ES2300888T3 - Proceso para la produccion de l-aminoacidos utilizando cepas de la familia enterobacteriaceas que contienen un gen fadr intensificado. - Google Patents
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Abstract
Un proceso para la producción de L-aminoácidos seleccionados del grupo L-treonina, L-valina, L-homoserina y L-lisina, en el cual se llevan a cabo los pasos siguientes: a) fermentación de microorganismos modificados de la familia Enterobacteriáceas que producen el L-aminoácido deseado, en donde la sobreexpresión del gen fadR de Escherichia coli o de secuencias de nucleótidos que codifican el producto del gen fadR conduce a un aumento de al menos 10% de la actividad o concentración de dicha proteína fadR, con relación a la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de partida, b) acumulación del L-aminoácido deseado en el medio o en las células de los microorganismos y c) aislamiento del L-aminoácido deseado, en donde los constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o fracciones de la misma (>0 hasta 100%) quedan opcionalmente en el producto.
Description
Proceso para la producción de
L-aminoácidos utilizando cepas de la familia
enterobacteriáceas que contienen un gen fadR intensificado.
La presente invención se refiere a un proceso
para la producción de L-aminoácidos, seleccionados
del grupo de L-valina,
L-homoserina, L-lisina y
L-treonina, que utiliza cepas de la familia
Enterobacteriáceas, en las cuales el gen fadR está
sobreexpresado.
Los L-aminoácidos, en particular
L-treonina, se utilizan en medicina humana y en la
industria de productos farmacéuticos, en la industria alimentaria y
muy particularmente en nutrición animal.
Es sabido que los L-aminoácidos
se producen por fermentación de cepas de Enterobacteriáceas, en
particular Escherichia coli (E. coli) y Serratia
marcescens. Debido a su gran importancia, se están realizando
continuamente esfuerzos para mejorar el proceso de producción. Las
mejoras en el proceso pueden referirse a medidas que conciernen a
la tecnología de la fermentación, tales como por ejemplo agitación y
suministro de oxígeno, o a la composición del medio nutriente, tal
como por ejemplo la concentración de azúcar durante la fermentación,
o a preparar el terreno para la obtención del producto mediante,
por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, o a las
características intrínsecas de eficiencia del microorganismo
propiamente dicho.
Las características de eficiencia de estos
microorganismos se mejoran utilizando métodos de mutagénesis,
selección y selección de mutantes. De esta manera, se obtienen
cepas que son resistentes a antimetabolitos, tales como por ejemplo
el análogo de treonina ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxivalérico
(AHV), o son auxótrofas para metabolitos importantes en cuanto a la
regulación y producen L-aminoácidos, tales como por
ejemplo L-treonina.
Desde hace algunos años, se han estado
utilizando análogamente métodos de la tecnología del DNA
recombinante para mejorar las cepas de la familia
Enterobacteriáceas que producen L-aminoácidos por
amplificación de genes de la biosíntesis de aminoácidos
individuales e investigación del efecto sobre la producción.
El objeto de la invención es proporcionar nuevas
medidas para la producción mejorada por fermentación de
L-aminoácidos, seleccionados del grupo
L-treonina, L-valina,
L-homoserina y L-lisina.
La invención proporciona un proceso para la
producción por fermentación de dichos L-aminoácidos
utilizando microorganismos de la familia Enterobacteriáceas, que
producen ya en particular dichos L-aminoácidos y en
los cuales el gen fadR o una o más secuencias de nucleótidos que
codifica(n) el producto génico de dicho gen fadR está(n)
sobreexpresado(s).
Debe entenderse que cualquier mención
subsiguiente de L-aminoácidos o aminoácidos
significa uno o más aminoácidos, con inclusión de las sales de los
mismos, seleccionados del grupo que comprende
L-treonina, L-valina,
L-homoserina y L-lisina. Se
prefiere particularmente L-treonina.
En este contexto, el término
"intensificación" describe el aumento en la actividad
intracelular de una o más enzimas o proteínas en un microorganismo,
enzimas o proteínas que están codificadas por el DNA
correspondiente, por ejemplo por aumento del número de copias del
gen o genes, por utilización de un promotor fuerte o un gen o alelo
que codifica una enzima o proteína correspondiente que tiene
actividad elevada, y opcionalmente por combinación de estas
medidas.
La intensificación, en particular
sobreexpresión, mide el aumento de la actividad o concentración de
la proteína correspondiente en general al menos en un 10%, 25%,
50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% o 500%, como máximo en 1000%
o 2000%, con relación a la actividad o concentración de la proteína
de tipo salvaje, o a la actividad o concentración de la proteína en
el microorganismo de partida.
La invención proporciona un proceso para la
producción de L-aminoácidos seleccionados del grupo
L-treonina, L-valina,
L-homoserina y L-lisina, en el cual
se llevan a cabo los pasos siguientes:
- a)
- fermentación de microorganismos modificados de la familia Enterobacteriáceas que producen el L-aminoácido deseado, en donde la sobreexpresión del gen fadR de Escherichia coli o de secuencias de nucleótidos que codifican el producto del gen fadR conduce a un aumento de al menos 10% de la actividad o concentración de dicha proteína fadR, con relación a la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de partida,
- b)
- acumulación del L-aminoácido deseado en el medio o en las células de los microorganismos de la familia Enterobacteriáceas y
- c)
- aislamiento del L-aminoácido deseado, en donde los constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o fracciones de la misma (>0 hasta 100%) quedan opcionalmente en el producto.
Los microorganismos proporcionados por la
presente invención son capaces de producir dichos
L-aminoácidos a partir de glucosa, sacarosa,
lactosa, fructosa, maltosa, melazas, opcionalmente almidón,
opcionalmente celulosa o a partir de glicerol y etanol. Los mismos
son representativos de la familia Enterobacteriáceas seleccionados
de los géneros Escherichia, Erwinia, Providencia y Serratia. Se
prefieren los géneros Escherichia y Serratia. Dentro del género
Escherichia, puede mencionarse en particular la especie
Escherichia coli y, dentro del género Serratia, la especie
Serratia marcescens.
