MXPA02005278A - Compuesto antitrombotico - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a compuestos de la fórmula (I), en dondeR es independientemente SO3 o CH3;el espaciador es un espaciador flexible de una longitud de 13-25átomos;la carga del residuo de pentasacárido se compensa por contraiones positivamente cargados;y el número total de grupos sulfato en el residuo de pentasacárido es 4,5 o 6;o una sal farmacéuticamente aceptable, un profármaco o un solvato de los mismos. Los compuestos de la invención tienen actividad antitrombótica y pueden utilizarse para tratar o prevenir enfermedades relacionadas con trombina.

Description

CO PUESTO ANTITROMBOTICO La invención se refiere a un nuevo compuesto antitrombótico, una composición farmacéutica que comprende el compuesto como un ingrediente activo, así como también al uso de dicho compuesto para la elaboración de medicamentos. Las proteasas de serina son enzimas que juegan un papel importante en la cascada de coagulación sanguínea. Una proteasa de serina importante es el factor Xa, que cataliza la conversión de protrombina en trombina. La trombina es la enzima de proteasa de serina final en la cascada de coagulación. La función principal de la trombina es la separación de fibrinogen para generar monómeros de fibrina, que se degradan para formar un gel insoluble. Además, la trombina regula su propia producción mediante la activación de los factores V y Vil anteriores en la cascada. También tiene acciones importantes en nivel celular, en donde actúa en receptores específicos para causar la agregación de plaqueta, activación de la célula endotelial y proliferación de fibroblasto. De esta manera, la trombina tiene un papel regulador central en hemostasis y formación de trombo. En el desarrollo de inhibidores sintéticos de proteasas de serina, recientemente un conjugado de NAPAP-pentasacárido sintético se ha reportado como antitrombótico teniendo un perfil doble de tanto actividad anti-trombina directa como actividad anti-Xa mediada por ATI 11 (ATIII: antitrombina lll) (Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999, 9(14), 2013-8). Aunque el antitrombótico reportado puede ser un compuesto interesante, la reactividad cruzada HIT y neutralización por PF4 se asociarán con este compuesto debido al contenido elevado de sulfato del residuo de pentasacárido (Thromb, Haem. Suppl. 1997, p363 PD1485). Se ha encontrado ahora que los compuestos de la fórmula (I) son antitrombóticos que tienen un excelente y ventajoso perfil doble. Los compuestos de la fórmula (I) tienen una vida promedio interesante farmacológica, que permiten el tratamiento una vez al día, y se neutralizan duramente por PF4. Además, los riesgos de sangrado son bajos. En conjunto, los compuestos de la fórmula (I) tienen una combinación atractiva de propiedades farmacológicas. Fórmula (I): [espaciador] en donde R es independientemente SO3' o CH3; el espaciador es un espaciador flexible de una longitud de 13-25 átomos, preferentemente de 16-22 y más preferido de 19 átomos: la carga del residuo de pentasacárido se compensa por contraiones positivamente cargados; y el número total de grupos sulfato en el residuo de pentasacárido es 4, 5 o 6; o una sal farmacéuticamente aceptable, un profármaco o un solvato de los mismos. Los compuestos de la presente invención son útiles para tratar y prevenir las enfermedades asociadas a trombina y mediadas por trombina. Esto incluye un número de estados protrombóticos y trombóticos en los cuales la cascada de coagulación se activa, que incluye, pero no se limita a, trombosis de vena profunda, embolismo pulmonar, tromboflebitis, oclusión arterial de trombosis o embolismo, reoclusión arterial durante o después de angioplastía o trombolísis, restenosis después de la lesión arterial o procedimientos cardiológicos invasivos, embolismo o trombosis venosa postoperativa, ateroesclerosis crónica o aguda, apoplejía, infarto miocardial, cáncer y metástasis, y enfermedades neurodegenerativas. Los compuestos de la invención también pueden utilizarse como anticoagulantes en circuitos sanguíneos extracorporales, como sea necesario en diálisis y cirugía. Los compuestos de la invención también pueden utilizarse como anticoagulantes in vitro. Los compuestos de la fórmula (I) son específicamente útiles como antitrombóticos para indicaciones arteriales. Los compuestos preferidos de acuerdo a la invención son compuestos en donde el residuo de pentasacárido tiene la estructura: La naturaleza química del espaciador es de menor importancia para la actividad anti-trombótica de los compuestos de la invención. Sin embargo, el espaciador de los compuestos de la invención es flexible, lo que significa que el espaciador no contiene elementos rígidos, tales como enlaces no saturados o estructuras cíclicas. Los espaciadores adecuados pueden designarse fácilmente por una persona experta en la materia. Los espaciadores preferidos contienen al menos un elemento -(CH2CH2O)-. Los espaciadores más preferidos contienen tres elementos -(CH2CH2O)-. El espaciador más preferido es *-(CH2CH2O)3-(CH2)2-NH-C(O)-(CH2)3-NH-C(O)-CH -, el final indicado con * uniéndose al residuo de pentasacárido. Los compuestos preferidos de la fórmula I son los compuestos de la fórmula (la), en donde p es 1 -5, n es 1-5 y m es 1 o 2. El compuesto más preferido es el compuesto de la fórmula (la), en donde p es 3, n es 3 y m es 1.

