CN112142859A - 一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程药物领域，具体涉及一种人白细胞介素10‑Fc融合蛋白及其编码基因与应用。通过对IgG4 Fc部分中多个位置氨基酸的替换，使得改造后的IL10‑Fc融合蛋白具有比现有Fc融合蛋白更优越的性能，例如增加体内稳定性、消除不必要的效应子功能以及降低该融合蛋白在生物体内的免疫原性。本发明还公开了所述IL10‑Fc融合蛋白药物用于治疗疾病的方法，该方法包括对患疾病的个体施用治疗有效量的药物，所述的疾病包括炎性病状、免疫相关病症、纤维化病症和癌症等。

Description

一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白及其编码基因与应用
本申请是申请号为201710362078.1、申请日为2017年5月22日、发明名称为“一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白及其编码基因与应用”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及基因工程药物领域，具体涉及一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
白细胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)是于1991年被发现的细胞因子，可以调节机体炎症及免疫反应。起初报道该细胞因子能抑制细胞因子分泌、抗原提呈和CD4+细胞活化，IL-10可通过抑制活化的单核细胞和活化的巨噬细胞的IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、GM-CSF和G-CSF的表达来抑制免疫应答，并且其还抑制NK细胞的IFN-γ产生。虽然IL-10主要在巨噬细胞中表达，但也已在活化的T细胞、B细胞、肥大细胞和单核细胞中检测到表达。除了抑制免疫应答以外，IL-10还展现免疫刺激性质，包括刺激IL-2和IL-4处理的胸腺细胞的增殖，增强B细胞的活力，和刺激MHCII类的表达。
然而，最新的临床研究显示聚乙二醇修饰的IL-10事实上可强有力地激活人体免疫***功能，尤其是能激活具有杀灭癌细胞作用的CD8+T细胞。IL-10能共刺激B细胞激活、延长B细胞存活、及帮助B细胞中的类别转换。此外，它能共刺激天然杀伤(NK)细胞增殖和细胞因子生成且起生长因子的作用刺激某些CD8+T细胞子集增殖(Mosser,D.M.&Yhang,X.,Immunological Reviews 226,205-218(2008)，高剂量的IL-10(分别为20和25μg/kg)在人中能引起INFγ生成升高(Lauw,F.N.et al.,J.Immunol.165,2783-2789(2000)；Tilg,H.etal.,Gut 50,191-195(2002))。
人IL-10是同型二聚体并且每一个单体包含178个氨基酸，其前18个氨基酸包含信号肽。本公开的特定实施方案包含缺乏信号肽的成熟人IL-10多肽(参见美国专利第6,217,857号)。成熟的IL-10有160个氨基酸残基(Seq ID No.1)，单体分子量为18.7KD，含有4个半胱氨酸形成的二硫键(12-108，62-114)，其天然活性形式是由非共价键连接的分子量为38KD的同源寡二聚体，其在两个单体亚单位之间的非共价相互作用受到破坏后变得无生物活性。获自IL-10的公开晶体结构的数据表明功能二聚体展现与IFN-γ的一定相似性(Zdanov等，1995，Structure(Lond)，3:591-601)。作为其多效性活性的结果，IL-10已与众多种疾病、病症和病状，包括炎性病状、免疫相关病症、纤维化病症和癌症关联。
重组人IL-10在体内的半衰期仅仅2-3h，蛋白很快被清除，这限制了IL-10的生物利用度(Braat,H.et al.,Expert Opin.Biol.Ther.3(5),725-731(2003))。为了改进循环时间、暴露、功效及降低肾摄取，已有文献公开可采用PEG化修饰方法延长其体内半衰期(Mattos,A.et al.,J.Control Release 162,84-91(2012)；Mumm,J.B.et al.,CancerCell 20(6),781-796(2011)；Alvarez,H.M.et al.,Drug Metab.Dispos.，40(2),360-373(2012)；CN 201480024021.5等)。但是，由于PEG修饰位点有多个，因此采用PEG化修饰后的产物是不均一的，这给后续的药物质量控制带来麻烦。
另一条途径涉及将IL-10肽与免疫球蛋白Fc部分融合。免疫球蛋白一般在体内具有长循环半寿期。例如，IgG分子在人体具有高达23天的半寿期。免疫球蛋白Fc部分是这种体内稳定性的部分原因。在保留IL-10分子生物学活性的同时，IL10-Fc融合蛋白质具有由免疫球蛋白Fc部分提供的稳定性而保留IL-10分子的生物活性的优点。
尽管此途径对于IL-10疗法是可行的，但是Fc融合蛋白质长时期反复施用时人体会产生免疫原性是该类药物潜在的隐患。此外，如果Fc部分保留不需要的生物效应功能，会导致额外的治疗副反应，这也是Fc融合蛋白疗法的潜在顾虑。
发明内容
本发明通过对Fc蛋白序列的改造得到一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白(IL10-Fc融合蛋白)，通过对Fc部分中多个位置氨基酸的替换，使得改造后的IL10-Fc融合蛋白具有比现有Fc融合蛋白更优越的性能，例如增加体内稳定性、消除不必要的效应子功能以及降低该融合蛋白在生物体内的免疫原性。
