ES2310588T3 - Proceso para la produccion de l-aminoacidos que utiliza cepas de la familia enterobacteriaceas que contienen un gen dgsa atenuado. - Google Patents
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Abstract
Proceso para la producción de L-aminoácidos, seleccionados del grupo de L-treonina, L-lisina y L-valina, en el cual se llevan a cabo los pasos siguientes: a) fermentación de microorganismos de la familia Enterobacteriáceas que producen el L-aminoácido deseado, b) enriquecimiento del L-aminoácido correspon-diente en el medio o en las células de los microorganismos, y c) aislamiento del L-aminoácido, en donde opcionalmente los constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o partes de la misma permanecen en el producto, en donde en el microorganismo comparado con el microorganismo inicial, la expresión del gen dgsA o la expresión de secuencias de nucleótidos que codifican el producto génico de dicho gen, el regulador del sistema fosfotransferasa, está apagada.
Description
Proceso para la producción de
L-aminoácidos que utiliza cepas de la familia
Enterobacteriáceas que contienen un gen dgsA atenuado.
La presente invención se refiere a un proceso
para la producción enzimática de los L-aminoácidos
L-treonina, L-lisina y
L-valina que utiliza cepas de la familia
Enterobacteriáceas en las cuales el gen dgsA está atenuado.
Los L-aminoácidos, en particular
L-treonina, se utilizan en medicina humana y en la
industria farmacéutica, en la industria alimentaria, y muy
especialmente en nutrición animal.
Es conocida la producción de
L-aminoácidos por fermentación de cepas de
Enterobacteriáceas, en particular Escherichia coli (E.
coli) y Serratia marcescens. Teniendo en cuenta su gran
importancia, se están realizando constantemente esfuerzos para
mejorar los procesos para producción de las últimas. Las mejoras de
proceso pueden referirse a medidas de la tecnología de la
fermentación, tales como por ejemplo agitación y provisión de
oxígeno, o la composición de los medios nutrientes, tales como por
ejemplo la concentración de azúcar durante la fermentación, o el
acabado de la forma del producto, por ejemplo por cromatografía de
intercambio iónico, o las propiedades intrínsecas de eficiencia del
microorganismo propiamente dicho.
Se emplean métodos que comprenden mutagénesis,
selección y elección de mutantes a fin de mejorar las propiedades
de eficiencia de estos microorganismos. De este modo, se obtienen
cepas que son resistentes a antimetabolitos, tales como por ejemplo
el análogo de treonina ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxivalérico
(AHV) o son auxótrofas para metabolitos importantes como
reguladores, y que producen L-aminoácidos tales como
por ejemplo L-treonina.
Se han utilizado métodos de la tecnología del
DNA recombinante desde hace algunos años a fin de mejorar las cepas
de la familia Enterobacteriáceas productoras de
L-aminoácidos, por amplificación de genes
individuales de la biosíntesis de aminoácidos e investigación de su
efecto sobre la producción.
El objeto de la invención es proporcionar nuevas
medidas para la producción enzimática mejorada de
L-aminoácidos, en particular
L-treonina.
La presente invención proporciona un proceso
para la producción enzimática de L-aminoácidos,
seleccionados del grupo L-treonina,
L-lisina y L-valina que utiliza
microorganismos de la familia Enterobacteriáceas que producen ya en
particular el L-aminoácido deseado y en los cuales
la secuencia de nucleótidos que codifica el gen dgsA está
atenuada.
En los casos en que se mencionan
L-aminoácidos o aminoácidos en lo sucesivo, debe
entenderse que esto significa uno o más aminoácidos con inclusión
de sus sales, seleccionados del grupo que comprende
L-treonina, L-valina y
L-lisina. Se prefiere particularmente
L-treonina.
El término "atenuación" describe en este
contexto la reducción o conmutación de la actividad intracelular de
una o más enzimas (proteínas) en un microorganismo que están
codificadas por el DNA correspondiente, utilizando por ejemplo un
promotor débil o un gen o alelo que codifica una enzima
correspondiente con actividad baja y/o que desactiva la enzima
(proteína) o el gen correspondiente, y combinando opcionalmente
estas medidas.
Por medio de estas medidas de atenuación, la
actividad o concentración de la proteína correspondiente se reduce
por regla general hasta 0 a 75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% o 0 a 5%
de la actividad o concentración de la proteína de tipo salvaje, o
la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo
inicial.