Un contraión cargada positivamente significa H+, Na+, K+> Ca2+ y lo similar. Preferentemente, los compuestos de la fórmula (I) se encuentran en la forma de su sal de sodio. El término "profármaco" significa un compuesto de la invención en el cual el grupo amino de la porción de amidino se protege, por ejemplo, por hidrozoo o un grupo (1 -6C)alcoxicarbonilo. Los solvatos de acuerdo con la invención incluyen hidratos. Los compuestos de la invención, que pueden ocurrir en la forma de una base libre, pueden aislarse de la mezcla de reacción en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Las sales farmacéuticamente aceptables también pueden obtenerse al tratar la base libre de fórmula (I) con un ácido orgánico o inorgánico tal como cloruro de hidrógeno, bromuro de hidrógeno, yoduro de hidrógeno, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido propiónico, ácido glucólico, ácido maléico, ácido malónico, ácido metanosulfónico, ácido fumárico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido ascórbico y lo similar. Los compuestos de esta invención poseen átomos de carbono quirales, y pueden por lo tanto obtenerse como un enantiómero puro, o como una mezcla de enantiómeros, o como una mezcla que contiene diastereómeros. Los métodos para obtener los enantiómeros puros se conocen bien en la materia, por ejemplo, cristalización de sales que se obtienen de ácidos ópticamente activos y la mezcla racémica, o cromatografía utilizando columnas quirales. Para diastereómeros pueden utilizarse columnas de fase inversa o fase recta. Los compuestos de la presente invención pueden prepararse al activar primero el grupo carboxilato del análogo NAPAP de la fórmula II y subsecuentemente la adición de un residuo espaciador de pentasacárido que contiene un grupo amina (fórmula lll), opcionalmente seguido por la desprotección de la porción de amidina.

El grupo carboxilato en compuestos de la fórmula II puede activarse como un anhídrido mezclado o más preferentemente como un éster activado tal como el éster de N-hidroxisuccinimida, pentafluorofenol o 1 -hidroxibenzotriazol. En la etapa de acoplamiento, el grupo benzamida en la fórmula II puede ser (R'=R"=H) desprotegido, o puede protegerse opcionalmente utilizando un grupo carbamato preferentemente aliloxicarbonilo (R' y/o R" es H2C=CH-CH-C(O)O) o benciloxicarbonilo (R' y/o R" es PhCH2-C(O)O). Los grupos protectores benciloxicarbonilo o aliloxicarbonilo pueden removerse bajo condiciones relativamente suaves. El grupo aliloxicarbonilo puede removerse utilizando Pd en la presencia de un nucleófilo débil tal como morfolina o un éster malónico. El grupo benciloxicarbonilo puede removerse bajo condiciones tales como hidrógeno/Pd(C). Alternativamente, los precursores sintéticos de benzamidina tal como N-alcoxibenzamidina o N-benciloxibenzamida o N-benciloxibenzamidina (R'=H, R"=alcoxi o benciloxi) pueden aplicarse. Estos precursores sintéticos pueden transformarse en benzamidina utilizando condiciones reductivas tal como hidrogenación (por ejemplo, Fujii, T et al., Chem. Pharm. Bull, 39, 301 , 1991 y Fujii, T er al., Chem. Pharm. Bull, 42, 1231 , 1994). El precursor de benzamidina preferido es 1 ,2,4-oxadiazolin-5-ona (-R'-R"-=-C(O)O-). Este precursor puede convertirse en la benzamidina por hidrogenación (Bolton, R.E. et al., Tetrahedron Letters, Vol 36, No 25, 1995, pp 4471-4474). Los compuestos de la fórmula II pueden prepararse en varias maneras utilizando métodos conocidos en la materia. Un método para preparar compuestos de la fórmula II en donde R'=R"=H; n es 3 y m es 1 se describe en EP 0513543. Los compuestos de la fórmula II en los cuales la amidina se protege, por ejemplo con un grupo aliloxicarbonilo o benciloxicarbonilo puede prepararse de compuestos de la fórmula IV en donde la amidina se protege con un grupo aliloxicarbonilo o benciloxicarbonilo utilizando métodos comúnmente conocidos en la materia para el acoplamiento de fragmentos de péptido. Los carbamatos de la fórmula IV pueden, por ejemplo, prepararse de la amidina correspondiente (fórmula IV, R'=R"=H) como se describe en la literatura, por ejemplo Séller, T et al., J. Med. Chem. 39, 3119, 1996).

Los compuestos de N-alcoxibenzamidina y N-benciloxibenzamidina de la fórmula II pueden prepararse del compuesto V (descrito en EP 0513543) por tratamiento de este compuesto ciano con O-alquil-hidroxilamina u O-bencil-hidroxilamina seguido por el retiro del éter de t-butilo utilizando condiciones acidas. Alternativamente, los compuestos de N-alcoxibenzamidina y N-benciloxibenzamidina de la fórmula II pueden prepararse al retirar primero el éster de t-butilo del compuesto V utilizando condiciones acidas para producir el compuesto VI y la reacción subsecuente de este compuesto ciano con O-alquil-hidroxilamina u O-bencil-hidroxilamina. Los compuestos de la fórmula II en la cual -R'-R'-=-C(O)O- (el grupo 1 ,2,4-oxadiazolin-5-ona), pueden prepararse de compuestos de la fórmula V en la cual -R'-R"-=-C(O)O, utilizando métodos conocidos en la materia para acoplar los fragmentos de péptido. La síntesis de residuos del espaciador de amino-oligosacárido de la fórmula ll l puede, por ejemplo, realizarse al utilizar métodos descritos en EP 0649854. Los residuos de sacárido de los compuestos