BRPI0608880A2 - agentes anti-angiogênicos com aldesleucina - Google Patents

Abstract

AGENTES ANTI-ANGIOGêNICOS COM ALDESLEUCINA. A presente invenção se refere à terapias combinadas com composições de IL-2 e agentes anti-angiogênicos para o tratamento de câncer. Ainda proporcionados são métodos de alívio de toxicidades e aumento da eficácia associada à administração de composições de IL-2 ou composições antiangiogênicas.

Description

AGENTES ANTI-ANGIOGÊNICOS COM ALDESLEUCINA

REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDO RELACIONADO

O presente pedido reivindica benefício sob 35 U.S.C. §119(e) do pedido provisório 60/654.341, depositado era 18 deFevereiro de 2 005, pedido o qual é aqui incorporado porreferência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a métodos de terapiapara doenças associadas à proliferação celular anormal. Emalgumas modalidades, IL-2 recombinante é combinada comagentes anti-angiogênicos para uso no tratamento de câncer.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Capilares atingem quase todos os tecidos do corpohumano e suprem os tecidos com oxigênio e nutrientes, bemcomo removem produtos residuais. Sob condições típicas, ascélulas endoteliais que revestem os capilares não sedividem e o número ou tamanho dos capilares, portanto, nãoaumentam normalmente em um adulto humano. Sob determinadascondições, contudo, tal como quando um tecido é danificadoou durante determinadas partes do ciclo menstrual, oscapilares começam a proliferar rapidamente. Esse processode formação de novos capilares a partir de vasos sangüíneospré-existentes é conhecido como angiogênese ouneovascularização. Veja Folkman, J. Scientific American275, 150-154 (1996). Angiogênese durante cicatrização deferimentos é um exemplo de neovascularizaçãopatofisiológica durante a vida adulta. Durante acicatrização de ferimento, os capilares adicionaisproporcionam um suprimento de oxigênio e nutrientes,promovem granulação tecidual e auxiliam na remoção deresíduos. Após término do processo de cicatrização, oscapilares normalmente regridem. Lymboussaki, A. "VascularEndothelial Growth Factors and their Receptors in Embryos,Adults and in Tumors" Academic Dissertation, University ofHelsinki, Molecular/Câncer Biology Laboratory andDepartment of Pathology, Haartman Institute, (1999).

A angiogênese também exerce um papel importante nodesenvolvimento de células cancerígenas. Sabe-se que, umavez que um agrupamento de células cancerígenas atinge umdeterminado tamanho, aproximadamente 1 a 2 mm de diâmetro,as células cancerígenas devem desenvolver um suprimentosangüíneo de forma que o tumor cresça, uma vez que difusãopode não ser suficiente para suprir as células cancerígenascom oxigênio e nutrientes o bastante. Assim, espera-se queinibição da angiogênese interrompa o crescimento de célulascancerígenas. Dos fatores angiogênicos identificados, ofator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é o maispotente e específico e foi identificado como um reguladorcrucial de angiogênese normal e patológica; embora outrosfatores, tais como fator de crescimento epidérmico (EGF),fator de crescimento de fibroblasto (FGF) e fator decrescimento derivado de plaquetas (PDGF), tenham sidoimplicados em angiogênese e sobrevivência de célulascancerígenas. Curr Opin Investig Drugs. Fevereiro de 2001;2(2): 280-6.

Imunidade anti-tumor específica envolve ativação demúltiplos tipos de células no sistema imune, o maiseficiente sendo linfócitos T citolíticos. São requeridospara induzir à resposta imune mediada por linfócitos Tanti-tumor específica, o reconhecimento não apenas doantlgeno de tumor de interesse, mas também de interaçõesco-estimulatórias entre ligantes específicos presentessobre a célula de tumor ou a célula que apresenta antígenoe os linfócitos T alvo. Esse segundo sinal co-estimulatóriopode também ser proporcionado por fatores solúveis, taiscomo citocinas ou outras moléculas peptídicas as quais seligam a receptores específicos na superfície celular einiciam diversas vias de transdução de sinal, resultando emaumento de função efetora.

A interleucina-2 (IL-2) é uma citocina linfócito T-derivada a qual se liga a receptores específicos presentessobre células T e células natural killer (NK) e ativará osmesmos para citólise de tumor, secreção de citocina eoutras funções efetoras. Linfócitos T CD4 e CD8 expressam oreceptor para IL-2 e desenvolvem função sintética decitocina e efetora citolítica aumentadas após exposição aoagente biológico. Os efeitos funcionais da IL-2 sãomediados via encaixe com o receptor de IL-2 (IL-2R), o qualé estruturalmente composto de três subunidades: a, p e umacadeia y comum que é compartilhada por outros receptores decitocina (Caligiuri e colaboradores, J. Exp. Med. 1990171(5): 1509-1526; Bazan, J.F., Science 1992 257(5068):410-413; Theze e colaboradores, Immunol. Today 1996 17(10):481-486). A ativação de receptores de IL-2 e conseqüentesinalização são dependentes dos tipos de receptor de IL-2sobre as células (Caligiuri e colaboradores, J". Exp. Med.1990 171(5): 1509-1526; Voss e colaboradores, J. Exp. Med.1992 176(2): 531-541; Expinoza e colaboradores, J". Leukoc.Biol. 1995 57(1): 13-29; Theze e colaboradores, Immunol.Today 1996 17(10): 481- 486). Células T expressam o IL-2RaPY de alta afinidade, enquanto que células NK, monócitose macrófagos expressam predominantemente a forma comafinidade intermediária, IL-2R]3y (Caligiuri ecolaboradores, J. Exp. Med. 1990 171(5): 1509-1526; Voss ecolaboradores, J. Exp. Med. 1992 176(2): 531-541; Theze ecolaboradores, Iwmunol. Today 1996 17(10): 481-486; Naglere colaboradores, J. Exp. Med. 1990 171(5): 1527-1533).Central a seu mecanismo, a IL-2 ativa as JAKs (JAK1, JAK3),as quais fosforilam tirosinas chave sobre IL-2RP, as quaisservem como locais de ancoragem para moléculas desinalização a jusante, incluindo Shc e Stat5 as quais,então, catalisam a ativação de duas vias distintas:Shc/Ras/Raf/MAPK e JAK/STAT5, as quais translocam para onúcleo e regulam diretamente uma família de fatores detranscrição gene-regulados - STATs (0'Shea, J.J., Iwmunity1997 7(1): 1-11). Shc recruta o complexo Grb-2/Sos e ativaa via Ras/Raf/MAPK e Grb-2/Gab-2, o qual ativa a via de 3-quínase de fosfatidilinositol (PI3K). Juntas, essasproteínas de sinalização regulam fatores de transcrição degene, por fim controlando o crescimento, divisão,diferenciação celular e atividade imune. Além disso, a IL-2induz a efeitos apoptóticos através de regulação de genespró-mitogênicos, levando a bcl-2, bcl-xl, c-myb aumentados,os quais afetam o controle do ciclo celular através deativação de cdk 2,4,6 e inibição de p27kipl ou pode sernegativamente regulada por SOCS (supressores de sinalizaçãode citocina) (Smith, K.A., Science 1988 240(4856): 1169-1176; Theze e colaboradores, Iwmunol. Today 1996 17(10):481-486) . É reportado que a interação entre IL-2 e IL-2Rdispara a ativação a jusante das vias de sinalização MAPK,PI-3K e JAK/STAT, levando à sobrevivência e proliferaçãocelular (Miyazaki e colaboradores, Science 1994 266(5187):1045-1047; Beadling e colaboradores, Embo J. 1996 15(8):1902-1913; Nakajima e colaboradores, Iwmunity 1997 7(5):691-701; Moriggl e colaboradores, Iwmunity 1999 11(2): 225-230) .

Estudos pré-clínicos em vários modelos de tumor emmurino demonstraram que a IL-2 humana recombinante, quandoadministrada a animais trazendo tumor durante períodos de10 a 14 dias, pode resultar em regressão das cargas detumor, sobrevivência a longo prazo e resistência aumentadaa re-crescimento de tumor. Análise de linfõcitos esplenicosobtidos desses animais mostrou que os efeitos anti-tumorsão em virtude, pelo menos em parte, de aumento da funçãode células T citolíticas. Esse efeito inclui ativação decitólise direta de células tumorígenas pela CTL, bem comosíntese aumentada de outras citocinas derivadas delinfõcitos T, as quais podem ter outros efeitos anti-tumordiretos ou indiretos também.

Melanoma metastático e carcinoma de células renais(RCC) são doenças grandemente incuráveis e resistentes amaioria dos tipos de quimioterapias sistêmicas, portanto,permanece uma necessidade considerável pelo desenvolvimentode terapias mais eficazes. Dados clínicos recentes têmsustentado o desenvolvimento de inibidores de quínase detirosina do receptor de pequenas moléculas (RTK),particularmente BAY 43-9006 ou SU11248 em melanoma ecarcinoma de células renais. BAY 43-9006 e SU11248 inibemmúltiplas quínases que estão envolvidas em crescimento,proliferação anti-angiogênese de tumor. BAY 43-9006 é uminibidor potente de Raf-1, um membro da via de sinalizaçãoRaf/MEK/ERK (Richly e colaboradores, Int. J. Clin.Pharmacol. Ther. 2003 41(12): 620-621; Wilhelm ecolaboradores, Câncer Res. 2004 64(19): 7099-7109; Awada ecolaboradores, Br. J. Câncer 2005 92(10): 1855-1861) einibe a B-Raf WT e B-Raf V599E mutante. Além dos efeitos doBAY 43-9006 sobre a Raf, acredita-se que a maior parte desua atividade pode ser mediada via inibição de outras RTKs,particularmente VEGFRs (VEGFR-2 e VEGFR-3), PDGFRp e outrasquínases chave FLT-3 e cKIT (Wilhelm e colaboradores,Câncer Res. 2004 64(19): 7099-7109). Respostas com BAY 43-9006 em experimentos preliminares com tumor sólidoestabeleceram que administrações diárias ou duas vezes aodia podem resultar em estabilizações da doença, incluindoalgumas respostas parciais. Até o momento, estudos em FaseI têm indicado que o BAY 43-9006 é geralmente bem toleradoem pacientes. As toxicidades mais comuns associadas ao Bay43-9006 envolviam efeitos no trato gastrintestinal(diarréia, náusea, eólica abdominal) ou reaçõesdermatológicas, incluindo prurido ou erupções na pele(Richly e colaboradores, Int. J. Clin. Pharmacol. Ther.2003 41(12): 620-621; Ahmad e Eisen, Clin. Câncer Res. 200410 (18 Pt 2) : 6388S-92S; Awada e colaboradores, Br. J.Câncer 2005 92(10): 1855-1861; Strumberg e colaboradores,J. Clin. Oncol. 2005 23(5): 965-972).

Em contraste, SU1124 8 é um inibidor de RTK seletivo,altamente potente de VEGFR-1- 3, PDGFRa, cKIT, FLT3 ePDGFRp (Abrams e colaboradores, Mol Câncer Ther. 2003 2(5):471-478; Mendel e colaboradores, Clin. Câncer Res. 20039(1): 327-337; 0'Farrell e colaboradores, Clin. Câncer Res.2003 9(15): 5465-5476). SU11248 mostrou atividade anti-tumor em uma série de tumores sólidos avançados (RCC,neuroendócrino, estromal e adenocarcinomas) (Faivre ecolaboradores, J. Clin. Oncol. 2006 24(1): 23-35; Motzer ecolaboradores, J". Clin. Oncol. 2006 24(1): 16-24). Dadosclínicos do SU1124 8 também indicam que o fármaco égeralmente tolerados com toxicidades controláveis, as quaisincluem fadiga, linfopenia, neutropenia, hiperlipasemia(Faivre e colaboradores, J". Clin. Oncol. 2006 24(1): 23-35;Motzer e colaboradores, J. Clin. Oncol. 2006 24(1): 16-24).

Estudos da forma hereditária de carcinoma renal decélulas claras, o qual ocorre na sindrome de von Hippel-Lindau, levaram à identificação do gene supressor de tumorde von Hippel-Lindau (VHL). O gene sofre mutação emcarcinoma hereditário de células renais (onde uma mutação éuma mutação na linhagem germinativa) e na maioria dos casosde carcinoma renal esporádico de células claras (onde ambosos alelos adquiriram mutações ou deleções). Gnarra JR, DuanDR, Weng Y e colaboradores, Molecular cloning of the vonHippel-Lindau tumor suppressor gene and its role in renalcarcinoma. Biochimica et Biophysica Acta. 1996; 1242(3):201-10. Uma conseqüência dessas mutações é a superproduçãode fator de crescimento endotelial vascular através de ummecanismo envolvendo o fator de hipoxia-induzível. OIliopoulous AL, C Jiang e colaboradores, NegativeRegulation of Hypoxia-inducable genes by the Von-HippelLindau protein. Proc Natl Acad Sei USA. 1996; 93: 10595-10599. Assim, através de regulação do fator de crescimentoendotelial vascular, a proteína de von Hippel-Lindau estáintimamente relacionada ã angiogênese. O fator decrescimento endotelial vascular estimula o crescimento decélulas endoteliais e, conforme mencionado, parece ser umfator central em angiogênese, particularmente duranteembriogênese, ovulação, cicatrização de ferimento ecrescimento de tumor. Ferrara N. Molecular and biologicalproperties of vascular endothelial growth factor. J. Mol.Med. 1999; 77: 527-543.

O fator de crescimento endotelial vascular representaum bom alvo para tratamento de câncer renal de célulasclaras em virtude do fato de mutações no gene supressor detumor de von Hippel-Lindau resultarem em superproduçãodesse fator de crescimento pelos tumores. Um estudoaleatório, duplo-cego, placebo-controlado do anticorpomonoclonal humanizado (bevacizumab) em pacientes com câncerrenal de células claras metastático foi conduzido por Yange colaboradores, A randomized trial of bevacizumab, ananti-vascular endothelial growth factor antibody,. formetastatic renal câncer. New England Journal of Medicine.2003; 349(5): 427-34. O tempo para progressão de tumor foiprolongado por um fator de 2,55 em pacientes aos quais foifornecido bevacizumab por quilograma (10 mg/kg a cada duassemanas), quando comparado com pacientes no grupo complacebo. A sobrevivência não era uma meta primária nesseexperimento, o que permitiu que os pacientes mudassem deplacebo para terapia com bevacizumab no momento deprogressão da doença. Id. Tratamentos para câncer renal queobjetivam mecanismos angiogenicos também podem ser eficazesatravés de outras vias que não aquelas mediadas pelo fatorde crescimento endotelial vascular. Existem outrasproteínas no microambiente local de alguns tumores quepodem promover a angiogênese. Como tal, existe umanecessidade por uma terapia anti-angiogênica que utilizauma combinação racional de inibidores, dirigida àcompreensão da biologia de carcinoma de células renais.

Interleucina-2 humana recombinante (aldesleucina) foiaprovada pelo FDA para o tratamento de câncer renalmetastático baseado nos resultados de vários experimentosmulticentro em 255 pacientes que receberam um regime debolus em alta dose intermitente. Nesses experimentos,respostas objetivas foram observadas em 15% dos pacientes ea sobrevivência média era de 16,3 meses (Fisher e Rosenberg2000 Câncer J Sei Am 6S1: S55-57). Levando-se em conta atoxicidade significativa associada a esse regime, uma sériede experimentos em fase I e fase II empregando rIL-2 emdiferentes doses e usando diferentes vias de administraçãoforam conduzidos. Uma revisão recente da eficácia da rIL-2como um único agente indicou uma resposta global de 15% emmais de 1700 pacientes com RCC metastático que foramtratados nesse série de estudos. Respostas completas foramobservadas em 3 a 5% dos pacientes. Bukowski RM. Naturalhistory and therapy of metastatic renal cell carcinoma: therole of interleukin-2. Câncer. 1997; 80(7): 1198-220. Astaxas não parecem diferir entre essas vias. Uma comparaçãoaleatória entre o regime intravenoso de bolus em alta dosee regime IV de bolus em baixa dose e regime ambulatorialsubeutâneo não mostrou diferença na sobrevivência médiaentre os grupos, mas os regimes em baixa dose eambulatorial eram significativamente menos tóxicos. YangJC, Sherry RM, Steinberg SM e colaboradores, Randomizedstudy of high-dose and low-dose interleukin-2 in patientswith metastatic renal câncer. Journal of Clinicai Oncology.2003; 21(16): 3127-32.

Além de ter efeitos diretos de imunomodulação, a rIL-2também pode impedir a proliferação de tumor causandoliberação secundária de citocina (IFNy) de células NKativadas. Saraya KLA, Balkwill FR. Temporal sequence andcellular origin of interleukin-2 stimulated cytokine geneexpression. British Journal of Câncer. 1993; 67(3): 514-21.

As taxas de resposta e resultados em pacientes comcâncer renal de células claras podem ser aperfeiçoados.Experimentos clínicos empregando novas combinações defármaco são necessários. A combinação de rIL-2 e agentesanti-angiogênicos, tal como bevacizumab, pode ter efeitosaditivos que poderiam se traduzir em benefício clínicoadicional para pacientes com carcinoma de células renaismetastático, bem como outros cânceres.

Outra vantagem à abordagem complementar para regressãode câncer é que ela proporciona uma plataforma menosfacilmente ultrapassada por mutações de resistência. Ondealvos terapêuticos são assim polarizados e específicos (oque pode ser necessário de forma a evitar objetivação decélulas hospedeiras), tal como um substrato particular emum replicon viral ou uma quínase em uma linhagem de célulascancerígenas, uma única mutação de ponto no estado doentiopode torna-la inalterada por um fármaco, resultando emcepas ainda mais resistentes da doença em futuras gerações.

Novos métodos e mecanismos para o tratamento depacientes tendo distúrbios associados à proliferaçãoanormal que são resistentes a ou inadequadamente tratadosatravés de abordagens convencionais, utilizando agentes queobjetivam mecanismos de resposta imune no corpo esubstratos de estado-doentio, são necessários. A presenteinvenção proporciona tais agentes terapêuticos e aindaproporciona outras vantagens relacionadas.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção é baseada, em parte, em terapiascombinadas únicas usando inibidores de quínase de tirosinado receptor de pequenas moléculas e rIL-2 com toxicidadesque não se sobrepõem. Dado que melanomas e RCC sãogeralmente responsivos à imunoterapia, tal como rIL-2,combinações racionais de rIL-2 com inibidores potenciais dequínase de tirosina de receptor, baseado na farmacologiados agentes individuais, foram avaliadas aqui. A invençãoproporciona esquemas de fármaco clinicamente aplicáveispara driblar interações potenciais de fármacos baseado noperfil toxicológico desses agentes. O potencial deinterações farmacocinéticas/farmacodinâmicas adversas einterações farmacológicas adversas também é elucidado. Osefeitos de rIL-2 e inibidores de quínase de tirosina depequenas moléculas, tal como BAY 43-9006, sobre células T eo impacto sobre vias de sinalização IL-2-mediadas (MAPK eJAK/STAT5) é descrito.

Assim, a presente invenção expande a indicação daeficácia anti-tumor de compostos de IL-2, tal como IL-2recombinante (rIL-2, também conhecida como aldesleucina)contra linhagens de células cancerígenas que respondempobremente à terapias convencionais, resultando emsobrevivência a longo prazo aumentada e reforço deimunidade ao tumor. Além disso, os efeitosimunomodulatórios de rIL-2 objetivam aliviar os efeitoscolaterais existentes através de administração decomposições anti-angiogênicas para co-administração com asmesmas. Métodos de tratamento de um indivíduo sofrendo deproliferação celular anormal, particularmente carcinoma decélulas renais, usando uma combinação de um composto de IL-2, tal como rIL-2, e pelo menos um agente anti-angiogênico,são proporcionados. Ainda, métodos de tratamento de umindivíduo sofrendo de proliferação celular anormal,particularmente carcinoma de células renais, usando umacombinação de um composto de IL-2, tal como rIL-2, e umamolécula pequena, são proporcionados também. Moléculaspequenas preferidas da presente invenção são listadas nasTabelas 1-5. Moléculas particularmente preferidas são N-(2-(dimetilamino)etil)-5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno)metil)-2,4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida (tambémconhecida como SU11248) e 1-(4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi)fenil)-3-(4-cloro-3- (trifluorometil)fenil)uréia(também conhecida como Bay 43-9006).

Aldesleucina e agentes anti-angiogênicos podem seradministrados juntos ou separadamente como composiçõesfarmacêuticas individuais. Se administrados separadamente,aldesleucina pode ser administrada antes de, concorrentecom ou subseqüente ao agente anti-angiogênico. Sãoproporcionados regimes particulares compreendendo esquemasde dosagem diários, semanais e mensais (ou interações dosmesmos) para a co-administração de aldesleucina com agenteanti-angiogênico, tal como 6,7-bis(2-metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6-(3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metóxiquinazolin-4-amina, N-(2-(dimetilamino)etil)-5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno)metil)-2,4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N-(4 -clorofenil)-4-((piridin-4-il)metil)ftalazin-l-amina e 1-(4-(2- (metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi)fenil)-3-(4-cloro-3-(trifluorometil)fenil)uréia.

Em uma modalidade, os agentes anti-angiogênicos, depreferência um de 6,7-bis(2- metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6- (3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-f luorofenil) -7-metóxiquinazolin-4-amina, N- (2-(dimetilamino) etil) -5- ( (5-f luoro-2-oxoindolin-3-ilideno)metil)-2,4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N- (4-clorofenil)-4-((piridin-4-il)metil)ftalazin-l-amina e l-(4-(2- (metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi)fenil)-3-(4-cloro-3-(trifluorometil)fenil)uréia são co-administrados comproteínas anti-angiogênicas, tais como anticorposmonoclonais capazes de inibição de VEGF. Em uma modalidademais particular, as proteínas anti-angiogênicas da presenteinvenção são bevacizumab ou VEGF-Trap. Em outra modalidademais particular, a proteína é um inibidor de EGF, tal comocetuximab.

Em uma modalidade, administração de aldesleucina eagente(s) anti-angiogênico(s) juntos da maneira apresentadaaqui potencializa a eficácia do agente anti-angiogênico,resultando em uma resposta terapêuticapositiva/sinergística que é aperfeiçoada com relação àquelaobservada com o inibidor apenas.

Outras modalidades proporcionam uma embalagemterapêutica adequada para venda comercial para o tratamentode um paciente sofrendo de câncer compreendendo umrecipiente, uma quantidade terapeuticamente eficaz dealdesleucina e uma quantidade terapeuticamente eficaz de umagente anti-angiogênico e/ou molécula pequena, depreferência listada nas Tabelas 1-5, tais como 6,7-bis(2-metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6-(3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metóxiquinazolin-4-amina, N-(2-dimetilamino)etil) -5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno)metil)-2,4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N-(4-clorofenil)-4-((piridin-4-il)metil)ftalazin-l-amina ou 1-(4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi) fenil)-3-(4-cloro-3-(trifluorometil)fenil)uréia.

Em ainda outras modalidades, um kit é proporcionado. Okit compreende uma combinação de medicamentos para otratamento de um paciente sofrendo de câncer compreendendo:(a) aldesleucina e (b) um agente anti-angiogênicoselecionado de 6,7-bis(2-metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6-(3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-fluorofenil)- 7-metóxiquinazolin-4-amina, N-(2-(dimetilamino)etil)-5- ( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno)metil) -2, 4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N-(4-clorofenil)-4-((piridin-4-il)metil)ftalazin-l-amina ou 1-(4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi)fenil)-3-(4-cloro-3-(trifluorometil)fenil)uréia, para uso simultâneo,seqüencial ou separado.

Métodos de fabricação das combinações descritas aquisão proporcionados e considerados dentro do escopo dainvenção, assim como o uso das combinações em métodos parafabricação de medicamentos para uso nos métodos dainvenção.

Outras modalidades da invenção incluem aquelasdescritas na descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURASA Figura 1 mostra a atividade de um único agente, rlL-2, BAY 43-9006 ou SU1124 8, em modelos de tumor em murinos células T-competente, IL-2-responsivo. Células de melanoma B16-F10 (2 x IO6) , de cólon CT26 (2 x IO6) ou carcinoma renal RENCA (1 x IO6) foram implantadas s.c. no f lanço direito de camundongos fêmeas C57BL6 ou BALB/c. Os tratamentos foram iniciados quando os tumores estavam estabelecidos em um tamanho médio de 50 - 225 mm3, conforme esboçado nos métodos. Os camundongos foram aleatoriamente distribuídos em grupos de tratamento (10 camundongos/grupo). rIL-2 foi administrada diariamente subcutaneamente (0,2-3 mg/kg/d). BAY 43-9006 ou SU11248 (1 - 100 mg/kg) foi administrado diariamente como uma solução via ingestão oral forçada. A Figura 1 ilustra a inibição média de crescimento de tumor (calculada como [1-(volume médio do tumor do grupo tratado/volume médio do tumor do grupo com veículo) x 100]) de um único agente nos modelos de tumor BI 6-FIO, CT26 e RENCA entre os dias 10-14. Os dados são compilados de múltiplos estudos independentes, com cada estudo de 10 camundongo/grupo. * denota significância estatística vs. tratamento com veículo (p< 0,05, ANOVA).

A Figura 2 mostra a eficácia de terapia concomitante com rIL-2 e BAY 43-9006 no modelo de melanoma B16-F10 em murino. Células B16-F10 (2 x IO6 células) foram implantadas subcutaneamente no flanco direito de camundongos fêmeas C57BL6. Os camundongos foram aleatoriamente distribuídos em grupos quando os tumores estavam com -50 mm3 e os tratamentos iniciados no dia 0 com veículo, dias 0-6 (♦) , rIL-2 (3,3 mg/kg, s.c, dias 0-6) (A) ou BAY 43-9006 (30mg/kg, p.o. dias 0-6) (x) ou rIL-2 (3,3 mg/kg, s.c, dias 0-6) + BAY 43-9006 (30 mg/kg, p.o. dias 0-6) (■) combinados. A Figura 2 ilustra o volume médio do tumor (mm3 + SE) vs. dias pós-distribuição aleatória (n= 10 camundongo/grupo).

