ES2313445T3 - Procedimiento de la preparacion de armazones polimericos bi- y tri-dimensionales. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para la preparación de armazones poliméricos bi- y tri-dimensionales para un uso hemostático, que contienen una proteína farmacológicamente y/o biológicamente activa que interfiere con el procedimiento de coagulación, consistiendo el armazón polimérico en ácido hialurónico modificado por esterificación, desacetilación, O-sulfatación, amidación, percarboxilación en la forma de películas, esponjas, mallas, telas no tejidas y tejidas, membranas y gránulos, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas: * neutralización del armazón polimérico bi- o tri-dimensional con una sustancia básica o una solución tamponante; * secado del armazón polimérico; * impregnación del armazón polimérico con una cantidad previamente definida de dicha proteína farmacológicamente y/o biológicamente activa.

Description

Procedimiento de la preparación armazones poliméricos bi- y tri-dimensionales.

Objeto de la invención

La presente invención describe un nuevo procedimiento para la preparación de armazones poliméricos bi- o tri-dimensionales en los que son fijadas proteínas con actividad enzimática, especialmente factores de coagulación. Los armazones poliméricos pueden ser usados en situaciones que exigen una hemostasis rápida y eficaz, como durante una cirugía o en el caso de heridas profundas o trauma en los órganos internos.

Antecedentes de la invención

El corte de una hemorragia durante una cirugía o a partir de órganos dañados o heridas propensas a hemorragias se ha intentado de diversas formas durante años y se ha encontrado una solución parcial en los denominados "pegamentos de fibrina" y/o tapones hechos de diversos materiales enriquecidos con factores capaces de activar una coagulación rápida localizada en el sitio de aplicación. Los pegamentos de fibrina (como Tisseel VH®, Baxter) se preparan habitualmente de forma extemporánea mezclando cantidades adecuadas de fibrinógeno y trombina que, como es conocido, dan lugar a un coágulo de fibrina que restaña el flujo de sangre. Sin embargo, estos productos no son adecuados para detener una hemorragia considerable de un área extensiva. En estos casos es preferible usar estructuras bi- o tri-dimensionales enriquecidas mediante diversas técnicas (adsorción, impregnación, etc.) con factores que activan el procedimiento de coagulación una vez que el soporte ha sido ajustado en la herida. Los factores usados son sustancialmente fibrinógeno y trombina que, una vez aplicados, se combinan para formar fibrina o trombina solamente, que reacciona con el fibrinógeno fisiológicamente presente en la lesión. Los materiales usados para preparar el armazón polimérico se deben caracterizar por una biocompatibilidad y bio-adherencia, deben ser fáciles de tratar y manejar y se deben ajustar en la lesión en cuestión. Los polímeros naturales son particularmente adecuados para estos fines (por ejemplo glicosaminoglicanos, polisacáridos, celulosa, ácido péctico, ácido algínico, colágeno, gelatina) como lo son los polímeros semisintéticos (como derivados de celulosa, ácido algínico, ácido hialurónico, colágeno reticulado con ácidos dicarboxílicos) o los sintéticos (que incluyen poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico) y sus copolímeros, policaprolactona); dichos polímeros pueden ser también químicamente modificados. Por ejemplo, el ácido hialurónico ha sido modificado de diversas formas, como:

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Esterificación (HYAFF®) con alcoholes de las series alifática, aralifática, aromática, cíclica y heterocíclica (documento EP 216453 B1);

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Amidación (HYADD®) con aminas de las series alifática, alarifática, cicloalifática, aromática, cíclica y heterocíclica (documento EP 1095064 B1);

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Desacetilación de la fracción de N-acetil-glucosamina (documento EP 1312772 B1;

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O-sulfatación (documento EP 702699 B1);

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Percarboxilación (HYOXX®) mediante oxidación del hidroxilo primario de la fracción de N-acetil-glucosamina (solicitud de patente EP 1339753).

