ES2310988T3

ES2310988T3 - Particulas para terapia genica.

Info

Publication number: ES2310988T3
Application number: ES00909000T
Authority: ES
Inventors: Eberhard Hildt; Peter Hofschneider
Original assignee: DIAFERON GmbH
Current assignee: DIAFERON GmbH
Priority date: 1999-02-05
Filing date: 2000-02-04
Publication date: 2009-02-01
Anticipated expiration: 2020-02-04
Also published as: CY1107431T1; ATE402261T1; PT1165797E; WO2000046376A3; DE19904800C1; US7018826B1; EP1165797B1; DK1165797T3; EP1165797A2; WO2000046376A2; DE50015272D1

Abstract

Partícula, que comprende: (a) una envoltura de proteína con una proteína de fusión, comprendiendo dicha proteína de fusión una proteína vírica, un péptido que proporciona permeabilidad celular y un lugar de enlace heterólogo específico de célula; y (b) un ácido nucleico presente dentro de la envoltura de proteína, que comprende secuencias para una señal de empaquetamiento específica de virus y un gen estructural, en la que el péptido que proporciona permeabilidad celular comprende la secuencia de aminoácidos P L S S I F S R I G D P, o una secuencia de aminoácidos, que difiere de la secuencia de aminoácidos P L S S I F S R I G D P en un aminoácido, en la que la secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos P L S S I F S R I G D P en un aminoácido está codificada por una secuencia de ácido nucleico, que se hibridiza con la secuencia de ácido nucleico CCC CTA TCG TCA ATC TTC TCG AGG ATT GGG GAC CCT.

Description

Partículas para terapia génica.

La presente invención se refiere a partículas que contienen ácido nucleico, las cuales se enlazan específicamente a células y pueden introducir su ácido nucleico en dichas células. La invención también se refiere a procedimientos para preparar dichas partículas y a medios adecuados para este propósito, así como a la utilización de las partículas para preparar una composición farmacéutica para terapia génica.

Para la terapia génica, es importante disponer de un sistema de transferencia de genes específico, en otras palabras, con el que se pueden alcanzar las células deseadas y se pueden introducir genes en las mismas. En el caso de células hepáticas, esto es generalmente posible con un virus de la hepatitis B modificado (HBV) como vector, ya que el HBV es específico para las células hepáticas. Para otras células, sin embargo, por ejemplo fibroblastos, no existe ningún sistema de transferencia de genes que dé resultados satisfactorios.

En consecuencia, el objetivo de la presente invención consiste en dar a conocer un sistema de transferencia de genes específico, en otras palabras, con el que se pueden alcanzar las células deseadas y se pueden introducir genes en las mismas.

De acuerdo con la invención, este objetivo se alcanza mediante el objeto de las reivindicaciones.

La presente invención se basa en el descubrimiento del solicitante de que las partículas que contienen ácido nucleico que comprenden una proteína de fusión, que a su vez incluye una proteína vírica, un péptido que proporciona permeabilidad celular, particularmente un péptido como el que se describe en la solicitud de patente alemana 198 50 718.6, y un lugar de enlace heterólogo específico de célula, se pueden enlazar a las células correspondientes y pueden introducir sus ácidos nucleicos en las mismas. Por ejemplo, el solicitante ha preparado partículas de HBV que contienen ácido nucleico, que se enlazan a los fibroblastos e introducen sus ácidos nucleicos en los mismos. Con este objetivo, el solicitante intercambió el lugar de enlace de hepatocitos presente en la región PreS1, particularmente entre los aminoácidos 21 y 47, de la proteína de gran superficie de HBV (LHBs), con el lugar de enlace de \alpha5\beta1-integrina de fibronectina, permaneciendo intacto el péptido que proporciona permeabilidad celular presente en la región PreS2 de LHB. Además, preparó partículas con especificidad para fibroblastos uniendo la proteína de núcleo de HBV (HBcAg) con el lugar de enlace de \alpha5\beta1-integrina de fibronectina y el péptido que proporciona permeabilidad celular mencionado anteriormente. Además, mostró que el ácido nucleico contenido en las partículas se expresa en las células.

De acuerdo con la invención, los descubrimientos del solicitante se utilizan para dar a conocer partículas que incluyen:

(a): una envoltura de proteína con una proteína de fusión, comprendiendo dicha proteína de fusión una proteína vírica, un péptido que proporciona permeabilidad celular y un lugar de enlace heterólogo específico de célula; y

(b): un ácido nucleico presente dentro de la envoltura de proteína, que comprende secuencias para una señal de empaquetamiento específica de virus y un gen estructural, en la que el péptido que proporciona permeabilidad celular comprende la secuencia de aminoácidos P L S S I F S R I G D P, o una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos P L S S I F S R I G D P en un aminoácido, en la que la secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos P L S S I F S R I G D P en un aminoácido está codificada por una secuencia de ácido nucleico que se hibridiza con la secuencia de ácido nucleico CCC CTA TCG TCA ATC TTC TCG AGG ATT GGG GAC CCT.