As Figuras 3A e 3B mostram a eficácia de terapia seqüencial com rIL-2 e BAY 43-9006 no modelo de melanoma B16-F10 em murino. Células B16-F10 (2 x 10e células) foram implantadas subcutaneamente no flanco direito de camundongos fêmeas C57BL6. Os camundongos foram aleatoriamente distribuídos em grupos quando os tumores estavam com -50 mm3 e os tratamentos iniciados no dia 0. A Figura. 3A mostra os resultados de um regime seqüencial com rIL-2 administrada primeiro, então, BAY 43-9006. O painel ilustra: veículo (♦) dias 0-6, 7-13; rIL-2 (3,3 mg/kg, s.c, dias 0-6) (A) ou BAY 43-9006 (30 mg/kg, p.o. dias 7-13) (x) ou rIL-2 (3,3 mg/kg, s.c, dias 0-6) + BAY 43-9006 (30 mg/kg, p.o. dias 7-13) (•) combinados. A Figura 3B mostra os resultados de regime seqüencial com BAY 43-9006 administrado primeiro, seguido por rIL-2. O painel ilustra: veículo (♦) dias 0-6, 7-13; BAY 43-9006 (30 mg/kg, p.o. dias 0-6) (x); rIL-2 (3,3 mg/kg, s.c, dias 7-13) ( ) ou BAY 43-9006 (30 mg/kg, p.o. dias 0-6) + rIL-2 (3,3 mg/kg, s.c, dias 7-13) (▲) combinados. Os gráficos mostram o volume médio do tumor (mm3 + SE) vs. dias pós-distribuição aleatória (n= 10 camundongo/grupo).

A Figura 4 mostra a eficácia de terapia concomitante com rIL-2 e SU11248 no modelo de melanoma B16-F10 em murino. Células B16-F10 (2 x 106 células) foram implantadas subcutaneamente no flanco direito de camundongos fêmeas C57BL6. Os camundongos foram aleatoriamente distribuídos emgrupos quando os tumores estavam com -50 mm3 e os tratamentos iniciados no dia 0 com veículo, dias 0-6 (O) , rIL-2 (3,3 mg/kg, s.c, dias 0-6) ( ) ou SU11248 (40 mg/kg, p.o. dias 0-6) (O) ou rIL-2 (3,3 mg/kg, s.c, dias 0-6) + SU1124 8 (4 0 mg/kg, p.o. dias 0-6) (A) combinados. A Figura 4 ilustra o volume médio do tumor (mm3 ± SE) vs. dias pós-distribuição aleatória (n= 10 camundongo/grupo).

As Figuras 5A e 5B mostram a eficácia de terapia seqüencial com rIL-2 e SU1124 8 no modelo de melanoma B16-F10 em murino. Células B16-F10 (2 x IO6 células) foram implantadas subcutaneamente no flanço direito de camundongos fêmea C57BL6. Os camundongos foram aleatoriamente distribuídos em grupos quando os tumores estavam com -50 mm3 e os tratamentos iniciados no dia 0. A Figura 5A mostra os resultados de regime seqüencial com rIL-2 administrada primeiro, então, SU11248. O painel ilustra: veículo (O) dias 0-6, 7-13; rIL-2 (3,3 mg/kg, s.c, dias 0-6) (□) ou SU11248 (40 mg/kg, p.o. dias 7-13) (x) ou rIL-2 (3,3 mg/kg, s.c, dias 0-6) + SU11248 (40 mg/kg, p.o. dias 7-13) (•) combinados. A Figura 5B mostra os resultados de regime seqüencial com SU11248 administrado primeiro, seguido por rIL-2. O painel ilustra: veículo (O) dias 0-6, 7-13; SU11248 (40 mg/kg, p.o. dias 0-6) (O); rlL-2 (3,3 mg/kg, s.c, dias 7-13) (A) ou SU11248 (40 mg/kg, p.o. dias 0-6) + rIL-2 (3,3 mg/kg, s.c, dias 7-13) combinados. Os gráficos mostram o volume médio do tumor (mm3 + SE) vs. dias pós-distribuição aleatória (n= 10 camundongo/grupo).

A Figura 6 mostra a eficácia de terapia seqüencial com rIL-2 e BAY 43-9006 no modelo de adenocarcinoma de cólonCT26 em murino. Células CT26 (2 x IO6 células) foram implantadas subcutaneamente no flanco direito de camundongos fêmeas BALB/c. Os camundongos foram aleatoriamente distribuídos em grupos quando os tumores estavam com -225 mm3 e os tratamentos iniciados no dia 0. 0 painel ilustra o regime seqüencial com rIL-2 administrada primeiro, então, BAY 43-9006: veículo (♦) dias 0-6, 7-13; rIL-2 (1 mg/kg, s.c, dias 0-6) (□) ou BAY 43-9006 (40 rog/kg, p.o. dias 7-13) (A) ou rIL-2 (1 mg/kg, s.c, dias 0-6) + BAY 43-9006 (40 mg/kg, p.o. dias 7-13) (•) combinados.

A Figura 7 mostra a eficácia de tratamento concomitante com rIL-2 e SU11248 no modelo de adenocarcinoma de cólon CT26 em murino. Células CT26 (2 x IO6 células) foram implantadas subcutaneamente no flanco direito de camundongos fêmeas BALB/c. Os camundongos foram aleatoriamente distribuídos em grupos quando os tumores estavam com -225 mm3 e os tratamentos iniciados no dia 0. 0 painel ilustra: veículo (♦) dias 0-6; rIL-2 (1 mg/kg, s.c, dias 0-6) (□) ou SU11248 (40 mg/kg, p.o. dias 0-6) (O) ou rIL-2 (1 mg/kg, s.c, dias 0-6) + SU11248 (40 mg/kg, p.o. dias 0-6) (•) combinados.

As Figuras 8A e 8B mostram a eficácia de terapia seqüencial com rIL-2 e SU11248 no modelo de adenocarcinoma de cólon CT26 em murino. Células CT26 (2 x IO6 células) foram implantadas subcutaneamente no flanco direito de camundongos fêmeas BALB/c. Os camundongos foram aleatoriamente distribuídos em grupos quando os tumores estavam com -225 mm3 e os tratamentos iniciados no dia 0. O painel ilustra: a Figura 8A mostra os resultados do regime seqüencial com rIL-2 administrada primeiro, então, SU11248:veículo (♦) dias 0-6, 7-13; rIL-2 (1 mg/kg, s.c, dias 0-6) (□) ou SU11248 (40 mg/kg, p.o. dias 7-13) (O) ou rIL-2 (1 mg/kg, s.c, dias 0-6) + SU11248 (40 mg/kg, p.o. dias 7-13) (■) combinados. A Figura 8B mostra os resultados do regime seqüencial com SU1124 8 administrado primeiro, seguido por rIL-2. O painel ilustra: veículo (♦) dias 0-6, 7-13; SU11248 (40 mg/kg, p.o. dias 0-6) (O); rIL-2 (3,3 mg/kg, s.c, dias 7-13) (□) ou SU11248(40 mg/kg, p.o. dias 0-6) + rIL-2 (3,3 mg/kg, s.c, dias 7-13) (A) combinados. Os gráficos mostram o volume médio do tumor (mm3 + SE) vs. dias pós-distribuição aleatória (n= 10 camundongo/grupo).

A Figura 9 mostra a eficácia de terapia concomitante com rIL-2 e BAY 43-9006 no modelo de tumor RENCA RCC em murino. Células RENCA (1 x IO6 células) foram implantadas subcutaneamente no flanco direito de camundongos fêmeas BALB/c. Os camundongos foram aleatoriamente distribuídos em grupos quando os tumores estavam com -5 0 mm3 e os tratamentos iniciados no dia 0 com veículo, dias 0-8 (♦) , rIL-2 (1 mg/kg, s.c, dias 0-4, 7-11) (A) ou BAY 43-9006 (30 mg/kg, p.o. dias 0-8) (x) ou rIL-2 (1 mg/kg, s.c, dias 0-4, 7-11) + BAY 43-9006 (30 mg/kg, p.o. dias 0-8 (■) combinados. A Figura 9 ilustra o volume médio do tumor (mm3 + SE) vs. dias pós-distribuição aleatória (n= 10 camundongo/grupo).

A Figura 10 mostra a eficácia de tratamento concomitante com rIL-2 e SU11248 no modelo de tumor RENCA RCC em murino. Células RENCA (1 x IO6 células) foram implantadas subcutaneamente no flanco direito de camundongos fêmeas BALB/c. Os camundongos foram aleatoriamente distribuídos em grupos quando os tumoresestavam com -50 mm3 e os tratamentos iniciados no dia 0. O painel ilustra: veículo (♦) dias 0-6; rIL-2 (1 mg/kg, s.c, dias 0-6) ou SU11248 (40 mg/kg, p.o. dias 0-6) (x) ou rIL-2 (1 mg/kg, s.c, dias 0-6) + SU11248 (40 mg/kg, p.o. dias 0-6) (A) combinados.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Utilizando um ensaio de detecção, vários tipos de cânceres foram caracterizados como suscetíveis a tratamento com inibidores anti-angiogênese/VEGF e administração de citocina ou modulação com rIL-2. Tais cânceres incluem, por exemplo, CML, AML, de mama, gástrico, endometrial, de glândula salivar, adrenal, de pulmão de células não-pequenas, pancreático, renal, retal, de pele, melanoma, mieloma múltiplo, de cérebro/CNS, de cérvix, de nasofaringe, mesotelioma maligno, de hipofaringe, carcinóide gastrintestinal, de peritônio, de omento, de mesentério, de vesícula biliar, de testículo, esofageal, de pulmão, de tiróide, ovariano, peritoneal, de próstata, de cabeça e pescoço, de bexiga, de cólon, cólon, linfornas e glioblastomas. Os métodos descritos aqui são úteis no tratamento de qualquer um de tais cânceres.

Terapia com uma combinação de aldesleucina e pelo menos um agente anti-angiogênico da maneira apresentada aqui causa uma resposta fisiológica que é benéfica com relação ao tratamento de cânceres cujas células em proliferação sem cessar são altamente dependentes de vascularização, tal como VEGF.

Uma modalidade da invenção proporciona um método de tratamento de um paciente com câncer sofrendo de hipotensão oriunda de administração de aldesleucina compreendendo:co-administração, ao paciente, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente anti-angiogênico para atenuar a hipotensão.

Outra modalidade mais particular da mesma compreende alívio de câncer no paciente.

Outra modalidade da invenção proporciona um método de tratamento de um paciente com câncer sofrendo de hipertensão oriunda de administração de um agente anti-angiogênico compreendendo: co-administração, ao paciente, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de aldesleucina para atenuar a hipertensão.

Outra modalidade mais particular da mesma compreende alívio de câncer no paciente. Em determinadas modalidades, o câncer é suscetível de inibição de angiogênese e/ou estimulação imune.

Em uma modalidade mais particular de qualquer uma das modalidades anteriores, o referido agente anti-angiogênico é selecionado de 6,7-bis(2-metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6-(3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metóxiquinazolin-4-amina, N-(2-(dimetilamino)etil)-5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno) metil)-2,4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N-(4-clorofenil)-4-((piridin-4-il)metil)ftalazin-l-amina ou 1-(4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi)fenil)-3-(4-cloro-3 -(trifluorometil)fenil)uréia.

Outra modalidade da invenção proporciona um método de tratamento de um paciente sofrendo de câncer compreendendo administração, ao referido paciente, de aldesleucina e um composto selecionado de 6,7-bis(2-metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6-(3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metóxiquinazolin-4-amina, N-(2-(dimetilamino)etil)-5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno) metil)-2,4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N- (4-clorofenil)-4-((piridin-4-il)metil)ftalazin-l-amina ou 1-(4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi)fenil)- 3-(4-cloro-3-(trifluorometil)fenil)uréia.

Outra modalidade da invenção proporciona um método de aumento da eficácia de aldesleucina em um paciente com câncer compreendendo primeiro administração de um agente anti-angiogênico em uma dose capaz de induzir à hipóxia no paciente, então, administração da aldesleucina.

Outra modalidade proporciona um método de aumento da eficácia de um agente anti-angiogênico em um paciente com câncer compreendendo redução da sintase de oxido nítrico através de administração de aldesleucina ao paciente.Outra modalidade proporciona um método de aumento da eficácia de um agente anti-angiogênico em um paciente com câncer compreendendo administração de aldesleucina ao paciente, em que a sintase de oxido nítrico e, dessa forma, reduzida através de administração de aldesleucina ao paciente.

Em uma modalidade mais particular da mesma, o referido agente anti-angiogênico é selecionado de 6,7-bis(2-metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6-(3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metóxiquinazolin-4-amina, N- (2- (dimetilamino)etil)-5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno)metil)-2,4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N-(4-clorofenil)-4-((piridin-4-il) metil) ftalazin-l-amina ou 1-(4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi)fenil)-3-(4-cloro-3-(trifluorometil)fenil)uréia.

Outra modalidade da invenção proporciona um métodopara tratamento de um paciente sofrendo de câncer compreendendo as etapas de, primeiro, administração, ao referido paciente, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de aldesleucina, seguido pela administração de um agente anti-angiogênico (tal como) selecionado de 6,7-bis(2-metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6-(3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metóxiquinazolin-4-amina, N-(2-(dimetilamino)etil)-5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno)metil)-2,4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N-(4-clorofenil)-4-((piridin-4-il)metil) ftalazin-l-amina ou 1-(4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi) fenil)-3-(4-cloro-3-(trifluorometil)fenil)uréia.

Outra modalidade da invenção proporciona um método para tratamento de um paciente sofrendo de câncer compreendendo as etapas de, primeiro, administração, ao referido paciente, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente anti-angiogênico, tal como 6,7-bis(2-metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6-(3- morfolinopropóxi)-N- (3-cloro-4-fluorofenil)-7-metóxiquinazolin-4-amina, N-(2-(dimetilamino)etil)-5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno)metil)-2,4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N- (4-clorofenil)-4-((piridin-4-il)metil) ftalazin-l-amina ou 1- (4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi)fenil)-3 -(4-cloro-3 -(trifluorometil)fenil)uréia, seguido pela administração de aldesleucina.

Outra modalidade da invenção proporciona um método para tratamento de um paciente sofrendo de câncer compreendendo administração, separadamente, ao referido paciente, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente anti-angiogênico e aldesleucina de acordo com umesquema de dosagem, em que a aldesleucina é administrada de 1 a 3 vezes ao dia em uma dose entre cerca de 9 e cerca de 13 0 MIU/dia durante um período de pelo menos 3 dias consecutivos, opcionalmente seguido por um período de descanso de pelo menos 3 dias consecutivos.

Em uma modalidade mais particular da mesma, o referido agente anti-angiogênico é administrado de 1 a 6 vezes a cada 2-3 semanas.

Em uma modalidade mais particular da mesma, o referido agente anti-angiogênico é um inibidor de VEGF.

Em uma modalidade mais particular da mesma, o agente anti-angiogênico é selecionado de 6,7-bis(2-metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6-(3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metóxiquinazolin-4-amina, N-(2-(dimetilamino)etil)-5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno)metil)-2,4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N-(4-clorofenil)-4-((piridin-4-il)metil)ftalazin-l-amina ou 1-(4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi)fenil)-3-(4-cloro-3-(trifluorometil)fenil)uréia.

Em uma modalidade mais particular da mesma, a aldesleucina é administrada intravenosamente e o referido período de descanso está presente.

Em uma modalidade mais particular da mesma, a aldesleucina é administrada subcutaneamente e o referido período de descanso está ausente.

Em uma modalidade mais particular da mesma, a aldesleucina é administrada 3 vezes ao dia em uma dose de cerca de 30-100 MIU/dia.

Em uma modalidade mais particular da mesma, a aldesleucina é administrada durante um período de 5 diasconsecutivos, seguido por um período de 9 dias de descanso. Em uma modalidade mais particular da mesma, o referidoesquema de dosagem é repetido durante pelo menos dois cursos. Em uma modalidade ainda mais particular, cada curso consiste de 2-5 dias de tratamento, seguido por um período de descanso de 9-15 dias.

Em outra modalidade mais particular da mesma, a aldesleucina é administrada 3 vezes durante o primeiro diae uma vez ao dia nos dias seguintes.

Em uma modalidade mais particular da mesma, o referido esquema de dosagem é repetido durante pelo menos doiscursos ou 3 cursos ou 4 cursos ou 5 cursos ou 6 cursos ou 7 cursos ou 8 cursos ou 9 cursos ou 10 cursos.

Em uma modalidade mais particular de qualquer uma das modalidades anteriores, o câncer é câncer de cólon, carcinoma de células renais ou melanoma maligno.

Em uma modalidade mais particular da qualquer uma das modalidades anteriores, quando de administração de aldesleucina, pelo menos um composto selecionado de acetaminofeno, meperidina, indometacina, ranitidina, nizatidina, diastop, loperamida, difenidramina ou furosemida é também administrado ao referido paciente.

Em uma modalidade preferida de qualquer uma das modalidades precedentes, o referido agente anti-angiogênico é 6, 7-bis(2-metóxietõxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4- amina, 6-(3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metóxiquinazolin-4-amina, N- (2-(dimetilamino)etil) - 5-((5-f luoro-2-oxoindolin-3 -ilideno) metil) - 2, 4 - dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N-(4-clorofenil)-4-((piridin-4-il) metil) ftalazin-l-amina ou 1-(4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi)fenil)- 3-(4-cloro-3-(trifluorometil)fenil) uréia.

Outra modalidade da invenção proporciona um método de tratamento de um paciente sofrendo de câncer compreendendo administração de aldesleucina e:

um tautômero, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou um sal farmaceuticamente aceitável do tautômero.

Outra modalidade da invenção proporciona um método de tratamento de um paciente sofrendo de câncer compreendendo administração de aldesleucina e:

um tautômero do mesmo, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou um sal farmaceuticamente aceitável do tautômero.

Outra modalidade da invenção proporciona um método de tratamento de um paciente sofrendo de câncer compreendendo administração de aldesleucina e:um tautômero do mesmo, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou um sal f armaceuticamente aceitável do tautômero.

Outra modalidade da invenção proporciona um método de tratamento de um paciente sofrendo de câncer compreendendo administração de aldesleucina e:

um tautômero do mesmo, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou um sal farmaceuticamente aceitável do tautômero.

Outra modalidade da invenção proporciona um método de tratamento de um paciente sofrendo de câncer compreendendo administração de aldesleucina e:

um tautômero do mesmo, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou um sal f armaceuticamente aceitável do tautômero.

Outra modalidade da invenção proporciona um método de tratamento de um paciente sofrendo de câncer compreendendo administração de aldesleucina e um composto da fórmula I:

<formula>formula see original document page 28</formula>em que,

R1 é alquila, -aril(Ri)p ou heterociclil;

R2 é H ou alquil; ou

Rx e R2 são ligados juntos para formar R1-2;

R3 é H, -CN, -0H, halogênio, alquil, aril, alcóxi,NRaRt>, -C(0)Rc, -S(0)nRa ou heterociclil;

R4 é H, -CN, -0H, halogênio, alquil, aril, -0-(CH2)qRg, -O-(CH2) q-0-Re, -NRaRb, -S(0)nRd ou -heterociclil-Rf;

R5 é H, -CN, -0H, halogênio, alquil, aril, -0-(CH2)qRg, -O-(CH2) q-0-Re, -NRaRb, -S(0)nRd ou heterociclil;

R6 é H, -CN, -0H, halogênio, alquil, aril, alcóxi,NRaRb, -C(0)Rc, -S(0)nRd ou heterociclil;

R7 é H, -0H, halogênio, alquil, aril, alcóxi, -NRaRb,S(0)nRd ou heterociclil;

cada Ra e Rb é, independentemente, H, alquil, -C(O)R0,aril, heterociclil ou alcóxi; ou

Ra e Rb são ligados juntos para formar Ri-2;

cada Rc é, independentemente, H, alquil, alcóxi,C(O)alquil, -C(0)arila, -CHO, aril ou heterociclil;

cada Rd é, independentemente, H, alquil, alquenil,aril ou -NRaRb;

cada Re é, independentemente, H ou alquil;

Rf é H, halogênio, -OH, -CN, - (CH2) qNRaRh, alcóxi, -C(0)Rc, -(CH2)qCH3;

cada Rg é, independentemente, H, halogênio, -C(0)Rc,aril, heterociclil ou -NRaRb;Rh é H ou - (CH2)qS (0)nRd;

cada Ri é, independentemente, H, halo, alquil,alquenil, alquinil ou -0(CH2)q-Rg;

cada n é, independentemente, 0, 1 ou 2;cada p é, independentemente, O, 1, 2 ou 3;

cada q é, independentemente, 0, 1 ou 2;

Rx-2 tem a estrutura geral conforme mostrado:

<formula>formula see original document page 30</formula>

em que,

cada R8 é, independentemente, H, -0H, halogênio,alquil, alcóxi, -NRaRb ou -S(0)nRa;

cada R9 é, independentemente, H, alquil, -C(0)Rc ouestá ausente se X é O, S ou está ausente,-

cada X é, independentemente, 0, S, N, CH ou estáausente, desse modo, formando uma ligação covalente; e

cada m é, independentemente, 0, 1 ou 2;ou um tautômero do mesmo, um sal farmaceuticamenteaceitável do mesmo ou um sal farmaceuticamente aceitável dotautômero.

Em uma modalidade mais particular da mesma, o referido

um tautômero do mesmo, um sal farmaceuticamente aceitáveldo mesmo ou um sal farmaceuticamente aceitável dotautômero.

Em uma modalidade mais particular da mesma, o referidocomposto é:

<formula>formula see original document page 30</formula>um tautômero do mesmo, um sal farmaceuticamente aceitáveldo mesmo ou um sal farmaceuticamente aceitável dotautômero.

Outra modalidade da invenção proporciona um método detratamento de um paciente sofrendo de câncer compreendendoadministração de aldesleucina e um composto da fórmula II:

em que:

Rn é alquil, aril ou heterociclil;

R12/ R13/ Ri4, e Ri5 são independentemente H, -CN, -0H,halogênio, alquil, aril, alcóxi, -NRaRb, -C(0)nRd/ ouheterociclil;

cada Ra e Rb é independentemente H, alquil, -C(0)Rz, aril,heterociclil, ou alcóxi;

cada Rz é independentemente H, alquil, alcóxi, -NH2,NH(alquil), -N(alquil)2/ aril, ou heterociclil;cada Rd é independentemente H, alquil, alquenil, aril, ou -NRaRb ;

cada n é independentemente 0, 1, ou 2; ecada q é independentemente 0, 1, ou 2; ou

um tautômero do mesmo, um sal farmaceuticamente aceitáveldo tautômero.

Em uma modalidade mais particular do mesmo, RX1 é Rna:

R16f R17 e RX8 são caaa independentemente H, -CN, -0H,halogênio, alquil, aril, alcóxi, -NRaRb, -C(0)Rz, -S(0)nRd

<formula>formula see original document page 31</formula>

em que:ou heterociclil.

Em uma modalidade mais particular do mesmo, o referidocomposto é: .

um tautômero do mesmo, um sal farmaceuticamente aceitáveldo mesmo, ou um sal farmaceuticamente aceitável dotautômero.

Outra modalidade da invenção proporciona um método detratamento de um paciente sofrendo de câncer compreendendoadministração de aldesleucina e um composto da fórmula III:

<formula>formula see original document page 32</formula>

em que,

a linha pontilhada representa uma colocação opcionalde uma ligação adicional;

<formula>formula see original document page 32</formula>

R-21, R22, R23 e R24 são, cada um independentemente, H,-CN, -OH, halogênio, alquil, aril, alcóxi, -NRaRb, -C(0)R2,-S(0)nRd ou heterociclil;

R25 é H, alquila ou -C(0)R2;

R26 e R27 são, cada um independentemente, H, -OH,halogênio, alquil, -NRaRb, -C(0)R2, ou -S(0)nRd;R2s é H, -CH3 ou halogênio;

cada Ra e Rb é, independentemente, H, alquil, -C(0)Rz,aril, heterociclil ou alcóxi;

cada Rz é, independentemente, H, alquil, alcóxi, -NH2/-NH(alquil), -N(alquil)2, aril ou heterociclil;

cada Rd é, independentemente, H, alquil, alquenil,aril ou -NRaRb/;

cada n é, independentemente, 0, 1 ou 2; e

cada q é, independentemente, 0, 1 ou 2 ;

ou um tautômero do mesmo, um sal farmaceuticamenteaceitável do mesmo ou um sal farmaceuticamente aceitável dotautômero.

Em uma modalidade mais particular da mesma, o referidocomposto é:

<formula>formula see original document page 33</formula>

um tautômero do mesmo, um sal farmaceuticamente aceitáveldo mesmo ou um sal farmaceuticamente aceitável dotautômero.

Em uma modalidade mais particular da mesma, o referidocomposto é:

<formula>formula see original document page 33</formula>

um tautômero do mesmo, um sal farmaceuticamente aceitáveldo mesmo ou um sal farmaceuticamente aceitável dotautômero.

Outra modalidade da invenção proporciona um método dediminuição da toxicidade associada à administração dealdesleucina a um paciente com câncer compreendendoadministração de uma quinolinona, de preferência um agenteanti-angiogênico, de preferência selecionado de 6,7-bis(2-metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6-(3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-fluorofenil) -7-metóxiquinazolin-4-amina, N-(2-(dimetilamino)etil)-5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno)metil)-2,4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N-(4-clorofenil)-4-((piridin-4-il) metil)ftalazin-l-amina ou 1-(4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi)fenil)-3-(4-cloro-3-(trifluorometil)fenil)uréia, aopaciente.