El proceso se caracteriza porque se llevan a
cabo los pasos siguientes:
- a)
- fermentación de microorganismos de la familia Enterobacteriáceas que producen el L-aminoácido deseado,
- b)
- enriquecimiento del L-aminoácido correspon-diente en el medio o en las células de los microorganismos de la familia Enterobacteriáceas, y
- c)
- aislamiento del L-aminoácido deseado, en donde opcionalmente los constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o partes de la misma permanecen en el producto,
en donde en el microorganismo
comparado con el microorganismo inicial, la expresión del gen dgsA o
la expresión de secuencias de nucleótidos que codifican el producto
génico de dicho gen, el regulador del sistema fosfotransferasa,
está
apagada.
Los microorganismos que son objeto de la
presente invención pueden producir L-aminoácidos a
partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas,
opcionalmente almidón, opcionalmente celulosa o de glicerol y
etanol. Los microorganismos son miembros de la familia
Enterobacteriáceas seleccionados de los géneros Escherichia,
Erwinia, Providencia y Serratia. Se prefieren los géneros
Escherichia y Serratia. En el caso del género Escherichia, puede
mencionarse en particular la especie Escherichia coli, y en
el caso del género Serratia puede mencionarse en particular la
especie Serratia marcescens.
Cepas adecuadas del género Escherichia, en
particular las de la especie Escherichia coli, que producen
en particular L-treonina incluyen por ejemplo:
Escherichia coli TF427
Escherichia coli H4578
Escherichia coli KY 10935
Escherichia coli VNIIgenetika Mg442
Escherichia coli VNIIgenetika M1
Escherichia coli VNIIgenetika 472T23
Escherichia coli BKIIM
B-3996
Escherichia coli kat 13
Escherichia coli
KCCM-10132
\vskip1.000000\baselineskip
Cepas adecuadas del género Serratia, en
particular de la especie Serratia marcescens, que producen
L-treonina incluyen por ejemplo:
Serratia marcescens HNr21
Serratia marcescens TLr156
Serratia marcescens T2000
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas de la familia de Enterobacteriáceas
productoras de L-treonina tienen preferiblemente,
inter alia, una o más de las características genéticas o
fenotípicas seleccionadas del grupo siguiente: resistencia a ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxivalérico,
resistencia a tialisina, resistencia a etionina, resistencia a
\alpha-metilserina, resistencia a ácido
diaminosuccínico, resistencia a ácido
\alpha-aminobutírico, resistencia a borrelidina,
resistencia a rifampicina, resistencia a análogos de valina tales
como por ejemplo hidroxamato de valina, resistencia a análogos de
purina tales como por ejemplo 6-dimetilaminopurina,
necesidad de L-metionina, opcionalmente necesidad
parcial y compensable de L-isoleucina, necesidad de
ácido meso-diaminopimélico, auxotrofia con relación
a dipéptidos que contienen treonina, resistencia a
L-treonina, resistencia a
L-homoserina, resistencia a
L-lisina, resistencia a L-metionina,
resistencia a ácido L-glutámico, resistencia a
L-aspartato, resistencia a
L-leucina, resistencia a
L-fenilalanina, resistencia a
L-serina, resistencia a L-cisteína,
resistencia a L-valina, sensibilidad a
fluoropiruvato, déficit de treonina-deshidrogenasa,
opcionalmente capacidad para utilizar sacarosa, mejora del operón
treonina, mejora de homoserina-deshidrogenasa,
l-aspartato-quinasa I,
preferiblemente de la forma resistente a realimentación, mejora de
homoserina-quinasa, mejora de
treonina-sintasa, mejora de
aspartato-quinasa, opcionalmente de la forma
resistente a la realimentación, mejora de la
aspartato-semialdehído-deshidrogenasa,
mejora de la
fosfoenol-piruvato-carboxilasa,
opcionalmente de la forma resistente a la realimentación, mejora de
la fosfoenol-piruvato-sintasa,
mejora de transhidrogenasa, mejora del producto génico RhtB, mejora
del producto génico RhtC, mejora del producto génico YfiK, mejora
de una piruvato-carboxilasa, y atenuación de la
formación de ácido acético.
Se ha encontrado ahora que microorganismos de la
familia Enterobacteriáceas, después de la atenuación, en particular
después de apagado del gen dgsA, producen
L-aminoácidos, en particular
L-treonina, de manera incrementada.
Las secuencias de nucleótidos de los genes de
Escherichia coli pertenecen a la técnica anterior y pueden
obtenerse también de la secuencia genómica de Escherichia
coli publicada por Blattner et al. (Science 277,
1453-1462 (1997)).
\newpage
El gen dgsA se describe inter alia por
los datos siguientes:
- Designación:
- Regulador del sistema de fosfotransferasa
- EC-No.:
- -
- Referencia:
- Hosono et al.; Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 59, 256-261; (1995) Morris et al.; Journal of Bacteriology 163, 785-786 (1985)
- No. de Acceso:
- AE000255
- Nota:
- El gen dgsA se designa también como gen mlc en la técnica anterior.