La expresión "péptido que proporciona permeabilidad celular" incluye péptidos capaces de proporcionar permeabilidad celular a sustancias, particularmente proteínas, particularmente un péptido que incluye la siguiente secuencia de aminoácidos (ADN):

\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 P \+ L \+ S \+ S \+ I \+ F \+ S \+ R \+ I \+ G \+ D \+ P\cr
\+\+\+\+\+\+\+\+\+\+\+\cr  CCC \+ CTA \+ TCG \+ TCA \+ ATC \+ TTC \+
TCG \+ AGG \+ ATT \+ GGG \+ GAC \+
CCT\cr}

La expresión "lugar de enlace específico de célula" incluye cualquier lugar de enlace de proteínas y otras moléculas pequeñas a través del cual las respectivas proteínas o moléculas se pueden enlazar a las células. Se encuentran ejemplos de estos lugares de enlace en las citoquinas y factores de crecimiento. También se encuentran en ligandos de receptores hormonales, receptores de neurotransmisores, receptores de superficie de células sanguíneas y receptores de integrina. Un lugar de enlace preferente es el lugar de enlace de \alpha5\beta1-integrina de fibronectina. En lo sucesivo, dicho lugar de enlace se designa RGD e incluye los aminoácidos arginina, glicina y aspartato.

El término "virus" incluye virus con ADN y con ARN, particularmente adenovirus, virus adeno-asociados, virus vacuna, baculovirus, virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis A, virus de la gripe y hepadnavirus. Son ejemplos de los últimos HBV, WHV ("virus de la hepatitis de la marmota"), GSHV ("virus de la hepatitis de la ardilla"), RBSHV ("virus de la hepatitis de la ardilla de vientre rojo"), DHV ("virus de la hepatitis del pato pequinés") y HHV ("virus de la hepatitis de la garza"), siendo preferente el HBV.

La expresión "proteína vírica" se refiere a cualquier proteína de uno de los virus mencionados anteriormente que puede estar presente entera o parcialmente en una proteína de fusión junto con un péptido que proporciona permeabilidad celular y un lugar de enlace heterólogo específico de célula en forma de péptido adicional. La proteína también puede contener anteriormente el péptido que proporciona permeabilidad celular. Un ejemplo de una proteína de este tipo es la LHBs. Esta proteína resulta preferente, así como lo son otras proteínas de superficie y proteínas de núcleo, por ejemplo, HBcAg. El término "heterólogo" indica que la proteína no comprende de forma natural el lugar de enlace heterólogo específico de célula mencionado anteriormente. Puede ser ventajoso que el lugar de enlace homólogo, es decir, de procedencia natural de la proteína, esté desactivado. Puede ser particularmente ventajoso que el lugar de enlace homólogo esté reemplazado con el lugar de enlace heterólogo.

La expresión "ácido nucleico" incluye ARN y ADN, pudiendo ser ambos de cadena simple y/o de doble cadena.

La expresión "señal de empaquetamiento específica de virus" indica una secuencia de señal en el ácido nucleico anterior, mediante la cual el ácido nucleico se empaqueta en la envoltura de proteína de una partícula. La secuencia de señal es específica para uno de los virus anteriores. Una secuencia de señal preferente es la del HBV. La misma se encuentra en el ADN del HBV, y en la bibliografía se designa épsilon.

La expresión "gen estructural" incluye genes que codifican polipéptidos (proteínas). Son ejemplos de dichos polipéptidos el factor de necrosis tumoral, interferonas, interleucinas, linfoquinas, factores de crecimiento, proteínas plasmáticas, por ejemplo factores de coagulación y enzimas metabólicas, y receptores. Particularmente, los polipéptidos pueden ser aquellos capaces de aumentar la inmunogenicidad de las células. Estos polipéptidos pueden ser polipéptidos ausentes en células tumorales, por ejemplo, citoquinas tales como IL-2 y GM-CSF, y moléculas co-estimulantes tales como B7-1, antígenos asociados a tumores, por ejemplo MAGE1, tirosinasas y polipéptidos víricos, por ejemplo E7 del virus del papiloma humano y el polipéptido EBNA-3 del virus de Epstein-Barr. Además, los polipéptidos pueden ser polipéptidos adaptadores, motivos de oligomerización de un polipéptido, fragmentos polipeptídicos de polipéptidos de envoltura de virus y hormonas. El término "gen estructural" incluye además oligonucleótidos antisentido, ácidos nucleicos peptídicos, secuencias de consenso para factores de transcripción y ribozimas.

De acuerdo con la invención, son preferidas las partículas que contienen una proteína de fusión, incluyendo dicha proteína de fusión una LHBs o fragmentos de la misma y un lugar de enlace heterólogo, particularmente RGD. Resulta ventajoso que el lugar de enlace heterólogo, por ejemplo RGD, esté presente en vez del lugar de enlace homólogo. Resulta particularmente preferente que la proteína de fusión comprenda la secuencia de aminoácidos de la figura 1 o una secuencia de aminoácidos que difiere de la misma en uno o más aminoácidos.

Además, resultan preferentes las partículas que contienen una proteína de fusión que incluye un HBcAg, un péptido que proporciona permeabilidad celular tal como se ha descrito anteriormente, particularmente con la secuencia de aminoácidos indicada anteriormente, y un lugar de enlace heterólogo, particularmente RGD. Resulta particularmente preferente que la proteína de fusión comprenda la secuencia de aminoácidos de la figura 2 o una secuencia de aminoácidos que difiera de la misma en uno o más aminoácidos.

