ES2314099T3 - Oligonucleotidos inmunoestimulantes con motivos combinados con actividad mejorada. - Google Patents
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Abstract
Un ácido nucleico inmunoestimulante de 14-100 nucleótidos de longitud que tiene una secuencia de bases que comprende la fórmula: 5'' PX1DCGHX2 3'' o 5'' X1DCGHX2P 3'' en la que X1 y X2 son independientemente cualquier secuencia de 0 a 10 bases de longitud, D es una base distinta de C, C es citosina, G es guanina, H es una base distinta de G y P es una secuencia que contiene palíndromo rica en CG de al menos 10 bases de longitud, en la que a) H es timina (T) y X2 es CGTTT o CGTTTT, b) P es completamente palindrómico, H es T y X2 se selecciona del grupo consistente en CG, CGT, CGTT, CGTTT y CGTTTT y/o c) P incluye al menos una hipoxantina (I).
Description
Oligonucleótidos inmunoestimulantes con motivos
combinados con actividad mejorada.
La presente invención se refiere en general a
ácidos nucleicos inmunoestimulantes, a composiciones de los mismos
y a métodos de uso de los ácidos nucleicos inmunoestimulantes.
Son conocidas en la técnica dos clases
principales de secuencias inmunoestimulantes que tienen diferentes
perfiles de actividad inmunoestimulante. Krieg A.M. (2001) Trends
Microbiol. 9: 249-252. Estas son los denominados
oligodesoxinucleótidos (ODN) de CpG de clase B, que son fuertes
activadores de células B, y los ODN de CpG de clase A, que son
fuertes activadores de linfocitos citolíticos naturales (NK). Además
de estas secuencias inmunoestimulantes, son conocidas al menos dos
clases de secuencias neutralizantes, incluyendo secuencias de CpG
en las que el CG está precedido por una C o seguido por una G (Krieg
A.M. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:
12631-12636), y secuencias de ADN en las que el CG
está metilado. Es un motivo neutralizante un motivo que tiene
cierto grado de capacidad inmunoestimulante cuando está presente en
un motivo por lo demás no estimulante pero que, cuando está
presente en el contexto de otros motivos inmunoestimulantes, sirve
para reducir el potencial inmunoestimulante de los otros
motivos.
Se han descrito también ácidos nucleicos
inmunoestimulantes ricos en pirimidina y ácidos nucleicos
inmunoestimulantes que tienen un motivo TG que no requieren la
presencia de un motivo CpG (número de solicitud de patente
internacional PCT/US00/26383). De forma interesante, se encontró
que las secuencias de poli-T y los motivos TG eran
rasgos estructurales importantes para conferir actividad
inmunoestimulante.
Se proporciona en la presente memoria una nueva
clase de ácidos nucleicos inmunoestimulantes. En algunos casos,
estos ácidos nucleicos tienen un palíndromo rico en CG o un motivo
neutralizante rico en CG. Los solicitantes reconocieron y
describieron anteriormente oligodesoxinucleótidos (ODN) que
contenían motivos neutralizantes consistentes en repeticiones de la
secuencia CG tales como CGCGCG o un dinucleótido CG precedido de una
C (concretamente CCG) y/o seguido de una G (concretamente CGG,
CCGG). Se creía que estos motivos neutralizantes causaban cierta
reducción de los efectos estimulantes de ODN que contienen CpG en
múltiples lecturas, tales como la secreción de
IL-6, IL-12,
IFN-\gamma, TNF-\alpha y la
inducción de una respuesta inmunitaria específica de antígeno.
Krieg A.M. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
95: 12631-12636.
La presente invención está basada en parte en el
sorprendente descubrimiento por los solicitantes de que ciertos ODN
que contienen una combinación de motivo estimulante y motivo
neutralizante son altamente inmunoestimulantes. La presente
invención está también basada en parte en el sorprendente
descubrimiento por los solicitantes de que los ODN que tienen
ciertas secuencias palindrómicas ricas en CG, incluyendo secuencias
palindrómicas que contienen motivos neutralizantes, son altamente
inmunoestimulantes. El motivo neutralizante, por tanto, puede pero
no tiene por qué aparecer en el contexto de una secuencia
palindrómica para ser altamente inmunoestimulante.
Además, los ODN inmunoestimulantes de la
presente invención tienen efectos inmunoestimulantes asociados
anteriormente a ambas de las dos clases distintas de ODN de CpG,
aquellos que activan característicamente células B (ODN de CpG de
clase B) y aquellos que activan característicamente células NK e
inducen la producción de interferón (IFN)-\alpha
(ODN de CpG de clase A). Los ODN inmunoestimulantes novedosos de la
presente invención tienen por tanto un espectro de efectos
inmunoestimulantes distinto de los ODN de CpG de clase A o los ODN
de CpG de clase B. La nueva clase de ODN inmunoestimulantes de la
presente invención se designa como ODN de CpG de tipo C. Como se
describe con mayor detalle a continuación, en ciertas realizaciones
los ODN de la presente invención implican una combinación de
motivos en la que un motivo es un palíndromo rico en CG o un motivo
neutralizante y otro motivo es un motivo estimulante, por ejemplo,
un motivo CpG o la secuencia TCGTCG.
\vskip1.000000\baselineskip
En un primer aspecto, se proporciona un ácido
nucleico inmunoestimulante de 14-100 nucleótidos de
longitud que tiene una secuencia de bases que comprende la
fórmula:
5'
PX_{1}DCGHX_{2} 3' o 5' X_{1}DCGHX_{2}P
3'
en la que X_{1} y X_{2} son
independientemente cualquier secuencia de 0 a 10 bases de longitud,
D es una base distinta de C, C es citosina, G es guanina, H es una
base distinta de G y P es una secuencia que contiene palíndromo
rica en CG de al menos 10 bases de longitud, en la
que
a) H es timina (T) y X_{2} es CGTTT o
CGTTTT,
b) P es completamente palindrómico, H es T y
X_{2} se selecciona del grupo consistente en CG, CGT, CGTT, CGTTT
y CGTTTT y/o
c) P incluye al menos una hipoxantina (I).
\vskip1.000000\baselineskip
En algunas realizaciones, el ácido nucleico
inmunoestimulante tiene una secuencia de bases que comprende 5'
X_{1}DCGHX_{2}PX_{3} 3', 5' X_{1}DCGHPX_{3} 3', 5'
DCGHX_{2}PX_{3} 3', 5' TCGHX_{2}PX_{3} 3' o 5' DCGHPX_{3}
3'. X_{3} es cualquier secuencia de 0 a 10 bases de longitud. En
otras realizaciones, el ácido nucleico inmunoestimulante tiene una
secuencia de bases que comprende 5' DCGHP 3'.
Opcionalmente, D y/o H son timina (T).
En un segundo aspecto, se proporciona un ácido
nucleico inmunoestimulante de 14-100 nucleótidos de
longitud que tiene una secuencia de bases que comprende la
fórmula:
5'
NX_{1}DCGHX_{2} 3' o 5' X_{1}DCGHX_{2}N
3'
en la que X_{1} y X_{2} son
independientemente cualquier secuencia de 0 a 10 bases de longitud.
D es una base distinta de C, C es citosina, G es guanina, H es una
base distinta de G y N es una secuencia neutralizante de células B
que empieza por CGG y es de al menos 10 bases de longitud, en el
que:
- 1)
- para 5' NX_{1}DCGHX_{2} 3':
- a)
- H es timina (T) y/o
- b)
- H es T y X_{2} se selecciona del grupo consistente en CG, CGT, CGTT, CGTTT y CGTTTT, y
- 2)
- para 5' X_{1}DCGHX_{2}N 3':
- a)
- H es T y X_{2} es CGTTTT.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización, C está no metilada.
N incluye al menos cuatro dinucleótidos CG y no
más de dos trinucleótidos CCG en algunas realizaciones.
Opcionalmente, P incluye al menos una
hipoxantina (I).
La secuencia de bases puede incluir también una
secuencia poli-T en el extremo 5' o el extremo
3'.
En un tercer aspecto, se proporciona un ácido
nucleico inmunoestimulante de 13-100 nucleótidos de
longitud que tiene una secuencia de bases que comprende la
fórmula
5'
N_{1}PyGN_{2}P
3'
en la que N_{1} es cualquier
secuencia de 1 a 6 bases de longitud, Py es una pirimidina, G es
guanina, N_{2} es cualquier secuencia de 0 a 30 bases de longitud
y P es una secuencia que contiene un palíndromo rica en GC de al
menos 10 bases de longitud, en la que
N_{1}:
- a)
- incluye al menos un motivo citosina-hipoxantina (CI),
- b)
- incluye al menos un motivo TCI,
- c)
- incluye al menos un motivo IG,
- d)
- incluye al menos un motivo TIG, y/o
- e)
- es TCGG.
\vskip1.000000\baselineskip
En algunas realizaciones, N_{1} es al menos un
50% de pirimidinas y preferiblemente al menos un 50% de T. En otras
realizaciones, N_{1} incluye al menos un motivo CG o al menos un
motivo TCG. N_{1} es TCGH en otras realizaciones, en las que H es
un nucleótido distinto de G.
En algunas realizaciones, Py es una C no
metilada.
En algunas realizaciones, N_{2} es al menos un
50% de pirimidinas o al menos un 50% de T. En otras realizaciones,
N_{2} no incluye ningún motivo poli-G ni
poli-A.
En algunas realizaciones, P es completamente
palindrómico. En otras realizaciones, P es un palíndromo que tiene
entre 1 y 3 nucleótidos intercalados consecutivos. Opcionalmente,
los nucleótidos intercalados pueden ser TG. En otras realizaciones,
P incluye al menos 3, 4 ó 5 nucleótidos C y al menos 3, 4 ó 5 G.
Según otras realizaciones, P incluye al menos una hipoxantina.
En una realización, el palíndromo rico en GC
tiene un contenido de bases de al menos dos tercios de G y C. En
otras realizaciones, el palíndromo rico en CG tiene un contenido de
bases de al menos un 81% de G y C. En algunas realizaciones, el
palíndromo rico en GC es de al menos 12 nucleótidos de longitud. El
palíndromo rico en GC puede estar compuesto exclusivamente por C y
G. En algunas realizaciones, el palíndromo rico en GC puede incluir
al menos un nucleótido que no es C ni G.
En algunas realizaciones, el palíndromo rico en
GC incluye al menos un trímero CGG, al menos un trímero CCG o al
menos un tetrámero CGCG. En algunas realizaciones, el palíndromo
rico en GC incluye al menos cuatro dinucleótidos CG. En ciertas
realizaciones preferidas, el palíndromo rico en GC tiene un
dinucleótido CG central.
En ciertas realizaciones, el palíndromo rico en
GC es CGGCGCGCGCCG (SEC ID Nº 23), CGGCGGCCGCCG (SEC ID Nº 28),
CGACGATCGTCG (SEC ID Nº 68) o CGACGTACGTCG (SEC ID Nº 69).
En ciertas realizaciones, el palíndromo rico en
GC no es CGCGCGCGCGCG (SEC ID Nº 29), GCGCGCGCGCGC (SEC ID Nº 30),
CCCCCCGGGGGG (SEC ID Nº 31), GGGGGGCCCCCC (SEC ID Nº 32), CCCCCGGGGG
(SEC ID Nº 33) ni GGGGGCCCCC (SEC ID Nº 34).
En algunas realizaciones, N_{1}PyGN_{2} es
una secuencia seleccionada del grupo consistente en TTTTTCG, TTTCG,
TTTTCG, TTCGT y TTTCGT.
En un cuarto aspecto, se proporciona un ácido
nucleico inmunoestimulante de 13-100 nucleótidos de
longitud que tiene una secuencia de bases que comprende la
fórmula:
5'
N_{1}PyG/IN_{2}P
3'
en la que N_{1} es cualquier
secuencia de 1 a 6 bases de longitud, Py es una pirimidina, G/I
designa una sola base que es una G o una I, G es guanina e I es
hipoxantina, N_{2} es cualquier secuencia de 0 a 30 bases de
longitud, y P es una secuencia que contiene un palíndromo de al
menos 10 bases de longitud en la que, cuando G/I es G, P es un
palíndromo rico en
IC.
En algunas realizaciones, P es un palíndromo
rico en GC. En otras realizaciones, P es un palíndromo rico en
IC.
N_{1}PyIN_{2} es en algunas realizaciones
TCITCITTTT (SEC ID Nº 47).
Las moléculas de ácido nucleico descritas en la
presente memoria pueden tener cualquier tipo de composición de
cadena principal. En algunas realizaciones, el ácido nucleico
inmunoestimulante tiene una cadena principal completamente
resistente a nucleasa. La cadena principal resistente a nucleasa
puede estar compuesta por enlaces fosforotioato. En otras
realizaciones, el ácido nucleico inmunoestimulante tiene una cadena
principal completamente fosfodiéter. En aún otras realizaciones, el
ácido nucleico inmunoestimulante tiene una cadena principal
quimérica. En una realización, el ácido nucleico inmunoestimulante
tiene al menos un enlace fosfodiéster entre un motivo CG, CI o IG.
Como alternativa, los ODN de la presente invención se formulan con
micropartículas, emulsiones u otros medios para evitar una
digestión rápida in vivo.
Las moléculas de ácido nucleico
inmunoestimulantes descritas en la presente memoria tienen una
variedad de longitudes. En algunas realizaciones, el ácido nucleico
inmunoestimulante es de 13-100,
13-40, 13-30,
14-100, 14-40 ó
14-30 nucleótidos de longitud o cualquier entero
entre estos.
Se proporciona también un ácido nucleico
inmunoestimulante que tiene una secuencia de bases que comprende
una de las siguientes secuencias: TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG (SEC ID Nº
1), TCGTCGTTTTCGGCGGCCGC
CG (SEC ID Nº 4), TCGTCGTTTTCGGCGCGCCGCG (SEC ID Nº 5), TCGTCGTTTTCGGCGCCGGCCG (SEC ID Nº 6), TCGTCGTTTTCGGCCCGCGCGG (SEC ID Nº 7), TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGTTTTT (SEC ID Nº 12), TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCG (SEC ID Nº 13), TZGTZGTTTTZGGZGZGZGZZG (SEC ID Nº 14), en la que Z es 5-metilcitosina, TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT (SEC ID Nº 11), TCGTCGTTTTCGGCGGCC
GACG (ODN 5513, SEC ID Nº 64), TCGTCGTTTTCGTCGGCCGCCG (ODN 5514, SED ID Nº 65), TCGTCGTT
TTCGACGGCCGCCG (ODN 5515, SEC ID Nº 66) y TCGTCGTTTTCGGCGGCCGTCG (ODN 5516, SEC ID Nº 67).
CG (SEC ID Nº 4), TCGTCGTTTTCGGCGCGCCGCG (SEC ID Nº 5), TCGTCGTTTTCGGCGCCGGCCG (SEC ID Nº 6), TCGTCGTTTTCGGCCCGCGCGG (SEC ID Nº 7), TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGTTTTT (SEC ID Nº 12), TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCG (SEC ID Nº 13), TZGTZGTTTTZGGZGZGZGZZG (SEC ID Nº 14), en la que Z es 5-metilcitosina, TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT (SEC ID Nº 11), TCGTCGTTTTCGGCGGCC
GACG (ODN 5513, SEC ID Nº 64), TCGTCGTTTTCGTCGGCCGCCG (ODN 5514, SED ID Nº 65), TCGTCGTT
TTCGACGGCCGCCG (ODN 5515, SEC ID Nº 66) y TCGTCGTTTTCGGCGGCCGTCG (ODN 5516, SEC ID Nº 67).
Adicionalmente según otras realizaciones de la
invención, el ácido nucleico inmunoestimulante tiene una secuencia
de bases consistente en una de las siguientes secuencias:
TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG (ODN 2395), TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG (ODN
2429), TCGTCGTTTTCGGCGCGCCGCG (ODN 2430), TCGTCGTT
TTCGGCGCCGGCCG (ODN 2431), TCGTCGTTTTCGGCCCGCGCGG (ODN 2432), TCGTCGTTTTCGGCGC
GCGCCGTTTTT (ODN 2452), TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCG (ODN 5315), TZGTZGTTTTZGGZGGZGZ
GZGZZG (ODN 5327, en la que Z es 5-metilcitosina), TCGTCGTTTTCGGCGGCCGACG (ODN 5513), TCGTCG
TTTTCGTCGGCCGCCG (ODN 5514), TCGTCGTTTTCGACGGCCGCCG (ODN 5515), TCGTCGTTTTCGGCG
GCCGTCG (ODN 5516), TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT (ODN 2451), TCGTCGTTTCGACGGCCGTCG
(ODN 20173, SEC ID Nº 71), TCGTCGTTTCGACGATCGTCG (ODN 20176, SEC ID Nº 72), TCGTCGTTTC
GACGTACGTCG (ODN 20177, SEC ID Nº 73), TCGTCGCGACGGCCGTCG (ODN 20178, SEC ID Nº 74), TCGT
CGCGACGATCGTCG (ODN 20179, SEC ID Nº 75), TCGTCGCGACGTACGTCG (ODN 20180, SEC ID Nº 76), TCGTTTTTTTCGACGGCCGTCG (ODN 20184, SEC ID Nº 77), TCGTTTTTTTCGACGATCGTCG (ODN 20185, SEC ID Nº 78) y TCGTTTTTTTCGACGTACGTCG (ODN 20186, SEC ID Nº 79).
TTCGGCGCCGGCCG (ODN 2431), TCGTCGTTTTCGGCCCGCGCGG (ODN 2432), TCGTCGTTTTCGGCGC
GCGCCGTTTTT (ODN 2452), TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCG (ODN 5315), TZGTZGTTTTZGGZGGZGZ
GZGZZG (ODN 5327, en la que Z es 5-metilcitosina), TCGTCGTTTTCGGCGGCCGACG (ODN 5513), TCGTCG
TTTTCGTCGGCCGCCG (ODN 5514), TCGTCGTTTTCGACGGCCGCCG (ODN 5515), TCGTCGTTTTCGGCG
GCCGTCG (ODN 5516), TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT (ODN 2451), TCGTCGTTTCGACGGCCGTCG
(ODN 20173, SEC ID Nº 71), TCGTCGTTTCGACGATCGTCG (ODN 20176, SEC ID Nº 72), TCGTCGTTTC
GACGTACGTCG (ODN 20177, SEC ID Nº 73), TCGTCGCGACGGCCGTCG (ODN 20178, SEC ID Nº 74), TCGT
CGCGACGATCGTCG (ODN 20179, SEC ID Nº 75), TCGTCGCGACGTACGTCG (ODN 20180, SEC ID Nº 76), TCGTTTTTTTCGACGGCCGTCG (ODN 20184, SEC ID Nº 77), TCGTTTTTTTCGACGATCGTCG (ODN 20185, SEC ID Nº 78) y TCGTTTTTTTCGACGTACGTCG (ODN 20186, SEC ID Nº 79).
Se proporciona según otros aspectos de la
invención una composición farmacéutica que comprende los ácidos
nucleicos inmunoestimulantes descritos en la presente memoria y un
portador farmacéuticamente aceptable.
En otros aspectos de la invención, se
proporciona un método in vitro para inducir la expresión de
interferón (IFN) de tipo 1. El método implica poner en contacto una
célula capaz de expresar IFN de tipo 1 con una cantidad eficaz de
un ácido nucleico inmunoestimulante descrito en la presente memoria
para inducir la expresión de IFN de tipo 1.
Se proporciona también un ácido nucleico
inmunoestimulante según una cualquiera de las reivindicaciones
1-15 para uso en un método terapéutico que
comprende poner en contacto el ácido nucleico inmunoestimulante con
una célula capaz de expresar interferón (IFN) de tipo 1 e inducir
así la expresión de IFN de tipo 1.
La invención es en otros aspectos un método
in vitro para activar un linfocito citolítico natural (NK).
El método implica poner en contacto una célula NK con una cantidad
eficaz de un ácido nucleico inmunoestimulante descrito en la
presente memoria para activar la célula NK.
Se proporciona también un ácido nucleico
inmunoestimulante según una cualquiera de las reivindicaciones
1-15, para uso en un método terapéutico que
comprende poner en contacto el ácido nucleico inmunoestimulante con
un linfocito citolítico natural (NK) y activar así la célula NK.
En aún otros aspectos, la invención es un ácido
nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones
1-15, para uso en un método terapéutico que
comprende tratar o prevenir una infección en un sujeto que tiene, o
está en riesgo de desarrollar, dicha infección.
En algunas realizaciones, el sujeto tiene, o
está en riesgo de desarrollar, una infección seleccionada del grupo
consistente en una infección vírica, bacteriana, fúngica y
parasitaria.
En ciertas realizaciones, el método implica la
administración de un ácido nucleico inmunoestimulante de la
invención solo para tratar o prevenir la infección. En ciertas
realizaciones, el método según este aspecto de la invención incluye
adicionalmente administrar al sujeto un agente antibiótico, que
puede ser un agente antibacteriano, un agente antivírico, un agente
antifúngico o un agente antiparasitario.
