Garrard et al. Publicación Internacional Nº WO 92/09690 (que describe en particular técnicas de expresión en fagos); Knappik et al. Publicación Internacional Nº WO 97/08320 (que describe la biblioteca de anticuerpos recombinantes humanos HuCal); Salfeld et al. Publicación Internacional Nº WO 97/29131, que describe la preparación de un anticuerpo humano recombinante para un antígeno humano (factor de necrosis tumoral alfa humano), así como la maduración de afinidad in vitro del anticuerpo recombinante) y Salfeld et al. Solicitud Provisional de Estados Unidos Nº 60/126.603, que también describe la preparación de un anticuerpo humano recombinante para un antígeno humano (interleuquina-12 humana), así como la maduración de afinidad in vitro del anticuerpo recombinante).

Pueden encontrarse otras descripciones de explorar de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en publicaciones científicas tales como Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibody Hybridomas 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226: 889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89: 3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acis Res 19: 4133-4137; Barbas et al. (1991) PNAS 88: 7978-7982; McCafferty et al. Nature (1990) 348: 552-554 y Knappik et al. (2000) J. Mol. Biol. 296:57-86.

Como alternativa al uso de sistemas de presentación en bacteriófagos, las bibliotecas de anticuerpos recombinantes pueden expresarse en la superficie de células de levadura o células bacterianas. Se describen además métodos para preparar y explorar bibliotecas expresadas en la superficie de células de levadura en la publicación PCT WO 99/36569. Los métodos para preparar y explorar bibliotecas expresadas en la superficie de células bacterianas se describen además en la publicación PCT WO 98/49286.

Una vez que se ha identificado un anticuerpo de interés de una biblioteca combinatoria, los ADN que codifican las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo se aíslan mediante técnicas de biología molecular convencionales, tales como por amplificación por PCR de ADN del paquete de presentación (por ejemplo, fagos) aislado durante el proceso de exploración de la biblioteca. Se conocen en la técnica secuencias de nucleótidos de genes de cadena ligera y pesada de anticuerpos a partir de las que pueden prepararse cebadores de PCR. Por ejemplo, se describen muchas de dichas secuencias en Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Department of Health and Human Services, publicación NIH Nº 91-3242 y en la base de datos de secuencias de la línea germinal humana "Vbase".

Puede prepararse un anticuerpo, o una parte de anticuerpo, de la invención mediante expresión recombinante de los genes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina en una célula hospedadora. Para expresar un anticuerpo de manera recombinante, se transfecta una célula hospedadora con uno o más vectores de expresión recombinantes que llevan fragmentos de ADN que codifican las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina del anticuerpo de manera que las cadenas ligeras y pesadas se expresan en la célula hospedadora y, preferiblemente, se secretan en el medio en el que se cultivan las células hospedadoras, pudiendo recuperarse los anticuerpos a partir de dicho medio. Se usan metodologías de ADN recombinante convencionales para obtener genes de cadena pesada y ligera de anticuerpos, incorporan estos genes en los vectores de expresión recombinante e introduce los vectores en células hospedadoras, tales como las descritas en Sambrook, Fritsch y Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989), Ausubel, F. M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates, (1989) y en la patente de Estados Unidos Nº 4.816.397 por Boss et al.

Una vez obtenidos los fragmentos de ADN que codifican los segmentos VH y VL del anticuerpo de interés, estos fragmentos de ADN pueden manipularse adicionalmente mediante técnicas de ADN recombinante convencionales, por ejemplo para convertir los genes de la región variable a genes de cadena de anticuerpo de longitud completa, en genes de fragmento Fab o en un gen de scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica VL o VH está unido operativamente a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o un enlazador flexible. La expresión "unido operativamente", como se usa en este contexto, pretende significar que los dos fragmentos de ADN están unidos de manera que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en fase de lectura.

El ADN aislado que codifica la región VH puede convertirse en un gen de cadena pesada de longitud completa uniendo operativamente el ADN que codifica VH con otra molécula de ADN que codifica las regiones constantes de cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Se conocen en la técnica las secuencias de genes de la región constante de la cadena pesada humana (véase por ejemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Department of Health and Human Services, publicación NIH Nº 91-3242) y los fragmentos de ADN que incluyen estas regiones pueden obtenerse mediante amplificación PCR convencional. La región constante de cadena pesada puede ser una región constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero más preferiblemente es una región constante de IgG1 o IgG4. Para un gen de cadena pesada del fragmento Fab, el ADN que codifica VH puede
unirse operativamente a otra molécula de ADN que únicamente codifique la región constante CH1 de cadena pesada.

El ADN aislado que codifica la región VL puede convertirse en un gen de cadena ligera de longitud completa (así como en un gen de cadena ligera Fab) uniendo operativamente el ADN que codifica VL con otra molécula de ADN que codifique la región constante de cadena ligera, CL. Se conocen en la técnica las secuencias de genes de la región constante de la cadena ligera humana (véase por ejemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Department of Health and Human Services, publicación NIH Nº 91-3242) y los fragmentos de ADN que incluyen estas regiones pueden obtenerse mediante amplificación PCR convencional. La región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda, pero más preferiblemente es una región constante kappa.

Para crear un gen de scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL se unen operativamente a otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly_{4}-Ser)_{3}, de manera que las secuencias VH y VL pueden expresarse como una proteína de cadena simple contigua, con las regiones VL y VH unidas por el enlazador flexible (véase por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348: 552-554).

Para expresar los anticuerpos recombinantes, o partes de anticuerpos de la invención, pueden insertarse ADN que codifican cadenas ligeras y pesadas parciales o de longitud completa, obtenidos como se ha descrito anteriormente, en vectores de expresión de manera que los genes se unen operativamente a secuencias de control de la transcripción y de la traducción. En este contexto, la expresión "unido operativamente", pretende significar que un anticuerpo se liga en un vector de manera que las secuencias de control de la transcripción y de la traducción dentro del vector cumplen la función pretendida de regular la transcripción y traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se eligen para ser compatibles con la célula hospedadora de expresión usada. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse en vectores separados o, más típicamente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresión mediante métodos convencionales (por ejemplo, ligadura de los sitios de restricción complementarios en el fragmento génico del anticuerpo y vector, o ligación de extremos romos, si no hay presentes sitios de restricción). Antes de insertar las secuencias de cadena ligera o pesada, el vector de expresión puede llevar ya secuencias de la región constante del anticuerpo. Por ejemplo, una estrategia para convertir las secuencias VH y VL en genes de anticuerpo de longitud completa es insertarlas en vectores de expresión que ya codifican regiones constantes de cadena pesada y constantes de cadena ligera, respectivamente, de manera que el segmento VH se une operativamente al segmento (o segmentos) CH dentro del vector y el segmento VL se une operativamente al segmento CL dentro del vector. Adicionalmente o como alternativa, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo a partir de una célula hospedadora. El gen de la cadena de anticuerpo puede clonarse en el vector de manera que el péptido señal se une en la fase de lectura al extremo terminal amino del gen de la cadena de anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína no inmunoglobulina).

Además de los genes de la cadena de anticuerpo, los vectores de expresión recombinante de la invención llevan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de la cadena de anticuerpo en una célula hospedadora. La expresión "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o traducción de los genes de la cadena de anticuerpo. Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Los especialistas en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión, que incluye la selección de secuencias reguladoras puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para la expresión de células hospedadoras de mamíferos incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de expresión de proteínas en células de mamíferos, tales como promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/potenciador de CMV), virus de los simios 40 (SV40) (tal como el promotor/potenciador SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)) y polioma. Para una descripción adicional de los elementos reguladores de virus y secuencias de los mismos, véase por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 5.168.062 por Stinski, patente de estados Unidos Nº 4.510.245 por Bell et al. y la patente de Estados Unidos Nº 4.968.615 por Schaffner et al.

Además de los genes de la cadena de anticuerpo y secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinante de la invención pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulen la replicación del vector en células hospedadoras (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores de selección. Los genes marcadores de selección facilitan la selección de las células hospedadoras en las que se ha introducido el vector (véanse, por ejemplo, las patentes de estados Unidos Nº 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todas por Axel et al.). Por ejemplo, típicamente el gen marcador de selección confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedadora en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores de selección preferidos incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para usar en células hospedadoras dhrf con selección/amplificación con metotrexato) y el gen neo (para selección con G418).

Para la expresión de las cadenas ligeras y pesadas, el vector (o vectores) de expresión que codifican las cadenas pesadas y ligeras se usa para transfectar una célula hospedadora mediante técnicas convencionales. Las diversas formas del término "transfección" pretenden incluir una amplia diversidad de técnicas comúnmente usadas para introducir ADN exógeno en una célula hospedadora procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano y similares. Aunque teóricamente es posible expresar los anticuerpos de la invención tanto en células hospedadoras procariotas como eucariotas, la expresión de anticuerpos en células eucariotas, y más preferiblemente en células hospedadoras de mamíferos, es la más preferida porque es más probable que dichas células eucariotas, y en particular las células de mamíferos, ensamble y secreten un anticuerpo correctamente plegado y activo inmunológicamente que las células procariotas. Se ha notificado que la expresión procariota de genes de anticuerpos es ineficaz para la producción de rendimientos elevados de anticuerpos activos (Boss, M. A. y Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6: 12-13).

Las células hospedadoras de mamíferos preferidas para la expresión de anticuerpos recombinantes de la invención incluyen de Ovario de Hámster Chino (células CHO) (que incluyendo células CHO dhfr-, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Natl: Acad Sci. USA 77:4216-4220, usadas con un marcador de selección con DHPR, por ejemplo, como se ha descrito en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621), células de mieloma NSO, células COS y células SP2. Cuando se introducen vectores de expresión recombinante que codifican genes de anticuerpos en células hospedadoras de mamíferos, los anticuerpos se producen cultivando las células hospedadoras durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospedadoras o, más preferiblemente, la secreción del anticuerpo al medio de cultivo en el que se cultivan las células hospedadoras. Los anticuerpos pueden recuperarse a partir del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteínas convencionales.