Outra modalidade da invenção proporciona um método dediminuição da toxicidade associada à administração de umagente anti-angiogênico, de preferência selecionado de 6,7-bis(2-metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6-(3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-fluorofenil) -7-metóxiquinazolin-4-amina, N- (2- (dimetilamino)etil)-5-((5-f luoro-2-oxoindolin-3 -ilideno) metil) - 2, 4 -dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N-(4-clorofenil)-4-((piridin-4-il)metil)ftalazin-l-amina ou 1-(4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi)fenil)-3-(4-cloro-3-(trifluorometil)fenil)uréia, a umpaciente com câncer compreendendo administração dealdesleucina ao paciente.

Outra modalidade da invenção proporciona um método dediminuição de resistência à IL-2 em um paciente sofrendo decâncer compreendendo administração de um agente anti-angiogênico, de preferência selecionado de 6,7-bis(2-metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil) quinazolin-4-amina, 6-(3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metóxiquinazolin-4-amina, N- (2 - (dimetilamino)etil) - 5-((5-f luoro-2-oxoindolin-3 - ilideno) metil) - 2, 4 - dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N-(4-clorofenil)-4-((piridin-4-il)metil)ftalazin-l-amina ou 1-(4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi)fenil)-3-(4-cloro-3-(trifluorometil)fenil)uréia aoreferido paciente.

Outra modalidade da invenção proporciona um métodopara tratamento de um paciente sofrendo de câncer,compreendendo as etapas de, primeiro, administração, aoreferido paciente, de uma quantidade terapeuticamenteeficaz de aldesleucina, seguido por administração de umagente anti-angiogênico, de preferência selecionado de 6,7-bis(2-metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6-(3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metóxiquinazolin-4-amina, N-(2-(dimetilamino)etil)-5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno)metil)-2,4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N-(4-clorofenil)-4-((piridin-4-il)metil)ftalazin-l-amina ou 1-(4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi) fenil)-3-(4-cloro-3-(trifluorometil)fenil)uréia.

Outra modalidade da invenção proporciona um métodopara tratamento de um paciente sofrendo de câncer,compreendendo administração, separadamente ao referidopaciente, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de umagente anti-angiogênico, de preferência selecionado de 6,7-bis(2-metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6-(3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-fluorofenil) -7-metóxiquinazolin-4-amina, N-(2-(dimetilamino)etil)-5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno)metil)-2,4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N- (4-clorofenil)-4-((piridin-4-il)metil)ftalazin-l-amina ou 1-(4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi)fenil)-3-(4-cloro-3-(trifluorometil)fenil)uréia ealdesleucina de acordo com um esquema de dosagem, em que aaldesleucina é administrada de la 3 vezes ao dia em umadose entre cerca de 9 e cerca de 13 0 MIU/dia durante umperíodo de pelo menos 3 dias consecutivos, opcionalmenteseguido por um período de descanso de pelo menos 3 diasconsecutivos. Mais especificamente, a dose está entre cercade 30 e cerca de 100 MIU/dia. Mais especificamente, a doseestá entre cerca de 30 e cerca de 60 MIU/dia. Maisespecificamente, a dose está entre cerca de 30 e cerca de40 MIU/dia. Mais especificamente, a dose está entre cercade 17 e cerca de 30 MIU/dia. Mais especificamente, a doseestá entre cerca de 9 e cerca de 3 0 MIU/dia.

Em uma modalidade mais particular, o referido agenteanti-angiogênico, de preferência selecionado de 6,7-bis(2-metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6-(3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-fluorofenil) -7-metóxiquinazolin-4-amina, N- (2-(dimetilamino)etil)-5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno)metil)-2,4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N-(4-clorofenil)-4-((piridin-4-il)metil)ftalazin-l-amina ou 1-(4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi)fenil)-3-(4-cloro-3-(trifluorometil)fenil)uréia, éadministrado de 1 a 9 vezes a cada 2-3 semanas. Em umamodalidade mais particular, o referido agente anti-angiogênico, de preferência selecionado de 6,7- bis(2-metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6-(3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metõxiquinazolin-4-amina, N-(2-(dimetilamino)etil)-5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno)metil)-2,4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N-(4-clorofenil)-4-((piridin-4-il)metil)ftalazin-l-amina ou 1-(4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi)fenil)-3 -(4-cloro-3-(trifluorometil)fenil)uréia é uminibidor de VEGF.

Em outra modalidade, o agente anti-angiogênico, depreferência selecionado de 6,7- bis(2-metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6-(3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metóxiquinazolin-4-amina, N-(2-(dimetilamino)etil)-5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno)metil)-2,4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N-(4-clorofenil)-4-((piridin-4-il)metil)ftalazin-l-amina ou 1-(4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi)fenil)-3-(4-cloro-3-(trifluorometil)fenil)uréia, é também administrado combevacizumab ou cetuximab ou VEGF-Trap. Maisespecificamente, o referido bevacizumab é administrado emuma dose entre 1 e 12 mg/kg uma vez a cada 12-16 dias.

Em outra modalidade, o agente anti-angiogênico éadministrado dentro de 72 horas da administração de rIL-2;em que "dentro de" se destina a indicar antes ou após,conforme em: o agente anti-angiogênico é administrado 72horas antes de ou 72 horas após a administração de rIL-2.Em outra modalidade, o agente anti-angiogênico éadministrado dentro de 14 dias da administração de rIL-2.Em outra modalidade, o agente anti-angiogênico éadministrado dentro de 7 dias da administração de rIL-2. Emoutra modalidade, o agente anti-angiogênico é administradodentro de 6 dias da administração de rIL-2. Em outramodalidade, o agente anti-angiogênico é administrado dentrode 5 dias da administração de rIL-2. Em outra modalidade, oagente anti-angiogênico é administrado dentro de 4 dias daadministração de rIL-2. Em outra modalidade, o agente anti-angiogênico é administrado dentro de 48 horas daadministração de rIL-2. Em outra modalidade, o agente anti-angiogênico é administrado dentro de 36 horas daadministração de rIL-2. Em outra modalidade, o agente anti-angiogênico é administrado dentro de 24 horas daadministração de rIL-2. Em outra modalidade, o agente anti-angiogênico é administrado dentro de 12 horas daadministração de rIL-2. Em outra modalidade, o agente anti-angiogênico é administrado dentro de 6 horas daadministração de rIL-2. Em outra modalidade, o agente anti-angiogênico é administrado dentro de 1 hora daadministração de rIL-2. Em outra modalidade, o agente anti-angiogênico é administrado ao mesmo tempo que aadministração de rIL-2. Em outra modalidade, o agente anti-angiogênico é administrado em combinação com rIL-2. Em umamodalidade mais particular da mesma, o agente anti-angiogênico é selecionado de 6,7-bis(2-metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6-(3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metóxiquinazolin-4-amina, N-(2-(dimetilamino)etil)-5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno)metil) - 2 , 4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N-(4-clorofenil)-4-((piridin-4-il)metil)ftalazin-l-amina ou 1-(4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi)fenil)-3-(4-cloro-3-(trifluorometil)fenil)uréia.

Outra modalidade da invenção proporciona um método detratamento de um paciente sofrendo de câncer compreendendoco-administração de aldesleucina e um agente anti-angiogênico, de preferência selecionado de 6,7-bis(2-metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6-(3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metóxiquinazolin-4-amina, N-(2-(dimetilamino)etil) - 5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno)metil)-2,4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N- (4-clorofenil)-4-((piridin-4-il)metil)ftalazin-l-amina ou 1- (4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi) fenil)-3-(4-cloro-3-(trifluorometil)fenil)uréia.

Outra modalidade da invenção proporciona uma embalagemterapêutica adequada para venda comercial para tratamentode um paciente sofrendo de câncer compreendendo umrecipiente, uma quantidade terapeuticamente eficaz dealdesleucina e uma quantidade terapeuticamente eficaz de umagente anti-angiogênico, de preferência selecionado de 6,7-bis(2-metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6-(3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metóxiquinazolin-4-amina, N- (2-(dimetilamino)etil)-5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno)metil)-2,4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N-(4-clorofenil)-4-((piridin-4-il)metil)ftalazin-l-amina ou 1-(4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi)fenil)-3-(4-cloro-3- (trifluorometil)fenil)uréia. Umaembalagem terapêutica da mesma, em que o referido pacienteestá sofrendo de carcinoma de células renais. Uma embalagemterapêutica da mesma, ainda compreendendo instruções porescrito para orientar o paciente que recebe tratamento comaldesleucina antes de tratamento com o agente anti-angiogênico, de preferência selecionado de 6,7-bis(2-metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6-(3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metóxiquinazolin-4-amina, N- (2-(dimetilamino)etil)-5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno)metil)-2,4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N-(4-clorofenil)-4-((piridin-4-il)metil)ftalazin-l-amina ou 1-(4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi)fenil)-3-(4-cloro-3-(trifluorometil)fenil)uréia.

Outra modalidade proporciona uma composiçãofarmacêutica compreendendo a um agente anti-angiogênico, depreferência selecionado de 6,7-bis(2-metóxietóxi)-N-(3 -etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6-(3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metóxiquinazolin-4-amina, N-(2-(dimetilamino)etil)-5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno)metil)-2,4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N- (4-clorofenil)-4-((piridin-4-il)metil)ftalazin-l-amina ou 1-(4- (2- (metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi)fenil)-3-(4-cloro-3-(trifluorometil)fenil)uréia e aldesleucina.

Carcinoma de células renais de células claras (RCC)está associado à vascularizaçao aumentada, particularmenteexpressão de VEGF. VEGF é uma proteína que exerce um papelcrucial em angiogênese de tumor (a formação de novos vasossangüíneos ao tumor) e manutenção de vasos sangüíneos detumor estabelecidos. Ele se liga a receptores específicossobre vasos sangüíneos para estimular extensões aos vasossangüíneos existentes. Alguns, mas nem todos os RCCa, têmníveis aumentados de VEGF no soro.

Existe evidência de que o VEGF aumentado secorrelaciona com a resistência à IL-2 (Lissoni ecolaboradores, Anticancer Res. 2001; 21: 777-9). Os efeitosimuno-supres s ivos do VEGF sobre as células T e célulasdendríticas (Gabrilovich e colaboradores, J Leukoc Biol.2002; 72: 285-96) poderiam representar um mecanismo pararesistência induzida por VEGF ao tratamento com IL-2.

Além disso, o VEGF aumenta a permeabilidade e foiobservado que o tratamento com anti-VEGF leva à pressãosangüínea aumentada em alguns pacientes. Portanto, éprovável que algumas das principais toxicidades do anti-VEGF (por exemplo, hipertensão) e rIL-2 (por exemplo,hipotensão) seriam mutuamente contra-atuados e levaria a umíndice terapêutico global aperfeiçoado se as combinações dapresente invenção fossem administradas a pacientes sofrendode câncer, tal como RCCa.

Outras combinações da presente invenção, tal comoaldesleucina com bevacizumab ou cetuximab, proporcionam umamaior proporção e/ou melhor durabilidade de respostascomparados com os agentes administrados sozinhos.

Os regimes de dosagem de aldesleucina particularesdivulgados aqui proporcionam a estimulação intermitente deatividade de células natural killer (NK) e risco diminuídode efeitos colaterais relacionados à rIL-2 que podem estarassociados à exposição a longo prazo à dosagem com rIL-2.De nota, a hipotensão tipicamente associada à dosagem comrIL-2 é compensada pela administração das composições anti-angiogênicas da presente invenção, uma vez que elas estão,em geral, associadas à hipertensão. Ainda, a hipóxiatipicamente associada a inibidores de VEGF aumentaria asensibilidade à eficácia de tratamento com rIL-2, ao mesmotempo em que proporciona, simultaneamente, benefíciospaliativos também.

Outra modalidade da invenção proporciona o uso dealdesleucina na fabricação de um medicamento para otratamento de câncer, em que o referido medicamento é parauso separado, simultâneo ou seqüencial com um agente anti-angiogênico, de preferência selecionado de 6,7-bis(2-metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6-(3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metóxiquinazolin-4-amina, N-(2-(dimelhylamino)etil) -5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno)metil)-2,4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N- (4-clorofenil)-4-((piridin-4-il) metil)ftalazin-l-amina ou 1-(4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi)fenil)-3-(4-cloro-3-(trifluorometil)fenil)uréia. Emuma modalidade mais particular da mesma, o referido agenteanti-angiogênico, de preferência selecionado de 6,7-bis(2-metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6-(3-morfolinopropóxi)-N- (3-cloro-4-fluorofenil)-7-metóxiquinazolin-4-amina, N- (2-(dimetilamino)etil)-5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno)metil)-2,4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N- (4-clorofenil)-4-((piridin-4-il)metil)ftalazin-l-amina ou 1-(4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi)fenil)-3-(4-cloro-3-(trifluorometil)fenil)uréia é umsal de lactato. Em outra modalidade, o referido câncer écarcinoma de células renais.

Outra modalidade da invenção proporciona o uso de umagente anti-angiogênico, de preferência selecionado de 6,7-bis(2-metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6-(3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metóxiquinazolin-4-amina, N-(2-(dimetilamino)etil)-5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno)metil)-2,4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N-(4-clorofenil)-4-((piridin-4-il)metil)ftalazin-l-amina ou 1-(4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi)fenil)-3-(4-cloro-3- (trifluorometil)fenil)uréia nafabricação de um medicamento para tratamento de câncer, emque o referido medicamento é para uso separado, simultâneoou seqüencial com aldesleucina.

Moléculas preferidas associadas à angiogênesemoduladas (tal como inibição) pelas composições da presenteinvenção incluem: Fator de Crescimento Endotelial Vascular(VEGF), Fator de Crescimento de Fibroblasto (FGF),Interleucina-8 (IL-8), Angiogenina, Angiotropina, Fator deCrescimento Epidérmico (EGF), Fator de Crescimento deCélulas Endoteliais Derivado de Plaquetas, Fator deCrescimento de Transformação a (THF-a), Fator deCrescimento de Transformação b (TGF-b) ou Oxido Nítrico.Também, modulação (tal como potencialização) , pelascomposições da presente invenção, de Trombospondina,Angiostatina e Endostatina é considerada dentro da presenteinvenção.

Composições Gerais Para Co-administração com rIL-2:QUINAZOLINA

Compostos da Fórmula I têm a seguinte estrutura:

<formula>formula see original document page 43</formula>

em que,

R1 é alquila, -aril(Ri)p ou heterociclil;

R2 é H ou alquil; ou

Ri e R2 são ligados juntos para formar R1-2;

R3 é H, -CN, -0H, halogênio, alquil, aril, alcóxi, -NRaRb, -C(0)Rc, -S(0)nRa ou heterociclil;

R4 é H, -CN, -0H, halogênio, alquil, aril, -0-(CH2)q-Rg, -O-(CH2) q-O-Re, -NRaRb, -S(0)nRd ou -heterociclil-Rf;

R5 é H, -CN, -OH, halogênio, alquil, aril, -0-(CH2)q-Rg, -O-(CH2) q-O-Re, -NRaRb, -S(0)nRd ou heterociclil;

R6 é H, -CN, -OH, halogênio, alquil, aril, alcóxi, -NRaRb, -C(0)Rc, -S(0)nRd ou heterociclil;

R7 é H, -OH, halogênio, alquil, aril, alcóxi, -NRaRb, -S(0)nRd ou heterociclil;

cada Ra e Rb é, independentemente, H, alquil, -C(O)R0,aril, heterociclil ou alcóxi; ou

Ra e Rb são ligados juntos para formar Ri-2;

cada Rc é, independentemente, H, alquil, alcóxi,C(O)alquil, -C(O)aril, -CHO, aril ou heterociclil;

cada Rd é, independentemente, H, alquil, alquenil,aril ou -NRaRb;cada Re é, independentemente, H ou alquil;

Rf é H, halogênio, -0H, -CN, - (CH2) qNRaRh, alcóxi, -C(0)RC1 -(CH2)qCH3;

cada Rg é, independentemente, H, halogênio, -C(0)Rc,aril, heterociclil ou -NRaRb;

Rh é H OU - (CH2)qS(0)nRd;

cada Ri é, independentemente, H, halo, alquil,alquenil, alquinil ou -O (CH2) q-Rg;

cada n é, independentemente, 0, 1 ou 2;

cada p é, independentemente, 0, 1, 2 ou 3;

cada q é, independentemente, 0, 1 ou 2;

R1-2 tem a estrutura geral conforme mostrado:

cada R8 é, independentemente, H, -0H, halogênio,alquil, alcóxi, -NRaRb ou -S(0)nRa;

cada R9 é, independentemente, H, alquil, -C(0)Rc ouestá ausente se X é O, S ou está ausente;

cada X é, independentemente, O, S, N, CH ou estáausente, desse modo, formando uma ligação covalente; e

cada m é, independentemente, 0, 1 ou 2.

Em uma modalidade mais particular da invenção, R2 é H.Em uma modalidade ainda mais particular, Rx é -aril(Ri)p. Emuma outra modalidade em que Ri é -aril (Ri) P; a arila dentrode R1 é fenila, p dentro de Ri é 2 e ambos os R± dentro deRi são halo.

Em uma outra modalidade em que Ri é -aril (Ri) p, a ariladentro de Ri é fenila, p dentro de Ri é 1 e os grupos Ridentro de Ri são alquinila, de preferência etinila.

<formula>formula see original document page 44</formula>

em que,Em uma outra modalidade em que Ri é -aril(Ri)P, a ariladentro de Ri é fenila, p dentro de Ri é 2, um grupo R±dentro de Rx é halo e o outro grupo R± dentro de Ri é -0(CH2)q-Rg. Em uma modalidade mais particular da mesma, qdentro de Ri é 1 e Rg dentro de Ri é halofenil.

Em uma outra modalidade em que Ri é -aril(Ri)p, pdentro de R% é 1 e Ri dentro de Ri é alquinil.

Outra modalidade mais particular da invenção éproporcionada, em que Ri e R2 são ligados juntos paraformar R1-2:

<formula>formula see original document page 45</formula>

em que, R8éH, XéNeRgé -C(0)NHRb. Em uma modalidademais particular da mesma, Rb dentro de R9 é -fenil-O-CH2 (CH3)2.

Em uma modalidade mais particular da invenção, R3 e R6são H.

Em uma modalidade mais particular da invenção, R4 é -0-(CH2)q-Rg. Em uma modalidade mais particular da mesma, qdentro de R4 é 1 e Rg é H.

Em outra modalidade em que R4 é -O- (CH2) q-Rg, Rg dentrode R4 é heterociclil.

Em uma modalidade mais particular da invenção, R4 e R5são, cada um, -O- (CH2) q-0-Re. Em uma modalidade maisparticular da mesma, q dentro de R4 e R5 é 2 e Re dentro deR4 e R5 é metila.

Em uma modalidade mais particular da invenção, R4 é -heterociclil-Rf e R5 é H. Em uma modalidade mais particularda mesma, a referida heterociclil dentro de R4 é furanil.Em uma modalidade ainda mais particular, Rf dentro de R4 é- (CH2) gNHRh. Ainda, Rh é - (CH2) qS (O) 2CH3.

Em uma modalidade mais particular da invenção, R5 é -0-(CH2)q-Rg. Em outra modalidade da mesma, Rg dentro de R5 éheterociclil.

Outra modalidade é proporcionada, em que R7 é H.

Outra modalidade é proporcionada, em que R3, R6 e R7são todos H.INDOLINONA

Compostos da Fórmula II têm a seguinte estrutura:

<formula>formula see original document page 46</formula>

R11 é alquil, aril ou heterociclil;

R12 R13/ R14 e Ris são, cada um independentemente, H, -CN, -0H, halogênio, alquil, aril, alcóxi, -NRaRb/ -C(0)R2, -S(0)nRd ou heterociclil;

cada Ra e Rb é, independentemente, H, alquil, -C(0)Rz,aril, heterociclil ou alcóxi;

cada Rz é, independentemente, H, alquil, alcóxi, -NH2,-NH(alquil), -N(alquil)2, aril ou heterociclil;

cada Rd é, independentemente, H, alquil, alquenil,aril ou -NRaRb;

cada n é, independentemente, 0, 1 ou 2; e

cada q é, independentemente, 0, 1 ou 2.

Em uma modalidade mais particular, Rn éheterociclila.

Em uma modalidade ainda mais particular, R11 e R11a

<formula>formula see original document page 46</formula>

em que,em que,

R16f R17 e Ris são, cada um independentemente, H, -CN, -OH, halogênio, alquil, aril, alcóxi, -NRaRb, -C(0)R2,S(0)nRd ou heterociclil. Em ainda outra modalidade maisparticular em que Ri é Ria, R7 é -C (O) - (CH2) P-N (H) (2.r) (alquila) r, em que p é 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 e r é 0, 1 ou 2.Em ainda outra modalidade mais particular em que Rn é Rua/Ri3 é F. Em ainda outra modalidade mais particular em queRn ê Rua, R17 é -(CH2)tC00H, em que t é 1, 2, 3 ou 4. Emainda outra modalidade mais particular em que Rn é Rlla, Ree R8 são ambos metila. Em ainda outra modalidade maisparticular em que Rn é Rlla, R17 é H.

Em ainda outra modalidade mais particular da invenção,Rn é arila. Ainda mais em particular, Rn é fenilsubstituído ou não substituído. Em outra modalidade, Ri3 éiodeto.

ISOINDOLINONAS

Compostos da Fórmula III têm a seguinte estrutura:

<formula>formula see original document page 47</formula>

em que,

a linha pontilhada representa uma colocação opcionalde uma ligação adicional;R20 é H ou =0;

R21/ R22, R23 e R24 são, cada um independentemente, H, -CN, -OH, halogênio, alquil, aril, alcóxi, -NRaRb, -C(0)R2, -S(0)nRdou heterociclil;

R25 é H, alquil ou -C(0)R2;

R26 e R27 são, cada um independentemente, H, -OH,halogênio, alquila, -NRaRb, -C(0)R2, ou -S(0)nRci;R28 é H, -CH3 ou halogênio;

cada Ra e Rb é, independentemente, H, alquil, -C(0)R2,aril, heterociclil ou alcóxi;

cada Rz é, independentemente, H, alquil, alcóxi, -NH2,-NH(alquil), -N(alquil)2, aril ou heterociclil;

cada Rd é, independentemente, H, alquil, alquenil,aril ou -NRaRb;

cada n é, independentemente, 0, 1 ou 2; e

cada q é, independentemente, 0, 1 ou 2.

DEFINIÇÕES:

AUC Área sob a curva

CR Resposta completa

DLT Toxicidade Dose-Limitativa

IL Interleucina

IL-2 Interleucina-2

IU Unidades internacionais

IV Intravenoso (como um modo de administração)

LAK Assassino linfocina-ativado

MTD Dosagem máxima tolerada

MIU Unidades internacionais por milhão

NK Natural Killer

PK Farmacocinética

PR Resposta parcial

RCC Carcinoma de células renais

RCCa Carcinoma renal de células claras

rIL-2 Interleucina-2 recombinante

RTK Quinase de tirosina de receptor

TNF Fator de necrose tumoral

VEGF Fator de crescimento endotelial vascularEm geral, referência a um determinado elemento, talcomo hidrogênio ou H, deve ser entendida como incluindotodos os isótopos desse elemento. Por exemplo, se um grupoR é definido como incluindo hidrogênio ou H, ele tambéminclui deutério e tritio.

Por "agente anti-angiogênico" entenda-se qualquerpequena molécula, mais especificamente qualquer compostotendo um peso molecular de menos de 1.100 g/moles, quemostre ou será mostrado suprimir angiogenese em um sistema.Moléculas preferidas associadas à angiogenese moduladas(tal como inibição) pelas composições da presente invençãoincluem: Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF),Fator de Crescimento de Fibroblasto (FGF), Interleucina-8(IL-8), Angiogenina, Angiotropina, Fator de CrescimentoEpidérmico (EGF), Fator de Crescimento de CélulasEndoteliais Derivado de Plaquetas, Fator de Crescimento deTransformação a (THF-a), Fator de Crescimento deTransformação b (TGF-b) ou Oxido Nítrico. Também, modulação(tal como potencialização), pelas composições da presenteinvenção, de Trombospondina, Angiostatina e Endostatina, éconsiderada dentro da presente invenção. Composições anti-angiogênicas preferidas da presente invenção incluem: 6,7-bis(2-metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6-(3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metóxiquinazolin-4-amina, N-(2-(dimetilamino)etil) - 5-( (5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno)metil)-2,4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N- (4-clorofenil)-4-((piridin-4-il)metil)ftalazin-l-amina e 1-(4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi)fenil)-3-(4-cloro-3-(trifluorometil)fenil)uréia.

O termo "quantidade eficaz" é uma quantidadenecessária ou suficiente para realizar um efeito biológicodesejado. Por exemplo, uma quantidade eficaz de um compostopara tratar carcinoma de células renais pode ser umaquantidade necessária para causar regressão de crescimentodo tumor em células renais. A quantidade eficaz pode variardependendo, por exemplo, da condição tratada, peso doindivíduo e gravidade da doença. Aqueles habilitados natécnica podem determinar prontamente a quantidade eficazempiricamente sem experimentação indevida.

Conforme usado aqui, uma "quantidade eficaz paratratamento" se refere a uma quantidade suficiente paraacalmar, aliviar, estabilizar, reverter, diminuir ouretardar a progressão de uma condição, tal como um estadodoentio.

Um "indivíduo" ou "paciente" se destina a descrever umser humano ou animal vertebrado, incluindo um cão, gato,animal de bolso, mico, cavalo, vaca, porco, ovelha, cabra,elefante, girafa, galinha, leão, macaco, coruja, rato,esquilo, lóris e camundongo.

Um "animal de bolso" se refere a um grupo de animaisvertebrados capazes de se adaptar a uma bolsa confortáveltais como, por exemplo, hâmsters, chinchilas, furões,ratos, porcos-da-índia, gerbil, coelhos e petauros doaçúcar.