La expresión "secuencia de aminoácidos que difiere en uno o más aminoácidos" indica que dicha secuencia de aminoácidos especifica una proteína de fusión que tiene elementos comparables y funciona como la proteína de fusión de la figura 1 o la figura 2, pero que difiere de la secuencia de aminoácidos de la figura 1 o la figura 2 en hasta un 20%, preferentemente un 10%.

Se puede preparar una partícula según la presente invención mediante métodos convencionales. Si la partícula contiene, por ejemplo, una proteína de fusión que incluye un LHBs en el que el lugar de enlace homólogo está sustituido por un lugar de enlace heterólogo, particularmente RGD, resulta ventajoso un método que contiene las siguientes etapas:

(a): cotransfección de células que codifican el genoma de un virus de la hepatitis B, en la que las células no expresan LHBs, con un primer vector de expresión que codifica una proteína de fusión que comprende una LHBs, en el que el lugar de enlace homólogo está sustituido por un lugar de enlace heterólogo, particularmente RGD, y con un segundo vector de expresión que comprende una señal de empaquetamiento específica de virus y un gen estructural; y

(b): aislamiento y purificación de la partícula.

Si la partícula contiene una proteína de fusión que incluye un HBcAg, un péptido que proporciona permeabilidad celular tal como se ha descrito anteriormente, particularmente el péptido con la secuencia de aminoácidos anterior, y un lugar de enlace heterólogo, particularmente RGD, resulta ventajoso un procedimiento que incluye las siguientes etapas:

\newpage

(a): cotransfección de células que codifican una polimerasa HBV con un primer vector de expresión que codifica una proteína de fusión que comprende HBcAg, un péptido que proporciona permeabilidad celular tal como se ha descrito anteriormente, particularmente el péptido con la secuencia de aminoácidos anterior, y un lugar de enlace heterólogo, particularmente RGD, y con un segundo vector de expresión que comprende una señal de empaquetamiento específica de virus y un gen estructural; y

(b): aislamiento y purificación de la partícula.

Con respecto a las expresiones "vector de expresión", "células" y "aislamiento y purificación", se hace referencia a las explicaciones siguientes, particularmente en los ejemplos. Con respecto al resto de términos, se hace referencia a las explicaciones anteriores.

Otro objetivo de la presente invención consiste en una proteína de fusión que comprende una proteína vírica, un péptido que proporciona permeabilidad celular y un lugar de enlace heterólogo específico de células, particularmente RGD, en la que el péptido que proporciona permeabilidad celular comprende la secuencia de aminoácidos P L S S I F S R I G D P, o una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos P L S S I F S R I G D P en un aminoácido, en la que la secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos P L S S I F S R I G D P en un aminoácido está codificada por una secuencia de ácido nucleico que se hibridiza con la secuencia de ácido nucleico CCC CTA TCG TCA ATC TTC TCG AGG ATT GGG GAC CCT. Preferentemente, la proteína vírica es una LHBs o un HBcAg. Preferentemente, la proteína de fusión incluye la secuencia de aminoácidos de la figura 1 o la figura 2, o una secuencia de aminoácidos que difiere de las mismas en uno o más aminoácidos.

Con respecto a la expresión "secuencia de aminoácidos que difiere en uno o más aminoácidos", se hace referencia a las explicaciones anteriores.

Otro objetivo de la presente invención es un ADN que codifica una proteína de fusión mencionada anteriormente. Preferentemente, se trata de un ADN que incluye lo siguiente:

(a): el ADN descrito en las figuras 1 ó 2, o un ADN que difiere del mismo en uno o más pares de bases; o

(b): un ADN relacionado con el ADN de (a) a través del código genético degenerado.

La expresión "ADN que difiere en uno o más pares de bases" indica que dicho ADN codifica una proteína de fusión que comprende elementos comparables y funciona tal como la proteína de fusión de la figura 1 o la figura 2, pero que difiere de la secuencia de bases de la figura 1 o la figura 2 de tal modo que, en la secuencia de aminoácidos, existe una diferencia, como máximo, del 20%, preferentemente del 10%.

Un ADN según la invención puede existir como tal o en un vector. Particularmente, un ADN según la invención puede existir en un vector de expresión. Los ejemplos de dichos vectores de expresión son conocidos por el experto en la materia. En el caso de un vector de expresión para E. coli, dichos factores son, por ejemplo, pGEMEX, derivados de pUC, pGEX-2T, pET3b y pQE-8. pY100 e Ycpad1 son ejemplos para la expresión en levadura, mientras que pKCR, pEFBOS, cDM8, pCEV4, pCDNA3, pKSV10, pRCMV y pRK5 son ejemplos para la expresión en células animales. El vector de expresión de baculovirus pAcSGHisNT-A es particularmente adecuado para la expresión en células de insecto.

El experto en la materia conoce células adecuadas para la expresión del ADN según la invención presente en un vector de expresión. Los ejemplos de dichas células incluyen las cepas de E. coli HB101, DH1, x1776, JM101, JM 109, BL21, SG 13009 y M15pRep4, la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae, las células animales L, NIH 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero, HeLa, Hep62, CCL13 y 293, las células de insecto Sf9 y Sf21, y las células vegetales Lupinus albus.

