ES2310988T3 - Particulas para terapia genica. - Google Patents
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Abstract
Partícula, que comprende: (a) una envoltura de proteína con una proteína de fusión, comprendiendo dicha proteína de fusión una proteína vírica, un péptido que proporciona permeabilidad celular y un lugar de enlace heterólogo específico de célula; y (b) un ácido nucleico presente dentro de la envoltura de proteína, que comprende secuencias para una señal de empaquetamiento específica de virus y un gen estructural, en la que el péptido que proporciona permeabilidad celular comprende la secuencia de aminoácidos P L S S I F S R I G D P, o una secuencia de aminoácidos, que difiere de la secuencia de aminoácidos P L S S I F S R I G D P en un aminoácido, en la que la secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos P L S S I F S R I G D P en un aminoácido está codificada por una secuencia de ácido nucleico, que se hibridiza con la secuencia de ácido nucleico CCC CTA TCG TCA ATC TTC TCG AGG ATT GGG GAC CCT.
Description
Partículas para terapia génica.
La presente invención se refiere a partículas
que contienen ácido nucleico, las cuales se enlazan específicamente
a células y pueden introducir su ácido nucleico en dichas células.
La invención también se refiere a procedimientos para preparar
dichas partículas y a medios adecuados para este propósito, así como
a la utilización de las partículas para preparar una composición
farmacéutica para terapia génica.
Para la terapia génica, es importante disponer
de un sistema de transferencia de genes específico, en otras
palabras, con el que se pueden alcanzar las células deseadas y se
pueden introducir genes en las mismas. En el caso de células
hepáticas, esto es generalmente posible con un virus de la hepatitis
B modificado (HBV) como vector, ya que el HBV es específico para
las células hepáticas. Para otras células, sin embargo, por ejemplo
fibroblastos, no existe ningún sistema de transferencia de genes que
dé resultados satisfactorios.
En consecuencia, el objetivo de la presente
invención consiste en dar a conocer un sistema de transferencia de
genes específico, en otras palabras, con el que se pueden alcanzar
las células deseadas y se pueden introducir genes en las mismas.
De acuerdo con la invención, este objetivo se
alcanza mediante el objeto de las reivindicaciones.
La presente invención se basa en el
descubrimiento del solicitante de que las partículas que contienen
ácido nucleico que comprenden una proteína de fusión, que a su vez
incluye una proteína vírica, un péptido que proporciona
permeabilidad celular, particularmente un péptido como el que se
describe en la solicitud de patente alemana 198 50 718.6, y un
lugar de enlace heterólogo específico de célula, se pueden enlazar a
las células correspondientes y pueden introducir sus ácidos
nucleicos en las mismas. Por ejemplo, el solicitante ha preparado
partículas de HBV que contienen ácido nucleico, que se enlazan a
los fibroblastos e introducen sus ácidos nucleicos en los mismos.
Con este objetivo, el solicitante intercambió el lugar de enlace de
hepatocitos presente en la región PreS1, particularmente entre los
aminoácidos 21 y 47, de la proteína de gran superficie de HBV
(LHBs), con el lugar de enlace de
\alpha5\beta1-integrina de fibronectina,
permaneciendo intacto el péptido que proporciona permeabilidad
celular presente en la región PreS2 de LHB. Además, preparó
partículas con especificidad para fibroblastos uniendo la proteína
de núcleo de HBV (HBcAg) con el lugar de enlace de
\alpha5\beta1-integrina de fibronectina y el
péptido que proporciona permeabilidad celular mencionado
anteriormente. Además, mostró que el ácido nucleico contenido en las
partículas se expresa en las células.
De acuerdo con la invención, los descubrimientos
del solicitante se utilizan para dar a conocer partículas que
incluyen:
- (a)
- una envoltura de proteína con una proteína de fusión, comprendiendo dicha proteína de fusión una proteína vírica, un péptido que proporciona permeabilidad celular y un lugar de enlace heterólogo específico de célula; y
- (b)
- un ácido nucleico presente dentro de la envoltura de proteína, que comprende secuencias para una señal de empaquetamiento específica de virus y un gen estructural, en la que el péptido que proporciona permeabilidad celular comprende la secuencia de aminoácidos P L S S I F S R I G D P, o una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos P L S S I F S R I G D P en un aminoácido, en la que la secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos P L S S I F S R I G D P en un aminoácido está codificada por una secuencia de ácido nucleico que se hibridiza con la secuencia de ácido nucleico CCC CTA TCG TCA ATC TTC TCG AGG ATT GGG GAC CCT.
La expresión "péptido que proporciona
permeabilidad celular" incluye péptidos capaces de proporcionar
permeabilidad celular a sustancias, particularmente proteínas,
particularmente un péptido que incluye la siguiente secuencia de
aminoácidos (ADN):
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ P \+ L \+ S \+ S \+ I \+ F \+ S \+ R \+ I \+ G \+ D \+ P\cr \+\+\+\+\+\+\+\+\+\+\+\cr CCC \+ CTA \+ TCG \+ TCA \+ ATC \+ TTC \+ TCG \+ AGG \+ ATT \+ GGG \+ GAC \+ CCT\cr}
La expresión "lugar de enlace específico de
célula" incluye cualquier lugar de enlace de proteínas y otras
moléculas pequeñas a través del cual las respectivas proteínas o
moléculas se pueden enlazar a las células. Se encuentran ejemplos
de estos lugares de enlace en las citoquinas y factores de
crecimiento. También se encuentran en ligandos de receptores
hormonales, receptores de neurotransmisores, receptores de
superficie de células sanguíneas y receptores de integrina. Un
lugar de enlace preferente es el lugar de enlace de
\alpha5\beta1-integrina de fibronectina. En lo
sucesivo, dicho lugar de enlace se designa RGD e incluye los
aminoácidos arginina, glicina y aspartato.