Conforme usado aqui, o termo "éster farmaceuticamenteaceitável" se refere a ésteres os quais hidrolisam in vivoe incluem aqueles que se decompõem prontamente no corpohumano para deixar o composto precursor ou um sal do mesmo.Grupos éster adequados incluem, por exemplo, aquelesderivados de ácidos carboxílicos alifáticosfarmaceuticamente aceitáveis, particularmente ácidosalcanóico, alquenóico, cicloalcanóico e alcanodióico, nosquais cada porção alquila ou alquenila tem, vantajosamente,não mais do que 6 átomos de carbono. Exemplosrepresentativos de ésteres incluem, mas não estão limitadosa, formatos, acetatos, propionatos, butiratos, acrilatos eetil-succinatos.

Os compostos da presente invenção podem ser usados naforma de sais, conforme em "sais farmaceuticamenteaceitáveis" derivados de ácidos inorgânicos ou orgânicos.Esses sais incluem, mas não estão limitados a, osseguintes: acetato, adipato, alginato, citrato, aspartato,benzoato, benzeno-sulfonato, bissulfato, butirato,canforato, cânfor-sulfonato, digluconato,

ciclopentanopropionato, dodecil-sulfato, etano-sulfonato,glucoheptanoato, glicerofosfato, hemi-sulfato, lactato,maleato, metano-sulfonato, nicotinato, 2-naftaleno-sulfonato, oxalato, pamoato, pectinato, sulfato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato,tartrato, tiocianato, p-tolueno-sulfonato e undecanoato.Também, os grupos contendo nitrogênio básico podem serquaternizados com agentes tais como haletos de alquilainferior, tais como cloreto, brometo e iodeto de metila,etila, propila e butila; dialquil sulfatos, tais comodimetil, dietil, dibutil e diamil sulfatos, haletos decadeia longa, tais como cloreto, brometo e iodeto dedecila, laurila, miristila e estearila, haletos dearalquila, tais como brometos de benzila e fenetila eoutros. Produtos dispersíveis ou solúveis em óleo ou águasão, desse modo, obtidos.O termo "pró-fármacos farmaceuticamente aceitáveis",conforme usado aqui, se refere àqueles pró-fármacos doscompostos da presente invenção os quais são, dentro doescopo do julgamento médico, adequados para uso em contatocom os tecidos de seres humanos e animais inferiores semtoxicidade, irritação, resposta alergia indevidas esemelhantes, comensuráveis com uma proporção

benefício/risco razoável e eficaz para seu uso pretendido,bem como formas zwiteriônicas, onde possível, dos compostosda invenção. O termo "pró-fármaco" se refere a compostosque são rapidamente transformados in vivo para proporcionaro composto precursor da fórmula acima, por exemplo, atravésde hidrólise em um sangue. Uma discussão completa éproporcionada em T. Higuchi e V. Stella, Pro-drugs as NovelDelivery Systems, Vol. 14 da série A. CS. Symposium e emEdward B. Roche, ed., Bioreversible Carriers in DrugDesign, American Pharmaceutical Association and PergamonPress, 1987. Pró-fármacos, conforme descrito na PatenteU.S. No. 6.284.772, por exemplo, podem ser usados.

Referência a "halo", "haleto" ou "halogênio" se referea átomos de F, Cl, Br ou I.

A palavra "alquil" se refere a grupos alquilasubstituídos e não substituídos, tais como metila, etila,propila, butila, pentila, hexila, heptila, octila, nonila,decila, undecila, dodecila e semelhantes. A palavra tambéminclui isômeros com cadeia ramificada de grupos alquila comcadeia reta incluindo, mas não limitado a, os seguintes, osquais são proporcionados à guisa de exemplo: -CH(CH3)2, -CH(CH3) (CH2CH3) , -CH(CH2CH3)2, -C(CH3)3, -C (CH2CH3) 3).CH2CH (CH3) 2 , - CH2CH (CH3) (CH2CH3) , - CH2CH (CH2CH3) 2 , - CH2C (CH3) 3 ,- CH2C (CH2CH3) 3 , - CH (CH3) CH (CH3) (CH2CH3) , - CH2CH2CH (CH3) 2,CH2CH2CH (CH3) (CH2CH3) , -CH2CH2CH (CH2CH3) S, -CH2CH2C (CH3) 3 ,CH2CH2C(CH2CH3)3, -CH(CH3)CH2CH(CH3)2, -CH (CH3) CH (CH3) CH (CH3) 2,- CH(CH2CH3)CH(CH3)CH(CH3) (CH2CH3) e outros. A frase tambéminclui grupos alquila cíclicos, tais como ciclopropila,ciclobutila, ciclopentila, ciclohexila, cicloheptila eciclooctila e anéis substituídos por grupos alquila comcadeia reta e ramificada, conforme definido acima. Apalavra também inclui grupos alquila policíclicos taiscomo, mas não limitado a, adamantila norbornila ebiciclo[2.2.2]octila e tais anéis substituídos por gruposalquila com cadeia reta e ramificada, conforme definidoacima. A palavra alquila também inclui grupos nos quais umaou mais ligações a carbono (s) ou hidrogênio (s) sãosubstituídas por uma ligação a átomos de não-hidrogênio enão-carbono tais como, mas não limitado a, um átomo dehalogênio em haletos tais como F, Cl, Br e I; e um átomo deoxigênio em grupos tais como grupos hidroxila, gruposalcóxi, grupos arilóxi e grupos éster; um átomo de enxofreem grupos tais como grupos tiol, grupos alquil e arilsulfeto, grupos sulfona, grupos sulfonila e grupossulfoxido; um átomo de nitrogênio em grupos tais comoaminas, amidas, alquilaminas, dialquilaminas, arilaminas,alquilarilaminas, diarilaminas, N-óxidos, imidas eenaminas; um átomo de silício em grupos tais comotrialquil-silila, grupos dialquilaril-silila, gruposalquildiaril-silila e grupos triaril-silila; e outrosheteroátomos em vários outros grupos. Grupos alquila sãoaqueles limitados a ter 1 a 20 átomos de carbono e tantoquanto 5 heteroátomos adicionais, conforme descrito acima.Grupos alquila mais preferidos têm de 1 a 5 átomos de carbono e tanto quanto 2 heteroátomos.

A palavra "aril" se refere a grupos arila substituídos e não substituídos que não contêm heteroátomos. Assim, a palavra inclui, mas não está limitada a, grupos tais como fenila, bifenila, antracenila, naftenila, à guisa de exemplo. Grupos arila também incluem aqueles nos quais um dos carbonos aromáticos é ligado a um átomo de não-carbono ou não-hidrogênio descrito acima (na definição de alquila) e também inclui grupos arila nos quais um ou mais carbonos aromáticos do grupo arila são ligados a um grupo alquila, alquenila ou alquinila substituídos e/ou não substituídos, conforme definido aqui. Isso inclui disposições de ligação nas quais dois átomos de carbono de um grupo arila são ligados a dois átomos de um grupo alquila, alquenila ou alquinila para definir um sistema de anel fundido (por exemplo, dihidronaftila ou tetrahidronaftila). Assim, a palavra "aril" inclui, mas não está limitada a, tolila e hidróxifenila, dentre outros.

A palavra "alquenil" se refere a grupos cíclicos e com cadeia reta e ramificada, tais como aqueles descritos com relação a grupos alquila, conforme definido acima, exceto que pelo menos uma ligação dupla existe entre dois átomos de carbono. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, vinila, -CH=C(H) (CH3) , -CH=C(CH3)2, -C(CH3) =C(H) 2, C(CH2) =C(H) (CH3) , -C (CH2CH2) =CH2, ciclohexenila,

ciclopentenila, ciclohexadienila, butadienila, pentadienila e hexadienila, dentre outros. Incluídos também são grupos nos quais um átomo de não-carbono ou não-hidrogênio é ligado a um carbono duplamente ligado a outro carbono eaqueles nos quais um dos átomos de não-carbono ou não-hidrogênio é ligado a um carbono não envolvido em uma ligação dupla a outro carbono. Grupos alquenila são aqueles limitados a ter 2 a 15 átomos de carbono e tanto quanto 4 heteroátomos adicionais, conforme descrito acima. Grupos alquenila mais preferidos têm de 2 a 5 átomos de carbono e tanto quanto 2 heteroátomos.

A palavra "alcóxi" se refere a grupos alcóxi substituídos ou não substituídos da fórmula -O-alquila, em que o ponto de fixação é o grupo óxi e o grupo alquila é conforme definido acima. Grupos alcóxi são aqueles limitados a ter 1 a 20 átomos de carbono e tanto quanto 5 heteroátomos adicionais, incluindo o átomo de oxigênio. Grupos alcóxi mais preferidos têm de 1 a 5 átomos de carbono e tanto quanto 2 heteroátomos, incluindo o átomo de oxigênio.

A palavra "alquinil" se refere a grupos com cadeia reta e ramificada, tais como aqueles descritos com relação a grupos alquila conforme definido acima, exceto que pelo menos uma ligação tripla existe entre dois átomos de carbono. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, C=C(H), -C3C(CH3), -C=C(CH2CH3) , -C (H2) C=C (H) , -C (H) 2C=C (CH3) e - C (H) 2C=C (CH2CH3) , dentre outros. Incluídos também são grupos alquinila nos quais um átomo de não-carbono ou não-hidrogênio está incluído a um carbono triplo ligado a outro carbono e aqueles nos quais um átomo de não-carbono ou não-hidrogênio é ligado a um carbono não envolvido em uma ligação tripla a outro carbono. Grupos alquinila são aqueles limitados a ter 2 a 15 átomos de carbono e tanto quanto 4 heteroátomos adicionais, conforme descrito acima.Grupos alquinila mais preferidos têm de 2 a 5 átomos de carbono e tanto quanto 2 heteroátomos.

A palavra "heterociclil" se refere a compostos com anel aromático e não aromático, incluindo compostos com anel monocíclico, bicíclico e policieiico tais como, mas não limitado a, quinuclidila contendo 3 ou mais elementos no ane 1, do s qua i s um é um he t e roát orno tal c orno, ma s não limitado a, N, O e S. Exemplos de grupos heterociclila incluem, mas não estão limitados a: anéis insaturados com 3 a 8 elementos contendo 1 a 4 átomos de nitrogênio tais como, mas não limitado a, pirrolila, pirrolinila, imidazolila, pirazolila, piridila, dihidropiridila, pirimidila, pirazinila, piridazinila, triazolila (por exemplo, 4H-1,2,4-triazolila, 1H-1,2,3-triazolila, 2H-1,2,3-triazolila etc.), tetrazolila, (por exemplo, 1H-tetrazolila, 2H-tetrazolila, etc.); anéis saturados com 3 a 8 elementos contendo 1 a 4 átomos de nitrogênio tais como, mas não limitado a, pirrolidinila, imidazolidinila, piperidinila, piperazinila; grupos heterociclicos condensados insaturados contendo 1 a 4 átomos de nitrogênio tais como, mas não limitado a, indolila, isoindolila, indolinila, indolizinila, benzimidazolila, quinolila, isoquinolila, indazolila, benzotriazolila; anéis insaturados com 3 a 8 elementos contendo 1 a 2 átomos de oxigênio tais como, mas não limitado a, furanila; anéis insaturados com 3 a 8 elementos contendo 1 a 2 átomos de oxigênio e 1 a 3 átomos de nitrogênio tais como, mas não limitado a, oxazolila, isoxazolila, oxadiazolila (por exemplo, 1,2,4-oxadiazolila, 1,3,4-oxadiazolila, 1,2,5-oxadiazolila, etc); anéis saturados com 3 a 8 elementoscontendo 1 a 2 átomos de oxigênio e 1 a 3 átomos de nitrogênio tais como, mas não limitado a, morfolinila; grupos heterociclicos condensados insaturados contendo 1 a 2 átomos de oxigênio e 1 a 3 átomos de nitrogênio, por exemplo, benzoxazolila, benzoxadiazolila, benzoxazinila (por exemplo, 2H-1,4-benzoxazinila, etc.); anéis insaturados com 3 a 8 elementos contendo 1 a 3 átomos de enxofre e 1 a 3 átomos de nitrogênio tais como, mas não limitado a, tiazolila, isotiazolila, tiadiazolila (por exemplo, 1,2,3-tiadiazolila, 1,2,4-tiadiazolila, 1,3,4-tiadiazolila, 1,2,5-tiadiazolila, etc.); anéis saturados com 3 a 8 elementos contendo 1 a 2 átomos de enxofre ela 3 átomos de nitrogênio tais como, mas não limitado a, tiazolodinila; anéis saturados e insaturados com 3 a 8 elementos contendo 1 a 2 átomos de enxofre tal como, mas não limitado a, tienila), dihidroditiinila, dihidroditionila, tetrahidrotiofeno, tetrahidrotiopirano; anéis heterociclicos insaturados condensados contendo 1 a 2 átomos de enxofre e 1 a 3 átomos de nitrogênio tais como, mas não limitado a, benzotiazolila, benzotiadiazolila, benzotiazinila (por exemplo, 2H-1,4-benzotiazinila, etc.), dihidrobenzotiazinila (por exemplo, 2H-3,4 -dihidrobenzotiazinila, etc.), anéis heterociclicos condensados insaturados contendo 1 a 2 átomos de oxigênio, tal como benzodioxolila (por exemplo, 1,3-benzodioxoíla, etc); anéis insaturados com 3 a 8 elementos contendo um átomo de oxigênio e 1 a 2 átomos de enxofre tal como, mas não limitado a, dihidrooxatiinila; anéis saturados com 3 a 8 elementos contendo 1 a 2 átomos de oxigênio e 1 a 2 átomos de enxofre, tal como 1,4-oxatiano; anéis insaturadoscondensados contendo 1 a 2 átomos de enxofre, tais como benzotienila, benzoditiinila; e anéis insaturados condensados heterociclicos contendo um átomo de oxigênio 1 a 2 átomos de oxigênio, tal como benzoxatiinila. O grupo heterociclila também inclui aqueles descritos acima, nos quais um ou mais átomos de S no anel são duplamente ligados a um ou dois átomos de oxigênio (sulfóxidos e sulfonas). Por exemplo, grupos heterociclila incluem

tetrahidrotiofeno, oxido de tetrahidrotiofeno e 1,1-dióxido de tetrahidrotiofeno. Grupos heterociclila preferidos contêm 5 ou 6 elementos no anel. Grupos heterociclila mais preferidos incluem morfolina, piperazina, piperidina, pirrolidina, imidazola, pirazola, 1,2,3-triazola, 1,2,4-triazola, tetrazola, tiomorfolina, tiomorfolina na qual o átomo de S da tiomorfolina é ligado a um ou mais átomos de O, pirrola, homopiperazina, oxazolidin-2-ona, pirrolidin-2-ona, oxazola, quinuclidina, tiazola, isoxazola, furano e tetrahidrofurano. "Heterociclila" também se refere àqueles grupos conforme definido acima nos quais um dos elementos no anel é ligado a um átomo de não-hidrogênio, tal como descrito acima com relação a grupos alquila substituídos e grupos arila substituídos. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, 2-metilbenzimidazolila, 5-metilbenzimidazolila, 5-clorobenztiazolila, 1-metil piperazinila e 2-cloropiridila, dentre outros. Grupos heterociclila são aqueles limitados a ter 2 a 15 átomos de carbono e tanto quanto 6 heteroátomos adicionais, conforme descrito acima. Grupos heterociclila mais preferidos têm de 3 a 5 átomos de carbono e tanto quanto 2 heteroátomos.

O termo "substituído", quando aplicado a um grupoindefinido, ainda bem conhecido na técnica, tal como fenila, terá o mesmo significado com relação aos anexos opcionais, conforme descrito na definição de alquila.

Dentro da presente invenção, deve ser compreendido que compostos descritos aqui podem exibir o fenômeno de tautomerismo e que as fórmulas desenhadas dentro da presente especificação podem representar apenas uma das possíveis formas tautoméricas. Deve ser compreendido que a invenção abrange qualquer forma tautomérica a qual possui atividade anti-angiogênica e não se destina a estar limitada meramente a qualquer uma das formas tautoméricas utilizadas dentro dos desenhos das fórmulas.

Também deve ser compreendido que determinados compostos e modalidades da invenção podem existir nas formas solvatadas, bem como não solvatadas tais como, por exemplo, formas hidratadas. Deve ser compreendido que a invenção abrange todas de tais formas solvatadas as quais possuem atividade anti-angiogênica.

A invenção também inclui compostos isotopicamente-rotulados que são estruturalmente idênticos àqueles divulgados acima, exceto quanto fato um ou mais átomos serem substituídos por um átomo tendo uma massa atômica ou número de massa diferente da massa atômica ou número de massa usualmente encontrado na natureza. Exemplos de isótopos que podem ser incorporados em compostos da invenção incluem isótopos de hidrogênio, carbono, nitrogênio, oxigênio, fósforo, enxofre, flúor e cloro, tais como 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18O, 17O, 31P, 32P, 35S, 18F e 36Cl, respectivamente. Compostos da presente invenção, pró-fármacos dos mesmos e sais farmaceuticamente aceitáveis dosreferidos compostos e dos referidos pró-fármacos que contêm os isótopos antes mencionados e/ou outros isótopos de outros átomos estão dentro do escopo da presente invenção. Determinados compostos isotopicamente rotulados da presente invenção, por exemplo, aqueles nos quais isótopos radioativos, tais como He C, são incorporados, são úteis em ensaios de distribuição em tecido de fármaco e/ou substrato. Isótopos tritiados, isto é, 3H e carbono-14, isto é, 14C, são particularmente preferidos por sua facilidade de preparo e detectabilidade. Ainda, substituição por isótopos mais pesados, tal como deutério, isto é, 2H, pode proporcionar determinadas vantagens terapêuticas resultantes de maior estabilidade metabólica, por exemplo, meia-vida aumentada in vivo ou requisitos de dosagem reduzidos e, conseqüentemente, pode ser preferido em algumas circunstâncias. Compostos isotopicamente rotulados da presente invenção e pró-fármacos dos mesmos podem, em geral, ser preparados realizando procedimentos conhecidos ou mencionados e através de substituição de um reagente isotopicamente rotulado prontamente disponíveis por um reagente não-isotopicamente rotulado.

Referência a "IL-2" ou "interleucina-2" indica um linfócito que é produzido por linfócitos de sangue periférico normais e está presente no corpo em baixas concentrações. IL-2 foi primeiro descrita por Morgan e colaboradores (1976) Science 193: 1007-1008 e originalmente denominada fator de crescimento de células T em virtude de sua capacidade de induzir à proliferação de linfócitos T estimulados. Ela é uma proteína com um peso molecular reportado na faixa de 13.000 a 17.000 (Gillis e Watson(1980) J\ Exp. Med. 159: 1709) e tem um ponto isoelétrico na faixa de 6-8,5. Para fins da presente invenção, o termo "IL-2" se destina a abranger qualquer fonte de IL-2, incluindo fontes de mamífero tais como, por exemplo, camundongo, rato, coelho, primata, porco, animais de bolso e seres humanos e podem ser nativos ou obtidos através de técnica recombinantes, tais como polipeptídeos recombinantes de IL-2 produzidos por vários hospedeiros microbianos. A IL-2 pode ser a seqüência de polipeptídeo nativa ou pode ser uma variante do polipeptídeo de IL-2 nativo, conforme descrito aqui abaixo, na medida em que o polipeptídeo variante de IL-2 retenha a atividade biológica de IL-2 de interesse, conforme definido aqui. De preferência, o polipeptídeo de IL-2 ou variante do mesmo é derivado de uma fonte humana e inclui IL-2 humana que é recombinantemente produzida, tais como polipeptídeos de IL-2 humanos recombinantes produzidos por hospedeiros microbianos e variantes dos mesmos que retêm a atividade biológica de IL-2 de interesse. Qualquer composição farmacêutica compreendendo IL-2 como um componente terapeuticamente ativo pode ser usada para praticar a presente invenção.

Agentes anti-câncer:

Composições da presente invenção podem ser administradas em conjunto com outros agentes anti-câncer. Em particular, composições serão formuladas juntas como um produto terapêutico combinado ou administradas separadamente. Agentes anti-câncer para uso com a invenção incluem, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes apresentados abaixo.A. Inibidores de Quínase

Inibidores de quínase para uso como agentes anti-câncer em conjunto com as composições da presente invenção incluem inibidores de quínases do Receptor de Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR), tais como quinazolinas de pequena molécula, por exemplo, gefitinib (US 5457105, US 5616582 e US 5770599), ZD-6474 (WO 01/32651), erlotinib (Tarceva®, US 5.747.498 e WO 96/30347) e lapatinib (US 6.727.256 e WO 02/02552); inibidores de quínase do Receptor de Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGFR) , incluindo SU-11248 (WO 01/60814), SU 5416 (US 5.883.113 e WO 99/61422), SU 6668 (US 5.883.113 e WO 99/61422), CHIR-258 (US 6.605.617 e US 6.774.237), vatalanib ou PTK-787 (US 6.258.812), VEGF-Trap (WO 02/57423), B43-Genisteína (WO-09606116), fenretinida (p-hidróxifenilamina de ácido retinóico) (US 4.323.581), IM-862 (WO 02/62826), bevacizumab ou Avastin® (WO 94/10202), KRN-951, 3-[5-(metil-sulfonilpiperadina metil) -indolil] -quinolona, AG-13736 e AG-13925, pirrolo[2,1-f] [1,2,4]triazinas, ZK-304709, Veglin®, VMDA-3601, EG-004, CEP-701 (US 5.621.100), Cand5 (WO 04/09769); inibidores de quínase de tirosina Erb2, tais como pertuzumab (WO 01/00245), trastuzumab e rituximab; inibidores de quínase de proteína AKT, tais como RX-0201; inibidores de quínase de Proteína C (PKC), tais como LY-317615 (WO 95/17182) e perifosina (US 2003171303); inibidores de 3-Quínase de Fosfoinositídeo (PI3K), incluindo SF-1126 e PI-103, PI-509, PI-516 e PI-540 (produzidos pela PIramed); inibidores de quínase de Raf/Map/MEK/Ras, incluindo sorafenib (BAY 43-9006), ARQ-350RP, LErafAON, BMS-3 54 825 AMG-54 8 e outros divulgados noWO 03/82272; inibidores de quínase do Receptor de Fator de Crescimento de Fibroblasto (FGFR); inibidores de quínase Célula-Dependentes (CDK), incluindo CIC-202 ou roscovitina (WO 97/20842 e WO 99/02162) ; inibidores de quínase de Receptor de Fator de Crescimento Plaqueta-Derivado (PGFR), tais como CHIR-258, 3G3 mAb, AG-13736, SU-11248 e SU6668; e inibidores de quínase Bcr-Abl e proteínas de fusão, tais como STI- 571 ou Gleevec®.

B. Anti-Estrogênios

Agentes de objetivação de estrogênio para uso em terapia anti-câncer em conjunto com as composições da presente invenção incluem Moduladores Seletivos do Receptor de Estrogênio (SERMs), incluindo tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno; inibidores de aromatase, incluindo Arimidex® ou anastrozola; Sub-reguladores do Receptor de Estrogênio (ERDs), incluindo Faslodex® ou fulvestrant.

C. Anti-Androgênios

Agentes de objetivação de androgênio para uso em terapia anti-câncer em conjunto com as composições da presente invenção incluem flutamida, bicalutamida, finasterida, aminoglutetamida, cetoconazola e corticosteróides.

D. Outros Inibidores

Outros inibidores para uso como agentes anti-câncer em conjunto com as composições da presente invenção incluem inibidores de farnesil transferase de proteína, incluindo tipifarnib ou R-115777 (US 2003134846 e WO 97/21701), BMS-214662, AZD-3409 e FTI-277; inibidores de topoisomerase, incluindo merbarona e diflomotecan (BN-80915); inibidores de proteína do fuso de cinesina mitótica (KSP), incluindoSB-743921 e MKI-833; moduladores de protease, tais como bortezomib ou Velcade® (US 5.780.454), XL-784; e inibidores de ciclooxigenase 2 (COX-2), incluindo fármacos anti-inflamatórios não esteroidais I (NSAIDs).

E. Fármacos Quimioterapêuticos para Câncer

Agentes quimioterapêuticos para câncer em particular para uso como agentes anti-câncer em conjunto com as composições da presente invenção incluem anastrozola (Arimidex®), bicalutamida (Casodex®), sulfato de bleomicina (Blenoxane®), busulfan (Myleran®), injeção de busulfan (Busulfex®), capecitabina (Xeloda®), N4-pentóxicarbonil-S-deóxi-S-fluorocitidina, carboplatina (Paraplatin®), carmustina (BiCNU®), clorambucil (Leukeran®) , cisplatina (Platinol®), cladribina (Leustatin®), ciclopfosfamida (Cytoxan® ou Neosar®), citarabina, arabinosídeo de citosina (Cytosar-U®), injeção de lipossoma de citarabina (DepoCyt®), dacarbazina (DTIC-Dome®), dactinomicina (Actinomicina D, Cosmegan), hidrocloreto de daunorubicina (Cerubidine®), injeção de lipossoma de citrato de daunorubicina (DaunoXome®), dexametasona, docetaxel (Taxotere®, US 2004073044), hidrocloreto de doxorubicina (Adriamycin®, Rubex®), etoposideo (Vepesid®), fosfato de fludarabina (Fludara®), 5-fluorouracila (Adrucil®, Efudex®), flutamida (Eulexin®), tezacitibina, Gemcitabina (difluorodeóxicitidina), hidróxiuréia (Hidrea®) , Idarubicina (Idamycin®), ifosfamida (IFEX®), irinotecan (Camptosar®), L-asparaginase (ELSPAR®), leucovorina cálcio, melphalan (Alqueran®), 6-mercaptopurina (Purinethol®), metotrexato (Folex®), mitoxantrona (Novantrone®) , mylotarg, paclitaxel (Taxol®), phoenix (ítrio 90/MX-DTPA),pentoestatina, polifeprosan 20 com implante de carmustina (Gliadel®), citrato de tamoxifen (Nolvadex®), teniposídeo (Vumon®), 6-tioguanina, tiotepa, tirapazamina (Tirazone®) , hidrocloreto de topotecan para injeção (Hycamptin®) , vinblastina (Velban®), vincristina (Oncovin®) e vinorelbina (Navelbine®).