El experto en la materia conoce procedimientos y condiciones para la transformación o transfección de células con un vector de expresión que contiene el ADN según la presente invención, así como para el cultivo de las células. También conoce procedimientos para el aislamiento y purificación de la proteína vírica expresada por el ADN según la presente invención.

Un anticuerpo dirigido contra la proteína de fusión mencionada anteriormente se puede preparar mediante métodos convencionales. El mismo puede ser policlonal o monoclonal. Al prepararlo, resulta ventajoso inmunizar animales, particularmente conejos o pollos para un anticuerpo policlonal y ratones para un anticuerpo monoclonal, con la proteína de fusión. Además, también pueden tener lugar "refuerzos" de los animales con la proteína de fusión. A continuación, el anticuerpo policlonal se puede obtener a partir del suero o la yema de huevo de los animales. Para anticuerpos monoclonales, las células de bazo de los animales se funden con células de mieloma.

(a): una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención,

(b): un ADN de acuerdo con la presente invención,

(c): un anticuerpo tal como se ha descrito anteriormente, así como

(d): adyuvantes convencionales, tales como portadores, amortiguadores, disolventes, controles, etc.

pueden estar presentes como componentes de un kit.

Pueden estar presentes uno o más representantes de cada uno de los componentes individuales. Con respecto a los términos individuales, se hace referencia a las explicaciones anteriores.

La presente invención da a conocer un sistema de transferencia de genes que es específico, en otras palabras, con el que se pueden alcanzar las células deseadas y se pueden introducir genes en las mismas. Las células pueden estar presentes individualmente o en un tejido. Además, las células pueden ser aisladas o estar presentes en el cuerpo de un individuo. En consecuencia, la presente invención es adecuada para una terapia génica ex vivo o in vivo de células o tejidos, respectivamente. La aplicación de la presente invención se puede seguir y controlar mediante anticuerpos de acuerdo con la presente invención.

En consecuencia, la presente invención representa un avance importante en el ámbito de las modificaciones terapéuticas de genes en células o tejidos de un modo dirigido.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra las secuencias de aminoácidos y de ADN de una proteína de fusión según la presente invención, que incluye una LHBs y el lugar de enlace heterólogo RGD, reemplazando este último el lugar homólogo.

La figura 2 muestra las secuencias de aminoácidos y de ADN de una proteína de fusión según la presente invención, que incluye un HBcAg, un péptido que proporciona permeabilidad celular con la secuencia de aminoácidos anterior y el lugar de enlace heterólogo RGD.

La presente invención se describe mediante los siguientes ejemplos:

Ejemplo 1 Preparación de una partícula según la presente invención que contiene una proteína de fusión que incluye una LHBs y un lugar de enlace heterólogo (A) Preparación de un vector de expresión que codifica todas las proteínas específicas de HBV, con la excepción de LHBs

Para alcanzar esto, se empieza por el plásmido pTKTHBV2 (véase Will y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. 82 (1985), 891-895). El mismo contiene dos copias del genoma de HBV. Un fragmento de ntHBV2821 (primera copia) a ntHBV2870 (segunda copia) se amplifica en un primer PCR. El primer directo (nt 2821-2855) presenta la siguiente secuencia: CCA TAT TCT TGG GAA CAA GAT ATC CAG CAC GGG GC. Se subraya un lugar de escisión por EcoRV. El triplete ACG entre nt 2849-2852 sustituye el codón de inicio ATG de LHBs. El primer inverso (nt 2877-2845) presenta la siguiente secuencia GGA TTG CTG GTG GAA GAT ATC TGC CCC GTG CTG. Se subraya un lugar de escisión por EcoRV. El triplete CGT entre nt 2852-2849 sustituye el triplete natural CAT. Los fragmentos PCR obtenidos se digieren por EcoRV y se purifican en un gel de agarosa al 1% preparativo. Un fragmento de aproximadamente 3,3 kb de tamaño se eluye del gel y se almacena.

En un segundo PCR, se utilizan un primer directo que comprende un lugar de escisión por EcoRV seguido por la sucesiva secuencia ntHBV2860 (segunda copia) -2878 (primera copia) (CAG CAC GGG GCA GAT ATC TTC CAC CAG CAA TCC), y un primer inverso que comprende un lugar de escisión por EcoRV seguido por la sucesiva secuencia ntHBV 2830-2810 (GC CCC GTG CTG GAT ATC ATC TTG TTC CCA AGA ATA TGG). Los fragmentos PCR obtenidos se digieren por EcoRV y se purifican en un gel de agarosa al 1% preparativo. Un fragmento del tamaño esperado se eluye del gel y se desfosforila. Este fragmento se utiliza en una reacción de ligasa con el fragmento anterior de aproximadamente 3,3 kb, en la que se obtiene el vector de expresión de HBV pTKTHBV2Ldef. Este vector de expresión codifica todas las proteínas específicas de HBV, excepto LHBs.