También pueden usarse células hospedadoras para producir partes de anticuerpos intactos, tales como fragmentos Fab o moléculas scFv. Se entenderá que las variaciones en el procedimiento anterior están dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar una célula hospedadora con un ADN que codifica la cadena ligera o la cadena pesada (pero no ambas) de un anticuerpo de esta invención. La tecnología de ADN recombinante también puede usarse para eliminar algunos o todos los ADN que codifican cualquiera o ambas cadenas ligera y pesada y que no sean necesarios para la unión a antígenos de interés. Las moléculas expresadas a partir de dichas moléculas de ADN truncadas también están incluidas en los anticuerpos de la invención. Además, pueden producirse anticuerpos bifuncionales en los que una cadena pesada y una ligera son un anticuerpo de la invención y la otra cadena pesada y ligera son específicas para un antígeno distinto de los antígenos de interés por entrecruzamiento de un anticuerpo de la invención con un segundo antígeno mediante métodos de entrecruzamiento químico convencionales.

En un sistema preferido para la expresión recombinante de un anticuerpo o parte de unión al antígeno del mismo, de la invención, se introduce un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada del anticuerpo como la cadena ligera del anticuerpo en células CHO dhfr- por transfección mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes de cadena pesada y ligera del anticuerpo están cada uno unido operativamente a elementos reguladores del potenciador CMV/promotor AdMLP para dirigir altos niveles de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también lleva un gen de DHFR, que permite la selección de células CHO que se han transfectado con el vector usando la selección/amplificación con metotrexato. Las células hospedadoras transformadas seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo y el anticuerpo intacto se recupera del medio de cultivo. Se usan técnicas de biología molecular convencionales para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células hospedadoras, seleccionar los transformantes, cultivar las células hospedadoras y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo. Además la invención proporciona un método para sintetizar un anticuerpo recombinante de la invención cultivando una célula hospedadora de la invención en un medio de cultivo adecuado hasta sintetizar un anticuerpo recombinante de la invención. El método puede comprender además aislar el anticuerpo recombinante del medio de cultivo.

Como alternativa a la exploración de bibliotecas de anticuerpos recombinantes mediante presentación en fagos, pueden aplicarse otras metodologías conocidas en la técnica para explorar grandes bibliotecas combinatorias para la identificación de anticuerpos de especificidad dual de la invención. Un tipo de sistema de expresión alternativo es uno en el que la biblioteca de anticuerpos recombinantes se expresa como fusiones de ARN-proteína, como se describe en la publicación PCT Nº WO 98/31700 por Szostak y Roberts y Roberts, R. W. y Szostak, J. W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 24: 12297-12302. En este sistema, se crea una fusión covalente entre un ARNm y el péptido o proteína que codifica mediante la traducción in vitro de ARNm sintéticos que llevan puromicina, un antibiótico aceptor de peptidilo, en su extremo 3'. De esta manera, un ARNm específico puede enriquecerse a partir de una mezcla compleja de ARNm (por ejemplo, una biblioteca combinatoria) en base a las propiedades del péptido o proteína codificada, por ejemplo, un anticuerpo, o parte del mismo, tal como la unión del anticuerpo, o una parte del mismo, al antígeno de especificidad dual. Las secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos, o partes de los mismos, recuperadas a partir de la exploración de dichas bibliotecas pueden expresarse por medios recombinantes como se ha descrito anteriormente (por ejemplo, en células hospedadoras de mamíferos) y, además, pueden someterse a una maduración de afinidad adicional por vueltas de selección adicionales de fusiones ARNm-péptido en las que se han introducido mutaciones en la secuencia (o secuencias) seleccionadas originariamente, o por otros métodos para la maduración de afinidad in vitro de anticuerpos recombinantes, como se ha descrito anteriormente.

C. Estrategias de combinación

También pueden prepararse anticuerpos de especificidad dual de la invención usando una combinación de estrategias in vivo e in vitro, tales como métodos en los que el antígeno de especificidad dual se expone originariamente a un repertorio de anticuerpos in vivo en un animal hospedador para estimular la producción de anticuerpos que se unan al antígeno de especificidad dual, pero en los que adicionalmente se consigue la selección y/o maduración (es decir, mejora) del anticuerpo usando una o más técnicas in vitro.

En una realización, dicho método de combinación implica en primer lugar la inmunización de un animal no humano (por ejemplo, un ratón, rata, conejo, cabra o versión transgénica del mismo o un ratón quimérico) con el antígeno de especificidad dual para estimular una respuesta de anticuerpos contra el antígeno, seguida de la preparación y exploración de una biblioteca de anticuerpos de presentación en fagos usando secuencias de inmunoglobulina a partir de linfocitos estimulados in vivo por exposición al antígeno de especificidad dual; la primera etapa de este procedimiento de combinación puede realizarse como se ha descrito en la subsección anterior IIA, mientras que la segunda etapa de este procedimiento puede realizarse como se ha descrito en la subsección anterior IIB. Las metodologías preferidas para la hiperinmunización de animales no humanos seguida de exploración in vitro de bibliotecas de presentación en fagos preparadas a partir de linfocitos estimulados incluyen las descritas por BioSite Inc., véase por ejemplo, la publicación PCT WO 98/47343, publicación PCT WO 91/17271, patente de Estados Unidos Nº 5.427.908 y patente de Estados Unidos Nº 5.580.717.

En otra realización, un método de combinación implica en primer lugar la inmunización de un animal no humano (por ejemplo, un ratón, rata, conejo, cabra o una versión knockout y/o transgénica del mismo, o un ratón quimérico) con el antígeno de especificidad dual para estimular una respuesta de anticuerpos contra el antígeno y la selección de linfocitos que estén produciendo anticuerpos que tengan la especificidad dual deseada (por ejemplo, mediante exploración de hibridomas preparados a partir de los animales inmunizados). Los genes de anticuerpo reorganizados a partir de los clones seleccionados se aíslan después (mediante métodos de clonación convencionales, tales como la transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa) y se someten a maduración de afinidad in vitro, para potenciar de esta manera las propiedades de unión del anticuerpo o anticuerpos seleccionados. La primera etapa de este procedimiento puede realizarse como se ha descrito en la subsección anterior IIA, mientras que la segunda etapa de este procedimiento puede realizarse como se ha descrito en la subsección IIB anterior, en particular usando métodos de maduración de afinidad in vitro tales como los descritos en la publicación PCT WO 97/29131 y por la publicación WO 00/56772.

En otro método de combinación más, se generan anticuerpos recombinantes a partir de linfocitos individuales aislados usando un procedimiento denominado en la técnica método de anticuerpo de linfocito seleccionado (SLAM), como se describe en la patente de Estados Unidos Nº 5.627.052, publicación PCT WO 92/02551 y Babcock, J. S. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci USA 93: 7843-7848. En este método, como se aplica para los anticuerpos de especificidad dual de la invención, un animal no humano (por ejemplo, un ratón, rata, conejo, cabra o versiones transgénicas de los mismos, o un ratón quimérico) se inmuniza en primer lugar in vivo con el antígeno de especificidad dual para estimular una respuesta de anticuerpos contra el antígeno y después se seleccionan las células individuales que secreten los anticuerpos de interés, por ejemplo, específicas para el antígeno de especificidad dual, usando un ensayo de placas hemolíticas específico de antígenos (por ejemplo, el propio antígeno de especificidad dual o las moléculas de interés relacionadas estructuralmente, se unen a glóbulos rojos de oveja usando un enlazador, tal como biotina, permitiendo de esta manera la identificación de células individuales que secreten anticuerpos con la especificidad apropiada usando el ensayo de placas hemolíticas). Después de la identificación de las células de interés que secretan anticuerpos, los ADNc de la región variable de las cadenas pesada y ligera se rescatan de las células mediante transcripción inversa-PCR y después estas regiones variables pueden expresarse, en el contexto de regiones constantes de inmunoglobulina apropiadas (por ejemplo, regiones constantes humanas), en células hospedadoras de mamíferos tales como células COS o CHO. Las células hospedadoras transfectadas con las secuencias de inmunoglobulina amplificadas, obtenidas de linfocitos seleccionados in vivo, pueden someterse después a un análisis y selección adicionales in vitro, por ejemplo seleccionando las células transfectadas para aislar células que expresen anticuerpos que tengan la especificidad dual deseada. Las secuencias de inmunoglobulina amplificadas pueden manipularse adicionalmente in vitro, tal como mediante maduración de afinidad in vitro, como se ha descrito anteriormente.

III. Características de los anticuerpos de especificidad dual

La invención proporciona anticuerpos de especificidad dual, así como partes de anticuerpo de los mismos, que pueden prepararse de acuerdo con los métodos de la invención. Preferiblemente, los anticuerpos, o partes de los mismos, son anticuerpos aislados. Preferiblemente, los anticuerpos, o partes de los mismos, son anticuerpos neutralizantes. Los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos monoclonales y recombinantes y partes de los mismos. En diversas realizaciones, el anticuerpo, o parte del mismo, puede comprender, secuencias de aminoácidos que que proceden en su totalidad de una sola especie, tal como un anticuerpo, o parte del mismo, completamente humano o completamente de ratón. En otras realizaciones, el anticuerpo, o parte del mismo, puede ser un anticuerpo quimérico o un anticuerpo injertado a CDR u otra forma de anticuerpo humanizado.

