ES2307059T3 - Bisindolilmaleimidas utiles para tratar el cancer de prostata y enfermedades mediadas por akt. - Google Patents
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Abstract
El uso de un compuesto de fórmula (Ver fórmula) en la que R 1 y R 2 son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo C1-C4; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la preparación de un medicamento para tratar el cáncer de próstata.
Description
Bisindolilmaleimidas útiles para tratar el
cáncer de próstata y enfermedades mediadas por AKT.
Las proteína quinasas están implicadas en las
rutas de transducción de señales conectando factores de crecimiento,
hormonas y otras moléculas de regulación celular con crecimiento
celular, supervivencia y metabolismo en ambas afecciones,
patológicas y normales. Una proteína quinasa de este tipo, la
proteína quinasa B (también conocida como AKT), es una
serina/treonina quinasa que desempeña un papel central en la
promoción de la proliferación y supervivencia de una amplia gama de
tipos de células, protegiendo así las células de la apoptosis
(muerte celular programada) (Khwaja, Nature 33-34
(1990)). Se han identificado tres miembros de la subfamilia de AKT
de proteína serina/treonina quinasas reguladas por un segundo
mensajero y se denominan AKT-1,
AKT-2 y AKT-3. Se han descrito
varias proteínas implicadas en la supervivencia y proliferación
celular como sustratos de AKT en células. Dos ejemplos de tales
sustratos incluyen glucógeno sintasa quinasa-3
(GSK3) y factores de transcripción forkhead (FK). Véase Brazil y
Hemmings, Trends in Biochemical Sciences 26,
675-664.
Varias proteína quinasas y fosfatasas regulan la
actividad de la AKT. Por ejemplo, la activación de AKT está mediada
por la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3- K), que
genera fosfolípidos como segundo mensajero que entonces se unen al
dominio de unión de homología a pleckstrina (PH) de AKT. La unión
atrae la AKT a la membrana plasmática en la que la AKT se fosforila
mediante quinasa 1 dependiente de fosfatidilinositol (PDK1) en
Thr308, lo que entonces provoca la fosforilación de AKT en Ser473 y
la activación de la enzima. Las amplificaciones de la subunidad
catalítica de PI3-K, p110\alpha, o mutaciones en
la subunidad reguladora de PI3-K, p85\alpha
conducen a la activación de AKT en varios tipos de cáncer humano.
(Vivanco y Sawyers, Nature Reviews in Cancer (2002) 2:
489-501).
El supresor tumoral, PTEN, es un regulador
negativo crítico de la activación de AKT mediante
PI3-K (Myers et al. Proc. Nat. Acad. Sci.
95, EE.UU. (1998) 13513-13518). Las mutaciones de
inactivación en el gen Pten se han encontrado a altas
frecuencias en un gran número de tumores humanos y líneas celulares
tumorales, incluyendo el cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer
de ovario, glioblastoma, melanoma y otros tipos de cáncer. La
inactivación de la proteína PTEN da como resultado niveles elevados
de la actividad de AKT aumentada y AKT fosforilada en células
tumorales (Li, et al., Science (1997) 275:
1943-1947; Guldberg, et al., Cancer Research
(1997) 57: 3660-3663; Risinger, et al.,
Cancer Research (1997) 57: 4736-4738; Vivanco y
Sawyers, Nature Reviews in Cancer (2002) 2:
489-501). Además de la sobreactivación de AKT debido
a defectos en PTEN, se ha encontrado amplificación directa y/o
sobreexpresión de AKT-2 y AKT-3 en
neoplasia humana, por ejemplo células de cáncer de mama, de
próstata, de páncreas y de ovario (Cheung et al., Proc. Nat.
Acad. Sci. EE.UU. (1992) 89: 9267-9271; Cheung
et al., Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. (1996) 93:
3636-3641; Nakatani et al., J. Biol. Chem.
(1999) 274: 21528-21532).