(B) Preparación de un vector de expresión que codifica una proteína de fusión que incluye una LHBs y el lugar de enlace heterólogo RGD

El fragmento ntHBV2990-834 se amplifica por PCR empezando por el plásmido pTKTHBV2 (véase referencia anterior). El primer 5' presenta la siguiente secuencia: AAA AGA TCT GGC CGT GGC GAA GGA GCT GGA GCA TTC. Esta secuencia incluye un lugar de escisión BglII seguido por un codon de inicio ATG y la secuencia que codifica el tripéptido RGD. Se utiliza en el marco de lectura específico de PreS1. El primer 3' presenta la siguiente secuencia: AAA AGA TCT GGT TTA AAT GTA TAC CCA AAG. Esta secuencia incluye un lugar de escisión BglII. Los fragmentos PCR obtenidos se digieren con BglII y se insertan en el vector pCDNA.3 (Invitrogen), que se ha escindido con BglII y se ha desfosforilado, con lo que se obtiene el vector de expresión pCRGDLHBs. Este vector de expresión codifica una LHBs acortada por su extremo N-terminal que incluye el lugar de enlace RGD.

(C) Preparación de un vector de expresión que comprende un gen estructural y una señal de empaquetamiento

Una secuencia que codifica la señal de empaquetamiento de HBV épsilon, por ejemplo ntHBV 1840-1914, se amplifica por PCR. Se introduce un lugar de escisión EcoRV a través del primer utilizado. La secuencia del primer directo es: CCC GAT ATC ATG TCA TCT CTT GTT CAT GTC CTA. La secuencia del primer inverso es: GGG GAT ATC GGT CGA TGT CCA TGC CCC AAA. Los fragmentos PCR obtenidos se escinden mediante EcoRV y se insertan en el vector pCDNA.3 (véase referencia anterior), que se ha escindido mediante EcoRV y se ha desfosforilado, obteniéndose el vector pcVPHBV. Este vector contiene la señal de empaquetamiento específica de HBV épsilon.

Empezando por el vector pCeGFP (Invitrogen), que codifica una "proteína verde fluorescente" bajo el control del promotor CMV, la secuencia que contiene el promotor CMV y el gen GFP se amplifica por PCR. El primer directo tiene la siguiente secuencia: GGG GGA TCC CGA TGT ACG GGC CAG ATA TAC GCG TTG. El primer inverso tiene la siguiente secuencia: GGG GGA TCC GCG GCC GCT TTA CTT GTA. Los primeros utilizados contienen cada uno un lugar de escisión BamHI. Los fragmentos PCR obtenidos se escinden mediante BamHI y se insertan en el vector pCVPHBV (Invitrogen), que se ha escindido mediante BamHI y se ha desfosforilado, obteniéndose el vector de expresión pCVPHBVeGFP. Este vector de expresión contiene la señal de empaquetamiento específica de HBV épsilon, el promotor CMV y una secuencia que codifica la eGFP.

(D) Preparación de una línea celular de empaquetamiento

Aproximadamente 0,8 x 10^{6} células HepG2 se transfectan con 4 \mug de pTKTHBV2Ldef (véase (A)) y 2 \mug de pCDNA.3 (véase (B)) mediante lipofección. pCDNA.3 codifica la resistencia a G418. 2 h después de la transfección, las células se transfieren a un medio que contiene 700 mg de G418/l. Los clones resistentes a G418 se subcultivan después de 14 d. La integración estable de pTKTHBV2Ldef se confirma mediante PCR y "Southern Blots". La expresión de la proteína de superficie SHBs a partir de HBV y a partir de HBcAg se confirma mediante anticuerpos específicos en ELISA. Se obtiene la línea celular de empaquetamiento HepG2-TKTHBV2Ldef. Esta línea celular expresa todas las proteínas específicas de HBV, excepto LHBs.

(E) Preparación de partículas según la invención

Aproximadamente 0,8 x 10^{6} células de la línea celular de empaquetamiento de (D) se transfectan con 3 \mug de pCRGDLHBs (véase (B)) y 3 \mug de pCVPHBVeGFP (véase (B)) mediante lipofección. 72 h después de la transfección, las células o sus sobrenadantes se recolectan y se someten a una precipitación con PEG. A continuación, se lleva a cabo una centrifugación por gradiente de densidad CsCl. Las partículas según la invención se obtienen en forma pura. Dichas partículas incluyen todas las proteínas específicas de HBV, excepto LHBs, que está sustituida por una RGD-LHBs.

Ejemplo 2 Preparación de una partícula según la presente invención que contiene una proteína de fusión que incluye un HBcAg, un péptido que proporciona permeabilidad celular y un lugar de enlace heterólogo

Se utiliza un ADN que codifica un péptido que proporciona permeabilidad celular (en lo sucesivo, designado ZPP). Dicho ADN presenta la siguiente secuencia: XXX AGA TCT ATC CCC ATA TCG TCA ATC TTC TCG AGG ATT GGG GAC CCT GGA TCC XXX (X designa un nucleótido cualquiera). Esta secuencia presenta en su extremo 5' un lugar de escisión BglII, seguido por un codón de inicio ATG y, en su extremo 3', un lugar de escisión BamHI. Una molécula de ADN de doble cadena basada en la secuencia anterior se escinde con BamHI/BglII y se inserta en el vector de expresión pCDNA.3 (véase referencia anterior), que se ha escindido mediante BamHI y se ha desfosforilado, obteniéndose el vector de expresión pCZPP.