El término "anticuerpo", como se usa en este documento, pretende referirse a moléculas de inmunoglobulina compuestas por cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada consta de una región variable de cadena pesada (abreviada en este documento HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada consta de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera consta de una región variable de cadena ligera (abreviada en este documento LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera consta de un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones más conservadas, denominadas regiones flanqueantes (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino terminal hasta el extremo carboxilo terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

La expresión "parte de unión al antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "parte de anticuerpo") como se usa en este documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo de especificidad dual que conserva la capacidad de unirse específicamente a dos antígenos diferentes pero relacionados estructuralmente. Se ha demostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión comprendidos dentro de la expresión "parte de unión al antígeno" de un anticuerpo nominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')_{2}, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificadas por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que permita que se generen como una sola cadena de proteína en la que el par de regiones VL y VH forme moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véase por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426 y Huston et al. (1988) Proc Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883. Dichos anticuerpos de cadena simple también pretenden incluirse dentro de la expresión "parte de unión al antígeno" de un anticuerpo. También están incluidas otras formas de anticuerpos de cadena sencilla, tales como diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes biespecíficos en los que los dominios VH y VL se expresan en una cadena polipeptídica sencilla pero usando un enlazador demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando de esta manera a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno (véase, por ejemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J. et al. (1994) Structure 2: 1121-1123.

Todavía adicionalmente, un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo puede ser parte de moléculas de inmunoadhesión de mayor tamaño, formadas por asociación covalente o no covalente del anticuerpo o parte del anticuerpo con una o más de otras proteínas o péptidos. Los ejemplos de dichas moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de la región de núcleo de estreptavidina para fabricar una molécula de scFv tetramérica (Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6: 93-101) y el uso de un resto cisteína, un péptido marcador y una etiqueta de polihistidina C-terminal para fabricar moléculas de scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov, S. M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31: 1047-1058). Pueden prepararse partes de anticuerpos, tales como fragmentos Fab y F(ab')_{2}, a partir de anticuerpos completos usando técnicas convencionales, tales como la digestión con papaína o pepsina, respectivamente; de anticuerpos completos. Además, pueden obtenerse anticuerpos, partes de anticuerpos y moléculas de inmunoadhesión usando técnicas de ADN recombinante convencionales.

Un "anticuerpo de especificidad dual aislado", como se usa en este documento, pretende referirse a un anticuerpo de especificidad dual que carece sustancialmente de otros anticuerpos que tienen especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a dos antígenos diferentes pero relacionados estructuralmente, o regiones relacionadas estructuralmente de antígenos no relacionados de otra manera, pero que carece sustancialmente de anticuerpos que se unen específicamente a otros antígenos no relacionados). Además, un anticuerpo de especificidad dual aislado puede carecer sustancialmente de otro material celular y/o químico.

Un "anticuerpo neutralizante", como se usa, pretende referirse a un anticuerpo cuya unión con un antígeno particular da como resultado la inhibición de la actividad biológica del antígeno. Esta inhibición de la actividad biológica del antígeno puede evaluarse por medición de uno o más indicadores de actividad biológica del antígeno usando un ensayo in vitro o in vivo apropiado.

Un "anticuerpo monoclonal" como se usa en este documento, pretende referirse a un anticuerpo derivado de un hibridoma (por ejemplo, un anticuerpo secretado por un hibridoma preparado mediante tecnología de hibridoma, tal como la metodología de hibridoma convencional de Kohler y Milstein). De esta manera, un anticuerpo de especificidad dual de la invención derivado de un hibridoma aún se denomina anticuerpo monoclonal aunque tiene especificidad antigénica por más de un solo antígeno.

La frase "anticuerpo recombinante" se refiere a anticuerpos que se preparan, expresan, crean y aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedadora, anticuerpos aislados a partir de una biblioteca de anticuerpos recombinantes combinatoria, anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylor L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique cortar y empalmar secuencias de genes de inmunoglobulina particulares (tales como secuencias de genes de inmunoglobulina humanos) con otras secuencias de ADN. Los ejemplos de anticuerpos recombinantes incluyen anticuerpos quiméricos, injertados a CDR y humani-
zados.

La expresión "anticuerpo humano" se refiere a anticuerpos que tienen regiones variables y constantes que se corresponden con, o derivadas de, secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana como las descritas, por ejemplo, por Kabat et al. (véase Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, publicación NIH Nº 91-3242). Sin embargo, los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir restos aminoacídicos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo en las CDR y en particular en la CDR3.

Los anticuerpos humanos recombinantes de la invención tienen regiones variables, y también pueden incluir regiones constantes, derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (véase Kabat, B. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, publicación NIH Nº 91-3242). Sin embargo, en ciertas realizaciones, dichos anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humanas, mutagénesis somática in vivo) y de esta manera las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, cuando proceden de y están relacionadas con la secuencias VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo. Sin embargo, en ciertas realizaciones, dichos anticuerpos recombinantes son el resultado de mutagénesis selectiva o retromutación o ambas.

El término "retromutación" se refiere a un proceso en el que algunos o todos los aminoácidos de un anticuerpo humano mutados somáticamente se reemplazan con los restos de la línea germinal correspondientes a partir de una secuencia de anticuerpo de la línea germinal homóloga. Las secuencias de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo humano de la invención se alinean por separado con las secuencias de la línea germinal en la base de datos VBASE para identificar las secuencias con la mayor homología. Las diferencias en el anticuerpo humano de la invención vuelven a la secuencia de la línea germinal por mutación de las posiciones de nucleótidos definidas que codifican dicho aminoácido diferente. El papel de cada aminoácido identificado de esta manera como candidato para la retromutación debe investigarse para un papel directo o indirecto en la unión al antígeno y no debe incluirse en el anticuerpo humano final ningún aminoácido que se descubra después de la mutación que afecta a cualquier característica deseable del anticuerpo humano. Para minimizar el número de aminoácidos sometidos a retromutación pueden conservarse las posiciones de aminoácidos que se descubra que son diferentes de la secuencia de la línea germinal más próxima pero idénticas al aminoácido correspondiente en una segunda secuencia de línea germinal, a condición de que la segunda secuencia de línea germinal sea idéntica y colineal a la secuencia del anticuerpo humano de la invención para al menos 10, preferiblemente 12 aminoácidos, a ambos lados del aminoácido en cuestión. La retromutación puede producirse en cualquier fase de la optimización de anticuerpos.

La expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de la región variable de las cadenas pesada y ligera de una especie y secuencias de la región constante de otra especie, tales como anticuerpos que tienen regiones variables de la cadena pesada y ligera murinas unidas a regiones constantes humanas.

La expresión "anticuerpo injertado a CDR" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de la región variable de las cadenas pesada y ligera de una especie pero en el que las secuencias de una o más de las regiones CDR de VH y/o VL se sustituyen por secuencias CDR de otra especie, tales como anticuerpos que tienen regiones variables de las cadenas pesada y ligera murinas en las que una o más de las CDR murinas (por ejemplo, CDR3) se han sustituido por secuencias CDR humanas.

La expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de región variable de las cadenas pesada y ligera de una especie no humana (por ejemplo, un ratón) pero en los que al menos una parte de la secuencia VH y/o VL se ha modificado para ser más "de tipo humano", es decir, más similar a las secuencias variables de la línea germinal humana. Un tipo de anticuerpo humanizado es un anticuerpo injertado a CDR, en el que las secuencias CDR humanas se introducen en secuencias VH y VL no humanas para sustituir las secuencias CDR no humanas correspondientes.

Un modo para medir la cinética de unión de un anticuerpo es mediante resonancia de plasmón superficial. La expresión "resonancia de plasmón superficial", como se usa en este documento, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real mediante la detección de alteraciones en las concentraciones de proteína dentro de una matriz biosensora, por ejemplo usando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden y Piscataway, NJ). Para descripciones adicionales, véase Jönsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; Jönsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11: 620-627; Johnsson B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131 y Johnsson B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277.

La expresión "K_{off}", como se usa en este documento, pretende referirse a la constante de disociación para la disociación de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno.

La expresión "K_{d}", como se usa en este documento, pretende referirse a la constante de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular.

Los anticuerpos de especificidad dual de la invención se preparan usando cualquiera de los diversos métodos para preparar anticuerpos descritos en la subsección anterior II. Los anticuerpos de especificidad dual de la invención pueden dirigirse esencialmente contra cualquier antígeno relacionado estructuralmente, aunque los anticuerpos de especificidad dual preferidos de la invención son los que se unen específicamente a IL-1\alpha y 1L-1\beta, que pueden prepararse usando un antígeno de especificidad dual tal como los descritos en los Ejemplos 1-4. Otros antígenos relacionados estructuralmente que pueden aplicarse a la presente invención incluyen pero sin limitación a los miembros de la familia de caspasas, familias de citoquinas, tales como miembros de la familia IL-1 (por ejemplo, IL-1/IL-18), miembros de la familia de TNF (por ejemplo, TNF\alpha/TNF\beta), miembros de la familia IL-6, interferones, miembros de la familia TGF\beta, miembros de la familia EGF, miembros de la familia de FGF, miembros de la familia de PDGF, miembros de la familia de VEGF, miembros de la familia de angiopoyetina, proteínas morfogénicas óseas, proteinasas secretadas (metaloproteinasas) y familias de receptores de citoquinas, tales como miembros de la familia del receptor de IL-1, miembros de la familia de los receptores de TNF, miembros de la familia del receptor de TGF\beta, miembros de la familia del receptor de EGF, miembros de la familia del receptor de FGF, miembros de la familia del receptor de PDGF, miembros de la familia del receptor VEGF y miembros de la familia del receptor angiopoyetina.