de la presente invención pueden prepararse de acuerdo con procedimientos conocidos en la materia, por ejemplo, de WO 99/25720. El acoplamiento de péptido, una etapa del procedimiento en el método arriba descrito para preparar los compuestos de la invención, puede llevarse a cabo por métodos comúnmente conocidos en la materia para el acoplamiento, o condensación, de fragmentos de péptido tal como por el método de azida, método de anhídrido mezclado, método de éster activado, o, preferentemente, por el método de carbodiimida, especialmente con la adición de compuestos que suprimen la racemización y catalíticos como N-hidroxisuccinimida y N-hidroxibenzotriazola. Un resumen se da en The Peptides. Analvsis, Svnthesis, Bioloov. Vol. 3, E. Groos y J . Meienhofer, eds. (Academic Press, Nueva York, 1981 ) y Bodanszky, M. ; Principies of peptide synthesis, Sprinher-Verlag, 1984. Las funciones de amina presentes en los compuestos pueden protegerse durante el procedimiento sintético por un grupo protector N, que significa un grupo comúnmente utilizado en química de péptido para la protección de un grupo a-amino, como el grupo rerí-butiloxicarbonilo (Boc), el grupo benciloxicarbonilo (Z), el grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc) o el grupo eftaloil (Phth). El retiro de los grupos protectores puede tener lugar en diferentes maneras, .dependiendo de la naturaleza de aquellos grupos protectores. Usualmente la desprotección tiene lugar bajo condiciones acidas y en la presencia de limpiadores. Un resumen de grupos protectores amino y métodos para su retiro se da en la arriba mencionada The Peptides, Analysis, Svnthesis, Bioloqy, Vol 3, y además como se describe por Greene, T.W. y Wuts, P.G.M. en Protective groups in organic synthesis, John Wiley & Sons Inc, 1991 . Los compuestos de la invención pueden administrarse entéricamente o parenteralmente. La dosis exacta y régimen de estos compuestos y composiciones de los mismos necesariamente dependerán de las necesidades del sujeto individual a quien el medicamento se administra, el grado de aflicción o necesidad y el juicio del médico. En general, la administración parenteral requiere dosis inferiores que otros métodos de administración que son más dependientes de la absorción. Sin embargo, las dosis diarias son para humanos preferentemente 0.001 -100 mg por kg de peso corporal, más preferentemente 0.01-10 mg por kg de peso corporal. El medicamento fabricado con los compuestos de esta invención también puede utilizarse como adyuvante en terapia anticoagulante aguda. En tal caso, el medicamento se administra con otros compuestos útiles para tratar tales estados de enfermedad. Mezclados con auxiliares farmacéuticamente adecuados, por ejemplo, como se describe en la referencia estándar Gennaro et al., Remington's Pharmaceutical Sciences, (18ava ed, Mack Publishing Company, 1990, ver especialmente la Parte 8: Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture), los compuestos pueden comprimirse en unidades dosis sólidas, tales como pildoras, tabletas, o procesarse en cápsulas o supositorios. Por medio de líquidos farmacéuticamente adecuados los compuestos también pueden aplicarse en la forma de una solución, suspensión, emulsión, por ejemplo, para utilizarse como una preparación de inyección, o como un rociador, por ejemplo, para utilizare como un rociador nasal. Para hacer unidades de. dosis, por ejemplo, tabletas, se contempla el uso de aditivos convencionales tales como rellenos, colorantes, aglutinantes poliméricos y lo similar. En general, cualquier aditivo farmacéuticamente aceptable que no interfiere con la función de los compuestos activos puede utilizarse. Los vehículos adecuados con los cuales las composiciones pueden administrarse incluyen lactosa, almidón, derivados de celulosa y lo similar, o mezclas de los mismos, utilizados en cantidades adecuadas. La invención se ilustra además por los siguientes ejemplos. EJEMPLO 1 Abreviaciones utilizadas: Ac = acetilo Bn = bencilo DBU = 1 ,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno DCC = diciciohexilcarbodiimida DMF = N , N-dimetilformamida Su = succinimidilo Me = metilo TBTU = tetrafluoroborato de 2-(1 H-benzotriazol-1 -il)-1 , 1 ,3,3- tetrametiluronio TEA = trietilamina TFA = ácido trifluoroacético Z = benciloxicarbonilo Los números de los compuestos se refieren a los compuestos en los esquemas 1 a 7. Compuesto 3 A una solución agitada del compuesto 1 (53.6 g, 143.6 mmol) (R. Roy; W. K.C. Park; Q. Wu; S-N. Wang, Tetrahedron Lett. , 1995, 36(25), 4377-80) y el compuesto 2 (27.9 g, 89.3 mmol) (S.J. Danishefsky; M.P.