Aparte del gen dgsA descrito, pueden utilizarse
alelos del gen que son resultado de la degeneración del código
genético o de mutaciones de sentido funcionalmente neutral, no
alterándose sustancialmente la actividad de la proteína.
Con objeto de conseguir una atenuación, la
expresión del gen o las propiedades catalíticas de las proteínas
enzimáticas pueden reducirse o apagarse, por ejemplo. Opcionalmente,
pueden combinarse ambas medidas.
La expresión del gen puede reducirse por
condiciones de cultivo adecuadas, por alteración genética (mutación)
de las estructuras de señal de la expresión del gen, o también por
técnicas de RNA antisentido. Estructuras de señal de la expresión
génica son por ejemplo genes represores, genes activadores,
operadores, promotores, atenuadores, sitios de fijación de
ribosoma, el codón de inicio y los terminadores. La persona experta
en la técnica puede encontrar información relevante en, inter
alia, artículos publicados por Jensen y Hammler (Biotechnology
and Bioengineering 58:191-195 (1998)), por Carrier y
Keasling (Biotechnology Progress 15, 58-64 (1999),
Franch y Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3,
159-164 (2000)) y en libros de texto conocidos de
genética y biología molecular, tales como por ejemplo el libro de
texto publicado por Knippers, "Molekulare Genetik", 6ª
edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995) o el
publicado por Winnacker ("Gene and Klone", VCH
Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990).
Mutaciones que conducen a un cambio o reducción
de las propiedades catalíticas de las proteínas enzimáticas son
conocidas por la técnica anterior. Como ejemplos puede mencionarse
el trabajo publicado por Qiu y Goodman (Journal of Biological
Chemistry 272:8611-8617 (1997)), Yano et al.
(Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95,
5511-5515 (1998), Wente y Schachmann (Journal of
Biological Chemistry 266, 20833-20839 (1991). Puede
obtenerse información detallada de libros de texto conocidos sobre
genética y biología molecular, tales como por ejemplo el publicado
por Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag,
Stuttgart, 1986).
Mutaciones adecuadas incluyen transiciones,
transversiones, inserciones y deleciones. Dependiendo de la acción
del intercambio de aminoácido sobre la actividad enzimática, se
habla de mutaciones de sentido erróneo o mutaciones sin sentido.
Las inserciones o deleciones de al menos un par de bases en un gen
conducen a mutaciones de desplazamiento de marco, que conducen a su
vez a la incorporación de aminoácidos falsos o a la terminación
prematura de una traducción. Si, como resultado de la mutación se
forma un codón de parada en la región codificante, esto conduce
también a una terminación prematura de la traducción. Deleciones de
varios codones conducen típicamente a una disrupción completa de la
actividad enzimática. Detalles concernientes a la producción de
tales mutaciones pertenecen a la técnica anterior y pueden
obtenerse de libros de texto conocidos sobre genética y biología
molecular, tales como por ejemplo el libro de texto publicado por
Knippers ("Molekulare Genetik", 6ª edición, Georg Thieme
Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995), el de Winnacker ("Gene und
Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheinm, Alemania, 1990), o
el de Hagemann ("Allgemeine Genetik, Gustav Fischer Verlag",
Stuttgart, 1986).
Mutaciones adecuadas en los genes tales como por
ejemplo mutaciones de deleción pueden incorporarse por intercambio
de genes y/o de alelos en cepas adecuadas.
Un método convencional es el método de
intercambio de genes por medio de un derivado de pSC101
condicionalmente replicante pMAC705 descrito por Hamilton et
al. (Journal of Bacteriology 171, 4617-4622
(1989)). Otros métodos descritos en la técnica anterior, tales como
por ejemplo el de Martínez-Morales et al.
(Journal of Bacteriology 181, 7143-7148 (1999)) o
el de Boyd et al. (Journal of Bacteriology 182,
842-847 (2000)) pueden utilizarse análogamente.
Es posible también transferir mutaciones en los
genes respectivos o mutaciones relativas a la expresión de los
genes relevantes, por conjugación o transducción en diversas
cepas.
Adicionalmente, para la producción de
L-treonina, utilizando cepas de la familia
Enterobacteriáceas, puede ser ventajoso además de la atenuación del
gen dgsA intensificar también una o más enzimas del camino de
biosíntesis conocido de la treonina o enzimas de metabolismo
anaplerótico o enzimas para la producción de fosfato de
nicotinamida-adenina-dinucleótido
reducido.
El término "intensificación" describe en
este contexto el aumento de la actividad intracelular de una o más
enzimas o proteínas en un microorganismo que están codificadas por
el DNA correspondiente, mediante por ejemplo aumento del número de
copias del gen o genes, utilización de un promotor fuerte o un gen
que codifica una enzima o proteína correspondiente que tiene una
actividad alta, y opcionalmente por combinación de estas
medidas.