Los anticuerpos de especificidad dual de la invención pueden presentar la misma actividad de unión hacia los dos antígenos diferentes pero relacionados estructuralmente a los que se unen o, como alternativa, los anticuerpos de especificidad dual pueden unirse más preferiblemente a uno de los dos antígenos, y aun así tener especificidad hacia los dos antígenos relacionados en comparación con antígenos no relacionados. La actividad de unión de los anticuerpos de especificidad dual hacia los antígenos relacionados estructuralmente, así como hacia antígenos no relacionados, puede evaluarse usando inmunoensayos in vitro convencionales, tales como análisis de ELISA o BIAcore. Preferiblemente, la proporción de K_{d} del anticuerpo hacia antígenos no relacionados estructuralmente con respecto a la K_{d} del anticuerpo hacia antígenos relacionados estructuralmente debe ser al menos de 3, incluso más preferiblemente la proporción debe ser al menos de 5, incluso más preferiblemente la proporción debe ser al menos de 10 o incluso más preferiblemente la proporción debe ser al menos de 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ó 1000.

En términos cuantitativos, la diferencia entre la unión de fondo y la especificidad dual es de un nivel o grado. Por ejemplo, la unión de fondo es a bajo nivel, por ejemplo, menor de 5%, más preferiblemente menor de 3% y más preferiblemente, aproximadamente de 0,1-1% mientras que la reactividad cruzada específica o unión de especificidad dual es a un nivel más elevado, por ejemplo, superior a 1%, más preferiblemente superior a 3%, incluso más preferiblemente superior a 5% e incluso más preferiblemente superior a 10%. De manera adicional, preferiblemente la CI_{50} del anticuerpo de especificidad dual para los antígenos diana está próxima a la DE_{50} de los antígenos en un bioensayo determinado.

Un anticuerpo de especificidad dual, o parte de unión al antígeno del mismo, de la invención se selecciona preferiblemente para tener una cinética de unión deseable (por ejemplo, elevada afinidad, baja disociación, disociación lenta, intensa actividad neutralizante) para uno, y más preferiblemente ambos, antígenos a los que se une específicamente. Por ejemplo, el anticuerpo de especificidad dual, o parte del mismo, puede unirse a uno, y más preferiblemente a ambos, antígenos relacionados estructuralmente con una constante de disociación k_{off} de 0,1s ^{-1} o menor, más preferiblemente una constante de disociación k_{off} de 1 x 10^{-2} s^{-1} o menor, incluso más preferiblemente una constante de disociación k_{off} de 1 x 10^{-3} s^{-1} o menor, incluso más preferiblemente una constante de disociación k_{off} de 1 x 10^{-4} s^{-1} o menor, o incluso más preferiblemente una constante de disociación k_{off} de 1 x 10^{-5} s^{-1} o menor, como se determina mediante resonancia de plasmón superficial. De manera alternativa o adicionalmente, un anticuerpo de especificidad dual o parte del mismo, puede inhibir la actividad de uno y más preferiblemente ambos, antígenos relacionados estructuralmente con una CI_{50} de 1 x 10^{-6} M o menor, incluso más preferiblemente con una CI_{50} de 1 x 10^{-7} M o menor, incluso más preferiblemente con una CI_{50} de 1 x 10^{-8} M o menor, incluso más preferiblemente con una CI_{50} de 1 x 10^{-9} M o menor, incluso más preferiblemente con una CI_{50} de 1 x 10^{-10} M o menor, o incluso más preferiblemente con una CI_{50} de 1 x 10^{-11} M o menor. Preferiblemente, la CI_{50} debe medirse usando un bioensayo sensible en el que los valores de CI_{50} deben estar próximos al valor de DE_{50} del antígeno en este ensayo.

La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo de especificidad dual o parte de unión al antígeno del mismo, de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica de la invención puede comprender además al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, uno o más agentes terapéuticos adicionales para tratar un trastorno en el que el uso del anticuerpo de especificidad dual es beneficioso para la mejoría del trastorno. Por ejemplo, cuando el anticuerpo de especificidad dual se une específicamente a IL-1\alpha e IL-1\beta, la composición farmacéutica puede incluir además uno o más agentes terapéuticos adicionales para el tratamiento de trastornos en los que la actividad de IL-1 es perjudicial.

Los anticuerpos y partes de anticuerpo de la invención pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para administrar a un sujeto. Típicamente, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo o parte de anticuerpo de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en este documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares que son fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden comprender además cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian la vida útil o la eficacia del anticuerpo o parte de anticuerpo.

Los anticuerpos y partes de anticuerpo de la invención pueden incorporarse en una composición farmacéutica adecuada para administración parenteral. Preferiblemente, el anticuerpo o partes de anticuerpo se preparará como una solución inyectable que contiene 0,1-250 mg/ml de anticuerpo. La solución inyectable puede estar compuesta por una forma de dosificación líquida o liofilizada en un vial de sílex o ámbar, ampolla o jeringuilla precargada. El tampón puede ser L-histidina (1-50 mM), óptimamente 5-10 mM, a pH de 5,0 a 7,0 (óptimamente pH 6,0). Otros tampones adecuados incluyen pero sin limitación, succinato de sodio, citrato de sodio, fosfato de sodio o fosfato de potasio. El cloruro de sodio puede usarse para modificar la toxicidad de la solución a una concentración de 0-300 mM (óptimamente 150 mM para una forma de dosificación líquida). Pueden incluirse crioprotectores para una forma de dosificación liofilizada, principalmente sacarosa 0-10% (óptimamente 0,5-1,0%). Otros crioprotectores adecuados incluyen trehalosa y lactosa. Pueden incluirse agentes formadores de volumen para una forma de dosificación liofilizada, principalmente manitol 1-10% (óptimamente 2-4%). Pueden usarse estabilizantes en formas de dosificación tanto líquidas como liofilizadas, principalmente L-Metionina 1-50 mM (óptimamente 5-10 mM). Pueden incluirse otros agentes formadores de volumen adecuados incluyendo glicina, arginina, como polisorbato-80 al 0-0,05% (óptimamente 0,005-0,01%). Los tensioactivos adicionales incluyen pero sin limitación polisorbato 20 y tensioactivos BRIJ.

Las composiciones de esta invención pueden estar en una diversidad de formas. Éstas incluye, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo de administración que se pretende y de la aplicación terapéutica. Las composiciones típicas preferidas están en forma de soluciones inyectables o infundibles, tales como composiciones similares a las usadas para la inmunización pasiva de seres humanos con otros anticuerpos. El modo de administración preferido es parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular). En una realización preferida, el anticuerpo se administra por infusión o inyección intravenosa. En otra realización preferida, el anticuerpo se administra por inyección intramuscular o subcutánea.

Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo (es decir, el anticuerpo o parte de anticuerpo) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles, liofilizados, para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y secado por pulverización que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente esterilizada por filtración del mismo. La fluidez adecuada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede llevarse a cabo incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Los anticuerpos y partes de anticuerpo de la presente invención pueden administrarse mediante una diversidad de métodos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas, la vía/modo preferido de administración es inyección subcutánea, inyección intravenosa o infusión. Como se apreciará por los especialistas en la técnica, la vía y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. En ciertas realizaciones, el compuesto activo puede prepararse con un vehículo que protegerá al compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables, biocompatibles tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones se han patentado o son generalmente conocidos por los especialistas en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo o parte de anticuerpo de la invención puede administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) también pueden incluirse en una cápsula de gelatina de carcasa dura o blanda, comprimirse en comprimidos, o incorporarse directamente en la dieta del sujeto. Para la administración terapéutica oral, los compuestos pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Para administrar un compuesto de la invención mediante administración distinta a la parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o coadministrar el compuesto con, un material para evitar su inactivación.

Pueden incorporarse también compuestos activos complementarios en las composiciones. En ciertas realizaciones, un anticuerpo o parte de anticuerpo de la invención se coformula con y/o se coadministra con uno o más agentes terapéuticos adicionales que son útiles para el tratamiento de trastornos en los que la actividad de IL-1 es perjudicial. Por ejemplo, un anticuerpo de especificidad dual anti-IL-1\alpha/IL-1\beta, o partes de anticuerpo, de la invención puede coformularse y/o coadministrarse con uno o más anticuerpos adicionales que se unen a otras dianas (por ejemplo, anticuerpos que se unen a otras citoquinas o que se unen a moléculas de la superficie celular). Además, uno o más anticuerpos de la invención pueden usarse en combinación con dos o más de los agentes terapéuticos anteriores. Dichas terapias de combinación pueden utilizar ventajosamente dosificaciones inferiores de los agentes terapéuticos administrados, evitando de esta manera posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias.

IV. Usos de los Anticuerpos de Especificidad Dual

Dada su capacidad para unirse a dos antígenos diferentes pero relacionados estructuralmente, los anticuerpos de especificidad dual, o partes de los mismos, de la invención pueden usarse para detectar cualquiera o ambos de estos antígenos (por ejemplo, en una muestra biológica, tal como suero o plasma), usando un inmunoensayo convencional, tal como un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) o inmunohistoquímica tisular. La invención proporciona un método para detectar un antígeno en una muestra biológica que comprende poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo de especificidad dual, o parte de anticuerpo, de la invención que reconoce específicamente el antígeno y detectar tanto el anticuerpo (o parte de anticuerpo) unido al antígeno o anticuerpo (o parte de anticuerpo) no unido, para detectar de esta manera el antígeno en la muestra biológica. El anticuerpo está directa o indirectamente marcado con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Las sustancias detectables adecuadas incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano rusticano, fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; y los ejemplos del material radiactivo adecuado incluyen ^{121}I, ^{131}I, ^{35}S o ^{3}H.

Alternativo al marcaje del anticuerpo, el antígeno (o antígenos) pueden ensayarse en fluidos biológicos mediante un radioinmunoensayo de competición utilizando antígenos convencionales marcados con una sustancia detectable y un anticuerpo de especificidad dual no marcado específico para el antígeno (o antígenos). En este ensayo, se combinan la muestra biológica, los antígenos marcados convencionales y el anticuerpo de especificidad dual y se determina la cantidad de antígeno marcado convencional unido al anticuerpo no marcado. La cantidad de antígeno en la muestra biológica es inversamente proporcional a la cantidad de antígeno marcado convencional unido al anticuerpo no marcado.