El papel crítico de AKT en la supervivencia y
proliferación celular se refuerza además mediante estudios que
muestran que la inactivación de la línea germinal de
AKT-1 da como resultado la letalidad embrionaria
parcial. Las crías supervivientes presentan un crecimiento
atrofiado, aumento de la apoptosis de organismo y muertes
prematuras. (Cho et al., J. Biol. Chem. (2001) 276:
38349-38520; Chen et al., Genes Dev. (2001)
15: 2203-2208). También se ha demostrado que la
inactivación farmacológica de AKT induce la apoptosis en células
cáncer de ovario humanas cultivadas (Yuan et al., Oncogene
19, 2324-2340, 2000) y disminuye el crecimiento de
un xenoinjerto de carcinoma de ovario humano en ratones (Hu et
al., Clin. Cancer Res. 6, 880-886, 2000).
Estudios recientes también han demostrado el
papel de la ruta PI3-K/AKT en el ciclo de vida de
numerosos virus. Algunas proteínas virales han mostrado que activan
directamente la ruta PI3-K/AKT, proporcionando así
un entorno favorable para la replicación viral. Éstas incluyen la
proteína Tat del virus de la inmunodeficiencia humano (VIH),
proteína X del virus de la hepatitis B, y NS5A del virus de la
hepatitis C (Borgatti et al., Eur. J. Immunol. (1997) 27:
2805-2811; Lee et al., J. Biol. Chem. (2001)
276: 16969-16977; He et al., J. Virol.
(2002) 76: 9207-9217). También se requiere la ruta
PI3-K/AKT para la iniciación y finalización del
ciclo de replicación del citomegalovirus humano (CMVH). De hecho, la
inactivación farmacológica de esta ruta da como resultado la
producción abortiva de CMVH y la supervivencia de las células
huésped (Johnson et al., J. Virol. (2001) 75:
6022-6032).
Debido a su papel fundamental en la regulación
de la supervivencia celular, la ruta PI3 quinasa/AKT proporciona
una diana terapéutica novedosa para el tratamiento eficaz de
diversos trastornos, particularmente cáncer e infecciones virales.
Sin embargo, tal tratamiento requiere el desarrollo de inhibidores
selectivos, potentes de quinasas dentro de esta ruta. La presente
invención proporciona métodos de uso de bisindolilmaleimidas
conocidas dadas a conocer previamente como inhibidores selectivos de
proteína quinasa C beta-1 y proteína quinasa C
beta-2 (véase entre otros el documento WO 01/30331).
Específicamente, se esperaría que la inhibición de
PDK-1 mediante estos compuestos suprima la
activación de la ruta completa ya que PDK-1 es la
quinasa clave que activa la AKT. La inhibición de p70S6 quinasa,
una quinasa efectora en el sentido de 3' de AKT, suprimiría además
la biogénesis potenciada de ribosomas y la traducción de proteínas
provocada mediante la activación de la ruta AKT.
El adenocarcinoma de próstata (ACP) es el tumor
maligno no cutáneo, más común y la segunda causa de muerte por
cáncer en hombres. La enfermedad tiene dos fases distintas: la fase
dependiente de andrógenos, que puede tratarse eficazmente con
terapias de ablación de andrógenos, y la fase independiente de
andrógenos. Se estima que más de treinta mil hombres morirán cada
año de ACP metastásico independiente de andrógenos. Los esfuerzos
para entender la progresión metastásica de la progresión del ACP a
enfermedad metastásica, independiente de andrógenos, implica una
respuesta apoptótica reducida, una liberación del bloqueo del ciclo
celular que sigue inicialmente la retirada de andrógenos y un
cambio de la dependencia de los factores de supervivencia y
crecimiento derivados de paracrina a la producción autónoma de
estas proteínas clave. La pérdida funcional de la fosfatasa
supresora de tumores y del homólogo de tensina suprimida en el
cromosoma diez (PTEN) y la posterior activación de la ruta AKT, se
han implicado de forma destacada en la progresión del ACP a la
independencia de andrógenos.
La activación de la ruta AKT puede suprimir la
respuesta apoptótica, debilitar el control del ciclo celular e
intensificar selectivamente la producción de factores de
supervivencia y crecimiento clave. Aunque muchas proteínas y rutas
de señalización intracelular pueden influenciar estas respuestas
biológicas, la activación de la ruta AKT es una señal
particularmente potente implicada en la progresión del ACP a la
independencia de andrógenos y por tanto proporciona una terapia de
ACP independiente de andrógenos avanzada (Graff 2002). El
tratamiento de células de cáncer de próstata CWR22Rv1, LNCaP y Du145
con el compuesto induce la apoptosis.