El ácido hialurónico usado según la presente invención puede ser obtenido a partir de cualquier fuente, por ejemplo, mediante extracción de crestas de gallo (documento EP 138572), por fermentación (documento EP 716688) o mediante una vía biotecnológica. El peso molecular puede variar en el intervalo de 400 a 3 x 10^{6} Da, particularmente de 1 x 10^{5} Da a 1 x 10^{6} Da, incluso más particularmente de 200.000 a 750.000 Da.

Los polímeros se pueden preparar en diversas formas y tamaños como se describe, por ejemplo, en el documento EP 618817 para derivados de ácido hialurónico. Ha sido atribuida una actividad hemostática de tipo física a estos polímeros, debido solamente a sus excelentes propiedades absorbentes (por ejemplo, las propiedades hemostáticas de los derivados ácido hialurónico se reivindican en el documento EP 999859) y esta actividad es altamente deseable en las situaciones contempladas por la presente invención. De hecho, ya es conocido que es posible explotar la presencia tanto de fibrinógeno como de trombina en un biomaterial constituido por un derivado de ácido hialurónico (documento US 6.503.527) para obtener un tapón con actividad hemostática. Se supondría que la actividad hemostática mencionada hasta ahora es debida a la actividad de la trombina que permanece inalterada, ya que ésta representa la enzima clave en la última fase de la cascada de coagulación. De hecho, el fibrinógeno no es indispensable, ya que está abundantemente disponible en el sitio de la lesión. La bibliografía científica informa que la trombina está en su máxima actividad a pH = 7, es decir, el pH de la sangre, y este valor debe ser mantenido tan estable y constante como sea posible cuando la trombina está asociada con un polímero, por sí misma o con fibrinógeno. Cualesquiera variaciones principales de la acidez pueden conducir a un reducción o incluso a la pérdida completa de la actividad enzimática debido a la desnaturalización la estructura proteica. Los vendajes hemostáticos que están siendo actualmente desarrollados se caracterizan todos por un armazón polimérico de una naturaleza sustancialmente ácida. Por ejemplo, el armazón polimérico descrito en el documento US 6.503.527 está constituido por el éster bencílico de ácido hialurónico (HYAFF® 11) en el que un 75% de las funciones carboxi están esterificadas, mientras que otro 25% permanecen libres y, por lo tanto, son capaces de interferir con la acción de la trombina. Además de ello, ya está disponible un producto en el mercado que está basado en trombina y fibrinógeno en un parche de colágeno compacto y bioadhesivo (TachoSil® Nycomed): en este caso, el nivel de acidez del producto es debido a los procedimientos químicos usados para transformar el polímero de partida en la estructura compacta en la que se depositan los factores de coagulación. Esto representa una limitación seria para los productos, porque la actividad de la enzima, a pesar de estar presente, es claramente inferior a la que se puede obtener en una situación en la que el pH del armazón polimérico, cuando es aplicado a las lesiones, es tan similar como sea posible al de la sangre, es decir pH = 7. La presente invención supera estas limitaciones mediante un nuevo procedimiento para la preparación de los armazones poliméricos que van a ser incluidos con trombina, de forma que pueden ejercer su efecto hemostático sobre superficies extensivas y/o lesiones profundas, lesiones de los órganos internos, o heridas quirúrgicas con pérdida de sangre desde áreas extensivas. Este procedimiento hace posible que la actividad enzimática de la trombina se mantenga completamente, manteniendo a valores neutros del pH la estructura bi- o tri- dimensional que actúa como un armazón polimérico para la enzima.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento para la neutralización de un armazón polimérico de polímero bi- o tri-dimiensional, de forma que una vez que ha sido enriquecido con una o más proteínas farmacológicas y/o biológicamente activas que interfieren con el procedimiento de coagulación, particularmente enzimas de coagulación, puede ser usado para inducir una hemostasis en casos de heridas superficiales y/o profundas, heridas quirúrgicas o lesiones en órganos internos, haciendo posible la expresión de una actividad enzimática máxima.