En otros aspectos, la invención es un ácido
nucleico inmunoestimulante según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-15, para uso en un método
terapéutico que comprende tratar o prevenir una afección alérgica en
un sujeto que tiene, o está en riesgo de desarrollar, dicha
afección alérgica.
En algunas realizaciones, la afección alérgica
es asma alérgica. En una realización, la afección alérgica es asma.
En ciertas realizaciones, el método implica administrar un ácido
nucleico inmunoestimulante de la invención solo para tratar o
prevenir la afección alérgica. En ciertas realizaciones, el método
según este aspecto de la invención incluye adicionalmente
administrar al sujeto un medicamento para el asma/alergia, por
ejemplo, esteroides, antihistamínicos e inductores de
prostaglandina.
Según otros aspectos de la invención, se
proporciona un ácido nucleico inmunoestimulante según una cualquiera
de las reivindicaciones 1-15, para uso en un método
terapéutico que comprende tratar o prevenir el cáncer en un sujeto
que tiene, o está en riesgo de desarrollar, cáncer. El método
implica administrar a un sujeto que tiene o está en riesgo de
desarrollar cáncer una cantidad eficaz de un ácido nucleico
inmunoestimulante descrito en la presente memoria, para tratar o
prevenir el cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer se
selecciona del grupo consistente en carcinoma de células basales,
cáncer de tracto biliar, cáncer de vejiga, cáncer óseo, cáncer de
cerebro y SNC, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino,
coriocarcinoma, cáncer de colon y recto, cáncer de tejido
conectivo, cáncer del sistema digestivo, cáncer endométrico, cáncer
esofágico, cáncer de ojo, cáncer de cabeza y cuello, cáncer
gástrico, neoplasma intraepitelial, cáncer de riñón, cáncer de
laringe, leucemia, cáncer de hígado, cáncer de pulmón (por ejemplo,
de células pequeñas y de células no pequeñas), linfoma incluyendo
linfoma de Hodgkin y no de Hodgkin, melanoma, mieloma,
neuroblastoma, cáncer de la cavidad oral (por ejemplo, de labio,
lengua, boca y faringe), cáncer de ovario, cáncer pancreático,
cáncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer rectal,
cáncer renal, cáncer del sistema respiratorio, sarcoma, cáncer de
piel, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer tiroideo, cáncer
uterino, cáncer del sistema urinario y otros carcinomas y
sarcomas.
En ciertas realizaciones, el método implica
administrar un ácido nucleico inmunoestimulante de la invención
solo para tratar el cáncer. En ciertas realizaciones, el método
según este aspecto de la invención incluye adicionalmente
administrar al sujeto un medicamento o tratamiento anticanceroso,
por ejemplo, agentes quimioterapéuticos o
radiación.
radiación.
Cada una de las limitaciones de la invención
puede comprender diversas realizaciones de la invención. Por lo
tanto, se prevé que cada una de las limitaciones de la invención que
implica cualquier elemento o combinaciones de elementos pueda
incluirse en cada aspecto de la invención.
Se proporcionan las siguientes figuras sólo con
fines ilustrativos, y no son necesarias para entender o practicar
la invención.
La Figura 1 es una gráfica de barras que exhibe
las cantidades de IFN-\alpha (pg/ml) inducidas en
PBMC humanas después de 24 horas de cultivo solas, con
IL-2 o en presencia del ODN indicado a las
concentraciones indicadas.
La Figura 2 es una gráfica de barras que exhibe
las cantidades de MCP-1 (pg/ml) inducidas en PBMC
humanas después de 24 horas de cultivo solas, con
IL-2 o en presencia del ODN indicado a las
concentraciones indicadas.
La Figura 3 es una gráfica de barras que exhibe
las cantidades de IP-10 (pg/ml) inducidas en PBMC
humanas después de 24 horas de cultivo solas, con
IL-2 o en presencia del ODN indicado a las
concentraciones indicadas.
La Figura 4 es una gráfica de barras que exhibe
las cantidades de IFN-\alpha (pg/ml) inducidas en
PBMC humanas después de 48 horas de cultivo solas (N/A) o en
presencia del ODN indicado a 1,0 \mug/ml.
La Figura 5 es un par de gráficas de barras que
exhiben la tinción de superficie en células B por CD86 (MFI)
después de 48 horas de cultivo solas (N/A) o en presencia del ODN
indicado a 0,25 \mug/ml (panel A) o 1,0 \mug/ml (panel B).
La Figura 6 es un par de gráficas de barras que
exhiben los resultados de un ensayo de proliferación de células B
de 72 horas (incorporación de cpm de
^{3}H-timidina) solas (N/A) o en presencia del ODN
indicado a 0,25 \mug/ml (panel A) o 1,0 \mug/ml (panel B).
La Figura 7 es un par de gráficas de barras que
exhiben las cantidades de IL-10 (pg/ml) inducidas en
PBMC humanas después de 24 horas de cultivo solas (N/A) o en
presencia del ODN indicado a 0,25 \mug/ml (panel A) o 1,0
\mug/ml (panel B).
La Figura 8 es una gráfica de barras que exhibe
las cantidades de IFN-\alpha (pg/ml) inducidas en
PBMC a partir de dos donantes (D127, barras negras y D124, barras
blancas) después de 24 horas de cultivo solas (sin) o en presencia
del ODN indicado a las concentraciones indicadas (1 ó 6
\mug/ml).
La Figura 9 es una gráfica de barras que exhibe
la activación de células B medida mediante el porcentaje de células
CD86+ en PBMC humanas cultivadas durante 24 horas solas (sin) o en
presencia del ODN indicado a las concentraciones indicadas (0,4,
1,0 ó 10,0 \mug/ml).
La Figura 10 es una gráfica de barras que exhibe
la cantidad de IFN-\alpha (pg/ml) secretada por
PBMC a partir de dos donantes (D141, barras blancas y D142, barras
negras) después de 24 horas de cultivo solas (sin) o en presencia
del ODN indicado a las concentraciones indicadas (1 ó 6
\mug/ml).
La Figura 11 es una gráfica de barras que exhibe
la cantidad de IFN-\alpha (pg/ml) secretada por
PBMC a partir de dos donantes (D141, barras blancas y D142, barras
negras) después de 48 horas de cultivo solas (sin) o en presencia
del ODN indicado a las concentraciones indicadas (1 ó 6
\mug/ml).
La Figura 12 es una gráfica de barras que exhibe
la cantidad de IFN-\alpha (\mug/ml) secretada
por PBMC a partir de dos donantes (D141, barras negras y D142,
barras blancas) después de 24 horas de cultivo solas (sin) o en
presencia del ODN indicado a 6 \mug/ml.
La Figura 13 es una serie de tres gráficas de
barras que exhiben la cantidad de IFN-\gamma
(pg/ml) secretada por PBMC después de 24 horas de cultivo solas
(n/a) o en presencia del ODN indicado a las concentraciones
indicadas (1, 3 ó 10 \mug/ml en los paneles A, B y C,
respectivamente).
La Figura 14 es una gráfica de barras que exhibe
el porcentaje de células CD3+ de tinción positiva por
IFN-\gamma después de 48 horas de cultivo solas
(N/A) o en presencia del ODN indicado.
La Figura 15 es una gráfica de barras que exhibe
la intensidad media de fluorescencia (MFI) de la tinción por
IFN-\gamma en células T después de 48 horas de
cultivo solas (N/A) o en presencia del ODN indicado.
La Figura 16 es una gráfica de barras que exhibe
la cantidad de IFN-\alpha (pg/ml) secretada por
PBMC humanas después de 24 horas de cultivo solas (N/A) o en
presencia del ODN indicado a 1,0 \mug/ml.
La Figura 17 es un par de gráficas de barras que
exhiben la cantidad de IFN-\alpha (pg/ml)
secretada por PBMC humanas después de 24 ó 48 horas solas (sin) o
en presencia del ODN indicado a la concentración indicada (1 ó 6
\mug/ml). El panel A exhibe resultados de PBMC combinados a partir
de dos donantes. El panel A exhibe resultados de PBMC obtenidos a
partir de dos donantes (D141 y D142).
La Figura 18 es una gráfica de barras que exhibe
el porcentaje de células B CD86+ después de 24 horas de cultivo
solas (sin) o en presencia del ODN indicado a las concentraciones
indicadas (0,4 y 1,0 \mug/ml).
La Figura 19 es una serie de tres gráficas de
barras que exhiben la concentración de IFN-\gamma
(pg/ml) en sobrenadantes de cultivo de PBMC humanas después de
incubación solas (sin), con LPS o con el ODN indicado a las
concentraciones indicadas (0,2 a 1,0 \mug/ml) durante 6 horas
(panel A), 24 horas (panel B) o 48 horas (panel C).
La Figura 20 es una gráfica de barras que exhibe
la cantidad de IFN-\gamma (pg/ml) generada en una
reacción linfocitaria mixta (MLR) bidireccional en la que los
linfocitos obtenidos a partir de dos donantes se cultivaron durante
24 horas solos (sin) o en presencia del ODN indicado a 6 \mug/ml y
se mezclaron después.
La Figura 21 es una serie de tres gráficas de
barras que exhiben la concentración de IL-10 (pg/ml)
en sobrenadantes de cultivo de PBMC humanas después de incubación
solas (sin), con LPS o con el ODN indicado a las concentraciones
indicadas (0,2 a 1,0 \mug/ml) durante 6 horas (panel 6), 24 horas
(panel B) o 48 horas (panel C).
La Figura 22 es una gráfica de barras que exhibe
las cantidades de IP-10 (pg/ml) en sobrenadantes de
PBMC 24 horas después de incubación solas (n/a) o en presencia de
controles (IL-2, ODN 1585 (GGGGTCAACGTT
GAGGGGGG, SEC ID Nº 35) y ODN 2118 (GGGGTCAAGCTTGAGGGGGG, SEC ID Nº 36)) o los diversos ODN indicados a 0,6 \mug/ml (barras blancas) o 3,0 \mug/ml (barras negras).
GAGGGGGG, SEC ID Nº 35) y ODN 2118 (GGGGTCAAGCTTGAGGGGGG, SEC ID Nº 36)) o los diversos ODN indicados a 0,6 \mug/ml (barras blancas) o 3,0 \mug/ml (barras negras).
La Figura 23 es un par de gráficas de barras que
exhiben las cantidades de IFN-\alpha (pg/ml) en
sobrenadantes de PBMC después de 24 horas de incubación solas (n/a)
o en presencia de controles (IL-2, ODN 1585 y ODN
2118) o los diversos ODN indicados a 0,6 \mug/ml (panel A) o 3,0
\mug/ml (panel B).
La Figura 24 es una gráfica de barras que exhibe
las cantidades de IFN-\gamma (pg/ml) en
sobrenadantes de PBMC después de 24 horas de incubación solas (n/a)
o en presencia de controles (IL-2, ODN 1585 y ODN
2118) o los diversos ODN indicados a 0,6 \mug/ml (barras blancas)
o 3,0 \mug/ml (barras negras).
La Figura 25 es una gráficas de barras que
exhibe las cantidades de IL-6 (pg/ml) en
sobrenadantes de PBMC después de 24 horas de incubación solas (n/a)
o en presencia de controles (IL-2, ODN 1585 y ODN
2118) o los diversos ODN indicados a 0,6 \mug/ml (barras blancas)
o 3,0 \mug/ml (barras negras).
La Figura 26 es una gráfica de barras que exhibe
las cantidades de secreción de IFN-\alpha (pg/ml)
por PBMC después de 24 horas de cultivo solas (sin) o en presencia
del ODN indicado a las concentraciones indicadas (3,0 y 6,0
\mug/ml).
Se ha descubierto que ciertos
oligodesoxinucleótidos (ODN) que contienen al menos dos motivos
distintos tienen efectos estimulantes únicos y deseables sobre
células del sistema inmunitario. Algunos de estos ODN tienen tanto
una secuencia CpG "estimulante" tradicional como un motivo
"rico en GC" o "neutralizante de células B". Estos ácidos
nucleicos de motivos combinados tienen efectos inmunoestimulantes
que entran en algún punto entre aquellos efectos asociados a ODN de
CpG "de clase B" tradicionales, que son fuertes inductores de
la activación de células B y de la activación de células
dendríticas (DC), y aquellos efectos asociados a una clase descrita
más recientemente de ácidos nucleicos inmunoestimulantes (ODN de CpG
"de clase A"), que son fuertes inductores de la activación de
IFN-\alpha y linfocitos citolíticos naturales (NK)
pero relativamente malos inductores de la activación de células B y
DC. Krieg A.M. et al. (1995) Nature 374:
546-549; Ballas Z.K. et al. (1996) J.
Immunol. 157: 1840-1845; Yamamoto S. et
al. (1992) J. Immunol. 148: 4072-4076.
Aunque los ODN de CpG de clase B preferidos tienen a menudo cadenas
principales de fosforotioato y los ODN de CpG de clase A preferidos
tienen cadenas principales mixtas o quiméricas, la nueva clase de
ácidos nucleicos inmunoestimulantes de motivos combinados puede
tener una cadena principal estabilizada, por ejemplo, cadenas
principales de fosforotioato, quiméricas o de fosfodiéster.
En un aspecto, la invención proporciona ácidos
nucleicos inmunoestimulantes que pertenecen a esta nueva clase de
ácidos nucleicos inmunoestimulantes de motivos combinados. El
dominio estimulante de células B se define por la fórmula: 5'
X_{1}DCGHX_{2} 3'. D es una base distinta de C, C es citosina, G
es guanina y H es una base distinta
de G.
de G.
X_{1} y X_{2} son cualquier secuencia de
ácido nucleico de 0 a 10 bases de longitud. X_{1} puede incluir
un CG, en cuyo caso hay preferiblemente una T inmediatamente antes
de este CG. En algunas realizaciones, el DCG es TCG. X_{1} es
preferiblemente de 0 a 6 bases de longitud. En algunas
realizaciones, X_{2} no contiene ningún motivo
poli-G ni poli-A. En otras
realizaciones, la secuencia de bases del ácido nucleico
inmunoestimulante tiene una secuencia poli-T en el
extremo 5' o el extremo 3'. Como se usa en la presente memoria,
"poli-A" o "poli-T"
designarán un tramo de cuatro o más A o T consecutivas,
respectivamente por ejemplo, 5' AAAA 3' o 5' TTTT 3'.
Como se usa en la presente memoria, "extremo
poli-G" designará un tramo de cuatro o más G
consecutivas, por ejemplo 5' GGGG 3', que aparece en el extremo 5'
o el extremo 3' de un ácido nucleico. Como se usa en la presente
memoria, "ácido nucleico poli-G" designará un
ácido nucleico que tiene una secuencia de bases de fórmula 5'
X_{1}X_{2}GGGX_{3}X_{4} 3' en la que X_{1}, X_{2},
X_{3} y X_{4} son bases y preferiblemente al menos una de
X_{3} y X_{4} es una G.
Algunos diseños preferidos para el dominio
estimulante de células B de esta fórmula comprenden TTTTTCG, TCG,
TTCG, TTTCG, TTTTCG, TCGT, TTCGT, TTTCGT, TCGTCGT.
El segundo motivo del ácido nucleico se designa
como P o N y está dispuesto inmediatamente 5' a X_{1} o
inmediatamente 3' a X_{2}.
N es una secuencia neutralizante de células B
que empieza con un trinucleótido CGG y es de al menos 10 bases de
longitud. Un motivo neutralizante de células B incluye al menos una
secuencia de CpG en la que el CG es precedido por una C o seguido
por una G (Krieg A.M. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 95: 12631-12636) o es una secuencia de ADN
que contiene CG en la que la C del CG está metilada. Como se usa en
la presente memoria, "CpG" designará una 5' citosina (C)
seguida de una 3' guanina (G) y ligadas por un enlace fosfato. Al
menos la C del 5' CG 3' debe estar no metilada. Los motivos
neutralizantes son motivos que tienen cierto grado de capacidad
inmunoestimulante cuando están presentes en un motivo por lo demás
no estimulante pero que, cuando están presentes en el contexto de
otros motivos inmunoestimulantes, sirven para reducir el potencial
inmunoestimulante de los otros motivos.
P es un palíndromo rico en GC que contiene una
secuencia de al menos 10 bases de longitud. Como se usa en la
presente memoria, "palíndromo" y equivalentemente "secuencia
palindrómica" designarán una repetición invertida, concretamente
una secuencia tal como ABCDEE'D'C'B'A' en la que A y A', B y B',
etc. son bases capaces de formar los pares de bases de
Watson-Crick habituales.
Como se usa en la presente memoria "palíndromo
rico en GC" designará un palíndromo que tiene una composición de
bases de al menos dos tercios de G y C. En algunas realizaciones, el
dominio rico en GC está preferiblemente 3' al "dominio
estimulante de células B". En el caso de un palíndromo rico en GC
de 10 bases de longitud, el palíndromo contiene por tanto al menos
8 G y C. En el caso de un palíndromo rico en GC de 12 bases de
longitud, el palíndromo contiene también al menos 8 G y C. En el
caso de un palíndromo de 14 unidades rico en GC, al menos 10 bases
del palíndromo son G y C. En algunas realizaciones, el palíndromo
rico en GC está compuesto exclusivamente
por G y C.
por G y C.
En algunas realizaciones, el palíndromo rico en
GC tiene una composición de bases de al menos un 81% de G y C. En
el caso de dicho palíndromo rico en GC de 10 bases, el palíndromo
está compuesto por tanto exclusivamente por G y C. En el caso de
dicho palíndromo rico en GC de 12 bases de longitud, se prefiere que
al menos 10 bases (83%) del palíndromo sean G y C. En algunas
realizaciones preferidas, el palíndromo rico en GC de 12 bases de
longitud está compuesto exclusivamente por G y C. En el caso de un
palíndromo rico en GC de 14 unidades, al menos 12 bases (86%) del
palíndromo son G y C. En algunas realizaciones preferidas, el
palíndromo rico en GC de 14 bases de longitud está compuesto
exclusivamente por G y C. Las C de un palíndromo rico en GC pueden
estar no metiladas o pueden estar metiladas.
En general, este dominio tiene al menos 3 C y G,
más preferiblemente 4 de cada, y lo más preferiblemente 5 o más de
cada. El número de C y G de este dominio no tiene que ser idéntico.
Se prefiere que las C y G estén dispuestas de modo que sean capaces
de formar un dúplex autocomplementario o palíndromo, tal como
CCGCGCGG. Este puede estar interrumpido por A o T, pero se prefiere
que la autocomplementariedad esté al menos parcialmente conservada
como, por ejemplo, en los motivos CGACGTTCGTCG (SEC ID Nº 80) o
CGGCGCCGTGCCG (SEC ID Nº 81). Cuando no se conserva la
complementariedad, se prefiere que los pares de bases no
complementarias sean TG. En una realización preferida, no hay más
de 3 bases consecutivas que no sean parte del palíndromo,
preferiblemente no más de 2, y lo más preferiblemente sólo 1. En
algunas realizaciones, el palíndromo rico en GC incluye al menos un
trímero CGG, al menos un trímero CCG o al menos un tetrámero CGCG.
En otras realizaciones, el palíndromo rico en GC no es CCCCCCGGGGGG
(SEC ID Nº 31) ni GGGGGGCCCCCC (SEC ID Nº 32), CCCCCGGGGG (SEC ID Nº
33) ni GGGGGCCCCC (SEC ID Nº 34).
Al menos una de las G de la región rica en GC
puede estar sustituida por una hipoxantina (I). En algunas
realizaciones, P incluye más de una I.
En ciertos aspectos, el ácido nucleico
inmunoestimulante tiene una secuencia de bases que comprende una de
las siguientes fórmulas: 5' NX_{1}DCGHX_{2} 3', 5'
X_{1}DCGHX_{2}N 3', 5' PX_{1}DCGHX_{2} 3' o 5'
X_{1}DCGHX_{2}P 3'.
En ciertas realizaciones, la secuencia de bases
comprende 5' X_{1}DCGHX_{2}PX_{3} 3', 5' X_{1}DCGHPX_{3}
3', 5' DCGHX_{2}
PX_{3} 3', 5' TCGHX_{2}PX_{3} 3', 5' DCGHPX_{3} 3' o 5' DCGHP 3'.
PX_{3} 3', 5' TCGHX_{2}PX_{3} 3', 5' DCGHPX_{3} 3' o 5' DCGHP 3'.
En otros aspectos, la invención proporciona
ácidos nucleicos inmunoestimulantes que se definen por la fórmula:
5' N_{1}PyGN_{2}P 3'. N_{1} es cualquier secuencia de 1 a 6
bases de longitud. Py es una pirimidina. G es guanina. N_{2} es
cualquier secuencia de 0 a 30 bases de longitud. P es un palíndromo
rico en GC que contiene una secuencia de al menos 10 bases de
longitud.
N_{1} y N_{2} pueden contener más de un 50%
de pirimidinas, y más preferiblemente más de un 50% de T. N_{1}
puede incluir un CG, en cuyo caso hay preferiblemente una T
inmediatamente anterior a este CG. En algunas realizaciones,
N_{1}PyG es TCG (tal como ODN 5376, que tiene un 5' TCGG), y lo
más preferiblemente TCGN_{2}, en la que N_{2} no es G.
