ES2312210T3 - Composiciones antitromboticas. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto de fórmula (I) (Ver fórmula) donde R 1 es fenilo, naftilo, 1,2,3,4-tetrahidronaftilo, (iso)quinolinilo, tetrahidro(iso)quinolinilo, 3,4-dihidro-1H-isoquinolinilo, cromanilo o el grupo alcanfor, cuyos grupos pueden estar eventualmente substituidos con uno o más substituyentes seleccionados entre alquilo(1-8 C) o alcoxi (1-8 C); R 2 y R 3 son independientemente H o alquilo (1-8 C); R 4 es alquilo (1-8 C) o cicloalquilo (3-8 C); o R 3 y R 4 , junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, son un anillo no aromático de (4-8) miembros que contiene eventualmente otro heteroátomo, estando el anillo eventualmente substituido con alquilo(1-8 C) o SO2-alquilo( 1-8 C); Q es un espaciador que tiene una longitud de cadena de 10 a 70 átomos; y Z es un residuo de oligosacárido cargado negativamente que tiene de dos a seis unidades de monosacáridos, estando compensada la carga por contraiones de carga positiva; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o un derivado del mismo en donde el grupo amino del resto amidino está protegido, v.g., por hidroxi o por un grupo alcoxi(1-6 C)carbonilo.
Description
Composiciones antitrombóticas.
La invención se relaciona con nuevos agentes
antitrombóticos, con un procedimiento para su preparación y con
composiciones farmacéuticas que contienen los compuestos como
ingredientes activos, así como con el uso de dichos compuestos para
la fabricación de medicamentos.
Las serina proteasas son enzimas que juegan un
importante papel en la cascada de coagulación de la sangre. Los
miembros de este grupo de proteasas son, por ejemplo, la trombina,
la tripsina, los factores VIIa, IXa, Xa, XIa, XIIa y la proteína
C.
La trombina es la enzima serina proteasa final
en la cascada de la coagulación. La función principal de la
trombina es la escisión del fibrinógeno para generar monómeros de
fibrina, que se entrecruzan para formar un gel insoluble. Además,
la trombina regula su propia producción por activación de los
factores V y VIII previamente en la cascada. También tiene
importantes acciones a nivel celular, donde actúa sobre receptores
específicos para provocar la agregación plaquetaria, la activación
de las células endoteliales y la proliferación de los fibroblastos.
Así, la trombina tiene un papel regulador central en la hemostasia y
la formación de trombos. Dado que los inhibidores de la trombina
pueden tener un amplio abanico de aplicaciones terapéuticas, se
realiza una amplia investigación en este área.
Otra importante serina proteasa, el factor Xa,
cataliza la conversión de la protrombina en trombina.
En el desarrollo de inhibidores sintéticos de
las serina proteasas, y más específicamente de la trombina, el
resto de benzamidina es una de las estructuras clave. Imita la
cadena lateral protonada de los aminoácidos básicos Arg y Lys de
sus substratos naturales. Se han estudiado compuestos con este resto
amplia y repetidamente. Un representante muy potente de este tipo
de inhibidores de la trombina es el derivado de aminoácido
N\alpha-(2-naftilsulfonil)-glicil-4-amidinofenilalanin-piperiduro
(NAPAP) (Stürzebecher, J. y col., Thromb. Res. 29,
635-642, 1983). Sin embargo, el perfil del NAPAP no
resulta atractivo para aplicaciones terapéuticas: por ejemplo, el
compuesto tiene una baja especificidad por la trombina y es poco
soluble. Se prepararon posteriormente derivados de NAPAP, tales como
los derivados N-alquil-substituidos
descritos en EP 0.236.163 o los derivados glicopeptídicos descritos
en EP 0.558.961, Proc. Am. Pept. Symp., 13º (60LXAW); 94; pp.
643-5 (Stüber, W. y col., Pept.: Chem., Struct.
Biol.,), Proc. Int. Symp. Controlled Release Bioact. Mater.
(PCRMEY, 10220178); 94; Vol. 21º; pp. 712-12
(Walter. E. y col.) y EP 0.513.543. Sin embargo, aunque estas
derivatizaciones pueden haber conducido a mejoramientos del perfil
farmacológico cuando se compara con el NAPAP, todos esos compuestos
derivados de NAPAP son aún activos sólo como inhibidores directos
de la trombina y tienen una vida media en plasma restringida y un
rápido aclaramiento (exhibiendo así su actividad antitrombina sólo
durante un corto período de tiempo).
Se ha visto ahora que compuestos de la fórmula
(I)
donde
R^{1} es fenilo, naftilo,
1,2,3,4-tetrahidronaftilo, (iso)quinolinilo,
tetrahidro(iso)quinolinilo,
3,4-dihidro-1H-isoquinolinilo,
cromanilo o el grupo alcanfor, cuyos grupos pueden estar
eventualmente substituidos con uno o más substituyentes
seleccionados entre alquilo(1-8 C) o alcoxi
(1-8 C);
R^{2} y R^{3} son independientemente H o
alquilo (1-8 C);
R^{4} es alquilo (1-8 C) o
cicloalquilo (3-8 C);
o R^{3} y R^{4}, junto con el átomo de
nitrógeno al que están unidos, son un anillo no aromático de
(4-8) miembros que contiene eventualmente otro
heteroátomo, estando el anillo eventualmente substituido con
alquilo(1-8 C) o
SO_{2}-alquilo(1-8 C);
Q es un espaciador que tiene una longitud de
cadena de 10 a 70 átomos; y
Z es un residuo de oligosacárido cargado
negativamente que tiene de dos a seis unidades de monosacáridos,
estando compensada la carga por contraiones de carga positiva;
o una sal farmacéuticamente aceptable de los
mismos o un profármaco de los mismos son antitrombóticos potentes y
altamente versátiles. Los compuestos de la invención tienen
actividad antitrombina, pero también la estructura de los
compuestos puede ser selectivamente modificada para que tengan un
perfil mixto afinable tanto de la actividad antitrombina directa
(factor IIa) no mediada como de la actividad anti-Xa
mediada por antitrombina III (AT-III). Los
compuestos de la invención son, por lo tanto, inhibidores dobles.
Los compuestos de la invención tienen una larga vida media
plasmática y, como resultado de ello, poseen una prolongada
actividad antitrombina en comparación con NAPAP o sus derivados
antes indicados. Además, los compuestos de la invención pueden
escapar a la acción neutralizante del factor plaquetario 4 (PF4).
La baja toxicidad es también un aspecto ventajoso de los compuestos
de esta invención.
Se describe otro tipo de inhibidores dobles en
EP 0.649.854. Contrariamente a los compuestos de la presente
invención, los compuestos sacarídicos conjugados descritos en ese
documento exhiben actividad antitrombina mediada por
AT-III indirecta, además de actividad
anti-Xa mediada por AT-III.