Los materiales que son adecuados para los fines de la presente invención pueden ser obtenidos también a partir de dichos polímeros que han sido químicamente modificados (por ejemplo, ácido hialurónico químicamente modificado por esterificación, amidación, O-sulfatación, desacetilación, percarboxilación), posiblemente asociado con otros y preparado en diversas formas y tamaños (películas, esponjas, mallas, telas no tejidas y tejidas, membranas y gránulos).

Como se dijo con anterioridad, el armazón polimérico de polímero al que se puede aplicar la presente invención se caracteriza por diversos grados de acidez, atribuibles a la naturaleza intrínseca del polímero y/o su derivado o a los procedimientos usados para tratar el polímero. La acidez tiene un efecto negativo sobre la actividad hemostática, especialmente la de la trombina, que deja de tener un efecto coagulante cuando es aplicada a la lesión. La acidez neutralizante es una forma de resolver el problema y superar las limitaciones de los procedimientos conocidos hasta la fecha, incluso cuando los armazones poliméricos descritos en la presente memoria descriptiva son usados para inmovilizar otras moléculas con actividad biológica, farmacéutica (por ejemplo, factores de crecimiento como FGF, EGF, IGF, TNF, PDGF, VEGF o BMP) que son sensibles a un entorno ácido.

Los armazones poliméricos según la invención, según una realización alternativa de la misma, pueden ser usados consecuentemente no solo para un uso hemostático sino también para favorecer la curación de heridas, por ejemplo, inmovilizando en dichos armazones poliméricos un factor de crecimiento como los mencionados anteriormente.

El procedimiento de la invención incluye dos etapas:

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neutralización del armazón polimérico con una sustancia básica (por ejemplo, bicarbonato de sodio) o con una solución tamponante;

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secado del armazón polimérico;

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impregnación del armazón polimérico con una cantidad precisamente calculada de trombina.

Según el tipo de polímero que esté siendo usado, puede resultar necesario precalentar el armazón polimérico con una solución de cloruro de sodio para mejorar la absorción de la solución básica, aumentando así la movilidad iónica del medio y favoreciendo la acción del agente neutralizante. Seguidamente sería necesario secar o liofilizar el armazón polimérico. La etapa de neutralización se realiza tratando el producto con una sustancia básica (por ejemplo, NaHCO_{3}) que, según el tipo de material que esté siendo usado, es añadida en cantidades estequiométricas o un exceso calculado. Cuando se añaden cantidades estequiométricas, el disolvente usado como vehículo para la sustancia básica debe ser también exactamente calculado, de forma que el polímero mantenga su capacidad de absorber la solución de trombina que es añadida inmediatamente después. De hecho, la trombina es suministrada normalmente en una forma liofilizada o como una solución congelada y, en cualquier caso, necesita ser disuelta en una solución antes de ser extendida sobre el producto. En el caso de polímeros de baja acidez, la trombina puede ser disuelta en una solución tamponante (como PBS) que será suficiente para combatir la acidez del armazón polimérico.

Cuando la neutralización se consigue añadiendo un exceso calculado de sustancia básica, la impregnación con NaCl y neutralización con una solución básica (por ejemplo, NaHCO_{3}) se debe realizar al mismo tiempo, disolviendo las sales en una mezcla de etanol y agua en una relación de 60:40. Esta operación está seguida de un aclarado cuidadoso para separar cualquier exceso de la base. Las soluciones de aclarado están compuestas por etanol y agua, preferentemente en una relación de 80:20. Finalmente, se lava solamente con etanol, expuesto a algunas pasadas en acetona y seguidamente secado. En este momento, el armazón polimérico tiene incluida la solución que contiene la molécula biológicamente-farmacológicamente activa de elección (trombina y/o otros factores de coagulación, factores de crecimiento, etc.).