N_{1}PyGN_{2}P puede incluir uno o más
nucleótidos de inosina (I). Cualquiera de C o G en N_{1} puede
reemplazarse por inosina, pero se prefiere CpI a IpG. Para
sustituciones por inosina tales como IpG, puede conseguirse una
actividad óptima con el uso de una cadena principal
"semiflexibilizada" o quimérica, en la que el enlace entre IG
o CI sea fosfodiéster. N_{1} puede incluir al menos un motivo CI,
TCI, IG o TIG.
En ciertas realizaciones, N_{1}PyGN_{2} es
una secuencia seleccionada del grupo consistente en TTTTTCG, TTTCG,
TTTTCG, TTCGT y TTTCGT.
En otros aspectos, la invención proporciona
ácidos nucleicos inmunoestimulantes que se definen por la fórmula:
5' N_{1}PyG/IN_{2}P 3'. N_{1} es cualquier secuencia de 1 a 6
bases de longitud. Py es una pirimidina, G/I designa un solo
nucleótido que es una G o una I. G es guanina e I es hipoxantina.
N_{2} es cualquier secuencia de 0 a 30 bases de longitud. P es un
palíndromo que contiene una secuencia de al menos 10 nucleótidos de
longitud en la que cuando G/I es G, P es un palíndromo rico en IC.
En algunas realizaciones, N_{1}PyIN_{2} es TCITCITTTT (SEC ID
Nº 47).
Algunos ejemplos no limitantes de ácidos
nucleicos inmunoestimulantes de motivos combinados, que se describen
por las fórmulas anteriores, incluyen aquellos que tienen las
siguientes secuencias de bases:
TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG (ODN 2395),
TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG (ODN 2429), TCGTCG
TTTTCGGCGCGCCGCG (ODN 2430), TCGTCGTTTTCGGCGCCGGCCG (ODN 2431), TCGTCGTTTTCGGC
CCGCGCGG (ODN 2432), TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGTTTTT (ODN 2452), TCCTGACGTTCGGCGCG
CGCCG (ODN 5315), TZGTZGTTTTZGGZGZGZGZZG (ODN 5327, en la que Z es 5-metilcitosina), TCGTCGTT
TTCGGCGGCCGACG (ODN 5513), TCGTCGTTTTCGTCGGCCGCCG (ODN 5514), TCGTCGTTTTCGACGG
CCGCCG (ODN 5515), TCGTCGTTTTCGGCGGCCGTCG (ODN 5516), TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT
(ODN 2451), TCGTCGTTTCGACGGCCGTCG (ODN 20173), TCGTCGTTTCGACGATCGTCG (ODN 20176), TCGTCGTTTCGACGTACGTCG (ODN 20177), TCGTCGCGACGGCCGTCG (ODN 20178), TCGTCGCGAC
GATCGTCG (ODN 20179), TCGTCGCGACGTACGTCG (ODN 20180), TCGTTTTTTTCGACGGCCGTCG (ODN 20184), TCGTTTTTTTCGACGATCGTCG (ODN 20185), TCGTTTTTTTCGACGTACGTCG (ODN 20186), TIG
TIGTTTTCGGCGGCCGCCG (ODN 5569, SEC ID Nº 63) y TCITCITTTTCGGCGGCCGCCG (ODN 5570, SEC ID Nº 70).
TTTTCGGCGCGCCGCG (ODN 2430), TCGTCGTTTTCGGCGCCGGCCG (ODN 2431), TCGTCGTTTTCGGC
CCGCGCGG (ODN 2432), TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGTTTTT (ODN 2452), TCCTGACGTTCGGCGCG
CGCCG (ODN 5315), TZGTZGTTTTZGGZGZGZGZZG (ODN 5327, en la que Z es 5-metilcitosina), TCGTCGTT
TTCGGCGGCCGACG (ODN 5513), TCGTCGTTTTCGTCGGCCGCCG (ODN 5514), TCGTCGTTTTCGACGG
CCGCCG (ODN 5515), TCGTCGTTTTCGGCGGCCGTCG (ODN 5516), TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT
(ODN 2451), TCGTCGTTTCGACGGCCGTCG (ODN 20173), TCGTCGTTTCGACGATCGTCG (ODN 20176), TCGTCGTTTCGACGTACGTCG (ODN 20177), TCGTCGCGACGGCCGTCG (ODN 20178), TCGTCGCGAC
GATCGTCG (ODN 20179), TCGTCGCGACGTACGTCG (ODN 20180), TCGTTTTTTTCGACGGCCGTCG (ODN 20184), TCGTTTTTTTCGACGATCGTCG (ODN 20185), TCGTTTTTTTCGACGTACGTCG (ODN 20186), TIG
TIGTTTTCGGCGGCCGCCG (ODN 5569, SEC ID Nº 63) y TCITCITTTTCGGCGGCCGCCG (ODN 5570, SEC ID Nº 70).
Como se usa en la presente memoria, "ácido
nucleico" y "oligonucleótido" se usan intercambiablemente y
designarán múltiples nucleótidos (concretamente, moléculas que
comprenden un azúcar (por ejemplo, ribosa o desoxirribosa) ligado a
un grupo fosfato y a una base orgánica intercambiable, que es una
pirimidina sustituida (por ejemplo, citosina (C), timina (T) o
uracilo (U)) o una purina sustituida (por ejemplo, adenina (A) o
guanina (G))). Como se usa en la presente memoria, los términos
designan oligorribonucleótidos así como oligodesoxirribonucleótidos
(ODN). Los términos incluirán también polinucleósidos (concretamente
un polinucleótido menos el fosfato) y cualquier otra fuente
orgánica (por ejemplo, ADN genómico o ADNc), pero son
preferiblemente sintéticos (por ejemplo, producidos mediante
síntesis de ácido nucleico).
Los términos ácido nucleico y oligonucleótido
comprenden también ácidos nucleicos u oligonucleótidos con
sustituciones o modificaciones, tales como en bases y/o azúcares.
Por ejemplo, incluyen ácidos nucleicos que tienen azúcares de
cadena principal que están unidos covalentemente a grupos orgánicos
de bajo peso molecular distintos de un grupo hidroxilo en la
posición 3', y otros distintos de un grupo fosfato en la posición
5'. Los ácidos nucleicos así modificados puede incluir un grupo
ribosa 2'-O-alquilado. Además, los
ácidos nucleicos modificados pueden incluir azúcares tales como
arabinosa en lugar de ribosa. Pro tanto, los ácidos nucleicos pueden
ser heterogéneos en la composición de la cadena principal,
conteniendo así cualquier posible combinación de unidades
poliméricas ligadas entre sí tales como ácidos péptidonucleicos (que
tienen una cadena principal de aminoácidos con bases de ácido
nucleico). En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos son
homogéneos en la composición de la cadena principal. Los ácidos
nucleicos incluyen también purinas y pirimidinas sustituidas tales
como bases modificadas con C-5 propino. Wagner R.W.
et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14:
840-844. Las purinas y pirimidinas incluyen, pero
sin limitación, adenina, citosina, guanina, timidina,
5-metilcitosina, 2-aminopurina,
2-amino-6-cloropurina,
2,6-diaminopurina, hipoxantina y otras nucleobases
de origen natural y no natural, restos aromáticos sustituidos y no
sustituidos. Son bien conocidas por los expertos en la técnica otras
de dichas modificaciones.
Los oligonucleótidos inmunoestimulantes de la
presente invención pueden comprender diversas modificaciones
químicas y sustituciones, en comparación con ARN y ADN naturales,
que implican un puente internucleosídico fosfodiéster, una unidad
\beta-D-ribosa y/o una base
nucleosídica natural (adenina, guanina, citosina, timina, uracilo).
Los ejemplos de modificaciones químicas son conocidos por el experto
y se describen, por ejemplo, en Uhlmannn E. et al. (1990)
Chem. Rev. 90: 543; "Protocols for Oligonucleotides and
Analogs", "Synthesis and Properties & Synthesis and
Analytical Techniques", S. Agrawal, Ed. Humana Press, Totowa,
EE.UU. 1993; Crooke S.T. et al. (1996) Annu. Rev.
Pharmacol. Toxicol. 36: 107-129; y Hunziker J.
et al. (1995) Mod. Synth. Methods. 7:
331-417. Un oligonucleótido según la invención puede
tener una o más modificaciones, en el que cada modificación se
localiza en un puente internucleosídico fosfodiéster particular y/o
en una unidad de \beta-D-ribosa
particular y/o en una posición de base nucleosídica natural
particular en comparación con un oligonucleótido de la misma
secuencia que está compuesto por ADN o ARN natural.
Por ejemplo, la invención se refiere a un
oligonucleótido que puede comprender una o más modificaciones y en
el que cada modificación se selecciona independientemente de:
a) el reemplazo de una unidad de
azúcar-fosfato de la cadena principal de
azúcar-fosfato por otra unidad,
b) el reemplazo de una unidad de
\beta-D-ribosa por una unidad de
azúcar modificada, y
c) el reemplazo de una base nucleosídica natural
por una base nucleosídica modificada.
Son ejemplos más detallados de la modificación
química de un oligonucleótido los siguientes.
Una unidad de azúcar-fosfato
(concretamente, una \beta-D-ribosa
y puente internucleosídico fosfodiéster formando conjuntamente una
unidad azúcar-fosfato) de la cadena principal de
azúcar-fosfato (concretamente, una cadena principal
de azúcar-fosfato está compuesta por unidades de
azúcar-fosfato) puede reemplazarse por otra unidad,
en la que la otra unidad es, por ejemplo, adecuada para formar un
oligómero "derivado de morfolino" (como se describe, por
ejemplo, en Stirchak E.P. et al. (1989) Nucleic Acids
Res. 17: 6129-6141), es decir, por ejemplo, el
reemplazo por una unidad derivada de morfolino; o para formar un
ácido poliamidonucleico ("PNA", como se describe, por ejemplo,
en Nielsen P.E. et al. (1994) Bioconjug. Chem. 5:
3-7), es decir, por ejemplo, el reemplazo por una
unidad de cadena principal de PNA, por ejemplo, por
2-aminoetilglicina.
Una unidad de \beta-ribosa o
unidad de
\beta-D-2'-desoxirribosa
puede reemplazarse por una unidad de azúcar modificada, en la que
la unidad de azúcar modificada se selecciona, por ejemplo, de
\beta-D-ribosa,
\alpha-D-2'-desoxirribosa,
L-2'-desoxirribosa,
2'-F-2'-desoxirribosa,
2'-O-alquil
C_{1}-C_{6}-ribosa,
preferiblemente 2'-O-alquil
C_{1}-C_{6}-ribosa es
2'-O-metilrribosa,
2'-O-alquenil
C_{2}-C_{6}-ribosa,
2'-[O-alquil
C_{1}-C_{6}-O-alquil
C_{1}-C_{6}]-ribosa,
2'-NH_{2}-2'-desoxirribosa,
\beta-D-xilofuranosa,
\alpha-arabinofuranosa,
2,4-didesoxi-\beta-D-eritrohexopiranosa
y análogos carbocíclicos (descritos, por ejemplo, en Froehler J.
(1992) Am. Chem. Soc. 114: 8320) y/o análogos de azúcar de
cadena abierta (descritos, por ejemplo, en Vandendriessche et
al. (1993) Tetrahedron 49: 7223) y/o análogos de
bicicloazúcar (descritos, por ejemplo, en Tarkov M. et al.
(1993) Helv. Chim. Acta 76: 481).
Una base nucleosídica natural puede reemplazarse
por una base nucleosídica modificada, en la que la base nucleosídica
modificada se selecciona, por ejemplo, de hipoxantina, uracilo,
dihidrouracilo, pseudouracilo, 2-tiouracilo,
4-tiouracilo, 5-aminouracilo,
5-alquil
C_{1}-C_{6}-uracilo,
5-alquenil
C_{2}-C_{6}-uracilo,
5-alquinil
C_{2}-C_{6}-uracilo,
5-hidroximetiluracilo,
5-clorouracilo, 5-fluorouracilo,
5-bromouracilo, 5-hidroxicitosina,
5-alquil
C_{1}-C_{6}-citosina,
5-alquenil
C_{2}-C_{6}-citosina,
5-alquinil
C_{2}-C_{6}-citosina,
5-clorocitosina, 5-fluorocitosina,
5-bromocitosina,
N^{2}-dimetilguanina,
2,4-diaminopurina, 8-azapurina y
modificaciones sustituidas de bases nucleosídicas naturales. Esta
lista se pretende que sea ilustrativa y no ha de interpretarse como
limitante.
Como se usa en la presente memoria, "ácido
nucleico inmunoestimulante" designará una molécula de ácido
ribonucleico o ácido desoxirribonucleico, derivado o análogo de la
misma, caracterizada por su capacidad de inducir un aspecto
funcional de una célula del sistema inmunitario. Dicho aspecto
funcional de una célula del sistema inmunitario puede incluir, por
ejemplo, la elaboración de una citocina o quimiocina, la expresión
de un marcador de superficie celular, la secreción de un
anticuerpo, la proliferación u otra actividad en respuesta a o
dirigida contra un antígeno o diana unida a membrana que porta
antígeno.
Para uso en la presente invención, los ácidos
nucleicos de la invención pueden sintetizarse de novo usando
cualquiera de una serie de procedimientos bien conocidos en la
técnica, por ejemplo, el método de
\beta-cianoetilfosforamidita (Beaucage S.L. y
Caruthers M.H. (1981) Tetrahedron Lett. 22: 1859) y el método
de H-fosfonato nucleosídico (Garegg et al.
(1986) Tetrahedron Lett. 27: 4051-4054;
Froehler et al. (1986) Nucl. Acid Res. 14:
5399-5407; Garegg et al. (1986)
Tetrahedron Lett. 27: 4055-4058; Gaffney
et al. (1988) Tetrahedron Lett. 29:
2619-2622). Estas químicas pueden realizarse
mediante una variedad de sintetizadores automatizados de ácidos
nucleicos disponibles en el mercado. Estos ácidos nucleicos se
designan como ácidos nucleicos sintéticos. Como alternativa, los
ácidos nucleicos de la invención pueden producirse a gran escala en
plásmidos (véase Sambrook T. et al., "Molecular Cloning: A
Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva
York, 1989) y se separan en trozos menores o se administran enteros.
Los ácidos nucleicos pueden prepararse entonces a partir de
secuencias de ácido nucleico existentes (por ejemplo, ADN genómico o
ADNc) usando técnicas conocidas tales como aquellas que emplean
enzimas de restricción, exonucleasas o endonucleasas. Los ácidos
nucleicos preparados de esta manera se designan como ácidos
nucleicos aislados. Un ácido nucleico aislado designa generalmente
un ácido nucleico que está separado de los componentes con los que
está asociado normalmente en la naturaleza. Como ejemplo, un ácido
nucleico aislado puede ser aquel que está separado de una célula,
de un núcleo, de mitocondrias o de cromatina. Los ácidos nucleicos
de motivos combinados de la presente invención comprenden tanto
ácidos nucleicos de motivos combinados sintéticos como aislados.
Para uso in vivo, los ácidos nucleicos
inmunoestimulantes de motivos combinados pueden ser opcionalmente
relativamente resistentes a la degradación (por ejemplo, están
estabilizados). Una "molécula de ácido nucleico estabilizada"
significará una molécula de ácido nucleico que es relativamente
resistente a la degradación in vivo (por ejemplo, mediante
una exonucleasa o endonucleasa). La estabilización de ácido nucleico
puede conseguirse mediante modificaciones de la cadena principal
fosfato. Los ácidos nucleicos estabilizados preferidos de la
presente invención tienen una cadena principal modificada. Se ha
demostrado que la modificación de la cadena principal de ácido
nucleico proporciona una actividad potenciada de los ácidos
nucleicos inmunoestimulantes de motivos combinados cuando se
administran in vivo. Los ácidos nucleicos inmunoestimulantes
de motivos combinados que tienen enlaces fosforotioato proporcionan
en algunos casos una máxima actividad y protegen al ácido nucleico
de la degradación por exonucleasas y endonucleasas intracelulares.
Otros ácidos nucleicos modificados incluyen ácidos nucleicos
fosfodiéster modificados, combinaciones de ácidos nucleicos
fosfodiéter y fosforotioato (concretamente quiméricos),
metilfosfonato, metilfosforotioato, fosforoditioato,
p-etoxi y combinaciones de los mismos.
Las cadenas principales modificadas tales como
fosforotioatos pueden sintetizarse usando técnicas automatizadas
que emplean químicas de fosforamidato o H-fosfonato.
Pueden prepararse fosfonatos de arilo y alquilo, por ejemplo como
se describe en la patente de EE.UU. nº 4.469.863, y pueden
prepararse fosfotriésteres de alquilo (en los que el resto de
oxígeno cargado está alquilado como se describe en la patente de
EE.UU. nº 5.023.243 y la patente europea nº 092.574) mediante
síntesis automatizada en fase sólida usando reactivos comercialmente
disponibles. Se han descrito métodos para preparar otras
modificaciones y sustituciones de la cadena principal de ADN.
Uhlmann E. y Peyman A. (1990) Chem. Rev. 90: 544, Goodchild
J. (1990) Bioconjugate Chem. 1: 165.
Otros ácidos nucleicos estabilizados incluyen:
análogos de ADN no iónicos tales como fosfatos de alquilo y arilo
(en los que el oxígeno de fosfonato cargado está reemplazado por un
grupo alquilo o arilo), fosfodiésteres y fosfotriésteres de alquilo
en los que el resto oxígeno cargado está alquilado. Los ácidos
nucleicos que contienen diol, tales como tetraetilenglicol o
hexaetilenglicol, en cualquiera o ambos extremos, han mostrado
también ser sustancialmente resistentes a la degradación por
nucleasa.
En otras realizaciones, los ácidos nucleicos
inmunoestimulantes pueden tener cadenas principales fosfodiéster o
quiméricas, por ejemplo, flexibilizadas o semiflexibilizadas. Una
cadena principal quimérica incluye una combinación de enlaces de
cadena principal fosfodiéster y modificados. Un oligonucleótido
quimérico, por ejemplo, puede ser un oligonucleótido flexibilizado
o un oligonucleótido semiflexibilizado.
Un oligonucleótido flexibilizado es un
oligonucleótido inmunoestimulante que tiene una cadena principal
parcialmente estabilizada, en la que los enlaces internucleosídicos
fosfodiéster o similares a fosfodiéster aparecen sólo dentro de e
inmediatamente adyacentes a al menos un dinucleótido de nucleósido
de pirimidina-guanosina (YG) interno. El al menos
un dinucleótido YG interno mismo tiene un enlace internucleosídico
fosfodiéster o similar a fosfodiéster. Un enlace internucleosídico
fosfodiéster o similar a fosfodiéster que aparece inmediatamente
adyacente a al menos un dinucleótido YG interno puede estar 5', 3' o
tanto 5' como 3' a al menos un dinucleótido YG interno.
Preferiblemente, un enlace internucleosídico fosfodiéster o similar
a fosfodiéster que aparece inmediatamente adyacente a al menos un
dinucleótido YG interno es en sí mismo un enlace internucleosídico
interno. Por tanto, para una secuencia N_{1}YGN_{2} en la que
N_{1} y N_{2} son cada uno independientemente del otro
cualquier nucleótido sencillo, el dinucleótido YG tiene un enlace
internucleosídico fosfodiéster o similar a fosfodiéster, y además
(a) N_{1} e Y están ligados por un enlace internucleosídico
fosfodiéster o similar a fosfodiéster cuando N_{1} es un
nucleótido interno, (b) G y N_{2} están ligados por un enlace
internucleosídico fosfodiéster o similar a fosfodiéster cuando
N_{2} es un nucleótido interno, o (c) N_{1} e Y están ligados
por un enlace internucleosídico fosfodiéster o similar a
fosfodiéster cuando N_{1} es un nucleótido interno y G y N_{2}
están ligados por un enlace internucleosídico fosfodiéster o similar
a fosfodiéster cuando N_{2} es un nucleótido interno.
Un oligonucleótido semiflexibilizado es un
oligonucleótido inmunoestimulante que tiene una cadena principal
parcialmente estabilizada en la que aparecen enlaces
internucleosídicos fosfodiéster o similares a fosfodiéster sólo
dentro de un dinucleótido de nucleósido de
pirimidina-guanosina (YG) interno. Los
oligonucleótidos semiflexibilizados pueden tener una serie de
ventajas frente a los oligonucleótidos inmunoestimulantes con
cadenas principales totalmente estabilizadas. Por ejemplo, los
oligonucleótidos semiflexibilizados pueden poseer una potencia
inmunoestimulante aumentada respecto a los correspondientes
oligonucleótidos inmunoestimulantes totalmente estabilizados.
Los ácidos nucleicos inmunoestimulantes pueden
usarse para tratar a un sujeto para inducir una respuesta
inmunitaria o tratar una enfermedad relacionada con el sistema
inmunitario tal como, por ejemplo, enfermedad infecciosa, cáncer y
trastornos alérgicos. Como se usa en la presente memoria,
"sujeto" designará un animal humano o vertebrado incluyendo,
pero sin limitación, un perro, gato, caballo, vaca, cerdo, oveja,
cabra, pollo, mono, conejo, rata, ratón, etc.