Cepas adecuadas del género Escherichia, en
particular cepas productoras de L-treonina, en
particular de la especie Escherichia coli son por
ejemplo
Escherichia coli TF427
Escherichia coli H4578
Escherichia coli KY10935
Escherichia coli VNIIgenetika MG442
Escherichia coli VNIIgenetika M1
Escherichia coli VNIIgenetika 472T23
Escherichia coli BKIIM
B-3996
Escherichia coli kat 13
Escherichia coli
KCCM-10132.
Cepas productoras de L-treonina
adecuadas del género Serratia, en particular de la especie
Serratia marcescens son por ejemplo
Serratia marcescens HNr21
Serratia marcescens TLr156
Serratia marcescens T2000.
Las cepas productoras de
L-treonina de la familia Enterobacteriáceas tienen
preferiblemente, entre otras, una o más de las características
genéticas o fenotípicas seleccionadas del grupo: resistencia a ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxivalérico,
resistencia a tialisina, resistencia a etionina, resistencia a
\alpha-metilserina, resistencia a ácido
diaminosuccínico, resistencia a ácido
\alpha-aminobutírico, resistencia a borrelidina,
resistencia a rifampicina, resistencia a análogos de valina tales
como por ejemplo hidroxamato de valina, resistencia a análogos de
purina, tales como por ejemplo
6-dimetilaminopurina, dependencia de
L-metionina, opcionalmente dependencia parcial y
contrarrestable de L-isoleucina, dependencia de
ácido meso-diaminopimélico, auxotrofia con relación
a dipéptidos que contienen treonina, resistencia a
L-treonina, resistencia a
L-homoserina, resistencia a
L-lisina, resistencia a L-metionina,
resistencia a ácido L-glutámico, resistencia a
L-aspartato, resistencia a
L-leucina, resistencia a
L-fenilalanina, resistencia a
L-serina, resistencia a L-cisteína,
resistencia a L-valina, sensibilidad a
fluoropiruvato, déficit de treonina-deshidrogenasa,
facultad opcional de utilizar sacarosa, intensificación del operón
treonina, intensificación de la
homoserina-deshidrogenasa
L-aspartato-quinasa I,
preferiblemente la forma resistente a la realimentación,
intensificación de homoserina-quinasa,
intensificación de treonina-sintasa, intensificación
de aspartato-quinasa, opcionalmente la forma
resistente a la realimentación, intensificación de
aspartato-semialdehido-deshidrogenasa,
intensificación de
fosfo-enolpiruvato-carboxilasa,
opcionalmente la forma resistente a la realimentación,
intensificación de fosfoenolpiruvato-sintasa,
intensificación de transhidrogenasa, intensificación del producto
del gen RhtB, intensificación del producto del gen RhtC,
intensificación del producto del gen YfiK, intensificación de una
piruvato-carboxilasa, y atenuación de la formación
de ácido
acético.
acético.
Se ha encontrado que, después de la
sobreexpresión del gen fadR, los microorganismos de la familia
Enterobacteriáceas producen dichos L-aminoácidos,
en particular L-treonina, de manera mejorada.
Las secuencias de nucleótidos de los genes de
Escherichia coli forman parte de la técnica anterior y pueden
ser obtenidas también por la secuencia del genoma de Escherichia
coli publicada por Blattner et al. (Science 277:
1453-1462 (1997)).
\vskip1.000000\baselineskip
Gen iclR (no es parte de la invención):
- Descripción:
- Regulador del metabolismo central intermedio, represor del operón aceBAK (IclR)
- Referencia:
- Sunnarborg et al.; Journal of Bacteriology 172(5): 2642-2649 (1990); Cortay et al.; EMBO Journal 10(3): 675-679 (1991)
- No. de Acceso:
- AE000475
Gen fadR:
- Descripción:
- Regulador del metabolismo de ácidos grasos y acetato (FadR)
- Referencia:
- DiRusso; Nucleic Acids Research 16(16): 7995-8009 (1988); Raman et al.; Journal of Biological Chemistry 272(49): 30645-30650 (1997)
- No. de Acceso
- AE000217
- Nombres alternativos de genes:
- dec, ole, thdB
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de ácido nucleico pueden
obtenerse de las bases de datos del Centro Nacional para Información
de Biotecnología (NCBI), la Librería Nacional de Medicina
(Bethesda, MD, EE.UU.), la base de datos de secuencias de
nucleótidos de los Laboratorios Europeos de Biología Molecular
(EMBL, Heidelberg, Alemania o Cambridge, Reino Unido) o el Banco de
Datos de DNA de Japón (DDBJ, Mishima, Japón).
Los genes descritos en las referencias indicadas
pueden utilizarse de acuerdo con la invención. Pueden utilizarse
también alelos de los genes originados por la degeneración del
código genético o por mutaciones de sentido funcionalmente
neutras.
La intensificación puede conseguirse, por
ejemplo, por aumento de la expresión génica o de las propiedades
catalíticas de las proteínas. Ambas medidas pueden combinarse
opcionalmente.
La sobreexpresión puede conseguirse por aumento
del número de copias de los genes correspondientes o por mutación
del promotor y la región reguladora o el sitio de fijación de
ribosoma localizado aguas arriba del gen estructural. Las casetes
de expresión incorporadas aguas arriba del gen estructural actúan de
la misma manera. Adicionalmente, es posible aumentar la expresión
durante la producción de L-treonina por fermentación
mediante promotores inducibles. La expresión se mejora también por
medidas para extender la vida útil del mRNA. La actividad enzimática
se intensifica además por prevención de la degradación de la
proteína enzimática. Los genes o constructos de genes pueden o bien
estar presentes en plásmidos en un número de copias variable, o
integrarse en el cromosoma y amplificarse. Alternativamente, la
sobreexpresión de los genes en cuestión puede conseguirse también
por modificación de la composición de los medios y las condiciones
de cultivo.