Una vez que han experimentado este tratamiento, los armazones poliméricos son envasados y esta etapa debe garantizar su estabilidad y esterilidad. La esterilidad es de importancia crucial considerando el campo de aplicación al que están destinados los armazones poliméricos de la presente invención. La esterilización se consigue mediante los procedimientos clásicos (que incluyen rayos \gamma rayos \beta, óxido de etileno) y en diferentes fases del procedimiento de la invención, según el tipo de polímero y molécula farmacológicamente/biológicamente activa usada. Más precisamente, la esterilización se puede realizar antes de que se neutralice el armazón polimérico o después de la neutralización y antes de la inclusión de la sustancia farmacológicamente/biológicamente activa. De hecho, la molécula activa puede ser sensible al procedimiento de esterilización y de esta forma es posible evitar que se degrade. Debe tenerse en cuenta que después de la esterilización se debe realizar cualquier otro procedimiento en un entorno aséptico; el mantenimiento de todas las etapas necesariamente asépticas hasta un mínimo disminuye el riesgo de contaminación y hace que el procedimiento de la invención sea más económico a una escala industrial.

Si lo permiten el polímero y la molécula activa, el producto puede ser esterilizado justo al comienzo del procedimiento.

La presente invención se refiere al procedimiento de neutralización de un armazón polimérico bi- o tri-dimensional basado en éster bencílico de ácido hialurónico, en el que la funciones carboxi han sido esterificadas con alcohol bencílico a porcentajes que varían entre 75 y 100% y preferentemente 80% (HYAFF® 11-p75HE). En todos los ejemplos, los soportes neutralizados recibieron un depósito de trombina, obtenido mediante procedimientos conocidos. Sin embargo, el procedimiento descrito en la presente memoria descriptiva es aplicable también a la inmovilización de dichos armazones poliméricos con otras moléculas farmacológicamente y/o biológicamente activas, aparte de las enzimas en general que son sensibles a las variaciones de los niveles de acidez, por lo que es esencial estabilizar el pH del armazón polimérico en el que son fijadas alrededor de valores entre 6,5 y 7,5.

La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos de neutralización de armazones poliméricos y su posterior impregnación con trombina, armazones poliméricos que están destinados a ser usados como tapones hemostáticos para heridas grandes, órganos dañados y/o heridas quirúrgicas caracterizados por áreas extensivas de hemorragia.

1. Neutralización de un armazón polimérico HYAFF®11 p75HE con cantidades estequiométricas de NaHCO_{3} 1.1 Pretratamiento con una solución de cloruro de sodio

Una tira de HYAFF® 11 p75HE no tejida que mide 4 x 4 cm y pesa 152 mg se coloca en un plato de Petri, humedecido con 1,4 ml de solución salina (0,9% de NaCl en agua) y se deja durante al menos 10 minutos. Seguidamente se verifica para asegurarse de que no hay zonas secas. Si estaban presentes todavía parches secos, se añaden unas pocas gotas más de solución salina, dejando durante 10 minutos adicionales.

El producto se seca en un liofilizador a vacío: se congela hasta al menos -30ºC y seguidamente la cámara de secado se despresuriza hasta 10 (-1) milibares.

Los platos se caldean hasta -5ºC y se dejan durante 4 horas y seguidamente hasta 25ºC y se dejan durante al menos 6 horas.

1.2 Titulación del armazón polimérico

El armazón polimérico de HYAFF® 11 p74HE no tejido pretratado con NaCl se corta y se pesan 165 mg y se colocan en una probeta con 60 ml de agua; se añade 0,1 g de NaCl y se agita durante otros 5 minutos.

Se enfría a temperatura constante entre 1 y 5ºC; se añaden 5 gotas de líquido indicador universal y se añade solución 0,01 N de NaOH gota a gota hasta que se alcanza la neutralidad, según se muestra por la coloración verde que aparece en la muestra de tela no tejida.