Como se usan en la presente memoria, los
términos "tratar", "tratamiento" y "tratado"
designarán un tratamiento profiláctico que aumenta la resistencia
de un sujeto a desarrollar una enfermedad o, en otras palabras,
reduce la probabilidad de que un sujeto desarrolle una enfermedad o
retarda el desarrollo de la enfermedad, así como un tratamiento
después de que el sujeto haya desarrollado la enfermedad para luchar
contra ella, por ejemplo, reducirla o eliminarla completamente o
evitar que empeore. Por ejemplo, cuando se usan con respecto al
tratamiento de una enfermedad infecciosa, los términos designan un
tratamiento profiláctico que aumenta la resistencia de un sujeto a
un microorganismo o, en otras palabras, reduce la probabilidad de
que el sujeto desarrolle una enfermedad infecciosa por el
microorganismo, así como un tratamiento después de que el sujeto se
haya infectado para luchar contra la enfermedad infecciosa, por
ejemplo, reducirla o eliminarla totalmente o evitar que empeore.
Cuando se usan con respecto a una enfermedad tal como cáncer, los
términos designan la prevención o retardo del desarrollo de un
cáncer, reducir los síntomas del cáncer y/o inhibir o retardar el
crecimiento de un cáncer establecido.
Por tanto, los ácidos nucleicos son útiles como
agentes profilácticos para la inducción de inmunidad de un sujeto
en riesgo de desarrollar una infección por un organismo infeccioso o
un sujeto en riesgo de desarrollar un trastorno alérgico o cáncer.
Un "sujeto en riesgo" como se usa en la presente memoria es un
sujeto que tiene cualquier riesgo de exposición a un patógeno
infeccioso causante de infección, exposición a un alergeno o
desarrollo de cáncer. Por ejemplo, un sujeto en riesgo puede ser un
sujeto que está planeando viajar a un área donde se encuentra un
tipo particular de agente infeccioso o alergeno o puede ser un
sujeto que por su estilo de vida o procedimientos médicos esté
expuesto a fluidos corporales que pueden contener organismos
infecciosos o incluso cualquier sujeto que viva en un área en la que
se haya identificado un organismo infeccioso o alergeno y esté
expuesto directamente al agente infeccioso o alergeno. Puede ser
también un sujeto en riesgo de guerra biológica tal como personal
militar o aquellos que vivan en áreas de riesgo de ataque
terrorista. Los sujetos en riesgo de desarrollar infección incluyen
también poblaciones genéricas a las que una agencia sanitaria
recomiende la vacunación con un antígeno de organismo infeccioso
particular. Si el antígeno es un alergeno y el sujeto desarrolla
respuestas alérgicas a ese antígeno particular y el sujeto está
expuesto al antígeno, concretamente, durante la temporada de
polinización, entonces ese sujeto está en riesgo de exposición al
antígeno. Los sujetos en riesgo de desarrollar cáncer incluyen
aquellos con una predisposición genética o tratados anteriormente
por cáncer, y aquellos expuestos a carcinógenos tales como tabaco,
asbestos y otras toxinas químicas o luz solar excesiva y otros
tipos de radiación. Los ácidos nucleicos son también útiles como
agentes terapéuticos en el tratamiento de enfermedad infecciosa,
cáncer y trastornos alérgicos.
Un "sujeto que tiene una infección" es un
sujeto que se ha expuesto a un patógeno infeccioso y que tiene
niveles detectables agudos o crónicos del patógeno en el cuerpo.
Los ácidos nucleicos pueden usarse solos, o junto con otros agentes
terapéuticos tales como un antígeno o medicamento antimicrobiano,
para generar una respuesta inmunitaria que sea capaz de reducir el
nivel de o erradicar el patógeno infeccioso. El método comprende la
administración a un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar
una infección una cantidad eficaz de un ácido nucleico
inmunoestimulante de motivos combinados de la invención para tratar
la infección. El método puede usarse para tratar infecciones
víricas, bacterianas, fúngicas y parasitarias en sujetos vertebrados
humanos y no humanos.
Como se usa en la presente memoria,
"infección", y equivalentemente, "enfermedad infecciosa"
designará una enfermedad que surge por la presencia de un
microorganismo extraño en el cuerpo de un sujeto. Un microorganismo
extraño puede ser un virus, una bacteria, un hongo o un
parásito.
Los ejemplos de virus infecciosos incluyen:
Retroviridae (por ejemplo, virus de inmunodeficiencia humana
tales como VIH-1 (también designado como
HTLV-III, LAV o HTLV-III/LAV o
VIH-III); y otros aislamientos tales como
VIH-LP; Picornaviridae (por ejemplo, virus de
la polio, virus de la hepatitis A, enterovirus, virus de Coxsackie
humanos, rinovirus, ecovirus); Calciviridae (por ejemplo,
cepas que causan gastroenteritis); Togaviridae (por ejemplo,
virus de la encefalitis equina, virus de la rubéola);
Flaviridae (por ejemplo, virus del dengue, virus de la
encefalitis, virus de la fiebre amarilla); Coronaviridae (por
ejemplo, coronavirus), Rhabdoviridae (por ejemplo, virus de
la estomatitis vesicular, virus de la rabia); Filoviridae
(por ejemplo, virus del Ébola); Paramyxoviridae (por
ejemplo, virus de la paragripe, virus de las paperas, virus del
sarampión, virus respiratorio sincitial); Orthomyxoviridae
(por ejemplo, virus de la gripe); Bungaviridae (por ejemplo,
virus del Hantaan, bungavirus, flebovirus y nairovirus);
Arenaviridae (virus de fiebre hemorrágica);
Reoviridae (por ejemplo, reovirus, orbivirus y rotavirus);
Birnaviridae; Hepadnaviridae (virus de la hepatitis B);
Parvoviridae (parvovirus); Papoviridae (papilomavirus,
poliomavirus); Adenoviridae (la mayoría de los adenovirus);
Herpesviridae (herpesvirus simple (HSV) 1 y 2, virus de la
varicela zóster, citomegalovirus (CMV), herpesvirus);
Poxviridae (virus de la viruela, virus variolovacunales,
poxvirus) e Iridoviridae (por ejemplo, virus de la fiebre
porcina africana); y virus no clasificados (por ejemplo, los
agentes etiológicos de encefalopatías espongiformes, el agente de la
hepatitis delta (que se cree que es un satélite defectivo del virus
de la hepatitis B), los agentes de la hepatitis no A no B (clase 1=
transmitido internamente, clase 2= transmitido parenteralmente
(concretamente, hepatitis C); virus de Norwalk y relacionados y
astrovirus).
Los ejemplos de bacterias infecciosas incluyen:
Actinomyces israelii, Bacillus anthracis, Bacteroides spp.,
Borrelia burgdorferi, Chlamydia trachomatis, Clostridium
perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae,
Corynebacterium spp., Enterobacter aerogenes, Enterococcus sp.,
Erysipelothrix rhusiopathiae, Fusobacterium nucleatum, Haemophilus
influenzae, Helicobacter pyloris, Klebsiella pneumoniae, Legionella
pneumophilia, Leptospira, Listeria monocytogenes, Mycobacteia
spp. (por ejemplo, M. tuberculosis, M. avium, M.
intracellulare, M. kansasii, M. gordonae), Neisseria
gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pasturella multocida,
Campylobacter sp. patogénica, Staphylococcus aureus,
Streptobacillus moniliformis, Streptococcus (sp.
anaeróbica), Streptococcus (grupo Viridans),
Streptococcus agalactiae (estreptococos de grupo B),
Streptococcus bovis, Streptococcus faecalis, Streptococcus
pneumoniae, Streptococcus pyogenes (estreptococos de grupo A),
Treponema pallidium y Treponema pertenue.
Los ejemplos de hongos infecciosos incluyen:
Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Histoplasma
capsulatum, Coccidioides immitis y Blastomyces
dermatitidis.
Otros organismos infecciosos (concretamente
protistas) incluyen Plasmodium spp. tales como Plasmodium
falciparumm, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium
vivax y Toxoplasma gondii. Los parásitos portados por
sangre y/o tejido incluyen Plasmodium spp., Babesia microti,
Babesia divergens, Leishmania tropica, Leishmania spp., Leishmania
braziliensis, Leishmania donovani, Trypanosoma gambiense y
Trypanosoma rhodesiense (enfermedad del sueño africana),
Trypanosoma cruzi (enfermedad de Chagas) y Toxoplasma
gondii.
Las listas anteriores de virus, bacterias,
hongos y otros microorganismos infecciosos se entiende que son
representativas y no limitantes. Se han descrito extensamente otros
microorganismos médicamente relevantes en la bibliografía, por
ejemplo, véase C.G.A. Thomas, "Medical Microbiology", Bailliere
Tendal, Reino Unido, 1983.
Aunque muchos de los agentes microbianos
descritos anteriormente se refieren a trastornos humanos, la
invención es también útil para tratar vertebrados no humanos. Los
vertebrados no humanos son también capaces de desarrollar
infecciones que pueden prevenirse o tratarse con los ácidos
nucleicos inmunoestimulantes dados a conocer en la presente
memoria. Por ejemplo, además del tratamiento de enfermedades
infecciosas humanas, los métodos de la invención son útiles para
tratar infecciones de animales.
Los virus infecciosos de vertebrados tanto
humanos como no humanos incluyen retrovirus, virus de ARN y virus
de ADN. Este grupo de retrovirus incluye tanto retrovirus sencillos
como retrovirus complejos. Los retrovirus sencillos incluyen los
subgrupos de retrovirus de tipo B, retrovirus de tipo C y retrovirus
de tipo D. Es un ejemplo de un retrovirus de tipo B el virus del
tumor mamario de ratón (MMTV). Los retrovirus de tipo C incluyen
los subgrupos grupo A de tipo C (incluyendo virus del sarcoma de
Rous (RSV), virus de la leucemia aviar (ALV) y virus de la
mieloblastosis aviar (AMV)) y grupo B de tipo C (incluyendo virus de
la leucemia felina (FeLV), virus de la leucemia de mono gibón
(GALV), virus de la necrosis de bazo (SNV), virus de la
reticuloendoteliosis (RV) y virus del sarcoma de simio (SSV)). Los
retrovirus de tipo D incluyen virus de mono de
Mason-Pfizer (MPMV) y retrovirus de simio de tipo 1
(SRV-1). Los retrovirus complejos incluyen los
subgrupos de lentivirus, virus de la leucemia de células T y virus
espumosos. Los lentivirus incluyen VIH-1, pero
incluyen también VIH-2, SIV, virus de Visna, virus
de la inmunodeficiencia felina (FIV) y virus de la anemia
infecciosa equina (EIAV). Los virus de la leucemia de células T
incluyen HTLV-1, HTLV-II, virus de
la leucemia de células T de simio (STLV) y virus de la leucemia
bovina (BLV). Los virus espumosos incluyen virus espumoso humano
(HFV), virus espumoso de simio (SFV) y virus espumoso bovino
(BFV).
Los ejemplos de otros virus de ARN que son
agentes infecciosos en animales vertebrados incluyen, pero sin
limitación, miembros de la familia Reoviridae, incluyendo el
género Orthoreovirus (serotipos múltiples de retrovirus de
mamífero y aviares), el género Orbivirus (virus de la lengua
azul, virus de Eugenangee, virus de Kemerovo, virus de la
enfermedad equina africana y virus de la fiebre por garrapatas de
Colorado), el género Rotavirus (rotavirus humano, virus de
la diarrea de terneros de Nebraska, rotavirus de simio, rotavirus
bovinos u ovinos, rotavirus aviares); la familia
Picornaviridae, incluyendo el género Enterovirus
(poliovirus, virus A y B de Coxsackie, virus entérico citopático
humano huérfano (ECHO), virus de la hepatitis A, enterovirus de
simio, virus de la encefalomielitis de múrido (ME), Poliovirus
muris, enterovirus bovinos, enterovirus porcinos, el género
Cardiovirus (virus de la encefalomiocarditis (EMC),
mengovirus), el género Rhinovirus (rinovirus humanos
incluyendo al menos 113 subtipos; otros rinovirus), el género
Apthovirus (virus de la glosopeda (FMDV); la familia
Calciviridae, incluyendo virus del exantema vesicular
porcino, virus del león marino de San Miguel, picornavirus felinos
y virus de Norwalk; la familia Togaviridae, incluyendo el
género Alphavirus (virus de la encefalitis equina oriental,
virus del bosque Semliki, virus de Sindbis, virus de la chicunguña,
virus de O'Nyong-Nyong, virus del río Ross, virus de
la encefalitis equina venezolana, virus de la encefalitis equina
occidental), el género Flavivirus (virus de la fiebre
amarilla portado por mosquitos, virus del dengue, virus de la
encefalitis japonesa, virus de la encefalitis de St. Louis, virus
de la encefalitis del valle Murray, virus del Nilo occidental, virus
de Kunjin, virus portado por garrapatas centroeuropeas, virus
portado por garrapatas de Extremo Oriente, virus del boque Kyasanur,
virus del Louping III, virus de Powassan, virus de la fiebre
hemorrágica de Omsk), el género Rubivirus (virus de la
rubéola), el género Pestivirus (virus de la enfermedad de la
mucosa, virus de la peste porcina, virus de la enfermedad de la
frontera); la familia Bunyaviridae, incluyendo el género
Bunyvirus (virus de Bunyamwera y relacionados, virus del
grupo de encefalitis de California), el género Phlebovirus
(virus siciliano de la fiebre por flebótomos, virus de la fiebre
del valle del Rift), el género Nairovirus (virus de la
fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, virus de la
enfermedad ovina de Nairobi) y el género Uukuvirus (virus de
Uukuniemi y relacionados); la familia Orthomyxoviridae,
incluyendo el género de virus Influenza (virus de la gripe
de tipo A, muchos subtipos humanos); virus de la gripe porcina y
virus de la gripe aviar y equina; gripe de tipo B (muchos subtipos
humanos) y de gripe de tipo C (posible género separado); la familia
Paramyxoviridae, incluyendo el género Paramyxovirus
(virus de la paragripe de tipo 1, virus de Sendai, virus de la
hemadsorción, virus de la paragripe de tipos 2 a 5, virus de la
enfermedad de Newcastle, virus del las paperas), el género
Morbillivirus (virus del sarampión, virus de panencefalitis
esclerosante subaguda, virus del moquillo, virus de la peste
bovina), el género Pneumovirus (virus respiratorio sincitial
(RSV), virus respiratorio sincitial bovino y virus de la neumonía);
la familia Rhabdoviridae, incluyendo el género
Vesiculovirus (VSV), virus de Chandipura, virus del parque
Flanders-Hart), el género Lyssavirus (virus
de la rabia), rabdovirus de peces y dos rabdovirus probables (virus
de Marburg y virus del Ébola); la familia Arenaviridae,
incluyendo virus de coriomeningitis linfocítica (LCM), virus del
complejo Tacaribe y virus de Lassa; la familia
Coronaviridae, incluyendo virus de la bronquitis infecciosa
(IBV), virus de la hepatitis, coronavirus entérico humano y de
peritonitis infecciosa felina (coronavirus felino).
Los virus de ADN ilustrativos que son agentes
infecciosos en animales vertebrados incluyen, pero sin limitación,
la familia Poxviridae, incluyendo el género
Orthopoxvirus (viruela mayor, viruela menor, Vaccinia de
viruela de los simios, viruela vacuna, viruela de búfalos, viruela
de conejos, ectromelia), el género Leporipoxvirus (mioxoma,
fibroma), el género Avipoxvirus (viruela aviar, otros virus
de viruela aviar), el género Capripoxvirus (viruela ovina,
viruela caprina), el género Suipoxvirus (viruela porcina), el
género Parapoxvirus (virus de la dermatitis pustular
contagiosa, pseudoviruela vacuna, virus de la estomatitis papular
bovina); la familia Iridoviridae (virus de la fiebre porcina
africana, virus de rana 2 y 3, virus linfoquístico de peces); la
familia Herpesviridae, incluyendo los herpesvirus alfa
(herpes simple de tipos 1 y 2, de varicela zóster, virus del aborto
equino, herpesvirus equino 2 y 3, virus de la pseudorrabia, virus de
la queratoconjuntivitis bovina infecciosa, virus de la
rinotraqueitis bovina infecciosa, virus de la rinotraqueitis
felina, virus de la laringotraqueitis infecciosa), los herpesvirus
beta (citomegalovirus humanos y citomegalovirus de cerdos y monos);
los herpesvirus gamma (virus de Epstein-Barr (EBV),
virus de la enfermedad de Marek, herpes de Saimiri,
herpesvirus de Ateles, herpesvirus de Sylvilagus,
herpesvirus de conejillo de indias, virus del tumor de Lucke); la
familia Adenoviridae, incluyendo el género
Mastadenovirus (subgrupos humanos A, B, C, D, E y no
agrupados; adenovirus de simio (al menos 23 serotipos), hepatitis
canina infecciosa y adenovirus de ganado bovino, cerdos, ovejas,
ranas y muchas otras especies, el género Aviadenovirus
(adenovirus aviares); y adenovirus no cultivables; la familia
Papoviridae, incluyendo el género Papillomavirus
(papilomavirus humanos, papilomavirus bovinos, papilomavirus de
conejo Shope y diversos papilomavirus patogénicos de otras
especies), el género Polyomavirus (poliomavirus, agente
vaculoante de simio (SV-40), agente vacuolante de
conejo (RKV), virus K, virus BK, virus JC y otros virus de polioma
de primate tales como el papilomavirus linfotrófico); la familia
Parvoviridae, incluyendo el género de virus adenoasociados,
el género Parvovirus (virus de panleucopenia felina,
parvovirus bovino, parvovirus canino, virus de la enfermedad
aleutiana del visón, etc.), Finalmente, los virus de ADN pueden
incluir virus que no se ajustan a las familias anteriores, tales
como los virus de la enfermedad Kuru y de
Creutzfeld-Jakob y agentes neuropáticos infecciosos
crónicos (virus CHINA).
Los ácidos nucleicos pueden administrarse a un
sujeto con un agente antimicrobiano. Un agente antimicrobiano, como
se usa en la presente memoria, designa un compuesto de origen
natural, sintético o semisintético que es capaz de matar o inhibir
microorganismos infecciosos. El tipo de agente antimicrobiano útil
según la invención dependerá del tipo de microorganismos con el que
el sujeto esté infectado o en riesgo de infectarse. Los agentes
antimicrobianos incluyen, pero sin limitación, agentes
antibacterianos, agentes antivíricos, agentes antifúngicos y
agentes antiparasitarios. Las frases tales como "agente
antiinfeccioso", "agente antibacteriano", "agente
antivírico", "agente antifúngico", "agente
antiparasitario" y "parasiticida" tienen significados bien
establecidos para los expertos en la técnica y se definen en textos
médicos estándar. Brevemente, los agentes antibacterianos matan o
inhiben bacterias, e incluyen antibióticos así como otros compuestos
sintéticos o naturales que tienen funciones similares. Los
antibióticos son moléculas de bajo peso molecular que se producen
como metabolitos secundarios por células tales como
microorganismos. En general, los antibióticos interfieren con una o
más funciones o estructuras bacterianas que son específicas del
microorganismo y que no están presentes en células hospedadoras.
Los agentes antivíricos pueden aislarse a partir de fuentes
naturales o sintetizarse y son útiles para matar o inhibir virus.
Los agentes antifúngicos se usan para tratar infecciones fúngicas
superficiales así como infecciones fúngicas oportunistas y
sistémicas primarias. Los agentes antiparásitos matan o inhiben
parásitos.
Los agentes antibacterianos matan o inhiben el
crecimiento o funcionamiento de bacterias. Es una gran clase de
agentes antibacterianos los antibióticos. Los antibióticos que son
eficaces para matar o inhibir un amplio intervalo de bacterias se
designan como antibióticos de amplio espectro. Otros tipos de
antibióticos son predominantemente eficaces contra las bacterias de
las clases grampositiva o gramnegativa. Estos tipos de antibióticos
se designan como antibióticos de espectro estrecho. Otros
antibióticos que son eficaces contra un solo organismo o enfermedad
y no contra otros tipos de bacterias se designan como antibióticos
de espectro limitado. Los agentes antibacterianos se clasifican a
veces basándose en su modo de acción primario. En general, los
agentes antibacterianos son inhibidores de la síntesis de la pared
celular, inhibidores de membrana celular, inhibidores de la síntesis
de proteína, inhibidores de la síntesis de ácido nucleico o
inhibidores funcionales e inhibidores competitivos.