Por medio de las medidas de intensificación
indicadas anteriormente, en particular sobreexpresión, la actividad
o concentración de la proteína correspondiente se aumenta por regla
general al menos en un 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%,
400% o 500%, como máximo hasta 1000% o 2000% con referencia a la de
la proteína de tipo salvaje y/o la actividad o concentración de la
proteína en el microorganismo inicial.
Así pues, uno o más de los genes seleccionados
del grupo siguiente pueden sobreexpresarse simultáneamente, por
ejemplo:
- \bullet
- el operón thrABC que codifica aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa y treonina-sintasa (US-A-4.278.765),
- \bullet
- el gen pyc que codifica piruvato-carboxilasa (DE-A-19 831 609),
- \bullet
- el gen pps que codifica fosfoenol-piruvato-sintasa (Molecular and General Genetics 231:332 (1992)),
- \bullet
- el gen ppc codifica fosfoenol-piruvato-carboxilasa (Gene 31:279-283 (1984)),
- \bullet
- los genes pntA y pntB que codifican transhidrogenasa (European Journal of Biochemistry 158:647-653 (1986)),
- \bullet
- el gen rhtB, que imparte resistencia a homoserina (EP-A-0 994 190),
- \bullet
- el gen mqo que codifica malato:quinona-oxidorreductasa (DE 100 348 33.5),
- \bullet
- el gen rhtC que imparte resistencia a la treonina (EP-A-1013765), y
- \bullet
- el gen thrE de Corynebacterium glutamicum que codifica la exportación de treonina (DE 100 264 94.8).
Por regla general se prefiere el uso de genes
endógenos. El término "genes endógenos" o "secuencias de
nucleótidos endógenas" debe entenderse que significa los genes o
secuencias de nucleótidos presentes en la población de una
especie.
Adicionalmente a la producción de
L-treonina, puede ser ventajoso además de la
atenuación del gen dgsA atenuar también, en particular apagar o
reducir la expresión de uno o más de los genes seleccionados del
grupo siguiente:
- \bullet
- el gen tdh que codifica treonina-deshidrogenasa (Ravnikar y Somerville, Journal of Bacteriology 169, 4716-4721 (1987)),
- \bullet
- el gen mdh que codifica malato-deshidrogenasa (E.C.1.1.1.37) (Vogel et al., Archives in Microbiology 149, 36-42 (1987)),
- \bullet
- el producto génico del marco de lectura abierto (orf) yjfA (Número de Acceso AAC77180 del National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, MD, EE.UU.),
- \bullet
- el producto génico del marco de lectura abierto (orf) ytfP (Número de Acceso AAC77179 del National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, MD, EE.UU.),
- \bullet
- el gen pckA que codifica la enzima fosfoenol-piruvato-carboxiquinasa (Medina et al., (Journal of Bacteriology 172, 7151-7156 (1990)),
- \bullet
- el gen poxB que codifica piruvato-oxidasa (Grabau and Cronan (Nucleic Acids Research 14(13), 5449-5460 (1986))),
- \bullet
- el gen fruR que codifica el represor fructosa: (Jahreis et al., Molecular and General Genetics 226, 332-336 (1991) y No. de Acceso: AE000118), y
- \bullet
- el gen aceA codificante de isocitrato-liasa (E.C. No.: 4.1.3.1) (Matsuoku y McFadden, Journal of Bacteriology 170, 4528-4536 (1988) y No. de Acceso: AE000474).
Adicionalmente a la producción de
L-aminoácidos, en particular
L-treonina, puede ser ventajoso además para la
atenuación del gen dgsA apagar también las reacciones secundarias
indeseables (Nakayama "Breeding of Aminoacid Producing
Microorganisms", en: Overproduction of Microbial Products,
Krumphanzl, Sikyta, Vanek (compiladores), Academic Press, Londres,
Reino Unido, 1982).
\newpage
Los microorganismos producidos de acuerdo con la
invención pueden cultivarse en un proceso de lotes (cultivo por
lotes), en un proceso de realimentación (proceso de alimentación) o
en un proceso de realimentación repetido (proceso de alimentación
repetitivo). Un sumario de métodos de cultivo conocidos se describe
en el libro de texto de Chmiel (BioprozessTechnik 1. Einführung in
die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))
o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren and periphere
Einrichtungen (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)).
El medio de cultivo a utilizar debe satisfacer
adecuadamente los requerimientos de las cepas respectivas.
Descripciones de medios de cultivo de diversos microorganismos se
contienen en la guía "Manual of Methods for General
Bacteriology", de la Sociedad Americana de Bacteriología
(Washington D.C., EE.UU., 1981).