La cantidad de NaOH 0,01 N consumido es de 1,7 ml, correspondiente a 0,017 mmol; la cantidad de bicarbonato consumido es igual al PM bicarbonato de sodio = 84,04 x 0,017 = 1,428 mg.

1.3 Neutralización del armazón polimérico con bicarbonato de sodio

Se usa una muestra de HYAFF® 11 p75HE no tejida, preparada según el apartado 1,1 y se esteriliza mediante rayos \gamma. Es necesario preparar una solución de bicarbonato de sodio al 1% disolviendo 1,001 g de bicarbonato de sodio en 100 ml de agua. Seguidamente se recoge 1 ml de solución de bicarbonato de sodio al 1% y el volumen se ajusta a 5,6 ml con agua. Seguidamente se usan 0,8 ml de esta solución para mojar la muestra del ensayo.

1.4 Impregnación del armazón polimérico con solución de trombina

Se extienden 0,5 ml de una solución que contiene 2.000 unidades de trombina/ml sobre la muestra preparada según el apartado 1.3 y seguidamente se deja durante al menos 15 minutos.

El producto seguidamente se liofiliza como sigue: el producto se enfría a una temperatura entre -2 y 5ºC, seguidamente se congela a una temperatura de menos de -30ºC, la cámara de secado se despresuriza seguidamente hasta 10(-1) milibares. Los platos se caldean a una temperatura entre -25ºC y -10ºC y seguidamente se dejan sublimar durante al menos 12 horas. Los platos del secador se llevan a una temperatura entre -10ºC y +25ºC durante al menos 2 horas.

1.5 Preparación de la muestra no neutralizada

Una tira de HYAFF® 11 p75HE no tejida pretratada con una solución de NaCl se trata con 0,8 ml de agua sola y 15 minutos después se extienden 0,5 ml de solución de trombina sobre la superficie.

1.6 Extracción de trombina de las muestras y dilución posterior hasta 5 UT/ml (unidades de trombina/ml)

Las dos muestras diferentes se insertan en una jeringuilla de 5 ml (sin su émbolo) y seguidamente se repone el émbolo. A cada jeringuilla se añaden 1,3 ml de agua por medio de la tapadera de la aguja. Esta se coloca en un lado durante aproximadamente una hora.

La solución se extrae de la tela no tejida empujando el émbolo en la aguja; el extracto se recoge en un tubo de ensayo. La tela no tejida se lava seguidamente añadiendo 1,5 ml de PBS a la jeringuilla, dejándolo en la misma durante unos pocos minutos y extrayendo seguidamente la solución apretando en el émbolo. La solución así obtenida se añade al tubo de ensayo que contiene el primer extracto. Se repite la operación.

La solución se lleva hasta un volumen de 10 ml, obteniéndose una concentración de 100 UT/ml.

Se toma 1 ml de la solución a una concentración de 100 UT/ml y se lleva hasta un volumen de 10 ml con PBS, obteniéndose una concentración de 10 UT/ml.

Se recoge 1 ml de la solución a una concentración de 10 UT/ml y se lleva hasta un volumen de 2 ml con PBS, obteniéndose una concentración de 5 UT/ml.

1.7 Preparación de una solución de referencia de trombina con una concentración de 5 UT/ml

Se diluyen 0,5 ml de solución de trombina a una concentración de 2.000 UT/ml con PBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco) hasta 10 ml, obteniéndose una concentración de 100 UT/ml.

Se lleva 1 ml de la solución a una concentración de 100 UT/ml hasta un volumen de 10 ml con PBS, proporcionando una concentración de 10 UT/ml.

Se toma 1 ml de la solución a una concentración de 10 UT/ml y se lleva hasta un volumen de 2 ml con PBS, proporcionando una concentración de 5 UT/ml.