El término "virus" incluye virus con ADN y
con ARN, particularmente adenovirus, virus
adeno-asociados, virus vacuna, baculovirus, virus
de la hepatitis C, virus de la hepatitis A, virus de la gripe y
hepadnavirus. Son ejemplos de los últimos HBV, WHV ("virus de la
hepatitis de la marmota"), GSHV ("virus de la hepatitis de la
ardilla"), RBSHV ("virus de la hepatitis de la ardilla de
vientre rojo"), DHV ("virus de la hepatitis del pato
pequinés") y HHV ("virus de la hepatitis de la garza"),
siendo preferente el HBV.
La expresión "proteína vírica" se refiere a
cualquier proteína de uno de los virus mencionados anteriormente
que puede estar presente entera o parcialmente en una proteína de
fusión junto con un péptido que proporciona permeabilidad celular y
un lugar de enlace heterólogo específico de célula en forma de
péptido adicional. La proteína también puede contener anteriormente
el péptido que proporciona permeabilidad celular. Un ejemplo de una
proteína de este tipo es la LHBs. Esta proteína resulta preferente,
así como lo son otras proteínas de superficie y proteínas de
núcleo, por ejemplo, HBcAg. El término "heterólogo" indica que
la proteína no comprende de forma natural el lugar de enlace
heterólogo específico de célula mencionado anteriormente. Puede ser
ventajoso que el lugar de enlace homólogo, es decir, de procedencia
natural de la proteína, esté desactivado. Puede ser particularmente
ventajoso que el lugar de enlace homólogo esté reemplazado con el
lugar de enlace heterólogo.
La expresión "ácido nucleico" incluye ARN y
ADN, pudiendo ser ambos de cadena simple y/o de doble cadena.
La expresión "señal de empaquetamiento
específica de virus" indica una secuencia de señal en el ácido
nucleico anterior, mediante la cual el ácido nucleico se empaqueta
en la envoltura de proteína de una partícula. La secuencia de señal
es específica para uno de los virus anteriores. Una secuencia de
señal preferente es la del HBV. La misma se encuentra en el ADN del
HBV, y en la bibliografía se designa épsilon.
La expresión "gen estructural" incluye
genes que codifican polipéptidos (proteínas). Son ejemplos de dichos
polipéptidos el factor de necrosis tumoral, interferonas,
interleucinas, linfoquinas, factores de crecimiento, proteínas
plasmáticas, por ejemplo factores de coagulación y enzimas
metabólicas, y receptores. Particularmente, los polipéptidos pueden
ser aquellos capaces de aumentar la inmunogenicidad de las células.
Estos polipéptidos pueden ser polipéptidos ausentes en células
tumorales, por ejemplo, citoquinas tales como IL-2 y
GM-CSF, y moléculas co-estimulantes
tales como B7-1, antígenos asociados a tumores, por
ejemplo MAGE1, tirosinasas y polipéptidos víricos, por ejemplo E7
del virus del papiloma humano y el polipéptido
EBNA-3 del virus de Epstein-Barr.
Además, los polipéptidos pueden ser polipéptidos adaptadores,
motivos de oligomerización de un polipéptido, fragmentos
polipeptídicos de polipéptidos de envoltura de virus y hormonas. El
término "gen estructural" incluye además oligonucleótidos
antisentido, ácidos nucleicos peptídicos, secuencias de consenso
para factores de transcripción y ribozimas.
De acuerdo con la invención, son preferidas las
partículas que contienen una proteína de fusión, incluyendo dicha
proteína de fusión una LHBs o fragmentos de la misma y un lugar de
enlace heterólogo, particularmente RGD. Resulta ventajoso que el
lugar de enlace heterólogo, por ejemplo RGD, esté presente en vez
del lugar de enlace homólogo. Resulta particularmente preferente
que la proteína de fusión comprenda la secuencia de aminoácidos de
la figura 1 o una secuencia de aminoácidos que difiere de la misma
en uno o más aminoácidos.
Además, resultan preferentes las partículas que
contienen una proteína de fusión que incluye un HBcAg, un péptido
que proporciona permeabilidad celular tal como se ha descrito
anteriormente, particularmente con la secuencia de aminoácidos
indicada anteriormente, y un lugar de enlace heterólogo,
particularmente RGD. Resulta particularmente preferente que la
proteína de fusión comprenda la secuencia de aminoácidos de la
figura 2 o una secuencia de aminoácidos que difiera de la misma en
uno o más aminoácidos.