DeNinno; G. B. Philips; R. E. Zelle, Tetrahedron, EN, 1986, 42, 1 1 , 2809- 2819) en 930 mL de DMF se agrega hidróxido de sodio (7,7 g, 60% de dispersión, 192.2 mmol) a 50°C. Después de 1 h, la mezcla de reacción se calienta a 120°C. Después de agitar por 5 minutos la mezcla de reacción se enfría a 40°C y diluye con agua y extrae tres veces con metano de dicloro. Las capas orgánicas combinadas se enjuagan con agua y concentran in vacuo, produciendo el producto crudo 3 (54 g). TLC: Rf = 0.23, éter 100%. Compuesto 4 A una solución agitada del compuesto 3 (89.3 mmol) en 800 mL de tolueno seco y 800 mL de anhídrido acético se agrega gota a gota una solución fría de 361.5 mL de ácido sulfúrico en anhídrido acético (16.5 mL de ácido sulfúrico concentrado y 345.0 mL de anhídrido acético) a -30°C. Después de 2 h la mezcla de reacción se enfría con 240 mL de TEA y agita a temperatura ambiente. A la solución se agrega carbonato de hidrógeno de sodio acuoso (5%) y la capa de agua se extrge tres veces con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se enjuagan dos veces con agua y concentran in vacuo. Este procedimiento se repite, resultando en el compuesto crudo 4 (53 g). TLC: Rf = 0.29, éter 100%. Compuesto 5 A una solución agitada del compuesto 4 (89.3 mmol) y etanotiol (1 1.1 mL, 150.3 mmol) en 370 mL de tolueno seco se agrega gota a gota una solución de BF3-eterato en tolueno (23.9 mL BF3-eterato y 190 mL de tolueno) a 0°C. Después de agitar por 16h a temperatura ambiente la mezcla de reacción se enfría con TEA y carbonato de hidrógeno de sodio acuoso y extrae tres veces con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se enjuagan con agua y concentran in vacuo. El producto crudo se purifica por cromatografía de columna (tolueno/acetato de etilo = 1/1 a 0/1 , v/v) dando el compuesto 5 (21.4 g). TLC: Rf = 0.31 , tolueno/acetato de etilo = 4/6, v/v. Compuesto 7 A una solución de donador 5 (15.0 mg, 30.3 mmol) y aceptador 6 (23.0 g, 30.3 mmol (WO 99/25720) en éter secp/diclorometano (232 mL, 3/1 , v/v) se agita por 30 minutos bajo un flujo de nitrógeno en la presencia de cribas moleculares activadas 4Á (7.6 g). Después una solución de 1 ,3-dibromo-5,5-dimetilh¡ndatoina (5.5 g, 19.1 mmol) y ácido tríflico (0.49 mL; 5.6 mmol) en dioxano/diclorometano (69.8 mL, 1/1 , v/v) se agrega gota a gota en 75 min a la mezcla de reacción a -20°C. Después de 30 minutos TEA (5 mL) se agrega a la mezcla de reacción, que se agita por 10 minutos y después se filtra. El filtrado se enjuaga con tiosulfato de sodio acuoso (10%) y carbonato de hidrógeno de sodio acuoso (10%) y concentra in vacuo. El producto se purifica por cromatografía de columna (0 a 5% de acetona en diclorometano) dando el compuesto 7 (19.6 g). TLC: Rf - 0.1 , éter/heptano = 8/2, v/v. Compuesto 8 A una solución agitada de compuesto 7 (19.5 g, 16.4 mmol) en tolueno seco/anhídrido acético (442 mL, 1/1 , v/v) se agrega gota a gota una solución fría de 131.5 mL de ácido sulfúrico en anhídrido acético (1 1.5 mL de ácido sulfúrico y 120 mL de anhídrido acético) a -26°C. Después de 75 minutos TEA (73.5 mL) se agrega a -20°C. El anhídrido acético se descompone al agregar gradualmente 330 mL de agua manteniendo la temperatura entre 25°C y 30°C. Después de agitar por 16h la mezcla se vierte en 800 mL de agua y extrae dos veces con tolueno. Las capas orgánicas combinadas se enjuagan con agua y concentran in vacuo. El producto crudo se purifica por cromatografía de columna (tolueno/acetato de etilo/etanol = 96/2/2, v/v/v) dando 8 como una espuma blanca (13.2 g). TLC: Rf = 0.29, tolueno/etanol = 9/1 , v/v. Compuesto 9 A una solución de compuesto 8 (13.2 g, 1 1 .7 mmol) en tolueno seco (66 mL) a 32°C se agrega morfolina (4.1 mL, 46.9 mmol). Después de agitar por 42h a 32CC la mezcla de reacción se enfría a temperatura acuosa y ácido hidroclórico acuoso (17.6 mL, 4N) se agrega. La mezcla se diluye con agua y extrae dos veces con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se enjuagan dos veces con agua, secan en sulfato de sodio y concentran in vacuo produciendo el compuesto crudo 9 (12.6 g). Compuesto 12 A una solución de compuesto 9 (12.6 g, 11.6 mmol) en diclorometano (114 mL) se agrega tricloroacetonitrilo (3.5 mL, 34.9 mmol) y DBU (52.2 µL, 0.35 mmol). Después de agitar por 2h a temperatura ambiente las cribas moleculares activadas 4Á (24 g) y aceptador 11 (8.9 g, 13.0 mmol) (WO 99/25720) en diclorometano (45 mL) se agregan a la mezcla de reacción. Después de agitar por 30 minutos a temperatura ambiente, la mezcla se enfría a -20°C y una solución de trifluorometanosulfonato de trimetilsililo (405 µL, 2.1 mmol) en diclorometano (100 mL) se agrega gota a gota. Después de agitar 30 minutos se agrega carbonato de hidrógeno de sodio a -20°C y la mezcla de reacción se filtra. El filtrado se vierte en carbonato de hidrógeno de sodio acuosos y se extrae tres veces con diclorometano. Las capas orgánicas combinadas se enjuagan dos veces con agua y concentran in vacuo. El producto se purifica por cromatografía de columna (1 : SIO2: 0-10% acetona en éter; 2: SiO2 tolueno/acetona = 85/15 a 80/20, v/v; 3: RP-18: agua/acetonitrilo = 2/8 a 0/10, v/v) produciendo el compuesto puro 12 (8.9 g). TLC: Rf = 0.37, tolueno/acetona = 7/3, v/v. Compuesto 14 Una suspensión de compuesto 12 (8.9 g, 5.1 mmol) y 10% Pd/C (8.9 g) en 312 mL de DMF y 45 mL de agua se agita bajo una corriente continua de hidrógeno. Después de 4.5h el catalizador Pd/C se remueve por filtración. El filtrado se concentra a un volumen de 400 mL y trata con 10% Pd/C (1.5 g) bajo una corriente de hidrógeno por 5.5 h. El catalizador se remueve por filtración. Al filtrado (900 mL) se agrega hidróxido de sodio acuoso (32 mL, 4N). Después de agitar por 4h a temperatura ambiente la mezcla se acidifica a pH=6.6, con 1 N de ácido hidroclórico y después se concentra in vacuo. El producto crudo se desala en una columna Sephadex