Rokhlin et al. J. Biol. Chemistry 2002,
277, 36, 33213-33219 notifica que un compuesto de
bisindolilmaleimida específico Bis IX podía inhibir la
transcripción en la muerte celular mediada por la familia del
receptor TNF. Según se informa, Bis IX puede potenciar la muerte
celular cuando se usa en combinación con un agente de inducción de
apoptosis tal como TNF-\alpha, anticuerpo
monoclonal anti-Fas agonista y ligando inductor de
la apoptosis relacionado con TNF (TRAIL) induciendo actividad
caspasa. Según se informa Bis IX solo no puede inducir actividad
caspasa. Rokhlin et al. concluía que tal terapia de
combinación con agentes que inducen apoptosis tales como TRAIL
pueden ser útiles en el tratamiento del cáncer de próstata
independiente de andrógenos.
La presente invención proporciona el uso de un
compuesto de fórmula
en la que R^{1} y R^{2} son
cada uno independientemente hidrógeno o alquilo
C_{1}-C_{4}; o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo, en la preparación de un medicamento para tratar
el cáncer de
próstata.
En una segunda realización, la invención
proporciona el uso de un compuesto de fórmula I o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo, en la preparación de un
medicamento para tratar el adenocarcinoma de próstata independiente
de andrógenos.
En una tercera realización, la invención
proporciona el uso de un compuesto de fórmula I o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo en la preparación de un
medicamento para tratar un glioblastoma, cáncer de colon, cáncer de
páncreas, cáncer de ovario, cáncer de endometrio o cáncer de células
renales.
Los términos generales usados en la descripción
de los compuestos descritos en el presente documento tienen sus
significados habituales. Por ejemplo, la expresión "alquilo
C_{1}-C_{4}" se refiere a cadenas alifáticas
saturadas, monovalentes, lineales o ramificadas, de 1 átomo de
carbono a 4 átomos de carbono e incluye, pero no se limita a,
metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo,
sec-butilo y terc-butilo.
Los compuestos preferidos de esta invención
incluyen compuestos de fórmula I en la que R^{1} es hidrógeno,
metilo, etilo, n-propilo o isopropilo. Otros
compuestos preferidos incluyen aquéllos en los que R^{2} es
hidrógeno o metilo. Los compuestos más preferidos son aquéllos en
los que R^{1} es hidrógeno. El experto apreciará que pueden
seleccionarse realizaciones preferidas adicionales combinando las
anteriores realizaciones preferidas, o por referencia a los
ejemplos dados en el presente documento.
La expresión "sal farmacéuticamente
aceptable" tal como se usa en el presente documento, se refiere a
una sal de un compuesto de la fórmula (I) anterior. Debe
reconocerse que el contraión particular que forma una parte de
cualquier sal de esta invención normalmente no es de naturaleza
crítica, siempre que la sal como un todo sea farmacológicamente
aceptable y siempre que el contraión no aporte cualidades no
deseadas a la sal como un todo.
Los compuestos de fórmula (I) descritos en el
presente documento forman sales de adición de ácido
farmacéuticamente aceptables con una amplia variedad de ácidos
orgánicos e inorgánicos e incluyen las sales fisiológicamente
aceptables que se usan a menudo en química farmacéutica. Tales sales
también son parte de esta invención. Una sal de adición de ácido
farmacéuticamente aceptable se forma a partir de un ácido
farmacéuticamente aceptable, tal como se conoce bien en la técnica.
Tales sales incluyen las sales farmacéuticamente aceptables
enumeradas en Journal of Pharmaceutical Science, 66,
2-19 (1977), que el experto conoce. Véase también,
The Handbook of Pharmaceutical Salts; Properties, Selection, and
Use. P. H. Stahl y C. G. Wermuth (ED.s), Verlag, Zurich (Suiza)
2002.