La expresión "secuencia de aminoácidos que
difiere en uno o más aminoácidos" indica que dicha secuencia de
aminoácidos especifica una proteína de fusión que tiene elementos
comparables y funciona como la proteína de fusión de la figura 1 o
la figura 2, pero que difiere de la secuencia de aminoácidos de la
figura 1 o la figura 2 en hasta un 20%, preferentemente un 10%.
Se puede preparar una partícula según la
presente invención mediante métodos convencionales. Si la partícula
contiene, por ejemplo, una proteína de fusión que incluye un LHBs en
el que el lugar de enlace homólogo está sustituido por un lugar de
enlace heterólogo, particularmente RGD, resulta ventajoso un método
que contiene las siguientes etapas:
- (a)
- cotransfección de células que codifican el genoma de un virus de la hepatitis B, en la que las células no expresan LHBs, con un primer vector de expresión que codifica una proteína de fusión que comprende una LHBs, en el que el lugar de enlace homólogo está sustituido por un lugar de enlace heterólogo, particularmente RGD, y con un segundo vector de expresión que comprende una señal de empaquetamiento específica de virus y un gen estructural; y
- (b)
- aislamiento y purificación de la partícula.
Si la partícula contiene una proteína de fusión
que incluye un HBcAg, un péptido que proporciona permeabilidad
celular tal como se ha descrito anteriormente, particularmente el
péptido con la secuencia de aminoácidos anterior, y un lugar de
enlace heterólogo, particularmente RGD, resulta ventajoso un
procedimiento que incluye las siguientes etapas:
\newpage
- (a)
- cotransfección de células que codifican una polimerasa HBV con un primer vector de expresión que codifica una proteína de fusión que comprende HBcAg, un péptido que proporciona permeabilidad celular tal como se ha descrito anteriormente, particularmente el péptido con la secuencia de aminoácidos anterior, y un lugar de enlace heterólogo, particularmente RGD, y con un segundo vector de expresión que comprende una señal de empaquetamiento específica de virus y un gen estructural; y
- (b)
- aislamiento y purificación de la partícula.
Con respecto a las expresiones "vector de
expresión", "células" y "aislamiento y purificación",
se hace referencia a las explicaciones siguientes, particularmente
en los ejemplos. Con respecto al resto de términos, se hace
referencia a las explicaciones anteriores.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en una proteína de fusión que comprende una proteína vírica, un
péptido que proporciona permeabilidad celular y un lugar de enlace
heterólogo específico de células, particularmente RGD, en la que el
péptido que proporciona permeabilidad celular comprende la secuencia
de aminoácidos P L S S I F S R I G D P, o una secuencia de
aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos P L S S I F
S R I G D P en un aminoácido, en la que la secuencia de aminoácidos
que difiere de la secuencia de aminoácidos P L S S I F S R I G D P
en un aminoácido está codificada por una secuencia de ácido nucleico
que se hibridiza con la secuencia de ácido nucleico CCC CTA TCG TCA
ATC TTC TCG AGG ATT GGG GAC CCT. Preferentemente, la proteína
vírica es una LHBs o un HBcAg. Preferentemente, la proteína de
fusión incluye la secuencia de aminoácidos de la figura 1 o la
figura 2, o una secuencia de aminoácidos que difiere de las mismas
en uno o más aminoácidos.
Con respecto a la expresión "secuencia de
aminoácidos que difiere en uno o más aminoácidos", se hace
referencia a las explicaciones anteriores.
Otro objetivo de la presente invención es un ADN
que codifica una proteína de fusión mencionada anteriormente.
Preferentemente, se trata de un ADN que incluye lo siguiente:
- (a)
- el ADN descrito en las figuras 1 ó 2, o un ADN que difiere del mismo en uno o más pares de bases; o
- (b)
- un ADN relacionado con el ADN de (a) a través del código genético degenerado.
La expresión "ADN que difiere en uno o más
pares de bases" indica que dicho ADN codifica una proteína de
fusión que comprende elementos comparables y funciona tal como la
proteína de fusión de la figura 1 o la figura 2, pero que difiere
de la secuencia de bases de la figura 1 o la figura 2 de tal modo
que, en la secuencia de aminoácidos, existe una diferencia, como
máximo, del 20%, preferentemente del 10%.
Un ADN según la invención puede existir como tal
o en un vector. Particularmente, un ADN según la invención puede
existir en un vector de expresión. Los ejemplos de dichos vectores
de expresión son conocidos por el experto en la materia. En el caso
de un vector de expresión para E. coli, dichos factores son,
por ejemplo, pGEMEX, derivados de pUC, pGEX-2T,
pET3b y pQE-8. pY100 e Ycpad1 son ejemplos para la
expresión en levadura, mientras que pKCR, pEFBOS, cDM8, pCEV4,
pCDNA3, pKSV10, pRCMV y pRK5 son ejemplos para la expresión en
células animales. El vector de expresión de baculovirus
pAcSGHisNT-A es particularmente adecuado para la
expresión en células de insecto.
El experto en la materia conoce células
adecuadas para la expresión del ADN según la invención presente en
un vector de expresión. Los ejemplos de dichas células incluyen las
cepas de E. coli HB101, DH1, x1776, JM101, JM 109, BL21, SG
13009 y M15pRep4, la cepa de levadura Saccharomyces
cerevisiae, las células animales L, NIH 3T3, FM3A, CHO, COS,
Vero, HeLa, Hep62, CCL13 y 293, las células de insecto Sf9 y Sf21, y
las células vegetales Lupinus albus.