F. Agentes de Alquilação

Agentes de alquilação para uso em conjunto com as composições da presente invenção para produtos terapêuticos anti-câncer incluem VNP-40101M ou cloretizina, oxaliplatina (US 4.169.846, WO 03/24978 e WO 03/04505), glufosfamida, mafosfamida, etopophos (US 5.041.424), prednimustina; treosulfan; busulfan; irofluven (acilfulveno) ; penclomedina; pirazoloacridina (PD-115934) ; 06- benzilguanina; decitabina (5-aza-2-deóxicitidina) ; brostalicina; mitomicina C (MitoExtra); TLK-286 (Telcyta®); temozolomida; trabectedina (US 5.478.932); AP-5280 (fórmula em Platinato de Cisplatina); porfiromicina; e clearazida (mecloretamina).

G. Agentes Quelantes

Agentes quelantes para uso em conjunto com as composições da presente invenção para produtos terapêuticos anti-câncer incluem tetratiomolibdato (WO 01/60814); RP-697; Chimeric T84.66 (cT84.66); gadofosveset (Vasovist®); deferoxamina; e bleomicina opcionalmente em combinação com eletroporação (EPT).

H. Modificadores de Resposta Biológica

Modificadores de resposta biológica, tais como moduladores imunes, para uso em conjunto com as composições da presente invenção para produtos terapêuticos anti-câncerincluem estaurosporina e análogos macrocíclicos da mesma, incluindo UCN-01, CEP-701 e midostaurina (veja WO 02/3 0941, WO 97/07081, WO 89/07105, US 5.621.100, WO 93/07153, WO 01/04125, WO 02/30941, WO 93/08809, WO 94/06799, WO 00/27422, WO 96/13506 e WO 88/07045); esqualamina (WO 01/79255); DA-9601 (WO 98/04541 e US 6,025,387); alemtuzumab; interferons (por exemplo, IFN-a, IFN-b, etc); interleucinas, especificamente IL-2 ou aldesleucina, bem como IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 e variantes biológicas dos mesmos tendo seqüências de aminoácido maiores do que 70% da seqüência humana nativa; altretamina (Hexalen®); SU 101 ou leflunomida (WO 04/06834 e US 6.331.555);

imidazoquinolinas, tais como resiquimod e imiquimod (US 4.689.338, 5.389.640, 5.268.376, 4.929.624, 5.266.575, 5.352.784, 5.494.916, 5.482.936, 5.346.905, 5.395.937, 5.238.944 e 5.525.612); e SMIPs, incluindo benzazolas, antraquinonas, tiosemicarbazonas e triptantrinas (WO 04/87153, WO 04/64759 e WO 04/60308). I. Vacinas contra Câncer

Vacinas anti-câncer para uso em conjunto com as composições da presente invenção incluem Avicine® (Tetrahedron Letters 26, 1974 2269-70); oregovomab (OvaRex®); Theratope® (STn-KLH); Vacinas contra Melanoma; a série GI-4000 (GI-4014, GI-4015 e GI-4016), a qual é dirigida a cinco mutações na proteína Ras; GlioVax-1; MelaVax; Advexin® ou INGN-201 (WO 95/12660) ; Sig/E7/LAMP-1, que codifica HPV-16 E7; Vacina MAGE-3 ou M3TK (WO 94/05304) ; HER-2VAX; ACTIVE, o qual estimula células T específicas para tumores; vacina contra câncer de GM-CSF; evacinas baseadas em monocitogenes de Listeria. J. Terapia Anti-senso

Agentes anti-câncer para uso em conjunto com as composições da presente invenção também incluem composições anti-senso, tais como AEG-35156 (GEM-640); AP-12009 e AP-11014 (oligonucleotídeos anti-senso TGF-beta2-específicos) ; AVI-4126; AVI-4557; AVI-4472; oblimersen (Genasense®); JFS2; aprinocarsen (WO 97/29780); GTI-2040 (oligo anti-senso de mRNA de reductase de ribonucleotídeo R2) (WO 98/05769) ; GTI-2501 (WO 98/05769) ; oligodeóxinucleotídeos anti-senso de c-Raf lipossoma-encapsulados (LErafAON) (WO 98/43095); e Sirna-027 (produto terapêutico RNAi-baseado que objetiva mRNA de VEGFR-1). K. IL-2

Um composto de IL-2 preferido é "aldesleucina" ou "Proleucina®", fabricado pela Chiron Corporation of Emeryville, Califórnia. A IL-2 nessa formulação é uma muteína de IL-2 humana não glicosilada recombinantemente produzida a qual difere da seqüência de aminoácido da IL-2 humana nativa por ter o resíduo inicial de alanina eliminado e o resíduo de cisteína na posição 125 substituído por um resíduo de serina (referido como interleucina-2 humana des-alanil-1, serina-125) . Essa muteína de IL-2 pode ser expressa em E. coli e subseqüentemente purificada através de diafiltração e cromatografia de troca de cátions, conforme descrito na Patente U.S. No. 4.931.543.

Aldesleucina foi comparada com a IL-2 nativa (Jurkat) in vitro. Nenhuma diferença significativa foi observada e indução in vivo de células citolíticas em camundongos e ameia-vida no soro após administração IV são equivalentes para aldesleucina e IL-2 nativa (Jurkat); embora existam atributos benéficos da forma de IL-2 abrangida por aldesleucina e, portanto, referência à "aldesleucina" abrange apenas essa composição e não todas as possíveis formas da proteína de IL-2.

Em 1983, quando o bioensaio de proliferação de linfócito de Cetus foi desenvolvido, não havia preparado de referência de IL-2 oficial disponível. Uma unidade de Cetus foi definida para esse preparado como a quantidade de IL-2 em 1 mL que induzia células T de murino IL-2-dependentes a incorporar timidina-tritiada a 50% de seu nível máximo após 24 horas de incubação. Ao produto contendo IL-2 foi atribuída uma atividade específica de 3 x IO6 unidades de Cetus por mg. Em 1988, o National Institute de Biological Standards e Controls (NIBSC) , o qual é um laboratório da WHO para Padrões Biológicos na Inglaterra, estabelecia um Padrão Internacional de IL-2. Também em 1988, o procedimento de ensaio para o bioensaio de proliferação de linfócito de Cetus foi alterado. 0 padrão em-laboratório de Cetus foi calibrado contra o Padrão Internacional de IL-2 no novo procedimento de bioensaio. O seguinte fator de correção foi estabelecido:

Unidades Internacionais = Unidades de Cetus x 6

Quantidades de aldesleucina serão designadas como unidades de massa baseado em 1 mg de aldesleucina tendo uma atividade específica nominal de 18 x IO6 Unidades Internacionais (18 MIU) . O protocolo incorpora Unidades Internacionais.

As composições farmacêuticas úteis nos métodos dainvenção podem compreender variantes biologicamente ativas de IL-2. Tais variantes reterão a atividade biológica desejada do polipeptideo nativo, de modo que a composição farmacêutica compreendendo o polipeptideo variante tenha o mesmo efeito terapêutico que a .composição farmacêutica compreendendo o polipeptideo nativo quando administrado a um indivíduo. Isto é, o polipeptideo variante servirá como um componente terapeuticamente ativo na composição farmacêutica de uma maneira similar àquela observada para o polipeptideo nativo. Métodos estão disponíveis na técnica para determinar se um polipeptideo variante retém a atividade biológica desejada e, conseqüentemente, serve como um componente terapeuticamente ativo na composição farmacêutica. A atividade biológica pode ser medida usando ensaios especificamente projetados para medição de atividade do polipeptideo ou proteína nativa, incluindo ensaios descritos na presente invenção. Adicionalmente, anticorpos estimulados contra um polipeptideo nativo biologicamente ativo podem ser testados com relação à sua capacidade de ligação ao polipeptideo variante, onde ligação eficaz é indicativa de um polipeptideo tendo uma conformação similar àquela do polipeptideo nativo.

Para fins da presente invenção, a atividade biológica de IL-2 de interesse é a capacidade da IL-2 de ativar e/ou expandir células natural killer (NK) para mediar atividade assassina linfocina-ativada (LAK) e citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC). Assim, uma variante de IL-2 (por exemplo, uma muteína de IL-2 humana) para uso nos métodos da presente invenção ativará e/ou expandirá células NK para mediar atividade de LAK e ADCC. Ensaios paradeterminar ativação ou expansão de IL-2 de células NK e mediação de atividade de LAC ou ADCC são bem conhecidos na técnica.

Variantes biologicamente ativas adequadas de IL-2 nativa ou que ocorre naturalmente podem ser fragmentos, análogos e derivados desse polipeptídeo. Por "fragmento" entenda-se um polipeptídeo consistindo de apenas uma parte da seqüência e estrutura do polipeptídeo intacto e pode ser uma deleção C-terminal ou deleção N-terminal do polipeptídeo nativo. Por "análogo" entenda-se um análogo do polipeptídeo nativo ou de um fragmento do polipeptídeo nativo, onde o análogo compreende uma seqüência e estrutura de polipeptídeo nativo tendo uma ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido. "Muteínas", tais como aquelas descritas aqui, e peptídeos tendo um ou mais peptóides (mímicos de peptídeo) são também abrangidos pelo termo análogo (veja Publicação Internacional No. WO 91/04282) . Por "derivado" entenda-se qualquer modificação adequada do polipeptídeo nativo de interesse, de um fragmento do polipeptídeo nativo ou de seus respectivos análogos, tais como glicosilação, fosforilação, conjugação de polímero (tal como com polietileno glicol) ou outra adição de porções estranhas, na medida em que a atividade biológica desejada do polipeptídeo nativo seja retida. Métodos para fazer fragmentos, análogos e derivados de polipeptídeo estão, em geral, disponíveis na técnica.

Por exemplo, variantes de seqüência de aminoácido do polipeptídeo podem ser preparadas através de mutações na seqüência de DNA clonada que codifica o polipeptídeo nativo de interesse. Métodos para mutagênese e alterações daseqüência de nucleotídeo são bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Walquer e Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 488-492; Kunkel e colaboradores (1987) Methods Enzymol. 154: 367-382; Sambrook e colaboradores (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York); Patente U.S. No. 4.873.192; e as referências citadas nos mesmos; aqui incorporados por referência. Orientação quanto à substituições apropriadas de aminoácido que não afetam a atividade biológica do polipeptídeo de interesse pode ser encontrada no modelo de Diahoff e colaboradores (1978) em Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D. C), aqui incorporado por referencia. Substituições conservativas, tais como troca de um aminoácido por outro tendo propriedades similares, podem ser preferidas. Exemplos de substituições conservativas incluem, mas não estão limitadas a, Gly : Ala, Vai : lie : Leu, Asp : Glu, Lys : Arg, Asn : Gln e Phe : Trp : Tyr.

Na construção de variantes do polipeptídeo de IL-2 de interesse, modificações são feitas de modo que as variantes continuem a possuir a atividade desejada. Quaisquer mutações feitas no DNA que codifica o polipeptídeo variante não devem colocar a seqüência fora da rede de leitura e, de preferência, não criarão regiões complementares que possam produzir uma estrutura de mRNA secundária.

Variantes biologicamente ativas de IL-2 geralmente terão pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, mais preferivelmente cerca de 90% a 95% ou mais e ainda maispref erivelmente cerca de 98% ou mais de identidade de seqüência de aminoácido com a seqüência de aminoãcido da molécula de polipeptídeo de referência, a qual serve como a base para comparação. Assim, onde a molécula de referência de IL-2 é IL-2 humana, uma variante biologicamente ativa da mesma terá pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, mais pref erivelmente cerca de 90% a 95% ou mais e ainda mais preferivelmente cerca de 98% ou mais de identidade de seqüência com a seqüência de aminoãcido para IL-2 humana. Uma variante biologicamente ativa de um polipeptídeo nativo de interesse pode diferir do polipeptídeo nativo em tão pouco quanto 1-15 aminoãcidos, tão pouco quanto 1-10, tal como 6-10, tão pouco quanto 5, tão pouco quanto 4, 3, 2 ou mesmo 1 resíduo de aminoácido. Por 11 identidade de seqüência1' entenda-se que os mesmos resíduos de aminoãcido são encontrados dentro do polipeptídeo variante e da molécula de polipeptídeo que serve como uma referência quando um segmento contínuo especificado da seqüência de aminoãcido das variantes é alinhado e comparado com a seqüência de aminoãcido da molécula de referência. A identidade de seqüência percentual entre as duas seqüências de aminoãcido é calculada determinando-se o número de posições nas quais o resíduo de aminoãcido idêntico ocorre em ambas as seqüências para proporcionar o número de posições equivalentes, dividindo-se o número de posições equivalentes pelo número total de posições no segmento que está sofrendo comparação com a molécula de referência e multiplicando-se o resultado por 100 para proporcionar o percentual de identidade de seqüência.

Assim, a determinação da identidade percentual entrequalquer duas seqüências pode ser realizada usando um algoritmo matemático. De preferência, variantes que ocorrem naturalmente ou não naturalmente de IL-2 têm seqüências de aminoacido que são pelo menos 70%, de preferência 80%, mais preferivelmente 85%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94% ou 95% idênticas à seqüência de aminoacido da molécula de referência, por exemplo, a IL-2 humana nativa ou uma porção mais curta da molécula de IL-2 de referência. Mais preferivelmente, as moléculas são 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas. A identidade de seqüência percentual é determinada usando o algoritmo de busca de Smith-Waterman usando uma busca refinada por gap com uma penalidade por abertura de gap de 12 e uma penalidade por extensão de gap de 2, matriz BLOSUM de 62. O algoritmo de busca por homologia de Smith-Waterman é ensinado em Smith e Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2: 482-489. Uma variante pode, por exemplo, diferir em tão pouco quanto 1 a 10 resíduos de aminoacido, tal como 6-10, tão pouco quanto 5, tão pouco quanto 4, 3, 2 ou mesmo 1 resíduo de aminoacido.

Com relação ao alinhamento ótimo de duas seqüências de aminoacido, o segmento contínuo da seqüência de aminoacido variante pode ter resíduos de aminoacido adicionais ou resíduos de aminoacido deletados com relação à seqüência de aminoacido de referência. O segmento contínuo usado para comparação com a seqüência de aminoacido de referência incluirá pelo menos vinte (20) resíduos de aminoacido contínuos e pode ter 30, 40, 50 ou mais resíduos de aminoacido. Correções para identidade de seqüência associadas à substituições de resíduo conservativas ou gaps podem ser feitas (veja o algoritmo de busca por homologiade Smith-Waterman).

A estrutura química precisa de um polipeptídeo tendo atividade de IL-2 depende de uma série de fatores. Uma vez que grupos amino e carboxila ionizáveis estão presentes na molécula, um polipeptídeo em particular pode ser obtido como uma forma de sal ácido ou básico ou neutra. Todos de tais preparados que retêm sua atividade biológica quando colocados em condições ambientais adequadas são incluídos na definição dos polipeptídeos tendo atividade de IL-2, conforme usado aqui.

Ainda, a seqüência de aminoácido primário do polipeptídeo pode ser aumentada através de derivatização usando porções açúcar (glicosilação) ou através de outras moléculas suplementares, tais como lipídios, fosfato, grupos acetila e semelhantes. Ela também pode ser aumentada através de conjugação com sacarídeos. Determinados aspectos de tal aumento são obtidos através de sistemas de processamento pós-traducionais do hospedeiro de produção; outras de tais modificações podem ser introduzidas in vitro. Em qualquer caso, tais modificações são incluídas na definição de um polipeptídeo de IL-2 usado aqui, na medida em que a atividade de IL-2 do polipeptídeo não seja destruída. Espera-se que tais modificações possam afetar, quantitativa ou qualitativamente, a atividade, quer através de intensificação ou diminuição de atividade do polipeptídeo, nos vários ensaios. Ainda, resíduos de aminoácido individuais na cadeia podem ser modificados através de oxidação, redução ou outra derivatização e o polipeptídeo pode ser clivado para obter fragmentos que retêm atividade.Tais alterações que não destroem a atividade não removem a seqüência de polipeptídeo da definição de polipeptídeos de IL-2 de interesse, conforme usado aqui.

A técnica proporciona orientação substancial com relação ao preparo e uso das variantes de polipeptídeo. No preparo de variantes de IL-2, aqueles habilitados na técnica podem determinar prontamente quais modificações na seqüência de nucleotídeo ou aminoácido da proteína nativa resultarão em uma variante que é adequada para uso como um componente terapeuticamente ativo de uma composição farmacêutica usada nos métodos da presente invenção.

A IL-2 ou variantes da mesma para uso nos métodos da presente invenção podem ser de qualquer fonte mas, de preferência, é IL-2 recombinante. Por "IL-2 recombinante" entenda-se interleucina-2 que tem atividade biológica comparável com a IL-2 de seqüência nativa e que tenha sido preparada através de técnicas de DNA recombinante conforme descrito, por exemplo, por Taniguchi e colaboradores (1983) Nature 302: 305-310 e Devos (1983) Nucleic Acids Research 11: 4307-4323 ou IL-2 mutacionalmente alterada, conforme descrito por Wang e colaboradores (1984) Science 224: 1431-1433. Em geral, o gene de codificação para IL-2 é clonado e, então, expresso em organismos transformados, de preferência um microorganismo e mais preferivelmente E. coli, conforme descrito aqui. O organismo hospedeiro expressa o gene estranho para produzir IL-2 sob condições de expressão. IL-2 recombinante sintética pode também ser feita em eucariotas, tal como células de levedo ou humanas. Processos para crescimento, coleta, ruptura ou extração de IL-2 de células são substancialmente descritos, porexemplo, nas Patentes U.S. Nos. 4.604.377; 4.738.927; 4.656.132; 4.569. 790; 4.748.234; 4.530.787; 4.572.798; 4.748.234; e 4.931.543.

Para exemplos de proteínas de IL-2 variantes veja Publicação de Patente Européia (EP) No. EP 136.489 (a qual divulga uma ou mais das seguintes alterações na seqüência de aminoácido da IL-2 que ocorre naturalmente: Asn26 para Gln26; Trpl21 para Phel21; Cys58 para Ser58 ou Ala58, Cysl05 para Serl05 ou Alal05; Cysl25 para Serl25 ou Alal25; deleção de todos os resíduos após Argl20; e as formas Met-1 das mesmas); e as muteínas de IL-2 recombinantes descritas no Pedido de Patente Européia No. 83306221.9, depositado em 13 de Outubro de 1983 (publicado em 30 de Maio de 1984 sob Publicação No. EP 109.748), o qual é equivalente à Patente Belga No. 893.016 e Patente U.S. comumente cedida No. 4.518.584 (a qual divulga muteína de IL-2 humana recombinante em que a cisteína na posição 125, numerada de acordo com a IL-2 humana nativa, é deletada ou substituída por um aminoácido neutro; alanil-serl25-IL-2; e des alanil-serl25-IL-2). Veja também Patente U.S. No. 4.752.585 (a qual divulga as seguintes proteínas de IL-2 variantes: alal04 serl25 IL-2, alal04 IL-2, alal04 alal25 IL-2, vall04 serl25 IL-2, vall04 IL-2, vall04 alal25 IL-2, des-alal alal04 serl25 IL-2, des-alal alal04 IL-2, 10 des-alal alal04 alal25 IL-2, des-alal vall04 serl25 IL-2, des-alal vall04 IL-2, des-alal vall04 alal25 IL-2, des-alal des-pro2 alal04 serl25 IL-2, des-alal des-pro2 alal04 IL-2, des-alal des-pro2 alal04 aial25 IL-2, des-alal des-pro2 vall04 serl25 IL-2, des-alal des pro2 vall04 IL-2, des-alal des-pro2 vall04 alal25 IL-2, des-alal des-pro2 des-thr3 alal04serl25 IL-2, des-alal des-pro2 des-thr3 alal04 IL-2, des-alal des-pro2 des-thr3 alal04 15 alal25 IL-2, des-alal des-pro2 des-thr3 vall04 serl25 IL-2, des-alal des-pro2 des-thr3 vall04 IL-2, des-alal des-pro2 des-thr3 vall04 alal25 IL-2, des-alal des-pro2 des-thr3 des ser4 alal04 serl25 IL-2, des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 alal04 IL-2, des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 alal04 alal25 IL-2, des-alal des-pro2 des-thr3 des- ser4 vall04 serl25 IL-2, des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 vall04 IL-2, des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 vall0420 alal25 IL-2, des-alal des-pro2 des- thr3 des-ser4 des- ser5 alal04 serl25 IL-2, des-alal des pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 alal04 IL-2, des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 alal04 alal25 IL-2, des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 vall04 serl25 IL-2, des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 vai 104 IL-2, des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 vall04 ala!25 IL-2, des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 alal04 25 alal25 IL-2, des-alal des-pro2, des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 alal04 IL-2, des-alal des pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 alal04 serl25 IL-2, des-alal des-pro2 des-thr3 des ser4 des-ser5 des-ser6 vall04 serl25 IL-2, des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des seró vall04 IL-2 e des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 vall04 alal25 IL-2) e Patente U.S. No. 4.931.54 3 (a qual divulga a muteína de IL-2 des-alanil-1, serina 30 125 IL-2 humana usada nos exemplos aqui, bem como outras muteínas de IL-2).

Veja também Publicação de Patente Européia No. EP 200.280 (publicada em 10 de Dezembro de 1986), a qual divulga muteínas de IL-2 recombinantes, em que a metioninana posição 104 foi substituída por um aminoácido conservativo.

Exemplos incluem as seguintes muteínas: ser4 des-ser5 alal04 IL-2; des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 alal04 alal25 IL-2; des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 glul04 serl25 IL-2; des-alal des-pro2 des-thr3 des ser4 des-ser5 glul04 IL-2; des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 glul04 alal25 IL-2; des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 alal04 alal25 IL-2; des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 alal04 IL-2; des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des- ser5 5 des-ser6 alal04 serl25 IL-2; des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 glul04 serl25 IL-2; des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 glul04 IL-2; e des-alal des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 glul04 alal25 IL-2. Veja também Publicação de Patente Européia No. EP 118.617 e Patente U.S. No. 5.700.913, a qual divulga variantes de IL-2 humana não glicosiladas trazendo alanina ao invés de metionina na IL-2 nativa como o aminoácido N-terminal; uma IL-2 humana não glicosilada com a metionina inicial deletada, de modo que prolina é o aminoácido N-terminal; e uma IL-2 humana não glicosilada com uma alanina inserida entre os aminoácidos metionina e prolina N-terminais.

Outras muteínas de IL-2 incluem aquelas divulgadas no WO 99/60128 (substituições do aspartato na posição 20 por histidina ou isoleucina, a asparagina na posição 8 8 por arginina, glicina ou isoleucina ou a glutamina na posição 126 por leucina ou ácido glutâmico) as quais, segundo informações, têm atividade seletiva por receptores de IL-2de alta afinidade expressos por células expressando receptores de células T, de preferência células NK, e toxicidade de IL-2 reduzida; as muteínas divulgadas na Patente U.S. No. 5.229.109 (substituições de arginina na posição 38 por alanina ou substituições da fenilalanina na posição 42 por lisina), as quais exibem ligação reduzida ao receptor de IL-2 de alta afinidade quando comparado com a IL-2 nativa, ao mesmo tempo em que mantém a capacidade de estimular células LAK; as muteínas divulgadas na Publicação Internacional No. WO 00/58456 (alteração ou deleção de uma seqüência (x)D(y) que ocorre naturalmente na IL-2 nativa, onde D é ácido aspártico, (x) é leucina, isoleucina, glicina ou valina e (y) é valina, leucina ou serina) , as quais são reivindicadas por reduzirem a síndrome de vazamento vascular; o peptídeo IL-2 pl-30 divulgado na Publicação Internacional No. WO 00/04 04 8 (correspondendo aos primeiros 3 0 aminoácidos da IL-2, o qual contém a a-hélice A inteira de IL-2 e interage com a cadeia P do receptor de IL-2) o qual, segundo informações, estimula as células NK e induz à células LAK; e uma forma mutante do peptídeo IL-2 pl-30 também divulgada no WO 00/04048 (substituição de ácido aspártico na posição 20 por lisina) a qual, segundo informações, é incapaz de induzir à hemorragias vasculares, mas permanece capaz de gerar células LAK. Adicionalmente, a IL-2 pode ser modificada com polietileno glicol para proporcionar solubilidade intensificada e um perfil farmacocinético alterado (veja Patente U.S. No. 4.766.106).

O termo IL-2, conforme usado aqui, também se destina a incluir fusões de IL-2 ou conjugados compreendendo IL-2fundida a uma segunda proteína ou covalentemente conjugada à poliprolina ou um polímero solúvel em água para reduzir as freqüências de dosagem ou melhorar a tolerabilidade à IL-2. Por exemplo, a IL-2 (ou uma variante da mesma conforme definido aqui) pode ser fundida à albumina humana ou um fragmento de albumina usando métodos conhecidos na técnica (veja WO 01/79258). Alternativamente, a IL-2 pode ser covalentemente conjugada à poliprolina ou homopolímeros de polietileno glicol e polióis polioxietilados, em que o homopolímero é não substituído ou substituído em uma extremidade por um grupo alquila e o poliol é não substituído, usando métodos conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 4.766. 106. 5.206.344 e 4.894.226). Qualquer composição farmacêutica compreendendo IL-2 como o componente terapeuticamente ativo pode ser usada nos métodos da invenção. Tais composições farmacêuticas são conhecidas na técnica e incluem, mas não estão limitadas a, aquelas divulgadas nas Patentes U.S. Nos. 4.745.180; 4.766.106; 4.816.440; 4.894.226; 4.931 .544; e 5.078.997. Assim, composições líquidas liofilizadas ou secas por pulverização compreendendo IL-2 ou variantes da mesma que são conhecidas na técnica podem ser preparadas como uma solução ou suspensão aquosa ou não aquosa para subseqüente administração a um indivíduo de acordo com os métodos da invenção. Cada uma dessas composições compreenderá IL-2 ou variantes da mesma como um componente terapêutica ou profílaticamente ativo. Por "componente terapêutica ou profílaticamente ativo" entenda-se que a IL-2 ou variantes da mesma é especificamente incorporada na composição para obter uma resposta terapêutica ouprofilática desejada com relação ao tratamento, prevenção ou diagnóstico de uma doença ou condição dentro de um indivíduo quando a composição farmacêutica é administrada a esse indivíduo. De preferência, a composição farmacêutica compreende agentes de estabilização apropriados, agentes de composição de volume ou ambos para minimizar os problemas associados à perda de estabilidade de proteína e atividade biológica durante preparo de armazenamento. Em modalidades preferidas da invenção, as composições farmacêuticas contendo IL-2 úteis nos métodos da invenção são composições compreendendo IL-2 monomérica estabilizadas ou variantes da mesma, composições compreendendo IL-2 multimérica ou variantes da mesma e composições compreendendo IL-2 liofilizada ou seca por pulverização ou variantes da mesma estabilizadas.