En una realización preferida, el anticuerpo de especificidad dual reconoce específicamente IL-1\alpha e IL-1\beta y los métodos de detección anteriores se usan para detectar IL-1\alpha y/o IL-1\beta. Por consiguiente, la invención proporciona adicionalmente un método para detectar IL-1\alpha o IL-1\beta en una muestra biológica o de tejido que comprende poner en contacto la muestra biológica o tejido que se supone que contiene IL-1\alpha o IL-1\beta con un anticuerpo o parte de unión al antígeno del mismo de especificidad dual de la invención y detectar IL-1\alpha o IL-1\beta en la muestra biológica o tejido. La muestra biológica puede ser, por ejemplo, una muestra in vitro, tal como una muestra de células, tejido o fluido corporal (por ejemplo, sangre, plasma, orina, saliva, etc.). Además, el tejido detectado puede ser tejido situado en un sujeto in vivo, por ejemplo, tejido visualizado por imágenes del tejido in vivo (por ejemplo, usando un anticuerpo marcado).

Los anticuerpos de especificidad dual de la invención también pueden usarse para propósitos de diagnóstico. En una realización, un anticuerpo de la invención se usa en un ensayo de diagnóstico in vitro, tal como un ensayo de laboratorio para detectar el antígeno (o antígenos) de interés o en un punto de atención del ensayo detectar el antígeno (o antígenos) de interés. Los ejemplos de ensayos in vitro bien establecidos que utilizan anticuerpos incluyen ELISA, RIA, transferencias de Western y similares. En otra realización, un anticuerpo de la invención se usa en un ensayo de diagnóstico in vivo, tal como una prueba de imagen in vivo. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con una sustancia detectable capaz de detectarse in vivo, el anticuerpo marcado puede administrarse a un sujeto, y el anticuerpo marcado puede detectarse in vivo, permitiendo de esta manera la formación de imágenes in vivo.

Los anticuerpos de especificidad dual de la invención que reconocen específicamente IL-1\alpha e IL-1\beta pueden usarse en ensayos de diagnóstico para detectar IL-1\alpha y/o IL-1\beta para propósitos de diagnóstico, por ejemplo en una variedad de enfermedades y trastornos inflamatorios, así como en la resorción espontánea de fetos. Con respecto a tipos específicos de enfermedades y trastornos, los anticuerpos de especificidad dual anti IL-1\alpha/IL-1\beta de la invención pueden usarse para propósitos de diagnóstico en cualquiera de las enfermedades/trastornos descritos en este documento con respecto a los usos terapéuticos de dichos anticuerpos (véase más adelante), tales como trastornos en los que la actividad IL-1 es perjudicial, analizados más adelante.

Los anticuerpos de especificidad dual y partes de anticuerpo de la invención preferiblemente son capaces de neutralizar, tanto in vivo como in vitro, la actividad de los antígenos a los que se unen. Por consiguiente, dichos anticuerpos y partes de anticuerpo de la invención pueden usarse para inhibir la actividad de los antígenos, por ejemplo, en un cultivo celular que contiene los antígenos o en sujetos humanos o en otros sujetos mamíferos que tienen los antígenos con los que reaccionan los anticuerpos de especificidad dual de la invención. En una realización, la invención proporciona un método para inhibir la actividad del antígeno que comprende poner en contacto el antígeno con un anticuerpo de especificidad dual o parte del anticuerpo de la invención de modo que la actividad del antígeno se inhibe. En una realización preferida, el anticuerpo de especificidad dual se une a IL-1\alpha e IL-1\beta y el método es un método para inhibir la actividad IL-1\alpha y/o IL-1\beta poniendo en contacto IL-1\alpha y/o IL-1\beta con el anticuerpo de especificidad dual o parte del mismo. La actividad de IL-1\alpha y/o IL-1\beta puede inhibirse, por ejemplo, in vitro. Por ejemplo, en un cultivo celular que contiene, o se supone que contiene, IL-1\alpha y/o IL-1\beta, un anticuerpo o parte de anticuerpo de la invención puede añadirse al medio de cultivo para inhibir la actividad de IL-1\alpha y/o IL-1\beta en el cultivo. De manera alternativa, la actividad de IL-1\alpha y/o IL-1\beta puede inhibirse in vivo en un sujeto.

En otra realización, la invención proporciona un método para inhibir la actividad antigénica en un sujeto que padece un trastorno en el que esta actividad antigénica es perjudicial. La invención proporciona métodos para inhibir la actividad antigénica en un sujeto que padece dicho trastorno, comprendiendo dicho método administrar al sujeto un anticuerpo de especificidad dual o parte de anticuerpo de la invención de manera que la actividad antigénica en el sujeto se inhibe. Preferiblemente el antígeno es un antígeno humano y el sujeto es un sujeto humano. Un anticuerpo de la invención puede administrarse a un sujeto humano para fines terapéuticos. Además un anticuerpo de la invención puede administrarse a un mamífero no humano que expresa un antígeno al cual se une el anticuerpo con fines veterinarios o como un modelo animal de enfermedad humana. Con respecto a esto último, dichos modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de los anticuerpos de la invención (por ejemplo, ensayando dosificaciones y cursos de tiempo de la administración).

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Preferiblemente, el anticuerpo de especificidad dual se une a IL-1\alpha e IL-1\beta y el método para inhibir la actividad antigénica en un sujeto es un método para inhibir la actividad de IL-1 en un sujeto, por ejemplo un sujeto que padece un trastorno en el que la actividad IL-1 es perjudicial. Como se usa en este documento, la expresión "un trastorno en el que la actividad IL-1 es perjudicial" pretende incluir enfermedades y otros trastornos en los que la presencia de IL-1 (que incluye tanto IL-1\alpha como IL-1\beta) en un sujeto que padece el trastorno ha demostrado ser, o se supone que es responsable de la patofisiología del trastorno o un factor que contribuye al empeoramiento del trastorno. Por consiguiente, un trastorno en el que la actividad de IL-1 es perjudicial, es un trastorno en el que se espera que la inhibición de la actividad de IL-1 (es decir, cualquiera o tanto IL-1\alpha como IL-1\beta) alivie los síntomas y/o progresión del trastorno. Dichos trastornos pueden evidenciarse, por ejemplo, por un aumento en la concentración de IL-1 en un fluido biológico de un sujeto que padece el trastorno (por ejemplo, un aumento en la concentración de IL-1 en suero, plasma, fluido sinovial, etc. del sujeto), que puede detectarse, por ejemplo, usando un anticuerpo anti-IL-1 como se ha descrito anteriormente.

La interleuquina 1 juega un papel crítico en la patología asociada con una diversidad de enfermedades que implican elementos inmunes e inflamatorios. Estas enfermedades incluyen, pero sin limitación, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis de Lyme, artritis psoriásica, artritis reactiva, espondiloartropatía, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad intestinal inflamatoria, diabetes mellitus dependiente de insulina, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, psoriasis, dermatitis, esclerodermia, enfermedad del injerto contra el hospedador, rechazo de trasplante de órganos, enfermedad inmune aguda o crónica asociada con trasplante de órganos, sarcoidosis, aterosclerosis, coagulación intravascular diseminada, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Grave, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, púrpura de Henoch-Schoenlein, vasculitis microscópica renal, hepatitis activa crónica, uveítis, septicemia, síndrome de choque tóxico, síndrome séptico, caquexia, enfermedades infecciosas, enfermedades parasitarias, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, mielitis transversal aguda, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, derrame cerebral, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, tumores, fallo cardiaco, infarto de miocardio, enfermedad de Addison, deficiencia poliglandular esporádica de tipo I y deficiencia poliglandular de tipo II, síndrome de Schmidt, síndrome de insuficiencia respiratoria (aguda) en adultos, alopecia, alopecia areata, artropatía seronegativa, artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía psoriásica, artropatía colítica ulcerosa, sinovitis enteropática, clamidia, artropatía asociada a yersinia y salmonella, espondiloartropatía, aterosclerosis/enfermedad ateromatosa, alergia atópica, enfermedad bulosa autoinmune, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, penfigoide, enfermedad IgA lineal, anemia hemolítica autoinmune, anemia hemolítica positiva de Coombs, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis miálgica/Enfermedad Royal Free, candidiasis mucocutánea crónica, arteritis de células gigantes, hepatitis esclerosante primaria, hepatitis autoinmune criptogénica, síndrome de la Enfermedad de la Inmunodeficiencia Adquirida, Enfermedades Relacionadas con la Inmunodeficiencia Adquirida, Hepatitis C, inmunodeficiencia variada común (hipogammaglobulinemia variable común), cardiomiopatía dilatada, infertilidad femenina, insuficiencia ovárica, insuficiencia ovárica prematura, enfermedad fibrótica pulmonar, alveolitis fibrosante criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial post-inflamatoria, neumonitis intersticial, enfermedad pulmonar intersticial asociada a enfermedad del tejido conectivo, enfermedad pulmonar asociada a enfermedad del tejido conectivo mixto, enfermedad pulmonar intersticial asociada a esclerosis sistémica, enfermedad pulmonar intersticial asociada a artritis reumatoide, enfermedad pulmonar asociada al lupus eritematoso sistémico, enfermedad pulmonar asociada a dermatomiositis/polimiositis, enfermedad pulmonar asociada a la enfermedad de Sjögren, enfermedad pulmonar asociada a la espondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar difusa vasculítica, enfermedad pulmonar asociada a haemosiderosis, enfermedad pulmonar intersticial inducida por fármacos, fibrosis de radiación, bronquiolitis obliterante, neumonía eosinofílica crónica, enfermedad pulmonar infiltrativa linfocítica, enfermedad pulmonar intersticial post-infecciosa, artritis gotosa, hepatitis autoinmune, hepatitis autoinmune de tipo 1 (autoinmune clásica o hepatitis lupoide), hepatitis autoinmune de tipo 2 (hepatitis del anticuerpo anti-LKM), hipoglucemia mediada autoinmune, acantosis nigrican con resistencia a la insulina de tipo B, hipoparatiroidismo, enfermedad inmune aguda asociada con trasplante de órganos, enfermedad inmune crónica asociada con trasplante de órganos, osteoartrosis, colangitis esclerosante primaria, psoriasis de tipo 1, psoriasis de tipo 2, leucopenia idiopática, neutropenia autoinmune, enfermedad renal NOS, glomerulonefritis, vasculitis microscópica renal; enfermedad de lyme, lupus eritematoso discoide, infertilidad masculina idiopática o NOS, autoinmunidad del esperma, esclerosis múltiple (todos los subtipos), oftalmia simpática, hipertensión pulmonar secundaria a enfermedades del tejido conectivo, síndrome de Goodpasture, manifestación pulmonar de poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, enfermedad de Still, esclerosis sistémica, síndrome de Sjörgen, arteritis/enfermedad de Takayasu, trombocitopenia autoinmune, trombocitopenia idiopática, enfermedad tiroidea autoinmune, hipertiroidismo, hipotiroidismo autoinmune bocioso (enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo autoinmune atrópico, mixedema primario, uveítis facogénica, vasculitis primaria, vitíligo, enfermedades del sistema nervioso central (por ejemplo, depresión, esquizofrenia, Alzheimer, Parkinson, etc.), dolor agudo y crónico y desequilibrio lipídico. Los anticuerpos humanos y partes del anticuerpo de la invención pueden usarse para tratar a seres humanos que padecen enfermedades autoinmunes, en particular las asociadas con inflamación, incluyendo, espondilitis reumatoide, alergia, diabetes autoinmune, uveítis autoinmune.