G-25 que se eluye con agua. Las fracciones apropiadas se agrupan y liofilizan produciendo el compuesto 14 (4.0 g)-Compuesto 15 Pentasacárido 14 (700 mg, 0.61 mmol) se disuelve en agua (13.2 mL) y DMF (3.3 mL) y trata con N-(benciloxicarboniloxi)-succinimida (224 mg, 0.90 mmol) y N-etílmorfolina (233 µL, 1.83 mmol). Después de agitar por 15 minutos la mezcla de reacción se aplica directamente en una columna RP-18, que se eluye con agua/acetonitrilo 10/0 a 7/3. Las fracciones apropiadas se agrupan y concentran a un volumen pequeño y aplican sobre una columna de intercambio de ion Dowex 50 WX4-H+ en agua. El eluato se concentra in vacuo para producir el puro 15 (482 mg). Compuesto 16 A una solución de compuesto 15 (471 mg, 0.37 mmol) en DMF (4.7 mL) se agrega complejo de trióxido de sulfuro-piridina (1.1 g, 6.6 mmol) y la mezcla se agita por 16h a 30°C. La mezcla se enfría a temperatura ambiente y agrega gota a gota a una solución de carbonato de hidrógeno al 10% fría (16.7 mL, 19.9 mmol) y agita por 1 h a temperatura ambiente. La mezcla se concentra a un volumen pequeño y aplica sobre una columna Sephadex G-25, que se eluye con agua. Las fracciones apropiadas se agrupan y concentran a un volumen pequeño, que se pasa subsecuentemente a través de una columna de Dowex Na+ HCRW2 eluida con agua. El eluato se concentra y redisuelve en 8.3 mL de 0.2N de ácido hidroclórico y se deja mantener por 16h a 4°C. La mezcla de reacción se neutraliza con 8 mL de 0.2N de hidróxido de sodio y desala en una columna Sephadex G-25 que se eluye con agua. Las fracciones apropiadas se agrupan y concentran in vacuo produciendo el compuesto puro 16 (840 mg). Compuesto 17 Una suspensión de compuesto 16 (0.37 mmol) y 10% de Pd/C (820 mg) en fe/7-butanol (85 mL) y agua (79 mL) y unas pocas gotas de ácido acético se agita bajo una corriente continua de hidrógeno. Después de 3h el catalizador Pd/C se remueve por filtración y el filtrado se concentra y liofiliza dando el puro 17 (675 mg). 4-[[4-[[(1 R)-1 -[[4-(aminoiminometil)fen¡l]metil]-2-oxo-2-(1 -piperid ini l)etil]amino]-3-[[(4-metoxí-2, 3, 6-trimetilfenil)sulfonil]am inoj-1 ,4(S)-dioxobutil]am¡no]-éster bencil de ácido butanóico. hidrocloruro (18) A una solución de 4-[[(1 R)-1 -[[4-(aminoiminometil)fenil]metil]-2-oxo-2-(1 -?iperidinil)etil]amino]-3-[[(4-metoxi-2>3,6-trimetilfenil)sulfonil]amino]-4-oxo-(3S)-ácido butanóico. hidrocloruro (2.38 g, 3.96 mmol) (Tetrahedron 51 , 12047-12068, 1995) y bencil-(4-ácido aminobutírico). encenosulfonato (1 .52 g , 3.96 mmol) (J. Am. Chem. Soc. 105, 5278-5284, 1983) en DMF (40 mL) bajo una atmósfera de nitrógeno se agrega N . N-diisopropiletilamina (0.689 mL, 3.96 mmol) y tetrametilo-tetrafluoroborato de uronio de benzotriazolilo (1 .91 g, 5.94 mmol). El pH de la mezcla de reacción se mantiene en 6 utilizando N, N- diisopropiletilamina. La mezcla de reacción se agita por 4 días a temperatura ambiente, concentra, disuelve en acetato de etilo, enjuaga con 5% de carbonato de sodio y 0.1 N de ácido hidroclórico, seca en sulfato de magnesio y concentra. El residuo se disuelve en etanol seco (5 mL), precipita con éter de diisopropilo seco, filtra, para producir 2.47 g del compuesto principal 18. Rf = 0.8, acetato de etilo/piridina/ácido acético/agua = 83/31/18/7, v/v/v/v; Masa (ESI+): 777.4 [M+H]+ 4-[[4-[[(1 R)-1 -[[4-(aminoiminometil)fenil]metil]-2-oxo-2-(1 -piperidin i l)etil]amino]-3-[[(4-metox¡-2, 3, 6-trimetilfeni l)sulfonil]am ino]-1 ,4(S)-dioxobutil]amino]-ácido butanóico. hidrocioruro (19) Una suspensión de 18 (2.42 g, 3. 1 1 mmol) y 10% de Pd/C (400 mg) en metanol/agua (40 mL, 3/1 , v/v) se agita bajo una corriente continua de hidrógeno. Después de 8h la mezcla de reacción se filtra, el filtrado se concentra y co-evapora tres veces con metanol/tolueno (1/10, v/v). El residuo se disuelve en etanol seco (5 mL), precipita con éter de dietilo seco, filtra y seca. El residuo se disuelve en agua y carga directamente en un DeltaPak HPLC preparativo RP-Ciß utilizando un sistema de elución gradiente de 20% A/60% B/20% C a 20%A/14% V/66% C durante 30 min a una velocidad de flujo de 40 mL/min (A:0.5 M regulador de fosfato pH 2.1 ; B:agua; C:acetonitrilo/agua = 6/4). Producción 598 mg. Rt = 26.4 min (3-10 min: 20-43%C + 20%A; 10-15 min: 43-66%C + 20%A), (A: regulador de fosfato pH 2.1 ; B:agua; C:gcetonitrilo/agua = 6/4, v/v), supelcosil HPLC analítico LC-18-DB; Masa (EST+): 687.2 [M+H]+, 685.2 [M-H] Compuesto 21 del compuesto 17 y el compuesto 19 A una solución de compuesto 19 (40 mg, 58.3 µmol) en DMF (800 µL) se agrega N-hidroxisuccinimida (9.0 mg, 78.1 µmol), DCC (18.5 mg, 89.7 µmol) y 1 -hidroxibenzotriazol (8.8 mg, 65.1 µmol). La mezcla de reacción se agita por 40h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se filtra sobre dicalito y el dicalito se enjuaga cuatro veces con DMF (284 µL). Al filtrado se agrega 0.1 M de regulador Na2HPO (1936 µL, pH=7.5) y pentasacárido 17 (94.7 mg, 52.6 µmol). Después de agitar por 30 minutos la mezcla se filtra sobre dicalito, concentra y aplica sobre una columna Sephadex G-50, que se eluye con acetonitrilo/agua (1/1 , v/v). Las fracciones apropiadas se agrupan, concentran y desalan dos veces en cromatografía de columna Sephadex G-50 (agua). Las fracciones apropiadas se agrupan