Como fuentes de carbono, pueden utilizarse
azúcares y carbohidratos tales como por ejemplo glucosa, sacarosa,
lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón y opcionalmente
celulosa, aceites y grasas tales como por ejemplo aceite de soja,
aceite de girasol, aceite de cacahuete y aceite de coco, ácidos
grasos tales como por ejemplo ácido palmítico, ácido esteárico, y
ácido linoleico, alcoholes tales como por ejemplo glicerol y etanol,
y ácidos orgánicos tales como por ejemplo ácido cítrico. Estas
sustancias se pueden utilizar individualmente o en forma de
mezclas.
Como fuente de nitrógeno, pueden utilizarse
compuestos orgánicos nitrogenados tales como peptonas, extracto de
levadura, extracto de carne, extracto de malta, agua de almidón de
maíz, harina de soja y urea o compuestos inorgánicos tales como
sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato
de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno pueden
utilizarse individualmente o en forma de mezcla.
Como fuente de fósforo, se pueden utilizar ácido
fosfórico, dihidrógeno-fosfato de potasio o
hidrogeno-fosfato dipotásico, o las sales
correspondientes que contienen sodio. El medio de cultivo debe
contener adicionalmente sales de metales, tales como por ejemplo
sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarias para el
crecimiento. Finalmente, pueden utilizarse promotores de crecimiento
esenciales tales como aminoácidos y vitaminas además de las
sustancias arriba mencionadas. Aparte de éstas, pueden añadirse al
medio de cultivo precursores adecuados. Las sustancias de partida
arriba mencionadas pueden añadirse al cultivo en forma de un lote
simple o pueden dosificarse de una manera apropiada durante el
cultivo.
Con objeto de regular el pH del cultivo, se
utilizan en caso apropiado compuestos básicos tales como hidróxido
de sodio, hidróxido de potasio, amoniaco o agua amoniacal, o
compuestos ácidos tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Con
objeto de controlar la formación de espuma, pueden utilizarse
agentes antiespumantes tales como por ejemplo poliglicolésteres de
ácidos grasos. Con objeto de mantener la estabilidad de los
plásmidos, pueden añadirse al medio sustancias adecuadas de acción
selectiva, por ejemplo antibióticos. Con objeto de mantener
condiciones aerobias, se alimentan al cultivo oxígeno o mezclas de
gases que contienen oxígeno, tales como ejemplo aire. La
temperatura del cultivo es normalmente 25ºC a 45ºC, y
preferiblemente 30ºC a 40ºC. El cultivo se continúa hasta que se ha
formado una cantidad máxima de L-aminoácidos (o
L-treonina). Este objetivo se alcanza normalmente
dentro de 10 horas a 160 horas.
Los L-aminoácidos pueden
analizarse por cromatografía de intercambio de anión seguida por
derivación con ninhidrina, como ha sido descrito por Spackman et
al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) o por HPLC en fase
inversa, como ha sido descrito por Lindroth et al.
(Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174).
El proceso de acuerdo con la invención puede
utilizarse para la producción enzimática de los
L-aminoácidos L-treonina,
L-valina y L-lisina, en particular
L-treonina.
Un cultivo puro de la cepa de Escherichia
coli K-12, DH5\alpha/pMAK705 se archivó como
DSM 13720 en fecha 8 de septiembre de 2000 en la Colección Alemana
de Microorganismos y Cultivos de Células (DSMZ, Brunswick,
Alemania) de acuerdo con el Convenio de Budapest.
La presente invención se describe con mayor
detalle en lo sucesivo con ayuda de ejemplos de implementación.
El aislamiento de DNA plasmídico de
Escherichia coli, así como todas las técnicas para la
restricción, el tratamiento Klenow y el tratamiento con fosfatasa
alcalina se llevan a cabo de acuerdo con Sambrook et al.
(Molecular Cloning - A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor
Laboratory Press). La transformación de Escherichia coli se
lleva a cabo, a no ser que se describa otra cosa, de acuerdo con
Chung et al. (Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, EE.UU. (1989) 86:
2172-2175).