本发明所述的IL10-Fc融合蛋白，其中IL-10的C末端直接或通过连接肽与Fc蛋白的N端相连；其中，IL-10序列与Seq ID No.1所示一致；连接肽序列通式为[GlyGlyGlyGlySer]n，n为1-5的整数；Fc蛋白部分包含SEQ ID NO.2的序列,其中:
16位的X1为Pro或Glu；
17位的X2为Phe、Val、或Ala；
18位的X3为Leu、Glu、或Ala；
80位的X4为Asn或Ala；以及
230位的X5为Lys或不存在。
本发明所述的IL10-Fc融合蛋白，其中优选的连接肽序列通式为[GlyGlyGlyGlySer]n，n为1-3的整数；更优选的，n为3，其序列为Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser。通过加入小的连接肽以防止潜在的不必要的结构域相互作用来优化本发明的融合蛋白的体内功能和稳定性。另外，富含甘氨酸的连接肽提供了一定的结构柔性，使IL-10部分可以与靶细胞上IL-10受体有效地相互作用。
本发明的Fc蛋白部分来自人类IgG4，但是与野生型人类序列相比包括一个或多个氨基酸替换的Fc部分。Fc部分由通过非共价相互作用和二硫键结合的抗体的两个重链恒定区组成。Fc部分可以包含铰链区，并经CH2和CH3结构域延伸到抗体C末端。Fc部分还可以包含一个或多个糖基化位点。
人体有五种类型的具有不同效应子功能和药物动力学特性的人类免疫球蛋白。IgG是五种类型中最稳定的，在人体具有约23天的血清半衰期。人体IgG有四个亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，各亚类具有称作效应子功能的不同生物学功能。这些效应子功能通常由与Fc受体(FcγR)的相互作用或通过结合Clq和固定补体介导。与FcγR的结合可以导致抗体依赖细胞介导的细胞裂解，而与补体因子的结合可以导致补体介导的细胞裂解。
在仅利用Fc部分延长半衰期的Fc融合蛋白的设计中，将效应子功能最小化是重要的。对于一些纯拮抗作用的抗体，如可溶性细胞激素如TNFα，IL17A等，或者免疫检查点如PD-1的抗体来说，并不需要FcγRs带来的效应作用，且能够防止ADCC等带来的细胞毒性，因此Fc效应弱的IgG2和IgG4被选择用来作为骨架。现在已有4个IgG2和6个IgG4单抗被批准上市，例如anti-PD1单抗nivolumab和pembrolizumab，anti-IL17A单抗ixekizumab以及anti-PCSK9单抗evolocumab等都采用了IgG2或IgG4亚型。因此，本发明的Fc融合蛋白结构中Fc部分优选来自人类IgG4 Fc区域，因其与其他IgG亚型相比结合FcγR和补体因子的能力降低。
为进一步降低其效应子功能，本发明对野生型的IgG4 Fc区域进行进一步的改造。本发明的融合蛋白的IgG4 Fc部分可以含有一个或多个下列替换：对应于SEQ ID NO：2中的第16位处以脯氨酸(Pro)或谷氨酸(Glu)替换谷氨酰胺(Gln)，对应于SEQ ID NO：2中的第17位处以丙氨酸(Ala)或缬氨酸(Val)替换苯丙氨酸(Phe)，对应于SEQ ID NO：2中的第18位处以丙氨酸(Ala)或谷氨酸(Glu)替换亮氨酸(Leu)。
人IgG分子Fc部分的N297位能够发生糖基化，该糖基化对IgG的活性有很大影响。如果该位点糖基化被移除，则会影响CH2上半部分的构象，从而丧失对FcγRs的结合能力，影响抗体相关的生物活性。但是对于本发明构造的融合蛋白来说，由于并不需要FcγRs带来的效应作用，且需要防止融合蛋白的ADCC等带来的细胞毒性，因此需要对Fc部分进行无糖基化改造。基于此考虑，发明人发现在对应于SEQ ID NO：2第80位处用Ala替换Asn，能够去除IgG4 Fc区域中N-连接的糖基化位点，该无糖基化改造能够降低融合蛋白的ADCC等生物学效应。
此外，在此讨论的IL10-Fc融合蛋白的IgG4衍生的Fc部分中可以缺失存在于天然分子中的C末端赖氨酸残基(Seq ID NO.2第230位；将缺失的赖氨酸称为des-K)。某些细胞例如NS0细胞表达的C末端为赖氨酸的Fc融合蛋白是不均一的，某些融合蛋白的C末端氨基酸为赖氨酸，而一部分融合蛋白的C末端将缺失赖氨酸，该缺失是由于某些类型的哺乳动物细胞表达过程中蛋白酶的作用。因此，为了避免这种异质性，Fc融合蛋白构建时优选C末端缺失赖氨酸。
为方便理解，提供了常见氨基酸单字母和三字母代码对应表，如下所示。
Figure BDA0002720547660000071
本发明优选的IL10-Fc融合蛋白包括下列蛋白质：
IL10-[GlyGlyGlyGlySer]3-IgG4 Fc，其中Fc第16位的X1为Glu，17位的X2为Ala，18位的X3为Ala，80位的X4为Asn，以及230位的X5不存在，其序列如SEQ ID NO：3所示。
IL10-[GlyGlyGlyGlySer]3-IgG4 Fc，其中Fc第16位的X1为Glu，17位的X2为Ala，18位的X3为Ala，80位的X4为Ala，以及230位的X5不存在，其序列SEQ ID NO：4所示。
IL10-GlyGlyGlyGlySer-IgG4 Fc，其中Fc第16位的X1为Glu，17位的X2为Ala，18位的X3为Ala，80位的X4为Asn，以及230位的X5为Lys，其序列SEQ ID NO：5所示。
IL10-IgG4 Fc，其中Fc第16位的X1为Glu，17位的X2为Ala，18位的X3为Ala，80位的X4为Ala，以及230位的X5不存在，其序列SEQ ID NO：6所示。
IL10-[GlyGlyGlyGlySer]3-IgG4 Fc，其中Fc第16位的X1为Glu，17位的X2为Ala，18位的X3为Ala，80位的X4为Asn，以及230位的X5为Lys。