Los ácidos inorgánicos típicos usados para
formar tales sales incluyen clorhídrico, bromhídrico, yodhídrico,
nítrico, sulfúrico, fosfórico, hipofosfórico, metafosfórico,
pirofosfórico y similares. También pueden usarse sales derivadas de
ácidos orgánicos, tales como ácidos mono y dicarboxílicos
alifáticos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos
hidroxialcanoicos e hidroxialcandioicos, ácidos aromáticos, ácidos
sulfónicos aromáticos y alifáticos. Por tanto tales sales
farmacéuticamente aceptables incluyen acetato, fenilacetato,
trifluoroacetato, acrilato, ascorbato, benzoato, clorobenzoato,
dinitrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxibenzoato, metilbenzoato,
o-acetoxibenzoato,
naftalen-2-benzoato, bromuro,
isobutirato, fenilbutirato,
\alpha-hidroxibutirato,
butino-1,4-dicarboxilato,
hexino-1,4-dicarboxilato, caprato,
caprilato, cinamato, citrato, formiato, fumarato, glicolato,
heptanoato, hipurato, lactato, malato, maleato, hidroximaleato,
malonato, mandelato, mesilato, nicotinato, isonicotinato, nitrato,
oxalato, ftalato, tereftalato, propiolato, propionato,
fenilpropionato, salicilato, sebacato, succinato, suberato,
bencensulfonato, p-bromobencensulfonato,
clorobencensulfonato, etilsulfonato,
2-hidroxietilsulfonato, metilsulfonato,
naftalen-1-sulfonato,
naftalen-2-sulfonato,
naftalen-1,5-sulfonato,
p-toluensulfonato, xilensulfonato, tartarato y
similares.
Los compuestos de fórmula (I) se describen en
Heath, Jr. et al., patente estadounidense nº 5.668.152. La
síntesis de los compuestos de fórmula (I) se expone completamente
así como una descripción de que dichos compuestos son útiles como
inhibidores de proteína quinasa C (PKC) selectivos de isozimas
beta-1 y beta-2. Como inhibidores
de PKC selectivos de isozimas, los compuestos se han dado a conocer
previamente como útiles en el tratamiento de afecciones asociadas a
diabetes mellitus y sus complicaciones así como isquemia,
inflamación, trastornos del sistema nervioso central, enfermedad
cardiovascular, enfermedad dermatológica, enfermedad de Alzheimer y
cáncer.
Mientras que la patente estadounidense nº
5.668.152 describe el tratamiento del cáncer usando inhibidores
selectivos de PKC beta-1 y beta-2,
de los que se incluyen de manera genérica los presentes compuestos
de fórmula (I), no se enseña ni se sugiere que los compuestos de
fórmula (I) son inhibidores de la ruta PI3K/AKT. Debido a que la
ruta AKT actúa como un regulador central de la respuesta apoptótica,
se esperaría que los inhibidores de esta ruta indujeran apoptosis
y/o bloquearan la progresión del ciclo celular mientras que no se
esperaría que la inhibición de PKC, que tiene muchos papeles
dispares en la célula, necesariamente hiciera eso.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "paciente" se refiere a un mamífero o animal de sangre
caliente que necesita tratamiento para, o con riesgo de desarrollar,
una o más enfermedades o trastornos asociados a la actividad de la
ruta AKT (por ejemplo actividad PDK-1/p70S6
quinasa). Se entiende que las cobayas, perros, gatos, ratas,
ratones, hámsters y primates, incluyendo seres humanos, son ejemplos
de pacientes dentro del alcance del significado del término. Los
pacientes preferidos incluyen seres humanos.
Los compuestos de la presente invención pueden
administrarse solos o en forma de una composición farmacéutica,
esto es, combinados con excipientes o vehículos farmacéuticamente
aceptables, la proporción y naturaleza de los cuales se determinan
mediante la solubilidad y las propiedades químicas del compuesto
seleccionado, la vía de administración elegida y la práctica
farmacéutica convencional. Los compuestos de la presente invención,
aunque son eficaces por sí mismos, pueden formularse y administrarse
en forma de sus sales farmacéuticamente aceptables, para fines de
estabilidad, conveniencia de cristalización, solubilidad aumentada y
similares.
Por tanto, la presente invención proporciona
composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula
(I) y un diluyente farmacéuticamente aceptable.