El experto en la materia conoce procedimientos y
condiciones para la transformación o transfección de células con un
vector de expresión que contiene el ADN según la presente invención,
así como para el cultivo de las células. También conoce
procedimientos para el aislamiento y purificación de la proteína
vírica expresada por el ADN según la presente invención.
Un anticuerpo dirigido contra la proteína de
fusión mencionada anteriormente se puede preparar mediante métodos
convencionales. El mismo puede ser policlonal o monoclonal. Al
prepararlo, resulta ventajoso inmunizar animales, particularmente
conejos o pollos para un anticuerpo policlonal y ratones para un
anticuerpo monoclonal, con la proteína de fusión. Además, también
pueden tener lugar "refuerzos" de los animales con la proteína
de fusión. A continuación, el anticuerpo policlonal se puede
obtener a partir del suero o la yema de huevo de los animales. Para
anticuerpos monoclonales, las células de bazo de los animales se
funden con células de mieloma.
- (a)
- una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención,
- (b)
- un ADN de acuerdo con la presente invención,
- (c)
- un anticuerpo tal como se ha descrito anteriormente, así como
- (d)
- adyuvantes convencionales, tales como portadores, amortiguadores, disolventes, controles, etc.
pueden estar presentes como componentes de un
kit.
Pueden estar presentes uno o más representantes
de cada uno de los componentes individuales. Con respecto a los
términos individuales, se hace referencia a las explicaciones
anteriores.
La presente invención da a conocer un sistema de
transferencia de genes que es específico, en otras palabras, con el
que se pueden alcanzar las células deseadas y se pueden introducir
genes en las mismas. Las células pueden estar presentes
individualmente o en un tejido. Además, las células pueden ser
aisladas o estar presentes en el cuerpo de un individuo. En
consecuencia, la presente invención es adecuada para una terapia
génica ex vivo o in vivo de células o tejidos,
respectivamente. La aplicación de la presente invención se puede
seguir y controlar mediante anticuerpos de acuerdo con la presente
invención.
En consecuencia, la presente invención
representa un avance importante en el ámbito de las modificaciones
terapéuticas de genes en células o tejidos de un modo dirigido.
La figura 1 muestra las secuencias de
aminoácidos y de ADN de una proteína de fusión según la presente
invención, que incluye una LHBs y el lugar de enlace heterólogo RGD,
reemplazando este último el lugar homólogo.
La figura 2 muestra las secuencias de
aminoácidos y de ADN de una proteína de fusión según la presente
invención, que incluye un HBcAg, un péptido que proporciona
permeabilidad celular con la secuencia de aminoácidos anterior y el
lugar de enlace heterólogo RGD.
La presente invención se describe mediante los
siguientes ejemplos:
Para alcanzar esto, se empieza por el plásmido
pTKTHBV2 (véase Will y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. 82 (1985),
891-895). El mismo contiene dos copias del genoma de
HBV. Un fragmento de ntHBV2821 (primera copia) a ntHBV2870 (segunda
copia) se amplifica en un primer PCR. El primer directo (nt
2821-2855) presenta la siguiente secuencia: CCA TAT
TCT TGG GAA CAA GAT ATC CAG CAC GGG GC. Se subraya un lugar
de escisión por EcoRV. El triplete ACG entre nt
2849-2852 sustituye el codón de inicio ATG de LHBs.
El primer inverso (nt 2877-2845) presenta la
siguiente secuencia GGA TTG CTG GTG GAA GAT ATC TGC CCC GTG
CTG. Se subraya un lugar de escisión por EcoRV. El triplete CGT
entre nt 2852-2849 sustituye el triplete natural
CAT. Los fragmentos PCR obtenidos se digieren por EcoRV y se
purifican en un gel de agarosa al 1% preparativo. Un fragmento de
aproximadamente 3,3 kb de tamaño se eluye del gel y se almacena.
En un segundo PCR, se utilizan un primer directo
que comprende un lugar de escisión por EcoRV seguido por la
sucesiva secuencia ntHBV2860 (segunda copia) -2878 (primera copia)
(CAG CAC GGG GCA GAT ATC TTC CAC CAG CAA TCC), y un primer inverso
que comprende un lugar de escisión por EcoRV seguido por la sucesiva
secuencia ntHBV 2830-2810 (GC CCC GTG CTG GAT ATC
ATC TTG TTC CCA AGA ATA TGG). Los fragmentos PCR obtenidos se
digieren por EcoRV y se purifican en un gel de agarosa al 1%
preparativo. Un fragmento del tamaño esperado se eluye del gel y se
desfosforila. Este fragmento se utiliza en una reacción de ligasa
con el fragmento anterior de aproximadamente 3,3 kb, en la que se
obtiene el vector de expresión de HBV pTKTHBV2Ldef. Este vector de
expresión codifica todas las proteínas específicas de HBV, excepto
LHBs.