Las personas expertas en la técnica encontrarán
orientaciones en este sentido, entre otros lugares, en Chang y
Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141-1156
(1978)), en Hartley y Gregori (Gene 13: 347-353
(1981)), en Amann y Brosius (Gene 40: 183-190
(1985)), en de Broer et al. (Proceedings de la Academia
Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América 80:
21-25 (1983)), en Lavallie et al.
(BIO/TECHNOLOGY 11: 187-193 (1993)), en PCT/US
97/13359, en Llosa et al. (Plasmid 26:
222-224 (1991)), en Quandt y Klipp (Gene 80:
161-169 (1989)), en Hamilton et al. (Journal
of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)), en Jensen y
Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58:
191-195 (1998)) y en libros de texto conocidos de
genética y biología molecular.
Pueden utilizarse vectores de plásmidos
replicables en Enterobacteriáceas, tales como por ejemplo vectores
de clonación derivados de pACYC184 (Bartolomé et al.; Gene
102: 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann et al.;
Gene 69: 301-315 (1988)) o derivados de pSC101
(Vocke and Bastia; Proceedings de la Academia Nacional de Ciencias
de los Estados Unidos de América 80 (21): 6557-6561
(1983)). Una cepa transformada con un vector de plásmido puede
utilizarse en un proceso de acuerdo con la invención, en donde el
vector de plásmido lleva el gen fadR, o secuencias de nucleótidos
que codifican el producto génico de dicho gen fadR.
Es también posible introducir mutaciones que
afectan a la expresión de los genes particulares en diversas cepas
por intercambio de secuencia (Hamilton et al.; Journal of
Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)), conjugación o
transducción.
Adicionalmente, puede ser ventajoso para la
producción de dichos L-aminoácidos, en particular
L-treonina, con cepas de la familia
Enterobacteriáceas, además de sobreexpresar el gen fadR,
sobreexpresar una o más enzimas del camino conocido de biosíntesis
de la treonina, o enzimas de metabolismo anaplerótico o enzimas para
la producción de
nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato
reducida o enzimas de la glicólisis o enzimas PTS o enzimas del
metabolismo del azufre.
Por ejemplo, es posible sobreexpresar
simultáneamente, uno o más de los genes seleccionados del grupo
- \bullet
- el operón thrABC, que codifica aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa y treonina-sintasa (US-A-4.278.765),
- \bullet
- el gen pyc de Corynebacterium glutamicum, que codifica piruvato-carboxilasa (WO 99/18228),
- \bullet
- el gen pps, que codifica fosfoenolpiruvato-sintasa (Molecular and General Genetics 231(2): 332-336 (1992)),
- \bullet
- el gen ppc que codifica fosfoenolpiruvato-carboxilasa (Gene 31: 279-283 (1984)),
- \bullet
- los genes pntA y pntB, que codifican transhidrogenasa (European Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1986)),
- \bullet
- el gen rhtB, que imparte resistencia a homoserina (EP-A-0 994 190),
- \bullet
- el gen mqo, que codifica malato:quinona-oxidorreductasa (Journal of Bacteriology 182: 6892-6899 (2000)),
- \bullet
- el gen rhtC, que imparte resistencia a treonina (EP-A-1013765),
- \bullet
- el gen thrE de Corynebacterium glutamicum, que codifica la proteína de exportación de treonina (EP-A-1085091),
- \bullet
- el gen gdhA, que codifica glutamato-deshidrogenasa (Nucleic Acids Research 11: 5257-5266 (1983); Gene 23: 199-209 (1983)),
- \bullet
- el gen hns, que codifica la proteína de fijación de DNA HLP-II (Molecular and General Genetics 212: 199-202 (1988)),
- \bullet
- el gen pgm, que codifica fosfoglucomutasa (Journal of Bacteriology 176: 5847-5851 (1994)),
- \bullet
- el gen fba, que codifica fructosa-bifosfato-aldolasa (Biochemical Journal 257: 529-534 (1989)),
- \bullet
- el gen ptsH del operón ptsHIcrr, que codifica la proteína fosfohistidina-hexosa-fosfotransferasa del sistema de fosfotransferasa, PTS (Journal of Biological Chemistry 262: 16241-16253 (1987)),
- \bullet
- el gen ptsI del operón ptsHIcrr que codifica la enzima I del sistema de fosfotransferasa, PTS (Journal of Biological Chemistry 262: 16241-16253 (1987)),
- \bullet
- el gen crr del operón ptsHIcrr que codifica el componente IIA específico de glucosa del sistema de fosfotransferasa, PTS (Journal of Biological Chemistry 262: 16241-16253 (1987)),
- \bullet
- el gen ptsG, que codifica el componente IIBC específico de glucosa (Journal of Biological Chemistry 261: 16398-16403 (1986)),
- \bullet
- el gen lrp, que codifica el regulador del regulón leucina (Journal of Biological Chemistry 266, 10768-10774 (1991)),
- \bullet
- el gen mopB, que codifica la chaperona de 10 kD (Journal of Biological Chemistry 261: 12414-12419 (1986)), que es conocido también por el nombre groES,
- \bullet
- el gen ahpC del operón ahpCF que codifica la subunidad pequeña de la alquil-hidroperóxido-reductasa (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92: 7617-7621 (1995)),
- \bullet
- el gen ahpF del operón ahpCF que codifica la subunidad grande de la alquil-hidroperóxido-reductasa (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92: 7617-7621 (1995)),
- \bullet
- el gen cysK, que codifica la cisteína-sintasa A (Journal of Bacteriology, 170: 3150-3157 (1988)),
- \bullet
- el gen cysB, que codifica el regulador del regulón cys (Journal of Biological Chemistry 262: 5999-6005 (1987)),
- \bullet