Composições farmacêuticas compreendendo IL-2 monomérica estabilizada ou variantes da mesma são divulgadas na Publicação Internacional No. WO 01/24814, intitulada "Stabilized Liquid Polypeptide-Containg Pharmaceutic Compositions". Por IL-2 "monomérica" entenda-se que as moléculas de proteína estão presentes substancialmente em sua forma monomérica, não em uma forma agregada, nas composições farmacêuticas descritas aqui. Conseqüentemente, oligômeros ou agregados covalentes ou hidrofóbicos de IL-2 não estão presentes. Resumidamente, a IL-2 nessas composições líquidas é formulada com uma quantidade de uma base de aminoácido suficiente para diminuir a formação de agregados de IL-2 durante armazenamento. A base de aminoácido é um aminoácido ou uma combinação de aminoácidos, onde qualquer dado aminoácidoestá presente em sua forma de base livre ou em sua forma de sal. Aminoácidos preferidos são selecionados do grupo consistindo de arginina, lisina, ácido aspártico e ácido glutâmico. Essas composições ainda compreendem um agente de tamponamento para manter o pH das composições líquidas dentro de uma faixa aceitável para estabilidade da IL-2, onde o agente de tamponamento é um ácido substancialmente isento de sua forma de sal, um ácido em sua forma de sal ou uma mistura de um ácido e sua forma de sal. De preferência, o ácido é selecionado do grupo consistindo de ácido succínico, ácido cítrico, ácido fosfórico e ácido glutâmico.

Tais composições são referidas aqui como composições farmacêuticas de IL-2 monoméricas estabilizadas. A base de aminoácido nessas composições serve para estabilizar a IL-2 contra formação de agregados durante armazenamento da composição farmacêutica líquida, enquanto que uso de um ácido substancialmente isento de sua forma de sal, um ácido em sua forma de sal ou uma mistura de um ácido e sua forma de sal como um agente de tamponamento resulta em uma composição líquida tendo uma osmolaridade que é aproximadamente isotônica. A composição farmacêutica líquida pode, adicionalmente, incorporar outros agentes de estabilização, mais particularmente metionina, um tensoativo não-iônico, tal como polisorbato 80, e EDTA, para aumentar adicionalmente a estabilidade do polipeptídeo. Tais composições farmacêuticas líquidas são mencionadas como sendo estabilizadas, uma vez que a adição da base de aminoácido em combinação com um ácido substancialmente isento de sua forma de sal, um ácido emsua forma de sal ou uma mistura de um ácido e sua forma de sal, resulta em composições tendo estabilidade ao armazenamento aumentada com relação à composições farmacêuticas líquidas formuladas na ausência da combinação desses dois componentes. Essas composições farmacêuticas líquidas compreendendo a IL-2 monomérica estabilizada podem ser usadas em uma forma líquida aquosa ou armazenadas para posterior uso em um estado congelado ou em uma forma seca para posterior reconstituição em uma forma líquida ou outra forma adequada para administração a um indivíduo de acordo com os métodos da presente invenção. Por "forma seca" entenda-se que a composição farmacêutica líquida ou formulação é seca através de secagem por congelamento (isto é, liofilização; veja, por exemplo, Williams e Polli (1984) J. Parenteral Sei. Technol. 38: 48 59), secagem por pulverização (veja Masters (1991) em Spray-Drying Handbook (8a ed; Longman Scientific and Technical, Essez, Reino Unido), páginas 491-676; Broadhead e colaboradores (1992) Drug Devei. Ind. Pharm. 18: 1169-1206; e Mumenthaler e colaboradores (1994) Pharm. Res. 11: 12-20 ou secagem a ar (Carpenter e Crowe (1988) Cryobiology 25: 459-470; e Roser (1991) Biopharm. 4: 47-53).

Outros exemplos de formulações de IL-2 que compreendem IL-2 em seu estado monomérico não agregado incluem aquelas descritas em Whittington e Faulds (1993) Drugs 46(3): 446-514. Essas formulações incluem o produto de IL-2 recombinante no qual a muteína de IL-2 recombinante Teceleucina (IL-2 humana não glicosilada com um resíduo de metionina adicionado ao amino-término) é formulada com albumina de soro humano a 0,25% em um pó liofilizado o qualé reconstituído com solução salina isotônica e a muteína de IL-2 recombinante Bioleucina (IL-2 humana com um resíduo de metionina adicionado ao amino-término e uma substituição do resíduo de cisteína na posição 125 da seqüência de IL-2 humana por alanina) formulada de modo que 0,1 a 1,0 mg/ml de muteína de IL-2 seja combinado com ácido, em que a formulação tem um pH de 3,0 a 4,0, vantajosamente sem tampão e uma condutividade de menos de 1.000 mS/cm (mmhos/cm) (vantajosamente menos de 500 mS/cm (mmhos/cm)). Veja EP 373.679; Xhang e colaboradores (1996) Pharmaceut. Res. 13(4): 643-644 e Prestrelski e colaboradores (1995) Pharmaceut. Res. 12(9): 1250-1258.

Exemplos de composições farmacêuticas compreendendo IL-2 multimérica são divulgados na Patente U.S. comumente cedida No. 4.604.377. Por "multimérica" entenda-se que as moléculas de proteína estão presentes na composição farmacêutica em uma forma microagregada tendo uma associação molecular media de 10-50 moléculas. Esses multímeros estão presentes como moléculas de IL-2 fisicamente associadas, frouxamente ligadas.

Uma forma liofilizada dessas composições esta comercialmente disponível sob a marca comercial Proleucina® IL-2 (Chiron Corporation, Emeryville, Califórnia). As formulações liofilizadas divulgadas nessa referência compreendem IL-2 recombinante microbianamente produzida, seletivamente oxidada na qual a IL-2 recombinante é misturada com um veículo solúvel em água, tal como manitol, que proporciona volume, e uma quantidade suficiente de dodecil sulfato de sódio para assegurar a solubilidade da IL-2 recombinante em água.Essas composições são adequadas para reconstituição em injeções aquosas para administração parenteral e são estáveis e bem toleradas em pacientes humanos. Quando reconstituída, a IL-2 mantém seu estado multimérico. Tais composições liofilizadas ou líquidas compreendendo IL-2 multimérica são abrangidas pelos métodos da presente invenção. tais composições são referidas aqui como composições farmacêuticas de IL-2 multiméricas.

Os métodos da presente invenção também podem usar composições farmacêuticas liofilizadas ou secas por pulverização estabilizadas compreendendo IL-2, as quais podem ser reconstituídas em um líquido ou outra forma adequada para administração de acordo com os métodos da invenção. Tais composições farmacêuticas são divulgadas na Publicação Internacional No. WO 01/4 9274 intitulada "Methods for Pulmonary Delivery of Interleukin-2" . Essas composições podem ainda compreender pelo menos um agente de composição de volume, pelo menos um agente em uma quantidade suficiente para estabilizar a proteína durante o processo de secagem ou ambos. Por "estabilizada" entenda-se que a proteína de IL-2 ou variantes da mesma retêm sua forma monomérica ou multimérica, bem como suas outras propriedades chave de qualidade, pureza e potência após liofilização ou secagem-pulverização para obter a forma em pó seco ou sólido da composição. Nessas composições, materiais veículo preferidos para uso como um agente de composição de volume incluem glicina, manitol, alanina, valina ou qualquer combinação dos mesmos, mais preferivelmente glicina. O agente de composição de volume está presente na formulação na faixa de 0% a cerca de 10%(peso/v), dependendo do agente usado. Materiais veículo preferidos para uso como um agente de estabilização incluem qualquer açúcar ou álcool de açúcar ou qualquer aminoacido. Açúcares preferidos incluem sacarose, trealose, rafinose, estaquiose, sorbitol, glicose, lactose, dextrose ou qualquer combinação dos mesmos, de preferência sacarose. Quando o agente de estabilização é um açúcar, ele está presente na faixa de cerca de 0% a cerca de 9,0% (peso/v), de preferência cerca de 0,5% a cerca de 5,0%, mais preferivelmente cerca de 1,0% a cerca de 3,0%, ainda mais preferivelmente cerca de 1,0%. Quando o agente de estabilização é um aminoacido, ele está presente na faixa de cerca de 0% a cerca de 1,0% (peso/v), de preferência cerca de 0,3% a cerca de 0,7%, ainda mais pref erivelmente cerca de 0,5%. Essas composições liofilizadas ou secas-pulverização estabilizadas podem, opcionalmente, compreender metionina, ácido etilenodiaminatetracético (EDTA) ou um de seus sais, tal como EDTA dissódico ou outro agente quelante, o qual protege a IL-2 ou variantes da mesma contra oxidação da metionina. O uso desses agentes dessa maneira é descrito no Pedido U.S. No. de Série 09/677.643, aqui incorporado por referencia. As composições liofilizadas ou secas-pulverização estabilizadas podem ser formuladas usando um agente de tamponamento, o qual mantém o pH da composição farmacêutica dentro de uma faixa aceitável, de preferência entre um pH de cerca de 4,0 a um pH de cerca de 8,5 quando em uma fase líquida, tal como durante o processo de formulação ou após reconstituição da forma seca da composição. Tampões são escolhidos de modo que eles seja compatíveis com o processo de secagem e nãoafetem a qualidade, pureza, potência e estabilidade da proteína durante processamento e quando de armazenamento.

As composições farmacêuticas liofilizadas ou secas por pulverização monoméricas, multiméricas e estabilizadas previamente descritas representam composições adequadas para uso nos métodos da invenção. Contudo, qualquer composição farmacêutica compreendendo um composto de IL-2 como um componente terapeuticamente ativo é abrangida pelos métodos da invenção.

Também proporcionado aqui é um kit ou embalagem contendo pelo menos uma composição combinada da invenção, acompanhada de instruções para uso. Por exemplo, em casos nos quais cada um dos fármacos em si é administrado como formas de dosagem individuais ou separadas, o kit compreende cada um dos fármacos, junto com instruções para uso. Os componentes de fármaco podem ser embalados através de qualquer maneira adequada para administração, na medida em que a embalagem, quando considerada junto com as instruções para administração, indique claramente a maneira pela qual cada um dos componentes de fármaco tem de ser administrado. Alternativamente, cada um dos componentes de fármaco da combinação pode ser combinado em uma única forma de dosagem administrável, tal como uma única composição.

Por exemplo, para um kit ilustrativo compreendendo rIL-2 e um agente anti-angiogênico, o kit pode ser organizado para qualquer período de tempo apropriado, tal como por dia. Como um exemplo, para o Dia 1, um kit representativo pode compreender dosagens unitárias de cada um da rIL-2 e agente anti-angiogênico. Se cada um dos fármacos tem de ser administrado duas vezes ao dia, então,o kit pode conter, correspondendo ao Dia 1, duas fileiras de formas de dosagem unitária de cada um da IL-2 e do agente anti-angiogênico, com instruções para o momento de administração. Alternativamente, se um ou mais dos fármacos difere quanto ao momento ou quantidade de fármaco a ser administrada em comparação com os outros elementos de fármaco da combinação, então, isso será refletido na embalagem e instruções. Por exemplo, se a rIL-2 tem de ser administrada duas vezes ao dia e o agente anti-angiogênico tem de ser tomado uma vez ao dia, a embalagem para o Dia 1 exemplificativa corresponderia às formas de dosagem unitária de rIL-2 como "Dia 1, Dose 1", junto com formas de dosagem para o agente anti-angiogênico correspondendo a "Dia 1, Dose 2".

Várias modalidades de acordo com o acima podem ser prontamente consideradas e, naturalmente, serão dependentes da combinação de fármacos em particular empregados para tratamento, suas formas de dosagem correspondentes, dosagens recomendadas, população de paciente pretendida e semelhantes. A embalagem pode estar em qualquer forma comumente empregada para o empacotamento de produtos farmacêuticos e pode utilizar qualquer uma de uma série de características, tais como diferentes cores, envoltório, empacotamento resistente à adulteração, pacotes de blister, dissecantes e semelhantes.

EXEMPLOS

Abaixo estão exemplos de modalidades específicas para realização da presente invenção. Os exemplos são oferecidos para fins ilustrativos apenas e não se destinam a limitar o escopo da presente invenção de qualquer forma.Esforços foram feitos para assegurar precisão com relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperaturas, etc.), mas algum erro e desvio experimental poderão, naturalmente, ser permitidos.

Exemplo 1

Composições para co-administração com rIL-2

A. COMPOSTOS

Tabela 1: Exemplos de Quinazolina

<table>table see original document page 89</column></row><table><table>table see original document page 90</column></row><table><table>table see original document page 91</column></row><table><table>table see original document page 92</column></row><table><table>table see original document page 93</column></row><table><formula>formula see original document page 94</formula>

O Esquema 1 descreve um método modular de síntese de uma miríade de compostos de quinazolina substituídos. Referência a AG indica um grupo de ativação tal como, por exemplo, um haleto, triflato ou cetona, em que tanto quanto quatro grupos AG podem estar presentes. Uma vez que a posição 4-cloro, mostrada na terceira etapa, é mais ativa do que as posições 5-8 sobre o anel de benzila, deslocamento com NHRR' pode ser processado sem muito deslocamento concomitante de AG em qualquer uma das posições 5-8. Subseqüente deslocamento do grupo AG para R" na etapa final pode ser processado na presença de uma base fraca a moderada. Alternativamente, o(s) grupo(s) AG pode(m) ser modificado(s) para proporcionar o produto desejado, por exemplo, um grupo N02 pode ser reduzido com Fe e AcOH em EtOH e H20 para proporcionar um substituinte amino, o qual pode ser ainda substituído, por exemplo, através de aminação redutiva com paraformaldeido.

Conforme será evidente para aqueles habilitados na técnica, uma pletora de materiais de iniciação de 2-aminobenzamida funcionalizada está comercialmente disponível ou é facilmente sintetizada através de procedimentos conhecidos, subseqüentemente, o(s) grupo(s) AG no material de iniciação pode(m) ser um substituinte desejado no produto final (conforme em R") tal como, porexemplo, (um) grupo(s) alcóxi ou (um) grupo(s) alquila substituído(s). ainda, uma série de materiais de iniciação de 2-nitrobenzamida funcionalizada está disponível, os quais são facilmente convertidos ao material de 2-aminobenzamida na presença de um agente de redução, tal como H2/Pd/C em EtOH.

Métodos alternativos de fabricação de quinazolinas da invenção são descritos no WO 04/24703, WO 01/32651, US 5.457.105, US 5.616.582, US 5.770.599, WO 02/16351, US 6.727.256, WO 02/02552, US 5.747.498 e WO 96/30347.

INDOLINONAS Esquema 2a:

<formula>formula see original document page 95</formula>

O Esquema 2a é realizado como um procedimento em uravaso, com reagentes na etapa a sendo NH4OH, CuCl em H20,seguido pela adição de HC1 aq. na etapa b. R2-R5 são conforme definido aqui.

Esquema 2b:

<formula>formula see original document page 95</formula>

No Esquema 2b, os reagentes são agitados em EtOH na presença de piperidina (a) para proporcionar o produto final. Conforme será evidente para aqueles habilitados, a reação pode ser aquecida para intensificar o rendimento, dependendo da reatividade dos materiais de iniciação em particular.

Esquema 2c:<formula>formula see original document page 96</formula>

No Esquema 2c, os reagentes são submetidos a refluxo em EtOH na presença de NaOBu-t (a) para proporcionar o produto final. R9, conforme mostrado no Esquema 2, é H, -OH, -CN, alquila, arila, heterociclila, alcóxi ou -NRaRb, conforme definido aqui. Considera-se que a estrutura acima pode substituir a Fórmula II para permitir substituição em R9, pelo que todos os outros substituintes são conforme definido aqui.

Esquema 2d (Síntese de Composto 6):

<formula>formula see original document page 96</formula>

FTALAZINAS

Preparo de ftalazinas substituídas, conforme no Composto 10, é descrito como segue, um esboço da US 6.258.812, a qual também inclui outros esquemas de reação que podem ser úteis na síntese dos compostos da presente invenção.

Esquema 3a:

Dihidrocloreto de 1-(4-Cloroanilino)-4-(4-piridilmetil) ftalazina

Uma mistura de 15,22 (59,52 mmoles) de l-cloro-4-(4-piridilmetil)ftalazina (para preparo veja Pedido de PatenteAlemã no. 1 061 788, publicado em 23 de Julho de 1959]), 7,73 g (60,59 mmoles) de 4-cloroanilina e 200 ml de 1-butanol é aquecida durante 2 h sob refluxo. 0 cristalizado, o qual é obtido quando a mistura esfria lentamente para 5°C é, então, filtrado e lavado com 1-butanol e éter. O resíduo no filtro é dissolvido em cerca de 200 ml de metanol quente, a solução é tratada com 0,75 g de carvão ativado e filtrada via um Hyflo Super Cel e o pH do filtrado é ajustado para cerca de 2,5 com 7 ml de HC1 metanólico a 3 N. O filtrado é evaporado para cerca de metade do volume original e éter adicionado até que ligeira turvação ocorra; resfriamento, então, leva à precipitação dos cristais. 0 cristalizado é filtrado, lavado com uma mistura de metanol/éter (1:2), bem como éter, seco durante 8 horas a 110°C sob HV e equilibrado durante 72 horas a 20°C e em atmosfera ambiente. Dessa forma, o composto do titulo é obtido com um teor de água de 8,6%; m.p. >270°C. ; 1H NMR (DMSO-d6) 11,05-12,20 (br), 9,18-9,23 (m, 1H) , 8,88 (d, 2H) , 8,35-8,40 (m, 1H) , 8,18-8,29 (m, 2H) , 8,02 (d, 2H) , 7,73 (d, 2H), 7,61 (d, 2H), 5,02 (s, 2H); ESI-MS: (M+H) + = 347 .

Esquema 3b:

Hidrocloreto de 1-(4-Cloroanilino)-4-(4-piridilmetil) ftalazina

Uma mistura de 0,972 g (3,8 mmoles) de l-cloro-4- (4-piridilmetil)ftalazina, 0,656 g (4 mmoles) de hidrocloreto de 4-cloroanilina (Research Organics, Inc., Cleveland, Ohio, EUA) e 2 0 ml de etanol é aquecida durante 2 h sob refluxo. A mistura de reação é esfriada em um banho de gelo, filtrada e o cristalizado lavado com um pouco deetanol e éter. Após secagem sob HV durante 8 h a 110°C e durante 10 h a 150°C, o composto do título é obtido como um resultado da remoção térmica de HCl; m.p. >270° C; XH NMR (DMSO-d6) 9,80-11,40 (br), 8,89-8,94 (m, 1H), 8,67 (d, 2H), 8,25-8,30 (m, 1H) , 8,06-8,17 (m, 2H) , 7,87 (d, 2H) , 7,69 (d, 2H), 7,49 (d, 2H), 4,81 (s, 2H); ESI-MS: (M+H) += 347.

Esquema 3c:

Hidrocloreto de 1-(4-Cloroanilino)-4-(4-piridilmetil) ftalazina

Uma mistura de 1,28 g (5 mmoles) de 1-cloro-4- (4 -piridilmetil)ftalazina, 0,67 g (5,25 mmoles) de 4-cloroanilina e 15 ml de 1-butanol é aquecida durante 0,5 h a 100°C enquanto se agita em uma atmosfera de nitrogênio. A mistura é, então, esfriada para a RT, filtrada e o filtrado lavado com 1-butanol e éter. Para purificação, o cristalizado é dissolvido em 40 ml de metanol quente, a solução tratada com carvão ativado, filtrada via Hyflo Super Cel e o filtrado evaporado para cerca de metade de seu volume original, resultando na formação de um precipitado cristalino. Após esfriar para 0°C, filtração, lavagem do resíduo no filtro com éter e secagem sob HV durante 8 h a 13 0°C, o composto do título é obtido; m.p. >270° C; 1H NMR (DMS0-d6) 9,80-11,40 (br), 8,89-8,94 (m, 1H) , 8,67 (d, 2H) , 8,25-8,30 (m, 1H) , 8,06-8,17 (m, 2H) , 7,87 (d, 2H) , 7,69 (d, 2H) , 7,49 (d, 2H) , 4,81 (s, 2H) ; ESI-MS: (M+H) + = 347.

Exemplo 2

Preparo de rIL-2

Preparo de Aldesleucina, rIL-2 (NSC3773364) (Proleucina"", Chiron) :RNA mensageiro da linhagem de células Jurkat humana é usado para criar cDNA fita dupla, o qual é hibridizado em plasmídeos pBR322. Um clone contendo o gene de IL-2 é identificado usando uma sonda de oligonucleotídeo 32P-rotulada correspondendo a um trecho curto da seqüência de base de IL-2. O gene é inserido em uma região do plasmídeo pBR322 que tem um sítio de restrição conveniente. 0 promotor e sítio de ligação ribossômica apropriados são inseridos na frente do gene de IL-2 e o clone de expressão resultante codifica uma rIL-2 recombinante modificada. Mutagênese ín vitro da IL-2 clonada é usada para fazer uma substituição conservativa de serina para cisteína na posição 125. A molécula resultante ê indistinguível da IL-2 nativa quanto à sua atividade biológica in vitro. Uma cepa de produção de E. coli trazendo o gene de aldesleucina é crescida em fermentadores. A cultura é coletada e a aldesleucina é extraída. Uma série de etapas cromatográficas foi realizada para purificar a aldesleucina. O produto formulado é ajustado para um pH de 7,2-7,8. O peso molecular da Proleucina* é de aproximadamente 15.600 daltons. Análise através de composição de aminoácido e seqüenciamento N-terminal confirmaram que a aldesleucina tem a seqüência de proteína prevista.

Procedimento de Reconstituição e Diluição:

Proleucina® é um bolo liofilizado em frascos de 5 cc contendo 1,3 mg de proteína. Frascos de Proleucina® para injeção são reconstituídos com 1,2 mL de Água Estéril para Injeção, USP. O diluente é dirigido contra o lado do frasco para evitar espuma em excesso, sacudindo os conteúdossuavemente até completamente dissolvidos, enquanto se evita agitação. Quando reconstituído, cada mL contém 1,1 mg (18 milhões de IU) de Proleucina'". Proleucina0 reconstituída é adequada para injeção intravenosa diretamente ou pode serdiluída conforme necessário em volumes de 50 mL a 500 mL com Injeção de Dextrose a 5%, USP, com Albumina Humana a 0,1%, USP. Quando de diluição, a Albumina Humana, USP é adicionada à Injeção de Dextrose a 5%, USP, antes da adição da Proleucina* reconstituída.

Exemplo 3

Terapia com uma Composição de rIL-2 como um único agente versus terapia combinada com composição de rIL-2 e agentesanti-angiogênicos Os resultados de rIL-2 em alta dose foram resumidos na Tabela 6.

Tabela 6: Experimentos de Esquemas de Infusão de Bolo de

<table>table see original document page 100</column></row><table><table>table see original document page 101</column></row><table>Unidades Internacionais; CR: resposta completa; PR: Resposta Parcial; q: cada; NS: não estabelecido

Resposta completa + resposta parcial = 16,5% (intervalo de confidencia de 95%, 13,8% - 19,2%).

Adaptado, em parte, de Bukowski (39).

Uma série de fatores tem dado origem ao ímpeto para terapias combinadas com composições anti-angiogênicas. A morbidade significativa associada à alta dose de rIL-2 requeria seleção cuidadosa do paciente, diminuindo dramaticamente o número de pacientes potenciais que poderiam se beneficiar de terapia. Infelizmente, enfermidade concomitante é mais freqüentemente encontrada naqueles que têm a maior incidência de RCC. O requisito de monitoramento cuidadoso do paciente e assistência média intensiva ocasional tem tornado a administração com alta dose de rIL-2 como um único agente cara e limitando seu uso em grandes centros médicos. O efeito pratico do qual é restringir a disponibilidade a apenas uma minoria de pacientes.

Doses menores de rIL-2 foram criticamente avaliadas, conforme observado na Tabela 7

Tabela 7: Experimentos em Fase II da rIL-2 como um Único Agente: Esquemas Subcutâneos1

<table>table see original document page 102</column></row><table><table>table see original document page 103</column></row><table><table>table see original document page 104</column></row><table>

rIL-2: Interleucina-2 recombinante; MIU: Milhão deUnidades Internacionais; CR: resposta completa,- PR:Resposta Parcial; q: cada; NS: não estabelecido; i.v.:intravenoso

Resposta completa + resposta parcial = 18,5%(intervalo de confidencia de 95%, 15,8% - 21,5%).aDose Total.

bTipo de Unidade não especificado,adaptado, em parte, de Bukowski (39).

A maioria dos regimes subcutâneos comumente utilizadosfoi publicada por Buter e colaboradores. Em Buter, rIL-2foi fornecida uma vez ao dia, 5 dias por semana durante 6semanas. Durante o primeiro ciclo de 5 dias, 18 x 106 IU(MIU) foram fornecidos uma vez ao dia; nos ciclosseguintes, as doses após os primeiros 2 dias foramreduzidas para 9 MIU. As taxas de resposta e dados desobrevivência podem ser similares àqueles publicados paraadministração em bolo IV em alta dose de rIL-2. O regime deButer/Sleijfer foi recentemente comparado com a alta dosede rIL-2 em um experimento prospectivo aleatório. Noventa eseis pacientes foram aleatoriamente distribuídos à altadose IV de rIL-2 e 92 pacientes a rIL-2 SQ (esquema de dosede Buter / Sleijfer). Anteriormente, a resposta à alta dosede rIL-2 era de 20% e ã rIL-2 SQ era de 10%. Contudo, asobrevivência global não era diferente (p = 0,34) da altadose. Como tal, um catalisador para combinação comcomposições anti-angiogênica existe para aumentar aeficácia e responsividade global do paciente ao regime commenor dose.