1.8 Preparación de una solución de fibrinógeno con una concentración de 1 mg/ml

Se diluye 1 ml de solución de fibrinógeno con una concentración de 90 mg/ml con PBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco) hasta un volumen de 9 ml, proporcionando una solución de fibrinógeno con una concentración de 10 mg/ml.

Se toma 1 ml y se lleva hasta un volumen de 10 ml con PBS, proporcionando una concentración de 1 mg/ml de fibrinógeno.

1.9 Comparación entre la actividad de trombina extraída de tela no tejida neutralizada y no neutralizada

Un plato de Petri que mide 10 x 10 cm se coloca liso sobre una superficie sin su tapadera. Se colocan en el plato tres pequeñas cantidades de 100 microlitros, una de cada una de las tres soluciones de trombina preparadas con anterioridad, aproximadamente a 1 cm del borde, en una hilera de aproximadamente 2 cm de separación:

1. solución de referencia con una concentración de 5 UT/ml;

2. solución extraída del material no tejido neutralizado con bicarbonato, con una concentración de 5 UT/ml;

3. solución extraída del material no tejido y no neutralizado, con una concentración de 5 UT/ml.

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Al mismo tiempo, se añaden tres muestras de 100 microlitros de fibrinógeno con una concentración de 1 mg/ml (usando una pipeta de canales múltiples). Ésta se deja seguidamente en reposo entre 30 y 60 segundos.

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El plato se vuelca seguidamente hasta que está en una posición vertical y se verifica lo siguiente:

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que la muestra de referencia constituida por fibrinógeno + trombina y la constituida por fibrinógeno + trombina extraída del material no tejido neutralizada con bicarbonato forman un coágulo del mismo volumen que la muestra original y permanecen firmemente adheridas al plato cuando se inclina;

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que la muestra formada por fibrinógeno + trombina extraída del material no tejido que no había sido neutralizada con bicarbonato forma un coágulo que es bastante más pequeño que el de las otras dos y se desliza hacia abajo del plato cuando es inclinado.

Esto indica que en la muestra 3, la trombina fue incapaz de ejercer completamente su actividad enzimática debido a la actividad del armazón polimérico.

Ejemplo de referencia

Neutralización de un armazón polimérico con celulosa regenerada y oxidada (ORC)

La neutralización se consigue en este tipo de armazón polimérico de polímero añadiendo un exceso de sustancia básica como bicarbonato de sodio.

2.1 Preparación de una solución hidroalcohólica de bicarbonato de sodio

Se disuelven 0,5 gramos de bicarbonato de sodio en 100 ml de agua. La solución se agita lentamente mientras se añaden 400 ml de etanol.

2.2 Neutralización de la muestra

Una tira de tejido basada en ORC (4 x 4 cm, peso 148 mg) se coloca en la mezcla resultante durante al menos 40 minutos. La muestra se retira seguidamente de la solución y se lava al menos dos veces con 200 ml de una solución de etanol y agua en una relación de 80:20.

El pH de la superficie se ensaya con un líquido indicador: si sobrepasa 7, se realizan lavados adicionales hasta que se corrige el valor.

En este momento, la muestra se lava dos veces en 200 ml de etanol absoluto. Cada lavado dura al menos 15 minutos.

La muestra se coloca en un secador ajustado a 30ºC en un flujo de nitrógeno durante al menos 4 horas, en un vacío durante al menos 8 horas y seguidamente se esteriliza por medio de rayos \gamma.

Se colocan en el tejido 1,2 ml de solución de trombina (con una concentración de 840 unidades/ml).

Se deja en reposo durante al menos 20 minutos y seguidamente se liofiliza como se describió en el apartado 1.1.

2.3 Preparación de la muestra no neutralizada

Una tira de ORC (4 x 4 cm, peso 148 mg) se sumerge en una solución hidroalcohólica constituida por 100 ml de agua y 400 ml de etanol. Seguidamente se sigue el procedimiento descrito en el apartado 2.2, sin comprobar el pH de la superficie, pero realizando las mismas etapas de aclarado, secado e impregnación con trombina.