El fragmento ntHBV2990-834 se
amplifica por PCR empezando por el plásmido pTKTHBV2 (véase
referencia anterior). El primer 5' presenta la siguiente secuencia:
AAA AGA TCT GGC CGT GGC GAA GGA GCT GGA GCA TTC. Esta secuencia
incluye un lugar de escisión BglII seguido por un codon de inicio
ATG y la secuencia que codifica el tripéptido RGD. Se utiliza en el
marco de lectura específico de PreS1. El primer 3' presenta la
siguiente secuencia: AAA AGA TCT GGT TTA AAT GTA TAC CCA AAG. Esta
secuencia incluye un lugar de escisión BglII. Los fragmentos PCR
obtenidos se digieren con BglII y se insertan en el vector pCDNA.3
(Invitrogen), que se ha escindido con BglII y se ha desfosforilado,
con lo que se obtiene el vector de expresión pCRGDLHBs. Este vector
de expresión codifica una LHBs acortada por su extremo
N-terminal que incluye el lugar de enlace RGD.
Una secuencia que codifica la señal de
empaquetamiento de HBV épsilon, por ejemplo ntHBV
1840-1914, se amplifica por PCR. Se introduce un
lugar de escisión EcoRV a través del primer utilizado. La secuencia
del primer directo es: CCC GAT ATC ATG TCA TCT CTT GTT CAT GTC CTA.
La secuencia del primer inverso es: GGG GAT ATC GGT CGA TGT CCA TGC
CCC AAA. Los fragmentos PCR obtenidos se escinden mediante EcoRV y
se insertan en el vector pCDNA.3 (véase referencia anterior), que
se ha escindido mediante EcoRV y se ha desfosforilado, obteniéndose
el vector pcVPHBV. Este vector contiene la señal de empaquetamiento
específica de HBV épsilon.
Empezando por el vector pCeGFP (Invitrogen), que
codifica una "proteína verde fluorescente" bajo el control del
promotor CMV, la secuencia que contiene el promotor CMV y el gen GFP
se amplifica por PCR. El primer directo tiene la siguiente
secuencia: GGG GGA TCC CGA TGT ACG GGC CAG ATA TAC GCG TTG. El
primer inverso tiene la siguiente secuencia: GGG GGA TCC GCG GCC
GCT TTA CTT GTA. Los primeros utilizados contienen cada uno un lugar
de escisión BamHI. Los fragmentos PCR obtenidos se escinden
mediante BamHI y se insertan en el vector pCVPHBV (Invitrogen), que
se ha escindido mediante BamHI y se ha desfosforilado, obteniéndose
el vector de expresión pCVPHBVeGFP. Este vector de expresión
contiene la señal de empaquetamiento específica de HBV épsilon, el
promotor CMV y una secuencia que codifica la eGFP.
Aproximadamente 0,8 x 10^{6} células HepG2 se
transfectan con 4 \mug de pTKTHBV2Ldef (véase (A)) y 2 \mug de
pCDNA.3 (véase (B)) mediante lipofección. pCDNA.3 codifica la
resistencia a G418. 2 h después de la transfección, las células se
transfieren a un medio que contiene 700 mg de G418/l. Los clones
resistentes a G418 se subcultivan después de 14 d. La integración
estable de pTKTHBV2Ldef se confirma mediante PCR y "Southern
Blots". La expresión de la proteína de superficie SHBs a partir
de HBV y a partir de HBcAg se confirma mediante anticuerpos
específicos en ELISA. Se obtiene la línea celular de
empaquetamiento HepG2-TKTHBV2Ldef. Esta línea
celular expresa todas las proteínas específicas de HBV, excepto
LHBs.
Aproximadamente 0,8 x 10^{6} células de la
línea celular de empaquetamiento de (D) se transfectan con 3 \mug
de pCRGDLHBs (véase (B)) y 3 \mug de pCVPHBVeGFP (véase (B))
mediante lipofección. 72 h después de la transfección, las células
o sus sobrenadantes se recolectan y se someten a una precipitación
con PEG. A continuación, se lleva a cabo una centrifugación por
gradiente de densidad CsCl. Las partículas según la invención se
obtienen en forma pura. Dichas partículas incluyen todas las
proteínas específicas de HBV, excepto LHBs, que está sustituida por
una RGD-LHBs.
Se utiliza un ADN que codifica un péptido que
proporciona permeabilidad celular (en lo sucesivo, designado ZPP).
Dicho ADN presenta la siguiente secuencia: XXX AGA TCT ATC CCC ATA
TCG TCA ATC TTC TCG AGG ATT GGG GAC CCT GGA TCC XXX (X designa un
nucleótido cualquiera). Esta secuencia presenta en su extremo 5' un
lugar de escisión BglII, seguido por un codón de inicio ATG y, en
su extremo 3', un lugar de escisión BamHI. Una molécula de ADN de
doble cadena basada en la secuencia anterior se escinde con
BamHI/BglII y se inserta en el vector de expresión pCDNA.3 (véase
referencia anterior), que se ha escindido mediante BamHI y se ha
desfosforilado, obteniéndose el vector de expresión pCZPP.