Los compuestos de la presente invención son
útiles para el tratamiento y la prevención de enfermedades mediadas
por la trombina y asociadas a la trombina. Esto incluye una serie de
estados trombóticos y protrombóticos en donde la cascada de
coagulación está activada, que incluyen, aunque sin limitación, la
trombosis venosa profunda, la embolia pulmonar, la tromboflebitis,
la oclusión arterial por trombosis o embolia, la reoclusión
arterial durante o después de una angioplastia o de una trombolisis,
la reestenosis después de una lesión arterial o de procedimientos
cardiológicos invasivos, la trombosis o la embolia venosa
post-operatoria, la aterosclerosis aguda o crónica,
el ictus, el infarto de miocardio, el cáncer y la metástasis y las
enfermedades neurodegenerativas. Los compuestos de la invención
pueden también ser usados como anticoagulantes en circuitos
sanguíneos extracorpóreos, como resulta necesario en diálisis y
cirugía. Los compuestos de la invención pueden ser también usados
como anticoagulantes in vitro.
El perfil mixto de los compuestos de la
invención puede ser afinado variando la naturaleza del residuo de
oligosacárido Z y la longitud del espaciador Q. Se dispone así de un
rango de perfiles.
Se puede utilizar cualquier residuo de
oligosacárido cargado negativamente de 2 a 6 unidades de sacárido
en los compuestos de la presente invención. Son compuestos adecuados
de la invención compuestos en los que Z es un residuo de
oligosacárido sulfatado o fosforilado. Preferiblemente, el residuo
de oligosacárido Z deriva de un oligosacárido que tiene per
se actividad anti-Xa mediada por
AT-III, tal como los sacáridos descritos en EP
0.454.220 y EP 0.529.715. Son residuos de oligosacárido
particularmente preferidos los residuos de pentasacárido. Más
preferiblemente, Z tiene la fórmula (II)
donde R^{5} es independientemente
OSO_{3}^{-} o alcoxi(1-8
C).
Otros compuestos preferidos de la invención son
los compuestos de fórmula I donde R^{1} es fenilo,
4-metoxi-2,3,6-trimetilfenilo
o naftilo. En compuestos preferidos, NR^{3}R^{4} representa el
grupo piperidinilo. Preferiblemente, R^{2} es H.
La estructura química del espaciador es de poca
o ninguna importancia para la actividad antitrombótica de los
compuestos de la invención; puede, sin embargo, no ser completamente
rígida. Los espaciadores altamente flexibles son más adecuados que
otros.
Además, por razones sintéticas algunos
espaciadores son más apropiados que otros.
Espaciadores adecuados que pueden ser fácilmente
usados tienen, por ejemplo, la fórmula (III):
(III),-[(CH_{2})_{2}O]_{m}-[(CH_{2})_{n}-NR^{3}-C(O)]_{p}-W-(CH_{2})_{s}-
donde
W es
-[1,4-fenilen-NR^{3}-C(O)]_{q}-(CH_{2})_{r}-S-
o
-(CH_{2})_{t}-S-(CH_{2})_{u}-[O(CH_{2})_{2}]_{v}-O-(CH_{2})_{w}-C(O)-NR^{3}-;
y R^{3} es independientemente H o
alquilo(1-8 C);
m = 1-12; n =
1-8; p = 0-4; q = 0 ó 1; r =
1-8; s = 1-8; t =
1-8; u = 1-8; v =
1-12; w = 1-8; el número total de
átomos es 10-70; y el resto
-[(CH_{2})_{2}O]_{m}- es el extremo con el que Q
se une a Z.
Son espaciadores preferidos los siguientes:
-[(CH_{2})_{2}O]_{5}-(CH_{2})_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-S-CH_{2}-,
-[(CH_{2})_{2}O]_{5}-(CH_{2})_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-S-(CH_{2})_{2}-[O(CH_{2})_{2}]_{3}-O-CH_{2}-C(O)-NH-(CH_{2})_{4}-
y
-[(CH_{2})_{2}O]_{3}-(CH_{2})_{2}-NH-C(O)-1,4-fenilen-NH-C(O)-CH_{2}-S-CH_{2}-.
En la descripción de los compuestos de fórmula
(I), se usan las siguientes definiciones.
El término alquilo(1-8 C)
significa un grupo alquilo ramificado o no ramificado de
1-8 átomos de carbono, por ejemplo metilo, etilo,
propilo, isopropilo, butilo, sec-butilo,
terc-butilo, hexilo y octilo. Metilo y etilo son
grupos alquilo preferidos.
El término alcoxi(1-8 C)
significa un grupo alcoxi de 1-8 átomos de carbono,
teniendo el resto alquilo el significado previamente definido. El
metoxi es un grupo alcoxi preferido.
El término
cicloalquilo(3-8 C) significa un grupo
cicloalquilo de 3-8 átomos de carbono, que es
ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo
o ciclooctilo. Ciclopentilo y ciclohexilo son grupos cicloalquilo
preferidos.
La longitud del espaciador es el número de
átomos del espaciador, contados a lo largo de la cadena más corta
entre Z y la parte peptídica de la molécula, sin contar el átomo de
oxígeno del oligosacárido Z que se conecta al espaciador.
El término "profármaco" significa un
compuesto de la invención en el que el grupo amino del resto amidino
está protegido, v.g. por hidroxi o por un grupo
alcoxicarbonilo(1-6 C).
Los compuestos de la presente invención son
preparados derivatizando NAPAP (o un análogo de NAPAP) en la
posición de la glicina con cisteína o lisina usando métodos
generalmente conocidos en la técnica, cuyo compuesto a continuación
(a) es copulado a un residuo de
oligosacárido-espaciador o (b) es copulado a un
espaciador, que es luego derivatizado con un grupo tiol y
posteriormente es copulado a un residuo de oligosacárido. Se puede
usar cualquier oligosacárido adecuado con este fin, por ejemplo
oligosacáridos conocidos en la literatura (v.g. por EP 0.454.220 y
EP 0.529.715, pero sin limitarse a estas fuentes) u oligosacáridos
comerciales. Los oligosacáridos pueden ser fosforilados en un
tiempo apropiado por métodos, v.g., descritos por Buijsman, R. y
col. (Abstracts of papers, 9th European Carbohydrate Symposium
Utrecht 1997, Abstract A150). La copulación del espaciador al
oligosacárido puede ser realizada, por ejemplo, usando los métodos
descritos en EP 0.649.854.
Se puede realizar la copulación peptídica, una
etapa de procedimiento en el método antes descrito para preparar
los compuestos de la invención, por métodos comúnmente conocidos en
la técnica para la copulación - o condensación - de fragmentos
peptídicos, tales como el método de la azida, el método del
anhídrido mixto, el método del éster activado o, preferiblemente,
el método de la carbodiimida, especialmente con adición de
compuestos catalíticos y supresores de la racemización, como la
N-hidroxisuccinimida y el
N-hidroxibenzotriazol. Se da una revisión en The
Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 3, E. Gross y J.
Meienhofer, eds. (Academic Press, New York,
1981).