- el gen cysJ del operón cysJIH que codifica la flavoproteína de la NADPH-sulfito-reductasa (Journal of Biological Chemistry 264: 15796-15808 (1989), Journal of Biological Chemistry 264: 15726-15737 (1989)),
- \bullet
- el gen cysI del operón cysJIH que codifica la hemoproteína de la NADPH-sulfito-reductasa (Journal of Biological Chemistry 264: 15796-15808 (1989), Journal of Biological Chemistry 264: 15726-15737 (1989)),
- \bullet
- el gen cysH del operón cysJIH que codifica la adenilil-sulfato-reductasa (Journal of Biological Chemistry 264: 15796-15808 (1989), Journal of Biological Chemistry 264: 15726-15737 (1989)),
- \bullet
- el gen phoB del operón phoBR que codifica el regulador positivo phoB del regulón pho (Journal de Molecular Biology 190 (1): 37-44 (1986)),
- \bullet
- el gen phoR del operón phoBR que codifica la proteína sensora del regulón pho (Journal of Molecular Biology 192 (3): 549-556 (1986)),
- \bullet
- el gen phoE, que codifica la proteína E de la membrana celular exterior (Journal of Molecular Biology 163(4): 513-532 (1983)),
- \bullet
- el gen malE, que codifica la proteína de fijación periplasmática del transporte de maltosa (Journal of Biological Chemistry 259 (16): 10606-10613 (1984)),
- \bullet
- el gen pykF, que codifica la piruvato-quinasa I estimulada por fructosa (Journal of Bacteriology 177 (19): 5719-5722 (1995)),
- \bullet
- el gen pfkB, que codifica 6-fosfofructoquinasa II (Gene 28(3): 337-342 (1984)),
- \bullet
- el gen talB, que codifica transaldolasa B (Journal of Bacteriology 177(20): 5930-5936 (1995)),
- \bullet
- el gen rseA del operón rseABC que codifica una proteína de membrana con actividad anti-sigma E (Molecular Microbiology 24(2): 355-371 (1997)),
- \bullet
- el gen rseC del operón rseABC que codifica un regulador global del factor sigma E (Molecular Microbiology 24(2): 355-371 (1997)),
- \bullet
- el gen sodA, que codifica superóxido-dismutasa (Journal of Bacteriology 155(3): 1078-1087 (1983)),
- \bullet
- el gen sucA del operón sucABCD que codifica la subunidad descarboxilasa de 2-cetoglutarato-deshidrogenasa (European Journal of Biochemistry 141(2): 351-359 (1984)),
- \bullet
- el gen sucB del operón sucABCD que codifica la subunidad dihidrolipoiltranssuccinasa E2 de 2-cetoglu-tarato-deshidrogenasa (European Journal of Biochemistry 141(2): 361-374 (1984)),
- \bullet
- el gen sucC del operón sucABCD que codifica la subunidad \beta de succinil-CoA-sintetasa (Biochemistry 24(22): 6245-6252 (1985)) y
- \bullet
- el gen sucD del operón sucABCD que codifica la subunidad \alpha de la succinil-CoA-sintetasa (Biochemistry 24(22): 6245-6252 (1985)).
Adicionalmente, puede ser ventajoso para la
producción de dichos L-aminoácidos, en particular
L-treonina, además de sobreexpresar el gen fadR,
atenuar, en particular suprimir o reducir la expresión de uno o más
genes seleccionados del grupo
- \bullet
- el gen tdh, que codifica treonina-deshidrogenasa (Journal of Bacteriology 169: 4716-4721 (1987)),
- \bullet
- el gen mdh, que codifica malato-deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.37) (Archives in Microbiology 149: 36-42 (1987)),
- \bullet
- el marco de lectura abierto (orf) yjfA (número de acceso AAC77180 del Centro Nacional para Información de Biotecnología (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.)),
- \bullet
- el marco de lectura abierto (orf) ytfP (número de acceso AAC77179 del Centro Nacional para Información de Biotecnología (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.)),
- \bullet
- el gen pckA, que codifica la enzima fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa (Journal of Bacteriology 172: 7151-7156 (1990)),
- \bullet
- el gen poxB, que codifica piruvato-oxidasa (Nucleic Acids Research 14(13): 5449-5460 (1986)),
- \bullet
- el gen aceA, que codifica la enzima isocitrato-liasa (Journal of Bacteriology 170: 4528-4536 (1988)),
- \bullet
- el gen dgsA, que codifica el regulador DgsA del sistema de fosfotransferasa (Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 59: 256-261 (1995)), que es conocido también por el nombre de gen mlc,
- \bullet
- el gen fruR, que codifica el represor fructosa (Molecular and General Genetics 226: 332-336 (1991)), que es conocido también por el nombre de gen cra,
- \bullet
- el gen rpoS, que codifica el factor Sigma^{38} (WO 01/05939), que es conocido también por el nombre de gen katF,
- \bullet
- el gen aspA, que codifica la aspartato-amonio-liasa (aspartasa) (Nucleic Acids Research 13(6): 2063-2074 (1985)) y
- \bullet
- el gen aceB, que codifica la malato-sintasa A (Nucleic Acids Research 16(19): 9342 (1988)).
En este contexto, el término "atenuación"
significa reducción o supresión de la actividad intracelular de una
o más enzimas (proteínas) en un microorganismo, enzimas que son
codificadas por el DNA correspondiente, por ejemplo por utilización
de un promotor débil o un gen o alelo que codifica una enzima
correspondiente que tiene una actividad baja o desactiva la enzima
(proteína) o gen correspondiente y opcionalmente por combinación de
estas medias.
Las medidas de atenuación reducen la actividad o
concentración de la proteína correspondiente en general hasta 0 a
75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% o 0 a 5% de la actividad o
concentración de la proteína de tipo salvaje, o la actividad o
concentración de la proteína en el microorganismo de partida.