Además, el vector de expresión pTKTHBV2 (véase
referencia anterior) se utiliza para amplificar el fragmento
nt-HBV 1861-2136 mediante PCR. El
primer directo incluye la siguiente secuencia: XXX GGA TCC ACT GTT
CTA GCC TCC AAG CTG. Esta secuencia incluye un lugar de escisión
BamHI seguido por la secuencia ntHB 1861-1881. El
primer inverso incluye la siguiente secuencia: XXX GAA TTC TGG ATC
TTC CAA ATT AAC ACC CAC CCA. Esta secuencia incluye un lugar de
escisión EcoRI seguido por la secuencia ntHBV
2139-2116. En un segundo PCR, el fragmento ntHBV
2140-2480, que se extiende por su extremo 5' con la
secuencia que codifica el motivo RGD, se amplifica. El primer
directo incluye la siguiente secuencia: XXX GAA TTC CGA GGC GAC GCG
TCT AGA GAC CTA GTA GTC. Esta secuencia incluye un lugar de
escisión EcoRI seguido por la secuencia que codifica el motivo RGD y
la secuencia ntHBV2140-2161. El primer inverso
incluye la siguiente secuencia: XXX AAG CTT TCC CCA CCT TAT GAG TCC
AAG. Esta secuencia incluye un lugar de escisión HindIII seguido
por la secuencia ntHBV 2480-2460.
Los fragmentos obtenidos a partir de los dos PCR
se escinden mediante EcoRI y se ligan entre sí. El producto de
ligación se utiliza como patrón para un PCR posterior, en el que el
primer directo del primer PCR se utiliza como primer directo y el
primer inverso del segundo PCR se utiliza como primer inverso. Los
fragmentos PCR obtenidos se escinden mediante BamHI/HindIII y se
insertan en el vector pCZPP, que se ha escindido mediante
BamHI/HindIII y se ha desfosforilado, obteniéndose el vector de
expresión pCZPPHBcRGC. Este vector de expresión codifica un HBcAg
que
contiene la secuencia ZPP en su extremo N-terminal y la secuencia de RGD en la región de los aminoácidos 79-82.
contiene la secuencia ZPP en su extremo N-terminal y la secuencia de RGD en la región de los aminoácidos 79-82.
Además, aproximadamente 0,8 x 10^{6} células
HepG2 se transfectan mediante lipofección con 4 \mug de un vector
de expresión que codifica la HBV polimerasa y con 2 \mug de
pCDNA.3. En este punto se hace referencia a la descripción anterior
del ejemplo 1 (D). Se obtiene una línea celular designada
HepG2-HBV Pol.
Aproximadamente 0,8 x 10^{6} células de la
línea celular HepG2-HBV Pol se transfectan con 3
\mug de pCZPPHBcRGC y 3 \mug de pCVPHBVeGFP (véase ejemplo 1,B)
mediante lipofección. En este punto se hace referencia a la
descripción anterior del ejemplo 1 (E). Se obtienen partículas según
la presente invención en forma pura.
Aproximadamente 1 x 10^{9} partículas según la
presente invención del ejemplo 1 (E) o del ejemplo 2 se disuelven
en 100 \mul de solución salina al 0,9% y se inyectan en la vena de
la cola de ratones balb/c. El músculo sóleo y tibial anterior se
aísla 48 h después de la inyección y se congela lentamente en un
"resto de tejido". Se preparan rodajas criogénizadas a partir
de las preparaciones congeladas y se analizan en un microscopio de
fluorescencia con excitación azul.
Se obtiene una fluorescencia verde en los
fibroblastos que indica la expresión de la "proteína verde
fluorescente".
Se prepara la proteína de fusión de la figura 1
según la presente invención. Con este objetivo, se proporciona al
ADN de la figura 1, en su extremo 5', un linker BglII y, en su
extremo 3', un linker BglII, y a continuación se escinde con las
correspondientes enzimas de restricción. El fragmento BglII/BglII
obtenido se inserta en el vector de expresión pQE8 escindido con
BamHI, de tal modo que se obtiene el plásmido de expresión
pQE8/LHBs. Dicho plásmido codifica una proteína de fusión de 6
residuos de histidina (pareja N-terminal) y la
proteína de fusión según la invención de la figura 1 (pareja
C-terminal). El pQE-8/LHBs se
utiliza para la transformación de E. coli SG 13009 (véase
Gottesman, S. y otros, J. Bacteriol. 148, (1981),
265-273). Las arterias se cultivan en un medio LB
con 100 \mug/ml de ampicilina y 25 \mug/ml de kanamicina, y se
inducen durante 4 h con
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido
60 \muM (IPTG). La lisis de las bacterias se alcanza mediante la
adición de hidrocloruro de guanidina 6 M, tras lo cual se lleva a
cabo una cromatografía (resina Ni-NTA) del lisado
en presencia de urea 8 M de acuerdo con las instrucciones del
fabricante (Qiagen) del material cromatográfico. La proteína de
fusión fijada se eluye en una solución tampón a pH 3,5. Tras la
neutralización, la proteína de fusión se somete a electroforesis de
gel de poliacrilamida-SDS 18% y se tiñe con azul de
Coomassie (véase Thomas, J.O. y Kornberg, R.D., J. Mol. Biol. 149,
(1975), 709-733).
Se ha puesto de manifiesto que una proteína de
fusión según la invención se puede preparar en forma muy pura.
Una proteína de fusión según el ejemplo 4 de
acuerdo con la invención se somete a electroforesis de gel de
poliacrilamida-SDS 18%. Tras la tinción del gel con
acetato de sodio 4 M, se corta una banda de 38 kD del gel y se
incuba en solución salina tamponada con fosfato. Trozos del gel se
sedimentan antes de la determinación de la concentración de
proteína del sobrenadante por electroforesis de gel de
poliacrilamida-SDS y tinción con azul de Coomassie.