Además, el vector de expresión pTKTHBV2 (véase referencia anterior) se utiliza para amplificar el fragmento nt-HBV 1861-2136 mediante PCR. El primer directo incluye la siguiente secuencia: XXX GGA TCC ACT GTT CTA GCC TCC AAG CTG. Esta secuencia incluye un lugar de escisión BamHI seguido por la secuencia ntHB 1861-1881. El primer inverso incluye la siguiente secuencia: XXX GAA TTC TGG ATC TTC CAA ATT AAC ACC CAC CCA. Esta secuencia incluye un lugar de escisión EcoRI seguido por la secuencia ntHBV 2139-2116. En un segundo PCR, el fragmento ntHBV 2140-2480, que se extiende por su extremo 5' con la secuencia que codifica el motivo RGD, se amplifica. El primer directo incluye la siguiente secuencia: XXX GAA TTC CGA GGC GAC GCG TCT AGA GAC CTA GTA GTC. Esta secuencia incluye un lugar de escisión EcoRI seguido por la secuencia que codifica el motivo RGD y la secuencia ntHBV2140-2161. El primer inverso incluye la siguiente secuencia: XXX AAG CTT TCC CCA CCT TAT GAG TCC AAG. Esta secuencia incluye un lugar de escisión HindIII seguido por la secuencia ntHBV 2480-2460.

Los fragmentos obtenidos a partir de los dos PCR se escinden mediante EcoRI y se ligan entre sí. El producto de ligación se utiliza como patrón para un PCR posterior, en el que el primer directo del primer PCR se utiliza como primer directo y el primer inverso del segundo PCR se utiliza como primer inverso. Los fragmentos PCR obtenidos se escinden mediante BamHI/HindIII y se insertan en el vector pCZPP, que se ha escindido mediante BamHI/HindIII y se ha desfosforilado, obteniéndose el vector de expresión pCZPPHBcRGC. Este vector de expresión codifica un HBcAg que
contiene la secuencia ZPP en su extremo N-terminal y la secuencia de RGD en la región de los aminoácidos 79-82.

Además, aproximadamente 0,8 x 10^{6} células HepG2 se transfectan mediante lipofección con 4 \mug de un vector de expresión que codifica la HBV polimerasa y con 2 \mug de pCDNA.3. En este punto se hace referencia a la descripción anterior del ejemplo 1 (D). Se obtiene una línea celular designada HepG2-HBV Pol.

Aproximadamente 0,8 x 10^{6} células de la línea celular HepG2-HBV Pol se transfectan con 3 \mug de pCZPPHBcRGC y 3 \mug de pCVPHBVeGFP (véase ejemplo 1,B) mediante lipofección. En este punto se hace referencia a la descripción anterior del ejemplo 1 (E). Se obtienen partículas según la presente invención en forma pura.

Ejemplo 3 Detección de la expresión de un ácido nucleico presente en partículas según la invención en fibroblastos

Aproximadamente 1 x 10^{9} partículas según la presente invención del ejemplo 1 (E) o del ejemplo 2 se disuelven en 100 \mul de solución salina al 0,9% y se inyectan en la vena de la cola de ratones balb/c. El músculo sóleo y tibial anterior se aísla 48 h después de la inyección y se congela lentamente en un "resto de tejido". Se preparan rodajas criogénizadas a partir de las preparaciones congeladas y se analizan en un microscopio de fluorescencia con excitación azul.

Se obtiene una fluorescencia verde en los fibroblastos que indica la expresión de la "proteína verde fluorescente".

Ejemplo 4 Preparación y purificación de una proteína de fusión según la invención

Se prepara la proteína de fusión de la figura 1 según la presente invención. Con este objetivo, se proporciona al ADN de la figura 1, en su extremo 5', un linker BglII y, en su extremo 3', un linker BglII, y a continuación se escinde con las correspondientes enzimas de restricción. El fragmento BglII/BglII obtenido se inserta en el vector de expresión pQE8 escindido con BamHI, de tal modo que se obtiene el plásmido de expresión pQE8/LHBs. Dicho plásmido codifica una proteína de fusión de 6 residuos de histidina (pareja N-terminal) y la proteína de fusión según la invención de la figura 1 (pareja C-terminal). El pQE-8/LHBs se utiliza para la transformación de E. coli SG 13009 (véase Gottesman, S. y otros, J. Bacteriol. 148, (1981), 265-273). Las arterias se cultivan en un medio LB con 100 \mug/ml de ampicilina y 25 \mug/ml de kanamicina, y se inducen durante 4 h con isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido 60 \muM (IPTG). La lisis de las bacterias se alcanza mediante la adición de hidrocloruro de guanidina 6 M, tras lo cual se lleva a cabo una cromatografía (resina Ni-NTA) del lisado en presencia de urea 8 M de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen) del material cromatográfico. La proteína de fusión fijada se eluye en una solución tampón a pH 3,5. Tras la neutralización, la proteína de fusión se somete a electroforesis de gel de poliacrilamida-SDS 18% y se tiñe con azul de Coomassie (véase Thomas, J.O. y Kornberg, R.D., J. Mol. Biol. 149, (1975), 709-733).