y liofilizan produciendo el conjugado 21 como un sólido blanco (95.8 mg). Masa (ES+) = 2469, HPLC: Rt = 8.3 min (20-80% B en 15 minutos, A = agua/acetonitrilo 8/2; B = 2M NaCI/acetonitrilo 8/2, v/v, HPLC analítico MonoQ HR5. Compuesto 22 Una solución de (R)-N-Boc(4-cianofenil)alalina (25.0 g, 86.1 mmol), piperidina (21.3 mL, 215.3 mmol) y TBTU (41.5 g, 129.2 mmol) en CH2CI2 seco (500 ml) se agita a temperatura ambiente bajo un flujo de nitrógeno por 2 horas. La mezcla de reacción se enjuaga sucesivamente con 0.2N de ácido hidroclórico, agua, carbonato de hidrógeno de sodio acuoso (saturado) y agua. La capa orgánica se seca en MgSO4l filtra y concentra in vacuo. El producto se disuelve en acetato de etilo caliente (35 mL), precipita con heptano (190 mL) y filtra para producir el compuesto 22 (27.75 g). TLC: Rf = 0.58, heptano/acetato de etilo = 3/7, v/v Compuesto 23 Una solución de compuesto 22 (25.6 g, 71 .7 mmol); hidroxilamina. HCL (7.1 g, 101 .8 mmol) y trietilamina (16.8 mL, 120.5 mmol) en etanol absoluto (307 mL) se agita a 80°C por 4 horas. En el enfriamiento de la mezcla a temperatura ambiente se forman cristales. Los cristales se eliminan por filtración, enjuagan con etanol y éter y secan en un disecador para producir el compuesto 23 (24.5 g). TLC: Rf = 0.15, heptano/acetato de etilo = 3/7, v/v Compuesto 24 Una solución de compuesto 23 (24.5 g, 62.7 mmol) y cloroformato de etilo (7.2 mL, 75.3 mmol) en piridina seca (245 mL) se agita a 1 15°C por 2 horas. La mezcla de reacción se enfría a temperatura ambiente y vierte en agua (1250 mL) y extrae 3 veces con acetato de etilo 500 mL). El extracto orgánico combinado se seca en MgSO4, filtra y concentra in vacuo para producir el compuesto 24 (24.3 g). TLC: Rf = 0.42, CH2CI2/MeOH 95/5, v/v. Compuesto 25 Una solución de compuesto 24 (24.3 g, 58.4 mmol) en CH2CI2 seco (122 mL) y TFA (122 ml) se agita a temperatura ambiente por 2 horas y concentra in vacuo en la presencia de tolueno para producir el compuesto 25 (37.6 g). Compuesto 26 Una suspensión de H-Asp-(OtBu)-OH (39 g, 206.35 mmol), 4- metoxi-2,3,6-trimetilbenceno-cloruro de sulfonilo (62 g, 249.3 mmol) y diisopropilamina (89 mL, 635 mmol) en DMF (950 mL) y agua (450 mL) se agita a 0°C por 3 horas. La mezcla de reacción se vierte en hielo/agua (5 L) y enjuaga dos veces con éter de dietilo, acidifica con ácido hidroclórico acuoso (4N , 72 ml) y extrae 3 veces con acetato de etilo. Las capas de acetato de etilo combinadas se secan en MgSO4, filtran y concentran in vacuo para producir el compuesto 26 (97.7 g)- TLC: Rf = 0.67, CH2CI2/MeOH 8/2, v/v. Compuesto 27 Una solución de compuesto 25 (33.5 g), compuesto 26 (24.7 g), TBTU (36.8 g, 114.6 mmol) y diisopropilamina (27.2 mL, 194.1 mmol) en DMF seca (670 mL) se agita por 2 horas y concentra in vacuo. El residuo se disuelve en acetato de etilo (750 mL), enjuaga con carbonato de hidrógeno de sodio acuoso (5%, 1250 mL) y ácido hidroclórico acuoso (0.1 N, 1250 mL), seca en MgSO4, filtra y concentra in vacuo para producir el compuesto 27 (33.8 g). TLC: Rf = 0.88, CH2CI2/MeOH 8/2, v/v. Compuesto 28 Una solución de compuesto 27 (33.8 g, 48.3 mmol) en CH2CI2 seco (170 mL) y TFA (170 mL) se agita a temperatura ambiente por 2 horas y concentra in vacuo en la presencia de tolueno para producir el compuesto 28 (32.3 g). TLC: Rf = 0.73, CH2CI2/MeOH 8/2, v/v. Compuesto 29 Una solución de compuesto 28 (32.3 g), H-GABA-OtBu. HCI (9.5 g, 48.4 mmol), TBTU (29.0 g, 90.5 mmol) y diisopropilamina (25.2 mL, 179.8 mmol) en DMF seca (622 mL) se agita a temperatura ambiente por 2 horas y concentra in vacuo. El residuo se disuelve en acetato de etilo (840 mL), enjuaga con carbonato de hidrógeno de sodio acuoso (5%, 1400 mL) y ácido hidroclórico acuoso (0.1 N, 1400 mL), seca sobre MgSO4, filtra y concentra in vacuo. El residuo se disuelve en etanol (75 mL) y se agrega lentamente a diisopropiléter agitado (2990 mL) produciendo el compuesto 29 como cristales blancuzcos (32.0 g). TLC: Rf = 0.56, CH2CI2/MeOH 9/1 , v/v. Compuesto 30 Una solución de compuesto 29 (3.0 g, 3.82 mmol) en CH2CI2 seco (15 mL) y TFA (15 mL) se agita a temperatura ambiente por 2 horas y concentra in vacuo en la presencia de tolueno. El residuo se purifica en gel de sílice utilizando CH2CI2/MeOH (0%-6% MeOH) produciendo el compuesto puro 30 (1.98 g). TLC: Rf = 0.56, CH2CI2/MeOH 8/2, v/v. Compuesto 31 Una solución de compuesto 30 (900 mg, 1.23 mmol), TBTU (396 mg, 1.23 mmol) y diisopropilamina (215 µL, 1.53 mmol) en DMF (45 mL) se agita por 1 horas a temperatura ambiente. El compuesto 17 (2.0 g, 1.11 mmol) se agrega y después de agitar por 4 horas la mezcla se concentra in vacuo produciendo el compuesto 31 (4.17 g). Compuesto 21 del compuesto 31 Una suspensión del compuesto 31 (4.17 g) y 10% de Pd/C (2.8 g) en tert-but \ alcohol (28 mL) y agua (56 mL) se agita durante la noche bajo una corriente continua de hidrógeno. El catalizador de Pd/C se remueve por filtración y filtrado se concentra in vacuo. El residuo se disuelve en agua y purifica en una columna Q-sefarosa. Las fracciones apropiadas se agrupan, concentran y desalan por cromatografía de columna Sephadex G-25 (agua). Las fracciones apropiadas se agrupan y liofilizan produciendo el conjugado 21 como un sólido blanco (1.74 g).