Se inmunizan animales con el polipéptido de fusión purificado
mediante gel del modo siguiente:
Se utilizan para cada inmunización 35 \mug de
proteína de fusión purificada mediante gel en 0,7 ml de PBS y 0,7 ml
de adyuvante de Freund completo o incompleto.
Día 0: 1ª inmunización (adyuvante de Freund
completo)
Día 14: 2ª inmunización (adyuvante de Freund
incompleto; icFA)
Día 28: 3ª inmunización (icFA)
Día 56: 4ª inmunización (icFA)
Día 80: sangrado
El suero de conejo se somete a ensayo en un
Inmunoblot. Con este objetivo, una proteína de fusión del ejemplo 4
según la invención se somete a electroforesis de gel de
poliacrilamida-SDS y se transfiere a un filtro de
nitrocelulosa (véase Khyse-Andersen, J., J. Biochem.
Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Se lleva a cabo
el análisis Western Blot tal como se describe en Bock, C.-T. y
otros, Virus Genes 8, (1994), 215-229. Con este
objetivo, el filtro de nitrocelulosa se incuba durante 1 h a 37ºC
con un primer anticuerpo. Este anticuerpo es el suero del conejo
(1:10.000 en PBS). Tras diversas etapas de lavado con PBS, el filtro
de nitrocelulosa se incuba con un segundo anticuerpo. Este
anticuerpo es un anticuerpo IgG monoclonal anticonejo de cabra
(Dianova) acoplado con fosfatasa alcalina (1:5.000) en PBS. Tras 30
minutos de incubación a 37ºC, se llevan a cabo diversas etapas de
lavado con PBS y a continuación la detección de la fosfatasa
alcalina con solución de desarrollo (36 \muM 5'
bromo-4-cloro-3-indolilfosfato,
400 \muM nitroazul de tetrazolio, 100 mM tris-HCl,
pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl_{2}) a temperatura ambiente hasta
que las bandas se hacen visibles.
Se ha puesto de manifiesto que se pueden
preparar anticuerpos policlonales dirigidos a una proteína de fusión
según la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizan para cada inmunización 40 \mug de
proteína de fusión purificada mediante gel en 0,8 ml de PBS y 0,8 ml
de adyuvante de Freund completo o incompleto.
Día 0: 1ª inmunización (adyuvante de Freund
completo)
Día 28: 2ª inmunización (adyuvante de Freund
incompleto; icFA)
Día 50: 4ª inmunización (icFA)
Los anticuerpos se extraen de la yema de huevo y
se someten a ensayo de Western Blot. Se detectan anticuerpos
policlonales dirigidos a una proteína de fusión según la presente
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizan para cada inmunización 12 \mug de
proteína de fusión purificada mediante gel en 0,25 ml de PBS y 0,25
ml de adyuvante de Freund completo o incompleto. En la cuarta
inmunización, la proteína de fusión se disuelve en 0,5 ml (sin
adyuvante).
Día 0: 1ª inmunización (adyuvante de Freund
completo)
Día 28: 2ª inmunización (adyuvante de Freund
incompleto; icFA)
Día 56: 3ª inmunización (icFA)
Día 84: 4ª inmunización (PBS)
Día 87: fusión
Los sobrenadantes de los hibridomas se someten a
ensayo de Western Blot. Se detectan anticuerpos dirigidos a una
proteína de fusión según la presente invención.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Dr. Eberhardt Hildt, Klinikum Rechts d. Isar
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Ismaninger Str.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Muenchen
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Deutschland
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- C.P.: 81675
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Partikel zur Gentherapie
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 19
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE SOLICITUD: DE 199 04 800.2
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 347 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: Peptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº1
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 215 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: Peptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 2
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 663 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 3
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1047 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 4
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 Pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCATATTCTT GGGAACAAGA TATCCAGCAC GGGGC
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 Pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGATTGCTGG TGGAAGATAT CTGCCCCGTG CTG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 Pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGCACGGGG CAGATATCTT CCACCAGCAA TCC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 Pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCCCGTGCT GGATATCATC TTGTTCCCAA GAATATGG
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 Pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAAAGATCTG GCCGTGGCGA AGGAGCTGGA GCATTC
\hfill36
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 Pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAAAGATCTG GTTTAAATGT ATACCCAAAG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 Pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCGATATCA TGTCATCTCT TGTTCATGTC CTA
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 Pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGATATCG GTCGATGTCC ATGCCCCAAA
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 Pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGATCCC GATGTACGGG CCAGATATAC GCGTTG
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 Pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGATCCG CGGCCGCTTT ACTTGTA
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 57 Pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipNNNAGATCTA TGCCCATATC GTCAATCTTC TCGAGGATTG GGGACCCTGG ATCCNNN
\hfill57
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 Pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipNNNGGATCCA CTGTTCAAGC CTCCAAGCTG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 Pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipNNNGAATTCT GGATCTTCCA AATTAACACC CACCCA
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 Pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipNNNGAATTCC GAGGCGACGC GTCTAGAGAC CTAGTAGTC
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 Pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: Cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: Otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc= "Primer"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipNNNAAGCTTT CCCCACCTTA TGAGTCCAAG
\hfill30
Claims (18)
1. Partícula, que comprende:
- (a)
- una envoltura de proteína con una proteína de fusión, comprendiendo dicha proteína de fusión una proteína vírica, un péptido que proporciona permeabilidad celular y un lugar de enlace heterólogo específico de célula; y
- (b)
- un ácido nucleico presente dentro de la envoltura de proteína, que comprende secuencias para una señal de empaquetamiento específica de virus y un gen estructural,
en la que el péptido que proporciona
permeabilidad celular comprende la secuencia de aminoácidos P L S S
I F S R I G D P, o una secuencia de aminoácidos, que difiere de la
secuencia de aminoácidos P L S S I F S R I G D P en un aminoácido,
en la que la secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de
aminoácidos P L S S I F S R I G D P en un aminoácido está codificada
por una secuencia de ácido nucleico, que se hibridiza con la
secuencia de ácido nucleico CCC CTA TCG TCA ATC TTC TCG AGG ATT GGG
GAC CCT.