1981).
Se pueden proteger las funciones amina presentes
en los compuestos durante el procedimiento sintético por un grupo
N-protector, que significa un grupo comúnmente usado
en química peptídica para la protección de un
\alpha-amino, como el grupo
terc-butiloxicarbonilo (Boc), el grupo
benciloxicarbonilo (Z), el grupo
9-fluorenilme-tiloxicarbonilo (Fmoc)
o el grupo ftaloílo (Phth). La eliminación de los grupos protectores
puede tener lugar de diferentes maneras, dependiendo de la
naturaleza de esos grupos protectores. Normalmente, la
desprotección tiene lugar en condiciones ácidas y en presencia de
capturadores. Se da una revisión de grupos
amino-protectores y de métodos para su eliminación
en The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 3, antes
mencionado.
Los compuestos de la invención, que pueden
aparecer en forma de base libre, pueden ser aislados de la mezcla
de reacción en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Las
sales farmacéuticamente aceptables pueden también ser obtenidas
tratando la base libre de fórmula (I) con un ácido orgánico o
inorgánico tal como HCl, HBr, HI, H_{2}SO_{4}, H_{3}PO_{4},
ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido maleico,
ácido malónico, ácido metanosulfónico, ácido fumárico, ácido
succínico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido
ascórbico y similares.
Los compuestos de esta invención poseen átomos
átomos de carbono quirales y pueden, por lo tanto, ser obtenidos
como un enantiómero puro o como una mezcla de enantiómeros, o como
una mezcla que contiene diastereómeros. Los métodos para obtener
los enantiómeros puros son bien conocidos en la técnica, v.g.
cristalización de sales obtenidas de ácidos ópticamente activos y
la mezcla racémica, o cromatografía usando columnas quirales. Para
los diastereómeros, se pueden usar columnas de fase directa o de
fase invertida.
Los compuestos de la invención pueden ser
administrados enteral o parenteralmente. La dosis exacta y el
régimen de estos compuestos y de sus composiciones dependerán
necesariamente de las necesidades del sujeto individual a quien se
esté administrando el medicamento, del grado de aflicción o
necesidad y del juicio del médico asistente. En general, la
administración parenteral requiere dosificaciones inferiores a otros
métodos de administración más dependientes de la absorción. Sin
embargo, las dosificaciones diarias son para humanos
preferiblemente de 0,001-100 mg por kg de peso
corporal, más preferiblemente de 0,01-10 mg por kg
de peso corporal.
El medicamento fabricado con los compuestos de
esta invención puede ser también usado como adyuvante en terapia
anticoagulante aguda. En tal caso, el medicamento es administrado
con otros compuestos útiles en el tratamiento de dichos estados de
la enfermedad. Mezclados con auxiliares farmacéuticamente adecuados,
v.g. como se describe en la referencia estándar, Gennaro y col.,
Remington's Pharmaceutical Sciences (18ª ed., Mack Publishing
Company, 1990, véase especialmente la Parte 8: Pharmaceutical
Preparations and Their Manufacture), los compuestos pueden ser
comprimidos en unidades sólidas de dosificación, tales como píldoras
o tabletas, o ser procesados en cápsulas o supositorios. Por medio
de líquidos farmacéuticamente adecuados, los compuestos pueden ser
también aplicados en forma de solución, suspensión, emulsión, v.g.
para uso como preparación para inyección, o como spray, v.g. para
uso como spray nasal.
Para preparar unidades de dosificación, v.g.
tabletas, se contempla el uso de aditivos convencionales, tales
como rellenantes, colorantes, ligantes poliméricos y similares. En
general, se puede usar cualquier aditivo farmacéuticamente
aceptable que no interfiera con la función de los compuestos
activos. Como soportes adecuados con los que se pueden administrar
las composiciones, se incluyen lactosa, almidón, derivados de
celulosa y similares, o sus mezclas, usados en cantidades
adecuadas.
La invención es además ilustrada mediante los
siguientes ejemplos.
DMAP =
N,N-dimetilaminopiridina
TEA = trietilamina
Z = benciloxicarbonilo
Ac = acetilo
MMTr = monometoxitritilo
Bn = bencilo
DCHA = diciclohexilamonio
EDCI = clorhidrato de
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
HOBt = 1-hidroxibenzotriazol
DiPEA = diisopropiletilamina
Pyr = piridinilo
TEG = tetraetilenglicol
HEG = hexaetilenglicol
APA = amidinofenilalanina
Cys = cisteína
Los números de los compuestos hacen referencia a
los compuestos de las hojas de fórmulas.
A una solución agitada de maltotriosa (1) (2,0
g, 4,0 mmol) en piridina (100 mL) se le añadió anhídrido acético
(6,2 mL, 65 mmol) y una cantidad catalítica de DMAP (0,79 g, 6,5
mmol). Después de 5 h, se vertió la mezcla de reacción en hidrógeno
carbonato de sodio acuoso (1M, 250 mL) y se extrajo tres veces con
acetato de etilo (200 mL). Se secaron las capas orgánicas
combinadas sobre sulfato de magnesio y se concentraron a vacío. Se
purificó el producto por cromatografía en columna (petróleo
ligero/acetato de etilo, 1/1 a 0/1, v/v), obteniéndose 2 como una
espuma blanca (rendimiento del 91%, 3,5 g). Se consiguió la
desacetilación anomérica por tratamiento de 2 (3,0 g, 3,1 mmol) con
una solución 0,1 M de acetato de hidrazina en dimetilformamida (34
mL, 3,4 mmol) durante 1 h. Tras concentración a vacío, se diluyó la
mezcla de reacción con acetato de etilo (50 mL), se lavó con
hidrógeno carbonato de sodio (1M, 3 x 25 mL), se secó (sulfato de
magnesio) y se concentró. La purificación por cromatografía en
columna de gel de sílice (petróleo ligero/acetato de etilo, 3/2 a
1/0, v/v) dio 3 (rendimiento del 92%, 2,7 g). Se disolvió el
Compuesto 3 (2,7 g, 3,1 mmol) en diclorometano (15 mL) y se añadió
tricloroacetonitrilo (1,7 mL) junto con una cantidad catalítica de
carbonato de cesio (0,2 g, 0,62 mmol). Después de 1 h, se filtró la
mezcla de reacción y se concentró el filtrado a presión reducida.