Los agentes antivíricos son compuestos que
previenen la infección de células por virus o la replicación del
virus en la célula. Hay muchos menos fármacos antivíricos que
fármacos antibacterianos porque el proceso de replicación vírica
está tan estrechamente relacionado con la replicación de ADN en la
célula hospedadora que los agentes antivíricos no específicos
serían a menudo tóxicos para el hospedador. Hay varias etapas dentro
del proceso de replicación vírica que pueden bloquearse o inhibirse
mediante agentes antivíricos. Estas etapas incluyen la unión del
virus a la célula hospedadora (inmunoglobulina o péptidos de unión),
la descapsidación del virus (por ejemplo, amantadina), la síntesis
o traducción de ARNm vírico (por ejemplo, interferón), la
replicación de ARN o ADN vírico (por ejemplo, análogos
nucleosídicos), la maduración de nuevas proteínas víricas (por
ejemplo, inhibidores de proteasa) y el brote y liberación de los
virus.
Los análogos nucleotídicos son compuestos
sintéticos que son similares a los nucleótidos, pero que tienen un
grupo desoxirribosa o ribosa incompleto o anormal. Una vez los
análogos nucleotídicos están en la célula, se fosforilan,
produciendo el trifosfato formado que compite con los nucleótidos
normales por la incorporación al ADN o ARN vírico. Una vez se
incorpora la forma trifosfato del análogo nucleotídico a la cadena
de ácido nucleico en crecimiento, causa una asociación irreversible
con la polimerasa vírica, y por tanto la terminación de cadena. Los
análogos nucleotídicos incluyen, pero sin limitación, aciclovir
(usado para el tratamiento de herpesvirus simple y virus de la
varicela zóster), ganciclovir (útil para el tratamiento de
citomegalovirus), idoxuridina, ribavirina (útil para el tratamiento
del virus respiratorio sincitial), didesoxiinosina, didesoxicitidina
y zidovudina (azidotimidina).
Los agentes antifúngicos son útiles para el
tratamiento y la prevención de hongos infecciosos. Los agentes
antifúngicos se clasifican a veces por su mecanismo de acción.
Algunos agentes antifúngicos funcionan como inhibidores de la pared
celular inhibiendo la glucosa sintasa. Estos incluyen, pero sin
limitación, basiunguna/ECB. Otros agentes antifúngicos funcionan
desestabilizando la integridad de la membrana. Estos incluyen, pero
sin limitación, imidazoles tales como clotrimazol, sertaconazol,
fluconazol, itraconazol, ketoconazol, miconazol y voriconazol, así
como FK 463, anfotericina B, BAY 38-9502, MK 991,
pradimicina, UK 292, butenafina y terbinafina. Otros agentes
antifúngicos funcionan degradando la quitina (por ejemplo,
quitinasa) o por inmunosupresión (501 Cream).
Los ácidos nucleicos inmunoestimulantes pueden
usarse, solos o en combinación con una terapia anticancerosa, para
el tratamiento del cáncer. El método comprende administrar a un
sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar cáncer una
cantidad eficaz de un ácido nucleico inmunoestimulante de motivos
combinados de la invención para tratar el cáncer.
Un "sujeto que tiene un cáncer" es un
sujeto que tiene células cancerosas detectables. El cáncer puede ser
un cáncer maligno o no maligno. Los cánceres o tumores incluyen,
pero sin limitación, cáncer del tracto biliar, cáncer de cerebro,
cáncer de mama, cáncer de cuello del útero, coriocarcinoma, cáncer
de colon, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer gástrico,
neoplasmas intraepiteliales, linfomas, cáncer de hígado, cáncer de
pulmón (por ejemplo, de células pequeñas y de células no pequeñas),
melanoma, neuroblastomas, cáncer oral, cáncer de ovario, cáncer de
páncreas, cáncer de próstata, cáncer rectal, sarcomas, cáncer de
piel, cáncer testicular, cáncer tiroideo y cáncer renal, así como
otros carcinomas y sarcomas. En una realización, el cáncer es
tricoleucemia, leucemia mielogenosa crónica, leucemia de células T
cutáneas, mieloma múltiple, linfoma folicular, melanoma maligno,
carcinoma de células escamosas, carcinoma de células renales,
carcinoma de próstata, carcinoma de células de vejiga o carcinoma
de colon.
El cáncer es una de las causas principales de
muerte en animales de compañía (concretamente, gatos y perros). Los
trastornos malignos diagnosticados comúnmente en perros y gatos
incluyen, pero sin limitación, linfosarcoma, osteosarcoma, tumor
mamario, mastocitoma, tumor cerebral, melanoma, carcinoma
adenoescamoso, tumor de pulmón carcinoide, tumor de glándula
bronquial, adenocarcinoma bronquiolar, fibroma, mixocondroma,
sarcoma pulmonar, neurosarcoma, osteoma, papiloma, retinoblastoma,
sarcoma de Ewing, tumor de Wilms, linfoma de Burkitt, microglioma,
neuroblastoma, osteoclastoma, neoplasia oral, fibrosarcoma,
osteosarcoma y rabdomiosarcoma. Otros neoplasmas en perros incluyen
carcinoma de células escamosas genitales, tumor venéreo
transmisible, tumor testicular, seminoma, tumor de células de
Sertoli, hemangiopericitoma, histiocitoma, cloroma (sarcoma
granulocítico), papiloma corneal, carcinoma de células escamosas
corneales, hemangiosarcoma, mesotelioma pleural, tumor de células
basales, timoma, tumor de estómago, carcinoma de glándula
suprarrenal, papilomatosis oral, hemangiotelioma y cistadenoma. Las
malignidades adicionales diagnosticadas en gatos incluyen linfoma
folicular, linfosarcoma intestinal, fibrosarcoma y carcinoma de
células escamosas pulmonares. El hurón, una mascota cada vez más
popular, es conocido por desarrollar insulinoma, linfoma, sarcoma,
neuroma, tumor de células del islote pancreático, linfoma gástrico
MALT y adenocarcinoma gástrico.
Los ácidos nucleicos inmunoestimulantes pueden
administrarse también junto con una terapia anticancerosa. Las
terapias anticancerosas incluyen medicamentos contra el cáncer,
radiación y procedimientos quirúrgicos. Como se usa en la presente
memoria, un "medicamento contra el cáncer" designa un agente
que se administra a un sujeto con el fin de tratar un cáncer. Se
describen en la presente memoria diversos tipos de medicamentos
para el tratamiento del cáncer. Con los fines de esta memoria
descriptiva, los medicamentos contra el cáncer se clasifican como
agentes quimioterapéuticos, agentes inmunoterapéuticos, vacunas del
cáncer, terapia hormonal y modificadores de la respuesta
biológica.
El uso de ácidos nucleicos inmunoestimulantes
junto con agentes inmunoterapéuticos tales como anticuerpos
monoclonales es capaz de aumentar la supervivencia a largo plazo
mediante una serie de mecanismos que incluyen una potenciación
significativa de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo
(ADCC), la activación de células NK y un aumento de los niveles de
IFN-\alpha. La ADCC puede realizarse usando un
ácido nucleico inmunoestimulante en combinación con un anticuerpo
específico de una diana celular, tal como una célula cancerosa.
Cuando el ácido nucleico inmunoestimulante se administra a un sujeto
junto con el anticuerpo, se induce al sistema inmunitario del
sujeto a matar la célula tumoral. Los anticuerpos útiles en el
procedimiento de ADCC incluyen anticuerpos que interaccionan con
una célula del cuerpo. Se han descrito en la técnica muchos de
dichos anticuerpos específicos de dianas celulares y muchos están
comercialmente disponibles. Los ácidos nucleicos, cuando se usan en
combinación con anticuerpos monoclonales, sirven para reducir la
dosis de anticuerpo necesaria para conseguir un resultado
biológico.
Otros tipos de agentes quimioterapéuticos que
pueden usarse según la invención incluyen aminoglutetimida,
asparaginasa, busulfano, carboplatino, clorambucilo, HCl de
citarabina, dactinomicina, HCl de daunorubicina, fosfato de
estramustina de sodio, etopósido (VP16-213),
floxuridina, fluorouracilo (5-FU), flutamida,
hidroxiurea (hidroxicarbamida), ifosfamida, interferón
alfa-2a, alfa-2b, acetato de
leuprolida (análogo de factor de liberación de LHRH), lomustina
(CCNU), HCl de mecloretamina (mostaza nitrogenada), mercaptopurina,
mesna, mitotano (op'-DDD), HCl de mitoxantrona,
octreotida, plicamicina, HCl de procarbazina, estreptozocina,
citrato de tamoxifeno, tioguanina, tiotepa, sulfato de vinblastina,
amsacrina (m-AMSA), azacitidina, eritropoyetina,
hexametilmelamina (HMM), interleucina 2, mitoguazona
(metil-GAG, metilglioxalbisguanilhidrazona, MGBG),
pentostatina (2'-desoxicoformicina), semustina
(metil-CCNU), tenipósido (VM-26) y
sulfato de vindesina.
Las vacunas del cáncer son medicamentos que se
pretende que estimulen una respuesta inmunitaria endógena contra
células cancerosas. Las vacunas producidas actualmente activan
predominantemente el sistema inmunitario humoral (concretamente, la
respuesta inmunitaria dependiente de anticuerpo). Otras vacunas
actualmente en desarrollo están enfocadas a activar el sistema
inmunitario mediado por célula, incluyendo los linfocitos T
citotóxicos que son capaces de matar células tumorales. Las vacunas
del cáncer potencian generalmente la presentación de antígenos
cancerosos tanto a células presentadoras de antígeno (por ejemplo,
macrófagos y células dendríticas) como a otras células inmunitarias
tales como células T, células B y células NK. En algunos casos, las
vacunas del cáncer pueden usarse junto con coadyuvantes tales como
aquellos descritos anteriormente.
Algunas células cancerosas son antigénicas y por
tanto pueden ser dianas del sistema inmunitario. En un aspecto, la
administración combinada de ácidos nucleicos inmunoestimulantes y
medicamentos contra el cáncer, particularmente aquellos que se
clasifican como inmunoterapias del cáncer, es útil para estimular
una respuesta inmunitaria específica contra un antígeno canceroso.
Como se usan en la presente memoria, los términos "antígeno
canceroso" y "antígeno tumoral" se usan intercambiablemente
para designar antígenos que se expresan diferencialmente por
células cancerosas y pueden explotarse por tanto para orientarse a
células cancerosas. Los antígenos cancerosos son antígenos que
pueden estimular potencialmente respuestas inmunitarias
aparentemente específicas de tumor. Algunos de estos antígenos
están codificados, aunque no necesariamente expresados, por células
normales. Estos antígenos pueden caracterizarse como aquellos que
son normalmente silenciosos (concretamente, no se expresan) en
células normales, aquellos que se expresan sólo en ciertas etapas de
diferenciación y aquellos que se expresan temporalmente tales como
antígenos embriónicos y fetales. Otros antígenos cancerosos están
codificados por genes celulares mutantes tales como oncogenes (por
ejemplo, oncogén ras activado), genes supresores (por ejemplo, p53
mutante), proteínas de fusión resultantes de delecciones internas o
translocaciones cromosómicas. Aún otros antígenos cancerosos pueden
estar codificados por genes víricos tales como aquellos portados en
virus tumorales de ARN y ADN. Los antígenos "asociados a
tumor" están presentes tanto en células tumorales como en
células normales, pero están presentes en una cantidad diferente o
en una forma diferente en células tumorales. Son ejemplos de dichos
antígenos los antígenos oncofetales (por ejemplo, antígeno
carcinoembriónico), antígenos de diferenciación (por ejemplo,
antígenos T y Tn) y productos oncogénicos (por ejemplo,
HER/neu).
Los antígenos cancerosos, tales como aquellos
presentes en vacunas del cáncer o aquellos usados para preparar
inmunoterapias del cáncer, pueden prepararse a partir de extractos
celulares cancerosos brutos, como se describe en Cohen P.A. et
al. (1994) Cancer Res. 54: 1055-1058, o
purificando parcialmente los antígenos, usando tecnología
recombinante o síntesis de novo de antígenos conocidos. Los
antígenos cancerosos pueden usarse en forma de porciones
inmunogénicas de un antígeno particular o, en algunos casos, puede
usarse como antígeno una célula entera o una masa tumoral. Dichos
antígenos pueden aislarse o prepararse recombinantemente o mediante
cualquier otro medio conocido en la técnica.
Otras vacunas toman la forma de células
dendríticas que se han expuesto a antígenos cancerosos in
vitro, han procesado los antígenos y son capaces de expresar
los antígenos cancerosos en su superficie celular en el contexto de
moléculas de MHC para una presentación de antígeno eficaz a otras
células del sistema inmunitario. Las células dendríticas forman el
nexo entre el sistema inmunitario innato y el adquirido al presentar
antígenos y mediante su expresión de receptores de reconocimiento
de patrón que detectan moléculas microbianas como LPS en su entorno
local.
Los ácidos nucleicos inmunoestimulantes de
motivos combinados son útiles para el tratamiento de la alergia,
incluyendo el asma. Los ácidos nucleicos inmunoestimulantes de
motivos combinados pueden usarse, solos o en combinación con un
medicamento para la alergia/asma, para tratar la alergia. El método
comprende administrar a un sujeto que tiene o está en riesgo de
desarrollar una afección alérgica o asmática una cantidad eficaz de
un ácido nucleico inmunoestimulante de motivos combinados de la
invención para tratar la afección alérgica o asmática.
Como se usa en la presente memoria,
"alergia" designará hipersensibilidad adquirida a una sustancia
(alergeno). Las afecciones alérgicas incluyen eccema, rinitis
alérgica o coriza, fiebre del heno, asma bronquial, urticaria
(erupción), alergias alimentarias y otras afecciones atópicas. Un
"sujeto que tiene una alergia" es un sujeto que tiene o está
en riesgo de desarrollar una reacción alérgica en respuesta a un
alergeno. Un "alergeno" designa una sustancia que puede
inducir una respuesta alérgica o asmática en un sujeto sensible. La
lista de alergenos es enorme y puede incluir pólenes, venenos de
insectos, caspa animal, polvo, esporas fúngicas y fármacos (por
ejemplo, penicilina).
Los ejemplos de alergenos naturales animales y
vegetales incluyen proteínas específicas de los siguientes géneros:
Canine (Canis familiaris), Dermatophagoides
(por ejemplo, Dermatophagoides farinae), Felis
(Felis domesticus), Ambrosia (Ambrosia
artemiisfolia), Lolium (por ejemplo, Lolium
perenne o Lolium multiflorum), Cryptomeria
(Cryptomeria japonica), Alternaria (Alternaria
alternata), Alder, Agnus (Agnus gultinosa),
Betula (Betula verrucosa), Quercus (Quercus
alba), Olea (Olea europa), Artermisia
(Artemisia vulgaris), Plantago (por ejemplo,
Plantago lanceolata), Parietaria (Parietaria
officinalis o Parietaria judaica), Blattella (por
ejemplo, Blattella germanica), Apis (por ejemplo,
Apis multiflorum), Cupressus (por ejemplo,
Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica y Cupressus
macrocarpa), Juniperus (por ejemplo, Juniperus
sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis y
Juniperus ashei), Thuya (por ejemplo, Thuya
orientalis), Chamaecyparis (por ejemplo,
Chamaecyparis obtusa), Periplaneta (por ejemplo,
Periplaneta americana), Agropyron (por ejemplo,
Agropyron repens), Secale (por ejemplo, Secale
cereale), Triticum (por ejemplo, Triticum
aestivum), Dactylis (por ejemplo, Dactylis
glomerata), Festuca (por ejemplo, Festuca
elatior), Poa (por ejemplo, Poa pratensis o Poa
compressa), Avena (por ejemplo, Avena sativa),
Holcus (por ejemplo, Holcus lanatus),
Anthoxanthum (por ejemplo, Anthoxanthum odoratum),
Arrhenatherum (por ejemplo, Arrhenatherum elatius),
Agrostis (por ejemplo, Agrostis alba), Phleum
(por ejemplo, Phleum pratense), Phalaris (por ejemplo,
Phalaris arundinacea), Paspalum (por ejemplo,
Paspalum notatum), Sorghum (por ejemplo, Sorghum
halepensis) y Bromus (por ejemplo, Bromus
inermis).
Como se usa en la presente memoria, "asma"
designa un trastorno del sistema respiratorio caracterizado por
inflamación, estrechamiento de las vías respiratorias y reactividad
aumentada de las vías respiratorias ante agentes inhalados. El asma
está frecuentemente asociado, aunque no exclusivamente, a síntomas
atópicos o alérgicos.
Un "medicamento para el asma/alergia" como
se usa en la presente memoria es una composición de material que
reduce los síntomas, inhibe la reacción asmática o alérgica o
previene el desarrollo de una reacción alérgica o asmática. Se
describen diversos tipos de medicamentos para el tratamiento de asma
y alergia en las "Guidelines for the Diagnosis and Management of
Asthma", Expert Panel Report 2, publicación NIH nº 97/4051, 19 de
julio de 1997. Se presenta a continuación el sumario de los
medicamentos como se describen en la publicación NIH.
En la mayoría de las realizaciones, el
medicamento para el asma/alergia es útil en cierto grado para tratar
tanto asma como alergia. Algunos medicamentos para el asma/alergia
se usan preferiblemente en combinación con los ácidos nucleicos
inmunoestimulantes para tratar el asma. Estos se designan como
medicamentos para el asma. Los medicamentos para el asma incluyen,
pero sin limitación, inhibidores de PDE-4,
broncodilatadores/agonistas de beta 2, abridores de canal de K+,
antagonistas de VLA-4, antagonistas de neurocina,
inhibidores de la síntesis de TXA2, xantaninas, antagonistas de
ácido araquidónico, inhibidores de 5-lipooxigenasa,
antagonistas de receptor de tromboxano A2, antagonistas de
tromboxano A2, inhibidor de proteínas de activación de
5-lipooxigenasa e inhibidores de proteasa.
Se usan preferiblemente otros medicamentos para
el asma/alergia en combinación con los ácidos nucleicos
inmunoestimulantes para tratar la alergia. Se designan estos como
medicamentos para la alergia. Los medicamentos para la alergia
incluyen, pero sin limitación, antihistamínicos, esteroides,
inmunomoduladores e inductores de prostaglandina. Los
antihistamínicos son compuestos que contrarrestan la histamina
liberada por mastocitos o basófilos. Estos compuestos son bien
conocidos en la técnica y se usan comúnmente para el tratamiento de
la alergia. Los antihistamínicos incluyen, pero sin limitación,
loratidina, cetirizina, buclizina, análogos de ceterizina,
fexofenadina, terfenadina, desloratadina, norastemizol, epinastina,
ebastina, astemizol, levocabastina, azelastina, tranilast,
terfenadina, mizolastina, betastatina, CS 560 y HSR 609. Los
inductores de prostaglandina son compuestos que inducen la
actividad de prostaglandina. Las prostaglandinas funcionan regulando
la relajación del músculo liso. Los inductores de prostaglandina
incluyen, pero sin limitación, S-5751.
Los esteroides incluyen, pero sin limitación,
beclometasona, fluticasona, tramcinolona, budesonida,
corticosteroides y budesonida. La combinación de ácidos nucleicos
inmunoestimulantes y esteroides es particularmente bien adecuada
para el tratamiento de sujetos jóvenes (por ejemplo niños). Hasta la
fecha, el uso de esteroides en niños ha estado limitado por la
observación de que algunos tratamientos con esteroides se han
asociado al parecer con retardo del crecimiento. Por tanto, según
la presente invención, los ácidos nucleicos inmunoestimulantes
pueden usarse en combinación con esteroides retardantes del
crecimiento, y pueden proporcionar por tanto un "efecto
economizador de esteroides". La combinación de los dos agentes
puede dar como resultado requerir menores dosis de esteroides.
Los inmunomoduladores incluyen, pero sin
limitación, el grupo consistente en agentes antiinflamatorios,
antagonistas de leucotrieno, muteínas de IL-4,
receptores solubles de IL-4, inmunosupresores (tales
como vacuna de péptido tolerizante), anticuerpos
anti-IL-4, antagonistas de
IL-4, anticuerpos
anti-IL-5, proteínas de fusión
receptor soluble de IL-13-Fc,
anticuerpos anti-IL-9, antagonistas
de CCR3, antagonistas de CCR5, inhibidores de VLA-4
y reguladores negativos de IgE.
Los ácidos nucleicos inmunoestimulantes de la
invención pueden usarse para inducir IFN de tipo 1, concretamente,
IFN-\alpha e IFN-\beta. El
método implica poner en contacto una célula capaz de expresar un IFN
de tipo 1 con una cantidad eficaz de un ácido nucleico
inmunoestimulante de motivos combinados de la invención para
inducir la expresión de IFN de tipo 1 por la célula. Se ha apreciado
recientemente que el tipo celular más productor de
IFN-\alpha en seres humanos es la célula
dendrítica plasmacitoide (pDC). Este tipo de célula aparece a muy
baja frecuencia (0,2-0,4%) en PBMC y se caracteriza
por un fenotipo que es de linaje negativo (concretamente, no se
tiñe por CD3, CD14, CD19 ni CD56) y negativo para CD11c, mientras
que es positivo para CD4, CD123 (IL-3R\alpha) y
complejo principal de histocompatibilidad de clase II (MHC de clase
II). Grouard G. et al. (1997) J. Exp. Med. 185:
1101-1111; Rissoan M.-C. et al. (1999)
Science 283: 1183-1186; Siegal F.P. et
al. (1999) Science 284: 1835-1837; Cella
M. et al. (1999) Nat. Med. 5: 919-923.
Los métodos para medir IFN de tipo 1 son bien conocidos por los
expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ensayo de
inmunosorción ligado a enzima (ELISA), bioensayo y clasificación de
células activada por fluorescencia (FACS). Pueden realizarse
ensayos de esta clase usando reactivos y kits fácilmente
disponibles
comercialmente.
comercialmente.