La temperatura de incubación en la producción de
cepas y transformantes es 37ºC. En el proceso de intercambio de
genes de acuerdo con Hamilton et al., se utilizan
temperaturas de 30ºC y 44ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Partes de las regiones génicas situadas aguas
arriba y aguas abajo del gen dgsA y partes de la región 5' y la
región 3' del gen dgsA se amplifican a partir de Escherichia
coli K12 utilizando la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) así como oligonucleótidos sintéticos. Partiendo de la
secuencia de nucleótidos del gen dgsA y secuencias en E.
coli K12 MG1655 (SEQ ID No. 1, Número de Acceso AE000255)
situadas aguas arriba y aguas abajo, se sintetizan los iniciadores
PCR siguientes (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania):
| dgsA'5'-1: | 5'-CGAATGTAACGCTGGCTGAA-3' | (SEQ ID No. 3) |
| dgsA'5'-2: | 5'-TCCAGCAATGGCAAGTCATC-3' | (SEQ ID No. 4) |
| dgsA'3'-1: | 5'-CAGCACATCAGCGTTGAGAG-3' | (SEQ ID No. 5) |
| dgsA'3'-2: | 5'-GATCGCCTGAGCTGTTAGCA-3' | (SEQ ID No. 6) |
El DNA cromosómico de E. coli K12 MG1655
utilizado para la PCR se aísla de acuerdo con las instrucciones del
fabricante utilizando "Qiagen Genomic-tips
100/G" (QIAGEN, Hilden, Alemania). Un fragmento de DNA de aprox.
850 pb de longitud de la región 5' de la región del gen dgsA
(designada dgsA1) y un fragmento de DNA de aprox. 700 pb de
longitud de la región 3' de la región del gen dgsA (designada dgsA2)
pueden amplificarse con los iniciadores específicos en condiciones
PCR estándar (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to
Methods and Applications, Academic Press) con
taq-DNA-polimerasa
(Gibco-BRL, Eggenstein, Alemania). Los productos
PCR se ligan de acuerdo con las instrucciones del fabricante en cada
caso con el vector pCR2.1TOPO (TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen,
Groningen, Países Bajos) y se transforman en la cepa TOP10F' de
E. coli. La selección de las células que llevan el plásmido
se realiza sobre agar LB al que se han añadido 50 \mug/ml de
ampicilina. Después del aislamiento del DNA plasmídico, el vector
pCR2.1TOPO dgsA2 se escinde con las enzimas de restricción Ecl136II
y XbaI, y el fragmento dgsA2 después de la separación en gel de
agarosa al 0,8% se aísla utilizando el Kit de Extracción de Gel
QIAquick (QIAGEN, Hilden, Alemania). Después del aislamiento del DNA
plasmídico, el vector pCR2.1TOPOdgsA1 se escinde con las enzimas
EcoRV y XbaI y se liga con el fragmento dgsA2 aislado. La cepa
DH5\alpha de E. coli se transforma con el lote de ligación
y las células que llevan el plásmido se seleccionan en agar LB al
que se han añadido 50 \mug/ml de ampicilina. Después del
aislamiento del DNA plasmídico, aquellos plásmidos en los cuales
está presente la secuencia de DNA mutágena representada en SEQ ID
No. 7 en forma clonada se detectan por escisión controlada con las
enzimas HindIII y XbaI. Uno de los plásmidos se designa
pCR2.1TOPO\DeltadgsA.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El alelo dgsA descrito en el Ejemplo 1 se aísla
del vector pCR2.1TOPO\DeltadgsA después de restricción con las
enzimas HindIII y XbaI y separación en gel de agarosa al 0,8%, y se
liga con el plásmido pAMK705 (Hamilton et al., (1989)
Journal of Bacteriology 171, 4617-4622), que se
había digerido con las enzimas HindIII y XbaI. El lote de ligación
se transforma en DH5\alpha y las células que llevan el plásmido se
seleccionan en agar LB al que se han añadido 20 \mug/ml de
cloranfenicol. La clonación con éxito se detecta después del
aislamiento del DNA plasmídico y escisión con las enzimas HindIII y
XbaI. El vector de intercambio resultante pMAK705\DeltadgsA (=
pMAK705deltadgsA) se muestra en Fig. 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
La cepa MG442 de E. coli productora de
L-treonina se describe en la memoria descriptiva de
patente US-A-4.278.765 y se ha
archivado como CMIM B-1628 en la Colección Nacional
Rusa de Microorganismos Industriales (VKPM, Moscú, Rusia).
Para el intercambio del gen cromosómico dgsA por
el constructo de deleción codificado por plásmido, MG442 se
transforma con el plásmido pMAK705\DeltadgsA. El intercambio
génico se realiza por el proceso de selección descrito por Hamilton
et al. (1989) Journal of Bacteriology 171,
4617-4622) y se verifica por métodos PCR estándar
(Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and
Applications, Academic Press) con los iniciadores
oligonucleotídicos siguientes:
| dgsA'5'-1: | 5'-CGAATGTAACGCTGGCTGAA-3' | (SEQ ID No. 3) |
| dgsA'3'-2: | 5'-GATCGCCTGAGCTGTTAGCA-3' | (SEQ ID No. 6) |
Después del intercambio, la forma del alelo
\DeltadgsA que se muestra en SEQ ID No. 8 está presente en MG442.