La purificación del 4 bruto por cromatografía en columna (petróleo
ligero/acetato de etilo/TEA, 50/49/1 a 0/99/1, v/v/v) dio 4 puro
como una espuma blanca (1,9 g, 71%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se agitó una solución de donador 4 (0,69 g, 0,76
mmol) y aceptor 5 (0,31 g, 0,76 mmol) en diclorometano (1,5 mL)
durante 1 h bajo un flujo de argón en presencia de cribas
moleculares activadas de 4\ring{A} (250 mg). Se enfrió la
solución a -20ºC y se añadió gota a gota una solución de
trifluorometanosulfonato de trimetilsililo (15 \muL) en
diclorometano (0,6 mL) a la mezcla de reacción. Después de 10 min,
el análisis por TLC (metanol al 5% en diclorometano) mostró la
presencia de un producto. Se añadió hidrógeno carbonato de sodio
sólido (0,3 g) a la mezcla de reacción, que fue agitada durante 10
min. y luego filtrada. Se diluyó el filtrado con diclorometano (50
mL), se lavó posteriormente con hidrógeno carbonato de sodio acuoso
(1 M, 2 x 25 mL), se secó (sulfato de magnesio) y se concentró a
vacío. Se cromatografió el residuo sobre gel de sílice (metanol
0-4% en acetato de etilo), obteniéndose 6 puro (0,57
g, rendimiento del 56%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se trató el compuesto 6 (0,57 g, 0,43 mmol) con
una solución de terc-butilato de potasio (43 mg, 10 mg por
mmol de Ac) en metanol (15 mL). Después de 1 h, el análisis por TLC
(acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua, 5/7/4/1,6, v/v/v/v)
indica una completa conversión de 6 en 7. Se neutralizó la reacción
con resina Dowex 50 WX4-H^{+}. Se eliminó la
resina por filtración y se concentró el filtrado a presión reducida
para obtener 7 (0,37 g, rendimiento del 95%), que fue usado sin
mayor purificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió una solución de 1H-tetrazol (54
mg, 0,77 mmol) en acetonitrilo (1 mL) a una mezcla de 7 (86 mg, 95
\mumol) y 8 (450 mg, 1,4 mmol) en acetonitrilo/dioxano (2/1, v/v,
2 mL). Después de agitar durante 1 h a 20ºC, se enfrió la mezcla de
reacción con un baño de hielo y se añadió hidroperóxido de
terc-butilo (0,75 mL). Se continuó agitando durante 45 min,
tras de lo cual el análisis por TLC mostró la presencia de un
producto principal. La purificación por cromatografía en columna de
gel de sílice (100/0 a 95/5, diclorometano/metanol, v/v)
proporcionó 9 puro (311 mg, rendimiento del 92%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió el compuesto 9 (311 mg, 87 \mumol)
en terc-butanol/agua (6/1, v/v, 20 mL) que contenía unas
cuantas gotas de ácido acético. Se agitó la solución bajo una
corriente continua de hidrógeno en presencia de Pd al 10%/C (100
mg). Después de 3 h, se retiró el catalizador de Pd/C por filtración
y se concentró el filtrado a vacío. El intercambio iónico con Dowex
50 WX4-Na^{+} proporcionó entonces 10 (179 mg,
rendimiento del 98%).
\vskip1.000000\baselineskip
A una mezcla agitada de
S-4-monometoxitritil-(L)-cisteína
comercial (11) (0,34 g, 1 mmol), dioxano (5 mL) y carbonato de
sodio acuoso al 10% (5 mL), se le añadió cloruro de
2-naftalenosulfonilo (0,25 g, 1,1 mmol). Después de
agitar durante 1 h, se acidificó la mezcla de reacción mediante
adición de ácido cítrico acuoso al 5% (50 mL) y se extrajo con
acetato de etilo (2 x 50 mL). Se secaron las capas orgánicas
combinadas (sulfato de magnesio) y se concentraron a presión
reducida. Se cromatografió el producto bruto en gel de sílice
(metanol/diclorometano/trietilamina, 0/99/1 a 4/95/1, v/v/v), para
obtener 12 (rendimiento del 76%, 0,44 g).
Se añadió una solución de ácido trifluoroacético
y triisopropilsilano en diclorometano (1/1/18, v/v/v) al compuesto
12 (0,44 g, 0,76 mmol). Después de agitar durante 20 min., se vertió
la mezcla en agua y se extrajo con diclorometano (2 x 50 mL). Se
secaron las capas orgánicas combinadas sobre sulfato de magnesio y
se concentraron a vacío. Se retiraron las trazas de ácido
trifluoroacético de la mezcla bruta por coevaporación con tolueno.
Se redisolvió el tiol libre resultante 13 en isopropanol (2,5 mL) y
se añadió gota a gota a una solución de Aldrithiol^{TM} (1,7 g,
7,6 mmol) en isopropanol/ácido acético acuoso 2 N (1/1, v/v, 20 mL).
Después de 1 h, el análisis por TLC indicó que la reacción se había
completado y se concentró la mezcla a presión reducida. Se
eliminaron las trazas de ácido acético del residuo por coevaporación
con tolueno. Se disolvió el producto bruto en acetona (10 mL) y se
añadió a esta solución diciclohexilamina (0,3 mL), después de lo
cual el compuesto 14 precipitó de la mezcla de reacción como su sal
de DCHA. Se aisló el precipitado, se disolvió en acetato de etilo
(50 mL) y se lavó con ácido cítrico acuoso al 5% (2 x 30 mL). Se
secó la capa orgánica (sulfato de magnesio) y se concentró a
presión reducida, para obtener 14 puro (rendimiento del 55%, 0,25
g).
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de diclorhidrato de
N-((D,L)-4-amidinofenilalanil)piperidina
(15) (0,13 g, 0,39 mmol) y derivado de cisteína 14 (0,16 g, 0,39
mmol) en dimetilformamida (2 mL), se le añadieron HOBt (58 mg, 0,42
mmol), EDCI (82 mg, 0,42 mmol) y N-etilmorfolina (110 \muL,
0,78 mmol). Después de agitar durante 16 h, se diluyó la mezcla con
diclorometano (20 mL) y se lavó con agua (2 x 10 mL). Se secó la
capa orgánica (sulfato de magnesio) y se concentró a vacío. Se
purificó el residuo por cromatografía en columna de gel de sílice
(primeramente metanol al 10%-20% en diclorometano para eliminar las
impurezas y luego con acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua
(16/7/1,6/4, v/v/v/v) para liberar producto) y posteriormente por
filtración por gel en Sephadex LH-20 (eluyente:
metanol/diclorometano, 4/1, v/v), para obtener 16 homogéneo (70%,
0,19 g).
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de decafosfato de maltotriosa 18
(21 mg, 9,8 \mumol) en tampón Na_{2}HPO_{4} 0,1 M (1,0 mL, pH
7,5), se le añadió una solución de
N-hidroxisuccinimidil-2-bromoacetato
en metanol (1 mL). Después de agitar durante 2 h, se aplicó la
mezcla de reacción a una columna Sephadex G25 eluida con
acetonitrilo al 10% en agua. Se juntaron las fracciones apropiadas
y se concentraron a presión reducida a baja temperatura (25ºC) para
obtener el compuesto 19. Se disolvió el análogo de NAPAP 16 (10 mg,
15 \mumol) en una mezcla de metanol (1 mL) y tampón
Na_{2}HPO_{4} 0,1M (0,75 mL, pH 7,0) desgasificado pasando a
través de helio y sonificando. Se añadió a esta solución
tributilfosfina (4,1 \muL, 16 \mumol) y se agitó la mezcla de
reacción bajo una atmósfera de argón. Después de 1 h, el análisis de
HPLC (columna Lichrospher® RP18) indicó una escisión completa del
grupo 2-piridinasulfenilo y se añadieron una
solución del compuesto 19 en dimetilformamida (0,25 mL) y tampón
Na_{2}HPO_{4} 0,1 M (0,50 mL, pH 7,0) a la mezcla de reacción.