Adicionalmente, puede ser ventajoso para la
producción de dichos L-aminoácidos, en particular
L-treonina, además de sobreexpresar el gen fadR,
suprimir las reacciones secundarias no deseadas (Nakayama:
"Breeding of Amino Acid Producing
Micro-Organisms", en: Overproduction of Microbial
Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek, (compiladores), Academic
Press, Londres, Reino Unido, 1982).
Los microorganismos producidos de acuerdo con la
invención pueden cultivarse utilizando el proceso de lotes, el
proceso de alimentación por lotes ("fed batch") o el proceso de
alimentación por lotes repetida. Un sumario de métodos de cultivo
conocidos se da en el libro de texto por Chmiel
(Bioprozess-technik 1. Einführung in die
Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en
el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere
Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
El medio de cultivo a utilizar debe satisfacer
adecuadamente los requerimientos de las cepas particulares. Medios
de cultivo para diversos microorganismos se describen en "Manual
of Methods for General Bacteriology" de la American Society for
Bacteriology (Washington D.C., EE.UU., 1981).
Fuentes de carbono que pueden utilizarse
incluyen azúcares y carbohidratos, tales como por ejemplo glucosa,
sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón y
opcionalmente celulosa, aceites y grasas, tales como por ejemplo
aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y aceite de
coco, ácidos grasos, tales como por ejemplo ácido palmítico, ácido
esteárico y ácido linoleico, alcoholes, tales como por ejemplo
glicerol y etanol, y ácidos orgánicos, tales como por ejemplo ácido
acético. Estas sustancias pueden utilizarse individualmente o en
forma de mezclas.
Fuentes de nitrógeno que pueden utilizarse
comprenden compuestos orgánicos nitrogenados, tales como peptonas,
extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor de
maceración de maíz, harina de soja y urea o compuestos inorgánicos
tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio,
carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno
pueden utilizarse individualmente o en forma de mezclas.
Fuentes de fósforo que pueden utilizarse son
ácido fosfórico, dihidrogenofosfato de potasio o hidrogenofosfato
dipotásico, o las sales correspondientes que contienen sodio. El
medio de cultivo debe contener adicionalmente sales de metales,
tales como sulfato de magnesio o sulfato de hierro, por ejemplo que
son necesarias para el crecimiento. Finalmente, sustancias
esenciales promotoras de crecimiento tales como aminoácidos y
vitaminas pueden utilizarse también además de las sustancias arriba
indicadas. Adicionalmente, pueden añadirse precursores adecuados al
medio de cultivo. Las sustancias de alimentación indicadas pueden
añadirse al cultivo como un solo lote o alimentarse adecuadamente
durante el cultivo.
Compuestos básicos, tales como hidróxido de
sodio, hidróxido de potasio, amoniaco o agua amoniacal, o compuestos
ácidos, tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico, se utilizan
adecuadamente para controlar el pH del cultivo. La formación de
espuma puede controlarse utilizando agentes antiespumantes tales
como poliglicolésteres de ácidos grasos, por ejemplo. Sustancias de
acción selectiva adecuadas, tales como por ejemplo antibióticos,
pueden añadirse al medio a fin de mantener la estabilidad del
plásmido. Oxígeno o mezclas gaseosas que contiene oxígeno, tales
como por ejemplo aire, se introducen en el cultivo a fin de mantener
condiciones aerobias. La temperatura del cultivo es normalmente de
25ºC a 45ºC, y preferiblemente de 30ºC a 40ºC. El cultivo se
continúa hasta que se ha formado la cantidad máxima de
L-aminoácidos o L-treonina. Esta
finalidad se alcanza normalmente dentro de 10 a 160 horas.
El análisis de L-aminoácidos
puede realizarse por cromatografía de intercambio de aniones por
derivación con ninhidrina subsiguiente, como se describe en
Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30,
1190-1206 (1958)) o puede analizarse por HPLC en
fase inversa, como se describe en Lindroth et al. (Analytical
Chemistry 51: 1167-1174 (1979)).
El propósito del proceso de acuerdo con la
invención es la producción fermentativa de
L-aminoácidos, seleccionados del grupo
L-treonina, L-valina,
L-homoserina y L-lisina, en
particular L-treonina.
La presente invención se ilustra con mayor
detalle en los ejemplos prácticos que siguen.
El medio mínimo (M9) y medio completo (LB)
utilizados para Escherichia coli se describen por J.H. Miller
(A Short Course in Bacterial Genetics (1992), Cold Spring Harbor
Laboratory Press). El aislamiento del DNA plasmídico a partir de
Escherichia coli y todas las técnicas de tratamiento de
restricción, ligación, Klenow y fosfatasa alcalina se llevaron a
cabo de acuerdo con Sambrook et al. (Molecular Cloning - A
Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). A no
ser que se indique otra cosa, la transformación de Escherichia
coli se realizó de acuerdo con Chung et al. (Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of America
86: 2172-2175 (1989)).
La temperatura de incubación durante la
producción de cepas y transformantes es 37ºC.