IL10-GlyGlyGlyGlySer-IgG4 Fc，其中Fc第16位的X1为Glu，17位的X2为Ala，18位的X3为Ala，80位的X4为Asn，以及230位的X5不存在。
IL10-[GlyGlyGlyGlySer]3-IgG4 Fc，其中Fc第16位的X1为Pro，17位的X2为Phe，18位的X3为Ala，80位的X4为Ala，以及230位的X5不存在。
IL10-[GlyGlyGlyGlySer]3-IgG4 Fc，其中Fc第16位的X1为Pro，17位的X2为Val，18位的X3为Ala，80位的X4为Ala，以及230位的X5不存在。
IL10-IgG4 Fc，其中Fc第16位的X1为Glu，17位的X2为Ala，18位的X3为Ala，80位的X4为Ala，以及230位的X5为Lys。
IL10-[GlyGlyGlyGlySer]2-IgG4 Fc，其中Fc第16位的X1为Pro，17位的X2为Ala，18位的X3为Ala，80位的X4为Asn，以及230位的X5为Lys。
IL10-Fc融合蛋白的结构如图1所示。
可以从多种来源获得野生型人类IgG4蛋白质。例如，可以从以可检测水平表达目的mRNA的细胞制备cDNA文库以获得这些蛋白质。使用特定目的蛋白质的公开的DNA或蛋白质序列设计的探针可以对文库进行筛选。例如，在Adams等人，(1980)Biochemistry 19：2711-2719；Goughet等人，(1980)Biochemistry 19：2702-2710；Dolby等人，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：6027-6031；Rice等人，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：7862-7862；Falkner等人，(1982)Nature 298：286-288；以及Morrison等人，(1984)Ann.Rev.Immunol.2：239-256中描述了免疫球蛋白轻或重链恒定区。
可以通过多种不同的方法产生编码本发明的IL-10和IgG4 Fc的DNA，所述方法包括标准程序的分子克隆方法和化学合成的DNA。然后可以通过将编码IL-10的DNA在框内与此处所述的编码IgG4 Fc蛋白质的DNA连接而构建编码融合蛋白的基因。可以在连接前或在编码整个融合蛋白质的cDNA中突变编码野生型IgG4 Fc片段的DNA。多种诱变技术在本领域广为人知。编码IL-10基因和编码IgG4 Fc类似物蛋白质的基因也可以通过编码富含G的连接肽的DNA在框内连接。
本发明提供能编码IL10-Fc融合蛋白的基因，例如编码SEQ ID NO：3所示的IL10-[GlyGlyGlyGlySer]3-IgG4 Fc融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：7所示。当把编码IL10-Fc融合蛋白的核酸分子***合适载体中，当将所述的载体引入合适的宿主细胞时能表达IL10-Fc融合蛋白。合适的载体为本领域技术人员所熟知的各种可商业化购买的原核或真核表达载体，原核表达载体如pET系列载体，pQE系列载体；酵母表达载体pPICZ-α-A，pHIL-D2，pPIC9，pHIL-S1(Invitrogen Corp.San Diego.California.USA)；动物细胞表达载体pIRES质粒、pSVK3、pMSG(Amersham Pharmacia Biotech Inc.USA)等。
合适的宿主细胞包括但不限于细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞。含编码IL10-Fc融合蛋白的外源核酸的重组细胞可通过任何合适的技术制备，例如，用裸露DNA质粒载体、病毒载体、侵入性细菌细胞载体或其它全细胞载体等转染/转化，包括通过磷酸钙沉淀的转染、受体介导的定位和转染、生物弹射击递送、电穿孔、葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转化、原生质体融合、直接微注射等方法将IL10-Fc融合蛋白编码序列递送到细胞中制备。转化/转染细胞的方法是本领域已知的，参见Sambrook et al.Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2d Edition，1989或3rdEdition，2001)。
本发明核苷酸分子的表达可通过另一核苷酸序列调控，因而该分子在用重组DNA分子转化的宿主中得以表达。例如，表达可通过本领域已知的任何启动子/增强子元件控制。可用于控制嵌合多肽分子表达的启动子包括但不限于长末端重复序列(Squinto等，1991，Cell，65：1-20)；SV40早期启动子区、CMV、M-MuLV、胸苷激酶启动子、金属硫蛋白(metallothionine)基因的调控序列；原核表达载体如b-内酰胺酶启动子或tac启动子(见Scientific American(1980)，242：74-94)；来自酵母或其它真菌的启动子元件如Gal 4启动子、ADH、PGK、碱性磷酸酶和源于基因如弹性蛋白酶I基因的组织特异性转录控制区。
作为宿主用于重组蛋白的细胞系是本领域周知的，包括多种可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系。这些细胞系中包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝癌细胞(例如Hep G2)、A549细胞及多种其它细胞系。在一个优选的技术方案中，融合蛋白抗体在CHO细胞(dhfr-CHO细胞，以DHFR为筛选标记)表达。表达***的另一个实施例是GS(谷氨酸合成酶)基因表达***，具体可参考WO87/04462、WO89/01036和EP338841等。当编码诸如IL10-Fc融合蛋白的核酸(或含核酸的载体)导入到哺乳动物宿主细胞中时，可通过将宿主细胞培养足以在宿主细胞中表达IL10-Fc融合蛋白或将融合蛋白分泌到宿主细胞生长的培养基中。