Preferiblemente, los anticuerpos de especificidad dual o partes de unión al antígeno de los mismos IL-1\alpha/IL-1\beta de la invención, se usan para tratar artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, diabetes mellitus dependiente de insulina y psoriasis.

Un anticuerpo de especificidad dual IL-1\alpha/IL-1\beta, o parte de anticuerpo, de la invención también puede administrarse con uno o más agentes terapéuticos adicionales útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunes e inflamatorias.

Los anticuerpos de la invención o partes de unión al antígeno de los mismos pueden usarse solos o en combinación para tratar dichas enfermedades. Debe entenderse que los anticuerpos de la invención o partes de unión al antígeno de los mismos pueden usarse solos o en combinación con un agente adicional, por ejemplo, un agente terapéutico, seleccionando los especialistas en la técnica dicho agente adicional para el propósito que se pretende. Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente terapéutico reconocido en la técnica que sea útil para tratar la enfermedad o estado a tratar por el anticuerpo de la presente invención. El agente adicional también puede ser un agente que confiere un atributo beneficioso a la composición terapéutica por ejemplo, un agente que proporciona la viscosidad de la composición.

Debe entenderse además que las combinaciones que están incluidas dentro de esta invención son las combinaciones útiles para el uso que se pretende. Los agentes que se indican a continuación son ilustrativos para los propósitos y no pretenden ser limitantes. Las combinaciones que son parte de esta invención pueden ser los anticuerpos de la presente invención y al menos un agente adicional seleccionado de las listas indicadas a continuación. La combinación puede incluir también más de un agente adicional, por ejemplo, dos o tres agentes adicionales si la combinación es tal que la composición formada puede realizar sus funciones pretendidas.

Las combinaciones preferidas son un fármaco (o fármacos) inflamatorio y no esteroideo también denominado AINE que incluye fármacos como ibuprofeno e inhibidores de COX-2. Otras combinaciones preferidas son los corticosteroides que incluyen prednisolona; los efectos secundarios bien conocidos de uso de esteroides pueden reducirse o incluso eliminarse reduciendo gradualmente la dosis requerida de esteroide cuando se están tratando pacientes en combinación con los anticuerpos anti-IL-1 de esta invención. Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para la artritis reumatoide con los que un anticuerpo, o parte de anticuerpo, de la invención pueden combinarse incluyen los siguientes: fármaco (o fármacos) antiinflamatorios supresores de citoquina (AISC); anticuerpos para o antagonistas de otras citoquinas humanas o factores de crecimiento por ejemplo, TNF, LT, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF. Los anticuerpos de la invención, o partes de unión al antígeno de los mismos, pueden combinarse con anticuerpos contra moléculas de la superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, o sus ligandos incluyendo CD154 (gp39 o CD40L).

Las combinaciones preferidas de agentes terapéuticos pueden interferir en diferentes puntos en la cascada inflamatoria autoinmune y posterior; los ejemplos preferidos incluyen antagonistas de TNF como anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos contra TNF, D2E7, (Publicación PCT Nº WO 97/29131), CA2 (Remicade^{TM}), CDP 571, CDP 870, Talidamida y receptores solubles de TNF p55 o p75, derivados de los mismos, (p75TNFR1gG (Enbrel^{TM}) o p55TNFR1gG (Lenercept), y también inhibidores de la enzima convertidora de TNF\alpha (TACE); de manera similar los inhibidores de IL-1 (inhibidores de la enzima convertidora de Interleuquina-1, IL-1 RA etc.) pueden ser eficaces por la misma razón. Otras combinaciones preferidas incluyen Interleuquina 11. En otra combinación preferida más hay otros actores clave de la respuesta autoinmune que pueden actuar en paralelo a, dependiendo de o en concierto con la función de IL-1; especialmente preferidos son los antagonistas de IL-12 y/o IL-18 que incluyen anticuerpos contra IL-12 y/o IL-18 o receptores solubles de IL-12 y/o IL-18 o proteínas de unión a IL-12 y/o IL-18. Se ha demostrado que IL-12 e IL-18 tienen funciones solapantes pero distintas y una combinación de antagonistas para ambos puede ser más eficaz. Otra combinación preferida son inhibidores anti-CD4 no-reductores. Otras combinaciones preferidas incluyen antagonistas de las rutas co-estimuladoras CD80 (B7.1) o CD86 (B7.2) que incluyen anticuerpos, receptores solubles o ligandos antagonístas.

Los anticuerpos de la invención o partes de unión al antígeno de los mismos, pueden combinarse también con agentes, tales como metotrexato, 6-MP, azatioprina sulfasalazina, mesalazina, olsalazina cloroquinina/hidroxicloroquina, pencilamina, aurotiomalato (intramuscular y oral), azatioprina, cochicina, corticosteroides (orales, inhalados e inyección local), agonistas del adrenoreceptor beta-2 (salbutamol, terbutalina, salmeteral), xantinas (teofilina, aminofilina), cromoglicato, nedocromil, ketotifeno, ipratropio y oxitropio, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato mofetil, leflunomida, AINE, por ejemplo, ibuprofeno, corticosteroides tales como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con la señalización mediante citoquinas pro-inflamatorias tales como TNF\alpha o IL-1 (por ejemplo, IRAK, NIK, IKK, p38 o inhibidores de quinasa MAP), inhibidores de la enzima convertidora de IL-1\beta, inhibidores de la enzima convertidora de TNF\alpha (TACE), inhibidores de la señalización de células T tales como inhibidores de quinasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina, receptores de citoquina solubles y derivados de los mismos (por ejemplo, receptores solubles de TNF p55 o p75 y los derivados p75TNFRIgG (Enbrel^{TM} y p55TNFRlgG (Lenercept)), sIL-1RI, sIL-1 RII, sIL-6R) y citoquinas anti-inflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 y TGF\beta). Las combinaciones preferidas incluyen metotrexato o leflunomida y en casos de artritis reumatoide moderada o severa, ciclosporina.

Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para la enfermedad intestinal inflamatoria con los que un anticuerpo, o parte de anticuerpo de la invención pueden combinarse incluyen los siguientes: budenosida; factor de crecimiento epidérmico, corticosteroides; ciclosporina, sulfasalazina; aminosalicilatos; 6-mercaptopmina; azatioprina; metronidazol; inhibidores de lipoxigenasa; mesalamina; olsalazina; balsalazida; antioxidantes; inhibidores de tromboxano; antagonistas de receptores de IL-1; anticuerpos monoclonales anti-IL-1\beta; anticuerpos monoclonales anti-IL-6; factores de crecimiento; inhibidores de elastasa; compuestos de piridinil-imidazol; anticuerpos para o antagonistas de otras citoquinas humanas o factores de crecimiento, por ejemplo, TNF, LT, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF y PDGP. Los anticuerpos de la invención pueden combinarse con anticuerpos contra moléculas de la superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o sus ligandos. Los anticuerpos de la invención, o partes de unión al antígeno de los mismos, pueden combinarse también con agentes, tal como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato mofetil, leflunomida, AINE, por ejemplo, ibuprofeno, corticosteroides tales como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes anti-trombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con la señalización mediante citoquinas pro-inflamatorias tales como TNF\alpha o IL-1 (por ejemplo. IRAK, NIK, IKK, p38 o inhibidores de la quinasa MAP), inhibidores de la enzima convertidora IL-1\beta, inhibidores de la enzima convertidora de TNF\alpha, inhibidores de la señalización de células T tales como inhibidores de quinasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, receptores solubles de citoquina y derivados de los mismos (por ejemplo, receptores solubles de TNF p55 o p75, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R) y citoquinas anti-inflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 y TGF\beta).