2.4 Comparación de la actividad de trombina extraída de ORC neutralizada y sin neutralizar

La actividad se ensayó como se describió en el apartado 1.9 y se mostró que la trombina mantenía una actividad máxima; de hecho, después de un tratamiento con solución de fibrinógeno, la muestra de trombina extraída de ORC neutralizada con bicarbonato de sodio y la constituida por trombina de referencia forman dos coágulos del mismo tamaño, que son bastante mayores que el obtenido con trombina extraída de la muestra no neutralizada. Además de ello, estos dos coágulos permanecen adheridos al plato de Petri cuando es inclinado.

3. Neutralización de un armazón polimérico de HYAFF® 11 p74HE con un exceso de NaHCO_{3}

En este caso, cuando se usa un exceso de sustancia básica, no es necesario pesar la HYAFF ® 11 p75HE no tejida con ninguna precisión.

3.1 Preparación del baño neutralizante y neutralización

El baño neutralizante contiene también un agente favorecedor de la movilidad iónica y está constituido por una mezcla de etanol y agua en una relación de 60:40. Seguidamente se mezclan conjuntamente 300 ml de etanol y 200 ml de agua y a esta mezcla se añaden 1,9 g de NaHCO_{3} y 2,25 g de NaCl. La solución se enfría seguidamente a una temperatura de 20º \pm 5ºC y en la misma se sumerge una tira de HYAFF® 11 p75HE no tejida que pesa 10 g, suspendida por dos mallas de acero inoxidable. El material no tejido se mantiene en el baño neutralizante durante aproximadamente 60 minutos.

3.2 Lavados

Son necesarios al menos 3 lavados con una mezcla de etanol y agua en una relación de 80:20 a una temperatura de 20ºC \pm 5ºC para eliminar el exceso de base. Por lo tanto, la tira de HYAFF® 11 p75HE no tejida es lavada siendo sumergida en 400 ml de la mezcla de etanol-agua descrita. Los dos primeros lavados duran al menos 1 y 2 horas cada uno y los posteriores duran entre 1 y 3 horas cada uno. Después del tercer aclarado, se verifica la neutralización de la mezcla de lavado; si todavía no se ha conseguido la neutralidad, se realizan lavados adicionales hasta conseguirla. Se realiza un lavado final agitando la muestra en 400 ml de etanol durante al menos 90 minutos.

La tira de HYAFF® 11 p75HE no tejida se lava seguidamente dos veces agitándola en 300 ml de acetona durante al menos 4 hora cada vez. El armazón polimérico así neutralizado se seca en un flujo de nitrógeno a una temperatura de 30ºC y se esteriliza por medio de rayos \gamma.

3.3 Inmovilización del armazón polimérico con solución de trombina

Se prepara una solución compuesta por trombina (1.000 unidades/ml) en PBS. Seguidamente se repone el émbolo y se añaden 1,2 ml de solución de trombina usando la tapadera de la aguja. Esta se deja en reposo durante 3 horas.

3.4 Extracción de la solución de trombina a partir de la muestra

El líquido deja chorrear fuera de la jeringuilla en un tubo de ensayo. Se colocan otros 1,5 ml de PBS en la jeringuilla y algunos minutos después se retira el líquido nuevamente y se añade a la cantidad previa. Esta operación se repite al meno dos veces más y seguidamente el volumen se ajusta a 10 ml con PBS.

3.5 Preparación de la muestra no neutralizada

Se mezclan 300 ml de etanol con 200 ml de agua, se enfría a una temperatura de 20ºC y en esta mezcla se sumerge una tira de HYAFF® 11 p75HE no tejida que pesa 10 g, suspendida por dos mallas de acero inoxidable. Después de aproximadamente 60 minutos, se pueden realizar los ciclos de aclarado, secado, esterilización, impregnación y extracción de trombina como se describió en los apartados previos.