Esquema 1 Esquema 2 R,=H. j=H ---^ R,=2. R,=H Esquema 4 Esquema 5 Esquema 6 Esquema 7 EJ EMPLO 2 Las actividades biológicas de los compuestos de la presente invención se determina por los siguientes métodos de prueba. I. Análisis de anti-trombina Trombina (Factor Ha) es un factor en la cascada de coagulación. La actividad de anti-trombina de compuestos de la presente invención se valora al medir espectrofotométricamente la velocidad de hidrólisis del substrato cromogénico s-2238 ejercida por trombii a. Este análisis para la actividad de anti-trombina en un sistema regulador se utiliza para valorar el valor ICS0 de un compuesto de prueba. Medio de prueba: regulador de trometamina-NaCI-polietilenglicol 6000 (TNP) Compuesto de referencia: 12581 (Kabi) Vehículo: regulador TNP La solubilización puede asistirse con dimetiisulfóxido, metanol, etanol, acetonitrilo o tert-butil alcohol que se encuentran sin efectos adversos en concentraciones de hasta 2.5% en la mezcla de reacción final.

Técnica: Reactivos* 1 . Regulador de trometamina-NaCI (TN); composición del regulador: Trometanima (Tris) 6.057 g (50 mmol), NaCI 5.844 g (100 mmol), Agua a 1 I. El pH de la solución se ajusta a 7.4 a 37°C con HCl (10 mmol. I"1). 2. Regulador TNP: Polietilenglicol 6000 se disuelve en regulador TN para dar una concentración de 3 g.l"1. 3. Solución S-2238: Un frasco de S-2238 (25 mg, Chromogeniz; Suecia) se disuelve en 20 ml de regulador TN para dar una concentración de 1.25 mg.ml"1 (2 mmol. I"1). 4. Solución de trombina: trombina humana (1000 NIH unidades/frasco, Enzyme Res. Lab. Inc., USA) se disuelve en regulador TNP para dar una solución de reserva de 50 NIH unidades. mi"1. Inmediatamente antes de utilizarse, esta solución se diluye con regulador TNP para dar un concentración de 30.2 NIH unidades. ml'1. * - Todos los ingredientes utilizados son de grado analítico Para soluciones acuosas se utiliza agua ultrapura (calidad Milli-Q). Preparación de las soluciones de compuesto de referencia v prueba Los compuestos de referencia y prueba se disuelven en agua Milli-Q para dar concentraciones de reserva de 10'2 mol. I'1. Cada concentración se diluye en etapas con el vehículo para dar concentraciones de 10"3, 10'4 y 10's mol. I'1. Las diluciones incluyendo la solución de reserva, se utilizan en el análisis (concentraciones finales en la mezcla de reacción: 3. 10'4; 10-4; 3. 10'5; 10_s; 3. 10'6; 10"6; 3. 10"7 y 10'7 mol. I'1 , respectivamente). Procedimiento A temperatura ambiente 0.075 ml y 0.025 ml de soluciones de compuesto de referencia o de compuesto de prueba o vehículo se entuban alternativamente en las cavidades de una placa de microconcentración y estas soluciones de diluyen con 0.115 ml y 0.0165 ml de regulador TNP, respectivamente. Una alícuota de 0.030 ml de solución de S-2238 se agrega a cada cavidad y la placa se pre-calienta y pre-incuba con agitación en un incubador (Amersham) por 10 min, a 37°C. Después de la pre-incubación, se inicia la hidrólisis de S-2238 por la adición de 0.030 ml de solución de trombina a cada cavidad. La placa se incuba (con agitación por 30 s) a 37°C. Iniciando después de 1 min de incubación, la absorbencia de cada muestra en 405 nm se mide cada 2 min por un periodo de 90 min utilizando un lector de placa de microconcentración cinética (Twinreaderplus, Flow Laboratories). Todos los datos se recolectan en una computadora personal utilizando un programa de procesamiento de datos (Biolise). Para cada concentración del compuesto (expresada en mol. I"1 de mezcla de reacción) y para el espacio, la absorbencia se diagrama contra el tiempo de reacción en min. Evaluación de respuestas: Para concentración final la absorbencia máxima se calcula del diagrama de análisis. El valor IC50 (concentración final, expresado en µmol. I"1 , causando 50% de inhibición de la absorbencia máxima del espacio) se calcula utilizando el análisis de transformación logit de acuerdo a Hafner et al., (Arzneim-Forsch/Drug Res. 1977; 27(ll): 1871 -3). Actividad de antitrombina del compuesto del EJEMPLO 1 :valor IC50: 17 nM. II. Análisis de antifactor XA El Factor Activado (Xa) es un factor en la cascada de coagulación. La actividad anti-Xa de compuestos de la presente invención se valora al medir espectrofotométricamente la velocidad de hidrólisis del substrato cromogénico s-2222 ejercida por Xa. Este análisis de actividad-Xa en un sistema regulador se utiliza para valorar el valor IC50 del compuesto de prueba.