Los ejemplos preferidos de agentes terapéuticos para la enfermedad de Crohn en los que un anticuerpo o una porción de unión al antígeno pueden combinarse incluyen los siguientes: antagonistas de TNF, por ejemplo, anticuerpos anti-TNF, D2E7 (Publicación PCT Nº WO 97/29131), CA2 (Remicade^{TM}), CDP 571, construcciones de TNFR-lg, inhibidores (p75TNFRlgG (Enbrel^{TM}) y p55TNFRlgG (Lenercep)) e inhibidores de PDE4. Los anticuerpos o partes de unión al antígeno de los mismos de la invención pueden combinarse con corticosteroides, por ejemplo, budenosida y dexametasona. Los anticuerpos de la invención o partes de unión al antígeno de los mismos, también pueden combinarse con agentes tales como sulfasalazina, ácido 5-aminosalicílico y olsalazina, y agentes que interfieren con la síntesis o acción de citoquinas pro-inflamatorias tales como IL-1, por ejemplo, inhibidores de la enzima convertidora IL-1\beta e IL-1ra. Los anticuerpos de la invención o la parte de unión al antígeno de los mismos pueden usarse también con inhibidores de la señalización de células T, por ejemplo 6-mercaptopurinas inhibidoras de tirosina quinasa. Los anticuerpos de la invención o las partes de unión al antígeno de los mismos pueden combinarse con IL -11.

Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para la esclerosis múltiple con los que un anticuerpo o parte del anticuerpo de la invención puede combinarse incluyen los siguientes: corticosteroides; prednisolona; metilprednisolona; azatioprina; ciclofosfamida; ciclosporina; metotrexato; 4-aminopiridina; tizanidina; interferón-\beta1a (Avonex; Biogen); interferón-\beta1b (Betaseron; Chiron/Berlex); Copolímero 1 (Cop-1; Copaxona; Teva Pharmaceutical lndustries, Inc.); oxígeno hiperbárico; inmunoglobulina intravenosa; clabribina; anticuerpos para o antagonistas para otras citoquinas humanas o factores de crecimiento, por ejemplo, TNF, LT, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF y PDGP. Los anticuerpos de la invención o partes de unión al antígeno de los mismos pueden combinarse con anticuerpos contra moléculas de la superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 o sus ligandos. Los anticuerpos de la invención, o partes de unión al antígeno de los mismos, también pueden combinarse con agentes, tal como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato mofetil, leflunomida, AINE, por ejemplo, ibuprofeno, inhibidores de COX-2, corticosteroides tales como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con la señalización por citoquinas pro-inflamatorias tales como TNF\alpha o IL-1 (por ejemplo, IRAK, NIK, IKK, p38 o inhibidores de la quinasa MAP), inhibidores de la enzima convertidora de IL-1\beta, inhibidores de TACE, inhibidores de la señalización de células T tales como inhibidores de quinasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, receptores solubles de citoquina y derivados de los mismos (por ejemplo, receptores solubles TNF de p55 o p75, sIL-1RI, sIL-1 RII, sIL-6R) y citoquinas anti-inflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-13 y TGF\beta).

Los ejemplos preferidos de agentes terapéuticos para la esclerosis múltiple con los que puede combinarse el anticuerpo o parte de unión al antígeno del mismo incluyen interferón-\beta, por ejemplo, IFPN\beta1a e IFN\beta1b; copaxona, corticosteroides, inhibidores de IL-1, inhibidores de TNF y anticuerpos para el ligando CD40 y CD80.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir una "cantidad terapéuticamente eficaz" o una "cantidad profilácticamente eficaz" de un anticuerpo o parte del anticuerpo de la invención. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico deseado. La cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o parte del anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o parte del anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. La cantidad terapéuticamente eficaz es también una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo o parte del anticuerpo se compensa por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profiláctico deseado. Típicamente, dado que una dosis profiláctica se usa en sujetos antes o en una etapa temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.

Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, puede administrarse un solo bolo, pueden administrarse diversas dosis divididas a lo largo del tiempo o las dosis pueden reducirse o aumentarse proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en formas unitarias de dosificación para conseguir una fácil administración y uniformidad de la dosificación. La forma unitaria de dosificación como se usa en este documento se refiere a unidades físicamente separadas apropiadas como dosificaciones unitarias para sujetos mamíferos a tratar; conteniendo cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. Las especificaciones para las formas unitarias de dosificación de la invención se dictan por y dependen directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico o profiláctico particular a conseguir, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de la formación de composiciones de dicho compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos.

Un intervalo ejemplar, no limitante para una cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz de un anticuerpo o parte del anticuerpo de la invención es 0,1 - 20 mg/kg, más preferiblemente, 1 - 10 mg/kg. Cabe señalar que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y la gravedad de la afección a aliviar. Además, cabe entender que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos deben ajustarse a lo largo del tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de dosificación indicados en este documento son únicamente ejemplares y no pretenden limitar el alcance o práctica de la composición reivindicada.

La presente invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como una limitación de ningún modo.

Ejemplo 1

Diseño de un antígeno de especificidad dual basándose en un área de identidad topológica contigua

En este ejemplo, se determinó el área de identidad topológica contigua más extensa entre dos proteínas diferentes pero relacionadas estructuralmente, IL-1\alpha e IL-1\beta, como base para el diseño de un antígeno de especificidad dual para generar anticuerpos de especificidad dual para IL-1\alpha e IL-1\beta. Se usó el algoritmo BLAST para comparar las dos proteínas y este algoritmo permite medir la tendencia de un resto a reemplazar otro en regiones estructurales o funcionales similares. Este análisis permitió la identificación de la mayor área de identidad topológica contigua entre IL-1\alpha e IL-1\beta para extender este área con cualquier tramo de similitud razonable para crear un péptido lineal que sirva como un antígeno de especificidad dual. El péptido que mejor se ajusta a estos criterios tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

100

El asterisco (*) indica restos idénticos en ambas proteínas y los otros restos son muy similares de acuerdo con el algoritmo BLAST. Por ejemplo, la lisina a menudo sustituirá a la arginina en proteína homólogas, pero no a la fenilalanina. Este péptido de SEC ID Nº: 1 es un híbrido tomado de dos secciones diferentes de la estructura que se procesan en direcciones opuestas, por lo que otra representación razonable de este epítopo es:

dNdEdAdQNITDF

(en la que el prefijo "d" indica que el resto aminoacídico es un resto aminoacídico D). Tanto la versión aminoacídica L del péptido como la versión parcialmente sustituida con restos aminoacídicos D se sintetizan por métodos químicos convencionales. El péptido se conjuga después con una proteína transportadora (por ejemplo, KLH o albúmina) y el péptido conjugado se usa para seleccionar anticuerpos mediante métodos in vitro o in vivo.

Ejemplo 2

Diseño de un antígeno de especificidad dual basándose en un péptido cíclico que mimetiza un bucle de un plegamiento común

En este ejemplo, se construyó un péptido cíclico que mimetiza estructuralmente un bucle clave de un plegamiento común entre dos proteínas diferentes pero relacionadas estructuralmente, IL-1\alpha e IL-1\beta, para usar como un antígeno de especificidad dual para generar anticuerpos de especificidad dual para IL-1\alpha e IL-1\beta. El bucle elegido representa los restos 168-184 de IL-1\alpha y los restos 160-176 de IL-1\beta. La secuencia consenso es:

101

El asterisco (*) indica restos idénticos entre IL-1\alpha e IL-1\beta, c indica restos consenso, es decir, restos similares para IL-1\alpha e IL-1\beta pero realmente no presentes en esta localización en ninguna proteína, y b indica que no había restos consenso claros por lo que se mantuvo la identidad de la secuencia de IL-1\beta. El péptido lineal se sintetiza por métodos de síntesis química convencional. Para hacer cíclico este péptido, se añade un resto de prolina y glicina. El péptido cíclico puede sintetizarse usando condiciones de acoplamiento convencionales a alta dilución en N,N-dimetilformamida (1 mg/ml). Las reacciones prototípicas se realizaron a temperatura ambiente usando reactivo de acoplamiento en exceso, tal como hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidin-fosfonio (PyBOP; 2 equiv.) y bicarbonato sódico (10 equiv.). Después el péptido se conjuga a una proteína transportadora (por ejemplo, KLH o albúmina) y el péptido conjugado se usa para seleccionar anticuerpos por métodos in vitro o in vivo.

Ejemplo 3

Diseño de un antígeno de especificidad dual basado en un péptido híbrido

En este ejemplo, se construyó un péptido híbrido que incluye secuencias alternantes o solapantes de dos proteínas diferentes pero relacionadas estructuralmente, IL-1\alpha e IL-1\beta, para usar como un antígeno de especificidad dual para generar anticuerpos de especificidad dual para IL-1\alpha e IL-1\beta. Para crear el péptido híbrido, se identificaron las secuencias aminoacídicas alternantes y solapantes de IL-1\alpha e IL-1\beta y se cortaron y empalmaron entre sí para generar el siguiente péptido:

102

Las letras a y b indican qué proteína es la fuente de los restos (a = IL-1\alpha; b = IL-1\beta). Se incluyó en el péptido híbrido el motivo común ITDF (SEC ID Nº: 4) para ambas proteínas. Además, este péptido híbrido se centra en las secuencias del terminal carboxilo de ambas proteínas, que se sabe que también es antigénico para la neutralización de anticuerpos en ambas proteínas. El péptido híbrido se sintetiza por métodos de síntesis química convencional. Después el péptido se conjuga a una proteína transportadora (por ejemplo, KLH o albúmina) y el péptido conjugado se usa para seleccionar anticuerpos por métodos in vitro o in vivo.

Ejemplo 4

Generación de anticuerpos de especificidad dual para IL-1\alpha e IL-1\beta

NEAQNITDF (SEC ID Nº: 1)

Ciclo-MAFLRANQNNGKISVAL(PG) (SEC ID Nº: 2)

TKGGQDITDFQILENQ (SEC ID Nº: 3)

Los péptidos de SEC ID Nº: 1, 2 y 3 se conjugaron con KLH y se inmunizaron conejos individuales. El antisuero de los conejos inmunizados con cada uno de los tres péptidos mostró una buena respuesta de anticuerpo contra el péptido usado como antígeno. Sin embargo, únicamente el antisuero del conejo inmunizado con el péptido de la SEC ID Nº: 3 fue capaz de unirse tanto a la proteína IL-1\alpha como a la proteína IL-1\beta.