2. Partícula según la reivindicación 1, en la
que la proteína vírica deriva de un adenovirus, de un virus
adeno-asociado, del virus vacuna, de un baculovirus
o de un hepadnavirus.
3. Partícula según la reivindicación 2, en la
que el hepadnavirus es un virus de la hepatitis B.
4. Partícula según una de las reivindicaciones 1
a 3, en la que la proteína vírica es una proteína de superficie.
5. Partícula según la reivindicación 4, en la
que la proteína de superficie es una LHBs.
6. Partícula según una de las reivindicaciones 1
a 3, en la que la proteína vírica es una proteína de núcleo.
7. Partícula según la reivindicación 6, en la
que la proteína de núcleo es un HBcAg.
8. Partícula según una de las reivindicaciones 1
a 7, en la que el péptido que proporciona permeabilidad celular
presenta la siguiente secuencia de aminoácidos: P L S S I F S R I G
D P.
9. Partícula según una de las reivindicaciones 1
a 8, en la que el lugar de enlace heterólogo específico de célula es
RGD.
10. Partícula según una de las reivindicaciones
1 a 9, en la que la proteína de fusión es la de las figuras 1 ó
2.
11. Procedimiento para la preparación de la
partícula según la reivindicación 1, en el que la proteína de fusión
contiene una LHBs y un lugar de enlace heterólogo específico de
célula, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas:
- (a)
- cotransfección de células, que codifican el genoma de un virus de la hepatitis B, en la que las células no expresan LHBs, con un primer vector de expresión, que codifica una proteína de fusión que comprende una LHBs y un lugar de enlace heterólogo específico de célula, y con un segundo vector de expresión que comprende una señal de empaquetamiento específica de virus y un gen estructural; y
- (b)
- aislamiento y purificación de la partícula.
12. Procedimiento para la preparación de la
partícula según la reivindicación 1, en el que la proteína de fusión
comprende un HBcAg, un péptido que proporciona permeabilidad celular
y un lugar de enlace heterólogo específico de célula, comprendiendo
dicho procedimiento las siguientes etapas:
- (a)
- cotransfección de células, que codifican una polimerasa HBV con un primer vector de expresión, que codifica una proteína de fusión, que comprende un HBcAg, un péptido que proporciona permeabilidad celular y un lugar de enlace heterólogo específico de célula, y con un segundo vector de expresión que comprende una señal de empaquetamiento específica de virus y un gen estructural; y
- (b)
- aislamiento y purificación de la partícula.
13. Proteína de fusión, que comprende una
proteína vírica, un péptido que proporciona permeabilidad celular y
un lugar de enlace heterólogo específico de célula, en la que el
péptido que proporciona permeabilidad celular comprende la secuencia
de aminoácidos P L S S I F S R I G D P, o una secuencia de
aminoácidos, que difiere de la secuencia de aminoácidos P L S S I F
S R I G D P en un aminoácido, en la que la secuencia de aminoácidos
que difiere de la secuencia de aminoácidos P L S S I F S R I G D P
en un aminoácido está codificada por una secuencia de ácido nucleico
que se hibridiza con la secuencia de ácido nucleico CCC CTA TCG TCA
ATC TTC TCG AGG ATT GGG GAC CCT.
14. Proteína de fusión según la reivindicación
13, que comprende la secuencia de aminoácidos en las figuras 1 ó 2,
o una secuencia de aminoácidos que difiere de la misma en uno o más
aminoácidos y difiere de la secuencia de aminoácidos descrita en las
figuras 1 ó 2 en hasta un 20%.
15. ADN, que codifica la proteína de fusión
según la reivindicación 13.
16. ADN, que codifica la proteína de fusión
según la reivindicación 14, que comprende:
- (a)
- el ADN descrito en las figuras 1 ó 2, o un ADN que difiere del mismo en uno o más pares de bases; o
- (b)
- un ADN relacionado con el ADN de (a) a través del código genético degenerado.
17. Vector de expresión que codifica el ADN
según la reivindicación 16.
18. Utilización de la partícula según una de las
reivindicaciones 1 a 10 para preparar una composición farmacéutica
destinada a la terapia génica de células y tejidos.
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