Se agitó la mezcla durante 3 h, después de lo cual se purificó la
mezcla bruta por filtración por gel (Fractogel
HW-40, eluyente: TEAB 0,15 M). La concentración de
las fracciones apropiadas y el posterior intercambio iónico con
Dowex 50 WX-Na^{+} dieron tras la liofilización
el conjugado homogéneo I (10,1 mg, rendimiento del 47%). Se
separaron los dos diastereoisómeros por cromatografía en columna de
HPLC semipreparatoria (columna LiChrospher® RP-18,
gradiente: 17,5%-22,5% de CH_{3}CN en TEAA acuoso 0,05 M), para
obtener el diastereoisómero I-a (tiempo de
retención: 28,6 min.) y el diastereoisómero I-b
(tiempo de retención: 33,0 min.). Se desalaron los dos isómeros por
filtración por gel (Sephadex G-25
DNA-grade Superfine) y se transformaron en la forma
Na^{+} usando resina de intercambio iónico Dowex 50
WX-Na^{+}.
Diastereoisómero I-a: ^{1}H
RMN (D_{2}O, 600 MHz, HH-COSY):
maltotriosa: (extremo reductor) 4,65 (s amplio, 1H, H1),
3,85 (m, 1H, H2), 4,35 (m, 1H, H3), 3,76 (m, 1H, H4); 5,50 (s
amplio, 1H, H1'), 4,18 (m, 1H, H2'), 4,10 (m, 1H, H4'); (extremo no
reductor) 5,71 (s amplio, 1H, H1''), 4,09 (m, 1H, H2''), 4,45 (m,
1H, H3''), 4,15 (m, 1H, H4''); 3,95-3,84 (H5,
maltotriosa); espaciador: 3,65-3,51 (m, 22H,
OCH_{2} HEG), 3,35 (m'' 2H, CH_{2}NH_{2}), 3,15 (s, 2H,
SCH_{2} (O)); péptido: 8,31 (s, 1H, H_{arom}NAS),
8,06-7,67 (m, 6H, H_{arom} NAS), 7,70, 7,17 (2 x
d, 4H, H_{arom} APA, J=7,8 Hz), 4,28 (m, 1H, \alphaCH APA), 3,91
(m, 1H, \alphaCH Cys), 3,30-3,04 (m, 4H,
CH_{2}N piperidina), 2,82-2,62 (m, 3H,
\betaCH_{2} Cys, \betaCH APA), 2,57 (m, 1H, \betaCH' APA),
1,45-1,25 (m, 6H, CH_{2} piperidina);
ES-MS: [M-3H]^{3-} 724,1,
[M-2H]^{2-}
1086,7.
1086,7.
Diastereoisómero I-b: ^{1}H
RMN (D_{2}O, 600 MHz, HH-COSY):
maltotriosa: (extremo reductor) 3,80 (m, 1H, H2), 4,32 (m,
1H, H3), 3,89 (m, 1H, H4); 5,49 (s amplio, 1H, H1'), 4,22 (m, 1H,
H2'), 4,11 (m, 1H, H4'); (extremo no reductor) 5,70 (s amplio, 1H,
H1''), 4,22 (m, 1H, H2''), 4,52 (m, 1H, H3''), 4,24 (m, 1H, H4'');
3,91-3,84 (H5, maltotriosa); espaciador:
3,63-3,52 (m, 22H, OCH_{2} HEG), 3,35 (t'' 2H,
CH_{2}NH_{2}), 3,17 (AB, 2H, SCH_{2}(O));
péptido: 8,35 (s, 1H, H_{arom} NAS),
8,07-7,65 (m, 6H, H_{arom} NAS), 7,77, 7,22 (2 x
d, 4H, H_{arom} APA, J=7,8 Hz), 4,62 (t, 1H, \alphaCH APA,
J_{\alpha CH, \beta CH}=7,3 Hz), 4,05 (m, 1H, \alphaCH Cys),
3,05-3,00 (m, 4H, CH_{2}N piperidina),
2,85-2,67 (m, 4H, \betaCH_{2} Cys,
\betaCH_{2} APA), 1,88-1,24 (m, 6H, CH_{2}
piperidina); ES-MS:
[M-3H]^{3-} 724,0,
[M-2H]^{2-} 1086,2.
\newpage
Se disolvieron el espaciador 20 (0,75, 2,4 mmol)
(P. Westerduin y col., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996, 35, 3, pp.
331-333) y Aldrithiol^{TM} (2,6 g, 12,1 mmol) en
diclorometano (20 mL) y se trataron con
n-butilamina (4 mL). Después de agitar durante 2 h,
se concentró la mezcla de reacción a vacío, se volvió a disolver en
diclorometano (50 mL) y se lavó con ácido cítrico acuoso al 5% (2 x
50 mL). Se secó la capa orgánica y se concentró a presión reducida.
La cromatografía en columna de gel de sílice (metanol/ácido
acético/diclorometano, 0/1/99 a 6/1/93, v/v/v) del residuo dio 21
puro (0,80 g, rendimiento del 88%). Se disolvió el compuesto 21
(0,80 g, 2,1 mmol) en diclorometano (10 mL) y se añadieron
N-hidroxisuccinimida (0,26 g, 2,3 mmol) y EDCI
(0,45 mg, 2,3 mmol) a esta solución. Al cabo de 1 h, se diluyó la
mezcla de reacción diclorometano (50 mL), se lavó tres veces con
agua helada (20 mL), se secó (sulfato de magnesio) y se concentró
para obtener 22 (0,98 mg, rendimiento del 98%,), que fue usado sin
mayor
purificación.
purificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Preparada como se describe para 12, usando 23 y
cloruro de bencenosulfonilo como materiales de partida. (0,86 g,
rendimiento del 75%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se trató el compuesto 24 (0,86 g, 2,2 mmol) con
cloruro de hidrógeno 3 N en acetato de etilo. Después de 15 min.,
se concentró la mezcla de reacción a vacío. Se eliminaron las trazas
de ácido del residuo por coevaporación con tolueno. Se disolvió el
25 bruto en una mezcla de dioxano/agua (4/1, v/v, 2,5 mL) y se
añadieron a esta solución el compuesto 22 (0,98 g, 2,1 mmol) y
DiPEA (1,1 mL, 6,6 mmol). Después de 1 h, se diluyó la mezcla de
reacción con diclorometano (100 mL) y se lavó con ácido cítrico
acuoso al 5% (2 x 50 mL). Se secó la capa orgánica (sulfato de
magnesio) y se concentró a vacío. Se purificó el aceite residual por
cromatografía en columna de gel de sílice (metanol al
0-10%/acetato de etilo), para obtener 26 homogéneo
(0,95 g, rendimiento del 67%).