可用任何本领域已知标准蛋白纯化方法从培养基中回收IL10-Fc融合蛋白，例如免疫亲和柱纯化、硫酸盐沉淀、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、反向色谱或凝胶过滤等纯化技术或其任意的组合。用于纯化具体蛋白质的实际条件将部分取决于因素，如净电荷、疏水性、亲水性等。对于本发明的融合蛋白的亲和层析纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。
另一方面，本发明提供包含本文中提供的任何IL10-Fc融合蛋白的药物组合物，本发明的药物组合物包含治疗有效量的IL10-Fc融合蛋白和药学可接受的载体。药学可接受的载体是指在所采用的剂量和浓度一般对接受者无毒性，即在适当时对动物(例如人)施用时不产生不利、变应性或其它不当反应的分子实体和组合物。药学可接受的载体包括任何和所有的溶剂、缓冲剂、分散介质、涂料材料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等张剂、吸收延缓剂、盐、防腐剂、抗氧化剂、蛋白质、药物、药物稳定剂、聚合物、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、芳香剂、染料、此类类似的材料及其组合。
本发明所述的药物组合物，可以静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、颅内、关节内等方式给药。本发明的融合蛋白尤其适合于胃肠外给药，特别是通过注射施用，例如皮下、皮内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射施用。对于注射，可以将本发明的融合蛋白在水性溶液，优选地在生理学相容的缓冲液中配制。或者，融合蛋白可以为粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物例如无菌水溶解。
本发明还公开了IL10-Fc融合蛋白在制造或制备药物中的用途，所述药物用于治疗有此需要的个体中的疾病，所述的疾病包括病毒性疾病、炎性疾病、免疫相关病症、纤维化病症和癌症等。IL-10为在免疫调节和炎症中具有多效性作用的细胞因子。其由肥大细胞产生，消解这些细胞在过敏反应的部位的炎性效应。虽然其能够抑制促炎性细胞因子诸如IFN-γ、IL-2、IL-3、TNFα和GM-CSF的合成，但IL-10对某些T细胞和肥大细胞也具有刺激性并且刺激B细胞成熟、增殖和抗体产生。IL-10可阻断NF-κB活性并且参与JAK-STAT信号转导途径的调控。其还诱导CD8+T细胞的细胞毒性活性和B细胞的抗体产生，并且其抑制巨噬细胞活性和促肿瘤炎症。CD8+T细胞的调节是剂量依赖性的，其中较高剂量诱导较强的细胞毒性反应。
IL-10在CD8+T细胞的活化中起着多个作用。例如，IL-10在记忆CD8+T细胞中诱导效应分子(IFNγ、穿孔蛋白和颗粒酶B)。此类记忆CD8+T细胞是负责提供受试者的长期抗病毒保护作用的细胞。虽然当IL-10不存在时记忆CD⑶8+T细胞的产生和扩增可发生(Vicari，A.和Trinchieri，G.,(2004)Immuno.Rev.202:223-236)，但IL-10直接活化此类细胞的事实提供独特的和备选的治疗方法。
IL10-Fc融合蛋白具有IL-10相似的生物学活性。鉴于上述，本公开的实施方案基于CD8+T细胞与癌症和病毒感染之间的联系。因此，治疗和/或预防癌症相关疾病、病症和病状的某些方法，诸如维持例如大于0.5ng/mL、大于1ng/mL或大于0.1ng/mL的平均IL10-Fc融合蛋白血清浓度应当也适用于此类疾病的治疗。本公开涵盖本文所述的IL10-Fc融合蛋白在治疗或预防广泛的疾病、病症或病状和/或其症状中的用途。根据本公开，IL10-Fc融合蛋白用于治疗或预防增殖性病状或病症，包括癌症，例如子宫、宫颈、乳腺、***、睾丸、胃肠道、肾、膀胱、骨、骨髓、皮肤、头或颈、皮肤、肝脏、胆囊、心脏、肺、胰腺、唾液腺、肾上腺、甲状腺、脑、神经节、中枢神经***(CNS)和周围神经***(PNS)的癌症，以及造血***和免疫***的癌症)。在特定实施方案中，肿瘤或癌症是结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤或白血病等。
在一个实施方案中，公开了所述IL10-Fc融合蛋白药物用于治疗疾病的方法，该方法包括对患疾病的个体施用治疗有效量的药物，所述的疾病包括炎性病状、免疫相关病症、纤维化病症和癌症等。所述的个体是哺乳动物，优选是人。根据疾病的类型和严重程度，大于约0.1ng/mL(例如，0.1-2ng/mL、0.1-1ng/mL、0.5-1.5ng/mL或1.1-2.1ng/mL)的血清谷浓度的IL10-Fc融合蛋白可以是用于对患者施用的起始候选剂量，不管是例如通过一次或多次分开的施用，还是通过连续输注进行。
优选的，当受试者为人时，可以以大于2.0μg/kg/日、大于2.5μg/kg/日、大于3.0μg/kg/日、大于5μg/kg/日、大于8μg/kg/日、大于10μg/kg/日、大于12μg/kg/日、15μg/kg/日、大于18μg/kg/日、大于20μg/kg/日、大于21μg/kg/日、大于22μg/kg/日、大于23μg/kg/日、大于24μg/kg/日或大于25μg/kg/日的剂量施用IL10-Fc融合蛋白。使用本领域中公知的技术，能从体外数据例如动物模型估算出初始剂量。本领域中的普通技术人员能容易地基于动物数据优化对人的施用。