Se ha puesto de manifiesto que una proteína de fusión según la invención se puede preparar en forma muy pura.

Ejemplo 5 Preparación y detección de un anticuerpo

Una proteína de fusión según el ejemplo 4 de acuerdo con la invención se somete a electroforesis de gel de poliacrilamida-SDS 18%. Tras la tinción del gel con acetato de sodio 4 M, se corta una banda de 38 kD del gel y se incuba en solución salina tamponada con fosfato. Trozos del gel se sedimentan antes de la determinación de la concentración de proteína del sobrenadante por electroforesis de gel de poliacrilamida-SDS y tinción con azul de Coomassie. Se inmunizan animales con el polipéptido de fusión purificado mediante gel del modo siguiente:

Protocolo de inmunización para anticuerpos policlonales en conejos

Se utilizan para cada inmunización 35 \mug de proteína de fusión purificada mediante gel en 0,7 ml de PBS y 0,7 ml de adyuvante de Freund completo o incompleto.

Día 0: 1ª inmunización (adyuvante de Freund completo)

Día 14: 2ª inmunización (adyuvante de Freund incompleto; icFA)

Día 28: 3ª inmunización (icFA)

Día 56: 4ª inmunización (icFA)

Día 80: sangrado

El suero de conejo se somete a ensayo en un Inmunoblot. Con este objetivo, una proteína de fusión del ejemplo 4 según la invención se somete a electroforesis de gel de poliacrilamida-SDS y se transfiere a un filtro de nitrocelulosa (véase Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Se lleva a cabo el análisis Western Blot tal como se describe en Bock, C.-T. y otros, Virus Genes 8, (1994), 215-229. Con este objetivo, el filtro de nitrocelulosa se incuba durante 1 h a 37ºC con un primer anticuerpo. Este anticuerpo es el suero del conejo (1:10.000 en PBS). Tras diversas etapas de lavado con PBS, el filtro de nitrocelulosa se incuba con un segundo anticuerpo. Este anticuerpo es un anticuerpo IgG monoclonal anticonejo de cabra (Dianova) acoplado con fosfatasa alcalina (1:5.000) en PBS. Tras 30 minutos de incubación a 37ºC, se llevan a cabo diversas etapas de lavado con PBS y a continuación la detección de la fosfatasa alcalina con solución de desarrollo (36 \muM 5' bromo-4-cloro-3-indolilfosfato, 400 \muM nitroazul de tetrazolio, 100 mM tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl_{2}) a temperatura ambiente hasta que las bandas se hacen visibles.

Se ha puesto de manifiesto que se pueden preparar anticuerpos policlonales dirigidos a una proteína de fusión según la presente invención.

\vskip1.000000\baselineskip

Protocolo de inmunización para anticuerpos policlonales en pollo

Se utilizan para cada inmunización 40 \mug de proteína de fusión purificada mediante gel en 0,8 ml de PBS y 0,8 ml de adyuvante de Freund completo o incompleto.

Día 0: 1ª inmunización (adyuvante de Freund completo)

Día 28: 2ª inmunización (adyuvante de Freund incompleto; icFA)

Día 50: 4ª inmunización (icFA)

Los anticuerpos se extraen de la yema de huevo y se someten a ensayo de Western Blot. Se detectan anticuerpos policlonales dirigidos a una proteína de fusión según la presente invención.

\vskip1.000000\baselineskip

Protocolo de inmunización para anticuerpos monoclonales de ratón

Se utilizan para cada inmunización 12 \mug de proteína de fusión purificada mediante gel en 0,25 ml de PBS y 0,25 ml de adyuvante de Freund completo o incompleto. En la cuarta inmunización, la proteína de fusión se disuelve en 0,5 ml (sin adyuvante).

Día 0: 1ª inmunización (adyuvante de Freund completo)

Día 28: 2ª inmunización (adyuvante de Freund incompleto; icFA)

Día 56: 3ª inmunización (icFA)

Día 84: 4ª inmunización (PBS)

Día 87: fusión

Los sobrenadantes de los hibridomas se someten a ensayo de Western Blot. Se detectan anticuerpos dirigidos a una proteína de fusión según la presente invención.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Dr. Eberhardt Hildt, Klinikum Rechts d. Isar

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: Ismaninger Str.

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Muenchen

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: Deutschland

\vskip0.500000\baselineskip

(F): C.P.: 81675

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Partikel zur Gentherapie

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 19

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPA)

\vskip0.800000\baselineskip

(v): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.800000\baselineskip

: NÚMERO DE SOLICITUD: DE 199 04 800.2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 347 Aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO MOLECULAR: Peptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº1

1

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 215 Aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO MOLECULAR: Peptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 2

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 663 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO MOLECULAR: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 3

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1047 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO MOLECULAR: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 4

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 35 Pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCATATTCTT GGGAACAAGA TATCCAGCAC GGGGC

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 Pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATTGCTGG TGGAAGATAT CTGCCCCGTG CTG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 Pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGCACGGGG CAGATATCTT CCACCAGCAA TCC

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38 Pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCCCGTGCT GGATATCATC TTGTTCCCAA GAATATGG