Los ácidos nucleicos inmunoestimulantes de la
invención pueden usarse para activar células NK. El método implica
poner en contacto una célula NK con una cantidad eficaz de un ácido
nucleico inmunoestimulante de motivos combinados de la invención
para activar las células NK. La activación de las células NK puede
ser activación directa o activación indirecta. La activación
indirecta designa la inducción de citocinas u otros factores que
causan la posterior activación de las células NK. La activación de
células NK puede evaluarse mediante diversos métodos, incluyendo la
medida de la actividad lítica, la medida de la inducción de
marcadores de activación tales como CD69 y la medida de la
inducción de ciertas citocinas. Además de su capacidad
característica de matar ciertas dianas tumorales espontáneamente,
las células NK participan en la ADCC y son productoras importantes
de IFN-\gamma, TNF-\alpha,
GM-CSF e IL-3.
La diana celular sensible a NK prototípica para
células NK de ratón es el cromosoma artificial de levadura
(YAC-1), un timoma derivado de cepa A de ratón
infectada con virus Moloney. Para células NK humanas, es una diana
estándar K562, una estirpe celular derivada de un linaje
eitroleucémico. Se incuba en placas de microvaloración un número
constante de dianas radiomarcadas (por ejemplo, K562 marcada con
^{51}Cr) solas (espontáneo), con detergente (máximo) o con
números variables de células efectoras (experimental). La relación
de células efectoras a diana se designa como la relación de E:T.
Las células NK enriquecidas activadas son típicamente eficaces a
relaciones de E:T de menos de 10:1, aunque las PBMC no fraccionadas
o esplenocitos requieren relaciones de E:T de 100:1 o más.
Los ácidos nucleicos inmunoestimulantes son
también útiles como coadyuvantes para inducir una respuesta
inmunitaria sistémica y/o mucosa. Los ácidos nucleicos
inmunoestimulantes de motivos combinados de la invención pueden
suministrarse a un sujeto expuesto a un antígeno para producir una
respuesta inmunitaria potenciada ante el antígeno. Por tanto, por
ejemplo, los ácidos nucleicos inmunoestimulantes de motivos
combinados son útiles como coadyuvantes de vacuna.
Los ácidos nucleicos inmunoestimulantes pueden
administrarse en combinación con coadyvuantes no ácidos nucleicos.
Un coadyuvante no ácido nucleico es cualquier molécula o compuesto,
excepto los ácidos nucleicos inmunoestimulantes descritos en la
presente memoria, que pueda estimular la respuesta inmunitaria
humoral y/o celular. Los coadyuvantes no ácido nucleico incluyen,
por ejemplo, coadyuvantes que crean un efecto de liberación lenta,
coadyuvantes inmunoestimulantes y coadyuvantes que crean un efecto
de liberación lenta y estimulan el sistema inmunitario. Un
coadyuvante mucoso no de ácido nucleico como se usa en la presente
memoria es un coadyuvante distinto de un ácido nucleico
inmunoestimulante que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria
mucosa en un sujeto cuando se administra a una superficie mucosa
junto con un antígeno.
Los ácidos nucleicos inmunoestimulantes de la
invención pueden formularse como composiciones farmacéuticas en un
portador farmacéuticamente aceptable. Los ácidos nucleicos
inmunoestimulantes pueden administrarse directamente al sujeto o
pueden administrarse junto con un complejo de suministro de ácido
nucleico. Un complejo de suministro de ácido nucleico significará
una molécula de ácido nucleico asociada a (por ejemplo, unida iónica
o covalentemente a o encapsulada en) un medio orientador (por
ejemplo, una molécula que dé como resultado una mayor afinidad de
unión por la célula diana (por ejemplo, superficies de células B)
y/o una captación celular aumentada por células diana). Los
ejemplos de complejos de suministro de ácido nucleico incluyen
ácidos nucleicos asociados a un esterol (por ejemplo, colesterol),
un lípido (por ejemplo, un lípido catiónico, virosoma o liposoma) o
un agente de unión específica a célula diana (por ejemplo, un
ligando reconocido por un receptor específico de célula diana). Los
complejos preferidos pueden ser suficientemente estables in
vivo para prevenir un desacoplamiento significativo antes de la
internalización por la célula diana. Sin embargo, el complejo puede
ser escindible en condiciones apropiadas en la célula, de modo que
el ácido nucleico se libere de forma funcional.
El ácido nucleico inmunoestimulante y/o el
antígeno y/u otros agentes terapéuticos pueden administrarse solos
(por ejemplo, en disolución salina o tampón) o usando cualquier
vehículo de suministro conocido en la técnica. Por ejemplo, se han
descrito los siguientes vehículos de suministro: cocleatos
(Gould-Fogerite et al., 1994, 1996);
emulsomas (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1997);
ISCOMas (Mowat et al., 1993, Carlsson et al., 1991,
Hu et al., 1998, Morein et al., 1999); liposomas
(Childers et al., 1999, Michalek et al., 1989, 1992,
de Haan 1995a, 1995b); microesferas (Gupta et al., 1998,
Jones et al., 1996, Maloy et al., 1994, Moore et
al., 1995, O'Hagan et al., 1994, Eldridge et al.,
1989); polímeros (por ejemplo, carboximetilcelulosa, quitosán)
(Hamajima et al., 1998, Jabbal-Gill et
al., 1998); anillos poliméricos (Wyatt et al., 1998);
proteosomas (Vancott et al., 1998, Lowell et al.,
1988, 1996, 1997); virosomas (Gluck et al., 1992, Mengiardi
et al., 1995, Cryz et al., 1998); partículas
similares a virus (Jiang et al., 1999, Leibl et al.,
1998). Son conocidos en la técnica otros vehículos de
suministro.
Las dosis en cuestión de los compuestos
descritos en la presente memoria para suministro mucoso o local se
encuentran típicamente en el intervalo de aproximadamente 0,1 \mug
a 10 mg por administración, que dependiendo de la aplicación
podrían darse diaria, semanal o mensualmente y en cualquier otro
espacio de tiempo entre ellos. Más típicamente, las dosis mucosa o
local se encuentran en el intervalo de aproximadamente 10 \mug a
5 mg por administración, y lo más típicamente de aproximadamente 100
\mug a 1 mg, estando espaciadas 2-4
administraciones por días o semanas. Más típicamente, las dosis
inmunoestimulantes se encuentran en el intervalo de 1 \mug a 10
mg por administración, y lo más típicamente de 10 \mug a 1 mg, con
administraciones diarias o semanales. Las dosis en cuestión de los
compuestos descritos en la presente memoria para suministro
parenteral con el fin de inducir una respuesta inmunitaria
específica de antígeno, en la que los compuestos se suministran con
un antígeno pero no otro agente terapéutico, son típicamente de 5 a
10.000 veces mayores que la dosis mucosa eficaz para coadyuvante de
vacuna o aplicaciones inmunoestimulantes, y más típicamente de 10 a
1.000 veces mayores, y lo más típicamente de 20 a 100 veces
mayores. Las dosis de compuestos descritos en la presente memoria
para suministro parenteral con el fin de inducir una respuesta
inmunitaria innata o para aumentar la ADCC o para inducir una
respuesta inmunitaria específica de antígeno cuando los ácidos
nucleicos inmunoestimulantes se administran en combinación con
otros agentes terapéuticos o en vehículos de suministro
especializados, se encuentran típicamente en el intervalo de
aproximadamente 0,1 \mug a 10 mg por administración, que
dependiendo de la aplicación podrían darse diaria, semanal o
mensualmente y en cualquier otro espacio de tiempo entre ellos. Más
típicamente, las dosis parenterales con estos fines se encuentran en
el intervalo de aproximadamente 10 \mug a 5 mg por
administración, y lo más típicamente de aproximadamente 100 \mug
a 1 mg, estando espaciadas 2-4 administraciones por
días o semanas. En algunas realizaciones, sin embargo, las dosis
parenterales con estos fines pueden usarse en un intervalo de 5 a
10.000 veces mayor que las dosis típicas descritas
anteriormente.
Como se usa en la presente memoria "cantidad
eficaz" designará la cantidad necesaria o suficiente para
realizar un efecto biológico deseado. Por ejemplo, es una cantidad
eficaz de un ácido nucleico inmunoestimulante para tratar una
infección aquella cantidad necesaria para tratar la infección.
Combinado con las enseñanzas proporcionadas en la presente memoria,
eligiendo entre los diversos compuestos activos y ponderando
factores tales como potencia, biodisponibilidad relativa, peso
corporal del paciente, gravedad de los efectos secundarios adversos
y modo de administración preferido, puede planearse un régimen de
tratamiento profiláctico o terapéutico que no cause una toxicidad
sustancial y que sin embargo sea enteramente eficaz para tratar el
sujeto particular. La cantidad eficaz para cualquier aplicación
dada puede variar dependiendo de factores tales como la enfermedad o
afección que se esté tratando, el ácido nucleico inmunoestimulante
particular que se esté administrando, el antígeno, el tamaño del
sujeto o la gravedad de la enfermedad o afección. Un experto en la
técnica puede determinar empíricamente la cantidad eficaz de un
ácido nucleico inmunoestimulante y/o antígeno y/u otro agente
terapéutico particular sin necesitar experimentación indebida.
Para cualquier compuesto descrito en la presente
memoria, la cantidad terapéuticamente eficaz puede determinarse
inicialmente a partir de modelos animales. Puede determinarse
también una dosis terapéuticamente eficaz a partir de datos humanos
de oligonucleótidos de CpG que se han ensayado en seres humanos (se
han iniciado ensayos clínicos humanos) y compuestos que son
conocidos por exhibir actividades farmacológicas similares, tales
como otros coadyuvantes mucosos, por ejemplo, LT y otros antígenos
con fines de vacunación, para administración mucosa o local. Son
necesarias dosis mayores para administración parenteral. La dosis
aplicada puede ajustarse basándose en la biodisponibilidad relativa
y la potencia del compuesto administrado. Ajustar la dosis para
conseguir una eficacia máxima basándose en los métodos descritos
anteriormente y otros métodos como son bien conocidos en la técnica
está bien dentro de las habilidades del experto ordinario.
Las formulaciones de la invención se administran
en disoluciones farmacéuticamente aceptables, que pueden contener
rutinariamente concentraciones farmacéuticamente aceptables de sal,
agentes de tamponación, conservantes, portadores compatibles,
coadyuvantes, y opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos.
Para uso en terapia, puede administrarse una
cantidad eficaz del ácido nucleico inmunoestimulante a un sujeto
mediante cualquier modo que suministre el ácido nucleico a la
superficie deseada, por ejemplo, mucoso o sistémico. La
administración de la composición farmacéutica de la presente
invención puede conseguirse mediante cualquier medio conocido por
el experto. Las vías de administración preferidas incluyen, pero sin
limitación, oral, parenteral, intramuscular, intranasal,
intratraqueal, por inhalación, ocular, sublingual, vaginal y
rectal.
Para administración oral, los compuestos
(concretamente, ácidos nucleicos inmunoestimulantes, antígenos y
otros agentes terapéuticos) pueden formularse fácilmente combinando
el(los) compuesto(s) activo(s) con portadores
farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Dichos
portadores posibilitan formular los compuestos de la invención como
comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes,
suspensiones densas, suspensiones y similares, para ingestión oral
por un sujeto a tratar. Las preparaciones farmacéuticas para uso
oral pueden obtenerse en forma de excipiente sólido, opcionalmente
moliendo la mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos,
después de añadir auxiliares adecuados, si se desea, para obtener
comprimidos o núcleo de gragea. Son excipientes adecuados, en
particular, cargas tales como azúcares, incluyendo lactosa,
sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como,
por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz,
almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa,
hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y/o
polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden añadirse agentes
disgregantes tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar o
ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato de sodio.
Opcionalmente, las formulaciones orales pueden formularse también en
disolución salina o tampones para neutralizar las condiciones
ácidas internas o pueden administrase sin portadores.
Los núcleos de grageas se proporcionan con
recubrimientos adecuados. Con este fin, pueden usarse disoluciones
concentradas de azúcar, que pueden contener opcionalmente goma
arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol,
polietilenglicol y/o dióxido de titanio, disoluciones de laca y
disolventes orgánicos o mezclas de disolventes adecuados. Pueden
añadirse tintes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de
gragea para identificación o para caracterizar diferentes
combinaciones de dosis de compuesto activo.
Las preparaciones farmacéuticas que pueden
usarse por vía oral incluyen cápsulas duras hechas de gelatina, así
como cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un plastificante
tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste suave pueden
contener los ingredientes activos mezclados con cargas tales como
lactosa, aglutinantes tales como almidones y/o lubricantes tales
como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente,
estabilizantes. En cápsulas blandas, los compuestos activos pueden
disolverse o suspenderse en líquidos adecuados tales como aceites
grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además,
pueden añadirse estabilizantes. Pueden usarse también microesferas
formuladas para administración oral. Dichas microesferas han sido
bien definidas en la técnica. Todas las formulaciones para
administración oral deberían estar en dosificaciones adecuadas para
dicha administración.
Para administración bucal, las composiciones
pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas masticables
formuladas de manera convencional.
Para administración por inhalación, los
compuestos para uso según la presente invención pueden suministrarse
convenientemente en forma de una presentación de pulverizador en
aerosol a partir de paquetes a presión o un nebulizador con el uso
de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano,
triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u
otro gas adecuado. En el caso de un aerosol a presión, la unidad de
dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para
suministrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos, por
ejemplo de gelatina para uso en un inhalador o insuflador, pueden
formularse para contener una mezcla en polvo del compuesto y una
base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
Los compuestos, cuando es deseable
suministrarlos sistémicamente, pueden formularse para administración
parenteral mediante inyección, por ejemplo, mediante inyección
intravenosa rápida o infusión continua. Las formulaciones para
inyección pueden presentarse en una forma de dosificación unitaria,
por ejemplo, en ampollas o en envases multidosis, con un
conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales
como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos oleosos o
acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes
de suspensión, estabilización y/o dispersión.
Las formulaciones farmacéuticas para
administración parenteral incluyen disoluciones acuosas de los
compuestos activos en forma soluble en agua. Adicionalmente, pueden
prepararse suspensiones de los compuestos activos en forma de
suspensiones de inyección oleosas apropiadas. Los disolventes o
vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como
aceite de sésamo o ésteres de ácido graso sintéticos tales como
oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones de
inyección acuosas pueden contener sustancias que aumentan la
viscosidad de la suspensión tales como carboximetilcelulosa de
sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede
contener también estabilizantes adecuados o agentes que aumentan la
solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de
disoluciones altamente concentradas.
Como alternativa, los compuestos activos pueden
estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado,
por ejemplo, agua estéril exenta de pirógenos, antes del uso.
Los compuestos pueden formularse también en
composiciones rectales o vaginales tales como supositorios o enemas
de retención, por ejemplo, que contienen bases de supositorio
convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
Además de las formulaciones descritas
anteriormente, los compuestos pueden formularse también en forma de
una preparación de liberación lenta. Dichas formulaciones de larga
acción pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos
adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o
resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente
solubles, por ejemplo, como una sal escasamente soluble.
Las composiciones farmacéuticas pueden
comprender también portadores o excipientes en fase sólida o gel
adecuados. Los ejemplos de dichos portadores o excipientes
incluyen, pero sin limitación, carbonato de calcio, fosfato de
calcio, diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa,
gelatina y polímeros tales como polietilenglicoles.
Son formas de preparación farmacéutica líquidas
o sólidas adecuadas, por ejemplo, disoluciones acuosas o salinas
para inhalación, formas microencapsuladas, encocleadas, recubiertas
sobre partículas de oro microscópicas, contenidas en liposomas,
nebulizadas, aerosoles, aglomerados para implantación en la piel, o
se secadas sobre un objeto punzante para arañar la piel. Las
composiciones farmacéuticas incluyen también gránulos, polvos,
comprimidos, comprimidos recubiertos, (micro)cápsulas,
supositorios, jarabes, emulsiones, suspensiones, cremas, gotas o
preparaciones con liberación postergada de compuestos activos, en
cuya preparación se usan habitualmente excipientes y aditivos y/o
auxiliares tales como disgregantes, aglutinantes, agentes de
recubrimiento, agentes de hinchamiento, lubricantes, aromatizantes,
edulcorantes o solubilizantes como se describen anteriormente. Las
composiciones farmacéuticas son adecuadas para uso en una variedad
de sistemas de suministro de fármaco. Para una breve revisión de
los métodos para suministro de fármaco, véase Langer (1990)
Science 249: 1527-1533.
Los ácidos nucleicos inmunoestimulantes, y
opcionalmente otros agentes terapéuticos y/o antígenos, pueden
administrarse per se (puros) o en forma de una sal
farmacéuticamente aceptable. Cuando se usan en medicina, las sales
deben ser farmacéuticamente aceptables, pero las sales
farmacéuticamente no aceptables pueden usarse convenientemente para
preparar sales farmacéuticamente aceptables de las mismas. Dichas
sales incluyen, pero sin limitación, aquellas preparadas a partir
de los siguientes ácidos: clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico,
nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico,
p-toluenosulfónico, tartárico, cítrico,
metanosulfónico, fórmico, malónico, succínico,
naftaleno-2-sulfónico y
bencenosulfónico. También, dichas sales pueden prepararse como
sales de metales alcalinos o alcalinotérreos tales como sales de
sodio, potasio o calcio del grupo ácido carboxílico.
Los agentes de tamponamiento adecuados incluyen:
ácido acético y una sal (1-2% p/v), ácido cítrico y
una sal (1-3% p/v), ácido bórico y una sal
(0,5-2,5% p/v) y ácido fosfórico y una sal
(0,8-2% p/v). Los conservantes adecuados incluyen
cloruro de benzalconio (0,003-0,03% p/v),
clorobutanol (0,3-0,9% p/v), parabenos
(0,01-0,25% p/v) y timerosal
(0,004-0,02% p/v).
Las composiciones farmacéuticas de la invención
contienen una cantidad eficaz de un ácido nucleico inmunoestimulante
y, opcionalmente, antígenos y/u otros agentes terapéuticos
incluidos opcionalmente en un portador farmacéuticamente aceptable.
El término "portador farmacéuticamente aceptable" significa una
o más cargas sólidas o líquidas, diluyentes o sustancias
encapsulantes compatibles que son adecuados para administración a un
ser humano u otro animal vertebrado. El término "portador"
designa un ingrediente orgánico u inorgánico, natural o sintético,
con el que se combina el ingrediente activo para facilitar la
aplicación. Los componentes de las composiciones farmacéuticas
pueden mezclarse también con los compuestos de la presente
invención, y entre sí, de tal manera que no haya interacción.
Para el tratamiento de un sujeto, dependiendo de
la actividad del compuesto, el modo de administración, el fin de la
inmunización (concretamente, profiláctico o terapéutico), la
naturaleza y gravedad del trastorno, la edad y peso corporal del
paciente, pueden ser necesarias diferentes dosis. La administración
de una dosis dada puede llevarse a cabo mediante administración
única en forma de una unidad de dosificación individual o también
de varias unidades de dosis menor. La administración múltiple de
dosis a intervalos específicos de semanas o meses es habitual para
reforzar las respuestas específicas de antígeno.
Otros sistemas de suministro pueden incluir
sistemas de suministro de liberación cronometrada, liberación
retardada o liberación mantenida. Dichos sistemas pueden evitar
administraciones repetidas de los compuestos, aumentando la
conveniencia para el sujeto y el médico. Están disponibles muchos
tipos de sistemas de suministro de liberación y son conocidos por
los expertos ordinarios de la técnica. Incluyen sistemas basados en
polímero tales como poli(lactida-glicolida),
copolioxalatos, policaprolactonas, poliesteramidas, poliortoésteres,
poli(ácido hidroxibutírico) y polianhídridos. Se describen
microcápsulas de polímeros extraños que contienen fármacos, por
ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.075.109. Los sistemas de
suministro incluyen también sistemas no poliméricos que son:
lípidos incluyendo esteroles tales como colesterol, ésteres de
colesterol y ácidos grasos o grasas neutras tales como mono-, di- y
triglicéridos; sistemas de liberación de hidrogel; sistemas
silásticos; sistemas basados en péptidos; recubrimientos de cera;
comprimidos por compresión que usan aglutinantes y excipientes
convencionales; implantes parcialmente fusionados y similares. Los
ejemplos específicos incluyen, pero sin limitación: (a) sistemas
erosivos en los que un agente de la invención está contenido en una
forma en una matriz tales como los descritos en las patentes de
EE.UU. nº 4.452.775, 4.675.189 y 5.736.152, y (b) sistemas de
difusión en los que un componente activo penetra a una velocidad
controlada desde un polímero tal como se describe en las patentes
de EE.UU. nº 3.854.480, 5.133.974 y 5.407.686. Además, pueden usarse
sistemas de suministro de material basado en bombeo, algunos de los
cuales están adaptados para implantación.