3.6 Soluciones de referencia

Las soluciones de trombina y fibrinógeno se preparan como se describe en los apartados 1.7 y 1.8.

3.7 Comparación entre las actividades de trombina extraída a partir de HYAFF® 11 p75HE neutralizado y sin neutralizar

Las actividades se ensayan como se describe en el apartado 1.9.

Después de la adición de fibrinógeno, se forman dos coágulos en las muestras constituidas por trombina de referencia y trombina extraída a partir de la muestra neutralizada. Los coágulos son del mismo tamaño y se adhieren al fondo del plato de Petri inclinado. En la muestra de trombina extraída a partir de muestra testigo no neutralizada, después de la adición de fibrinógeno, se forma un coágulo muy pequeño que se desliza rápidamente hacia abajo por la pared del plato de Petri cuando se inclina.

Por lo tanto, también en este caso, la neutralización del armazón polimérico no afecta a la actividad de la trombina.

La descripción anterior confirma la importancia de neutralizar los armazones poliméricos que van a ser usados, después de una impregnación con trombina, como agentes hemostáticos en casos que requieren la coagulación rápida de heridas profundas y/o superficiales, órganos dañados y/o durante una cirugía; el procedimiento reivindicado por la presente invención supera las limitaciones del conocimiento presente del problema y proporciona una solución que es fácil de aplicar, sencilla de preparar, eficaz y segura. Se ha demostrado también que es satisfactoria cuando las moléculas farmacológicamente/biológicamente activas son distintas de factores de coagulación o factores de crecimiento.

Claims (13)

1. Un procedimiento para la preparación de armazones poliméricos bi- y tri-dimensionales para un uso hemostático, que contienen una proteína farmacológicamente y/o biológicamente activa que interfiere con el procedimiento de coagulación, consistiendo el armazón polimérico en ácido hialurónico modificado por esterificación, desacetilación, O-sulfatación, amidación, percarboxilación en la forma de películas, esponjas, mallas, telas no tejidas y tejidas, membranas y gránulos, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas:

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neutralización del armazón polimérico bi- o tri-dimensional con una sustancia básica o una solución tamponante;

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secado del armazón polimérico;

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impregnación del armazón polimérico con una cantidad previamente definida de dicha proteína farmacológicamente y/o biológicamente activa.

2. El Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el ácido hialurónico es esterificado con alcoholes bencílicos hasta un grado entre 75 y 100%.

3. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la neutralización se realiza con bicarbonatos alcalinos o soluciones tamponantes.

4. Un procedimiento según las reivindicaciones 1-3, en el que la esterilización se realiza antes de la neutralización del armazón polimérico.

5. Un procedimiento según las reivindicaciones 1-3, en el que la esterilización se realiza después de la impregnación del armazón polimérico con la sustancia biológicamente/farmacológicamente activa.

6. Un procedimiento según las reivindicaciones 1-3, en el que la esterilización se realiza después de la neutralización del armazón polimérico y antes de la impregnación con la sustancia biológicamente/farmacológicamente activa.

7. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la proteína biológicamente/farmacológicamente activa es un factor de coagulación, particularmente trombina.

8. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la molécula biológicamente/farmacológicamente activa es un factor de crecimiento.

9. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que la molécula se selecciona entre FGF, EGF, IGF, TNF, PDGF, VEGF o BMP.

10. Armazones poliméricos, que se pueden obtener mediante uno cualquiera de los procedimientos de las reivindicaciones 1-7.

11. El uso de armazones poliméricos de la reivindicación 10, para la preparación de dispositivos para un uso hemostático.

12. Armazones poliméricos, que se pueden obtener mediante el procedimiento de las reivindicaciones 8 o 9.

13. El uso de armazones poliméricos de la reivindicación 12, para la preparación de dispositivos para favorecer la curación de heridas.