\vskip1.000000\baselineskip
Preparada como se describe para 16, usando 26 y
15 como materiales de partida. (87 mg, rendimiento del 70%).
\vskip1.000000\baselineskip
Preparado como se describe para I, usando 18 y
27 como materiales de partida. Se efectuó la purificación del II
bruto por HPLC semipreparatoria (columna LiChrospher®
RP-18). La posterior desalación por filtración por
gel (Sephadex G-25 DNA grade Superfine), la
transformación en la forma Na^{+} usando resina de intercambio
iónico Dowex 50 WX4-Na^{+} y la liofilización
dieron II puro como un sólido velloso blanco (8,5 mg, rendimiento
del 23% a partir de 18).
^{1}H RMN (D_{2}O, 600 MHz,
HH-COSY): maltotriosa: (extremo reductor)
4,67 (m, 1H, H1), 4,07 (m, 1H, H2), 4,40 (m, 1H, H3), 4,06 (m, 1H,
H4); 5,49 (s amplio, 1H, H1'), 4,24 (m, 1H, H2'), 4,66 (m, 1H, H3'),
4,10 (m, 1H, H4'); (extremo no reductor) 5,73 (s amplio, 1H, H1''),
4,17 (m, 1H, H2''), 4,38 (m, 1H, H3''), 4,22 (m, 1H, H4'');
3,95-3,82 (H5, maltotriosa); espaciador:
4,03, 4,02 (2 x s, 2H, OCH_{2}C(O)),
3,73-3,59 (m, 36H, OCH_{2} TEG, HEG), 3,38 (t,
2H, CH_{2}NH_{2}), 3,27, 3,26 (2 x s, 2H, SCH_{2} (O)), 2,75
(2 x t, 2H, CH_{2}S); péptido: 7,81-7,52
(m, 5H, H_{arom} BS), 7,79, 7,76, 7,42, 7,41, (4 x d, 4H,
H_{arom} APA), 4,87, 4,66 (2 x t, 1H, \alphaCH APA, J_{\alpha
CH, \beta CH}=7,4 Hz), 4,07 (m, 1H, \alphaCH Lys),
3,37-3,73 (m, 8H, \varepsilonCH_{2} Lys,
\betaCH_{2} APA, CH_{2}N piperidina),
1,96-1,46 (m, 12H, CH_{2} piperidina,
\beta/\gamma,\deltaCH_{2} Lys);
ES-MS: [M+3H]^{3+}
801,2, [M+2H]^{2+} 1200,8.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió el conocido pentasacárido 29 (53 mg,
49 \mumol) (R.C. Buijsman y col., Chem. Eur. J. 1996, 2, 12, pp.
1572-1577) en dimetilformamida (0,25 mL) y agua (1
mL) y se trató con N-(benciloxicarboniloxi)succinimida
(18 mg, 72 \mumol) y N-etilmorfolina (18,6 mL). Después de
agitar durante 15 min., el análisis por TLC (acetato de
etilo/piridina/ácido acético/agua, 5/7/1,6/4, v/v/v/v) reveló que la
reacción se había completado y se aplicó directamente la mezcla de
reacción a una columna RP-18, que fue eluida con
agua/metanol (90/10 a 60/40). Se juntaron las fracciones apropiadas
y se concentraron a un pequeño volumen y se aplicaron a una columna
de intercambio iónico Dowex 50 WX4-H en agua. Se
concentró el eluato a vacío para obtener 30 puro (54 mg,
rendimiento del 91%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió el compuesto 30 (54 mg, 45 \mumol)
en dimetilformamida (1 mL). Se añadió complejo de
trietilamina-trióxido de azufre (0,51 g, 5 equiv.
por cada grupo hidroxilo) y se agitó la mezcla bajo una atmósfera
de nitrógeno a 55ºC durante 16 h. Se enfrió la mezcla a continuación
a 0ºC y se añadió hidrógeno carbonato de sodio acuoso (5 equiv. por
cada eq. de complejo de trietilamina-trióxido de
azufre). Se agitó la mezcla durante 1 h, se concentró a un pequeño
volumen y se aplicó a una columna Sephadex G-25, que
fue eluida con acetonitrilo al 10% en agua. Se juntaron las
fracciones apropiadas y se concentraron a un pequeño volumen, que
fue luego pasado a través de una columna de Dowex 50 WX4 (forma
Na^{+}) eluida con agua. Se concentró el eluato y se redisolvió
en cloruro de hidrógeno 0,2 N (1 mL) y se dejó reposar durante 16 h
a 4ºC. Se neutralizó la mezcla de reacción con hidróxido de sodio
0,1 N y se desaló en una columna Sephadex G-25 y se
eluyó con acetonitrilo al 10% en agua para obtener 31 homogéneo. Se
disolvió el compuesto 31 en terc-butanol/agua (6/1,
v/v, 20 mL) que contenía unas cuantas gotas de ácido acético. Se
agitó la solución bajo una corriente continua de hidrógeno en
presencia de Pd al 10%/C (100 mg). Después de 3 h, se eliminó el
cata-
lizador de Pd/C por filtración y se concentró el filtrado a vacío, para obtener 32 puro (60 mg, rendimiento del 60%).
lizador de Pd/C por filtración y se concentró el filtrado a vacío, para obtener 32 puro (60 mg, rendimiento del 60%).
Se disolvió el pentasacárido 32 (15 mg, 6,5
\mumol) en tampón NaH_{2}PO_{4} 0,1 M (2 mL, pH 7,5) y se
añadió a esta solución sulfo-SIAB^{TM} (16 mg, 33
\mumol). Después de agitar durante 3 h en obscuridad, el análisis
de HPLC (intercambio aniónico monoQ) reveló que la reacción se había
completado y se purificó el 34 bruto en una columna Superdex 30
(acetonitrilo al 10% en agua). Se juntaron las fracciones apropiadas
y se concentraron a vacío a baja temperatura (25ºC). A una solución
de análogo de NAPAP 16 (9 mg, 14 \mumol) en una mezcla de metanol
(1 mL) y tampón Na_{2}HPO_{4} 0,1 M (0,75 mL, pH 7,0),
desgasificada por pase a través de helio y por sonicación antes de
su uso, se le añadió tributilfosfina (3,9 \muL, 15 \mumol).