Regimes para combinações de aldesleucina com agentesanti-angiogênicos são criticamente avaliados, conformeobservado na Tabela 8

Tabela 8: Tratamento, Dose e Duração

<table>table see original document page 105</column></row><table>

" Uma dose de agente anti-angiogênico (igual à doseplanejada de acordo com o nível de dose) é fornecida no Dia-7 .

" Agente anti-angiogênico é fornecido novamente no dia1 e, então, a cada 2 semanas continuamente em um ciclo detratamento de 8-semanas.

Tratamento com rIL-2 é continuado durante 6 semanasconsecutivas (dias 1-42, Segunda-Sexta de cada semana)seguido por um período de descanso de 2-semanas, resultandoem um ciclo de tratamento de 8-semanas.

Exemplo 4

Terapia Combinada com rIL-2 e Inibidores de Quínase deTirosina do Receptor de Pequena Molécula BAY 43-9006 e

SU11248

A. Material e Métodos

Fármacos

Interleucina-2 recombinante humana (Proleucina8",Aldesleucina/rIL-2); 18 MIU/ ml, Chiron Corporation,Emeryville, CA) foi reconstituída com água estéril parainjeção e formulada em dextrose a 5% antes deadministração. Vincristina (sulfato de vincristina) era daMayne Pharma Ltda (Mulgrave, Austrália). CHIR-258 é 4-amino-5-fluoro-3-[5-(4-metilpiperazin-l-il)-1H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1H)-ona (Chiron). BAY 43-9006(Sorafanib/Nexavar®) (Riedl e colaboradores, Proc. Am.Assoc. Câncer Res. 2001 42(Abs 4956); Lowinger ecolaboradores, Curr. Pharm. Des. 2002 8(25): 2269-2278; WO9932455) e SU11248 (Sunitinib/Sutent®) (Sun ecolaboradores, J". Med. Chem. 2003 46(7): 1116-1119; WO0160814) foram sintetizados e purificados no-laboratório deacordo com procedimentos e patentes publicados. Soluções deestoque de BAY 43-9006 ou SU11248 (20 mM) foram preparadasem DMSO e alíquotas serão armazenadas a - 2 0°C antes deuso. Para ensaios in vitro, todos os fármacos foramdiluídos em meio de cultura ótimo. Para administração invivo, BAY 43-9006 foi formulado em veículo PEG 400 a 100%,enquanto que soluções de dosagem de SU1124 8 forampreparadas em tampão de citrato a 5 mM. Todos os outrosprodutos químicos usados eram de grau para pesquisa.

Linhagens de Células

Todas as linhagem de células de murino, CTLL-2(linhagem de células T IL-2- dependente), melanoma B16-F10,carcinoma de cólon CT26 e renal RENCA foram obtidas daAmerican Tissue Culture Collection (Rockville, MD). CTLL-2foram crescidas em RPMI1640 suplementado com FBS a 10%(soro bovino fetal, Gibco Life Technologies, Gaithersburg,MD) , L-glutamina a 2 mM, piruvato de sódio a 1 mM, HEPES a25 mM, rIL-2 a 0,5 nM, P-mercaptoetanol a 2 mM. CélulasRENCA foram cultivadas em um meio contendo EMEM com FBS a10%, 100X Vitamina a 2%, 1% de glutamina a 200 mM, 1% deNaPy a 100 mM, 1% de aminoácidos não essenciais. Paracrescimento de células CT26, o meio continha EMEM, FBS a10%, 2% de vitaminas, 1% de glutamina a 200 mM, 1% depiruvato de sódio a 100 mM, 1% de aminoácidos nãoessenciais. Células B16-F10 foram crescidas em RPMI 1640com FBS a 10%, 1% de aminoácidos não essenciais, 1% depiruvato de sódio a 100 mM, 2% de vitaminas; l-glutamina a2 mM; 2% de bicarbonato de sódio. Células Yac-1 (ATCC)foram cultivadas em RPMI + FBS a 10% e subcultivadas 1-2dias antes de ensaio para assegurar crescimento em log-fase. As células foram mantidas como suspensão ou culturasaderentes em uma atmosfera umidif içada a 37°C e 5% de C02.As células foram usadas na fase de crescimento exponencial(não excedendo a 6-8 passagens) com viabilidade >98%(avaliada usando coloração com azul de tripano) edeterminadas isentas de micoplasma.

Estudos de Eficácia in vivo

Camundongos fêmeas BALB/c ou C57BL6 (4-6 semanas deidade, 18-22 g) foram obtidos de Charles River (Wilmington,MA) e aclimatados durante 1 semana em gaiolas isentas depatógeno antes de começar o estudo. Os animais receberamração para roedor estéril e água ad libitum e foramalojados em gaiolas com filtro por cima estéreis com ciclosde claro/escuro de 12 horas. Todos os experimentos foramsob as diretrizes da Association for Assessment and

Accreditation of Laboratory Animal Care International.

Para implante de tumor, células B16-F10 (2 x IO6) ,CT26 (2 x IO6) ou RENCA (1 x IO6) foram coletadas, lavadastrês vezes e resuspensas em PBS. Os camundongos foramraspados no flanço e implantados (0,2 ml) subcutaneamente(s.c.) no flanço direito do camundongo. Para o modelo detumor BI6-FIO, camundongos C57BL6 foram usados, enquantoque os tumores CT26 e RENCA foram implantados emcamundongos BALB/c. Os tratamentos foram iniciados quandoos tumores estavam com um tamanho médio estabelecido de 50-250 mm3 (dia 0) , conforme esboçado em projetos de estudoespecíficos. Os camundongos foram aleatoriamentedistribuídos em grupos de (tipicamente 10camundongos/grupo). rIL-2 foi administrada diariamente s.c.(0,2-3 mg/kg/dia) nos dias 0-6 ou 7-13 ou dias 0-4, 7-11.BAY 43-9006 ou SU11248 (1-100 mg/kg) foram administradosdiariamente (durante 5-12 dias) como uma solução viaingestão oral forçada, começando no dia 0 ou dia 7. Todasas monoterapias e combinações de fármaco em dosesselecionadas, esboçadas em estudos individuais, foram bemtoleradas.

Avaliação de Inibição de Tumor e RespostasOs volumes do tumor e pesos corporais foram avaliados2-3 vezes por semana. Medições de calibre dos tumores foramconvertidas em volume médio do tumor (mm3) usando afórmula: 1/2 (comprimento (mm) x [largura (mm)]2). Inibiçãode crescimento do tumor (TGI) foi calculada como [1-(volumemédio do tumor do grupo tratado/volume médio do tumor dogrupo de controle) x 100]. As respostas foram definidascomo uma resposta completa (CR, sem tumor mensurável) ouresposta parcial (PR, redução de volume do tumor de 50-99%)comparado com o volume de tumor para cada animal no iníciode tratamento. Análise do retardo de crescimento de tumorfoi calculada como: [(número de dias para um que grupotratado atinja um volume médio de tumor de 1000 mm3) -(número de dias para que o grupo de controle atinja umvolume médio de tumor de 1000 mm3)].

Efeitos sinergísticos foram definidos quando aproporção de inibição % de crescimento de tumor esperada daterapia combinada (%T/Cexp = %T/C tratamento 1 x %T/Ctratamento 2) dividido pela % T/C observada (%T/Cobs) dotratamento combinado era >1. Efeitos aditivos foramdefinidos quando %T/Cexp/%T/Cobs = 1 e antagonismo quando%T/Cexp/%T/Cobs <1 (Yokoyama e colaboradores, Câncer Res.2000 60(80): 2190-2196).

Farmacocinética

Para avaliação da farmacocinética do fármaco, oscamundongos foram tratados com uma única dose s.c. de rIL-2(6 mg/kg, 0,2 ml) ou BAY 43-9006 (20 mg/kg, p.o., 0,2 ml) esangue foi coletado em vários tempos após administração defármaco. Os níveis de BAY 43-9006 e rIL-2 no plasma foramdeterminados usando HPLC ou um bioensaio ELISA.

Análise por Western blot

Após incubações do fármaco sob condições indicadas, ascélulas foram coletadas, lavadas com PBS gelado esubmetidas à lise com tampão RIPA (Nonidet P-40 a 1%,deoxicolato de sódio a 0,5%, dodecil sulfato de sódio a0,1% em IX solução salina tamponada com fosfato, pH de 7,2)contendo inibidores de protease (Roche MolecularBiochemicals, Indianápolis, IN) e inibidores de fosfatase(Sigma, St. Louis, MO) . O teor de proteína nos lisatos foideterminado usando o ensaio BCA (Bio-Rad, Hercules, CA).Para análise por western blot, 60 ug de proteína foramsubmetidos à eletroforese e detecção de pERK foi feita comum anticorpo de camundongo ao pERK (1 : 1000, CellSignaling, Beverly, MA) e incubados a 4°C durante a noite.Detecção de anticorpo pSTAT5 (1 : 1000, Upstate) e pAKT(1:1000, Cell Signaling) foi realizada com a mesmaquantidade de proteína através de hibridização comanticorpos anti-fosfotirosina apropriados durante 2 horasem temperatura ambiente. As membranas foram, então,incubadas durante 1 hora em temperatura ambiente com IgG decoelho peroxidase de armorácia-conjugada a 1:5000 (JacksonImmunoresearch, West Grove, PA) . Para verificarcarregamento igual, as blots foram extraídas e submetidasnovamente à hibridização com anticorpos anti-ERK (CellSignaling), anti-STAT5 (BD Biosciences) e anti-AKT (CellSignaling) para medir as proteínas ERK, STAT5 e AKT totais,respectivamente. As proteínas foram detectadas usandoquimioluminescência intensificada (ECL; Amersham

Biosciences, Buckinghamshire, Inglaterra) e visualizadasapós exposição a um filme Kodak. Densitometria deexploração foi realizada para quantificar as intensidadesde banda. A quantidade de pERK, pSTAT5 ou pAKT foinormalizada para os níveis totais de proteínas ERK, STAT5ou AKT e comparada com controles com veículo ou nãotratados.Imunofenotipificação Celular em Camundongos BALB/c NusApós Tratamento com Fármaco

Amostras de sangue foram coletadas em vários temposapós os tratamentos indicados. Sangue íntegro (100 ul) foitransferido para tubos FACS/TruCount (BD BioSciences) emantido sobre gelo. As amostras foram tratadas com 0,5 ugde bloco Fc de camundongo (CD16/CD32 anti-camundongo; BDBioSciences) e incubadas sobre gel 20 minutes. Anticorposfluorocroma- conjugados, conforme indicado abaixo, foramadicionados às amostras e incubados durante 20 minutessobre gelo protegidos da luz. As amostras de sangue foramsubmetidas a turbilhonamento, enquanto se adicionava 2 mlde lx solução de lise FACS (BD BioSciences) , seguido porincubação em temperatura ambiente durante 10 minutes,então, centrifugadas a 1250 rpm. Todas as amostras foramlavadas duas vezes, suspensas em PBS e FBS a 2% earmazenadas a 4°C antes de aquisição da amostra sobre um BDFACScalibur e subseqüente análise através do softwareCellQuest Pro. Os números absolutos de células foramdeterminados com relação ao glóbulo de referência TruCount.Populações de células foram identificadas e separadasbaseado nas características de FSC e SSC, bem comomarcadores para linfócitos totais (CD45, BD BioSciences);as populações de linfócitos de células T foramidentificadas baseado em coloração de CD3 e as sub-populações identificadas através de coloração de CD4 ou CD8(BD Biosciences). As populações de células individuaisforam identificadas através de eventos apropriadamenteseparados.

Histopatologia e ImunohistoquímicaTumores de camundongo foram fixados em formalinatamponada neutra a 10% e, então, transferidos para etanol a70% e subseqüentemente processados para incrustação emparafina usando um processador de tecidos Excelsior (ThermoElectron Corporation, Pittsburgh, PA) . Seções teciduais (4um) foram cortadas sobre um microtoma giratório (RM2125,Leica Microsystems, Nussloch, Alemanha). Seções coradas comhemotoxilina e eosina (H&E) foram preparadas.Imunocolorações foram, então, realizadas usando um sistemade coloração de lâmina automático Discovery XT (VentanaMedicai Systems, Tucson, AZ) . Células T de murino foramdetectadas com um anticorpo anti-CD3 de murino (diluição de1:60, Dako Norden S/A, Glostrup Dinamarca) emonócitos/macrófagos foram detectados usando F4/80(Serotec). Para proliferação de células, os tumores doscamundongos foram corados para Ki-67 usando um anticorpomonoclonal anti-camundongo de rato (diluição de 1:15,DAKO) . Recuperação de epítopo calor-induzida foi realizadausando CC 1 (Ventana Medicai Systems). As amostras foram,então, incubadas com os anticorpos secundários apropriados(anticorpo biotinilado de IgG anti-coelho de cabra,diluição de 1:100, Jackson ImmunoReseach Laboratories). Umsistema de biotina/estreptavidina rotulado com peroxidasede armorácia com cromogênio 3-3'-diaminobenzidina (VentanaMedicai Systems) foi usado para localização dos anticorpos.As seções foram contra-coradas com Fast Red Nuclear paraintensificar a visualização de morfologia tecidual. Paratumores B16-F10, o kit Ventana Bluemap - um método decoloração com NBT/BCIP alternativo - foi usado em virtudedos depósitos de melanina observados em tecidos H&E, o queauxiliou na visualização de células T em tumores.

Ensaio de Proliferação de células T CTLL-2

Células T CTLL-2 foram pré-incubadas com ou sem BAY43-9006 (3 uM) a 37°C durante 2 horas. As células foram,então, lavadas e colocadas em lâminas de microtitulação com96 cavidades, 5.000 células/cavidade em meio de cultura comdiluições seriais de rhIL-2 (1 pM a 100 nM) . Ao final doperíodo de incubação (72 horas a 37°C), a viabilidadecelular foi determinada através de um ensaio com corantetetrazólio usando o reagente de proliferação celular WST-I(Roche Applied Science, Indianápolis, IN).

Ensaios de Citotoxicidade in vitro

Células foram colocadas em lâminas de microtitulaçãocom 96 cavidades (CTLL-2: 5000 células/cavidade; RENCA:1500/cavidade; B16-F10: 100O/cavidade; MV4.11:5000/cavidade) e tratadas com diluições seriais de BAY 43-9006/SU11248 ou vincristina. CTLL-2 é uma linhagem decélulas IL-2-dependente e, conseqüentemente, para essascélulas, o ensaio de citotoxicidade foi conduzido em meiocontendo rIL-2 a 5 nM. Ao final do período de incubação (72horas a 3 7°C) , a viabilidade celular foi determinadasatravés de um ensaio com corante tetrazólio (WST-I) ou umensaio quimioluminescente (BrdU) (Roche Applied Science,Indianápolis, IN) . Os valores de EC50 foram definidos comoa concentração necessária para uma redução de 50% naabsorbância de células tratadas vs. de controle nãotratadas.

Ensaios de Citotoxicidade Esplenócito Ex Vivo

Esplenócitos foram obtidos de camundongos BALB/ctratados com droga (n = 3-5/grupo) sob condições assépticase homogeneizados em PBS gelado. Após passagem através de umretentor de células de náilon de 70 um, as células foramrapidamente centrifugadas a 4°C. Células sangüíneasvermelhas foram submetidas à lise usando tampão de lise RBC(Sigma, St. Louis, MO). As células foram lavadas ecolocadas em lâminas com células alvo Yac-1 51Cr-rotuladasem várias proporções de E:T (100:1, 50:1, 25:1, 12/5:1,6,25: 1, 3:1) em um ensaio de citotoxicidade de 4 horas. Osdados foram obtidos usando um leitor para lâminas Wallac eexpressos como contagens por minuto (cpm). Quantificação éexpressa como lise específica percentual e foi calculadacomo: % de lise específica = 100 x ( (média experimental -liberação média espontânea)/(liberação média máximaliberação média espontânea)). A liberação espontânea foideterminada a partir de cavidade contendo células alvorotuladas e nenhuma célula efetora e a liberação máxima foideterminada a partir de cavidades contendo células alvorotuladas em Triton X-100 a 1%.

Análise Estatística

Múltiplas comparações foram feitas usando análise devariância em uma-via (ANOVA) e pós-teste para comparardiferentes meios de tratamento usando o teste de Student-Newman Keuls (SigmaStat). As diferenças foram consideradasestatisticamente significativas a p < 0,05.

B. Estudos in vitro com rIL-2 e BAY 43-9006 sobre as Viasde Sinalização de Células T e Células Tumorais

rIL-2 Ativa a Sinalização de JAK/STAT e MAPK emCélulas CTLL-2 in vitro

Para elucidar o início, curso de tempo e duração dasvias de transdução de sinal de IL-2/IL-2R em células T,células CTLL-2 (lxlO7 células) foram privadas de sorodurante 24 horas antes de tratamento com váriasconcentrações de rIL-2 (1 pM a 100 nM) durante 2 horas evias de sinalização chave MAPK, STAT5, AKT foram avaliadasusando análises por Western blot. As células CTLL-2privadas de soro foram tratadas in vitro com uma amplafaixa de concentrações de rIL-2 (de 1 pM a 100 nM) de formaa delinear as interações de dois complexos de IL-2Rpredominantes: receptor de alta afinidade (KD de IL-2Rapy =10-11M) e de afinidade intermediária (KD de IL-2py = 10"9M) .Em alguns experimentos, as células foram expostas aoanticorpo anti-IL-2a livre (excesso >1000-vezes; 10 nM)incubadas durante 1 hora antes de adição de rIL-2. Paraavaliar o tempo de curso de ativação de IL-2/IL-2R, célulasCTLL-2 privadas de soro foram ativadas com rIL-2 a 10 nM esinalização IL-2 foi examinada em vários tempos de 10minutos a 48 horas. Fosforilação de IL-2R a jusante deERK1/2, STAT5 e AKT foi avaliada em células rlL-2-tratadasusando análise de Western blot. Os níveis relativos depERK, pSTAT5 ou pAKT foram comparados com os níveis deproteína total para ERK, STAT5 ou AKT, respectivamente.

Ativação de pERKl/2 foi observada após exposição dascélulas CTLL-2 à rIL-2. Fosfo ERK foi ligeiramente ativadaa 1 pM em 2 horas, contudo, ativação máxima foi observadaem concentrações > 100 pM. A via de JAK/STAT5 foimaximamente ativada em uma concentração de 1 pM; e aumentodas concentrações de rIL-2 não alteraram os níveis depSTAT5 (até 100 nM) . A via de pAKT basal em CTLL-2 pareciaser ativada em células T sob condições de privação de soro.Além disso, os níveis de pAKT permaneceram grandementeinalterados nas concentrações de rIL-2 testadas (1 pM a 100nM; usando um anticorpo pAKT ao sítio de fosforilação 483).

Um anticorpo de bloqueio à IL-2Ra foi usado paraconfirmar se as vias de sinal de IL-2 são mediadasespecificamente pela ligação ao IL-2R. Os níveis de pSTAT5em células CTLL-2 foram analisados através de Western blot.Células CTLL foram privadas de soro e tratadas com excessode anticorpo anti-IL-2Ra livre (10 nM, > 1000-vezes)durante 1 hora antes de tratamento com rIL-2 (0,1 pM a 10nM). Na ausência de anticorpo IL-2Ra de bloqueio, pSTAT5foi ativado a 1 pM após tratamento com rIL-2, contudo, napresença de inibição por IL-2Ra, a sinalização de pSTAT5foi anulada (inibição > 95%), confirmando o requisito deIL-2Ra na sinalização de STAT5. De modo interessante, osníveis de pSTAT5 foram restaurados em células CTLL-2 comaumento das concentrações de rIL-2 (>10 pM) , sugerindo quea rIL-2 desloca competitivamente o anticorpo anti-IL-2Rae/ou ativa a sinalização de pSTAT5 através de ligação àcadeia IL-2RJ3Y de baixa afinidade (KD = 10"9 M) .

Ativação de pSTAT5 por rIL-2 é Rápida e Sustentada emCélulas CTLL-2

Para avaliar o tempo de início e duração de respostasde sinalização ao IL-2R em células CTLL-2 privadas de soroforam tratadas in vitro com rIL-2 (10 nM) e os efeitossobre a fosforilação de ERK1/2, STAT5 e AKT foram avaliadosusando análises por Western blot. A fosforilação de ST AT 5foi ativada em minutos (< 10 minutos) após a adição de rlL-2 às células CTLL-2 e a duração de resposta de pSTAT5 foimantida até 48 horas. Ativação da via de MAPK (pERK) pelarIL-2 parecia ser ligeiramente retardada e foi ativada em 1hora. A intensidade de pERK era menor do que a respostamáxima obtida através de estimulação das células CTLL-2privadas de soro com PMA (50 ng/ml) + ionomicina (0,4ug/ml) durante 15 minutos. Adicionalmente, os níveis depERK foram sustentados até 24 horas e retornaram para osníveis de base em 4 8 horas. Nenhum efeito discernível foiobservado sobre pAKT, confirmando que a via PI-3K/AKT eracontinuamente ativa em células CTLL-2.

Tratamento com BAY 43-9006 Inibe pERK e não pSTAT5 emCélulas CTLL-2

BAY-43-9006 é um potente inibidor de Raf-1, o qualtambém inibe a BRAF do tipo silvestre e mutante. Alémdisso, o BAY-43-9006 inibe múltiplas quínases,particularmente VEGF2, 3; PDGFRJ3; FLT3 e cKIT (Wilhelm, SMe colaboradores, Câncer Res 2004; e dados de definição deperfil de quínase de Chiron) e inibe, até algum ponto, aLck e Fyn, duas quínases que estão envolvidas em respostasfuncionais de células T. Dado o perfil inibitório dequínase do BAY 43-9006 e o impacto potencial sobre asinalização de MAPK/sinalização de células T, acredita-seque o BAY 43-9006 possa interferir potencialmente com asinalização de IL-2/IL-2R em células T. Portanto, asinterações potenciais do BAY 43-9006 sobre a sinalização deIL-2 foram avaliadas em células CTLL-2, B16-F10 ou RENCA invitro.

Para examinar os efeitos do BAY 43-9006 sobre célulasmodelo de CTLL-2, B16-F10 ou RENCA, células privadas desoro foram tratadas com várias concentrações de BAY 43-9006(0,01-20 uM). Como um controle apropriado, as células foramestimuladas com PMA (50 ng/ml) e ionomicina (0,4 ug/ml)durante 15 minutos. Para examinar os efeitos de tratamentosconcomitantes e seqüenciais com rIL-2 e BAY 43-9006 emcélulas CTLL-2 in vitro, células CTLL-2 privadas de soroforam tratadas com rIL-2 (10 nM) na presença ou ausência deBAY 43-9006 (3 uM) durante 2 horas. Para tratamentoseqüenciais, BAY 43-9006 foi tratado durante 2 horas. Ascélulas foram, então, lavadas e, então, tratadas com rIL-2e vice versa. Os efeitos inibitórios do BAY 43-9006 (3 uM)foram também examinados sem ou com estimulação com PMA (50ng/ml) e ionomicina (0,4 ug/ml) durante 15 minutos.

Uma vez que a concentração de BAY 43-9006 requeridapara inibir a via de MAPK em diferentes tipos de células émuito variável, os efeitos de várias concentrações de BAY43-9006 (oscilando de 0 a 20 uM) foram avaliados em célulasCTLL-2 privadas de soro durante 2 horas com ou semestimulação com PMA + Ionomicina. Ao final do período deincubação, células CTLL-2 tratadas foram, então, submetidasà lise e os lisatos de proteína foram submetidos à análisepor Western blot para determinação dos níveis de pERK. BAY43-9006 inibiu substancialmente pERK em concentrações _> 1uM em células CTLL-2 de murino e na linhagem de células Thumana Jurkat. Os efeitos de tratamento com BAY 43-9006sobre células CTLL-2 não altera os níveis de pSTAT5 e pAKTem células, indicando que a via de JAK/STAT5 e PI-3K/AKT emcélulas T permaneceram grandemente não afetadas.

Para investigar a base terapêutica de combinação derIL-2 e BAY 43-9006 in vitro, os efeitos de rIL-2 e BAY 43-9006 sobre as células T e o impacto sobre as duas vias desinalização IL-2-mediadas (MAPK e JAK/STAT5) em célulasCTLL-2foram estudados. Os efeitos de sinalização de célulasT IL-2-mediada com regimes concomitantes ou seqüenciais dosdois fármacos foram investigados em células CTLL-2. CélulasCTLL-2 privadas de soro foram tratadas com BAY 43-9006 (3uM) durante 2 horas e, então, tratadas com veículo, rIL-2(10 nM) ou PMA+Ionomicina. Alternativamente, tratamento comrIL-2 (10 nM, 2 horas) , seguido por BAY 43-9006 (3 uM, 2horas) também foi investigado. Após exposição ao fármacoe/ou estimulação com PMA+ Ionomicina, análises por Westernblot de pERK e pSTAT5 em lisatos de células foramrealizadas (conforme descrito anteriormente). Tratamentocom BAY 43-9006 (3 pM) inibiu os níveis de pERK, enquantoque a rIL-2 ativou os níveis de pERK em células CTLL-2privadas de soro (vs. níveis de pERK de linha de base),confirmando os efeitos opostos dos dois fármacos sobre avia de MAPK. Todos os tratamentos com combinações de BAY43-9006 (exposições concomitantes e seqüenciais ao fármaco)inibiram substancialmente pERK em células CTLL-2. Nenhumefeito foi observado sobre a via de STAT5 ou a via de AKT,com todos os tratamentos combinados testados (conformeesboçado em métodos).