El gen fadR de E. coli K12 se amplifica
utilizando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y
oligonucleótidos sintéticos. Se sintetizan los iniciadores PCR (MWG
Biotech, Ebersberg, Alemania) sobre la base de la secuencia de
nucleótidos del gen fadR en E. coli K12 MG1655 (No. de Acceso
AE000217, Blattner et al. (Science 277:
1453-1462 (1997)). Las secuencias iniciadoras se
modifican de tal manera que se obtienen sitios de reconocimiento
para las enzimas de restricción. Para el iniciador fadR3 se
selecciona, la secuencia de reconocimiento por XbaI, mientras que
para el iniciador fadR4 se selecciona la secuencia de reconocimiento
por HindIII, viniendo indicadas estas secuencias por las porciones
subrayadas de las secuencias de nucleótidos que se muestran a
continuación:
| fadR3: | 5' - GTCCAACTTTGTCTAGATGAGTTATGG - 3' | (SEQ ID no. 1) |
| fadR4: | 5' - GAGGGGTTTGAAGCTTAAACGGAAGGG - 3' | (SEQ ID no. 2) |
El DNA cromosómico de E. coli K12 MG1655
utilizado para la PCR se aísla utilizando "Qiagen
Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Alemania)
de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Puede amplificarse
un fragmento de DNA de aprox. 800 pb con los iniciadores
específicos en condiciones PCR estándar (Innis et al. (1990)
PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press)
utilizando DNA-polimerasa Pfu (Promega Corporation,
Madison, EE.UU.). El producto PCR se liga de acuerdo con las
instrucciones del fabricante con el vector pCR-Blunt
II-TOPO (Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit,
Invitrogen, Groningen, Países Bajos) y se transforma en la cepa
TOP10 de E. coli. Las células que llevan el plásmido se
seleccionan en agar LB que se ha combinado con 50 \mug/ml de
kanamicina. Después de aislamiento del DNA plasmídico, el vector
pCR-Blunt
II-TOPO-fadR se escinde con las
enzimas de restricción HindIII y XbaI y, después de la separación,
se aísla el fragmento fadR en gel de agarosa al 0,8% utilizando el
kit de extracción de gel QIAquick (QIAGEN, Hilden, Alemania). El
vector pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) se escinde con
las enzimas HindIII y XbaI y se liga con el fragmento fadR aislado.
La cepa de E. coli XL1-Blue MRF' (Stratagen,
La Jolla, EE.UU.) se transforma con el lote de ligación y las
células que llevan el plásmido se seleccionan en agar LB, que se ha
combinado con 50 \mug/ml de ampicilina. El éxito de la clonación
puede comprobarse después de aislamiento del DNA plasmídico por
realización de una escisión de ensayo con las enzimas AccI, HincII
y SspI. El plásmido se designa pTrc99AfadR (Figura 1).
La cepa de E. coli MG442 productora de
L-treonina se describe en la Patente
US-A-4.278.765 y ha sido depositada
como CMIM B-1628 en la Colección Nacional Rusa de
Microorganismos Industriales (VKPM, Moscú, Rusia).
La cepa MG442 se transforma con el plásmido de
expresión pTrc99AfadR describo en el Ejemplo 1a y el vector pTrc99A
y las células que llevan el plásmido se seleccionan en agar LB con
50 \mug/ml de ampicilina. De esta manera, se obtienen las cepas
MG442/pTrc99AfadR y MG442/pTrc99A. Las colonias individuales
seleccionadas se multiplican luego adicionalmente en medio mínimo
de la composición siguiente: 3,5 g/l Na_{2}HPO_{4}*2H_{2}O,
1,5 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l NH_{4}Cl, 0,1 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 2 g/l glucosa, 20 g/l agar, 50 mg/l
ampicilina. La formación de L-treonina se comprueba
en cultivos de lotes de 10 ml en matraces Erlenmeyer de 100 ml.
Dicho cultivo se inocula con 10 ml de medio de precultivo de la
composición siguiente: 2 g/l extracto de levadura, 10 g/l
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 g/l KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 15 g/l CaCO_{3}, 20 g/l glucosa, 50 mg/l
ampicilina y se incuba durante 16 horas a 37ºC y 180 rpm en una
incubadora ESR de Kühner AG (Birsfelden, Suiza).
Porciones de 250 \mul de este precultivo se
transfieren en 10 ml de medio de producción (25 g/l
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 2 g/l KH_{2}PO_{4}, 1 g/l
MgSO_{4}*7H_{2}O, 0,03 g/l FeSO_{4}*7H_{2}O, 0,018 g/l
MnSO_{4}*1H_{2}O, 30 g/l CaCO_{3}, 20 g/l glucosa, 50 mg/l
ampicilina) y se incuban durante 48 horas a 37ºC. La formación de
L-treonina por la cepa de partida MG442 se comprueba
de la misma manera, pero sin la adición de ampicilina al medio.
Después de la incubación, se determina la densidad óptica (DO) de la
suspensión de cultivo a una longitud de onda de medida de 660 nm
utilizando un fotómetro LP2W de la compañía Dr. Lange (Düsseldorf,
Alemania).
La concentración de L-treonina
formada se determina luego en el sobrenadante de cultivo filtrado en
condiciones estériles utilizando un analizador de aminoácidos de
Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por
cromatografía de intercambio iónico y reacción
post-columna con detección con ninhidrina.
La Tabla 1 muestra los resultados del
ensayo.
Figura 1: mapa del plásmido pTrc99AfadR que
contiene el gen fadR
Las longitudes indicadas deben considerarse como
aproximadas. Las abreviaturas y términos utilizados tienen el
significado siguiente:
- \bullet
- Amp: gen de resistencia a ampicilina
- \bullet
- lacI: gen para la proteína represora del promotor trc
- \bullet
- Ptrc: región del promotor trc, inducible por IPTG
- \bullet
- fadR: región codificante del gen fadR
- \bullet
- 5S: región de rRNA 5S
- \bullet
- rrnBT: región terminadora de rRNA
Las abreviaturas para las enzimas de restricción
tienen el significado siguiente:
- \bullet
- AccI: endonucleasa de restricción de Acinetobacter calcoaceticus
- \bullet
- HincII: endonucleasa de restricción de Haemophilus influenzae R_{c}
- \bullet
- HindIII: endonucleasa de restricción de Haemophilus influenzae
- \bullet
- SspI: endonucleasa de restricción de Sphaerotilus, especie ATCC 13925
- \bullet
- XbaI: endonucleasa de restricción de Xanthomonas campestris.