Después de agitar durante 1 h bajo una atmósfera de argón, el
análisis de HPLC (columna Lichrospher® RP-18)
indicó una escisión completa del grupo
2-piridinasulfenilo. Se añadió una solución de
pentasacárido 34 derivatizado en dimetilformamida (0,25 mL) y
tampón Na_{2}HPO_{4} 0,1 M (0,50 mL, pH 7,0) y se agitó la
mezcla durante 3 h. Se aplicó el producto bruto a una columna
Sephadex G-50, que fue eluida con acetonitrilo al
10% en agua. Se juntaron las fracciones apropiadas, se concentraron
a un pequeño volumen y se desalaron en una columna Superdex 30, que
fue eluida con metanol al 10% en agua. La concentración y la
liofilización dieron el conjugado III como un sólido blanco (9 mg,
rendimiento del 52%).
^{1}H RMN (D_{2}O, 600 MHz,
HH-COSY): \delta 3,60, 3,53, 3,43 (3 x s, 9H,
CH_{3}O_{E,G,H}); anillo D: 5,53 (m, 1H, H1), 4,15 (m,
1H, H2), 4,58 (m, 1H, H3), 3,56 (m, 1H, H4), 3,92 (m, 1H, H5), 4,26,
4,13 (2 x m, 2H, H6, H6'); anillo E: 4,70 (d, 1H, H1,
J_{1,2}=8,1 Hz), 4,21 (m, 1H, H2), 3,62 (m, 1H, H3), 3,92 (m, 1H,
H4), 3,74 (m, 1H, H5); anillo F: 5,39 (d, 1H, H_{1},
J_{1,2}=3,8 Hz), 4,22 (m, 1H, H2), 4,56 (m, 1H, H3), 3,83 (t, 1H;
H4, J_{3,4}=J_{4,5}=9,8 Hz), 4,12 (m, 1H, H5); anillo G:
5,15 (s amplio, 1H, H1), 4,35 (m, 1H, H2), 3,76 (m, 1H, H3), 4,21
(m, 1H, H4), 4,80 (m, 1H, H5); anillo H: 5,10 (d, 1H,
H_{1}, J_{1,2}=3,6 Hz), 4,31 (m, 1H, H2), 4,54 (m, 1H, H3), 4,21
(m, 1H, H4); espaciador: 7,51, 7,53, 7,13, 712 (4 x d, 4H,
H_{arom} SIAB), 3,73 (m, 2H, CH_{2}CH_{2}NH_{2}), 3,66 (m,
12H, OCH_{2} TEG), 3,31 (m'' 2H, CH_{2}NH_{2});
péptido: 8,27, 8,22 (2 x s, 1H, H_{arom} NAS),
7,98-7,60 (m, 6H, H_{arom} NAS), 7,71, 7,64,
7,46, 7,44 (4 x d, 4H, H_{arom} APA), 4,60, 4,45 (2 x t, 1H,
\alphaCH APA, J_{\alpha CH, \beta CH}=6,6 Hz), 4,00, 3,97 (2 x
m, 1H, \alphaCH Cys), 3,10-2,85 (m, 4H, CH_{2}N
piperidina), 2,82-2,70 (m, 3H, \betaCH_{2} Cys,
\betaCH APA), 2,61 (m, 1H, \betaCH' APA),
1,55-1,15 (m, 6H, CH_{2} piperidina);
ES-MS:
[M-H]^{-} 2680,6
Usando métodos similares, se preparan los
siguientes compuestos:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinaron las actividades biológicas de
los compuestos de la presente invención por los siguientes métodos
de ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
La trombina (Factor IIa) es un factor de la
cascada de coagulación de la sangre.
Se valoró la actividad antitrombina de los
compuestos de la presente invención midiendo
espectrofotométricamente la velocidad de la hidrólisis del
substrato cromogénico s-2238 ejercida por la
trombina. Este ensayo para la actividad antitrombina en un sistema
tampón fue usado para valorar el valor de la CI_{50} de un
compuesto de ensayo.
Medio de ensayo: Tampón
trometamina-NaCl-polietilenglicol
6000 (TNP).
Compuesto de referencia: I2581
(Kaki).
Vehículo:
\hskip0,5cmTampón TNP.
- \quad
- La solubilización puede estar asistida con sulfóxido de dimetilo, metanol, etanol, acetonitrilo o alcohol terc-butílico, que no tienen efectos adversos en concentraciones de hasta el 2,5% en la mezcla de reacción final.
\newpage
Técnica\hskip0,5cmReactivos*
- 1.
- Tampón trometamina-NaCl (TN)
- \quad
- Composición del tampón:
- Trometamina (Tris)
- 6,057 g (50 mmol)
- NaCl
- 5,844 g (100 mmol)
- Agua
- hasta 1
- \quad
- Se ajusta el pH de la solución a 7,4 a 37ºC con HCl (10 mmol\cdotl^{-1}).
- 2.
- Tampón TNP
- \quad
- Se disuelve polietilenglicol 6000 en tampón TN para obtener una concentración de 3 g\cdotl^{-1}.
- 3.
- Solución de S-2238
- \quad
- Se disuelve un vial de S-2238 (25 mg; Kabi Diagnostica, Suecia) en 20 ml de tampón TN para obtener una concentración de 1,25 mg\cdotml^{-1} (2 mmol\cdotl^{-1}).
- 4.
- Solución de trombina
- \quad
- Se disuelve trombina humana (16.000 nKat\cdotvial^{-1}; Centraal Laboratorium voor Bloedtransfusie, Amsterdam, Países Bajos) en tampón TNP para obtener una solución stock de 835 nKat\cdotml^{-1}.
- \quad
- Inmediatamente antes de su uso, se diluye esta solución con tampón TNP para obtener una concentración de 3,34 nKat\cdotml^{-1}.
- *
- - Todos los ingredientes usados son de grado analítico.
- \quad
- - Para las soluciones acuosas, se usa agua ultrapura (calidad Milli-Q).
- \quad
- \underbar{Preparación de las soluciones de los compuestos de ensayo y de referencia}
- \quad
- Se disuelven los compuestos de ensayo y de referencia en agua Milli-Q para obtener concentraciones stock de 10^{-2} mol\cdotl^{-1}. Se diluye cada concentración por pasos con el vehículo para obtener concentraciones de 10^{-3}, 10^{-4} y 10^{-5} mol\cdotl^{-1}. Se usan las diluciones, incluyendo la solución stock, en el ensayo (concentraciones finales en la mezcla de reacción: 3\cdot10^{-3}, 10^{-3}, 3\cdot10^{-4}, 10^{-4}, 3\cdot10^{-5}, 10^{-5}, 3\cdot10^{-6} y 10^{-6} mol\cdotl^{-1}, respectivamente).
- \quad
- \underbar{Procedimiento}
- \quad
- A temperatura ambiente, se pipetean alternativamente 0,075 ml y 0,025 ml de soluciones de compuesto de ensayo o de compuesto de referencia o de vehículo en los pocillos de una placa de microtitulación y se diluyen estas soluciones con 0,115 ml y 0,0165 ml de tampón TNP, respectivamente. Se añade una alícuota de 0,030 ml de solución de S-2238 a cada uno de los pocillos y se precalienta la placa y se preincuba con agitación en una incubadora (Amersham) durante 10 min. a 37ºC. Tras la preincubación, se inicia la hidrólisis de S-2238 por adición de 0,030 ml de solución de trombina a cada pocillo. Se incuba la placa (con agitación durante 30 s) a 37ºC. Comenzando después de 1 min. de incubación, se mide la absorbancia de cada muestra a 405 nm cada 2 min. durante un período de 90 min. usando un lector de placas de microtitulación cinético (Twinreader plus, Flow Laboratories).