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 Pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAAGATCTG GCCGTGGCGA AGGAGCTGGA GCATTC

\hfill

36

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 Pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAAGATCTG GTTTAAATGT ATACCCAAAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 Pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCGATATCA TGTCATCTCT TGTTCATGTC CTA

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 Pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGATATCG GTCGATGTCC ATGCCCCAAA

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 Pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGGATCCC GATGTACGGG CCAGATATAC GCGTTG

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 Pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGGATCCG CGGCCGCTTT ACTTGTA

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 57 Pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

NNNAGATCTA TGCCCATATC GTCAATCTTC TCGAGGATTG GGGACCCTGG ATCCNNN

\hfill

57

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 Pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

NNNGGATCCA CTGTTCAAGC CTCCAAGCTG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 Pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

NNNGAATTCT GGATCTTCCA AATTAACACC CACCCA

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 39 Pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

NNNGAATTCC GAGGCGACGC GTCTAGAGAC CTAGTAGTC

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 Pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: Nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

NNNAAGCTTT CCCCACCTTA TGAGTCCAAG

\hfill

30

Claims

1. Partícula, que comprende:

(b): un ácido nucleico presente dentro de la envoltura de proteína, que comprende secuencias para una señal de empaquetamiento específica de virus y un gen estructural,

en la que el péptido que proporciona permeabilidad celular comprende la secuencia de aminoácidos P L S S I F S R I G D P, o una secuencia de aminoácidos, que difiere de la secuencia de aminoácidos P L S S I F S R I G D P en un aminoácido, en la que la secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos P L S S I F S R I G D P en un aminoácido está codificada por una secuencia de ácido nucleico, que se hibridiza con la secuencia de ácido nucleico CCC CTA TCG TCA ATC TTC TCG AGG ATT GGG GAC CCT.

2. Partícula según la reivindicación 1, en la que la proteína vírica deriva de un adenovirus, de un virus adeno-asociado, del virus vacuna, de un baculovirus o de un hepadnavirus.

3. Partícula según la reivindicación 2, en la que el hepadnavirus es un virus de la hepatitis B.

4. Partícula según una de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la proteína vírica es una proteína de superficie.

5. Partícula según la reivindicación 4, en la que la proteína de superficie es una LHBs.

6. Partícula según una de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la proteína vírica es una proteína de núcleo.

7. Partícula según la reivindicación 6, en la que la proteína de núcleo es un HBcAg.

8. Partícula según una de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el péptido que proporciona permeabilidad celular presenta la siguiente secuencia de aminoácidos: P L S S I F S R I G D P.

9. Partícula según una de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el lugar de enlace heterólogo específico de célula es RGD.

10. Partícula según una de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la proteína de fusión es la de las figuras 1 ó 2.

11. Procedimiento para la preparación de la partícula según la reivindicación 1, en el que la proteína de fusión contiene una LHBs y un lugar de enlace heterólogo específico de célula, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas:

(a): cotransfección de células, que codifican el genoma de un virus de la hepatitis B, en la que las células no expresan LHBs, con un primer vector de expresión, que codifica una proteína de fusión que comprende una LHBs y un lugar de enlace heterólogo específico de célula, y con un segundo vector de expresión que comprende una señal de empaquetamiento específica de virus y un gen estructural; y

(b): aislamiento y purificación de la partícula.

12. Procedimiento para la preparación de la partícula según la reivindicación 1, en el que la proteína de fusión comprende un HBcAg, un péptido que proporciona permeabilidad celular y un lugar de enlace heterólogo específico de célula, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas:

(a): cotransfección de células, que codifican una polimerasa HBV con un primer vector de expresión, que codifica una proteína de fusión, que comprende un HBcAg, un péptido que proporciona permeabilidad celular y un lugar de enlace heterólogo específico de célula, y con un segundo vector de expresión que comprende una señal de empaquetamiento específica de virus y un gen estructural; y

(b): aislamiento y purificación de la partícula.

13. Proteína de fusión, que comprende una proteína vírica, un péptido que proporciona permeabilidad celular y un lugar de enlace heterólogo específico de célula, en la que el péptido que proporciona permeabilidad celular comprende la secuencia de aminoácidos P L S S I F S R I G D P, o una secuencia de aminoácidos, que difiere de la secuencia de aminoácidos P L S S I F S R I G D P en un aminoácido, en la que la secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos P L S S I F S R I G D P en un aminoácido está codificada por una secuencia de ácido nucleico que se hibridiza con la secuencia de ácido nucleico CCC CTA TCG TCA ATC TTC TCG AGG ATT GGG GAC CCT.

14. Proteína de fusión según la reivindicación 13, que comprende la secuencia de aminoácidos en las figuras 1 ó 2, o una secuencia de aminoácidos que difiere de la misma en uno o más aminoácidos y difiere de la secuencia de aminoácidos descrita en las figuras 1 ó 2 en hasta un 20%.

15. ADN, que codifica la proteína de fusión según la reivindicación 13.

16. ADN, que codifica la proteína de fusión según la reivindicación 14, que comprende:

17. Vector de expresión que codifica el ADN según la reivindicación 16.

18. Utilización de la partícula según una de las reivindicaciones 1 a 10 para preparar una composición farmacéutica destinada a la terapia génica de células y tejidos.