La cepa obtenida se designa MG442\DeltadgsA.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se cultiva MG442\DeltadgsA en medio mínimo que
tiene la composición siguiente: 3,5 g/l de
Na_{2}HPO_{4}\cdot2H_{2}O, 1,5 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1
g/l de NH_{4}Cl, 0,1 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 2 g/l de
glucosa y 20 g/l de agar. La formación de
L-treonina se comprueba en cultivos de lotes de 10
ml que están contenidos en matraces Erlenmeyer de 100 ml. Para
esto, se inoculan 10 ml de medio de precultivo de la composición
siguiente: 2 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l
de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 15 g/l de CaCO_{3}, 20 g/l de
glucosa, y se incuban durante 16 horas a 37ºC y 180 rpm en una
incubadora ESR de Kühner AG, (Birsfelden, Suiza). Se reinoculan 250
\mul de este precultivo en 10 ml de medio de producción (25 g/l
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 2 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,03 g/l FeSO_{4}\cdot7H_{2}O,
0,018 g/l MnSO_{4}\cdot1H_{2}O, 30 g/l de CaCO_{3} y 20 g/l
de glucosa) y se incuba durante 48 horas a 37ºC. Después de la
incubación, se mide la densidad óptica (DO) de la suspensión de
cultivo con un fotómetro LP2W de la compañía del Dr. Lange
(Dusseldorf, Alemania) a una longitud de onda de medida de 660
nm.
La concentración de L-treonina
formada se determina luego en el sobrenadante de cultivo filtrado en
condiciones estériles utilizando un analizador de aminoácidos de
Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por
cromatografía de intercambio iónico y reacción
post-columna con detección por ninhidrina.
El resultado del test se da en la Tabla 1.
\bullet Fig. 1: pMAK705\DeltadgsA (=
pMAK705deltadgsA)
Los datos de longitud se dan como valores
aproximados. Las abreviaturas y acrónimos tienen los significados
siguientes:
- \bullet
- cat: gen de resistencia a cloranfenicol
- \bullet
- rep-ts: región de replicación sensible a la temperatura del plásmido pSC101
- \bullet
- dgsA1: parte de la región 5' del gen dgsA y de la región que se encuentra aguas arriba
- \bullet
- dgsA2: parte de la región 3' del gen dgsA y de la región que se encuentra aguas abajo
Las abreviaturas para las enzimas de restricción
tienen los significados siguientes:
- \bullet
- BamHI: endonucleasa de restricción de Bacillus amyloliquefaciens
- \bullet
- BglII: endonucleasa de restricción de Bacillus globigii
- \bullet
- ClaI: endonucleasa de restricción de Caryphanon latum
- \bullet
- EcoRI: endonucleasa de restricción de Escherichia coli
- \bullet
- EcoRV: endonucleasa de restricción de Escherichia coli
- \bullet
- HindIII: endonucleasa de restricción de Haemophilus influenzae
- \bullet
- KpnI: endonucleasa de restricción de Klebsiella pneumoniae
- \bullet
- PstI: endonucleasa de restricción de Providencia stuartii
- \bullet
- PvuI: endonucleasa de restricción de Proteus vulgaris
- \bullet
- SacI: endonucleasa de restricción de Streptomyces achromogenes
- \bullet
- SalI: endonucleasa de restricción de Streptomyces albus
- \bullet
- SmaI: endonucleasa de restricción de Serratia marcescens
- \bullet
- SphI: endonucleasa de restricción de Streptomyces phaeochromogenes
- \bullet
- SspI: endonucleasa de restricción de Sphaerotilus species
- \bullet
- XbaI: endonucleasa de restricción de Xanthomonas badrii
- \bullet
- XhoI: endonucleasa de restricción de Xantomonas holcicola
<110> Degussa AG.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proceso para la producción de
L-amino-ácidos que utiliza cepas de la familia
enterobacte-riáceas que contienen un gen dgsA
atenuado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 020003 BT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2306
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (485)..(1705)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> dgsA gene
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 406
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> dgsA '5'-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> dgsA '5'-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> dgsA '3'-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> dgsA '3'-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1756
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica diversa
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1756)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<211> característica diversa
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(60)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia técnica DNA/polienlazador
restante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica diversa
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (61)..(921)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Parte de la región situada aguas
arriba y parte de la región 5' del gen dgsA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica diversa
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (922)..(986)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia técnica DNA/polienlazador
restante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica diversa
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (987)..(1704)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Parte de la region 3' del gen dgsA y
parte de la region situada aguas abajo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica diversa
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1705)..(1756)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia técnica DNA/polienlazador
restante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 559
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica diversa
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(559)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica diversa
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codón de inicio del alelo delta
dgsA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica diversa
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(337)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región 5' del alelo delta dgsA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica diversa
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (378)..(442)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia técnica DNA/polienlazador
restante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica diversa
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (443)..(556)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región 3' del alelo delta dgsA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica diversa
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (557)..(559)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codón de inicio del alelo delta
dgsA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
Claims (23)
1. Proceso para la producción de
L-aminoácidos, seleccionados del grupo de
L-treonina, L-lisina y
L-valina, en el cual se llevan a cabo los pasos
siguientes:
- a)
- fermentación de microorganismos de la familia Enterobacteriáceas que producen el L-aminoácido deseado,
- b)
- enriquecimiento del L-aminoácido correspon-diente en el medio o en las células de los microorganismos, y
- c)
- aislamiento del L-aminoácido, en donde opcionalmente los constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o partes de la misma permanecen en el producto,
en donde en el microorganismo
comparado con el microorganismo inicial, la expresión del gen dgsA o
la expresión de secuencias de nucleótidos que codifican el producto
génico de dicho gen, el regulador del sistema fosfotransferasa,
está
apagada.
2. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde, para la producción de L-treonina, se
fermentan microorganismos de la familia Enterobacteriáceas, en los
cuales al mismo tiempo se sobreexpresa(n) uno o más de los
genes seleccionados del grupo siguiente:
- 2.1
- el operón thrABC que codifica aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa y treonina-sintasa,
- 2.2
- el gen pyc que codifica piruvato-carboxilasa,
- 2.3
- el gen pps que codifica fosfoenol-piruvato-sintasa,
- 2.4
- el gen ppc codifica fosfoenol-piruvato-carboxilasa,
- 2.5
- los genes pntA y pntB que codifican transhidrogenasa,
- 2.6
- el gen rhtB de Escherichia coli, que codifica una proteína que imparte resistencia a homoserina,
- 2.7
- el gen mqo que codifica malato:quinona-oxidorreductasa,
- 2.8
- el gen rhtC de Escherichia coli, que codifica una proteína que imparte resistencia a la treonina, y
- 2.9
- el gen thrE que codifica la exportación de treonina.
3. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde, para la producción de L-treonina, se
fermentan microorganismos de la familia Enterobacteriáceas en los
cuales al mismo tiempo está o están apagadas la expresión de uno o
más de los genes seleccionados del grupo siguiente:
- 3.1
- el gen tdh que codifica treonina-deshidrogenasa, 3.2 el gen mdh que codifica malato-deshidrogenasa,
- 3.3
- el producto génico del marco de lectura abierto (orf) yjfA, en el que dicho microorganismo es Escherichia coli,
- 3.4
- el producto génico del marco de lectura abierto (orf) ytfP, en el que dicho microorganismo es Escherichia coli,
- 3.5
- el gen pckA que codifica la enzima fosfoenol-piruvato-carboxiquinasa, y
- 3.6
- el gen poxB que codifica piruvato-oxidasa, y
- 3.7
- el gen aceA codificante de isocitrato-liasa.
4. Microorganismos recombinantes de la familia
Enterobacteriáceas, que producen L-treonina, y en
los cuales al menos:
- a)
- el operón thrABC, cuyos genes codifican aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homo-serina-quinasa y treonina-sintasa, está sobre-expresado, y
- b)
- la expresión del gen dgsA que codifica el regulador del sistema de fosfotransferasa o secuencias de nucleótidos, que codifican el producto del gen dgsA, está apagada.
\newpage
5. Microorganismos recombinantes de la familia
Enterobacteriáceas, que producen L-lisina, y en los
cuales al menos:
- a)
- la expresión del gen pckA para fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa está apagada, y
- b)
- la expresión del gen dgsA que codifica el regulador del sistema de fosfotransferasa o secuencias de nucleótidos, que codifican el producto del gen dgsA, está apagada.
6. Microorganismos recombinantes de la familia
Enterobacteriáceas, que producen L-valina, y en los
cuales al menos:
- a)
- la expresión del gen poxB que codifica piruvato-oxidasa, y
- b)
- la expresión del gen dgsA que codifica el regulador del sistema de fosfotransferasa o secuencias nucleotídicas, que codifican el producto del gen dgsA, está apagada.
7. Microorganismos de acuerdo con las
reivindicaciones 4 a 6, en donde los microorganismos se originan del
género Escherichia.
8. Microorganismos de acuerdo con la
reivindicación 7, en donde los microorganismos se originan de la
especie E. coli.
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|---|---|---|---|
| DE10116518 | 2001-04-03 | ||
| DE10116518A DE10116518A1 (de) | 2001-04-03 | 2001-04-03 | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
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