- \quad
- Se recogen todos los datos en un ordenador personal IBM usando LOTUS-MEASURE. Para cada concentración de compuesto (expresada en mol\cdotl^{-1} de mezcla de reacción) y para el blanco, se representa la absorbancia frente al tiempo de reacción en min.
Evaluación de las respuestas:
Para cada concentración final, se calculó la
absorbancia máxima a partir del gráfico de ensayo. Se calculó el
valor de la CI_{50} (concentración final, expresada en
\mumol\cdotl^{-1}, que causa el 50% de inhibición de la
absorbancia máxima del blanco) usando el análisis de transformación
de logit según Hafner y col. (Arzneim.-Forsch./Drug Res. 1977;
27(II): 1871-3).
\newpage
Actividad antitrombina:
\vskip1.000000\baselineskip
El factor X (Xa) activado es un factor en la
cascada de la coagulación. Se valoró la actividad
anti-Xa de los compuestos de la presente invención
por medición espectrofotométrica de la velocidad de hidrólisis del
substrato cromogénico s-2222 ejercida por Xa. Se usó
este ensayo para la actividad anti-Xa en un sistema
tampón para valorar el valor de la CI_{50} del compuesto de
ensayo.
En general, el procedimiento seguido y las
condiciones de ensayo eran análogos a los del ensayo de
antitrombina antes descrito. A continuación se indican las
diferencias.
Compuesto de referencia: benzamidina.
Vehículo: \hskip0,5cm tampón TNP.
- \quad
- La solubilización puede estar asistida con sulfóxido de dimetilo, metanol, etanol, acetonitrilo o alcohol terc-butílico, que no tienen efectos adversos en concentraciones de hasta el 1% (para el DMSO) el 2,5% (para los otros solventes) en la mezcla de reacción final.
Técnica\hskip0,5cmReactivos*
- 3.
- Solución S-2222
- \quad
- Se disuelve un vial de S-2222 (15 mg; Kabi Diagnostica, Suecia) en 10 ml de agua para obtener una concentración de 1,5 mg\cdotml^{-1} (2 mmol\cdotl^{-1}).
- 4.
- Solución de Xa
- \quad
- Se disuelve factor Xa bovino humano (71 nKat\cdotvial^{-1}; Kabi Diagnostica) en 10 ml de tampón TNP y se diluye después además con 30 ml de tampón TNP para obtener una concentración de 1,77 nKat\cdotml^{-1}. La dilución ha de estar recién preparada.
- \quad
- \underbar{Procedimiento}
- \quad
- En lugar de la solución de S-2238 (en el ensayo de antitrombina), se añade la anterior solución de S-2222 a cada pocillo en este ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Actividad anti-factor Xa:
Claims (10)
1. Un compuesto de fórmula (I)
donde
R^{1} es fenilo, naftilo,
1,2,3,4-tetrahidronaftilo, (iso)quinolinilo,
tetrahidro(iso)quinolinilo,
3,4-dihidro-1H-isoquinolinilo,
cromanilo o el grupo alcanfor, cuyos grupos pueden estar
eventualmente substituidos con uno o más substituyentes
seleccionados entre alquilo(1-8 C) o alcoxi
(1-8 C);
R^{2} y R^{3} son independientemente H o
alquilo (1-8 C);
R^{4} es alquilo (1-8 C) o
cicloalquilo (3-8 C);
o R^{3} y R^{4}, junto con el átomo de
nitrógeno al que están unidos, son un anillo no aromático de
(4-8) miembros que contiene eventualmente otro
heteroátomo, estando el anillo eventualmente substituido con
alquilo(1-8 C) o
SO_{2}-alquilo(1-8 C);
Q es un espaciador que tiene una longitud de
cadena de 10 a 70 átomos; y
Z es un residuo de oligosacárido cargado
negativamente que tiene de dos a seis unidades de monosacáridos,
estando compensada la carga por contraiones de carga positiva;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo
o un derivado del mismo en donde el grupo amino del resto amidino
está protegido, v.g., por hidroxi o por un grupo
alcoxi(1-6 C)carbonilo.
2. El compuesto de la reivindicación 1, donde Z
deriva de un oligosacárido que tiene per se actividad
anti-Xa mediada por AT-III.
3. El compuesto de la reivindicación 2, donde Z
es un residuo de pentasacárido.
4. El compuesto de la reivindicación 3, donde Z
tiene la fórmula (II)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde R^{5} es independientemente
OSO_{3}^{-} o alcoxi(1-8
C).
5. El compuesto de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, donde R^{1} es fenilo,
4-metoxi-2,3,6-trimetilfenilo
o naftilo; R^{2} es H, y NR^{3}R^{4} representa el grupo
piperidinilo.
6. El compuesto de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, donde Q tiene la fórmula (III)
(III),-[(CH_{2})_{2}O]_{m}-[(CH_{2})_{m}-NR^{3}-C(O)]_{p}-W-(CH_{2})_{s}-
donde
W es
-[1,4-fenilen-NR^{3}-C(O)]_{q}-(CH_{2})_{r}-S-
o
-(CH_{2})_{t}-S-(CH_{2})_{u}-[O(CH_{2})_{2}]_{v}-O-(CH_{2})_{w}-C(O)-NR^{3}-;
y R^{3} es independientemente H o
alquilo(1-8 C);
m = 1-12; n =
1-8; p = 0-4; q = 0 ó 1; r =
1-8; s = 1-8; t =
1-8; u = 1-8; v =
1-12; w = 1-8; el número total de
átomos es 10-70; y el resto
-[(CH_{2})_{2}O]_{m}- es el extremo con el que Q
se une a Z.
7. El compuesto de la reivindicación 6, donde Q
es seleccionado entre
-
[(CH_{2})_{2}O]_{5}-(CH_{2})_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-S-CH_{2}-,
-
[(CH_{2})_{2}O]_{5}-(CH_{2})_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-S-(CH_{2})_{2}-[O(CH_{2})_{2}]_{3}-O-CH_{2}-C(O)-NH-(CH_{2})_{4}-
y
-
[(CH_{2})_{2}O]_{3}-(CH_{2})_{2}-NH-C(O)-1,4-fenilen-NH-C(O)-CH_{2}-S-CH_{2}-.
8. Una composición farmacéutica que contiene el
compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y auxiliares
farmacéuticamente adecuados.
9. El compuesto de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 para uso en terapia.
10. Uso del compuesto de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 para la fabricación de un medicamento para
tratar o prevenir la trombosis u otras enfermedades relacionadas con
la trombina.
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