Se inmunizaron cinco ratones (BA119 - BA123) de manera subcutánea con el péptido de la SEC ID Nº: 3 conjugado con adyuvante incompleto de Freund más KLH (FIA) una vez cada tres semanas durante un total de tres veces, seguido por dos estímulos intravenosos con el péptido de la SEC ID Nº: 3 conjugado con KLH. Se extrajo sangre de cada ratón 10 días después de cada inmunización y se determinó la titulación de los anticuerpos mediante ELISA. Los esplenocitos de los ratones BA 119 y BA 123 se fusionaron respectivamente con la línea celular de mieloma P3X36Ag8.653 como se ha descrito en la sección IIA, y las células fusionadas resultantes se sembraron una célula por pocillo en diversas placas de 96 pocillos usando dilución limitante. Los clones del hibridoma que crecieron se ensayaron primero para la producción de IgG e IgM mediante ELISA convencional para identificar clones productores de anticuerpos. Se aislaron un total de 945 clones a partir de la fusión de #BA123 de ratón. Los sobrenadantes de los 355 clones
ensayados en un ELISA mostraron actividad de unión al antígeno para IL-1\alpha, IL-1\beta o tanto IL-1\alpha como IL-1\beta.

1

\vskip1.000000\baselineskip

NEAQNITDF (SEC ID Nº: 1)

Ciclo-MAFLRANQNNGKISVAl(PG) (SEC ID Nº: 2)

TKGGQDITOFOILENQ (SEC ID Nº: 3)

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0.3cm

3

Claims (41)

1. Un método para obtener un anticuerpo de especificidad dual o parte de unión al antígeno del mismo, que se une específicamente a dos proteínas diferentes pero relacionadas estructuralmente, comprendiendo el método:

proporcionar un antígeno diseñado sobre la base del corte y empalme de partes solapantes entre sí de las dos proteínas diferentes pero relacionadas estructuralmente para crear un péptido híbrido, donde dicho péptido híbrido tiene una estructura X-Y-Z, en la que Y representa una región de identidad o de fuerte similitud entre las dos proteínas relacionadas, X representa una región de una de las proteínas relacionadas y Z representa una región de la otra de las proteínas relacionadas;

exponer un repertorio de anticuerpos al antígeno; y

seleccionar del repertorio un anticuerpo que se una específicamente a las dos proteínas diferentes pero relacionadas estructuralmente para obtener de esta manera el anticuerpo de especificidad dual.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el repertorio de anticuerpos se expone al antígeno in vivo inmunizando un animal no humano con el antígeno.

3. El método de la reivindicación 2, que comprende adicionalmente preparar un panel de hibridomas a partir de linfocitos del animal y seleccionar un hibridoma que secrete un anticuerpo que se una específicamente a las dos moléculas diferentes pero relacionadas estructuralmente.

4. El método de la reivindicación 2, en el que el animal se selecciona del grupo que consiste en ratones, ratas, conejos y cabras.

5. El método de la reivindicación 2, en el que el animal es un ratón knockout deficiente para una versión endógena del antígeno.

6. El método de la reivindicación 2, en el que el animal es un ratón que es transgénico para los genes de inmunoglobulina humana de manera que el ratón fabrica anticuerpos humanos después de la estimulación antigénica.

7. El método de la reivindicación 2, en el que el animal es un ratón con inmunodeficiencia combinada severa (SCID) que se ha reconstituido con células mononucleares de sangre periférica humanas o células linfoides o precursoras de las mismas.

8. El método de la reivindicación 2, en el que el animal es un ratón que se ha tratado con irradiación corporal total letal, seguido por radioprotección con células de la médula ósea de un ratón con inmunodeficiencia combinada severa (SCID), seguido por injertos con linfocitos humanos funcionales.

9. El método de la reivindicación 1, en el que el repertorio de anticuerpos se expone al antígeno in vitro explorando una biblioteca de anticuerpos recombinantes con el antígeno.

10. El método de la reivindicación 9, en el que la biblioteca de anticuerpos recombinantes se expresa en la superficie de bacteriófagos.

11. El método de la reivindicación 9, en el que la biblioteca de anticuerpos recombinantes se expresa en la superficie de células de levadura.

12. El método de la reivindicación 9, en el que la biblioteca de anticuerpos recombinante se expresa en la superficie de células bacterianas.

13. El método de la reivindicación 9, en el que la biblioteca de anticuerpos recombinantes se expresa como fusiones de proteína-ARN.

14. El método de la reivindicación 9, en el que la biblioteca de anticuerpos recombinantes es una biblioteca scFv o una biblioteca Fab.

15. El método de la reivindicación 1, en el que el repertorio de anticuerpos se expone al antígeno por inmunización in vivo de un animal no humano con el antígeno, seguido por la exploración in vitro de una biblioteca de anticuerpos recombinantes preparada a partir de células de linfoides del animal con el antígeno.

16. El método de la reivindicación 1, en el que el repertorio de anticuerpos se expone al antígeno mediante inmunización in vivo de un animal no humano con el antígeno, seguido por maduración de afinidad in vitro de una biblioteca de anticuerpos recombinantes preparada a partir de células linfoides del animal.

\newpage

17. El método de la reivindicación 1, en el que el repertorio del anticuerpo se expone al antígeno por inmunización in vivo de un animal no humano con el antígeno, seguido por la selección de células individuales que secretan anticuerpos que se unen al antígeno y la recuperación de los ADNc de la región variable de cadena pesada y ligera a partir de las células individuales.

18. El método de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo de especificidad dual es un anticuerpo completamente humano.

19. El método de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo de especificidad dual es un anticuerpo quimérico.

20. El método de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo de especificidad dual es un anticuerpo injertado con CDR.

21. El método de la reivindicación 1, en el que dichas dos moléculas diferentes pero relacionadas estructuralmente son interleuquina-1\alpha e interleuquina-1\beta.

22. El método de la reivindicación 21, en el que el antígeno comprende la secuencia de aminoácidos TKGGQDlT
DFQILENQ (SEC ID Nº: 3).

23. El método de la reivindicación 21, en el que el repertorio de anticuerpos se expone al antígeno por inmunización in vivo de un animal no humano con el antígeno.

24. El método de la reivindicación 23, que comprende adicionalmente preparar un panel de hibridomas a partir de linfocitos del animal y seleccionar un hibridoma que secrete un anticuerpo que se una específicamente a IL-1\alpha e IL-1\beta.

25. El método de la reivindicación 23, en el que el animal se selecciona del grupo que consiste en ratones, ratas, conejos y cabras.

26. El método de la reivindicación 23, en el que el animal es un ratón knockout deficiente para IL-1\alpha, IL-1\beta o tanto IL-1\alpha como IL-1\beta.

27. El método de la reivindicación 23, en el que el animal es un ratón que es transgénico para los genes de inmunoglobulina humana de manera que el ratón fabrica anticuerpos humanos tras la estimulación antigénica.

28. El método de la reivindicación 23, en el que el animal es un ratón con inmunodeficiencia combinada severa (SCID) que se ha reconstituido con células mononucleares de sangre periférica humanas o células linfoides o precursoras de las mismas.

29. El método de la reivindicación 23, en el que el animal es un ratón que se ha tratado con irradiación corporal total letal, seguido por radioprotección con células de la médula ósea de un ratón con inmunodeficiencia combinada severa (SCID), seguido por injerto con linfocitos humanos funcionales o precursores de los mismos.

30. El método de la reivindicación 21, en el que el repertorio de anticuerpos se expone al antígeno in vitro por exploración de una biblioteca de anticuerpos recombinantes con el antígeno.

31. El método de la reivindicación 30, en el que la biblioteca de anticuerpos recombinantes se expresa en la superficie de bacteriófagos.

32. El método de la reivindicación 30, en el que la biblioteca de anticuerpos recombinantes se expresa en la superficie de células de levadura.

33. El método de la reivindicación 30, en el que la biblioteca de anticuerpos recombinantes se expresa en la superficie de células bacterianas.

34. El método de la reivindicación 30, en el que la biblioteca de anticuerpos recombinantes se expresa como fusiones de ARN-proteína.

35. El método de la reivindicación 30, en el que la biblioteca de anticuerpos recombinantes es una biblioteca de scFv o una biblioteca de Fab.

36. El método de la reivindicación 21, en el que el repertorio de anticuerpos se expone al antígeno por inmunización in vivo de un animal no humano con el antígeno, seguido por exploración in vitro de una biblioteca de anticuerpos recombinantes preparadas a partir de células linfoides del animal con el antígeno.

37. El método de la reivindicación 21, en el que el repertorio de anticuerpos se expone al antígeno por inmunización in vivo de un animal no humano con el antígeno, seguido por maduración de afinidad in vitro de una biblioteca de anticuerpos recombinantes preparada a partir de células linfoides del animal.

38. El método de la reivindicación 21, en el que el repertorio de anticuerpos se expone al antígeno por inmunización in vivo de un animal no humano con el antígeno, seguido por la selección de células individuales que secretan anticuerpos que se unen al antígeno y la recuperación de los ADNc de la región variable de cadena pesada y ligera a partir de las células individuales.

39. El método de la reivindicación 21, en el que el anticuerpo de especificidad dual es un anticuerpo completamente humano.

40. El método de la reivindicación 21, en el que el anticuerpo de especificidad dual es un anticuerpo quimérico.

41. El método de la reivindicación 21, en el que el anticuerpo de especificidad dual es un anticuerpo injertado con CDR.