Los compuestos de fórmula (I) pueden
administrarse mediante una variedad de vías. Efectuando el
tratamiento de un paciente aquejado con o con riesgo de desarrollar
los trastornos descritos en el presente documento, puede
administrarse un compuesto de fórmula (I) en cualquier forma o modo
que haga al compuesto biodisponible en una cantidad eficaz,
incluyendo las vías oral y parenteral. Por ejemplo, los compuestos
de fórmula (I) pueden administrarse por vía oral, mediante
inhalación o mediante las vías subcutánea, intramuscular,
intravenosa, transdérmica, intranasal, rectal, ocular, tópica,
sublingual, bucal u otras. Generalmente se prefiere la
administración oral para el tratamiento de los trastornos descritos
en el presente documento. Sin embargo, la administración oral no es
la única vía preferida. Por ejemplo, puede preferirse la vía
intravenosa por conveniencia o para evitar posibles complicaciones
relacionadas con la administración oral. Cuando se administra el
compuesto de fórmula (I) a través de la vía intravenosa, se
prefiere una inyección en bolo intravenosa o infusión lenta.
Un experto en la técnica de preparar
formulaciones puede seleccionar rápidamente la forma y el modo de
administración apropiados dependiendo de las características
particulares del compuesto seleccionado, el trastorno o afección a
tratar, la fase del trastorno o la afección, y otras circunstancias
relevantes. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª edición, Mack
Publishing Co. (1990)).
Las composiciones farmacéuticas se preparan de
una manera bien conocida en la técnica farmacéutica. El vehículo o
excipiente puede ser un material sólido, semi-sólido
o líquido que puede servir como un vehículo o medio para el
principio activo. Se conocen bien en la técnica vehículos o
excipientes adecuados. La composición farmacéutica puede adaptarse
para uso oral, por inhalación, parenteral o tópico y puede
administrarse al paciente en forma de comprimidos, cápsulas,
aerosoles, inhaladores, supositorios, soluciones, suspensiones o
similares.
Para el fin de la administración oral
terapéutica, los compuestos pueden incorporarse con excipientes y
usarse en forma de comprimidos, trociscos, cápsulas, elixires,
suspensiones, jarabes, obleas, chicles y similares. Estas
preparaciones deben contener al menos el 4% del compuesto de la
presente invención, el principio activo, pero pueden variarse
dependiendo de la forma particular y puede ser convenientemente de
entre el 4% y aproximadamente el 70% del peso de la unidad. La
cantidad del compuesto presente en las composiciones es tal que se
obtendrá una dosificación adecuada. Un experto en la técnica puede
determinar las composiciones y preparaciones preferidas según la
presente invención.
Los comprimidos, pastillas, cápsulas, trociscos
y similares también pueden contener uno o más de los siguientes
adyuvantes: aglutinantes tales como povidona, hidroxipropilcelulosa,
celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina;
excipientes tales como fosfato de dicalcio, almidón o lactosa;
agentes de disgregación tales como ácido algínico, Primogel,
almidón de maíz y similares; lubricantes tales como talco, aceite
vegetal hidrogenado, estearato de magnesio o Sterotex; deslizantes
tales como dióxido de silicio coloidal; y agentes edulcorantes,
tales como sacarosa, aspartamo o sacarina, o un agente aromatizante,
tal como menta, salicilato de metilo o aromatizante de naranja,
pueden añadirse. Cuando la forma unitaria de dosificación es una
cápsula puede contener, además de materiales del tipo anterior, un
vehículo líquido tal como polietilenglicol o un aceite graso. Otras
formas unitarias de dosificación pueden contener otros materiales
diversos que modifican la forma física de la forma unitaria, por
ejemplo, revestimientos. Por tanto, los comprimidos o pastillas
pueden revestirse con azúcar, goma laca u otros agentes de
revestimiento. Los jarabes pueden contener, además de los presentes
compuestos, sacarosa como agente edulcorante y ciertos conservantes,
tintes y colorantes y aromas. Los materiales usados en la
preparación de estas diversas composiciones deben ser
farmacéuticamente puros y no tóxicos en las cantidades usadas.
Los compuestos de fórmula (I) son inhibidores de
PDK1 y p70S6 quinasa, dos miembros de la ruta PI3 quinasa/AKT.
Puede demostrarse la actividad inhibidora de los compuestos de
fórmula (I) mediante los métodos a continuación.
El ensayo descrito mide la fosforilación del
péptido PDKtide (KTFCGTPEYLAPEVRREPRILSEEEQEMFRDFDYIADWC; nº de
cat. 14-452, lote 23876U) en el sitio consenso de
fosforilación de PDK1 mediante PDK-1 recombinante
(UBI) en Km para la saturación de ATP y PDKtide usando placas
filtrantes de membrana de fosfocelulosa. También se mide de manera
similar la fosforilación del sustrato de p70S6 quinasa mediante
p70S6 quinasa recombinante.