La presente invención se ilustra adicionalmente
con los siguientes ejemplos, que en modo alguno deben considerarse
como limitantes adicionales. Los contenidos enteros de todas las
referencias (incluyendo referencias de la bibliografía, patentes
expedidas, solicitudes de patente publicadas y solicitudes de
patente en tramitación junto con la presente) citadas a lo largo de
esta solicitud se incorporan expresamente por la presente como
referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Se han reconocido y descrito anteriormente
oligodesoxinucleótidos (ODN) que contienen motivos neutralizantes
consistentes en repeticiones de la secuencia CG tales como CGCGCG o
en los que el CG está precedido por una C y/o seguido por una G. Se
cree que estos motivos neutralizantes reducen los efectos
estimulantes del ODN en múltiples lecturas, tales como la secreción
de IL-6, IL-12,
IFN-\gamma, TNF-\alpha y la
inducción de una respuesta inmunitaria específica de antígeno.
Krieg A.M. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
95: 12631-12636.
En muchos casos, la presencia de un motivo
neutralizante en un oligonucleótido junto con un motivo estimulante
se creía que evitaba la activación inmunitaria. Uno de dichos ODN
que contiene tanto motivos estimulantes como neutralizantes es el
ODN 2136, que tiene la secuencia TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCC (SEC ID Nº
19). El extremo 3' de este ODN contiene un motivo neutralizante
bastante típico, CGGCGCGCGCCC (SEC ID Nº 37), derivado del extremo
3' del ODN 2010 inhibidor (GCGGCGGGCGGCGCGCGCCC, SEC ID Nº 38).
Sorprendentemente, el ODN 2136 tenía una fuerte actividad inductora
de la actividad lítica de células NK (unidades líticas, U.L.). Como
se muestra en la Tabla 1, el ODN 2136 a una concentración de 3
\mug/ml era realmente más fuerte que el patrón fosforotioato
estimulante de células B y células NK ODN 2006
(TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT, SEC ID nº 39) para la inducción de U.L.
Más llamativamente, mientras que el ODN 2006 inducía sólo la
producción de 2,396 pg/ml de IFN-\alpha, el ODN
2136 inducía la producción de 14,278 pg/ml (Figura 1). Esto indicaba
que, sorprendentemente, la presencia de esta secuencia
neutralizante no había de evitarse necesariamente.
\newpage
Secuencias de ODN para la Tabla 1
\vskip1.000000\baselineskip
Sin embargo, en un esfuerzo por entender esta
observación, se creó un activador de NK e inductor de
IFN-\alpha aún más fuerte combinando el extremo
3' del ODN 2136 con el extremo 5' del ODN 2006. El ODN 2395
resultante (TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG, SEC ID Nº 1) incorporaba
fortuitamente un cambio en la última base del extremo 3' de C a G.
Este único cambio de base tiene el efecto de crear un palíndromo
perfecto de 12 bases de longitud en el extremo 3' del ODN 2395,
mientras que en el ODN 2136 el palíndromo es de sólo 10 bases de
longitud.
La Tabla 2 muestra otro ejemplo de datos en que
el ODN 2395 es notablemente potente en la inducción de las U.L. de
células NK en comparación con la mayoría de los otros ODN de cadena
principal toda fosforotioato. En este ensayo, el ODN 2395 es más
débil que el control ODN 1585 positivo, que tiene una cadena
principal fosforotioato/fosfodiéter quimérica (SOS). El ODN 1585
(ggGGTCAACGTTGAgggggG, SEC ID Nº 35) se describe en la solicitud
PCT publicada WO 01/22990. A la baja concentración de 0,6 \mug/ml
ensayada en este experimento, el ODN 2136 no inducía U.L. por
encima del fondo de 0,03 en el control sin ODN. La Figura 2 y la
Figura 3 muestran el nivel de proteína quimiotáctica de monocito
(MCP)-1 y proteína inducible de
IFN-1 (IP)-10, respectivamente, en
los sobrenadantes de cultivos de células NK de la Tabla 2. La
MCP-1 es una quimiocina que es un ligando de CCR2 y
está asociada tanto a respuestas inmunitarias de tipo Th1 como Th2.
La IP-10 es una quimiocina CXC que es un ligando de
CXCR3 y está asociada a respuestas Th1. Loetscher P. et al.
(2001) J. Biol. Chem. 276: 2986-2991. Estos
datos muestran que el ODN 2395 es un inductor relativamente fuerte
de la producción de IP-10, pero induce sólo niveles
medios
de MCP-1.
de MCP-1.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Secuencias de ODN para la Tabla 2
\vskip1.000000\baselineskip
Basándose en estos y otros datos, se concluyó
que la secuencia de ODN 2395 era un activador notablemente fuerte
de células NK y de la producción de
IFN-\alpha.
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Se diseñaron y se sintetizaron ODN
2427-2433 (SEC ID Nº 2-8)
adicionales para ensayar la posibilidad de que el palíndromo en el
extremo 3' del ODN 2395 pueda ser importante en su actividad
inmunoestimulante. La Tabla 3 compara la capacidad de estos
diferentes ODN de activar U.L. de NK. Como resulta evidente a partir
de estos datos, el ODN más fuerte a la concentración de 1 \mug/ml
es el ODN 2429 (TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG, SEC ID Nº 4) que inducía
2,85 U.L. de actividad NK. El ODN 2006 era muy débil en este
experimento y todos los demás oligos que se ensayaron, excepto el
control ODN 2118 (GGGGTCAAGCTTGAGGGGGG, SEC ID Nº 36) que no tiene
CG, eran más fuertes que 2006. El ODN 2429 es notable debido a que
es el único que mantiene un palíndromo de 12 bases, aunque es un
palíndromo diferente del que estaba presente en 2395. El ODN 2430
(TCGTCGTTTTCGGCGCGCCGCG, SEC ID Nº 5), que es el segundo ODN más
fuerte a la concentración de 1 \mug/ml, es similar, pero el
palíndromo se ha acortado ligeramente a 10 bases de longitud. El
resto de los ODN no tienen secuencias palindrómicas o son más
cortas, e inducen menos actividad NK.
\newpage
Secuencias de ODN para la Tabla 3
La Figura 4 muestra la capacidad de estos oligos
de inducir la producción de IFN-\alpha en
comparación con el control positivo SOS ODN 2216
(GGGGGACGATCGTCGGGGG, SEC ID Nº 55), 2334 (GGGGTCGACGTCGACGTC
GAGGGGGGG, SEC ID Nº 56) y 2336 (GGGGACGACGTCGTGGGGGGG, SEC ID Nº 57). Todos los ODN relacionados con 2395 inducen un mayor nivel de producción de IFN-\alpha que el ODN 2006, aunque los niveles están por debajo de los niveles inducidos por el ODN SOS quimérico. El orden de grado de inducción de la expresión de IFN-\alpha es aproximadamente similar al de U.L. de NK, observándose los efectos más fuertes en los ODN 2395 y 2429.
GAGGGGGGG, SEC ID Nº 56) y 2336 (GGGGACGACGTCGTGGGGGGG, SEC ID Nº 57). Todos los ODN relacionados con 2395 inducen un mayor nivel de producción de IFN-\alpha que el ODN 2006, aunque los niveles están por debajo de los niveles inducidos por el ODN SOS quimérico. El orden de grado de inducción de la expresión de IFN-\alpha es aproximadamente similar al de U.L. de NK, observándose los efectos más fuertes en los ODN 2395 y 2429.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la Figura 5A, el ODN 2395 y
sus próximos eran relativamente más débiles a una concentración de
0,25 \mug/ml que el ODN 2006 o su próximo 2397, en términos de su
capacidad de inducir la expresión de células B de CD86 a las 48
horas. Como se ha observado anteriormente, a concentraciones de ODN
mayores tales como 1 \mug/ml, se observó menos diferencia entre
los diversos ODN (Figura 5B). En el mismo experimento, se midió
también la activación de células B mediante un ensayo de
proliferación (incorporación de ^{3}H-timidina;
Figura 6). De nuevo, a la concentración de 0,25 \mug/ml, el ODN
2006 y el ODN 2397 (SEC ID Nº 44) eran de lejos los más fuertes
(Figura 6A). Sin embargo, a concentraciones mayores, los ODN
relacionados con 2395 eran de eficacia similar (Figura 6B).
\vskip1.000000\baselineskip
Los estudios previos han sugerido que la mayoría
de la producción de IL-10 que se induce por CpG
deriva de células B. Como se muestra en la Figura 7, la expresión
de IL-10 se correlacionaba bien con la proliferación
de células B. De nuevo, el ODN 2006 y su próximo ODN 2397 eran los
más fuertes a la concentración baja de 0,25 \mug/ml. El ODN 2395
y sus próximos inducían menos producción de IL-10 a
esta concentración.
\vskip1.000000\baselineskip
Estudios adicionales de esta clase de
oligonucleótidos y los derivados implicaron ODN de números
2427-2433 (SEC ID Nº 2-8). Los
datos para estos ODN se muestran en la Figura 8. Esta demuestra de
nuevo que el ODN 2006 era muy débil para inducir la producción de
IFN-\alpha a una concentración de 1 ó 6 \mug/ml.
Sin embargo, el ODN 2395 inducía cantidades sustanciales de
IFN-\alpha, especialmente a la menor concentración
de 1 \mug/ml. Se han observado ocasionalmente ODN en los que la
actividad estimulante se reducía a las concentraciones mayores,
tales como 6 \mug/ml, en comparación con los efectos observados a
las concentraciones menores tales como 1 \mug/ml. En los
experimentos mostrados en la Figura 8, el ODN 2395 era más potente a
la concentración menor que a la concentración mayor, pero el ODN
2429 era más potente a la concentración mayor. En contraposición
con la curva de dosis-respuesta invertida común de
ODN de fosforotioato, los ODN quiméricos tales como ODN 2336 en
este experimento mostraron típicamente efectos inmunoestimulantes
aumentados a concentraciones mayores. El efecto estimulante del ODN
2432 en este experimento mostrado en la Figura 8 era interesante,
considerando que este ODN no tiene un buen palíndromo. Este sistema
con actividad estimulante de células B relativamente débil se
muestra en la Figura 5 y la Figura 6.
La Figura 9 muestra otro experimento en el que
el ODN 2395 a una baja concentración de 0,4 \mug/ml era
significativamente más débil que el ODN 2006 para inducir la
expresión de células B de CD86. Los otros próximos de 2395 muestran
una pérdida menos marcada de estimulación de células B. De forma
interesante, existe la sugerencia del mismo orden de grado de
pérdida de estimulación de células B que se había observado
anteriormente para la ganancia de estimulación de NK: el ODN 2429,
seguido del ODN 2430, son los estimulantes de células B más débiles
entre los próximos a 2395. Esto plantea la posibilidad de que la
pérdida de estimulación de células B por los ODN similares a 2395
esté estrechamente relacionada con la ganancia de estimulación de NK
y secreción de IFN-\alpha. La Figura 10 y la
Figura 11 muestran que se observa inducción de
IFN-\alpha con ODN 2395 y ODN 2429, seguido de
ODN 2430. La Tabla 4 y la Figura 12, de un experimento separado,
muestran también la fuerte capacidad de los ODN 2395 y ODN 2429 de
inducir la secreción de IFN-\alpha en dos donantes
humanos diferentes (D141 y D142).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencias de ODN para la Tabla 4
Sorprendentemente, ninguno de los ODN
5293-5297 demostró respuestas inmunoestimulantes
fuertes. El ODN 5293 contiene un palíndromo de 10 bases, pero el
palíndromo difiere del de 2395 en que el CG central está invertido
a un GC. Sin embargo, se cree que este cambio no puede explicar por
sí mismo la pérdida de actividad, puesto que el ODN 2429 tiene
también dicha inversión. En lugar de ello, pueden aparecer mayores
niveles de actividad con un palíndromo de 12 bases a menos que haya
un CG central en el palíndromo. Sin embargo, el ODN 2430 tiene
también sólo un palíndromo de 10 bases con un dinucleótido GC
central. La actividad inmunoestimulante del ODN 2430 puede
potenciarse por el hecho de que contiene cinco dinucleótidos CpG en
el extremo 3', mientras que el ODN 5293 contiene sólo tres.
El ODN 5294 contiene sólo un palíndromo de 6
bases, lo que podría estar relacionado posiblemente con su baja
actividad. El ODN 5295 igualmente no tiene un buen palíndromo. La
baja actividad del ODN 5296 sugiere que simples repeticiones de CCG
no son suficientes para conferir los efectos inmunoestimulantes del
ODN 2395. El ODN 2397 tiene un palíndromo de 12 bases perfecto en
el extremo 3', pero no tiene motivos CpG en el extremo 5'. Puesto
que el palíndromo de 12 bases en el ODN 5297 es el mismo que en el
ODN 2429, puede concluirse que el motivo 5' TCGTCG del ODN 2429 es
importante para su actividad inmunoestimulante. Es decir, se cree
que la presencia del palíndromo neutralizante de ODN 2429 en un
extremo de un oligonucleótido será insuficiente para proporcionar
actividad inmunoestimulante en ausencia de al menos un motivo
estimulante en el otro extremo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se han realizado varios tipos de ensayos
adicionales para entender mejor el intervalo de efectos
inmunoestimulantes de esta nueva clase de ácidos nucleicos
inmunoestimulantes. La Figura 13 muestra algunos de los efectos de
estos ODN sobre la producción de IFN-\gamma a
partir de los sobrenadantes de PBMC humanos. Estas células eran las
mismas que las usadas en los experimentos mostrados en la Tabla 3,
pero se ensayaron los niveles de IFN-\gamma en
los sobrenadantes de los cultivos. El panel C de la Figura 3 muestra
que los ODN de CpG SOS tales como el ODN 1585 inducen cierta
producción de IFN-\gamma, mientras que los ODN sin
el motivo CpG (por ejemplo, ODN 2118 control) no lo hacen. Los
paneles A y B de la Figura 13 muestran que el ODN 2006 es
relativamente débil para inducir la producción de
IFN-\gamma, mientras que el ODN 2395 y sus
próximos son algo más fuertes.
Se realizó otro conjunto de estudios para
examinar los efectos de estos ODN diferentes sobre células
dendríticas. Las DC plasmacitoides (pDC) son la fuente del
IFN-\alpha que se produce en respuesta al ODN 2395
y sus próximos. Los efectos de los diversos ODN sobre las DC
mieloides (mDC) son relativamente similares en que todos los ODN
inducen a mDC parcialmente purificadas a activar células T CD4+,
produciendo IFN-\gamma (Figura 14 y Figura 15).
Se aislaron DC mieloides de una capa leucocítica y se incubaron con
GM-CSF (4,4 ng/ml) y diversos ODN durante 2 días.
Se aislaron entonces células T no expuestas a CD4+ de un donante
diferente, se mezclaron con las DC a relaciones de efector a diana
(E:T) seleccionadas y se incubaron durante 6 días más. Se tiñeron
entonces las células y se analizaron mediante clasificación celular
activada por fluorescencia (FACS). Se midieron los resultados en
términos del porcentaje de células CD3+ que se teñían por
IFN-\gamma. La Figura 14 muestra el porcentaje de
células T que se teñían positivamente por
IFN-\gamma y la Figura 15 muestra la intensidad
media de fluorescencia (MFI) de tinción por
IFN-\gamma en estas células.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizaron varios ODN adicionales para
entender mejor los requisitos estructurales de esta nueva clase de
ODN. Puesto que se había observado que los ODN inmunoestimulantes
potentes contenían palíndromos ricos en GC, se sintetizaron los ODN
2449 (TCGTCGTTTTCGGGGGGCCCCC, SEC ID Nº 9) y 2450
(TCGTCGTTTTCCCCC
CGGGGGG, SEC ID Nº 10) que tenían palíndromos ricos en GC que eran simplemente sólo G seguidas de sólo C o sólo C seguidas de sólo G. Como se muestra en la Figura 16, ninguno de estos ODN inducía la producción de
IFN-\alpha.
CGGGGGG, SEC ID Nº 10) que tenían palíndromos ricos en GC que eran simplemente sólo G seguidas de sólo C o sólo C seguidas de sólo G. Como se muestra en la Figura 16, ninguno de estos ODN inducía la producción de
IFN-\alpha.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizó el ODN 2451
(TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT, SEC ID Nº 11) para ensayar la posibilidad
de que la orientación 5' y 3' del motivo TCGTCG "estimulante"
y el palíndromo CGGCGCGCGCCG "neutralizante" (SEC ID Nº 23)
pudieran invertirse sin perder actividad inmunoestimulante. Es más,
el ODN 2451 era altamente estimulante (Figura 16). Se sintetizó el
ODN 2452 (TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGTTTTT, SEC ID Nº 12) para determinar
si podrían añadirse secuencias adicionales al extremo 3' del
palíndromo CGGCGCGCGCCG (SEC ID Nº 23) sin reducir la actividad
inmunoestimulante a condición de que el motivo estimulante TCGTCG
estuviera en el extremo 5'. Es más, este ODN era también altamente
inmunoestimulante (Figura 16).
\vskip1.000000\baselineskip
Para estudiar con más detalle los requisitos
estructurales de esta nueva clase de ODN para inducir la secreción
de IFN-\alpha, se sintetizaron variantes de ODN
2395 y se ensayó su actividad inmunoestimulante. La Tabla 5 resume
los datos referentes a la inducción de
IFN-\alpha.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir del primer conjunto de experimentos que
usa los ODN de fosforotioato 2395 y 2427-2433,
resultó evidente que la secuencia palindrómica en el extremo 3' del
ODN tiene un papel importante para la inducción de la secreción de
IFN-\alpha por células dendríticas que son las
principales productoras de IFN-\alpha (véanse 2395
y 2429), aunque algunos ODN sin dicho palíndromo en el extremo 3'
(por ejemplo, ODN 2430 y ODN 2432) inducían también
IFN-\alpha en cantidades algo menores (ejemplo de
la Figura 17A). Los ODN 2395 y ODN 2429 inducían las mayores
cantidades de IFN-\alpha, mientras que el 2006
(ODN de clase B) inducía de nada a cantidades mínimas, y el ODN
2336 (ODN de clase A) inducía grandes cantidades de esta citocina.
La mayoría de experimentos demostraron que el ODN 2429 inducía
cantidades aún mayores de esta citocina (Figura 17B). La
introducción de un motivo TCG adicional (por ejemplo, ODN 2427 y
ODN 2428) parecía tener efectos negativos sobre la secreción de
IFN-\alpha. Basándose en los datos de estos y
otros estudios de ODN 2186, el gcc en el extremo 3' parecía
desempeñar un posible papel en los efectos observados.
Por lo tanto, se ensayó otro conjunto de ODN que
tenían todos secuencias GCC en el extremo 3'. No se observó que
ninguno de estos ODN indujera IFN-\alpha. Por lo
tanto, sólo el GCC mismo en un palíndromo no parece ser suficiente
para los efectos observados.
Además, el ODN 5297 con un TGC en el extremo 5'
no inducía nada de IFN-\alpha a pesar de portar la
secuencia 3' palindrómica. Esto condujo a la conclusión de que no
sólo la secuencia 3' palindrómica, sino también el motivo 5' TCG es
importante para la actividad de estos ODN.
Esto se confirmó usando el ODN 5328 (2395 con
motivo 5' TGC). En contraposición con la metilación de los ODN de
clase A, la metilación de al menos el motivo 5' reducía, pero no
anulaba, la secreción de IFN-\alpha. Este
descubrimiento está de acuerdo con los resultados obtenidos con ODN
de clase B. No obstante, un ODN con parte del palíndromo 3' pero
una secuencia diferente en el extremo 5' con sólo un dinucleótido
CpG (ODN 2136) inducía también IFN-\alpha. En
resultados preliminares que usan este ODN y un ODN con el palíndromo
3' completo (ODN 5315), el ODN 5315 era mejor que el ODN 2136, pero
no tan bueno como el ODN 2395.
El hecho de que el ODN 5329 no parece inducir
IFN-\alpha o sólo cantidades muy bajas, aunque
tenga un palíndromo CG completo en el extremo 3', indica que se
prefieren secuencias palindrómicas específicas para la actividad de
IFN-\alpha.