<110> Degussa AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proceso para la producción de
L-aminoácidos que utiliza cepas de la familia
Enterobacteriáceas que contienen un gen fadR o iclR
intensificado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 010455 BT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fadR3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtccaacttt gtctagatga gttatgg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Iniciador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fadR4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggggtttg aagcttaaac ggaaggg
\hfill27
Claims (109)
1. Un proceso para la producción de
L-aminoácidos seleccionados del grupo
L-treonina, L-valina,
L-homoserina y L-lisina, en el cual
se llevan a cabo los pasos siguientes:
- a)
- fermentación de microorganismos modificados de la familia Enterobacteriáceas que producen el L-aminoácido deseado, en donde la sobreexpresión del gen fadR de Escherichia coli o de secuencias de nucleótidos que codifican el producto del gen fadR conduce a un aumento de al menos 10% de la actividad o concentración de dicha proteína fadR, con relación a la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de partida,
- b)
- acumulación del L-aminoácido deseado en el medio o en las células de los microorganismos y
- c)
- aislamiento del L-aminoácido deseado, en donde los constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o fracciones de la misma (>0 hasta 100%) quedan opcionalmente en el producto.
2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
1, en el cual los L-aminoácidos deseados se producen
por fermentación de microorganismos de la familia
Enterobacteriáceas en los cuales se incrementa además al mismo
tiempo la actividad o concentración de una o más de las proteínas
codificadas por los genes seleccionados del grupo constituido
por:
- 2.1
- el operón thrABC que codifica aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa y treonina-sintasa,
- 2.2
- el pyc gen que codifica piruvato-carboxilasa,
- 2.3
- el gen pps que codifica fosfoenolpiruvato-sintasa,
- 2.4
- el gen ppc que codifica fosfoenolpiruvato-carboxilasa,
- 2.5
- los genes pntA y pntB que codifican transhidrogenasa,
- 2.6
- el gen rhtB que imparte resistencia a homoserina,
- 2.7
- el gen mqo que codifica malato:quinona-oxidorreductasa,
- 2.8
- el gen rhtC que imparte resistencia a treonina,
- 2.9
- el gen thrE que codifica la proteína de exportación de treonina,
- 2.10
- el gen gdhA que codifica glutamato-deshidrogenasa,
- 2.11
- el gen hns que codifica la proteína de fijación de DNA HLP-II,
- 2.12
- el pgm gen que codifica fosfoglucoisomerasa,
- 2.13
- el gen fba que codifica fructosa-bisfosfato aldolasa,
- 2.14
- el gen ptsH que codifica la proteína fosfohistidina hexosa-fosfotransferasa,
- 2.15
- el gen ptsI que codifica la enzima I del sistema de fosfotransferasa,
- 2.16
- el gen crr que codifica el componente específico de glucosa IIA,
- 2.17
- el gen ptsG que codifica componente el específico de glucosa IIBC,
- 2.18
- el gen lrp que codifica el regulador del regulón leucina,
- 2.19
- el gen mopB que codifica la chaperona de 10 kD,
- 2.20
- el gen ahpC que codifica la subunidad pequeña de alquil-hidroperóxido-reductasa,
- 2.21
- el gen ahpF que codifica la subunidad grande de alquil-hidroperóxido-reductasa,
- 2.22
- el gen cysK que codifica cisteína-sintasa A,
- 2.23
- el gen cysB que codifica el regulador del regulón cys,
- 2.24
- el gen cysJ que codifica la flavoproteína de NADPH-sulfito-reductasa,
- 2.25
- el gen cysI que codifica la hemoproteína de NADPH-sulfito-reductasa,
- 2.26
- el gen cysH que codifica adenilil-sulfato-reductasa,
- 2.27
- el gen phoB que codifica el regulador positivo PhoB del regulón pho,
- 2.28
- el gen phoR que codifica la proteína sensora del regulón pho,
- 2.29
- el gen phoE que codifica la proteína E de la membrana celular externa,
- 2.30
- el gen malE que codifica la proteína de fijación periplasmática de transporte de maltosa,
- 2.31
- el gen pykF que codifica piruvato-quinasa I,
- 2.32
- el gen pfkB que codifica la 6-fosfofructo-quinasa II estimulada por fructosa,
- 2.33
- el gen talB que codifica transaldolasa B,
- 2.34
- el gen rseA que codifica una proteína de membrana que actúa como un regulador negativo de la actividad sigmaE,
- 2.35
- el gen rseC que codifica un regulador global del factor sigmaE,
- 2.36
- el gen sodA que codifica superóxido-dismutasa,
- 2.37
- el gen sucA que codifica la subunidad descarboxilasa de 2-cetoglutarato-deshidrogenasa,
- 2.38
- el gen sucB que codifica la subunidad dihidrolipoiltranssuccinasa E2 de 2-cetoglutarato-deshidrogenasa,
- 2.39
- el gen sucC que codifica la subunidad \beta de succinil-CoA-sintetasa, y
- 2.40
- el gen sucD que codifica la subunidad \alpha de succinil-CoA-sintetasa
al menos en un 10%, con relación a
la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de
partida, por sobreexpresión de uno o más de dichos
genes.
3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1
ó 2, en el cual se producen L-aminoácidos por
fermentación de microorganismos de la familia Enterobacteriáceas en
las cuales se reduce además al mismo tiempo la actividad o
concentración de una o más de las proteínas codificadas por los
genes seleccionados del grupo constituido por:
- 3.1
- el gen tdh que codifica treonina-deshidrogenasa,
- 3.2
- el gen mdh que codifica malato-deshidrogenasa,
- 3.3
- el marco de lectura abierto (orf) yjfA,
- 3.4
- el marco de lectura abierto (orf) ytfP,
- 3.5
- el gen pckA que codifica fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa,
- 3.6
- el gen poxB que codifica piruvato-oxidasa,
- 3.7
- el gen aceA que codifica isocitrato-liasa,
- 3.8
- el gen dgsA que codifica el regulador DgsA del sistema de fosfotransferasa,
- 3.9
- el gen fruR que codifica el represor fructosa,
- 3.10
- el gen rpoS que codifica el factor Sigma^{38},
- 3.11
- el gen aspA que codifica aspartato-amonio-liasa (aspartasa) y
- 3.12
- el gen aceB que codifica malato-sintasa A
hasta 0% a 75%, de la actividad o
concentración de la proteína en el microorganismo de partida por
atenuación de uno o más de dichos
genes.