Se obtuvieron ambas líneas tumorales, de
carcinoma de colon HCT116 (nº de cat. CCL-247) y
glioblastoma U87MG (nº de cat. HTB-14), a partir de
la Colección americana de cultivos tipo (ATCC, American Type
Culture Collection). El medio de crecimiento convencional
difería para cada línea celular pero se hicieron crecer todas en FBS
inactivado por calor al 10% (Invitrogen nº de cat.
10082-147), 37ºC, atmósfera de CO_{2} al 5% y en
una cámara humidificada. Se completó el paso celular de una a dos
veces por semana usando disolución de tripsina al 0,25%/EDTA 1 mM
(Invitrogen, nº de cat. 25200-056) manteniendo las
células en crecimiento de fase log. Se cultivaron células U87MG en
medio DMEM (Invitrogen nº de cat. 11965-092),
aminoácidos no esenciales 1 mM (AANE) y piruvato de sodio 0,1 mM.
Se hicieron crecer células HCT116 en medio modificado McCoy 5A
(Invitrogen, nº de cat. 16600-082), bicarbonato de
sodio al 0,15%, HEPES 0,1 mM, D-glucosa 25 mM y
piruvato de sodio 0,1 mM.
Se ejecutaron ensayos de apoptosis usando el kit
de ensayo de detección de muerte celular ELISA^{plus} (Roche,
1774425) siguiendo estrictamente el protocolo adjunto.
Se evaluaron los cambios en la proliferación
celular resultante del tratamiento con LY317615 (véase por ejemplo
el documento WO 02/02116), que es un compuesto de fórmula
o un compuesto de fórmula (I) en la
que R^{1} es hidrógeno y R^{2} es metilo (compuesto 1) mediante
la incorporación de yoduro de propidio (PI) (Sigma, nº de cat.
p-4864). Brevemente, se centrifugó cada placa de
cultivo celular 10 minutos (200 rpm), se aspiró cuidadosamente el
sobrenadante y se añadieron 100 \mul de PI 0,125 mM en PBS a cada
pocillo de una placa de 96 pocillos. Se midió la intensidad de
fluorescencia de cada pocillo en el cultivo (células no viables)
usando el lector de placas multicanal Vector^{2} (Wallac, modelo
nº 1420) y se congeló hasta -80ºC. Se dejó descongelar la placa,
volver a temperatura ambiente y reanalizarse para determinar los
cambios en la intensidad de fluorescencia (células totales) usando
de nuevo el Vector^{2}. Se determinaron las células proliferantes
en el cultivo restando la fracción no viable de las células totales.
Entonces se notificaron los resultados como un porcentaje del
control no
tratado.
Se prepararon lisados de proteínas mediante la
incubación en tampón RIPA (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150
mM, EDTA 1 mM, NP-40 al 1%, desoxicolato de sodio
al 0,25%, fluoruro de sodio 1 mM, ortovanadato de sodio 1mM e
inhibidores de proteasas Complete^{TM} (Roche nº de cat.
10019600) durante una hora con rotación. Entonces se centrifugó el
lisado (10 minutos a 10.000 rpm), se recogió el sobrenadante y se
determinaron las concentraciones de proteína usando el ensayo de
proteínas Bio-Rad DC (nº de cat.
500-0122). Se separaron las proteínas mediante
SDS-PAGE usando geles de
tris-glicina al 4-20% (Invitrogen,
nº de cat. EC6028) y se transfirieron a la membrana de PVDF
Hyper^{TM}-bond (Amersham, nº de cat. rpn303F). Se
incubaron todos los anticuerpos primarios durante la noche a 4ºC en
una disolución de leche al 5%/1X PBS (Gibco, nº de cat.
70011-044). Se incubaron anticuerpos secundarios
(Santa Cruz, nº de cat. sc-2055,
sc-2054) unidos a peroxidadas del rábano (HRP)
durante un mínimo de dos horas antes de la detección. Se determinó
la señal específica mediante el programa
Lumi-Imager^{TM} y Lumi-Analyst
para definir cambios en la fosforilación y expresión de proteínas.