Se realizó un experimento de activación de
células B adicional con un panel de algunos de los ODN del ejemplo
11 (Figura 18). Los resultados indicaron que cuanto mejor es un ODN
para la inducción de IFN-\alpha, menos activo es
en células B (comparar especialmente los ODN 2006, 2336, 2395 y
2429). No obstante, se demostró también que todos estos ODN eran
superiores al 2336 (ODN de clase A) en la estimulación de células
B.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó también la secreción de
IFN-\gamma tras incubación de PBMC con diferentes
concentraciones de ODN en diferentes puntos temporales (Figura
19A-C). Los ODN ensayados inducían una secreción de
IFN-\gamma con el orden de grado 2336 > 2395,
2429 > 2006. No obstante, la diferencia entre los ODN no era tan
clara como usando IFN-\alpha como lectura.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó también el efecto de estos ODN
sobre la inducción de IFN-\gamma en una reacción
linfocitaria mixta (MLR). En estas condiciones, los linfocitos de
un donante responden a antígenos expresados en células de otro
donante. Los resultados demostraron que los ODN 2006, 2336, así como
2395, eran capaces de potenciar la secreción de
IFN-\gamma durante dicha respuesta específica de
antígeno (Figura 20). Esto indicaba que todos estos ODN eran
capaces de potenciar la reactividad ante antígeno(s)
específico(s).
\vskip1.000000\baselineskip
Un conjunto adicional de experimentos se centró
en la inducción de la citocina proinflamatoria
IL-10. De nuevo, como antes para
IFN-\gamma, se incubaron PBMC durante tiempos
diferentes y con diferentes concentraciones de ODN (Figura
21A-C). Los resultados demuestran que, como se
muestra anteriormente, el ODN 2006 induce cantidades relativamente
altas de IL-10 en contraposición con el ODN 2336,
que induce sólo cantidades de mínimas a bajas. En contraposición,
el ODN 2395, así como el ODN 2429, inducen más IL-10
que el ODN 2336, pero menos que el ODN 2006. Esto confirma de nuevo
que el ODN de esta nueva clase de ODN inmunoestimulantes tiene
actividades estimulantes que se encuentran entre las descritas para
ODN de clase A y de clase B.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron PBMC humanos durante 6 horas con
1,6 \mug/ml de ODN 2006, 8954, 2395, 2429 o LPS, y se recogieron
entonces los sobrenadantes y se midió el
TNF-\alpha mediante ELISA específico. Se muestran
los resultados en la Tabla 6.
Experimentos adicionales indicaron que las
citocinas IL-5 así como IL-15 no
podían detectarse en estas condiciones experimentales tras la
incubación de PBMC con estos ODN.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron PBMC humanos solos, en presencia
de IL-2, en presencia de ODN control 1585 u ODN
control 2118 a 10 \mug/ml, o en presencia de diversos ODN a 0,6 ó
3,0 \mug/ml. Se recogieron los sobrenadantes después de 24 horas
y se midió la IP-10 mediante ensayo de inmunosorción
ligado a enzima (ELISA) específico. Se muestran los resultados en
la Figura 22. Los ODN 2395, 2429, 2430, 2432 y 2451 a 3,0 \mug/ml
y el ODN 2452 a 0,6 \mug/ml inducían todos grandes cantidades de
IP-10.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron PBMC humanos solos, en presencia
de IL-2, en presencia de ODN control 1585 u ODN
control 2118 a 10 \mug/ml, o en presencia de diversos ODN a 0,6 ó
3,0 \mug/ml. Se recogieron los sobrenadantes después de 24 horas
y se midió el IFN-\alpha mediante ELISA
específico. Se muestran los resultados en la Figura 23A (ODN a 0,6
\mug/ml) y la Figura 23B (ODN a 3,0 \mug/ml). Los ODN 2395,
2427, 2429, 2430, 2431, 2432 y 2451 a 3,0 \mug/ml y el ODN 2452 a
0,6 \mug/ml inducían todos grandes cantidades de
IFN-\alpha.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron PBMC humanos solos, en presencia
de IL-2, en presencia de ODN control 1585 u ODN
control 2118 a 10 \mug/ml, o en presencia de diversos ODN a 0,6 ó
3,0 \mug/ml. Se recogieron los sobrenadantes después de 24 horas
y se midió el IFN-\gamma mediante ELISA
específico. Se muestran los resultados en la Figura 24. Los ODN
2395, 2427, 2429, 2430, 2431, 2432, 2451 y 2452 a 3,0 \mug/ml y el
ODN 2352 a 0,6 \mug/ml inducían todos grandes cantidades de
IFN-\gamma.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron PBMC humanos solos, en presencia
de IL-2, en presencia de ODN control 1585 u ODN
control 2118 a 10 \mug/ml, o en presencia de diversos ODN a 0,6 ó
3,0 \mug/ml. Se recogieron los sobrenadantes después de 24 horas
y se midió el IL-6 mediante ELISA específico. Se
muestran los resultados en la Figura 25. Los ODN 2395, 2430, 2432,
2433, 2136, 2449, 2450, 2451 y 2452 a 0,6 \mug/ml y el ODN 2449 y
el ODN 2451 a 3,0 \mug/ml inducían todos grandes cantidades de
IL-6.
Se cultivaron PBMC humanos solos o en presencia
de diversos ODN a 3,0 ó 6,0 mg/ml. Los ODN incluían 2006, 8954,
2395, 2449, 2450, 2451, 2452, 5373 (CGGCGCGCGCCG, SEC ID Nº 23),
5374 (CGGCGCGCGCCGCGGC
GCGCGCCG, SEC ID Nº 24), 5375 (CGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT, SEC ID Nº 25), 5376 (TCGGCGCGCGC
CGTGCTGCTTT, SEC ID Nº 26) y 5377 (CCGCCGTTTTCGGCGCGCGCCG, SEC ID Nº 27). Se recogieron los sobrenadantes después de 24 horas y se midió el IFN-\alpha mediante ELISA específico. Se muestran los resultados en la Figura 26. Los ODN 2395, 2451, 2452 y 5376 inducían todos IFN-\alpha.
GCGCGCCG, SEC ID Nº 24), 5375 (CGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT, SEC ID Nº 25), 5376 (TCGGCGCGCGC
CGTGCTGCTTT, SEC ID Nº 26) y 5377 (CCGCCGTTTTCGGCGCGCGCCG, SEC ID Nº 27). Se recogieron los sobrenadantes después de 24 horas y se midió el IFN-\alpha mediante ELISA específico. Se muestran los resultados en la Figura 26. Los ODN 2395, 2451, 2452 y 5376 inducían todos IFN-\alpha.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron PBMC humanos obtenidos de dos
donantes (D346 y D240) solos o en presencia de ODN 2006, ODN 5515 u
ODN 5516 a 0,8, 2,4 ó 6,0 \mug/ml. Se recogieron los sobrenadantes
después de 24 horas y se midió el IFN-\alpha
mediante ELISA específico. Se muestran los resultados en la Tabla 7.
Los ODN 5515 y ODN 5516 inducían IFN-\alpha más
eficazmente que el ODN 2006, particularmente a concentraciones de
ODN de 2,4 y 6,0 \mug/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron PBMC obtenidos de tres donantes
(D445, D446 y D448) solos o en presencia de ODN 2006, ODN 20184,
ODN 20185 u ODN 20186 a 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 ó 1,0 \mug/ml. Se
recogieron los sobrenadantes después de 24 horas y se midió el
IFN-\alpha mediante ELISA específico. Se muestran
los resultados en la Tabla 8. Los ODN 20184, ODN 20185 y ODN 20186
inducían IFN-\alpha más eficazmente que el ODN
2006, particularmente a 0,2-0,5 \mug/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron PBMC humanos obtenidos de tres
donantes (D521, D525 y D526) solos o en presencia de ODN 2006 (SEC
ID Nº 39), ODN 8954, ODN 5569 (TIGTIGTTTTCGGCGGCCGCCG, SEC ID Nº 63)
u ODN 5570 (TCIT
CITTTTCGGCGGCCGCCG, SEC ID Nº 70) a 0,03, 0,06, 0,125, 0,25 ó 1,0 \mug/ml. Se recogieron los sobrenadantes después de 24 horas y se midieron IFN-\alpha e IL-10 mediante ELISA específico. Se muestran los resultados en las Tablas 9 y 10.
CITTTTCGGCGGCCGCCG, SEC ID Nº 70) a 0,03, 0,06, 0,125, 0,25 ó 1,0 \mug/ml. Se recogieron los sobrenadantes después de 24 horas y se midieron IFN-\alpha e IL-10 mediante ELISA específico. Se muestran los resultados en las Tablas 9 y 10.
\vskip1.000000\baselineskip
La memoria descriptiva escrita anterior se
considera suficiente para posibilitar a un experto en la técnica
practicar la invención. La presente invención no ha de limitarse en
alcance por los ejemplos proporcionados, puesto que los ejemplos se
pretenden sólo como una simple ilustración de un aspecto de la
invención, y otras realizaciones funcionalmente equivalentes están
dentro del alcance de la invención. Resultarán evidentes para los
expertos en la técnica diversas modificaciones de la invención,
además de las mostradas y descritas en la presente memoria, a
partir de la descripción anterior y entra dentro del alcance de las
reivindicaciones adjuntas. Las ventajas y objetos de la invención
no están necesariamente comprendidos por cada realización de la
invención.
<110> Coley Pharmaceutical Group Inc.
\hskip1cmColey Pharmaceutical GmbH
\hskip1cmUniversity of Iowa Research Foundation
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Oligonucleótidos inmunoestimulantes
de motivos combinados con actividad mejorada
\vskip0.400000\baselineskip
<130> TSJ/45454EP1
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 02768621.1
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
19-08-2002
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/313.273
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
17-08-2001
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/393.952
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
03-07-2002
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\hskip1cm
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<210> 3
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido sintético
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<400> 3
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\hskip1cm
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<210> 4
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido sintético
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido sintético
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<400> 5
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\hskip1cm
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<210> 6
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido sintético
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<400> 6
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\hskip1cm
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido sintético
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\hskip1cm
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<400> 9
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (28)
1. Un ácido nucleico inmunoestimulante de
14-100 nucleótidos de longitud que tiene una
secuencia de bases que comprende la fórmula:
5'
PX_{1}DCGHX_{2} 3' o 5' X_{1}DCGHX_{2}P
3'
en la que X_{1} y X_{2} son
independientemente cualquier secuencia de 0 a 10 bases de longitud,
D es una base distinta de C, C es citosina, G es guanina, H es una
base distinta de G y P es una secuencia que contiene palíndromo
rica en CG de al menos 10 bases de longitud, en la
que
- a)
- H es timina (T) y X_{2} es CGTTT o CGTTTT,
- b)
- P es completamente palindrómico, H es T y X_{2} se selecciona del grupo consistente en CG, CGT, CGTT, CGTTT y CGTTTT y/o
- c)
- P incluye al menos una hipoxantina (I).
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un ácido nucleico inmunoestimulante según la
reivindicación 1, en el que las secuencias de bases comprenden:
- a)
- 5' X_{1}DCGHX_{2}PX_{3} 3', en la que X_{3} es cualquier secuencia de 0 a 10 bases de longitud,
- b)
- 5' X_{1}DCGHPX_{3} 3', en la que X_{3} es cualquier secuencia de 0 a 10 bases de longitud,
- c)
- 5' DCGHX_{2}PX_{3} 3', en la que X_{3} es cualquier secuencia de 0 a 10 bases de longitud,
- d)
- 5' TCGHX_{2}PX_{3} 3', en la que X_{3} es cualquier secuencia de 0 a 10 bases de longitud,
- e)
- 5' DCGHPX_{3} 3', en la que X_{3} es cualquier secuencia de 0 a 10 bases de longitud, y/o
- f)
- 5' DCGHP 3'.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un ácido nucleico inmunoestimulante de
14-100 nucleótidos de longitud que tiene una
secuencia de bases que comprende la fórmula
5'
NX_{1}DCGHX_{2} 3' o 5' X_{1}DCGHX_{2}N
3'
en la que X_{1} y X_{2} son
independientemente cualquier secuencia de 0 a 10 bases de longitud.
D es una base distinta de C, C es citosina, G es guanina, H es una
base distinta de G y N es una secuencia neutralizante de células B
que empieza por CGG y es de al menos 10 bases de longitud, en el
que:
- 1)
- para 5' NX_{1}DCGHX_{2} 3':
- a)
- H es timina (T) y/o
- b)
- H es T y X_{2} se selecciona del grupo consistente en CG, CGT, CGTT, CGTTT y CGTTTT, y
- 2)
- para 5' X_{1}DCGHX_{2}N 3':
- a)
- H es T y X_{2} es CGTTTT.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Un ácido nucleico inmunoestimulante según la
reivindicación 1, en el que en las fórmulas 5' PX_{1}DCGHX_{2}
3' y 5' X_{1}DCGHX_{2}P 3', la C está no metilada.
5. Un ácido nucleico inmunoestimulante según la
reivindicación 3, en el que en las fórmulas 5' NX_{1}DCGHX_{2}
3' y 5' X_{1}DCGHX_{2}N 3', la C está no metilada.
6. Un ácido nucleico inmunoestimulante según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el ácido
nucleico inmunoestimulante
- a)
- tiene una cadena principal resistente a nucleasa,
- b)
- tiene una cadena principal fosforotioato,
- c)
- tiene una cadena principal quimérica,
- d)
- es de 14-40 nucleótidos de longitud y/o
- e)
- es de 14-30 nucleótidos de longitud.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Un ácido nucleico inmunoestimulante según una
cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la
secuencia de bases comprende adicionalmente una secuencia de
poli-T en el extremo 5' y/o 3'.
8. Un ácido nucleico inmunoestimulante de
13-100 nucleótidos de longitud que tiene una
secuencia de bases que comprende la fórmula:
5'
N_{1}PyGN_{2}P
3'
en la que N_{1} es cualquier
secuencia de 1 a 6 bases de longitud, Py es una pirimidina, G es
guanina, N_{2} es cualquier secuencia de 0 a 30 bases de longitud
y P es una secuencia que contiene un palíndromo rico en GC de al
menos 10 bases de longitud, en la que
N_{1}:
- a)
- incluye al menos un motivo citosina-hipoxantina (CI),
- b)
- incluye al menos un motivo TCI,
- c)
- incluye al menos un motivo IG,
- d)
- incluye al menos un motivo TIG, y/o
- e)
- es TCGG.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Un ácido nucleico inmunoestimulante según la
reivindicación 8, en el que
- a)
- Py es C no metilada,
- b)
- N_{2} es al menos un 50% de pirimidinas,
- c)
- N_{2} es al menos un 50% de T,
- d)
- N_{2} no incluye ningún motivo poli-G ni poli-A, y/o
- e)
- N_{1}PyGN_{2} es una secuencia seleccionada del grupo consistente en TTTCG, TTTTCG, TTTTTCG, TTCGT y TTTCGT.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Un ácido nucleico inmunoestimulante según la
reivindicación 8, en el que el ácido nucleico inmunoestimulante
tiene:
- a)
- una cadena principal completamente resistente a nucleasa, opcionalmente en el que la cadena principal está compuesta por enlaces fosforotioato,
- b)
- una cadena principal completamente fosfodiéster y/o
- c)
- una cadena principal quimérica, preferiblemente en la que el ácido nucleico inmunoestimulante tiene al menos un enlace fosfodiéster entre un motivo CG, CI o IG.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Un ácido nucleico inmunoestimulante según la
reivindicación 8, en el que P:
- a)
- es completamente palindrómico,
- b)
- es una secuencia palindrómica que tiene entre 1 y 3 bases intercaladas consecutivas, preferiblemente en el que las bases intercaladas son TG,
- c)
- incluye al menos 3 bases C y al menos 3 G,
\newpage
- d)
- incluye al menos 4 bases C y al menos 4 G,
- e)
- incluye al menos 5 bases C y al menos 5 G, y/o
- f)
- incluye al menos una hipoxantina.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Un ácido nucleico inmunoestimulante según la
reivindicación 8, en el que el ácido inmunoestimulante es
- a)
- de 13-40 nucleótidos de longitud, y/o
- b)
- de 13-30 nucleótidos de longitud.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Un ácido nucleico inmunoestimulante de
13-100 nucleótidos de longitud que tiene una
secuencia de bases que comprende la fórmula:
5'
N_{1}PyG/IN_{2}P
3'
en la que N_{1} es cualquier
secuencia de 1 a 6 bases de longitud, Py es una pirimidina, G/I
designa una sola base que es una G o una I, G es guanina e I es
hipoxantina, N_{2} es cualquier secuencia de 0 a 30 bases de
longitud y P es una secuencia que contiene un palíndromo de al menos
10 bases de longitud, en el que cuando G/I es G, P es un palíndromo
rico en
IC.
14. Un ácido nucleico inmunoestimulante según la
reivindicación 13, en el que cuando G/I es I:
- a)
- N_{1}PyIN_{2} es TCITCITTTT (SEC ID Nº 47),
- b)
- P es un palíndromo rico en GC, y/o
- c)
- P es un palíndromo rico en IC.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Un ácido nucleico inmunoestimulante según la
reivindicación 13, en el que el ácido nucleico inmunoestimulante es
de 13-30 nucleótidos de longitud.
16. Una composición farmacéutica que comprende
un ácido nucleico inmunoestimulante según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-15 y un portador
farmacéuticamente aceptable.
17. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 16, que comprende adicionalmente un antígeno,
opcionalmente un antígeno tumoral.
18. Un método in vitro para inducir la
expresión de interferón (IFN) de tipo 1, que comprende poner en
contacto una célula capaz de expresar IFN de tipo 1 con un ácido
nucleico inmunoestimulante según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-15.
19. Un método in vitro para activar un
linfocito citolítico natural (NK), que comprende poner en contacto
una célula NK con un ácido nucleico inmunoestimulante según una
cualquiera de las reivindicaciones 1-15.
20. Un ácido nucleico inmunoestimulante según
una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, para
uso en un método terapéutico que comprende poner en contacto el
ácido nucleico inmunoestimulante con una célula capaz de expresar
interferón (IFN) de tipo 1 e inducir así la expresión de IFN de tipo
1.
21. Un ácido nucleico inmunoestimulante según
una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, para
uso en un método terapéutico que comprende poner en contacto el
ácido nucleico con un linfocito citolítico natural (NK) y activar
así la célula NK.
22. Un ácido nucleico inmunoestimulante según
una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, para
uso en un método terapéutico que comprende tratar o prevenir una
infección en un sujeto que tiene, o está en riesgo de desarrollar,
dicha infección.
23. Un ácido nucleico inmunoestimulante según la
reivindicación 22, en el que el sujeto tiene, o está en riesgo de
desarrollar, una infección seleccionada del grupo consistente en
infección vírica, bacteriana, fúngica y parasitaria.
24. Un ácido nucleico inmunoestimulante según
una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, para
uso en un método terapéutico que comprende tratar o prevenir una
afección alérgica en un sujeto que tiene, o está en riesgo de
desarrollar, dicha afección alérgica.
25. Un ácido nucleico inmunoestimulante según la
reivindicación 24, en el que la afección alérgica es asma
alérgica.
26. Un ácido nucleico inmunoestimulante según
una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, para
uso en un método terapéutico que comprende tratar o prevenir el
cáncer en un sujeto que tiene, o está en riesgo de desarrollar,
cáncer.
27. Un ácido nucleico inmunoestimulante según la
reivindicación 26, en el que el cáncer se selecciona del grupo
consistente en:
carcinoma de células basales, cáncer de tracto
biliar, cáncer de vejiga, cáncer óseo, cáncer de cerebro y SNC,
cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, coriocarcinoma, cáncer de
colon y recto, cáncer de tejido conectivo, cáncer del sistema
digestivo, cáncer endométrico, cáncer esofágico, cáncer de ojo,
cáncer de cabeza y cuello, cáncer gástrico, neoplasma
intraepitelial, cáncer de riñón, cáncer de laringe, leucemia, cáncer
de hígado, cáncer de pulmón, linfoma incluyendo linfoma de Hodgkin
y no de Hodgkin, melanoma, mieloma, neuroblastoma, cáncer de la
cavidad oral, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de
próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer rectal, cáncer
renal, cáncer del sistema respiratorio, sarcoma, cáncer de piel,
cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer tiroideo, cáncer
uterino, cáncer del sistema urinario y otros carcinomas y
sarcomas.
28. Un ácido nucleico inmunoestimulante que
tiene una secuencia que comprende:
TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG (SEC ID Nº 1),
TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG (SEC ID Nº 4), TCGT
CGTTTTCGGCGCGCCGCG (SEC ID Nº 5), TCGTCGTTTTCGGCGCCGGCCG (SEC ID Nº 6), TCGTCGTTTT
CGGCCCGCGCGG (SEC ID Nº 7), TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGTTTTT (SEC ID Nº 12), TCCTGACGTTC
GGCGCGCGCCG (SEC ID Nº 13), TZGTZGTTTTZGGZGZGZGZZG (SEC ID Nº 14), en la que Z es 5-metilcitosina o TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT (SEC ID Nº 11).
CGTTTTCGGCGCGCCGCG (SEC ID Nº 5), TCGTCGTTTTCGGCGCCGGCCG (SEC ID Nº 6), TCGTCGTTTT
CGGCCCGCGCGG (SEC ID Nº 7), TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGTTTTT (SEC ID Nº 12), TCCTGACGTTC
GGCGCGCGCCG (SEC ID Nº 13), TZGTZGTTTTZGGZGZGZGZZG (SEC ID Nº 14), en la que Z es 5-metilcitosina o TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT (SEC ID Nº 11).
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