4. Microorganismos modificados de la familia
Enterobacteriáceas de acuerdo con la reivindicación 1, en los
cuales se incrementa al mismo tiempo la actividad o concentración de
una o más proteínas codificadas por un gen o genes adicionales al
menos en un 10%, con relación a la actividad o concentración de las
proteínas en el microorganismo de partida en condiciones de
fermentación similares, por sobreexpresión de los genes, en donde
dichos genes adicionales se seleccionan del grupo, constituido
por:
- 4.1
- el operón thrABC que codifica aspartato-quinasa, homoserina-deshidrogenasa, homoserina-quinasa y treonina-sintasa,
- 4.2
- el gen pyc que codifica piruvato-carboxilasa,
- 4.3
- el gen pps que codifica fosfoenolpiruvato-sintasa,
- 4.4
- el gen ppc que codifica fosfoenolpiruvato-carboxilasa,
- 4.5
- los genes pntA y pntB que codifican transhidrogenasa,
- 4.6
- el gen rhtB que imparte resistencia a homoserina,
- 4.7
- el gen mqo que codifica malato:quinona-oxidorreductasa,
- 4.8
- el gen rhtC que imparte resistencia a treonina,
- 4.9
- el gen thrE que codifica la proteína de exportación de treonina,
- 4.10
- el gen gdhA que codifica glutamato-deshidrogenasa,
- 4.11
- el gen hns que codifica la proteína de fijación de DNA HLP-II,
- 4.12
- el gen pgm que codifica fosfoglucoisomerasa,
- 4.13
- el gen fba que codifica fructosa-bisfosfato aldolasa,
- 4.14
- el gen ptsH que codifica la proteína fosfohistidina hexosa-fosfotransferasa,
- 4.15
- el gen ptsI que codifica la enzima I del sistema de fosfotransferasa,
- 4.16
- el gen crr que codifica el componente específico de glucosa IIA,
- 4.17
- el gen ptsG que codifica el componente específico de glucosa IIBC,
- 4.18
- el gen lrp que codifica el regulador del regulón leucina,
- 4.19
- el gen mopB que codifica la chaperona de 10 kD,
- 4.20
- el gen ahpC que codifica la subunidad pequeña de alquil-hidroperóxido-reductasa,
- 4.21
- el gen ahpF que codifica la subunidad grande de alquil-hidroperóxido-reductasa,
- 4.22
- el gen cysK que codifica cisteína-sintasa A,
- 4.23
- el gen cysB que codifica el regulador del regulón cys,
- 4.24
- el gen cysJ que codifica la flavoproteína de NADPH-sulfito-reductasa,
- 4.25
- el gen cysI que codifica la hemoproteína de NADPH-sulfito-reductasa,
- 4.26
- el gen cysH que codifica adenilil-sulfato-reductasa,
- 4.27
- el gen phoB que codifica el regulador positivo PhoB del regulón pho,
- 4.28
- el gen phoR que codifica la proteína sensora del regulón pho,
- 4.29
- el gen phoE que codifica la proteína E de la membrana celular externa,
- 4.30
- el gen malE que codifica la proteína de fijación periplasmática de transporte de maltosa,
- 4.31
- el gen pykF que codifica estimulada por fructosa piruvato-quinasa I,
- 4.32
- el gen pfkB que codifica 6-fosfofructoquinasa II,
- 4.33
- el gen talB que codifica transaldolasa B,
- 4.34
- el gen rseA que codifica una proteína de membrana que actúa como un regulador negativo de la actividad sigmaE,
- 4.35
- el gen rseC que codifica un regulador global del factor sigmaE,
- 4.36
- el gen sodA que codifica superóxido-dismutasa,
- 4.37
- el gen sucA que codifica la subunidad descarboxilasa de 2-cetoglutarato-deshidrogenasa,
- 4.38
- el gen sucB que codifica la subunidad dihidrolipoiltranssuccinasa E2 de 2-cetoglutarato-deshidro-genasa,
- 4.39
- el gen sucC que codifica la subunidad \beta de succinil-CoA-sintetasa, y
- 4.40
- el gen sucD que codifica la subunidad \alpha de succinil-CoA-sintetasa.
5. Microorganismos modificados de la familia
Enterobacteriáceas de acuerdo con la reivindicación 1, en los
cuales al mismo tiempo la actividad o concentración de una o más
proteínas codificadas por un gen o genes adicionales se reduce a 0
hasta 75%, con relación a la actividad o concentración de dicha o
dichas proteínas en el microorganismo de partida en condiciones de
fermentación similares, por atenuación de uno o más del gen o genes
adicionales, en donde dichos genes adicionales se seleccionan del
grupo, constituido por:
- 5.1
- el gen tdh que codifica treonina-deshidrogenasa,
- 5.2
- el gen mdh que codifica malato-deshidrogenasa,
- 5.3
- el marco de lectura abierto (orf) yjfA,
- 5.4
- el marco de lectura abierto (orf) ytfP,
- 5.5
- el gen pckA que codifica fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa,
- 5.6
- el gen poxB que codifica piruvato-oxidasa,
- 5.7
- el gen aceA que codifica isocitrato-liasa,
- 5.8
- el gen dgsA que codifica el regulador DgsA del sistema de fosfotransferasa,
- 5.9
- el gen fruR que codifica el represor fructosa,
- 5.10
- el gen rpoS que codifica el factor sigma^{38}.
6. Microorganismos de acuerdo con la
reivindicación 4 ó 5, en donde los microorganismos se originan del
género Escherichia.
7. Microorganismos de acuerdo con la
reivindicación 4 ó 5, en donde los microorganismos se originan de la
especie E. coli.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| DE10154102 | 2001-11-02 | ||
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