Los anticuerpos primarios usados son los siguientes: GSK3b,
pGSK3b^{ser9} (Cell Signaling, nº de cat. 9332, 9336), proteína
ribosómica S6, proteína^{ser240/244} ribosómica pS6 (Cell
Signaling, nº de cat. 2212, 2215), AKT (Transduction Labs nº de
cat. 610861), pAKT^{ser308}, pAKT^{ser473} (Cell Signaling, nº
de cat. 9275, 9271), PHASi (Zymed, nº de cat.
51-2900), p4EBP1^{ser65} (Cell Signaling nº de
cat. 9451), p70S6 quinasa, phos-p70S6
quinasa^{thr421/ser424} (Cell Signaling nº de cat. 9202, 9204),
p90RSK, phosp90RSK^{thr359/ser363} (Cell Signaling nº de cat.
9347, 9344), FKHRL1, pFKHRL^{thr32} (Upstate Biochemicals, Inc.
nº de cat. 06-951, 06952).
Se implantan de manera subcutánea
aproximadamente 5 x 10^{6} células tumorales en el costado de
ratones atímicos desnudos (Harlan, Indianápolis, IN). El
tratamiento de tumores comienza cuando los tumores alcanzan los 100
mm^{3} y continúa durante 21 días consecutivos dos veces por día
v.o. Se controlan el peso corporal y el tamaño tumoral semanalmente
o dos veces por semana.
El compuesto 1 inhibe la PDK-1
con una CE50 de 370 nM e inhibe la p70S6 quinasa con una CE50
<500 nM. El tratamiento con compuesto 1 induce la apoptosis en
líneas celulares de cáncer en seres humanos derivadas de colon,
pulmón y próstata (ambas líneas tumorales, dependientes e
independientes de andrógenos) así como de linfoma no de Hodgkin. El
tratamiento con compuesto 1 suprime la fosforilación de GSK3\beta,
el factor de transcripción forkhead AFX, 4EBP1, y proteína
ribosómica S6 (todas las lecturas de actividad de la ruta AKT).
Además, el tratamiento de ratones portadores de xenoinjertos de
tumor humano con compuesto 1 suprime la fosforilación de
GSK3\betaser9 en estos tejidos de xenoinjerto, incluyendo una
línea celular de carcinoma de próstata independiente de andrógenos,
durante hasta 8 horas tras la dosificación. Se ha demostrado la
eficacia antitumoral del compuesto tanto en xenoinjertos de cáncer
de colon HCT116, en xenoinjertos de glioblastoma U87MG como en
xenoinjertos a partir de la línea celular PC3 de carcinoma de
próstata independiente de andrógenos.
Claims (12)
1. El uso de un compuesto de fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{1} y R^{2} son
cada uno independientemente hidrógeno o alquilo
C_{1}-C_{4}; o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo, en la preparación de un medicamento para tratar
el cáncer de
próstata.
2. El uso de un compuesto de fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{1} y R^{2} son
cada uno independientemente hidrógeno o alquilo
C_{1}-C_{4}; o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo, en la preparación de un medicamento para tratar
el adenocarcinoma de próstata independiente de
andrógenos.
\newpage
3. El uso de un compuesto de fórmula
en la que R^{1} y R^{2} son
cada uno independientemente hidrógeno o alquilo
C_{1}-C_{4}; o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo en la preparación de un medicamento para tratar
el glioblastoma, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de
ovario, cáncer de endometrio o cáncer de células
renales.
4. El uso según la reivindicación 3, en el que
dicho medicamento es para tratar el glioblastoma.
5. El uso según la reivindicación 3, en el que
dicho medicamento es para tratar el cáncer de colon.
6. El uso según la reivindicación 3, en el que
dicho medicamento es para tratar el cáncer de páncreas.
7. El uso según la reivindicación 3, en el que
dicho medicamento es para tratar el cáncer de ovario.
8. El uso según la reivindicación 3, en el que
dicho medicamento es para tratar el cáncer de endometrio.
9. El uso según la reivindicación 3, en el que
dicho medicamento es para tratar el cáncer de células renales.
10. El uso según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que R^{2} es hidrógeno o metilo.
11. El uso según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que R^{1} es hidrógeno, metilo, etilo,
n-propilo o isopropilo.
12. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que R^{1} es hidrógeno y R^{2} es
metilo.
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