附图说明
附图1:人白细胞介素10-Fc融合蛋白结构示意图
附图2：IL10-Fc刺激CD8+细胞产生细胞毒因子
具体实施方式
实施例1：IL10-Fc融合蛋白基因构建
将SEQ ID NO：3翻译成DNA序列，并根据CHO细胞的密码子偏好性优化，获得IL10-Fc融合蛋白的表达序列SEQ ID NO：7。在该优化好的序列5’端添加NheI酶切位点和kozac序列(SEQ ID No.8)，在3’端添加终止密码子和XhoI酶切位点(SEQ ID No.9)，得到融合蛋白的完整表达框。人工合成完整表达框序列，***到pIRES质粒的NheI和XhoI酶切位点之间，得到pIRES-IL10-Fc表达质粒。该质粒经线性化后，电转染至CHO-s细胞，加入MSX筛选出阳性克隆。
实施例2：IL10-Fc融合蛋白的表达及纯化
实施例1中获得的阳性克隆，经过两轮有限稀释，筛选出表达量较优的克隆，经扩大培养，接种到7L发酵罐进行补料培养，表达目的蛋白。发酵结束后4500rpm离心6min，收集上清调整pH至4.0后4℃保存。
上清先用10KDa的超滤膜包，超滤浓缩；然后用Mabselect Sure进行初步亲和层析，收集融合蛋白。亲和层析流动相为：A1:25mM PB+50mM Nacl,pH7.0，B1:20mM Gly,pH3.0，B2:20mM柠檬酸缓冲液,pH3.0。层析柱先用流动相A1平衡，上样后，先用流动相B1洗脱杂质，再用流动相B2洗脱融合蛋白，收集到的洗脱也用1M Tris-His pH8.0调节至pH中性。此步收集到的粗纯样品，在通过Capto adhere层析柱精纯。样品经pH7.0上样结合后，用pH4.0洗脱得到较纯的样品(95％以上)。
实施例3：体内半衰期测定
通过尾静脉注射，将rhIL-10(Rochy Hill公司)和由实施例2获得的IL10-Fc融合蛋白按200ng/Kg体重剂量分别注入平均体重约200g的SD大鼠)。注射后，在不同时间点(0、1、2、4、6、8、12、24、36、48、60、72、96小时)通过剪尾取血法收集血样，肝素钠抗凝，将采集的血样12000g离心5min，收集血清。
将血样用人IL-10ELISA试剂盒(购自Bender Medsystem公司)并参照说明书检测血清中融合蛋白的含量，结果取平均值。结果显示，本发明制备IL10-Fc融合蛋白的体内消除半衰期为22.6小时，而用人rhIL-10经尾静脉注射后消除半衰期为4小时，表明本发明制备得到IL10-Fc融合蛋白在体内的半衰期相对于rhIL-10对照品延长了5-6倍。
实施例4：抗肿瘤活性实验
研究证明IL-10不仅可以通过活化NK细胞发挥抗肿瘤效应，还可以通过活化T细胞抑制肿瘤的发展。研究表明IL-10治疗的荷瘤小鼠可以诱导IFN-γ和颗粒酶的表达。该作用可能是由对肿瘤内CD8+T细胞有特异性的IL-10信号通路介导的：IL-10激活CD8+T细胞中磷酸化的STAT1和STAT3，从而诱导CD8+T细胞的增殖和IFN-γ、细胞毒性蛋白穿孔素及颗粒蛋白酶的表达；IFN-γ可以诱导肿瘤细胞和单核巨噬细胞中MHC-Ⅰ类抗原提呈分子的表达，协助CD8+T细胞杀死大部分抗原特异性肿瘤细胞；激活CD8+T细胞中的TCR可以有效地诱导抗细胞凋亡信号和细胞增殖信号。总之，IL-10不仅可以通过提高NK细胞的细胞毒性活性增强肿瘤杀伤效应，还可以通过介导肿瘤内特异性细胞毒性CD8+T细胞的浸润和激活、IFN-γ和颗粒蛋白酶的表达和增强肿瘤抗原提呈等而提高瘤内CD8+T细胞的肿瘤杀伤能力和IFN-γ诱导的抗原提呈能力，从而增强了抗肿瘤免疫逃逸的功能。
为了检测IL10-Fc刺激CD8+T的细胞毒作用,从小鼠脾脏分离出CD8+细胞，在体外培养并激活后，加入不同浓度的IL10-Fc(以IL-10为对照)作用后，可刺激细胞产生细胞毒作用(颗粒酶/穿孔素表达提升)并刺激IFNγ表达(如图2)。尽管，体外活性方面，IL10-Fc只有IL10的30％-40％左右，但是考虑到IL10-Fc体内半衰期显著延长，其体内生物学活性并未显著下降。
序列表
<110> 杭州博虎生物科技有限公司
<120> 一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白及其编码基因与应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 160
<212> PRT
<213> Homo sapiens (Human)
<400> 1
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
<210> 2
<211> 230
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
20 25 30
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
35 40 45
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
50 55 60
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Xaa
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
85 90 95
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
100 105 110
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
115 120 125
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
130 135 140