BAY 43-9006 em Altas Concentrações Inibe os Níveis depERK em Linhagens de Células Tumorígenas

Os efeitos de tratamento com BAY 43-9006 sobre aslinhagens de células tumorígenas de murino - melanoma B16-F10, cólon CT26 o modelo de RCC RENCA foram determinados.As linhagens de células de murino foram selecionadasbaseado em sua responsividade à terapia com rIL-2 in vivoem modelos imunocompetentes (camundongos T-/NK-/monócito-/macrófago-competentes), onde os efeitos de terapiacombinada de rIL-2 e BAY 43-9006 poderiam ser investigados.Células de melanoma BI6-FIO e RENCA privadas de soro foramexpostas a uma faixa de concentrações de BAY 43-9006 de 0 a20 uM. Os níveis de Fosfo-ERK em lisatos de células apósexposição ao fármaco foram determinados através de análisesde Western blot. BAY 43-9006 inibiu os níveis de pERK emtodas as linhagens de células testadas (B16-F10 e RENCA) emconcentrações muito altas de > 5uM, com quase eliminaçãocompleta de pERK observada a 20 uM.

C. Efeitos in vitro de BAY 43-9006 sobre a ProliferaçãoCelular IL-2-Mediada

Para examinar se inibição de pERK pelo BAY 43-9006afetou as respostas proliferativas IL-2-mediadas em célulasCTLL-2, ensaios de proliferação foram conduzidos através depré-incubação de células CTLL-2 (5000 células/cavidades) emconcentrações de BAY 43-9006 (3 uM, 2 horas) que inibempERK. Após uma incubação de 2 horas das células com BAY 43-9006 (3 uM) , as células foram colocadas em lâminas com 96cavidades e expostas à várias concentrações de rIL-2 (0-100nM) durante 72 horas. Às células não tratadas foramfornecidos tratamentos sham antes de incubação com rIL-2(nas mesmas concentrações). As respostas proliferativas decélulas CTLL-2 tratadas e não tratadas com BAY 43-9006foram avaliadas usando o ensaio WST-I. Pré-incubação dascélula com BAY 43-9006 (3 uM) inibiu a sinalização de pERK,mas não afetou as respostas proliferativas IL-2-induzidasna linhagem de células CTLL-2.

D. Atividade Anti-proliferativa de BAY 43-9006 ou SU11248sobre Células CTLL-2 e Tumorígenas in vitro

Para avaliar a atividade citotóxica in vitro do BAY43-9006 ou SU11248 em cada um desses tipos de células(CTLL-2, B16-F10, RENCA, CT26), as células foram colocadasem lâminas de microtitulação com 96 cavidades e tratadascom diluições seriais de BAY 43-9006 (de 0 a 50 uM) durante72 horas a 3 7 °C. Uma vez que a linhagem de células CTLL-2é dependente de IL-2 para proliferação, a citotoxicidadecontra essas células foi conduzida em meio contendo rIL-2 a5 nM. Ao final do período de incubação de 72 horas, aviabilidade celular foi determinada através do ensaio comcorante tetrazólio (WST-I) ou um ensaio quimioluminescente(BrdU). Como controles, MV4.11 (linhagem de células de AMLhumana FLT3 ITD) foi tratado com BAY 43-9006 (0 a 50 uM) oucélulas B16-F10 foram tratadas com vincristina (0 a 1 pM)para confirmar a citotoxicidade dos agentes e validez dosensaios. As concentrações inibitórias dos fármacos foramexpressas como o valor de EC50, o qual foi definido como aconcentração necessária para uma redução de 50% na respostaproliferativa medida como a absorbancia de células tratadascom fármaco vs. controle com veículo/não tratados.

A EC50 relativa do BAY 43-9006 ou SU11248 éapresentada na Tabela 9.

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As células foram colocadas em lâminas demicrotitulação com 96 cavidades (CTLL-2: 5000células/cavidade; RENCA: 150O/cavidade; B16-F10:

1000/cavidade; CT26: 1000 células/cavidade; MV4;11:50 00/cavidade) e tratadas com diluições serias de BAY 43-9006, SU11248 ou Vincristina. CTLL-2 é uma linhagem decélulas IL-2-dependente e, conseqüentemente, o ensaio decitotoxicidade foi conduzido em meio contendo rIL-2 a 5 nM.Ao final do período de incubação (72 horas a 37 °C) , aviabilidade celular foi determinada através de um ensaiocom corante tetrazólio (WST-I).

aEC50 = concentração necessária para uma redução de 50% naresposta proliferativa, medida como a absorbância decélulas tratadas com fármaco vs. controles de veículo/nãotratados.

bMV4.11 é uma linhagem de células de leucemia mielogêneaaguda humana (AML) que expressa uma Duplicação AleatóriaInterna FLT3 (ITD). BAY 43-9006 (inibidor potente dequlnase FLT3; IC50 = 58 nM) demonstra potente atividadeanti-proliferativa in vitro contra células MV4.11.dA viabilidade celular foi avaliada usando o ensaio PromegaCell-Titer Glo™ que mede o teor de APT de células.

Em geral, concentrações relativamente altas de BAY 43-9006 (ou SU11248) foram necessárias para inibir aproliferação de células CTLL-2, bem como várias linhagensde células (B16-F10, RENCA, CT26), comparado com o agenteantimitótico vincristina (definido pelas EC50's relativas;veja Tabela 9). A citotoxicidade dos efeitos de BAY 43-9006sobre células RENCA também foi examinada usando o ensaioBrdU para avaliar o efeito sobre a síntese de DNA (vs.atividade anti-proliferativa usando o ensaio com corantetetrazólio mitocondrial) . A EC50 para BAY 43-9006 (~5 uM)sobre células RENCA obtida usando o método BrdU era similaràquela observada com o ensaio WST-I. Nenhuma respostaproliferativa direta (ou citotoxicidade) foi observadaquando células tumorígenas RENCA foram expostas à faixa deconcentrações de rIL-2 (de 0 a 1 uM) , confirmando que omecanismo da rIL-2 conta com ativação do componente célulasefetoras imunes.

E. Estudos de Eficácia in vivo

Farmacocinética de rIL-2 e BAY 43-9006 em CamundongosEm relatórios de Fase I publicados do BAY 43-9006 (emuma dose de 4 00 mg) , alta Cmax de 10-20 uM e longas meias-vidas do fármaco de cerca de 24 horas foram obtidas nospacientes (Strumberg e colaboradores, J. Clin. Oncol. 200523(5) : 965-972) . Para determinar se exposição ao fármaco noplasma pode ter um impacto sobre a viabilidade de células Te respostas proliferativas in vivo, a farmacocinética deuma única dose de rIL-2 e BAY 43-9006 em camundongos foimedida.

Uma única dose oral de 30 mg/kg de BAY 43-9006 emcamundongos obteve uma Cmax de cerca de 5500 a 8000 ng/ml(-10 uM) em um tmax de 2 horas. A taxa de eliminação de BAY43-9006 do plasma era razoavelmente lenta e a conseqüentemeia-vida era cerca de 4 horas. Em contraste, o perfil PKda rIL-2 após administração subcutânea de 6 mg/kgdemonstrou uma Cmax de cerca de 550 - 850 ng/ml em um tmax decerca de 30 minutos. O t1/2 de rIL-2 em camundongos era deaproximadamente 1 hora, com exposições de >50 ng/ml obtidasdurante 4 horas. De modo interessante, tratamentos após umaúnica dose e nas respectivas vias de aminoácidodemonstraram Cmax de não-sobreposição (no tmax) , concluindo-se que tratamentos concomitantes e seqüenciais podem serpassíveis, conforme sustentado pelos achados de PK. Dadoque o BAY 43-9006 pode estar grandemente ligado à proteínasno sangue, o impacto dessas exposições ao fármaco sobre aviabilidade de células T in vivo continua a serconsiderada.

Tratamento com rIL-2 e BAY 43-9006 diminui a funçãoefetora imune ex vivo

Uma vez que inibição de uma ou múltiplas quínaseslinfocíticas T (Lck, Fyn, Syk, Btk, Src, Tck2, MAPK, JAKs)pode eliminar a expansão de células T e função efetoraimune, os efeitos de rIL-2 e BAY 43-9006 sobre as respostasprolif erativas e funcionais de células T in vivo foraminvestigadas.

Nesses experimentos, camundongos BALB/c trazendotumores RENCA foram tratados com rIL-2 (1 mg/kg/dia, s.c.dias 6-10), BAY 43-9006 (30 mg/kg/dia, p.o., dias 6-10) oucombinações de rIL-2 e BAY 43-9006 administradasconcomitante ou seqüencialmente (rIL-2, 1 mg/kg/dia, s.c,dias 1-5 + BAY 43-9006, 30 mg/kg/dia, p.o., dias 6-10; ouBAY 43-9006, 30 mg/kg/dia, p.o., dias 1-5 + rIL-2, 1mg/kg/dia, s.c, dias 6-10). Esplenócitos isolados doscamundongos tratados foram, então, submetidos à ensaios demorte ex vivo contra células alvo Yac-1 em váriasproporções de efetuador:alvo (E: T) e a lise percentualespecífica de células Yac-1 51Cr-rotuladas foi determinada.Camundongos tratados com rIL-2 (1 mg/kg) aumentaramsignificativamente a morte esplenócito-mediada de alvosYac-1 comparado com tratamento com veículo (23% com rIL-2vs. 0% com tratamento com veículo) . Os efeitos de morteespecífica observados com tratamento com BAY 43-9006 (1%)eram negligenciáveis e não diferiam do tratamento comveículo. Todos os tratamentos com rf e BAY 43-9006proporcionaram atividade lítica esplenócito-mediadareduzida (tratamento concomitante = 16%; tratamentosseqüenciais < 9% vs. monoterapia com rIL-2 = 23%).

Efeito de Terapia com rIL-2 e BAY 43-9006 Sobre AsPopulações de Células Efetoras Imunes em Circulação

Os efeitos farmacodinâmicos de terapia com rIL-2 e/ouBAY-43-9006 sobre as populações de linfócitos e monócitosem circulação em camundongos BALB/c trazendo tumor e foramavaliados. Nesses estudos, sangue foi coletado após umúnico agente ou terapia combinada de rIL-2 e BAY 43-9006(tratamentos concomitantes ou seqüenciais, conformedescrito anteriormente). As contagens absolutas delinfócitos e sub-populações de células T (CD4+ ou CD8+)foram quantificadas em sangue íntegro usando tubosTruCount™ e imunocoloração apropriada.

Tratamento com rIL-2 diminuiu os números absolutos delinfócitos e monócitos em circulação (células CD45+: 2387células/pl vs. 1575 células/pl com veículo) e células T(1550 célula/ul vs. 664 célula/ul com veículo) emcamundongos. Uma proporção significativa de células CD4:CD 8 foi observada com terapia com rIL-2, comparado comtratamento com veículo (5:3; rIL-2:Veículo, isto é, 1,7-vezes) , como indicativo do mecanismo de ação da rIL-2 naexpansão dos número de células T. Os números relativos decélulas não-T e monocíticas (CD45+CD3-) após tratamento comrIL-2 eram similares ao tratamento com veículo (83 7células/ul vs. 911 células/ul com veículo).

Em contraste, o único agente BAY 43-9006 ou BAY 43-9006 combinado com rIL-2 tinha pouco impacto ou aumentou osnúmeros absolutos de linfócitos e monócitos (faixa de 2417-3577 células/pl vs. 2387 células/pl com veículo) e tambémaumentou as populações de células não-T e monócitos (1241-1563 células/pl vs. 837 células/pl com veículo). 0 efeitode terapia com BAY 43-9006 sobre os números totais decélulas T era similar ao tratamento com veículo (1827células/pl vs. 1550 células/pl com veículo) . Números decélulas T totais aumentaram ligeiramente (incluindopopulações de CD4+ e CD8 + ) com o regime seqüencial de rIL-2e BAY 43-9006 quando iniciado com rIL-2 (2081 T células/plvs. 1550 células/pl com veículo). Quando rIL-2 e BAY 43-9006 foram fornecidos concomitante ou seqüencialmente comoBAY 43-9006, então, rIL-2, os números de células T totaisdiminuíram ligeiramente comparado com tratamento comveículo (-1170-1244 T células/pl vs. 1550 células/pl comveículo). Tendências similares foram observadas empopulações individuais de células T CD4+ e CD8+.Adicionalmente, a histologia de tumores após terapiade tratamento com rIL-2 e BAY 43-9006 ou SU11248 (conformedescrito anteriormente) foi determinada. Para examinar af armacodinâmica de células T in vivo, células T que seinfiltram em tumores foram detectadas com um anticorpoanti-CD3 de camundongo. Os efeitos anti-proliferativos emtumores após os tratamentos com fármaco foram avaliadosusando coloração com KÍ67. Com tratamento com rIL-2,números aumentados de células T foram observados seinfiltrando em tumores RENCA (e tumores B16-F10) comparadocom tratamento com veículo. Geralmente, menos células Tforam detectadas no grupo tratado com Bayer 43-9006 nomodelo RENCA. Os efeitos de terapia com rIL-2 e BAY 43-9006ou SU1124 8 sobre a infiltração de células T em tumores B16-F10 eram equivocados, uma vez que algumas células T foramdetectadas em todos os grupos tratados. Tumores quedemonstraram necrose aumentada (inibição de tumor) ,geralmente mostraram números maiores de células Tinterdispersas entre as células tumorígenas. Coletivamente,os dados sugerem que a rIL-2 ativa células T em circulaçãoe as células trafegam para locais extravasculares,incluindo tumores, e que tratamento com BAY43-9006 ouSU11248 pode eliminar parcialmente as respostasproliferativas e tráfego de células T.

Terapia com rIL-2 e BAY 43-9006 Aumenta a Eficácia deModelos de Tumor em Murino IL-2-Responsivos

Interações de fármaco de rIL-2 com BAY 43-9006 ouSU11248 foram examinadas (veja Figuras 1-10 e Tabela 10-12) . Os tratamentos combinados foram avaliados em trêsmodelos de tumor IL-2-responsivos, células T-competentes,experimentais (melanoma B16-F10, cólon CT26, modelo de RCCRENCA) (Figuras 1-10). Nesses estudos, os camundongos foramaleatoriamente distribuídos quando os tumores estavam comum tamanho estabelecido de 50- 225 mm3 e o crescimento dostumores foi monitorado através de medições do calibre apósdosagem diária oral de BAY 43-9006 ou SU11248 ouadministração diária subcutanea de rIL-2 (conforme indicadoem métodos). A eficácia e tolerabilidade de um único agentede rIL-2, BAY 43-9006 e SU11248 foram investigadas em umafaixa de doses e esquemas de tratamento (Figura 1) . Emtodos os modelos, a rIL-2 demonstrou eficácia potente einibições de tumor em doses eficazes estava, em geral, nafaixa de 40-60% (vs. tratamento com veículo) (Figura 1). Adose mínima eficaz para BAY 43-9006 era de >30 mg/kg/dia(vs. tratamento com veículo). SU11248 era, em geral, eficazem doses > 4 0 mg/kg/dia, exceto quanto ao modelo de tumorB16-F10 (Figura 1).

Baseado na eficácia e tolerabilidade de um únicoagente, rIL-2 foi, então, combinada com BAY 43-9006 ouSU1124 8 em doses que eram toleradas e não exibiram efeitosprejudiciais sobre o peso corporal ou quaisquer sintomasclínicos adversos. Esquemas de tratamento seqüencial econcomitante foram examinados nos modelos de tumor B16-F10e CT26 (Figuras 2-8, Tabelas 10 e 11) . Nos modelos de tumorB16-F10 e CT26, quase todas as terapias combinadas (regimeconcomitante ou seqüencial) investigadas com rIL-2 e BAY43-9006 ou rIL-2 e SU12248 aumentaram a atividade anti-tumor comparado com tratamentos com monoterapia ou veículos(Figuras 2-5) . Um resumo das interações de fármacoscombinados das várias terapias combinadas é resumido nas<table>table see original document page 129</column></row><table><table>table see original document page 130</column></row><table><table>table see original document page 131</column></row><table>

an = 10 camundongos C57BL6/grupo em cada estudo.Camundongos trazendo tumor BI6-FIO foram tratados quando ostumores estavam com um tamanho médio estabelecido de -50mm3.

b T/Cobservada (O) = % T/C

c T/Cesperada (E) = %T/C tratamento 1 x %T/C tratamento 2

d Efeitos sinergísticos foram definidos quando a proporçãode inibição % de crescimento de tumor esperada da terapiacombinada (%T/Cesp = %T/C tratamento 1 x %T/C tratamento 2)dividido pela % T/C observada (%T/Cobs) do tratamentocombinado era >1.

e Interações de droga foram definidas como aditivas quando%T/Cesp/%T/Cobs = 1 e antagonismo quando %T/Cesp/%T/Cobs <!•N/A, não aplicável.

Tabela 11. Eficácia de rIL-2, BAY 43-9006, SU11248 ecombinações de rIL-2 e BAY 43-9006/SU11248 no modelo de<table>table see original document page 132</column></row><table><table>table see original document page 133</column></row><table><table>table see original document page 134</column></row><table>

an = 10 camundongos BALB-c/grupo em cada estudo.Camundongos trazendo tumor CT26 foram tratados quando ostumores estavam com um tamanho médio estabelecido de ~225mm3.

b T/Cobservada (O) = % T/C

c T/Cesperada (E) = %T/C tratamento 1 x %T/C tratamento 2d Efeitos sinergísticos foram definidos quando a proporçãode inibição % de crescimento de tumor esperada da terapiacombinada (%T/CesP = %T/C tratamento 1 x %T/C tratamento 2)dividido pela % T/C observada (%T/C0bS) do tratamentocombinado era >1.

e Interações de droga foram definidas como aditivas quando%T/Cesp/%T/Cobs = 1 e antagonismo quando %T/Cesp/%T/C0bs <1-N/A, não aplicável.

Em apenas um caso no modelo CT26, quando BAY 43-9006(40 mg/kg/dia, p.o. dias 1-7) foi administrado antes derIL-2 (1 mg/kg/dia, s.c. dias 8-13), os efeitos dotratamento combinado foram sub-ótimos.

No modelo RENCA, apenas esquemas concomitantes foramavaliados (Figuras 9-10; Tabela 12) e combinações de rIL-2com BAY 43-9006 ou SU11248 demonstraram maior inibição detumor comparado com terapia com um único agente.

<table>table see original document page 135</column></row><table><table>table see original document page 136</column></row><table>b T/Cobservada (O) = % T/C

c T/Cesperada (E) = %T/C tratamento 1 x %T/C tratamento 2

d Efeitos sinergísticos foram definidos quando a proporçãode inibição % de crescimento de tumor esperada da terapiacombinada (%T/Cesp = %T/C tratamento 1 x %T/C tratamento 2)dividido pela % T/C observada (%T/Cobs) do tratamentocombinado era >1.

e Interações de droga foram definidas como aditivas quando%T/CeSp/%T/Cobs = 1 e antagonismo quando %T/Cesp/%T/Cobs <1-N/A, não aplicável.

Tratamentos seqüenciais no modelo RENCA não erapossíveis em virtude da curta duração do modelo e caquexiado camundongo (debilitação/perda de peso do animal).Coletivamente, os dados demonstram atividade intensificadaquando rIL-2 foi combinada com terapias com moléculaspequenas, tais como BAY 43-9006 e SU11248, em modelos pré-clínicos, indicando que tais estratégias terapêuticaspoderiam ser traduzidas ao clínico.

Embora a presente invenção tenha sido descrita comrelação a exemplos específicos, incluindo modospresentemente preferidos de realização da invenção, aqueleshabilitados na técnica apreciarão que existem diversasvariações e permutas dos sistemas e técnicas descritosacima que caem dentro do conceito inventivo e escopo dainvenção.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

Os conteúdos de todas as patentes, pedidos de patentee artigos de jornal mencionados acima são incorporados porreferência, conforme se totalmente apresentado aqui.

Claims (32)

1. Método de tratamento de um paciente sofrendo decâncer caracterizado por compreender a administração, aoreferido paciente, de uma quantidade terapeuticamenteeficaz de aldesleucina e um agente anti-angiogênicoselecionado de 6,7-bis (2-metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6- (3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metóxiquinazolin-4-amina. N-(2-dimetilamino)etil)-5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno)metil)-2,4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N-(4-clorofenil)-4-((piridin-4-il)metil)ftalazin-l-amina ou 1-(4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi)fenil)-3-(4-cloro-3-(trifluorometil)fenil)uréia.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato da aldesleucina ser administradaantes do agente anti-angiogênico.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato da aldesleucina ser administradasubseqüente ao agente anti-angiogênico.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato da aldesleucina ser administradaconcorrente com o agente anti-angiogênico.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pelo fato da aldesleucina ser administrada emuma composição separada do agente anti-angiogênico.

6. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizado porcompreender a administração separadamente ao referidopaciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz dealdesleucina e um agente anti-angiogênico de acordo com umesquema de dosagem onde a aldesleucina é administrada de 1a 3 vezes ao dia em uma dose entre cerca de 9 e cerca de 13 0 MIU/dia durante um período de pelo menos 3 diasconsecutivos, opcionalmente seguido por um período de pausade pelo menos 3 dias consecutivos.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato do referido agente anti-angiogênicoser administrado de 1 a 6 vezes a cada 2-3 semanas.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato da aldesleucina ser administradaintravenosamente e o referido período de pausa estarpresente.

9. Método, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato da aldesleucina ser administradasubcutaneamente e o referido período de repouso estarausente.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato da aldesleucina ser administrada de 1-3 vezes ao dia em uma dose de cerca de 9-30 MIU/dia.

11. Método, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato da aldesleucina ser administrada 3vezes ao dia em uma dose de cerca de 30-130 MIU/dia.

12. Método, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato da aldesleucina ser administradadurante um período de cerca de 5 dias consecutivos seguidopor um período de 9 dias de pausa.

13. Método, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato do referido esquema de dosagem serrepetido durante pelo menos dois cursos.

14. Método, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato do referido esquema de dosagem serrepetido durante 3 cursos.

15. Método, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato do referido esquema de dosagem serrepetido durante 4 cursos.

16. Método, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato da aldesleucina ser administradadurante 3 vezes durante o primeiro dia e uma vez ao dia acada dia posterior.

17. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15 ou 16, caracterizado pelo fato do câncer sercarcinoma de células renais, melanoma e câncer de cólon.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado por ainda compreender a administração, aopaciente, de pelo menos um composto selecionado deacetaminophen, meperidina, indometacina, ranitidina,nizatidina, diastop, loperamida, difenidramina oufurosemida subseqüente a ou concorrentemente comadministração de aldesleucina.

19. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17 ou 18, caracterizado pelo fato do referidométodo resultar no alívio de câncer no paciente.

20. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17 ou 18, caracterizado pelo fato do referidométodo resultar em atenuação de hipotensão no paciente.

21. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17 ou 18, caracterizado pelo fato do referidométodo resultar na atenuação de hipertensão no paciente.

22. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17 ou 18, caracterizado pelo fato do referidométodo resultar na redução de sintase de oxido nítrico nopaciente.

23. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17 ou 18, caracterizado pelo fato do câncer sersuscetível à inibição de angiogênese e/ou estimulaçãoimune.

24. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23, caracterizadopelo fato do referido agente anti-angiogênico ser N-(2-(dimetilamino)etil)-5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno)metil)-2,4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida.

25. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24, caracterizadopelo fato do agente anti-angiogênico ser 1- (4-(2-metilcarbamoil)piridin-4-ilóxi)fenil)-3-(4-cloro-3-(trifluorometil)fenil)uréia.

26. Composição caracterizada por compreender: (a) umaquantidade terapeuticamente eficaz de aldesleucina; (b) umaquantidade terapeuticamente eficaz de um agente anti-angiogênico selecionado de 6,7-bis(2-metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6-(3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metóxiquinazolin-4-amina, N-(2-(dimetilamino)etil)-5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno)metil)-2,4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N-(4-clorofenil)-4-((piridin-4-il)metil)ftalazin-1-(trifluorometil)fenil)uréia; e (c) um excipiente farmaceuticamenteaceitável.

27. Kit caracterizado por compreender uma combinaçãode medicamentos para o tratamento de um paciente sofrendode câncer englobando: (a) aldesleucina e (b) um agenteanti-angiogênico selecionado de 6,7-bis(2-metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6-(3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metóxiquinazolin-4-amina, N-(2-(dimetilamino)etil)-5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno)metil)-2,4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N-(4-clorofenil)-4-((piridin-4-il)metil)ftalazin-l-amina, ou l-(4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-iloxi)fenil)-3-(4-cloro-3-(trifluorometil)fenil)uréia para uso simultâneo, seqüencial ouseparado.

28. Kit, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de cada um dos referidosmedicamentos ser separadamente embalado.

29. Uso de aldesleucina e um agente anti-angiogênicoselecionado de 6,7-bis(2-metóxietóxi)-N-(3-etinilfenil)quinazolin-4-amina, 6-(3-morfolinopropóxi)-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metóxiquinazolin-4-amina, N-(2-(dimetilamino) etil) -5-((5-fluoro-2-oxoindolin-3-ilideno)metil)-2,4-dietil-lH-pirrola-3-carboxamida, N-(4-clorofenil)-4-((piridin-4-il)metil)ftalazin-l-amina, ou 1-(4-(2-(metilcarbamoil)piridin-4-iloxi)fenil)-3- (4-cloro-3-(trifluorometil)fenil)uréia caracterizado por ser para a fabricaçãode um ou mais medicamentos para tratamento de um pacientesofrendo de câncer.

30. Uso, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato da aldesleucina ser formulada paraadministração antes do agente anti-angiogênico.

31. Uso, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato da aldesleucina ser formulada parasubseqüente administração ao agente anti-angiogênico.

32. Uso, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato da aldesleucina ser formulada paraadministração concorrente com o agente anti-angiogênico.