Compuesto de Referencia: pentasacárido Org 31540 Vehículo: regulador TNP La solubilización puede asistirse con dimetiisulfóxido, metanol, etano, acetonitrilo o tert-butil alcohol los cuales se encuentran sin efectos adversos en concentraciones de hasta 1 % (para DMSO) y 2.5% (para los otros solventes) en la mezcla de reacción final. Técnica Reactivos* 1. Regulador de trometatina-NaCI (TN); composición del regulador: Trometatina (Tris) 6.11 g (50.4 mmol), NaCI 10.17 g (174 mmol). Polietilenglicol 6000 3 g.l'1 , Agua a 1 I. El pH de la solución se ajusta a 7.4 a 37°C con HCl (10 mmol. I"1): 3. Solución S-2222: un frasco de S-2222 (25 mg; Cromogenix, Suecia) se disuelve en agua para dar una concentración de 0.375 mg.ml'1) (0.5 mmol. I'1). 4. Solución de Xa: Factor de Bovino Xa Humano (71 nKat. frasco'1; Chromogenix) se disuelve en 10 ml de regulador TNP y después se diluye además con regulador TNP para dar una concentración de 0.75 nKat. (1.5 U).ml"1. La dilución tiene que prepararse recientemente. 5. Solución ATI 11: ÁTIII Humano (Chromogenix) se disuelve en agua para dar una concentración de 1 U.ml"1, después de lo cual la solución se diluye además con 3 volúmenes de regulador TNP a una concentración de 0.25 U.ml"1. 6. Solución estándar: una solución madre de 5.7 anti-Xa U.ml"1 Org 31540 se diluye en regulador TNP a 0.05 U.ml'1. 6. Muestras de prueba: Cada preparación se disuelve en agua y diluye con el regulador TNP a una concentración de 0.05 nmol. mi"1. De cada preparación, un rango de 9 diluciones se hace (factor de dilución 1 .5).

Determinación de la actividad de Xa Cada muestra de prueba (0.05 ml) se entuba en una cavidad de una placa de microconcentración a temperatura ambiente. Solución AT-I I I (0.05 ml) se agrega a cada muestra y la placa se agita utilizando un agitador Vari. Una alícuota de solución Xa (0.05 ml) se entuba en cada cavidad por 10 min después de la adición de solución de AT-ll l y la placa se agita de nuevo. Exactamente 2 min después de la adición de solución Xa, 0.1 ml de solución S-2222 se entuba en cada cavidad y la polaca se agita de nuevo. Para todas las adiciones, se utiliza un tubo de 12 canales. La cantidad restante de Xa cataliza la hidrólisis de S-2222, la velocidad de la cual se mide fotométricamente utilizando periodos de incubación de 2 y 22 min respectivamente a temperatura ambiente. La absorbencia de cada muestra se mide en 405 nm utilizando un Lector Microelisa, modelo 310C (Organon Teknika, Oss, Países Bajos) y el incremento en la absorbencia (?OD) se calcula. Cada muestra de prueba se determina por duplicado. Con cada 10 muestras, un espacio (0.05 ml de regulador TNP) se incluye. Curva de calibración A partir de una alícuota de la solución estándar de la muestra de calibración un rango de diluciones se hace (factor de dilución, 1 .4 para muestras de Org 31540). Las muestras estándar resultantes (aprox. 12 muestras) deben contener entre 0.01 -0.05 anti-Xa U/ml. Dentro de cada prueba, 0.05 ml de cada muestra estándar se prueba al menos 3 veces como se describe bajo "Determinación de la actividad de Xa". Una curva de calibración se obtiene al ajustar una línea recta a TABLA Valores U/ml, utilizando el método de menos cuadrados Evaluación de respuestas: Para cada muestra la actividad ant-Xa promedio en U/ml se determina utilizando la curva de calibración. Actividad del anti-factor Xa del compuesto del EJEMPLO 1 : 1012 U/ mmol.

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES 1 . Un compuesto de la fórmula (I) [espaciador] en donde R es independientemente SO3" o CH3; el espaciador es un espaciador flexible de una longitud de 13-25 átomos; la carga del residuo de pentasacárido se compensa por contraiónes positivamente cargados; y el número total de grupos sulfato en el residuo de pentasacárido es 4, 5 o 6; o una sal farmacéuticamente aceptable, un profármaco o un solvato de los mismos.
2. 2. El compuesto según la reivindicación 1 , caracterizado porque el residuo de pentasacárido tiene la estructura
3. 3. El compuesto según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el espaciador tiene una longitud de 16-22 átomos.
4. 4. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, caracterizado porque el espaciador tiene una longitud de 19 átomos.
5. 5. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, caracterizado porque el espaciador es *-(CH2CH2?)3-(CH2)2-NH-C(O)-(CH2)3-NH-C(O)-CH2-, el final indicado con * uniéndose al residuo de pentasacárido.
6. 6. El compuesto según la reivindicación 1 , que tiene la estructura
7. 7. Un proceso para la preparación del compuesto de la fórmula I , que comprende una etapa en donde la porción de benzamidina se encuentra en la forma de un precursor, siendo el grupo 1 ,2,4-oxadiazolin-5-ona.
8. 8. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y auxiliares farmacéuticamente aceptables.
9. 9. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para utilizarse en terapia.
10. 10. El uso del compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la elaboración de un medicamento para tratar o evitar trombosis u otras enfermedades relacionadas con trombina.