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
145 150 155 160
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
165 170 175
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
180 185 190
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
195 200 205
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Gly Xaa
225 230
<210> 3
<211> 404
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
165 170 175
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
180 185 190
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
195 200 205
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
210 215 220
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
225 230 235 240
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
245 250 255
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
260 265 270
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
275 280 285
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
290 295 300
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
305 310 315 320
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
325 330 335
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
340 345 350
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
355 360 365
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
370 375 380
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
385 390 395 400
Leu Ser Leu Gly
<210> 4
<211> 404
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
165 170 175
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
180 185 190
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
195 200 205
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
210 215 220
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
225 230 235 240
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Ala Ser
245 250 255
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
260 265 270
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
275 280 285
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
290 295 300
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
305 310 315 320
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
325 330 335
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
340 345 350
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
355 360 365
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
370 375 380
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
385 390 395 400
Leu Ser Leu Gly
<210> 5
<211> 395
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
165 170 175
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
180 185 190
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
195 200 205
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
210 215 220
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
225 230 235 240
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
245 250 255
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
260 265 270
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
275 280 285
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
290 295 300
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
305 310 315 320
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
325 330 335
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
340 345 350
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
355 360 365
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
370 375 380
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
385 390 395
<210> 6
<211> 389
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
165 170 175
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
180 185 190
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
195 200 205
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
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Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Ala
225 230 235 240
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
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Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
260 265 270
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
275 280 285
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
290 295 300
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
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Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
325 330 335
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340 345 350
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
355 360 365
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
370 375 380
Ser Leu Ser Leu Gly
385
<210> 7
<211> 972
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gagaaccagg accccgacat caaggcccac gtgaacagcc tgggcgagaa cctgaagacc 60
ctgaggctga ggctgaggag gtgccacagg ttcctgccct gcgagaacaa gagcaaggcc 120
gtggagcagg tgaagaacgc cttcaacaag ctgcaggaga agggcatcta caaggccatg 180
agcgagttcg acatcttcat caactacatc gaggcctaca tgaccatgaa gatcaggaac 240
ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcgccga gagcaagtac 300
ggccccccct gccccccctg ccccgccccc gaggccgccg gcggccccag cgtgttcctg 360
ttccccccca agcccaagga caccctgatg atcagcagga cccccgaggt gacctgcgtg 420
gtggtggacg tgagccagga ggaccccgag gtgcagttca actggtacgt ggacggcgtg 480
gaggtgcaca acgccaagac caagcccagg gaggagcagt tcaacagcac ctacagggtg 540
gtgagcgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 600
gtgagcaaca agggcctgcc cagcagcatc gagaagacca tcagcaaggc caagggccag 660
cccagggagc cccaggtgta caccctgccc cccagccagg aggagatgac caagaaccag 720
gtgagcctga cctgcctggt gaagggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 780
agcaacggcc agcccgagaa caactacaag accacccccc ccgtgctgga cagcgacggc 840
agcttcttcc tgtacagcag gctgaccgtg gacaagagca ggtggcagga gggcaacgtg 900
ttcagctgca gcgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gagcctgagc 960
ctgagcctgg gc 972
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gctagccgcc accatgcata tg 22
<210> 9
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
taactcgag 9

Claims (10)

1.一种IL10-Fc融合蛋白，其中IL-10的C末端直接或通过连接肽与Fc蛋白的N端相连；其中，IL-10序列与Seq ID No.1所示一致；连接肽序列通式为[GlyGlyGlyGlySer]n，n为1-5的整数；Fc蛋白部分包含SEQ ID NO.2的序列,其中:
16位的X1为Pro或Glu；
17位的X2为Phe、Val、或Ala；
18位的X3为Leu、Glu、或Ala；
80位的X4为Asn或Ala；以及
230位的X5为Lys或不存在。
2.根据权利要求1所述的IL10-Fc融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白中连接肽序列通式为[GlyGlyGlyGlySer]n，n为1-3的整数。
3.根据权利要求2所述的IL10-Fc融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白中连接肽序列为[GlyGlyGlyGlySer]3。
4.根据权利要求1所述的IL10-Fc融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白中，SEQ ID NO：2第80位处的氨基酸X4为Ala，以去除IgG4 Fc区域中N-连接的糖基化位点。
5.根据权利要求1所述的IL10-Fc融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白中，SEQ ID NO：2第230位处的氨基酸X5缺失。
6.根据权利要求1所述的IL10-Fc融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示序列一致。
7.根据权利要求1所述的IL10-Fc融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白选自如下的蛋白质：
IL10-[GlyGlyGlyGlySer]3-IgG4 Fc，其中Fc第16位的X1为Glu，17位的X2为Ala，18位的X3为Ala，80位的X4为Asn，以及230位的X5为Lys；
IL10-GlyGlyGlyGlySer-IgG4 Fc，其中Fc第16位的X1为Glu，17位的X2为Ala，18位的X3为Ala，80位的X4为Asn，以及230位的X5不存在；
IL10-[GlyGlyGlyGlySer]3-IgG4 Fc，其中Fc第16位的X1为Pro，17位的X2为Phe，18位的X3为Ala，80位的X4为Ala，以及230位的X5不存在；
IL10-[GlyGlyGlyGlySer]3-IgG4 Fc，其中Fc第16位的X1为Pro，17位的X2为Val，18位的X3为Ala，80位的X4为Ala，以及230位的X5不存在；
IL10-IgG4 Fc，其中Fc第16位的X1为Glu，17位的X2为Ala，18位的X3为Ala，80位的X4为Ala，以及230位的X5为Lys；
IL10-[GlyGlyGlyGlySer]2-IgG4 Fc，其中Fc第16位的X1为Pro，17位的X2为Ala，18位的X3为Ala，80位的X4为Asn，以及230位的X5为Lys。
8.编码权利要求1-7任一项所述的IL10-Fc融合蛋白的基因。
9.一种药物组合物，包含治疗有效量的权利要求1-7任一项所述的IL10-Fc融合蛋白和药学可接受的载体。
10.权利要求1-7任一项所述的IL10-Fc融合蛋白在制备用于病毒性疾病、炎性病状、免疫相关病症、纤维化病症和癌症等疾病治疗药物中的用途。
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